CN111534594B - 反义RNAch-MYC-AS1的FISH检测引物、试剂盒 - Google Patents

反义RNAch-MYC-AS1的FISH检测引物、试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种反义RNA ch‑MYC‑AS1FISH检测试剂盒的制备及其应用，属于分子生物学领域。引物组由序列为SEQ ID NO.1‑20所示的20条引物组，反义RNA ch‑MYC‑AS1的FISH检测试剂盒，包括FISH探针、杂交液和染色液；FISH探针序列如SEQ ID NO.1‑20示；共定位分析实验显示ch‑MYC‑AS1与HuR蛋白在细胞核中存在共定位现象。本研究发明不仅提供了ch‑MYC‑AS1 FISH检测手段，也为ch‑MYC‑AS1作用机制研究提供了方法基础。

Description

反义RNAch-MYC-AS1的FISH检测引物、试剂盒
技术领域
本发明涉及一种反义RNAch-MYC-AS1的FISH检测引物、试剂盒，属于分子生物学领域。
背景技术
原癌基因c-myc最先被鉴定为禽白血病病毒诱导淋巴瘤的常见整合位点，并在肿瘤发生中扮演着关键角色。在禽白血病病毒易感品系鸡中，由于“强”病毒启动子的插入，前病毒整合入c-myc原癌基因后由病毒启动子LTR驱动c-myc基因高表达从而诱发法氏囊淋巴瘤。禽白血病病毒感染引起的致癌蛋白MYC的异常高表达影响了鸡法氏囊组织的基因表达谱，这是导致淋巴瘤发生的重要原因。而在禽白血病病毒抗性品系鸡中，机体通过减少病毒启动子LTR驱动的c-myc基因高表达，从而对前病毒整合入c-myc原癌基因后诱导的淋巴瘤产生了抗性。因此，通过降低致癌蛋白MYC表达是一种抵抗禽白血病病毒诱导淋巴瘤发生的有效策略。
对反义RNA的研究中，我们意外发现不仅抑癌基因存在反义RNA，许多癌基因也存在反义RNA。在癌细胞中，这些反义RNA处于沉默(Silencing)状态，DNA甲基化抑制剂AZA可明显激活这些反义RNA表达，且反义RNA与对应的正义癌基因呈显著负相关关系。因此，癌细胞中的一些癌基因可能受其反义RNA的调控，这些癌基因的激活可能归因于它们反义RNA的表观遗传沉默，致使癌基因去抑制，从而导致癌基因的激活。这种全新的癌基因的致癌表观遗传学机制，不仅对基础研究和临床医学研究均具重大意义，也对抗肿瘤病毒研究具有重要意义。癌基因衍生的反义RNA在抑制肿瘤细胞和肿瘤病毒增殖中的作用及其表观遗传学机制将逐渐被阐明，有望成为新型的抗肿瘤和病毒药物。
发明内容
本发明通过双链RNA文库测序在鸡2号染色体上鉴定出一条原癌基因c-myc衍生的反义RNA，命名为ch-MYC-AS1。研究表明，ch-MYC-AS1可以抑制原癌基因c-myc表达并抑制J亚群禽白血病病毒增殖。因此，进一步了解ch-MYC-AS1在细胞中的定位分布显得尤为重要。
本发明的目的是这样实现的，一种反义RNA ch-MYC-AS1的FISH检测探针组，其特征在于，所述探针组由序列为SEQ ID NO.1-20所示的20条探针组成；其中：
SEQ ID NO.1：gtgcataggaactcttggac；
SEQ ID NO.2：cacaaccttgagcagctaag；
SEQ ID NO.3：gcggaggagagaacagttga；
SEQ ID NO.4：tcgcagagaaagagcagttg；
SEQ ID NO.5：caatcggacgagcacagact；
SEQ ID NO.6：cacggagtacgttctgtcta；
SEQ ID NO.7：ccaaggttgtcatcctgaaa；
SEQ ID NO.8：ggtggccaacaacgagaagg；
SEQ ID NO.9：tgaagctgagattctttgcc；
SEQ ID NO.10：acaagaggcgaacgcacgac；
SEQ ID NO.11：cacgttagactcagaggaga；
SEQ ID NO.12：caaccgaaaatgctccagtc；
SEQ ID NO.13：agggtcctcaaacagatcag；
SEQ ID NO.14：gccaagaggctaaagttgga；
SEQ ID NO.15：accaacacaactacgctgct；
SEQ ID NO.16：aagcggtgtcacgtcaacat；
SEQ ID NO.17：atcagaggagcactgtaagc；
SEQ ID NO.18：aacgagtctgaatccagcac；
SEQ ID NO.19：tcgatgtcgttacattagct；
SEQ ID NO.20：gcagcgactcggaagaagaa。
利用反义RNA ch-MYC-AS1的FISH检测探针组在制备反义RNA ch-MYC-AS1的FISH检测试剂盒中的应用。
一种反义RNA ch-MYC-AS1的FISH检测试剂盒，包括FISH探针、杂交液和染色液；其特征在于，所述FISH探针序列如SEQ ID NO.1-20示，分别为：
SEQ ID NO.1：gtgcataggaactcttggac；
SEQ ID NO.2：cacaaccttgagcagctaag；
SEQ ID NO.3：gcggaggagagaacagttga；
SEQ ID NO.4：tcgcagagaaagagcagttg；
SEQ ID NO.5：caatcggacgagcacagact；
SEQ ID NO.6：cacggagtacgttctgtcta；
SEQ ID NO.7：ccaaggttgtcatcctgaaa；
SEQ ID NO.8：ggtggccaacaacgagaagg；
SEQ ID NO.9：tgaagctgagattctttgcc；
SEQ ID NO.10：acaagaggcgaacgcacgac；
SEQ ID NO.11：cacgttagactcagaggaga；
SEQ ID NO.12：caaccgaaaatgctccagtc；
SEQ ID NO.13：agggtcctcaaacagatcag；
SEQ ID NO.14：gccaagaggctaaagttgga；
SEQ ID NO.15：accaacacaactacgctgct；
SEQ ID NO.16：aagcggtgtcacgtcaacat；
SEQ ID NO.17：atcagaggagcactgtaagc；
SEQ ID NO.18：aacgagtctgaatccagcac；
SEQ ID NO.19：tcgatgtcgttacattagct；
SEQ ID NO.20：gcagcgactcggaagaagaa。
一种分析ch-MYC-AS1与目标蛋白共定位的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)细胞培养；
(2)对经步骤(1)培养后的细胞进行反义RNA ch-MYC-AS1FISH探针检测：包括细胞固定、细胞通透和ch-MYC-AS1FISH探针(SEQ ID NO.1-20)检测，SEQ ID NO.1-20分别为：
SEQ ID NO.1：gtgcataggaactcttggac；
SEQ ID NO.2：cacaaccttgagcagctaag；
SEQ ID NO.3：gcggaggagagaacagttga；
SEQ ID NO.4：tcgcagagaaagagcagttg；
SEQ ID NO.5：caatcggacgagcacagact；
SEQ ID NO.6：cacggagtacgttctgtcta；
SEQ ID NO.7：ccaaggttgtcatcctgaaa；
SEQ ID NO.8：ggtggccaacaacgagaagg；
SEQ ID NO.9：tgaagctgagattctttgcc；
SEQ ID NO.10：acaagaggcgaacgcacgac；
SEQ ID NO.11：cacgttagactcagaggaga；
SEQ ID NO.12：caaccgaaaatgctccagtc；
SEQ ID NO.13：agggtcctcaaacagatcag；
SEQ ID NO.14：gccaagaggctaaagttgga；
SEQ ID NO.15：accaacacaactacgctgct；
SEQ ID NO.16：aagcggtgtcacgtcaacat；
SEQ ID NO.17：atcagaggagcactgtaagc；
SEQ ID NO.18：aacgagtctgaatccagcac；
SEQ ID NO.19：tcgatgtcgttacattagct；
SEQ ID NO.20：gcagcgactcggaagaagaa；
(3)细胞二次固定：加入4％多聚甲醛室温固定20分钟；PBS洗涤三次，每次5分钟；
(4)细胞二次通透：加入0.5％Triton X-100室温通透15分钟；PBS洗涤三次，每次5分钟；
(5)封闭：加入2％BSA室温封闭30分钟；PBS洗涤三次，每次5分钟；
(6)一抗孵育：加入稀释至工作浓度的目标蛋白，37℃孵育1小时；PBS洗涤三次，每次5分钟；
(7)二抗孵育：避光条件下加入稀释至工作浓度Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG，37℃孵育40分钟；PBS洗涤三次，每次5分钟；
(8)DAPI染色：避光条件下加入DAPI染色液染色10分钟；PBS洗涤三次，每次5分钟；
(9)封片：避光条件下，从孔中小心取出细胞爬片，用封片剂将其固定于载玻片上；
(10)共聚焦显微镜检测：使用Leica SP8共聚焦显微镜进行观察拍照。
步骤(9)中，所述封片剂为指甲油。
通过本发明，提供了一种反义RNA ch-MYC-AS1荧光原位杂交(Fluorescence insitu hybridization，FISH)检测引物、试剂盒，同时，还提供一种分析ch-MYC-AS1与HuR蛋白共定位的方法，为研究ch-MYC-AS1的作用机制提供了研究基础。
一种反义RNA ch-MYC-AS1的FISH检测探针组，所述探针组由序列为SEQ ID NO.1-20所示的20条探针组成。
本发明还公开了所述探针组在制备反义RNA ch-MYC-AS1的FISH检测试剂盒中的应用。
一种反义RNA ch-MYC-AS1的FISH检测试剂盒，包括FISH探针、杂交液和染色液；其特征在于，所述探针序列如SEQ ID NO.1-20所示。
本发明提供反义RNA ch-MYC-AS1 FISH检测试剂盒的应用，即分析ch-MYC-AS1与目标蛋白的共定位情况，其特征在于，包括如下步骤：
(1)细胞培养。
(2)反义RNA ch-MYC-AS1 FISH探针检测。具体包括细胞固定、细胞通透和ch-MYC-AS1探针检测。
(3)细胞二次固定。加入4％多聚甲醛室温固定20分钟；PBS洗涤三次，每次5分钟。
(4)细胞二次通透。加入0.5％Triton X-100室温通透15分钟；PBS洗涤三次，每次5分钟。
(5)封闭。加入2％BSA室温封闭30分钟；PBS洗涤三次，每次5分钟。
(6)一抗孵育。加入稀释至工作浓度目标蛋白，37℃孵育1小时；PBS洗涤三次，每次5分钟。
(7)二抗孵育。避光条件下加入稀释至工作浓度Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG，37℃孵育40分钟；PBS洗涤三次，每次5分钟。
(8)DAPI染色。避光条件下加入DAPI染色液染色10分钟；PBS洗涤三次，每次5分钟。
(9)封片。避光条件下，从孔中小心取出细胞爬片，用封片剂(如指甲油)将其固定于载玻片上。
(10)共聚焦显微镜检测。使用Leica SP8共聚焦显微镜进行观察拍照。
本发明的实施方案提供上述探针引物在制备ch-MYC-AS1FISH定位和共定位检测试剂盒中的应用。一个实例中目标蛋白采用HuR蛋白抗体进行说明，但其他蛋白也同样可适用于本发明。
本研究发明不仅提供了ch-MYC-AS1 FISH检测手段，也为ch-MYC-AS1作用机制研究提供了方法基础。
附图说明
图1是ch-MYC-AS1的FISH共定位结果图。
图2A是鸡原癌基因c-myc反义RNA ch-MYC-AS1的鉴定，ch-MYC-AS1在鸡2号染色体上的位置示意图；
图2B：是鸡原癌基因c-myc反义RNA ch-MYC-AS1的鉴定，ch-MYC-AS1 5′-RACE琼脂糖凝胶电泳图；
图2C是鸡原癌基因c-myc反义RNA ch-MYC-AS1的鉴定，ch-MYC-AS1 3′-RACE琼脂糖凝胶电泳图。
图3A是ch-MYC-AS1抑制原癌基因c-myc基因表达能力分析，RT-qPCR分析过表达ch-MYC-AS1对原癌基因c-myc基因表达的影响；
图3B是ch-MYC-AS1抑制原癌基因c-myc基因表达能力分析，Western-blot分析过表达ch-MYC-AS1对原癌基因c-myc基因表达的影响。
图4A是ch-MYC-AS1抑制J亚群禽白血病病毒增殖能力分析，ELISA分析过表达ch-MYC-AS1对J亚群禽白血病病毒增殖的影响；
图4B是ch-MYC-AS1抑制J亚群禽白血病病毒增殖能力分析，TCID50分析过表达ch-MYC-AS1对J亚群禽白血病病毒增殖的影响；
图4C是ch-MYC-AS1抑制J亚群禽白血病病毒增殖能力分析，RT-qPCR分析过表达ch-MYC-AS1对J亚群禽白血病病毒增殖的影响；
图4D是ch-MYC-AS1抑制J亚群禽白血病病毒增殖能力分析，Western-blot分析过表达ch-MYC-AS1对J亚群禽白血病病毒增殖的影响。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明使用的HuR蛋白抗体购自Abcam公司，货号：ab200342。
实施例1 ch-MYC-AS1全长序列的测定。
(1)鉴定ch-MYC-AS1的5′和3′末端序列；
主要由Takara公司提供的
Figure GDA0003888088450000061
RACE 5’/3’Kit试剂盒来完成。
首先，用
Figure GDA0003888088450000062
Reagent提取鸡巨噬细胞系HD11总RNA，然后用RNase-freeDNase I去除基因组。在SMARTScribeReverse Transcriptase(试剂盒提供)的作用下分别将1μg去除基因组的RNA逆转录合成5′-或3′-RACE产物。
然后，按照
Figure GDA0003888088450000063
RACE 5’/3’Kit试剂盒的操作说明，利用通用引物UPM分别与5′-末端或3′-末端基因特异性引物(gene-specific primer，GSP)进行PCR扩增(RACE琼脂糖凝胶电泳图见图2B、图2C)，克隆测序获得ch-MYC-AS1的5′末端和3′末端序列。其中，所用5′-末端或3′-末端基因特异性引物的核苷酸序列如下：
ch-MYC-AS1-5-race：
5′-TCAGAGGAGAACGACAAGAGGCGAACG-3′(SEQ ID NO.6)
ch-MYC-AS1-3-race：
5′-TCCTCCGCCTCAACTGCTCTTTCTCTG-3′(SEQ ID NO.7)。
(2)常规PCR扩增ch-MYC-AS1产物。其中，所用引物ch-MYC-AS1-F和ch-MYC-AS1-R的核苷酸序列如下：
ch-MYC-AS1-F：5′-GATTCTAAGTGATGTCCAAG-3′(SEQ ID NO.2)
ch-MYC-AS1-R：5′-TTTTTCTTCCGACACGCC-3′(SEQ ID NO.3)
其反应体系包括：100ng鸡胚成纤维细胞cDNA产物作为模板，1μL(10μM)上游引物ch-MYC-AS1-F与1μL(10μM)ch-MYC-AS1-R分别作为扩增引物，1μL DNA Polymerase，10μL5x SF Buffer，1μL(10μM)dNTP Mix和32μL ddH2O。
其反应条件为：95℃3min；95℃15s，58℃90s，72℃1min，35x循环；72℃7min；4℃维持。
(3)TA克隆测序获得ch-MYC-AS1的全长cDNA序列，该序列在鸡2号染色体上的位置示意图见图2A。
实施例2 ch-MYC-AS1过表达载体构建。
本实施例2中，使用从实施例1中所获得的ch-MYC-AS1全长序列，构建ch-MYC-AS1过表达质粒。
具体包括如下步骤：
(1)从鸡巨噬细胞系HD11中，使用
Figure GDA0003888088450000071
Reagent提取总RNA，然后用RNase-freeDNase I去除基因组。使用PrimeScript RT reagent Kit试剂盒将其逆转录成cDNA产物。
(2)以实施例2步骤(1)所获得的cDNA产物为模板，使用高保真酶扩增ch-MYC-AS1全长序列，其中，所用引物ch-MYC-AS1-HindIII-F和ch-MYC-AS1-BamHI-R的核苷酸序列如下：
ch-MYC-AS1-HindIII-F:
5′-cccaagcttGATTCTAAGTGATGTCCAAG-3′(SEQ ID NO.4)
ch-MYC-AS1-BamHI-R:
5′-cgcggatccTTTTTCTTCCGACACGCC-3′(SEQ ID NO.5)
其反应体系包括：100ng实施例2步骤(1)所获得的cDNA产物作为模板，1μL(10μM)上游引物ch-MYC-AS1-HindIII-F与1μL(10μM)ch-MYC-AS1-BamHI-R分别作为扩增引物，1μLDNA Polymerase，10μL 5x SF Buffer，1μL(10μM)dNTP Mix和32μL ddH2O。
其反应条件为：95℃3min；95℃15s，58℃90s，72℃1min，35x循环；72℃7min；4℃维持。
(3)以实施例2步骤(2)中PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后切胶回收产物并连接至T载体进行克隆测序。测序正确的阳性克隆质粒与pcDNA3.1(+)(Invitrogen)过表达质粒载体分别用HindIII和-BamHI酶切。最后，酶切回收的ch-MYC-AS1目的片段DNA和pcDNA3.1(+)载体DNA用T4 DNA ligase进行连接，连接产物直接转化大肠杆菌。重组子经PCR、酶切和克隆测序鉴定正确后，命名为pcDNA3.1-ch-MYC-AS1。
实施例3 ch-MYC-AS1抑制原癌基因c-myc基因表达能力分析。
本实施例3中，使用从实施例2中所获得的pcDNA3.1-ch-MYC-AS1过表达质粒，通过荧光定量PCR和Western-blot方法评估了ch-MYC-AS1抑制鸡原癌基因c-myc基因表达能力。
具体包括如下步骤：
(1)将鸡巨噬细胞系HD11细胞接种至6孔细胞培养板，然后转染pcDNA3.1-ch-MYC-AS1过表达质粒。同时转染GFP过表达质粒作为载体对照。
(2)转染后48小时，收集细胞；
(3)提取总RNA，使用荧光定量PCR方法检测原癌基因c-myc表达水平。
(4)提取总蛋白，Western-blot分析原癌基因c-myc蛋白表达水平。将pcDNA3.1-ch-MYC-AS1和GFP过表达质粒转染后的细胞裂解液进行SDS-PAGE,然后按照Western-blot操作步骤转移到硝酸纤维素膜，5％脱脂乳封闭后分别加入鸡c-MYC抗体和HRP标记的山羊抗鼠IgG进行孵育，观察结果。
通过荧光定量PCR和Western-blot分析，我们观察到ch-MYC-AS1可以显著抑制原癌基因c-myc表达(图3A、图3B)。
实施例4 ch-MYC-AS1抗J亚群禽白血病病毒增殖能力分析。
本实施例4中，使用从实施例2中所获得的pcDNA3.1-ch-MYC-AS1过表达质粒，通过ELISA、TCID50、荧光定量PCR和Western-blot方法评估了ch-MYC-AS1抗J亚群禽白血病病毒增殖能力。
具体包括如下步骤：
(1)将鸡巨噬细胞系HD11接种至6孔细胞培养板，然后感染J亚群禽白血病病毒(J亚群禽白血病病毒毒株JS09GY3，GenBank accession number GU982308)。
(2)病毒感染后4小时后转染ch-MYC-AS1过表达质粒；同时转染GFP过表达质粒作为载体对照。
(3)转染后48小时，收集上清，使用IDEXX禽白血病抗原检测试剂盒检测J亚群禽白血病病毒p27蛋白表达水平。
(4)转染后48小时，收集细胞和上清，使用TCID50方法测定J亚群禽白血病病毒滴度。
(5)转染后48小时，收集细胞，分别提取总RNA和蛋白，使用荧光定量PCR和Western-blot检测J亚群禽白血病病毒env基因mRNA和蛋白表达水平
通过ELISA、TCID50、荧光定量PCR和Western-blot实验，我们观察到ch-MYC-AS1可以显著抑制J亚群禽白血病病毒增殖(图4A、图4B、图4C、图4D)。
实施例5 ch-MYC-AS1共定位分析。
(1)细胞培养。
将细胞爬片置于24孔细胞培养板孔底，培养适量细胞(～6X104/孔)。实验前使细胞融合度达到60％-70％。注：爬片与底板间不要产生气泡；
(2)细胞固定；
(3)细胞通透；加入0.5％Triton X-100室温通透15分钟，PBS洗涤三次；
(4)探针检测；首先通过
Figure GDA0003888088450000091
Probe Designer version 4.2软件设计反义RNA ch-MYC-AS1探针，然后由广州锐博生物科技有限公司合成，探针序列如下：
探针1：gtgcataggaactcttggac(SEQ ID NO.1)
探针2：cacaaccttgagcagctaag(SEQ ID NO.2)
探针3：gcggaggagagaacagttga(SEQ ID NO.3)
探针4：tcgcagagaaagagcagttg(SEQ ID NO.4)
探针5：caatcggacgagcacagact(SEQ ID NO.5)
探针6：cacggagtacgttctgtcta(SEQ ID NO.6)
探针7：ccaaggttgtcatcctgaaa(SEQ ID NO.7)
探针8：ggtggccaacaacgagaagg(SEQ ID NO.8)
探针9：tgaagctgagattctttgcc(SEQ ID NO.9)
探针10：acaagaggcgaacgcacgac(SEQ ID NO.10)
探针11：cacgttagactcagaggaga(SEQ ID NO.11)
探针12：caaccgaaaatgctccagtc(SEQ ID NO.12)
探针13：agggtcctcaaacagatcag(SEQ ID NO.13)
探针14：gccaagaggctaaagttgga(SEQ ID NO.14)
探针15：accaacacaactacgctgct(SEQ ID NO.15)
探针16：aagcggtgtcacgtcaacat(SEQ ID NO.16)
探针17：atcagaggagcactgtaagc(SEQ ID NO.17)
探针18：aacgagtctgaatccagcac(SEQ ID NO.18)
探针19：tcgatgtcgttacattagct(SEQ ID NO.19)
探针20：gcagcgactcggaagaagaa(SEQ ID NO.20)
探针检测步骤如下：
a)每孔加入200uL预杂交液，37℃封闭30分钟；
b)预杂交同时，将杂交液在37℃中预热；
c)避光条件下，把2.5uL 20uM ch-MYC-AS1 FISH Probe Mix储存液加入到杂交液中；
d)弃去每孔细胞中的预杂交液，加入适量含有ch-MYC-AS1探针的探针杂交液，避光，37℃杂交过夜；
e)避光，42℃，洗液I(4X SSC，0.1％Tween-20)清洗每孔细胞3次，每次5分钟，以降低背景信号；
f)避光，42℃，(2X SSC)清洗细胞1次；
g)避光，42℃，(1X SSC)清洗细胞1次；
h)避光，1X PBS清洗细胞，室温5min；
(5)细胞二次固定。加入4％多聚甲醛室温固定20分钟；PBS洗涤三次，每次5分钟。
(6)细胞二次通透。加入0.5％Triton X-100室温通透15分钟；PBS洗涤三次，每次5分钟。
(7)封闭。加入2％BSA室温封闭30分钟；PBS洗涤三次，每次5分钟。
(8)一抗孵育。加入稀释至工作浓度的鸡TLR3抗体，37℃孵育1小时；PBS洗涤三次，每次5分钟。
(9)二抗孵育。避光条件下加入稀释至工作浓度Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG，37℃孵育40分钟；PBS洗涤三次，每次5分钟。
(10)DAPI染色。避光条件下加入DAPI染色液染色10分钟；PBS洗涤三次，每次5分钟。
(11)封片。避光条件下，从孔中小心取出细胞爬片，用封片剂(如指甲油)将其固定于载玻片上。
(12)共聚焦显微镜检测。使用Leica SP8共聚焦显微镜进行观察拍照。结果如图1所示，ch-MYC-AS1与HuR蛋白在细胞核内存在共定位，说明ch-MYC-AS1 FISH检测试剂盒可应用于ch-MYC-AS1与蛋白的共定位分析。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 反义RNAch-MYC-AS1的FISH检测引物、试剂盒
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 1
gtgcatagga actcttggac 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 2
cacaaccttg agcagctaag 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 3
gcggaggaga gaacagttga 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 4
tcgcagagaa agagcagttg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 5
caatcggacg agcacagact 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 6
cacggagtac gttctgtcta 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 7
ccaaggttgt catcctgaaa 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 8
ggtggccaac aacgagaagg 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 9
tgaagctgag attctttgcc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 10
acaagaggcg aacgcacgac 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 11
cacgttagac tcagaggaga 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 12
caaccgaaaa tgctccagtc 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 13
agggtcctca aacagatcag 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 14
gccaagaggc taaagttgga 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 15
accaacacaa ctacgctgct 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 16
aagcggtgtc acgtcaacat 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 17
atcagaggag cactgtaagc 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 18
aacgagtctg aatccagcac 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 19
tcgatgtcgt tacattagct 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 20
gcagcgactc ggaagaagaa 20

Claims (3)

1.一种反义RNA ch-MYC-AS1的FISH检测探针组，其特征在于，反义RNA ch-MYC-AS1的cDNA序列通过以下方法获得：
(1)鉴定ch-MYC-AS1的5′和3′末端序列；
由Takara公司提供的
Figure FDA0003906861150000011
RACE 5’/3’Kit试剂盒来完成；
首先，用
Figure FDA0003906861150000012
Reagent提取鸡巨噬细胞系HD11总RNA，然后用RNase-free DNase I去除基因组；在试剂盒提供的SMARTScribeReverse Transcriptase的作用下分别将1μg去除基因组的RNA逆转录合成5′-或3′-RACE产物；
然后，按照
Figure FDA0003906861150000013
RACE 5’/3’Kit试剂盒的操作说明，利用通用引物UPM分别与5′-末端或3′-末端基因特异性引物gene-specific primer进行PCR扩增，克隆测序获得ch-MYC-AS1的5′末端和3′末端序列；其中，所用5′-末端或3′-末端基因特异性引物的核苷酸序列如下：
ch-MYC-AS1-5-race：
5′-TCAGAGGAGAACGACAAGAGGCGAACG-3′
ch-MYC-AS1-3-race：
5′-TCCTCCGCCTCAACTGCTCTTTCTCTG-3′
(2)常规PCR扩增ch-MYC-AS1产物；其中，所用引物ch-MYC-AS1-F和ch-MYC-AS1-R的核苷酸序列如下：
ch-MYC-AS1-F：5′-GATTCTAAGTGATGTCCAAG-3′
ch-MYC-AS1-R：5′-TTTTTCTTCCGACACGCC-3′
其反应体系包括：100ng鸡胚成纤维细胞cDNA产物作为模板，1μL上游引物ch-MYC-AS1-F与1μL ch-MYC-AS1-R分别作为扩增引物，1μL DNA Polymerase，10μL 5x SF Buffer，1μLdNTP Mix和32μL ddH2O；
其反应条件为：95℃3min；95℃15s，58℃90s，72℃1min，35x循环；72℃7min；4℃维持；
(3)TA克隆测序获得ch-MYC-AS1的全长cDNA序列；
所述探针组由序列为SEQ ID NO.1-20所示的20条探针组成；其中：
SEQ ID NO.1：gtgcataggaactcttggac；
SEQ ID NO.2：cacaaccttgagcagctaag；
SEQ ID NO.3：gcggaggagagaacagttga；
SEQ ID NO.4：tcgcagagaaagagcagttg；
SEQ ID NO.5：caatcggacgagcacagact；
SEQ ID NO.6：cacggagtacgttctgtcta；
SEQ ID NO.7：ccaaggttgtcatcctgaaa；
SEQ ID NO.8：ggtggccaacaacgagaagg；
SEQ ID NO.9：tgaagctgagattctttgcc；
SEQ ID NO.10：acaagaggcgaacgcacgac；
SEQ ID NO.11：cacgttagactcagaggaga；
SEQ ID NO.12：caaccgaaaatgctccagtc；
SEQ ID NO.13：agggtcctcaaacagatcag；
SEQ ID NO.14：gccaagaggctaaagttgga；
SEQ ID NO.15：accaacacaactacgctgct；
SEQ ID NO.16：aagcggtgtcacgtcaacat；
SEQ ID NO.17：atcagaggagcactgtaagc；
SEQ ID NO.18：aacgagtctgaatccagcac；
SEQ ID NO.19：tcgatgtcgttacattagct；
SEQ ID NO.20：gcagcgactcggaagaagaa。
2.利用权利要求1所述的反义RNA ch-MYC-AS1的FISH检测探针组在制备反义RNA ch-MYC-AS1的FISH检测试剂盒中的应用。
3.一种反义RNA ch-MYC-AS1的FISH检测试剂盒，包括FISH探针、杂交液和染色液；其特征在于，所述FISH探针序列如SEQ ID NO.1-20示，分别为：
SEQ ID NO.1：gtgcataggaactcttggac；
SEQ ID NO.2：cacaaccttgagcagctaag；
SEQ ID NO.3：gcggaggagagaacagttga；
SEQ ID NO.4：tcgcagagaaagagcagttg；
SEQ ID NO.5：caatcggacgagcacagact；
SEQ ID NO.6：cacggagtacgttctgtcta；
SEQ ID NO.7：ccaaggttgtcatcctgaaa；
SEQ ID NO.8：ggtggccaacaacgagaagg；
SEQ ID NO.9：tgaagctgagattctttgcc；
SEQ ID NO.10：acaagaggcgaacgcacgac；
SEQ ID NO.11：cacgttagactcagaggaga；
SEQ ID NO.12：caaccgaaaatgctccagtc；
SEQ ID NO.13：agggtcctcaaacagatcag；
SEQ ID NO.14：gccaagaggctaaagttgga；
SEQ ID NO.15：accaacacaactacgctgct；
SEQ ID NO.16：aagcggtgtcacgtcaacat；
SEQ ID NO.17：atcagaggagcactgtaagc；
SEQ ID NO.18：aacgagtctgaatccagcac；
SEQ ID NO.19：tcgatgtcgttacattagct；
SEQ ID NO.20：gcagcgactcggaagaagaa。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Characterization of Basal and Estrogen-Regulated Antisense Transcription in Breast Cancer Cells: Role in Regulating Sense Transcription;Tim Y. Hou等;《 Molecular and Cellular Endocrinology》;20200229;第1-39页 *
内源性反转录病毒衍生的长非编码RNA的功能;胡序明等;《生命科学》;20160630;第28卷(第6期);第695-702页 *

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