CN103088165A - 一种快速鉴定鸭病毒性肝炎病毒血清型的多重rt-pcr方法 - Google Patents

一种快速鉴定鸭病毒性肝炎病毒血清型的多重rt-pcr方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种快速鉴定鸭病毒性肝炎病毒血清型的多重RT-PCR方法，是分别合成鸭甲肝病毒1型特异性引物SEQ1和SEQ2，鸭甲肝病毒3型特异性引物SEQ3和SEQ4，鸭星状病毒1型特异性引物SEQ5和SEQ6，以待检样品RNA为模板，以SEQ1、SEQ3和SEQ5为引物反转录获得病毒cDNA，以上述三组引物为多重引物，以病毒cDNA为模板，在同一反应体系中进行PCR反应，可同时完成对鸭甲肝病毒1型、鸭甲肝病毒3型和鸭星状病毒1型的快速血清型鉴定。本发明根据RT-PCR技术原理，根据鸭病毒性肝炎病毒基因型与血清型相对应和我国大陆地区目前存在的3种鸭病毒性肝炎病毒的特点，建立了多重RT-PCR检测方法，其简单、快速、特异性好、灵敏度高，可以用于鸭病毒性肝炎病毒的快速血清型鉴定。

Description

一种快速鉴定鸭病毒性肝炎病毒血清型的多重RT-PCR方法
（一）技术领域
本发明所涉及的是一种快速鉴定鸭病毒性肝炎病毒血清型的多重RT-PCR方法，属于病毒分子生物学领域。 
（二）背景技术
鸭肝炎病毒包括鸭甲肝病毒(DuckhepatitisAvirus,DHAV)、鸭星状病毒(Duck astrovirus,DAstV)1型(DAstV-1)和2型(DAstV-2)3个不同的血清型，相互之间无抗原交叉性。DHAV作为小RNA病毒科禽肝病毒属的唯一成员，目前又分为三个基因型和血清型：DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3，三个血清型之间几乎无交叉保护。近年来，我国鸭病毒性肝炎的病原日趋复杂化，研究表明目前至少存在DHAV-1、DHAV-3和DAstV-1三种血清型的鸭肝炎病毒，导致许多地区针对某型鸭病毒性肝炎采取主动或被动免疫后仍不能有效控制鸭病毒性肝炎的发生和流行，给养鸭业生产造成严重的经济损失。 
目前鸭病毒性肝炎的鉴定主要依靠流行病学调查、临床症状和病理变化，但不同鸭肝炎病毒引起的鸭病毒性肝炎在流行病学、临床症状和病理变化方面极为相似，特别是两种或多种病毒混合感染时，依靠上述方法和手段难以确定病毒类型。有效控制鸭病毒性肝炎的关键是要明确鸭肝炎病毒的血清型，因此，加强鸭病毒性肝炎病毒不同血清型鉴定技术的研究对预防和控制鸭病毒性肝炎具有重要的现实意义。传统的病毒血清型鉴定需要分离培养获得纯化的病毒，通过单因子血清进行鉴定，这种方法费事费力，对于多重感染的鉴定难以进行。多重PCR方法在检测多种病原微生物感染时具有省时省力、简单快速、敏感、特异的优点，已在多种病毒的鉴定与检测中得到了广泛应用，但PCR方法鉴定的基础是依据病原的基因型来进行的。目前的研究表明，不同鸭病毒性肝炎病毒的基因型与血清型相对应，因此可以通过基因型的检测来完成对鸭肝炎病毒血清型的鉴定。目前我国鸭群中DHAV-1，DHAV-3和DAstV-1的单重及混合感染现象非常普遍，尚没有一种可以一次反应快速鉴定这三种鸭病毒性肝炎病毒血清型的方法。 
（三）发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种快速鉴定鸭病毒性肝炎病毒血清型的多重RT-PCR方法，本发明设计并筛选了新的特异性引物，优化了反应过程中的各种参数，建立的针对鸭病毒性肝炎病毒的多重RT-PCR分型方法特异性强、敏感性高，可以快速准确地进行DHAV-1，DHAV-3和DAstV-1的血清型鉴定。 
一种快速鉴定鸭病毒性肝炎病毒血清型的多重RT-PCR方法，包括以下步骤： 
A、对GenBank上已发表的DHAV-1，DHAV-3和DAstV-1的序列进行比对，在三种病毒基因序列的保守区，分别设计一对针对DHAV-1的特异性引物SEQ1和SEQ2，一对针对DHAV-3的特异性引物SEQ3和SEQ4，和一对针对DAstV-1的特异性引物SEQ5和SEQ6， 
SEQ1：5’-GATGTGGCAY(T/C)GTTGTY(T/C)AAY(T/C)CGA-3’， 
SEQ2：5’-CTGATGTD(G/A/T)CCAGGR(A/G)ATTGGTCG-3’， 
SEQ3：5’-GAGCCAGAATTGGAATGGACACA-3’， 
SEQ4：5’-CATACTTR(G/A)CCACCAACTGCCAATC-3’， 
SEQ5：5’-ATGGCCCAGAGCGGTGAAAA-3’， 
SEQ6：5’-GCCAGGTGTCAACAATCATGC-3’ 
所有引物以无菌ddH2O（Rnase free）配成25pmol/μl的浓度备用。 
B、常规方法提取待测鸭肝组织总RNA作为模板，进行反转录反应。反应体系为：模板RNA3μl，SEQ1、SEQ3和SEQ5引物各1μl，5×M-MLV Buffer2μl，dNTPs（10.0mM）0.5μl，Rnase Inhibition0.25μl，RTase M-MLV(5U/μl)0.5μl，ddH2O（Rnase free）0.75μl。反应程序为：42℃保存60min，70℃15min，获得病毒cDNA。 
C、以病毒cDNA为模板进行PCR反应。反应体系为：32.5μl ddH2O（Rnase free），5μl10×Buffer，3μl dNTPs（10.0mM），SEQ1和SEQ2各0.8μl，SEQ3和SEQ4各1.0μl，SEQ5和SEQ6各1.2μl，3μl cDNA模板，0.5μl Taq酶。PCR反应条件为：95°C5min；95°C50s，62°C50s，72°C1min10s，35个循环；72°C10min。 
D、对步骤C得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测： 
如果从样品中只扩增出了570bp的产物，则该样品含有DHAV-1阳性；如果从样品中只扩增出了1099bp的产物，则该样品含有DHAV-3；如果从样品中只扩增出了898bp的产物，则该样品含有DAstV-1；如果同时扩增出了570bp和1099bp的产物，则该样品中含有DHAV-1和DHAV-3；如果同时扩增出了570bp和898bp的产物，则该样品中含有DHAV-1和DAstV-1；如果同时扩增出了898bp和1099bp的产物，则该样品中含有DAstV-1和DHAV-3；如果同时扩增出了570bp、898bp和1099bp的产物，则该样品中含有DHAV-1，DHAV-3和DAstV-1；如果未扩增出了570bp、898bp和1099bp的产物，则该样品不含有DHAV-1，DHAV-3和DAstV-1。 
本发明的多重RT-PCR方法最低可检测到10pg的组织总RNA和102个拷贝DHAV-1，DHAV-3和DAstV-1的病毒RNA，表明本方法具有很高的灵敏性。 
用本发明建立的多重RT-PCR方法对山东、河南、四川、广东四个省12个鸭场送检的48只分离到DHAV-1、DHAV-3或/和DAstV-1的雏鸭肝组织进行检测，结果发现所有样品的检测结果与病毒分离培养的检测结果符合率为100%，说明本发明建立的多重RT-PCR方法适合于鸭病毒性肝炎病毒的血清型鉴定。由于本方法可以通过一次RT-PCR反应完成对DHAV-1，DHAV-3和DAstV-1的血清型鉴定，可快速鉴定鸭病毒性肝炎病毒血清型。 
（四）附图说明
附图1单重RT-PCR的特异性检测结果 
M,DL5000；1-4,用引物SEQ1和SEQ2分别扩增DHAV-1感染鸭，DHAV-3感染鸭，DAstV-1感染鸭， 健康鸭肝组织RNA；5-8,用引物SEQ3和SEQ4分别扩增DHAV-3感染鸭，DHAV-1感染鸭，DAstV-1感染鸭，健康鸭肝组织RNA；9-12,用引物SEQ5和SEQ6分别扩增DAstV-1感染鸭，DHAV-1感染鸭，DHAV-3感染鸭，健康鸭肝组织RNA 
附图2多重RT-PCR的特异性检测结果 
M,DL2000；1,DHAV-1,DHAV-3,DAstV-1；2,DHAV-1,DHAV-3；3,DHAV-1,DAstV-1；4,DHAV-3,DAstV-1；5,DHAV-1；6,DHAV-3；7,DAstV-1；8,AIV；9,NDV；10,DEV；11,DuCV；12,RA；13,E.coli；14,阴性对照 
附图3多重RT-PCR针对DHVs感染鸭肝脏总RNA的敏感性检测结果 
M,DL2000；1-7,分别为1μg-1pg感染鸭肝组织RNA 
附图4多重RT-PCR针对DHVs模板RNA的敏感性检测结果 
M,DL2000；1-10,分别为1010-101拷贝的模板RNA 
（五）具体实施方式
1引物设计 
本发明通过对参考GenBank上已发表的DHAV-1，DHAV-3和DAstV-1的序列进行比对，选择在这三种病毒基因序列的保守区，分别设计一对针对DHAV-1的特异性引物SEQ1/SEQ2，一对针对DHAV-3的特异性引物SEQ3/SEQ4，和一对针对DAstV-1的特异性引物SEQ5/SEQ6，利用常规方法对三种病毒样品进行扩增。 
SEQ1：5’-GATGTGGCAY(T/C)GTTGTY(T/C)AAY(T/C)CGA-3’， 
SEQ2：5’-CTGATGTD(G/A/T)CCAGGR(A/G)ATTGGTCG-3’， 
SEQ3：5’-GAGCCAGAATTGGAATGGACACA-3’， 
SEQ4：5’-CATACTTR(G/A)CCACCAACTGCCAATC-3’， 
SEQ5：5’-ATGGCCCAGAGCGGTGAAAA-3’， 
SEQ6：5’-GCCAGGTGTCAACAATCATGC-3’。 
DHAV-1引物扩增片段大小为570bp，DHAV-3引物扩增片段大小为1099bp，DAstV-1引物扩增片段大小为898bp。所有引物以无菌ddH2O（Rnase free）配成25pmol/μl的浓度备用。 
2RNA提取 
使用常规方法提取DHAV感染雏鸭肝组织的总RNA。 
3单一RT-PCR 
（1）反转录（RT）：反应总体积为10μl，其中包括上述模板RNA3μl，SEQ1、SEQ3和SEQ5引物各1μl，5×M-MLV Bufferμl，dNTP Mixture（10.0mM）0.5μl，Rnase Inhibition0.25μl，RTase M-MLV(5U/μl)0.5μl，ddH2O（Rnase free）0.75μl。 
反应程序为：42℃保存60min，70℃15min，得到的cDNA4℃保存备用。 
（2）单重PCR：反应总体系为50μl，包括37.5μl ddH2O（Rnase free），5μl10×PCR Buffer，3μl dNTPs（10.0mM），DHAV-1、DHAV-3或DAstV-1上下游引物各1.0μl，2μl cDNA模板，0.5μl Taq酶。PCR反应程序为：95°C5min；95°C50s，62°C50s，72°C40s，30个循环；72°C10min。 
（3）分别用设计的DHAV-1，DHAV-3和DAstV-1引物对DHAV-1阳性、DHAV-3阳性和DAstV-1阳性和阴性病料进行单重PCR扩增，以检测引物的特异性。对单重PCR产物进行电泳，结果表明，设计的三对引物只能分别针对DHAV-1，DHAV-3和DAstV-1进行特异性扩增（见图1）。 
4多重RT-PCR条件的优化 
在单重RT-PCR的基础上，对引物、dNTPs、Buffer的浓度，及退火温度等参数进行优化，得到多重RT-PCR最佳反应体系和反应程序。 
（1）反转录：反应总体积为10μl，其中包括待测样品组织RNA3μl，SEQ1、SEQ3和SEQ5引物各1μl，5×M-MLV Buffer2μl，dNTPs（10.0mM）0.5μl，Rnase Inhibition0.25μl，RTase M-MLV(5U/μl)0.5μl，ddH2O（Rnase free）0.75μl。反应程序为：42℃保存60min，70℃15min，得到病毒cDNA。 
（2）多重PCR：以上述得到的病毒cDNA为模板，反应总体积为50μl，最佳反应体系为：32.5μl ddH2O（Rnase free），5μl10×Buffer，3μl dNTPs，DHAV-1引物各0.8μl，DHAV-3引物各1.0μl，DAstV-1引物各1.2μl，3μl病毒cDNA模板，0.5μl Taq酶。 
PCR反应程序为：95°C5min；95°C50s，62°C50s，72°C1min10s，35个循环；72°C10min。 
5特异性试验 
以DHAV-1，DHAV-3和DAstV-1、DHAV-1和DHAV-3、DHAV-1和DAstV-1、DHAV-3和DAstV-1、DHAV-1、DHAV-3、DAstV-1、新城疫病毒（NDV）、禽流感病毒（AIV/H9）的cDNA，鸭瘟病毒(DVE)、鸭圆环病毒（DucV）的病毒DNA，鸭疫里默是杆菌（Ra）、大肠杆菌（E.coli）的菌株为模板分别用上述优化的条件进行多重PCR反应，同时用健康鸭肝提取的cDNA做阴性对照进行特异性试验。对多重PCR产物进行电泳，结果可知，建立的多重PCR方法只能针对DHAV-1、DHAV-3和DAstV-1进行特异性扩增，对其他家禽常发病的病原扩增为阴性，说明本发明可作为特异性鉴定DHAV-1、DHAV-3和DAstV-1的方法（见图2）。 
6敏感性试验 
以提取的待测样品组织病料的总RNA为模板进行单重和多重RT-PCR对每种病毒的检测灵敏度测定。用紫外分光光度计对含有DHAV-1、DHAV-3和DAstV-1目的片段的RNA模板进行260nm/280nmOD值的测定，计算出纯度和含量，将模板10倍梯度稀释，取每个稀释度的模板分别进行单重或多重RT-PCR反应。结果可知，该多重RT-PCR方法最低可检测到10pg的组织总RNA，与单重RT-PCR方法的检测灵敏度一致（见图3）。 
应用SP6启动子对扩增片段进行体外转录的方法获得纯RNA片段后，对RNA片段进行定量，计算出纯度和含量，将模板10倍梯度稀释，取每个稀释度分别进行多重RT-PCR反应。结果可知该RT-PCR方法最低可检测到102个拷贝的病毒RNA（见图4）。 
7临床样本检测 
用建立的多重RT-PCR方法对山东、河南、河北、江苏、四川、广东、福建7个省42个鸭场送检的108只分离到DHAV-1、DHAV-3或/和DAstV-1的雏鸭肝组织进行检测，结果发现所有样品的检测结果与病毒分离培养的检测结果符合率为100%，说明本发明建立的多重RT-PCR方法适合于鸭病毒性肝炎病毒的临床检测和血清型鉴定。 
本发明的优点 
本发明根据RT-PCR技术原理，根据鸭病毒性肝炎病毒基因型与血清型相对应以及我国大陆地区具有三种血清型鸭病毒性肝炎病毒的特点，建立了多重RT-PCR检测方法，其简单、快速、特异性好、灵敏度高，可以用于临床样品中鸭病毒性肝炎病毒的快速血清型鉴定。 

Claims (1)

1.一种快速鉴定鸭病毒性肝炎病毒血清型的多重RT-PCR方法，其特征在于包括以下步骤：
A、对GenBank上已发表的DHAV-1，DHAV-3和DAstV-1的序列进行比对，在三种病毒基因序列的保守区，分别设计一对针对DHAV-1的特异性引物SEQ1和SEQ2，一对针对DHAV-3的特异性引物SEQ3和SEQ4，和一对针对DAstV-1的特异性引物SEQ5和SEQ6，
SEQ1：5’-GATGTGGCAY(T/C)GTTGTY(T/C)AAY(T/C)CGA-3’，
SEQ2：5’-CTGATGTD(G/A/T)CCAGGR(A/G)ATTGGTCG-3’，
SEQ3：5’-GAGCCAGAATTGGAATGGACACA-3’，
SEQ4：5’-CATACTTR(G/A)CCACCAACTGCCAATC-3’，
SEQ5：5’-ATGGCCCAGAGCGGTGAAAA-3’，
SEQ6：5’-GCCAGGTGTCAACAATCATGC-3’
所有引物以无菌ddH2O配成25pmol/μl的浓度备用；
B、常规方法提取待测鸭肝组织总RNA作为模板，进行反转录反应；反应体系为：模板RNA3μl，SEQ1、SEQ3和SEQ5引物各1μl，5×M-MLV Buffer2μl，浓度为10.0mM dNTPs0.5μl，Rnase Inhibition 0.25μl，浓度为5U/μlRTase M-MLV0.5μl，ddH2O0.75μl；反应程序为：42℃保存60min，70℃15min，获得病毒cDNA；
C、以病毒cDNA为模板进行PCR反应；反应体系为：32.5μl ddH2O，5μl10×Buffer，浓度为10.0mM dNTPs3μl，SEQ1和SEQ2各0.8μl，SEQ3和SEQ4各1.0μl，SEQ5和SEQ6各1.2μl，3μl cDNA模板，0.5μl Taq酶；PCR反应条件为：95°C5min；95°C50s，62°C50s，72°C1min10s，35个循环；72°C10min；
D、对步骤C得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
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