CN102580116A - 一种鸭病毒性肝炎自杀性dna疫苗及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及动物病毒学与动物传染病学的技术领域，特别涉及一种鸭病毒性肝炎自杀性DNA疫苗及其构建方法和应用。本发明的鸭病毒性肝炎自杀性DNA疫苗，该疫苗由DHV-VP1基因和甲病毒复制子载体pSCA1组成，该DNA疫苗的构建包括如下步骤：DHV病毒总RNA的提取及纯化，设计特异性引物，通过RT-PCR扩增，克隆得到DHV-VP1的全长cDNA基因序列，最后将纯化后的VP1全长cDNA片段重组到甲病毒复制子载体pSCA1真核表达质粒中。与现有技术相比，本发明的疫苗所需的免疫剂量小，安全，高效；可随细胞凋亡而被机体清除，从而可避免DNA质粒可能整合到宿主细胞染色体或可能造成免疫耐受等隐患，且更长效，稳定，操作便捷。

Description

一种鸭病毒性肝炎自杀性DNA疫苗及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及动物病毒学与动物传染病学的技术领域，特别涉及一种鸭病毒性肝炎自杀性DNA疫苗及其构建方法和应用。

背景技术

鸭病毒性肝炎(Duck Viral Hepatitis，DVH)是由鸭病毒性肝炎病毒(DHV)引起的雏鸭的一种高度致死、快速传播的病毒性传染病。该病的特征是发病急、病程短、死亡率高。临床症状以痉挛、抽搐和角弓反张等神经症状为主要特征，病理变化主要以肝脏肿大和斑点出血为特征性病变。DHV分为三个血清型，即I型、II型和III型，三个血清型之间无交叉保护作用。I型DHV呈世界性分布，并常和其它病毒、细菌混合感染，对养鸭业的危害很严重，给养鸭业造成了巨大的经济损失，同时也是对养鸭业威胁最大的一种传染病。DHV-I结构蛋白为VP0、VP3、VP1构型，其中，结构蛋白中VP1位于衣壳表面，含有主要的抗原决定簇，包含了大多数能够与细胞受体相互作用的抗原表位，能够诱导宿主机体产生中和抗体，所以认为VP1与DHV的致病性有密切的关系。经试验证实，壳体蛋白含有多个β片层结构，与其相连的环形结构位于壳粒表面，这在免疫学中占有重要作用。

现有的DVH疫苗有DVH鸡胚化弱毒苗、DVH鸡胚化灭活苗和DVH鸭胚化灭活苗3种。通常认为弱毒苗的免疫效果要好于灭活苗，但是存在毒力返强的危险。与弱毒苗相比，灭活苗虽然安全，但是往往需要多次免疫接种，而且效果不稳定，还经常导致免疫失败。

Berglund等于1998年率先提出了以甲病毒复制子为基础的自杀性DNA疫苗(suicidal DNA vaccine)的设想，即利用自杀性DNA疫苗的甲病毒进入细胞后能表达出甲病毒的非结构蛋白(nSPs)，在nSPs的作用下，甲病毒基因组RNA进行高效复制，在此过程中产生大量的双链RNA(dsRNA)中间体，最终可使转染的细胞凋亡，基于甲病毒复制子的DNA疫苗可引起转染的细胞凋亡，也称自杀性DNA疫苗，它比传统DNA疫苗更安全，无整合到宿主染色体的潜在危险性。自杀性DNA疫苗可引起高水平的体液免疫和细胞免疫，且可打破免疫耐受。在甲病毒基因组高效复制同时，目的抗原在亚基因组启动子的调控下获得高效表达，从而可以较低的免疫剂量引起较强的免疫反应。

自杀性DNA疫苗的载体是以甲病毒复制子为基础的复制型DNA载体。病毒复制时结构基因拷贝数高达10⁵之多，因此可以利用亚基因组的启动子使外源基因获得高效表达。自杀性DNA疫苗由于其具有RNA复制子，大量复制可导致感染细胞的凋亡。该凋亡可能是复制型载体在表达外源基因的过程中产生双链RNA(dsRNA)复制中间体介入的结果。dsRNA能在细胞和体液免疫中起强大的辅助作用。后来，研究者将RNA复制子载体系统改造成以DNA为基础的、RNA聚合酶n依赖的系统。这种载体携带了甲病毒复制酶基因和外源基因的重组质粒DNA，缺失了病毒结构蛋白基因。它通过将人巨细胞病毒(CMV)早期增强子/启动子序列插入到SP6启动子的上游或替换SP6启动子启动转录。同时，在多克隆位点下游插入强转录终止信号SV40晚期聚A信号序列，正常终止转录。该质粒DNA转染宿主细胞后，利用宿主RNA聚合酶n在细胞核内转录，合成甲病毒复制酶，再合成亚基因组RNA及大量外源蛋白，从而大大提高表达效率。因此，从自杀性DNA疫苗的构建上我们可以看出其具有RNA疫苗和DNA疫苗的优点，能自主复制、大量表达。

甲病毒复制子载体表达效率高，在理论上，在4h内单个细胞内可产生20万个RNA拷贝，表达的外源蛋白可占细胞总蛋白的25％。甲病毒复制酶可在多种细胞中发挥作用，如哺乳动物细胞、禽类细胞、两栖类动物细胞和昆虫细胞等。RNA的复制在细胞浆内进行，是与宿主的复制系统分开的。甲病毒复制子载体的高表达效率、广泛的宿主细胞类型和独立的细胞浆复制系统等特性，很适合作为DNA疫苗。该类载体转染细胞后，其RNA复制酶可合成大量的双链RNA(dsRNA)，而dsRNA可诱导转染细胞凋亡，，因此称为自杀性DNA疫苗。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种鸭病毒性肝炎自杀性DNA疫苗，以解决现有技术中现有的DVH疫苗一般为弱毒苗或灭活苗，弱毒苗存在毒力返强的危险，而灭活苗往往需要多次免疫接种，而且效果不稳定，还经常导致免疫失败的技术性问题。

本发明的第二目的在于提供一种鸭病毒性肝炎自杀性DNA疫苗的构建方法。

本发明的第三目的在于提供一种鸭病毒性肝炎自杀性DNA疫苗在制备预防和治疗鸭病毒性肝炎药物中的应用。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种鸭病毒性肝炎自杀性DNA疫苗，该疫苗由DHV-VP1基因和甲病毒复制子载体pSCA1组成，所述DHV-VP1基因是DHV病毒的致病决定基因，其为DHV病毒基因中第2106至2819的核苷酸，具有如下所示的核苷酸序列：

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一种鸭病毒性肝炎自杀性DNA疫苗的构建方法，包括如下步骤：

1)DHV病毒总RNA的提取及纯化：将DHV ZJ08病毒株腿部肌注射两日龄的小鸭，待小鸭死亡后，取其肝脏制备研磨液，按常规方法提取DHV病毒总RNA；

2)设计特异性引物：根据DHV病毒VP1蛋白基因序列分析设计出一对特异性引物，在上游引物中引入Kozak序列：

VP1-F：5’-CGGGATCC _BamH I GCCACCATG _kozak序列GGTGATTCCAACCAGTT-3’，

VP1-R：5’-TCCCCCGGG _Sma ITTCAATTTCCAGATTGAGTTCAGA-3’；

3)通过反转录-聚合酶链式扩增方法，克隆得到DHV-VP1的全长cDNA基因序列；

4)将步骤3)扩增的VP1片段，利用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒纯化回收VP1 cDNA片段；

5)将VP1全长cDNA片段重组到甲病毒复制子载体pSCA1真核表达载体中，构建成鸭病毒性肝炎自杀性DNA疫苗——抗DHV的pSCA1-VP1DHV疫苗。

进一步地，步骤3)进一步包括：

在聚合酶链式反应中，反应程序为：95℃预变性5min，然后94℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min后，10℃终止反应，于1％琼脂糖凝胶电泳胶回收聚合酶链式反应产物。

一种鸭病毒性肝炎自杀性DNA疫苗在制备预防鸭病毒性肝炎药物中的应用。

一种鸭病毒性肝炎自杀性DNA疫苗在制备治疗鸭病毒性肝炎药物中的应用。

与现有技术相比，本发明有以下优点：

1、所需的免疫剂量小；

2、与现有的弱毒苗和灭活苗相比，本发明的自杀性DNA疫苗更加安全、高效；

3、本发明的自杀性DNA疫苗在动物体内一过性表达外源基因后，随细胞凋亡而被机体清除，从而可避免DNA质粒可能整合到宿主细胞染色体或可能造成免疫耐受等隐患；

4、本发明的自杀性DNA疫苗更长效，稳定，且操作便捷。

附图说明

图1为用RT-PCR方法扩增VP1基因的电泳检测图；

图2为pSCA1-VP1重组质粒酶切鉴定的电泳检测图；

图3为VP1基因在细胞中表达RT-PCR的电泳检测图；

图4为VP1蛋白在细胞中表达后在荧光显微镜下的结构图，其中，a为重组质粒pSCA1-VP1转染400×；b为重组质粒pSCA1-VP1转染100×；c阴性对照；

图5为构建本发明的自杀性DNA疫苗PSCA1/VP1的策略示意图；

图6为本发明的鸭病毒性肝炎自杀性DNA疫苗刺激雏鸭T淋巴细胞增殖后，试验组与对照组于λ570nm处测定OD值的对比图；

图7为本发明的鸭病毒性肝炎自杀性DNA疫苗刺激雏鸭产生特异性抗体后，试验组与对照组于λ450nm处测定每孔的OD值的对比图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明的鸭病毒性肝炎自杀性DNA疫苗，该疫苗由DHV-VP1基因和甲病毒复制子载体pSCA1组成，如图5，DHV-VP1基因是DHV病毒的致病决定基因，其为DHV病毒基因中第2106至2819的核苷酸，具有如下所示的核苷酸序列：

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实施例1：本发明的鸭病毒性肝炎自杀性DNV疫苗-pSCA1-VP1自杀性DHV疫苗的构建方法，包括如下步骤：

1)DHV病毒总RNA的提取及纯化：将DHV ZJ08病毒株腿部肌肉注射两日龄的小鸭，待小鸭死亡后，解剖取其肝脏，用剪刀将肝脏剪碎研磨，并加入1％的双抗，将研磨液反复冻融3次后，用TakaRa Catrimox-14^TM试剂盒提取RNA，具体步骤参照试剂盒说明书。

2)设计特异性引物：根据DHV病毒VP1蛋白基因序列分析设计出一对特异性引物，在上游引物中引入Kozak序列：

VP1-F：5’-CGGGATCC _BamH I GCCACCATG _kozak序列GGTGATTCCAACCAGTT-3’，

VP1-R：5’-TCCCCCGGG _Sma ITTCAATTTCCAGATTGAGTTCAGA-3’。

3)提取RNA后，再用Takara M-MLV反转录试剂盒进行转录，具体步骤如下：将9μL提取的RNA和1μL VP1-R引物均匀混合，70℃水浴10min后，冰上极冷2min，最后离心数秒。配制反转录缓冲液，参照反转录试剂盒。反应体系：M-MLV Buffer 2μL、RNA/引物变性溶液6μL、dNTP Mixture(2.5mM)2μL、RNase Inhibitor 0.25μL、RTase M-MLV0.5μL、加灭菌蒸馏水至20μL。42℃温浴1h后，70℃水浴15min，最后在冰上2min，得到的cDNA于-20℃保存备用。

4)通过反转录-聚合酶链式扩增方法，克隆得到DHV-VP1的全长cDNA基因序列；在聚合酶链式反应中，反应程序为：95℃预变性5min，然后94℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min后，10℃终止反应，于1％琼脂糖凝胶电泳胶回收聚合酶链式反应产物，请参阅图1，为VP1基因扩增后的电泳检测图。

5)将步骤4)扩增的VP1片段，利用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒纯化回收VP1cDNA片段，具体步骤参照试剂盒说明书。

6)将步骤5)回收的VP1全长cDNA片段和pSCA1空载体用BamHI和SmaI进行双酶切，并利用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒纯化回收VP1 cDNA和pSCA1空载体片段，具体步骤参照试剂盒说明书。

7)将回收的VP1cDNA和pSCA1空载体片段用so1ution I进行连接，连接体系如下：

连接反应体系为10uL，16℃水浴连接30min，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞JM109，混匀，冰浴放置30min，42℃水浴中热激90S后迅速置冰上3～5min，然后涂布于氨苄抗性平板中，12h后挑取菌落并摇菌。

8)将步骤7)的菌液利用AxyPrep DNA质粒抽提试剂盒抽提质粒，具体步骤参照试剂盒说明书。

9)重组质粒酶切鉴定：

根据引物中所带酶切位点，将步骤8)抽提的质粒用BamH I、Sma I进行双酶切鉴定。酶切体系如下：

反应体系为10uL，37℃水浴2h，1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切鉴定结果，如图2。

10)重组质粒pSCA1-VP1经invitrogen公司测序显示，结果完全正确。

11)成功将VP1基因重组到甲病毒复制子载体pSCA1真核表达载体中，构建一种鸭病毒性肝炎自杀性DNA疫苗——抗DHV的pSCA1-VP1DHV疫苗，如图5。

实施例2：pSCA1-VP1DHV疫苗外源VP1基因体外瞬时表达鉴定

1)VP1基因的体外mRNA表达鉴定：RT-PCR法检测

当BHK-21细胞在六孔板中长到80％时，进行转染。转染过程如下：(1)将5μg pSCA1-VP1质粒和10μg脂质体分别加入到250ul Opti-MEM培养液中，轻轻混匀，静止5min；(2)将含质粒的Opti-MEM培养液加入到含脂质体的Opti-MEM培养液中，轻轻混匀，静止20min；(3)将六孔板中的培养液吸出并弃掉，用PBS洗细胞3次，然后加入含pSCA1-VP1质粒和脂质体的Opti-MEM混合液500ul，再加500ul Opti-MEM于六孔板中，轻轻摇匀；(4)放入37℃，5％CO₂培养箱中，5h后换含FBS的全培养液继续培养。48h后取出细胞，PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤3次后胰酶消化，离心弃上清，细胞沉淀用于提取RNA，RNA用特异性引物VP1-R进行反转录获得cDNA，以cDNA为模板，用引物VP1-F和VP1-R进行PCR扩增。PCR反应程序：95℃预变性5min，94℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸10min，PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，如图3，成功检测到mRNA。

2)VP1基因体外表达鉴定：IFA法检测

当BHK-21细胞在六孔板中长到80％时，进行转染。转染过程如下：(1)将5μg pSCA1-VP1质粒和10μg脂质体分别加入到250ul Opti-MEM培养液中，轻轻混匀，静止5min；(2)将含质粒的Opti-MEM培养液加入到含脂质体的Opti-MEM培养液中，轻轻混匀，静止20min；(3)将六孔板中的培养液吸出并弃掉，用PBS洗细胞3次，然后加入含pSCA1-VP1质粒和脂质体的Opti-MEM混合液500ul，，再加500ul Opti-MEM于六孔板中，轻轻摇匀；(4)放入37℃，5％CO2培养箱中，5h后换完含FBS的全培养液继续培养。48h后的BHK-21细胞，用PBS液洗3次，5min/次。将培养的细胞用丙酮∶甲醇＝(1∶1)固定液4℃固定15min。用PBST清洗3次，5min/次。用封闭液(5％脱脂乳配制)37℃封闭30min。加入1∶200稀释的VP1多抗血清，37℃下孵育1h。用PBST清洗3次，5min/次。加入1∶1000稀释的FITC标记山羊抗兔IgG二抗，37℃下孵育40min。PBST清洗3次，10min/次。最后置于倒置荧光显微镜下观察并记录结果，如图4，成功检测到VP1蛋白获得表达。

实施例3：pSCA1-VP1 DHV疫苗在雏鸭体内T淋巴细胞增殖检测

将24只一日龄雏鸭随机分为4组，每组6只，分别为DHV/弱毒疫苗、pSCA1/VP1、pSCA1空载体、PBS组，在初免前一天及初免疫后第1周、第2周，颈静脉采血分离淋巴细胞，以含10％FBS的RPMI 1640稀释成1×10⁷/mL。于96孔细胞培养板中，每孔加入100μL细胞悬液，同时设RPMI 1640自身对照，每个样品设8个重复孔。培养板置37℃、5％CO₂饱和湿度条件下培养68h后，每孔加10μL MTT(5mg/mL)，孵育4h，加入50ul DMSO溶液终止反应，待蓝色沉淀溶解后于λ570nm处测定OD值，进行统计学分析，如表1和图6，结果显示试验组与对照组比较差异显著。

表1T淋巴细胞增殖检测结果

实施例4：pSCA1-VP1DHV疫苗在雏鸭体内免疫反应的特异性抗体检测

以间接ELISA法测定血清抗体的OD450值，以DHV-VP1原核表达蛋白为包被抗原(2μg/孔)于96孔酶标板上，被检雏鸭血清为一抗，过氧化物酶标记的兔抗鸭IgG为二抗，同时设立阴性对照，空白对照，于λ450nm处测定每孔的OD值，SAS统计软件分析，如表2和图7，结果显示试验组与对照组比较差异显著。

表2特异性抗体检测结果

实施例5：pSCA1-VP1DHV疫苗体内免疫反应血清中和试验检测

在初免后第1周、第2周，颈静脉采血分离血清，然后将血清2倍梯度稀释(1∶5-1∶160)至100ul，被检血清56℃孵育30min，混合100ul含200EDL50的弱毒疫苗株DHV病毒于96孔板，37℃孵育1h，然后以0.2ml/枚接种9日龄鸡胚，同时设立空白组即将0.2ml(0.1mlPBS+0.1ml 200EDL50病毒)的弱毒疫苗株DHV病毒。根据鸡胚死亡结果数据计算血清中和滴度(血清中和滴度为-log10的被检血清可以中和200EID50病毒使50％鸡胚不发生死亡最大稀释度)，具体数值见表3、4。

表3血清中和试验结果

表4血清中和滴度

实施例6：pSCA1-VP1DHV疫苗在雏鸭中预防和治疗鸭病毒性肝炎的效果实验

将24只1日龄小鸭随机分为4组，每组6只，分别为：I组注射PBS为对照，II组免疫pSCA1空质粒，III组免疫pSCA1/VP1，IV组免疫DHV-弱毒疫苗弱毒株病毒。采用腿部肌肉和腹股沟注射免疫，每组动物均免疫2次，间隔1周，第一次免疫剂量为100μg，第二次为200μg。二次免疫7天后，对所有雏鸭用强毒株(DHVZJ/08)进行攻击，攻毒剂量为0.2ml/只。连续观察10天，并记录每组小鸭死亡情况(表5)及临床症状，病变。

结果为：

(1)I、II组在接毒48-72h分别死亡4只，眼观明显角弓反张，喙端和爪尖淤血呈暗紫色，解剖发现肝脏肿大和斑点出血，胆囊肿胀呈长卵圆形，充满胆汁，胆汁呈褐色，脾见有肿大，外观呈斑驳状，肿胀，充血，呈灰暗色，″花斑肾″。III、IV组未出先死亡情况，并健康生长。

(2)10天后解剖所有小鸭，发现I、II组未死的小鸭部分，肝肿大，质脆，色暗或发黄，脾见肿大。III、IV组小鸭肝，脾都正常。

表5动物保护试验结果

实验结果表明，本发明的鸭病毒性肝炎自杀性DNA疫苗可预防和治疗鸭病毒性肝炎。

本发明的鸭病毒性肝炎自杀性DNA疫苗可用于制备预防和治疗鸭病毒性肝炎的药物，且具有以下优点：

1、所需的免疫剂量小；

2、与现有的弱毒苗和灭活苗相比，本发明的自杀性DNA疫苗更加安全、高效；

3、本发明的自杀性DNA疫苗在动物体内一过性表达外源基因后，随细胞凋亡而被机体清除，从而可避免DNA质粒可能整合到宿主细胞染色体或可能造成免疫耐受等隐患；

4、本发明的自杀性DNA疫苗更长效，稳定，且操作便捷。

以上公开的仅为本申请的几个具体实施例，但本申请并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化，都应落在本申请的保护范围内。

Claims (5)

1.一种鸭病毒性肝炎自杀性DNA疫苗，其特征在于，该疫苗由DHV-VP1基因和甲病毒复制子载体pSCA1组成，所述DHV-VP1基因是DHV病毒的致病决定基因，其为DHV病毒基因中第2106至2819的核苷酸，具有如下所示的核苷酸序列：

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2.一种如权利要求1所述的鸭病毒性肝炎自杀性DNA疫苗的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)DHV病毒总RNA的提取及纯化：将DHV ZJ08病毒株腿部肌注射两日龄的小鸭，待小鸭死亡后，取其肝脏制备研磨液，按常规方法提取DHV病毒总RNA；

2)设计特异性引物：根据DHV病毒VP1蛋白基因序列分析设计出一对特异性引物，在上游引物中引入Kozak序列：

VP1-F：5’-CGGGATCC BamH IGCCACCATG _kozak序列GGTGATTCCAACCAGTT-3’，

VP1-R：5’-TCCCCCGGG _Sma ITTCAATTTCCAGATTGAGTTCAGA-3’；

3)通过反转录-聚合酶链式扩增方法，克隆得到DHV-VP1的全长cDNA基因序列；

4)将步骤3)扩增的VP1片段，利用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒纯化回收VP1 cDNA片段；

5)将VP1全长cDNA片段重组到甲病毒复制子载体pSCA1真核表达载体中，构建成鸭病毒性肝炎自杀性DNA疫苗——抗DHV的pSCA1-VP1 DHV疫苗。

3.如权利要求2所述的鸭病毒性肝炎自杀性DNA疫苗的构建方法，其特征在于，步骤3)进一步包括：

在聚合酶链式反应中，反应程序为：95℃预变性5min，然后94℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min后，10℃终止反应，于1％琼脂糖凝胶电泳胶回收聚合酶链式反应产物。

4.一种如权利要求1所述的鸭病毒性肝炎自杀性DNA疫苗在制备预防鸭病毒性肝炎药物中的应用。

5.一种如权利要求1所述的鸭病毒性肝炎自杀性DNA疫苗在制备治疗鸭病毒性肝炎药物中的应用。

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