CN104630150B - 一种以Cfr蛋白为免疫原得到的单克隆抗体及其在检测Cfr蛋白中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种以Cfr蛋白为免疫原得到的单克隆抗体及其在检测Cfr蛋白中的应用。本发明提供了杂交瘤细胞Cfr‑D9，保藏号为CGMCC No.8415。本发明还保护所述杂交瘤细胞Cfr‑D9分泌的单克隆抗体。本发明提供的单克隆抗体可以结合并识别Cfr蛋白，具有良好的特异性和较高的效价。由于Cfr蛋白介导病原菌的对多种药物的耐药性，本发明具有良好的推广价值。

Description

一种以Cfr蛋白为免疫原得到的单克隆抗体及其在检测Cfr蛋 白中的应用

技术领域

本发明涉及一种以Cfr蛋白为免疫原得到的单克隆抗体及其在检测Cfr蛋白中的应用。

背景技术

cfr基因首次由Stefan Schwarz教授在2000年从呼吸道感染的小牛鼻腔拭子中分离的松鼠葡萄球菌中发现。敏感性实验表明该菌对四环素、红霉素、卡那霉素、氯霉素和氟苯尼考均具有耐药性。通过质粒抽提、质粒转化实验和抗生素敏感性测定发现一个介导多药耐药的质粒pSCFS1。该质粒大小为17.1-kb，除了包含介导红霉素耐药的ermC基因外，还发现了一个能够介导对氯霉素（64μg/mL）和氟苯尼考（32μg/mL）的耐药性的蛋白质，即为Cfr蛋白（由349个氨基酸残基组成）。cfr即Chloramphenicol-florfenicol resistance的缩写。

进一步的研究表明，cfr基因编码的Cfr蛋白为一种rRNA甲基转移酶，它不同于其它已知类型的rRNA甲基转移酶，但是和自由基SAM超家族中作用于蛋白自由基形成、异构化和异常甲基化等功能的酶类相似。Cfr蛋白的作用位点是多种药物作用的靶位点A2503。由于葡萄球菌23S rRNA中氯霉素类药物结合位点和林可霉素药物结合位点部分重叠，而且A2503位的甲基化使23S rRNA中上述两类药物的结合位点构型发生变化，因而导致了葡萄球菌对氯霉素类和林可霉素的耐药。截断侧耳素、恶唑烷酮类和链阳菌素A类药物作用于革兰氏阳性菌中23S rRNA转肽中心，该转肽中心和A2503位临近，因此A2503位的甲基化还可以介导这三类药物的耐药。深入进行对A2503位的甲基化介导的耐药机制研究后发现，Cfr蛋白催化该腺苷第8位的甲基化后而导致了细菌对酰胺醇类、林可胺类、恶唑烷酮类、截断侧耳类和链阳菌素A类以及部分十六元环大环内酯类药物的耐药性。

上述各类药物中既包含动物专用抗菌药物（氟苯尼考、泰妙菌素、沃尼妙林），也有人临床专用的抗菌药物（喹奴普汀/达福普汀），甚至还包括2000年获得美国FDA批准的人工合成的恶唑烷酮类抗生素-利奈唑胺，该药被认为是临床上治疗耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA）和耐万古霉素的肠球菌（VRE）最后一道防线的药物。

因此cfr基因介导病原菌的耐药性是近年来耐药性领域的研究热点之一，具有很重要的公共卫生意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种以Cfr蛋白为免疫原得到的单克隆抗体及其在检测Cfr蛋白中的应用。

本发明提供了Cfr蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株Cfr-D9（简称杂交瘤细胞Cfr-D9），该杂交瘤细胞已于2013年10月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCC No.8415。

本发明还保护所述杂交瘤细胞Cfr-D9分泌的单克隆抗体。

本发明还保护所述杂交瘤细胞Cfr-D9或所述单克隆抗体在制备与Cfr蛋白结合的试剂盒中的应用。

本发明还保护所述杂交瘤细胞Cfr-D9或所述单克隆抗体在制备辅助检测Cfr蛋白的试剂盒中的应用。

本发明还保护所述杂交瘤细胞Cfr-D9或所述单克隆抗体在辅助检测Cfr蛋白中的应用。

本发明还保护所述杂交瘤细胞Cfr-D9或所述单克隆抗体在制备辅助检测含有Cfr蛋白的编码基因的菌的试剂盒中的应用。

本发明还保护所述杂交瘤细胞Cfr-D9或所述单克隆抗体在辅助检测含有Cfr蛋白的编码基因的菌中的应用。

以上任一所述的Cfr蛋白具体可如序列表的序列1所示。

本发明提供的杂交瘤细胞可以分泌得到相应的单克隆抗体。本发明提供的单克隆抗体可以结合并识别Cfr蛋白，具有良好的特异性和较高的效价。由于Cfr蛋白介导病原菌的对多种药物的耐药性，本发明具有良好的推广价值。

附图说明

图1为Western Blot的结果图谱。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。载体pET-28a(+)：购自Novagen公司，产品目录号为69864-3。大肠杆菌BL21(DE3)：购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为CD601-01。本实施例中的PBS缓冲液，如无特殊说明，均为pH7.4、0.01M的PBS缓冲液。Cfr蛋白如序列表的序列1所示，cfr基因如序列表的序列2所示。

实施例1、制备Cfr蛋白

一、制备重组质粒

1、合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。

2、以步骤2合成的双链DNA分子为模板，采用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

F1：5’-GGAATTCCATATG ATGAATTTTAATAATAAAAC-3’；

R1：5’-CGGAATTC CTATTGGCTATTTTGATAAT-3’。

3、用限制性内切酶Nde I和EcoR I双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。

4、用限制性内切酶Nde I和EcoR I双酶切载体pET-28a(+)，回收约5369bp的载体骨架。

5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pET-28a-cfr。

二、制备Cfr蛋白

1、将重组质粒pET-28a-cfr导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌。

2、将重组菌的单克隆接种至LB液体培养基，37℃、200r/min振荡培养过夜；

3、取步骤2得到的菌液，以1：100的体积比接种至LB液体培养基，37℃、200r/min振荡培养至OD_600nm=0.8（实际操作中0.6-1.0均可）；加入IPTG并使其浓度为1mmol/L，37℃、200r/min振荡培养6h。

4、完成步骤3后，取整个培养体系、4℃、9000rpm离心10min，收集菌体沉淀，用PBS缓冲液洗涤3次；用PBS缓冲液重悬菌体，加入溶菌酶（购自SIGMA公司，产品目录号为L6876）并使其浓度为1mg/ml，37℃静置30min，然后在冰上进行超声破碎（sonics and materialsinc；MODE:VCX105；SERIAL NO:45852L；40%功率，每超声2s停3s，总时间为30min），然后4℃、9000rpm离心10min，收集沉淀。

5、取步骤4得到的沉淀，用8mol/L尿素水溶液溶解，然后在冰上进行超声破碎（sonics and materials inc；MODE:VCX105；SERIAL NO:45852L；40%功率，每超声2s停3s，总时间为10min），然后4℃、9000rpm离心10min，取上清液。

6、取步骤5得到的上清液，进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，切胶回收目的条带（即分子量为39.86kDa的条带），加入PBS缓冲液并反复冻融以促使目的蛋白与凝胶充分分离，然后4℃、9000rpm离心10min，收集上清液，即为Cfr蛋白液。

Cfr蛋白液中的Cfr蛋白浓度以总蛋白浓度计，用PBS缓冲液调整总蛋白浓度。

实施例2、杂交瘤细胞的获得

以实施例1制备的Cfr蛋白液免疫BALB/c小鼠：初次免疫时将弗氏完全佐剂与抗原400μl(50-100μg均可)等体积混合，充分乳化，皮下分点注射；一个月后对小鼠进行加强免疫，抗原量、注射体积和注射方式均不变，但改用弗氏不完全佐剂；此后每间隔2周加强免疫一次，共4次加强免疫；末次免疫7天后收集血清，取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，用HAT培养基进行选择性培养（以小鼠腹腔巨噬细胞为滋养细胞）。

用间接ELISA法检测杂交瘤细胞的培养上清，步骤如下：（1）以实施例1制备的Cfr蛋白液（蛋白浓度为1μg/ml）包被酶标板，每孔100μl，37℃、2h；（2）37℃封闭2h，然后每孔加入待检培养上清100μl，37℃孵育1h，洗涤4次；（3）加酶标二抗（辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG），37℃孵育1h，洗涤4次；（4）每孔加100μl底物显色剂，室温避光静止10min；（5）每孔加终止液50μl，用酶标仪测定波长450nm值，OD值高于阴性值2倍+3倍标准差可视为阳性值。

将选出的阳性杂交瘤细胞克隆化培养（有限稀释法，以小鼠腹腔巨噬细胞为滋养细胞）。经过2-3轮克隆化培养，获得稳定的能够产生高效价单抗的杂交瘤细胞克隆。将杂交瘤细胞克隆扩大培养，并冻存保种。

一株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体的效价最高，将该株杂交瘤细胞命名为Cfr-D9。该杂交瘤细胞已于2013年10月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCC No.8415。

实施例3、单克隆抗体的制备、鉴定和应用

一、单克隆抗体的制备和纯化

1、增量培养法

细胞培养基（7.4）的制备方法：向DMEM高糖培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，小牛血清的终浓度为20%（质量百分含量），碳酸氢钠的终浓度为0.2%（质量百分含量）。

将杂交瘤细胞Cfr-D9置于细胞培养基中，37℃培养2天，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体溶液（-20℃保存）。

单克隆抗体中的蛋白质浓度（mg/ml）=1.45×OD₂₈₀-0.74×OD₂₆₀。

采用以上公式计算单克隆抗体中的蛋白质浓度，为16.5mg/ml。

2、腹水制备

Balb/c小鼠腹腔注射灭菌石蜡油（0.4mL/只）。7天后腹腔注射杂交瘤细胞Cfr-D9（5×10⁵个/只）。7天后采集腹水，用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，纯化后的腹水-20℃保存。

二、单克隆抗体的鉴定

将步骤一的1得到的单克隆抗体溶液分别进行如下鉴定：

1、采用ELISA单克隆抗体亚型检测试剂盒（Sigma公司产品，产品目录号为19285）检测单克隆抗体的亚型，单克隆抗体的免疫球蛋白亚类为IgG2a。

2、单克隆抗体的效价

（1）用PBS缓冲液将单克隆抗体溶液稀释至1000倍体积、3000倍体积、9000倍体积、27000倍体积、81000倍体积、243000倍体系或729000倍体积。

（2）采用实施例1制备的Cfr蛋白液（蛋白浓度为1μg/ml）包被酶标板，100μL/孔，37℃孵育2h。

（3）取完成步骤（2）的酶标板，37℃封闭2h，洗板。

（4）取完成步骤（3）的酶标板，每孔加入100μl步骤（1）得到的单克隆抗体稀释液（每种稀释液设置5个复孔），37℃孵育1h，洗板；同时设置5个孔，用等体积PBS缓冲液代替单克隆抗体稀释液，作为阴性对照。

（5）取完成步骤（4）的酶标板，加酶标二抗（辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG），37℃孵育1h，洗板。

（6）取完成步骤（5）的酶标板，每孔加入100μl底物显色剂，室温避光静置10min，然后每孔加入50μl终止液。

（7）取完成步骤（6）的酶标板，用酶标仪测定波长450nm值。

将阈值设为：2×阴性对照孔的平均值OD值+3倍标准差。对于试验孔来说，如果其OD值高于阈值，即可判断为阳性。

单克隆抗体溶液的效价为1：243000。

3、单克隆抗体的特异性

1株cfr阳性菌和1株cfr阴性菌均从野外分离获得，经鉴定均为大肠杆菌。形态鉴定的结果描述如下：革兰染色呈阴性，镜下形态为红色短小的杆状。经PCR鉴定（上游引物：CGATTTGAGGATATGAAGGTTCT；下游引物：AAATTAGGATCCGTAAACGAAT），cfr阳性菌基因组中含有cfr基因，cfr阴性菌基因组中不含有cfr基因。

（1）用PBS缓冲液重悬cfr阳性菌或cfr阴性菌，得到OD_600nm=0.8的菌悬液。

（2）取步骤（1）得到的菌悬液，加入溶菌酶至浓度为10mg/ml、TritonX-100至浓度为1%（体积比）、蛋白酶抑制剂PMSF至浓度为100μg/mL，冰浴静置1h，然后在冰上进行超声破碎（sonics and materials inc；MODE：VCX105；SERIAL NO：45852L；40%功率，每超声2s停3s，总时间为30min），然后4℃、9000rpm离心10min，收集沉淀。

（3）取步骤（2）得到的沉淀，用8mol/L尿素水溶液溶解，然后在冰上进行超声破碎（sonics and materials inc；MODE：VCX105；SERIAL NO：45852L；40%功率，每超声2s停3s，总时间为10min），然后4℃、9000rpm离心10min，取上清液。

（4）取步骤（3）得到的上清液，进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转至硝酸纤维膜进行western blot，采用的一抗为步骤一的1得到的单克隆抗体溶液的2000倍稀释液（采用PBS缓冲液稀释），采用的二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG的10000倍稀释液。结果见图1（1：cfr阴性菌；2：cfr阳性菌）。结果显示，单克隆抗体可以特异性地结合并识别自然菌中的Cfr蛋白，在约40kDa处有特异性的反应条带。

Claims (5)

1.Cfr蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株Cfr-D9，它的保藏编号为CGMCC No.8415。

2.权利要求1所述杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。

3.权利要求2所述单克隆抗体或权利要求1所述杂交瘤细胞在制备与Cfr蛋白结合的试剂盒中的应用。

4.权利要求2所述单克隆抗体或权利要求1所述杂交瘤细胞在制备辅助检测Cfr蛋白的试剂盒中的应用。

5.权利要求2所述单克隆抗体或权利要求1所述杂交瘤细胞在制备辅助检测含有Cfr蛋白的编码基因的菌的试剂盒中的应用。