CN108676902A - 一种检测HPS、SS2、Pm、APP的复合PCR试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域的多重PCR检测，具体涉及一种检测HPS、SS2、Pm、APP的复合PCR试剂盒，该试剂盒可检测副猪嗜血杆菌（HPS）、猪链球菌（SS2）、猪产毒多杀性巴氏杆菌（Pm）、猪胸膜肺炎放线杆菌（APP），本发明解决了HPS、SS2、Pm、APP这四种病原菌的混合感染后，临床症状难以区分也难以治疗PRDC的问题，且快速、准确率高，节省了检测时间和成本。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域的多重 PCR 检测领域，具体是一种特异检测副猪嗜血杆菌（HPS）、猪链球菌2型（SS2）、猪产毒多杀性巴氏杆菌（Pm）、猪胸膜肺炎放线杆菌（APP）复合PCR快速检测试剂盒及其应用方法。
背景技术
呼吸道疾病一直是困扰我国养猪业的一大难题，其中副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病、猪产毒多杀性巴氏杆菌病、猪传染性胸膜肺炎是目前猪群呼吸道疫病中最主要的细菌传染病。副猪嗜血杆菌病可以引起猪的纤维素性肺炎，关节炎和脑膜炎。猪链球菌病可以引起化脓性脑膜炎、败血症、心内膜炎、肺炎和关节炎等，其中，2型猪链球菌病更是一种重要的人畜共患病，不仅给养猪业带来严重经济危害，还能感染人，严重威胁人类公共卫生安全。猪多杀性巴氏杆菌病可以引起猪肺疫和萎缩性鼻炎。猪胸膜肺炎放线杆菌病具有高度接触性传染性，能引起猪出现出血性、化脓性和纤维素性肺炎。这些疫病多混合感染或者继发于其他病原感染，给养猪业造成严重的经济损失。
副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病、猪产毒多杀性巴氏杆菌病、猪传染性胸膜肺炎这几种疫病的临床症状类似，多重感染与激发感染更是给诊断带来困难。现有报道的方法如细菌分离鉴定、免疫组化、补体结合试验，间接血凝试验和ELISA等方法，都是针对其中某一个或其中几个病原菌的检测，能同时检出HPS、SS2、Pm、APP四种病原菌的方法还没有。同时存在耗时长，灵敏度不高的缺点。
多重PCR(complex PCR) 是在同一个PCR反应体系中同时加入了多对引物，而实现在同一体系中对多个目的片段的同时扩增。多重PCR克服了常规PCR方法一次只能扩增一个目的片段的缺点，该方法可同时快速检测多种病原菌，节省了检测成本和时间。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种检测HPS、SS2、Pm、 APP的复合PCR试剂盒，旨在快速检测HPS、SS2、Pm、APP等猪病病原中的一种或多种，解决临床上混合感染后难以区分的难题。
本发明是这样实现的，一种检测HPS、SS2、Pm、 APP的复合PCR试剂盒，该试剂盒包括：a) PCR反应液、b)10×PCR buffer、c)Taq酶、d)dNTP、e)ddH2O、f)阳性质控品和阴性质控品；
其中，所述PCR反应液包括：序列为 SEQ ID NO.1 、SEQ ID NO.2的检测副猪嗜血杆菌的上游、下游引物；SEQ ID NO.1：5'-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3’，SEQ ID NO.2：5'-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3’；
序列为 SEQ ID NO.3 、SEQ ID NO.4的检测猪链球菌2型的上游、下游引物；SEQ IDNO.3：5'-GCAGCGTATTCTGTCAAACG-3’，SEQ ID NO.4：5'-CCATGGACAGAT AAAGATGG-3’；
序列为 SEQ ID NO.5 、SEQ ID NO.6的检测猪产毒多杀性巴氏杆菌的上游、下游引物；SEQ ID NO.5：5'-ATCCGCTATTTACCCAGTGG-3’，SEQ ID NO.6：5'-GCT GTAAACGAACTCGCCAC-3’；
序列为 SEQ ID NO.7 、SEQ ID NO.8的检测猪胸膜肺炎放线杆菌的上游、下游引物；SEQ ID NO.7：5'-AGCCGGGCAAATATTCCAA-3’，SEQ ID NO.8：5'-AAACTA AAACAGCCGCCGA-3’；
所述阳性质控品为HPS、SS2、Pm、APP基因组PCR产物。
优选地，如上所述的一种检测HPS、SS2、Pm、 APP的复合PCR试剂盒，所述试剂盒的反应体系和条件为：在 25 μL 体系中 rTaq 酶加 0.75 μL ，Mg 2+ 加 1.75 μL ，引物总体积为 1 μL ，dNTP 加 1.5 μL。
优选地，如上所述的一种检测HPS、SS2、Pm、 APP的复合PCR试剂盒，其特征在于：所述PCR反应液中的上游、下游引物浓度均为5µM。
优选地，如上所述的一种检测HPS、SS2、Pm、 APP的复合PCR试剂盒，所述PCR 扩增条件为：94℃ 5min、94℃ 30s、58℃ 30s 、72℃ 50s、72℃ 10min、4℃ 2h；其中，94℃ 30s、58℃ 30s、72℃ 50s各循环30次。
本发明的另一目的在于提供一种HPS、SS2、Pm、APP 复合 PCR试剂盒在猪呼吸道病原菌的快速检测方面的应用。
与现有技术相比，本发明的优点为：
（1）简便，能够直接对临床组织样品进行检验，省去分离、培养及纯化细菌的繁琐步骤。
（2）快捷，相对于单个PCR而言，本发明仅一次PCR反应就可以区别HPS、SS2、Pm、APP这四种病原菌，全程只需2-3小时，大大节约了时间。
附图说明
图1是本发明的HPS、SS2、Pm、 APP 复合 PCR 检测试剂盒的设计流程图。
图2是HPS、SS2、Pm、APP 复合 PCR 的敏感性试验图，图中： M：DL 2000 DNAMarker；1-7：HPS、SS2、Pm、APP四种模板浓度 100-106 倍的倍比稀释。
图3是HPS、SS2、Pm、APP 复合 PCR 的特异性试验图，图中：M：DL 2000 DNAMarker；1：HPS、SS2、Pm 、APP 四种模板组合；2：HPS；3：SS2；4：Pm；5：APP；6：解淀粉芽孢杆菌；7：葡萄球菌；8：枯草芽孢杆菌；9：奇异变形杆菌；10：猪丹毒；11：猪瘟病毒；12：细小病毒；13：乙脑病毒；14：阴性对照。
图4是HPS、SS2、Pm、APP 复合 PCR 的重复性试验图，图中：M：DL 2000 DNAMarker；1～9：相同模板的 9 次扩增。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细描述
如图1所示的一种检测HPS、SS2、Pm、 APP的复合PCR试剂盒的设计流程，包括以下步骤：
S101：HPS、SS2、Pm、APP 复合 PCR 反应体系和条件的优化：使用 rTaq 酶、dNTPs、引物总体积和 Mg 2+ 的组合作一个四因素四水平的正交试验；
S102：HPS、SS2、Pm、APP 复合 PCR 最佳反应体系和条件的确定：再对复合 PCR 退火温度、循环数、延伸时间的优化，最终确定的 PCR 反应最佳体系和条件；
S103：HPS、SS2、Pm、APP 复合 PCR 的敏感性试验：使用复合 PCR 的最佳反应体系和条件，进行敏感性试验的扩增；
S104：HPS、SS2、Pm、APP 复合 PCR 的特异性试验：使用复合 PCR 的最佳反应体系和条件，进行特异性性试验的扩增；
S105：HPS、SS2、Pm、APP 复合 PCfR 的重复性试验：对 HPS、SS2、Pm、APP 进行 9 次重复试验。
实施例1 HPS、SS2、Pm、APP 复合 PCR 反应体系和条件的优化
使用 rTaq 酶、dNTPs、引物总体积和 Mg 2+ 的组合作一个四因素四水平的正交试验，结果如表1。
表1 HPS、SS2、Pm、APP 复合 PCR 反应体系的优化
（四因素四水平正交试验）
| 试验号 | rTaq酶（µL） | Mg2+（µL） | 引物总体积（µL） | dNTP（µL） |
| 1 | 0.25 | 1.25 | 1.0 | 1.25 |
| 2 | 0.25 | 1.5 | 2.0 | 1.5 |
| 3 | 0.25 | 1.75 | 3.0 | 1.75 |
| 4 | 0.25 | 2.0 | 4.0 | 2.0 |
| 5 | 0.5 | 1.25 | 2.0 | 1.25 |
| 6 | 0.5 | 1.5 | 1.0 | 1.5 |
| 7 | 0.5 | 1.75 | 4.0 | 1.75 |
| 8 | 0.5 | 2.0 | 3.0 | 2.0 |
| 9 | 0.75 | 1.25 | 3.0 | 1.25 |
| 10 | 0.75 | 1.5 | 1.0 | 1.5 |
| 11 | 0.75 | 1.75 | 4.0 | 1.75 |
| 12 | 0.75 | 2.0 | 2.0 | 2.0 |
| 13 | 1.0 | 1.25 | 4.0 | 1.25 |
| 14 | 1.0 | 1.5 | 3.0 | 1.5 |
| 15 | 1.0 | 1.75 | 2.0 | 1.75 |
| 16 | 1.0 | 2.0 | 1.0 | 2.0 |
结果表明：第 6、11、16 号的条带都很亮，从敏感性、特异性试验结果确定11号为最佳组合。在 25 μL 体系中 rTaq 酶加 0.75 μL ，Mg 2+ 加 1.75 μL ，
引物总体积为 1 μL ，dNTP 加 1.5 μL。
实施例2、HPS、SS2、Pm、APP 复合 PCR 最佳反应体系和条件的确定
再对复合 PCR 退火温度、循环数、延伸时间等的优化，最终确定的 PCR 反应体系和条件，见表2。
表2复合 PCR 最佳反应体系
PCR 扩增条件为：94℃ 5min，94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 50s，72℃ 10min，4℃ 2h。30Cycles包括94℃ 30s、58℃ 30s、72℃ 50s。
实施例3、HPS、SS2、Pm、APP 复合 PCR 的敏感性试验
使用复合 PCR 的最佳反应体系和条件，进行敏感性试验的扩增，结果见图2。从图2可以看出：HPS 最低检测量为 112.5pg/μL，SS2 最低检测量为 11.7pg/μL，Pm 最低检测量为8.7ng/μL，APP 最低检测量为 267pg/μL。
实施例4、HPS、SS2、Pm、APP 复合 PCR 的特异性试验
使用复合 PCR 的最佳反应体系和条件，进行特异性试验研究，结果见图3。从图3可以看出：HPS、SS2、Pm、APP 四种模板组合能扩增出特异性条带，四种模板分开也能分别扩增出特异性条带，而解淀粉芽孢杆菌、葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、奇异变形杆菌、猪丹毒、猪瘟病毒、细小病毒、乙脑病毒、阴性对照都无法扩出条带，说明此复合 PCR 检测快速检测试剂盒特异性良好。
实施例5、HPS、SS2、Pm、APP 复合 PCR 的重复性试验
从图4可以看出：对 HPS、SS2、Pm、APP 进行 9 次重复试验，检测结果一致，说明重复性良好。
实施例6、HPS、SS2、Pm、APP 复合 PCR 的临床应用
用已建立的 HPS、SS2、Pm、APP 复合 PCR方法 对 579 份临床有呼吸道症状的病猪组织，进行检测，鉴定结果为 59 株 HPS，74 株 SS2，35 株 Pm和24 株 APP。
为了比较 HPS、SS2、Pm、APP 复合 PCR快速检测试剂盒与单一 PCR 的阳性符合率，对其中 8 株APP作 HPS、SS2、Pm、APP 复合 PCR 扩增；HPS、SS2、Pm、APP 复合 PCR 对 8株 APP的检测结果与APP单一 PCR 的比较，阳性符合率为 100%。
所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 一种检测HPS、SS2、Pm、 APP的复合PCR试剂盒
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggcttcgtca ccctctgt 18
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcagcgtatt ctgtcaaacg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccatggacag ataaagatgg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaactaaaac agccgccga 19
Claims (5)
1.一种检测HPS、SS2、Pm、 APP的复合PCR试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括：a) PCR反应液、b)10×PCR buffer、c)Taq酶、d)dNTP、e)ddH2O、f)阳性质控品和阴性质控品；
其中，所述PCR反应液包括：序列为 SEQ ID NO.1 、SEQ ID NO.2的检测副猪嗜血杆菌的上游、下游引物；
序列为 SEQ ID NO.3 、SEQ ID NO.4的检测猪链球菌2型的上游、下游引物；
序列为 SEQ ID NO.5 、SEQ ID NO.6的检测猪产毒多杀性巴氏杆菌的上游、下游引物；
序列为 SEQ ID NO.7 、SEQ ID NO.8的检测猪胸膜肺炎放线杆菌的上游、下游引物；
所述阳性质控品为HPS、SS2、Pm、APP基因组PCR产物。
2.如权利要求1所述的一种检测HPS、SS2、Pm、 APP的复合PCR试剂盒，所述试剂盒的反应体系和条件为：在 25 μL 体系中 rTaq 酶加 0.75 μL ，Mg 2+ 加 1.75 μL ，引物总体积为 1 μL ，dNTP 加 1.5 μL。
3.如权利要求1所述的一种检测HPS、SS2、Pm、 APP的复合PCR试剂盒，其特征在于：所述PCR反应液中的上游、下游引物浓度均为5µM。
4.如权利要求1所述的一种检测HPS、SS2、Pm、 APP的复合PCR试剂盒，所述PCR 扩增条件为：94℃ 5min、94℃ 30s、58℃ 30s 、72℃ 50s、72℃ 10min、4℃ 2h；其中，94℃ 30s、58℃ 30s、72℃ 50s各循环30次。
5.如权利要求1-4任一项所述的一种检测HPS、SS2、Pm、 APP的复合PCR试剂盒，可用于猪呼吸道病原菌的快速检测。
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Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN106434935A (zh) * | 2016-10-13 | 2017-02-22 | 中国动物疫病预防控制中心 | 鉴定猪多杀性巴氏杆菌和/或副猪嗜血杆菌组合物和方法 |
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Patent Citations (2)
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 张德福等: "SS-2 、APP 和PM 多重PCR检测方法的建立与应用", 《中国兽医学报》 * |
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| CN114214442A (zh) * | 2021-12-22 | 2022-03-22 | 龙阔（苏州）生物工程有限公司 | 一种三重荧光定量pcr引物探针组与三重荧光定量pcr试剂盒 |
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