CN106811544A - 两类猪肺部病原菌的双重pcr引物及其应用 - Google Patents

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hps
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陈秋勇
陈如敬
王隆柏
车勇良
周伦江
王晨燕
刘玉涛
严山
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Abstract

本发明提供一种两类猪肺部病原菌的双重PCR引物及其应用方法，属于畜牧兽医技术领域。本发明根据猪肺部病原菌副猪嗜血杆菌(Hamophilus parasuis,Hps)和多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)的基因序列设计了两队特异性引物Hps及Pm；并建立了其双重PCR检测方法。本发明可实现同时检测猪肺部病原菌副猪嗜血杆菌和多杀性巴氏杆菌，具有快速、特异、敏感性强等优点；便于疾病的大规模检测，具有很强的实用性和推广价值。

Description

两类猪肺部病原菌的双重PCR引物及其应用
技术领域
本发明涉及一种两类猪肺部病原菌的双重PCR引物及其应用方法，属于畜牧兽医技术领域。
背景技术
副猪嗜血杆菌(Hamophilus parasuis,Hps)是一种条件致病菌,可以引起猪的纤维素性肺炎,关节炎和脑膜炎。多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)可以引起猪肺疫和猪的萎缩性鼻炎。副猪嗜血杆菌和多杀性巴氏杆菌都是猪呼吸道常见的重要致病细菌，都可能导致或者继发于其他病原感染，给养猪业造成严重的经济损失。这2种细菌引起的临床症状很难区分，病猪剖检肺部病变极为相似，而且常伴有多重感染，给传统的细菌学诊断方法带来困难。因此，本研究发明设计合成的特异性引物，建立的多重聚合酶链式反应（PCR）方法能够准确诊断鉴别这2种细菌，具有很强的实用性和推广价值。
发明内容
本发明的目的是提供两种猪肺部病原菌副猪嗜血杆菌Hps和多杀性巴氏杆菌Pm的双重PCR引物及其应用方法，从而建立一种能够同时鉴别诊断Hps和Pm病原菌的多重PCR检测方法，并且具有很高准确性和敏感度，能够精准的鉴别诊断出猪肺部感染的病因，从而实施正确的治疗方案，挽回经济损失。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
两类猪肺部病原菌的双重PCR引物，该引物的核苷酸序列为：
（1）副猪嗜血杆菌特异性引物Hps：
上游引物H1：3’-ATACCCTGGTAGTCCACGCT-5’，
下游引物H2：3’-ATTGGCTTCGTCACCCTCTG-5’；
（2）多杀性巴氏杆菌特异性引物Pm：
上游引物P1：3’- TTCCAGGTGTAGCGGTGAAA-5’，
下游引物P2：3’- CTCCCCACGCTTTAGCACAT-5’。
其中，上述副猪嗜血杆菌特异性引物Hps的扩增产物大小为475bp，上述多杀性巴氏杆菌特异性引物Pm的扩增产物大小为131bp。
本发明的另一目的在于提供一种利用上述两类猪肺部病原菌的双重PCR引物进行双重PCR检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）待测样品DNA提取；
（2）以待测样品DNA为模板，利用引物对Hps及Pm进行双重PCR扩增；
（3）扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测及判断：PCR反应终止后，琼脂糖电泳检测扩增结果：扩增得到475bp大小产物则判定为检测出副猪嗜血杆菌，扩增得到131bp大小产物则判定为检测出多杀性巴氏杆菌，同时得到475bp及131bp大小产物则判定为副猪嗜血杆菌和多杀性巴氏杆菌混合感染。
本发明的优点在于：
能够同时鉴别诊断Hps和Pm病原菌，并且具有很高准确性和敏感度，能够精准的鉴别诊断出猪肺部感染的病因，从而实施正确的治疗方案，挽回经济损失。
附图说明
图1 双重PCR结果电泳图；其中：
泳道1：DNA Marker DL2000；
泳道2：检测到Hps菌DNA，说明Hps菌为阳性；
泳道3：检测到Pm菌DNA，说明Pm菌为阳性；
泳道4：检测到Hps菌和Pm菌的DNA，说明Hps菌和Pm菌为阳性；
泳道5：均未检测到，说明Hps菌和Pm菌为阴性。
具体实施方式
实施例1
根据GeneBank公布的副猪嗜血杆菌(Hamophilus parasuis,Hps)和多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)两种病原菌基因序列，利用引物设计软件（Primer Premier5.0）分别自主设计2对特异性引物，如表1所示。
表1 两种病原菌特异性引物
利用这2种病原菌的特异性引物，结合PCR反应原理，摸索出最适的PCR反应条件（2个引物浓度比例、反应时间，退火温度等），最终实现在一个PCR反应就能鉴别诊断出Hps和Pm病原菌，从而达到快速准确的诊断目的。引物对Hps扩增产物大小为475bp，引物对Pm扩增产物大小为131bp。
实施例2
双重PCR检测
（1）待测样品DNA提取；
（2）以待测样品DNA为模板，利用引物对Hps及Pm进行双重PCR扩增；
PCR反应的总体积为20μL：2×Easy Taq SuperMix 10 μL，上游引物（H1和P1）各0.5 μL，下游引物（H2和P2）各0.5 μL，提取的待检测样品的DNA模板3 μL，无菌去离子水补充至终体积为20μL。
PCR反应条件为：94℃预变性10 min后进入循环，循环参数为94℃ 30sec，57℃退火30sec，72℃ 45sec，35个循环后72℃延伸10min。
（3）扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测及判断：
反应结束，取5μL PCR反应产物于1%的琼脂糖凝胶电泳，以DNA Marker DL2000为参照，并拍照观察结果。若在475 bp 处出现条带说明该样品中含有副猪嗜血杆菌的DNA，即存在Hps菌的感染；若在131 bp 处出现条带说明该样品中含有多杀性巴氏杆菌的DNA，即存在Pm菌的感染；若在475 bp 和 131 bp 处都出现条带说明该样品中含有Hps菌和Pm菌的DNA，即存在Hps菌和Pm菌的混合感染。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 两类猪肺部病原菌的双重PCR引物及其应用
<130> 4
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 上游引物H1
<400> 1
ataccctggt agtccacgct 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 下游引物H2
<400> 2
attggcttcg tcaccctctg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 上游引物P1
<400> 3
ttccaggtgt agcggtgaaa 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 下游引物P2
<400> 4
ctccccacgc tttagcacat 20

Claims (3)

1.两类猪肺部病原菌的双重PCR引物，其特征在于，该引物的核苷酸序列为：
（1）副猪嗜血杆菌特异性引物Hps：
上游引物H1：3’-ATACCCTGGTAGTCCACGCT-5’，
下游引物H2：3’-ATTGGCTTCGTCACCCTCTG-5’；
（2）多杀性巴氏杆菌特异性引物Pm：
上游引物P1：3’- TTCCAGGTGTAGCGGTGAAA-5’，
下游引物P2：3’- CTCCCCACGCTTTAGCACAT-5’。
2.根据权利要求1所述的两类猪肺部病原菌的双重PCR引物，其特征在于，所述副猪嗜血杆菌特异性引物Hps的扩增产物大小为475bp，所述多杀性巴氏杆菌特异性引物Pm的扩增产物大小为131bp。
3.利用权利要求1或2所述两类猪肺部病原菌的双重PCR引物进行双重PCR检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）待测样品DNA提取；
（2）以待测样品DNA为模板，利用引物对Hps及Pm进行双重PCR扩增；
（3）扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测及判断：PCR反应终止后，琼脂糖电泳检测扩增结果：扩增得到475bp大小产物则判定为检测出副猪嗜血杆菌，扩增得到131bp大小产物则判定为检测出多杀性巴氏杆菌，同时得到475bp及131bp大小产物则判定为副猪嗜血杆菌和多杀性巴氏杆菌混合感染。
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