CN113718062B - 乙型流感病毒分型鉴定的引物和探针组、产品与用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体而言，提供了一种用于乙型流感病毒分型鉴定的引物和探针组、产品与用途。本发明提供的引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1和2所示，探针组核苷酸序列如SEQ ID NO.3和4所示，该引物和探针组可以实现一个反应体系中乙型流感病毒两种类型的同时检测，并且由于选择保守区域作为靶区域设计，可以保证检测稳定性，改善由于病毒突变需要时常更新检测引物和探针的弊端。同时含有该引物和探针组的反应液和试剂盒均具有良好的检测性能。

Description

乙型流感病毒分型鉴定的引物和探针组、产品与用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种乙型流感病毒分型鉴定的引物和探针组、产品与用途。
背景技术
流感是以一种由甲型、乙型或丙型流感病毒引起的急性呼吸道疾病，呈季节性流行或局部暴发特征。流感病毒属于正粘病毒科，是一种单链负义RNA病毒，基因组分节段。其中甲型流感病毒常引起世界范围内的流感大流行，而乙型则是季节型流行趋势。与甲型流感不同，人类是乙型流感病毒的唯一宿主，乙型流感病毒不分HA和NA亚型，而是划分为抗原不同的两个分支，即victoria系和Yamagata系。
每年乙型流感病毒一个或两个分支，与季节性H1N1或季节性H3N2亚型流感病毒共流行，发病率仅次于季节性H3N2亚型流感病毒。
由于Real-time RT-PCR(rRT-PCR)的众多优点，现在已经是生命科学领域的一项常规技术。通过rRT-PCR方法对流感病毒型别进行鉴定，能够在较短时间内对疑似感染样本进行确诊，该方法应用于临床标本检测时，可用于呼吸道病原监测以及临床流行病学研究。应用rRT-PCR方法对病毒核酸进行检测时，其难点之一在于病毒的变异为引物和探针设计带来困难，为了准确对流行中的流感病毒进行鉴定，需要定期对流行毒株的序列进行比对和分析，如分型鉴定引物探针不再适用于流行的毒株，则需要对引物和探针序列进行更新。其二在于对不同的亚型或亚系进行鉴定的探针使用相同的荧光标记，同一检测反应体系中只能对一种亚型或亚系的流感病毒进行分型鉴定，如果需要对多个亚型或亚系进行分型鉴定，则需要更多的标本量，反应体系的配置和鉴定结果报告时间相应的增加。
如何避免反复设计引物和探针同时实现毒株的准确检测，以及一管检测是目前需要解决的问题。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种用于乙型流感病毒victoria系和Yamagata系分型鉴定的引物和探针组。
本发明的第二目的在于提供上述引物和探针组的用途。
本发明的第三目的在于提供一种乙型流感病毒victoria系和Yamagata系分型鉴定的反应液。
本发明的第四目的在于提供一种乙型流感病毒victoria系和Yamagata系分型鉴定的试剂盒。
本发明的第五目的在于提供一种非疾病诊断和治疗目的的分型鉴定乙型流感病毒victoria系和Yamagata系的方法。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种用于乙型流感病毒victoria系和Yamagata系分型鉴定的引物和探针组，所述引物和探针组如下所示：
上游引物：5’-AACTGYACAGATCTGGATGT-3’(SEQ ID NO.1)，其中，第13位碱基C为锁核酸修饰碱基；
下游引物：5’-GATGTAACAGGTCTGAC-3’(SEQ ID NO.2)，其中，第15位碱基G为锁核酸修饰碱基；
victoria系探针：5’-CTTGGGCAGACCAAAATGCACA-3’(SEQ ID NO.3)，其中，第3位碱基T修饰荧光基团，第16位碱基A修饰淬灭基团，第22位碱基A为磷酸化碱基；
Yamagata系探针：5’-CAGGCCAATGTGTGTGGGGACC-3’(SEQ ID NO.4)，其中，第5位碱基C修饰荧光基团，第20位碱基A修饰淬灭基团，第22位碱基C为磷酸化碱基；
所述victoria系探针和Yamagata系探针的荧光基团互不相同。
进一步地，victoria系探针的荧光基团为FAM，Yamagata系探针的荧光基团为HEX，victoria系探针和Yamagata系探针的淬灭基团均独立地为BHQ1。
上述引物和探针组在制备用于乙型流感病毒victoria系和Yamagata系分型鉴定的产品中的应用。
一种用于乙型流感病毒victoria系和Yamagata系分型鉴定的反应液，所述反应液中含有上述引物和探针组。
进一步地，所述反应液还包括DNA聚合酶，所述DNA聚合酶包括Taq酶、Vent酶和Tth酶中的至少一种，优选为Taq酶、Vent酶和Tth酶；
优选地，所述反应液还包括UNG酶；
优选地，所述反应液还包括增强剂，所述增强剂为：T4 Gene 32 Protein 0.5-1g/L、MnCl2 2.0-3.0g/L，SSB单链结合蛋白0.8-1.0g/L，焦磷酸酶0.5-1g/L，氯化四甲基铵1.0-2.0g/L，叠氮钠0.08-1.0g/L和BSA 0.8-1.0g/L。
进一步地，所述反应液还包括逆转录酶、RNA酶抑制剂、酶稀释液、dNTPs、Mg2+和反应缓冲液中的至少一种。
进一步地，所述反应液为冻干制剂，冻干保护剂为：甘露醇0.6-0.8g/L，吐温20 2-3％，BSA 0.8-1.0g/L，明胶1-2％，山梨醇糖1-2％，精氨酸1.0-3.0g/L，葡聚糖1.0-3.0g/L和海藻糖1.0-3.0g/L。
一种用于乙型流感病毒victoria系和Yamagata系分型鉴定的试剂盒，所述试剂盒包括上述反应液。
进一步地，所述试剂盒还包括阳性对照液和阴性对照液。
一种非疾病诊断和治疗目的的分型鉴定乙型流感病毒victoria系和Yamagata系的方法，利用上述反应液或试剂盒对待检测样本进行扩增检测，根据荧光信号判断待检测样本中的乙型流感病毒类型。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的引物和探针组是针对乙型流感病毒victoria系和Yamagata系进行特殊设计得到的，可以实现一个反应体系中乙型流感病毒两种类型的同时检测，并且由于选择保守区域作为靶区域设计，可以保证检测稳定性，改善由于病毒突变需要时常更新检测引物和探针的弊端。
该引物和探针组在检测时，由于victoria系和Yamagata系共用一对引物，所以也做到了尽可能减少核酸片段的数量，提高检测体系的灵敏度。
上游引物和下游引物通过特定碱基锁核酸修饰实现调整引物的结合自由能分布，使得结合自由能呈正弦分布，不仅可以提高引物与模板结合的稳定性，同时大大提高了特异性。两种探针均采用特定的多种修饰，目的在于尽可能降低探针自身的本底信号值，提高检测的灵敏度。
本发明通过选用特异性高的引物和Taqman探针，能够快速特异性地检测乙型流感病毒，同时选用两种不同的荧光标记探针，避免了多重荧光反应体系中不同引物之间干扰，实现单次检测即可对两种亚系的乙型流感病毒进行分型鉴定，进一步简化操作，节省检测时间。
以上述引物和探针组作为扩增引物的相关产品，例如反应液、试剂盒等也具有检测稳定性好、操作简单的优势，鉴定方法具有使用方便、时间短、准确性高的优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例2中组合1与组合2扩增乙流victoria系效果对比图；
图2为实施例2中组合1与组合2扩增乙流Yamagata系效果对比图；
图3为实施例3中不同引物探针的修饰方法组合效果图(乙流victoria系)；
图4为实施例3中不同引物探针的修饰方法组合效果图(乙流Yamagata系)；
图5为实施例4中不同浓度UNG酶检测含dUTP产物的对比图(乙流victoria系)；
图6为实施例4中不同浓度UNG酶检测含dUTP产物的对比图(乙流Yamagata系)；
图7为实施例5中不同DNA聚合酶组合方式检测阳性样本的对比效果图(乙流victoria系)；
图8为实施例5中不同DNA聚合酶组合方式检测阳性样本的对比效果图(乙流Yamagata系)；
图9为实施例6中反应液是否含有增强剂的对比效果图(乙流victoria系)；
图10为实施例6中反应液是否含有增强剂的对比效果图(乙流Yamagata系)；
图11为实施例7中灵敏度和扩增效率检测结果示意图(乙流victoria系)；
图12为实施例7中灵敏度和扩增效率检测结果示意图(乙流Yamagata系)；
图13为实施例7中精密度示意图(乙流victoria系)；
图14为实施例7中精密度示意图(乙流Yamagata系)；
图15为实施例8中预分装八连管中的冻干反应液37℃保存30天与冻存于-20℃的冻干粉的检测效果对比(乙流Yamagata系)；
图16为实施例8中预分装八连管中的冻干反应液37℃保存30天与冻存于-20℃的冻干粉的检测效果对比(乙流victoria系)；
图17为实施例9中本发明与文献检测乙型流感病毒victoria系结果图；
图18为实施例9中本发明与文献检测乙型流感病毒Yamagata系结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
一种用于乙型流感病毒victoria系和Yamagata系分型鉴定的引物和探针组，具体信息如下所示：
上游引物：5’-AACTGYACAGATCTGGATGT-3’(SEQ ID NO.1)，其中，第13位碱基C为锁核酸修饰碱基；
下游引物：5’-GATGTAACAGGTCTGAC-3’(SEQ ID NO.2)，其中，第15位碱基G为锁核酸修饰碱基；
victoria系探针：5’-CTTGGGCAGACCAAAATGCACA-3’(SEQ ID NO.3)，其中，第3位碱基T修饰荧光基团，第16位碱基A修饰淬灭基团，第22位碱基A为磷酸化碱基；
Yamagata系探针：5’-CAGGCCAATGTGTGTGGGGACC-3’(SEQ ID NO.4)，其中，第5位碱基C修饰荧光基团，第20位碱基A修饰淬灭基团，第22位碱基C为磷酸化碱基；
所述victoria系探针和Yamagata系探针的荧光基团互不相同。
乙型流感病毒victoria系和Yamagata系的检测共用一对引物组，即上游引物和下游引物，而不是选择2组引物对分别扩增victoria系和Yamagata系HA基因，再通过2条特异性的探针进行victoria系和Yamagata系的分型。众所周知，在同一个反应体系中，引物的数量越少，引物二聚体及非特异性扩增片段形成的可能性越少，此方案可有效提高试剂盒的灵敏度。其中，上游引物和下游引物分别在特定位点含有锁核酸修饰；探针分别在特定位点修饰荧光基团、淬灭基团和磷酸化。
在优选的实施方式中，victoria系探针的荧光基团为FAM，Yamagata系探针的荧光基团为HEX，victoria系探针和Yamagata系探针的淬灭基团均独立地为BHQ1。
上述引物和探针组在制备乙型流感病毒victoria系和Yamagata系分型鉴定的产品中的应用。产品可以为含有引物和探针组的试剂(例如反应液等)、试剂盒等。
一种乙型流感病毒victoria系和Yamagata系分型鉴定的反应液，含有上述的引物和探针组。此外，还可以含有病毒检测所必需的其余试剂。
在优选的实施方式中，反应液还包括DNA聚合酶，DNA聚合酶包括Taq酶、Vent酶和Tth酶中的至少一种，优选为Taq酶、Vent酶和Tth酶。经过大量配比及浓度优化后，同时含有三种酶的组合方式可以显著提高乙型流感病毒victoria系和Yamagata系的检测灵敏度。三者比例优选为2-2.5:0.75-1.5:1.25-1.7。
在优选的实施方式中，反应液还包括UNG酶。
在优选的实施方式中，反应液还包括增强剂，增强剂为：T4 Gene 32 Protein0.5-1g/L、MnCl2 2.0-3.0g/L，SSB单链结合蛋白0.8-1.0g/L，焦磷酸酶0.5-1g/L，氯化四甲基铵1.0-2.0g/L，叠氮钠0.08-1.0g/L和BSA 0.8-1.0g/L。其中，MnCl2和氯化四甲基铵有助于提高扩增效率，T4 Gene 32 Protein和SSB单链结合蛋白有助于稳定单链结构，焦磷酸酶有助于消除PCR过程生成的焦磷酸，从而提高PCR的持续性，BSA有助于提高酶热稳定性，增强PCR的持续性。经过大量配比及浓度优化后，试剂检测流感病毒的信号值及灵敏度得到显著提升。
在优选的实施方式中，反应液还包括逆转录酶、RNA酶抑制剂、酶稀释液、dNTPs、Mg2+和反应缓冲液中的至少一种。
在优选的实施方式中，反应液为冻干制剂，冻干保护剂为：甘露醇0.6-0.8g/L，吐温20 2-3％，BSA 0.8-1.0g/L，明胶1-2％，山梨醇糖1-2％，精氨酸1.0-3.0g/L，葡聚糖1.0-3.0g/L和海藻糖1.0-3.0g/L，优选为甘露醇0.6g/L，吐温20 2％，BSA 0.8g/L，明胶1％，山梨醇糖1％，精氨酸1.0g/L，葡聚糖1.0g/L和海藻糖1.0g/L。冻干制剂可以直接做成预分装冻干八连管的形式，开封后直接加入提取好的核酸进行检测，省时、省力，通量大并且灵敏度高。并且，本发明提供的冻干保护剂使得试剂的热稳定性显著增加，可在37℃稳定储存至少一个月的时间，从而减少对低温运输和储存的依赖。其中，甘露醇能够提高冻干过程的稳定，吐温20、BSA、明胶有助于提高酶热稳定性和冻融稳定性，增强PCR的持续性，精氨酸，山梨糖醇，葡聚糖和海藻糖有助于提高酶的冻融稳定性和构象。
本发明还提供一种乙型流感病毒victoria系和Yamagata系分型鉴定的试剂盒，试剂盒包括本发明的反应液。
在优选的实施方式中，试剂盒还包括阳性对照液和阴性对照液。
阳性对照液可以为乙型流感病毒victoria系和Yamagata系病毒样颗粒，阴性对照液可以为1％的氯化钠溶液。
一种非疾病诊断和治疗目的的分型鉴定乙型流感病毒victoria系和Yamagata系的方法，利用本发明的反应液或试剂盒对待检测样本进行扩增检测，根据荧光信号判断待检测样本中的乙型流感病毒类型。该方法可以实现待检测样本是否含有乙型流感病毒检测，也可以实现何种乙型流感病毒的定性和定量检测。
在优选的实施方式中，具体检测方法可以如下：
S1、预处理，分别取出阳性对照液和阴性对照液，并在室温下融化，充分振荡混匀后瞬间离心；
S2、核酸提取：待测样本与阳性对照液、阴性对照液同步进行核酸提取；
S3、加样：取出装有流感病毒反应液的预分装冻干八连管，加入待测样本、阳性对照和阴性对照的核酸各25μL，盖紧管盖，振荡均匀后瞬时离心；
S4、扩增和荧光信号检测，将步骤S3得到的PCR反应管放置在荧光定量PCR仪中进行扩增和荧光信号检测；
扩增反应的反应条件为：55℃，2分钟，1个循环；97℃，1分钟，1个循环；97℃，1秒，55℃，10秒，45个循环；
S5、判断样本检测结果。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本发明提供的一种乙型流感病毒分型检测试剂盒中反应液的组分如下所示，后续实施例均以此为基础进行：
试剂名称 加入体积(μl)/50反应
乙型流感病毒上游引物100uM 5
乙型流感病毒下游引物100uM 5
乙型流感病毒victoria系探针(FAM)100uM 2.5
乙型流感病毒Yamagata系探针(HEX)100uM 2.5
UNG(5U/μl) 1
DNA聚合酶(2.5U/μl) 40
逆转录酶(200U/μl) 2.5
RNA酶抑制剂(40U/μl) 2.5
酶稀释液 154
dATP 100mM 2.5
dCTP 100mM 2.5
dGTP 100mM 2.5
dUTP 100mM 2.5
10×buffer 125
MgCL2(25mM) 150
冻干保护剂 100
增强剂 100
DEPC 300
总汁 1000
其中，冻干保护剂：甘露醇0.6g/L，吐温202％，BSA 0.8g/L，明胶1％，山梨醇糖1％，精氨酸1.0g/L，葡聚糖1.0g/L和海藻糖1.0g/L。
增强剂：T4 Gene 32 Protein 0.65g/L、MnCl2 2.2g/L，SSB单链结合蛋白0.92g/L，焦磷酸酶0.75g/L，氯化四甲基铵1.25g/L，叠氮钠0.09g/L和BSA0.85g/L。
实施例1、乙型流感病毒victoria系和Yamagata系引物和探针的设计与合成
下载GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html)中2010至2020年中国地区和GISAID(http://platform.ogisaid.org/epi3/frontend)数据库中乙型流感病毒的HA基因，软件比对分析不同病毒各个基因序列的一致性，选择相对保守区设计全基因组特异性扩增引物序列。引物设计中同一变异位点允许4个及4个以下简并碱基。将所提取的备选引物和探针满足以下要求进行筛选：①探针与同链引物位置接近，PCR产物大小在100bp到150bp之间；②引物和探针的GC％在25％到75％之间；③引物长度20bp左右，Tm值在58℃到60℃之间，探针长度20bp到30bp，Tm值比引物高5℃到10℃；④polyN≤4bp；⑤Hairpin≤4bp；⑥覆盖率≥90％；⑦进行BLAST筛选，特异性分数＞L×0.4；⑦探针5’端应避免使用碱基G。
引物和探针序列信息如表1所示：
表1引物和探针序列信息表
实施例2、单组引物与双组引物组合的对比测试
在研发的过程中分别使用单组引物+2条分型探针(实施例1)与两组引物+2条分型探针进行了对比实验，将2株已知确定为乙型流感病毒的样本进行测序，确定其所属乙型流感的型别。2株乙型流感病毒的样本中1株为乙型流感病毒victoria系，1株为乙型流感病毒Yamagata系。组合1为本发明提供的引物探针组合(单组引物+2条分型探针，实施例1)，组合2为研发过程中设计的两组引物+2条分型探针，2组引物探针同时进行检测(组合1和组合2中所用的探针相同)，结果显示，组合1效果要优于组合2效果(如图1-2所示)。表明本发明在实际应用检测中具有良好的扩增效率。
其中，组合2的两组引物如下：
victoria系上游引物：CAAATCTCAAAGGAACAGAA(SEQ ID No.5)；
victoria系下游引物：AGATGTAACAGGTCTGACTTCA(SEQ ID No.6)；
Yamagata系上游引物：AATCTCAAAGGAACAAGGACC(SEQ ID No.7)；
Yamagata系下游引物：TGTAACAGGTCTGACCTCGTG(SEQ ID No.8)。
实施例3、不同引物探针的修饰方法组合
设置3种不同引物探针的修饰方法组合，进行对比评价，修饰组合方法见表2。
表2不同引物探针修饰组合方法
3种修饰组合对比来看，修饰1的引物探针信号值及扩增曲线均明显好于其他修饰方法，不同修饰方式下的检测结果见图3-4。由结果可知，修饰1和修饰2的扩增效果要优于修饰3，上下游引物中的特定碱基经锁核酸修饰后，Tm值变高，自由能成正态分布，因而与模块的结合效率提高，扩增效率相比于不做修饰更高，进而改善了体系扩增的效率问题。探针经过多重修饰后，本地信号值更低，进而提升检测的信号值。本发明提供的引物探针的组可同时提升检测灵敏度和信号值。
实施例4、UNG酶浓度测试
体系中加入不同浓度的UNG酶：浓度1(3.0U/uL)、浓度2(6.0U/uL)、最佳浓度(5.0U/uL)，以1×104copies/mL的含dU的产物为模板进行扩增，结果显示，最佳浓度UNG酶无扩增曲线，表明5U/uL的UNG酶能够消除不高于1×104copies/mL的产物的污染，起到防污染的效果，检测结果见图5-6。
实施例5、不同的DNA聚合酶组合方式
设置4种不同的DNA聚合酶组合方式，分别为体系中加入2.2U Taq酶+1.7U Tth酶(组合1)、2.2U Taq酶+0.75U Vent酶+1.7U Tth酶(组合2)、2.2U Taq酶+0.75U Vent酶(组合3)、仅含2.2U Taq酶(组合4)4种组合，对比检测乙型流感阳性样本，对比检测结果如下图。从图7-8中可知，体系中同时加入2.2U Taq酶、0.75U Vent酶和1.7U Tth酶时，反应体系扩增效果最佳。
实施例6、添加增强剂进行对比
本发明提供的反应液中含有增强剂，具有增强乙型流感病毒反应液稳定性的效果，同时也可显著提高灵敏度及信号值。具体检测结果见图9-10，实施方案中去除增强剂和加入增强剂的对比效果图，可明显看到无论高浓度样本还是低浓度样本，增强剂均有显著提升效果。
实施例7、灵敏度、扩增效率和精密度检测结果
图11为乙型victoria系流感病毒HA基因阳性参考品10倍梯度稀释，选取10个浓度的模板进行灵敏度和扩增效率检测的检测结果示意图；阳性参考值为Ct值等于40，最低检测限为100copies/mL，扩增效率为95.676％；
图12为乙型Yamagata系流感病HA基因阳性参考品10倍梯度稀释，选取10个浓度的模板进行灵敏度和扩增效率检测的检测结果示意图；阳性参考值为Ct值等于40，最低检测限为100copies/mL，扩增效率为97.457％；
图13为乙型victoria系流感病毒HA基因阳性参考品重复检测计算Ct值的变异系数的结果示意图；CV＝1.3％；
图14为乙型Yamagata系流感病毒HA基因阳性参考品重复检测计算Ct值的变异系数的结果示意图；CV＝1.03％。
实施例8、不同储存条件下冻干粉的检测效果对比
本发明中乙型流感病毒反应液为预分装在冻干八连管中的冻干粉，具有操作简便，上样量大的效果，稳定性更强，置于37℃条件下可稳定保存30天。实施方案中将预分装在冻干八连管中的冻干粉置于37℃条件下储存30天，与正常冻存于-20℃条件保存的冻干粉的检测效果对比。可以明显观察到同浓度之间曲线差异很小，表明冻干粉37℃保存30天储存性能良好，检测结果见图15-16。
实施例9、与已知文献中引物探针检测真实样本结果对比
将本发明(实施例1，引物探针不带有任何修饰)与查阅文献所获取的引物探针进行对比。将12株已知确定为乙型流感病毒的样本进行测序，确定其所属乙型流感的型别。12株乙型流感病毒的样本中6株为乙型流感病毒victoria系，6株为乙型流感病毒Yamagata系。用本发明与文献(DOI：10.1016/j.jviromet.2014.04.016)进行同时检测，结果显示文献的方法都存在明显延迟(如图17-18所示)。表明本发明在实际应用中有良好的特异性和检出率。
其中，文献中引物探针信息如下：
victoria系上游引物CCTGTTACATCTGGGTGCTTTCCTATAATG(SEQ ID NO.9)；
victoria系下游引物GTTGATARCCTGATATGTTCGTATCCTCKG(SEQ ID NO.10)；
victoria系探针TTAGACAGCTGCCTAACC(SEQ ID NO.11)；
Yamagata系上游引物：CCTGTTACATCCGGGTGCTTYCCTATAATG(SEQ ID NO.12)；
Yamagata系下游引物：GTTGATAACCTKATMTTTTCATATCCTCTG(SEQ ID NO.13)；
Yamagata系探针：TCAGGCAACTASCCAATC(SEQ ID NO.14)。
本发明选择在相对保守区域设计引物探针，选用特异性高的引物和Taqman探针，能够快速特异性地检测乙型流感病毒，同时选用两种不同的荧光标记探针，优化了反应体系中引物和探针的浓度，避免了多重荧光反应体系中不同引物之间干扰，并添加增强剂，实现单次检测即可对两种亚系的乙型流感病毒进行分型鉴定，进一步简化操作，节省检测时间，仅需30min即可完成扩增，加上样本核酸提取10min，从获得样本到得到检测结果，40min内即可完成全部检测。同时，各靶标灵敏度均可达100copies/mL，通过冻干保护剂，使得试剂盒热稳定性显著增加，可于37℃稳定储存1个月，从而减少对低温运输和储存的依赖。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海伯杰医疗科技有限公司
<120> 乙型流感病毒分型鉴定的引物和探针组、产品与用
途
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aactgyacag atctggatgt 20
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gatgtaacag gtctgac 17
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cttgggcaga ccaaaatgca ca 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
caggccaatg tgtgtgggga cc 22
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
caaatctcaa aggaacagaa 20
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
agatgtaaca ggtctgactt ca 22
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
aatctcaaag gaacaaggac c 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tgtaacaggt ctgacctcgt g 21
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cctgttacat ctgggtgctt tcctataatg 30
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gttgatarcc tgatatgttc gtatcctckg 30
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ttagacagct gcctaacc 18
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
cctgttacat ccgggtgctt ycctataatg 30
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gttgataacc tkatmttttc atatcctctg 30
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
tcaggcaact asccaatc 18

Claims (11)

1.一种用于乙型流感病毒victoria系和Yamagata系分型鉴定的反应液，其特征在于，所述反应液包括引物、探针组和增强剂；
所述引物和探针组如下所示：
上游引物：5’-AACTGYACAGATCTGGATGT-3’(SEQ ID NO.1)，其中，第13位碱基C为锁核酸修饰碱基；
下游引物：5’-GATGTAACAGGTCTGAC-3’(SEQ ID NO.2)，其中，第15位碱基G为锁核酸修饰碱基；
victoria系探针：5’-CTTGGGCAGACCAAAATGCACA-3’(SEQ ID NO.3)，其中，第3位碱基T修饰荧光基团，第16位碱基A修饰淬灭基团，第22位碱基A-为磷酸化碱基；
Yamagata系探针：5’-CAGGCCAATGTGTGTGGGGACC-3’(SEQ ID NO.4)，其中，第5位碱基C修饰荧光基团，第20位碱基A修饰淬灭基团，第22位碱基C为磷酸化碱基；
所述victoria系探针和Yamagata系探针的荧光基团互不相同；
所述增强剂为：T4 Gene 32Protein 0.5-1g/L、MnCl2 2.0-3.0g/L，SSB单链结合蛋白0.8-1.0g/L，焦磷酸酶0.5-1g/L，氯化四甲基铵1.0-2.0g/L，叠氮钠0.08-1.0g/L和BSA0.8-1.0g/L。
2.根据权利要求1所述的反应液，其特征在于，victoria系探针的荧光基团为FAM，Yamagata系探针的荧光基团为HEX，victoria系探针和Yamagata系探针的淬灭基团均独立地为BHQ1。
3.根据权利要求1所述的反应液，其特征在于，所述反应液还包括DNA聚合酶，所述DNA聚合酶包括Taq酶、Vent酶和Tth酶中的至少两种。
4.根据权利要求3所述的反应液，其特征在于，所述DNA聚合酶为Taq酶、Vent酶和Tth酶。
5.根据权利要求1所述的反应液，其特征在于，所述反应液还包括UNG酶。
6.根据权利要求1所述的反应液，其特征在于，所述反应液还包括逆转录酶、RNA酶抑制剂、酶稀释液、dNTPs、Mg2+和反应缓冲液中的至少一种。
7.根据权利要求1-6任一项所述的反应液，其特征在于，所述反应液为冻干制剂，冻干保护剂为：甘露醇0.6-0.8g/L，吐温20 2-3％，BSA 0.8-1.0g/L，明胶1-2％，山梨醇糖1-2％，精氨酸1.0-3.0g/L，葡聚糖1.0-3.0g/L和海藻糖1.0-3.0g/L。
8.权利要求1-7任一项所述的反应液在制备用于乙型流感病毒victoria系和Yamagata系分型鉴定的产品中的应用。
9.一种用于乙型流感病毒victoria系和Yamagata系分型鉴定的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-7任一项所述的反应液。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照液和阴性对照液。
11.一种非疾病诊断和治疗目的的分型鉴定乙型流感病毒victoria系和Yamagata系的方法，其特征在于，利用权利要求1-7任一项所述的反应液或权利要求9或10所述的试剂盒对待检测样本进行扩增检测，根据荧光信号判断待检测样本中的乙型流感病毒类型。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107893130A (zh) * 2017-12-26 2018-04-10 湖南圣湘生物科技有限公司 流感病毒分型检测用的引物和探针、试剂盒及试剂盒的使用方法
CN108179224A (zh) * 2018-01-29 2018-06-19 上海伯杰医疗科技有限公司 B型流感病毒分型鉴定用引物探针和鉴定方法
CN109897917A (zh) * 2019-04-01 2019-06-18 广东和信健康科技有限公司 一种甲流、乙流及腺病毒多重核酸检测引物探针组及其试剂盒

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107893130A (zh) * 2017-12-26 2018-04-10 湖南圣湘生物科技有限公司 流感病毒分型检测用的引物和探针、试剂盒及试剂盒的使用方法
CN108179224A (zh) * 2018-01-29 2018-06-19 上海伯杰医疗科技有限公司 B型流感病毒分型鉴定用引物探针和鉴定方法
CN109897917A (zh) * 2019-04-01 2019-06-18 广东和信健康科技有限公司 一种甲流、乙流及腺病毒多重核酸检测引物探针组及其试剂盒

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