JP2018503390A - 基質分子 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2015年1月30日に出願された米国仮特許出願第62/110,237号の優先権を主張する。この出願の全内容は参照により本明細書に組み入れられる。
核酸増幅反応は、標的核酸が存在しないこと(真陰性)、または特異的増幅が阻害されること(偽陰性)に起因して、反応しない場合がある。従って、反応しない原因を理解することは、陰性結果の解釈に影響を与え得る。陽性対照を使用すると、反応成分に起因する失敗を除外することによって、陰性結果が真陰性であるという確信を高めることができる。感染因子を検出するための手段として核酸増幅反応を用いる場合、陰性増幅が真に陰性の試料を表すことを示すために、陽性対照は特に有用である。
「アンプリコン」は、関心対象のポリヌクレオチドの増幅の際に生成されるポリヌクレオチドを意味する。一例において、アンプリコンは、ニッキング増幅反応の際に生成される。
本発明は、基質に対するニッキング酵素およびポリメラーゼの活性によって放出されて蛍光を発することができるクエンチされた蛍光体を有する、ニッキングおよび伸長反応のための核酸基質分子を特徴とする。本発明の基質分子は、既存のニッキング増幅反応に添加され得、従って、ニッキング増幅反応において外在性対照分子として使用され得る。このことに関して、当該外在性対照分子は、ニッキング増幅反応において存在するニッキング酵素活性およびポリメラーゼ酵素活性の両方についての対照を提供する。外在性対照反応は、並行して進むが、はっきりと感知できるほどには主要な増幅反応に干渉しない。例えば、外在性対照は、大量の反応成分(例えばdNTP)を消費しない。外在性対照は、非特異的ポリメラーゼ伸長およびバックグランド干渉をもたらし得る3'末端の形成を最小限にするように設計され得る。本明細書において示されるように、外在性対照分子はまた、特定の時間で開始するように「チューニング」され得る。本発明の基質分子はそれ単独で、酵素性能試験において、または酵素品質を検査するために、使用され得る。
本発明は、反応におけるニッキング酵素およびポリメラーゼの活性を試験または確認するために使用することができる、ニッキングおよび伸長の基質分子を提供する。図1A〜1Eを参照すると、当該基質分子は、一方の末端が検出可能なレポーター(例えば、蛍光体・クエンチャー対;蛍光エネルギー移動(FRET)用のドナー・アクセプター対)で標識されたオリゴヌクレオチド二重鎖を含む。いくつかの態様では、2つのオリゴヌクレオチド鎖は共有結合されている。当該オリゴヌクレオチド二重鎖はニッキング酵素認識部位を含有し、その結果、当該分子がニッキングされると、ニックによって露出された3'末端がポリメラーゼ伸長を駆動することができ、これは検出可能なレポーターの活性化をもたらす。特定の態様では、検出可能なレポーターは、クエンチャー分子と対になった蛍光レポーター(例えば、FAM)である(例えば、当技術分野において公知の、相互作用する任意の蛍光体とクエンチャーの対またはFRETドナー・アクセプター対)。蛍光レポーターは、ポリメラーゼの鎖置換活性、およびクエンチャーからの蛍光体の分離によって活性化される。蛍光レポーターは、オリゴヌクレオチド二重鎖の3'末端または5'末端のいずれかに共有結合されており、クエンチャーは、反対側の鎖の、それぞれ5'末端または3'末端のいずれかに共有結合されている。ある態様では、蛍光体は、FAM、TET、HEX、TAMRA、JOE、またはROXのうちの1つまたは複数である。様々な態様において、クエンチャーは、ダブシル(dabcyl)、ダブシル(dabsyl)、Black Hole Quencher色素(5' Iowa Black(登録商標)RQ (5IabRQ)を含む)のうちの1つまたは複数である。一般に、クエンチング色素は、励起が適合したクエンチング色素である。蛍光体・クエンチャー対およびそれらの選択は、例えば、Marras, Selection of Fluorophore and Quencher Pairs for Fluorescent Nucleic Acid Hybridization Probes in Methods in Molecular Biology: Fluorescent Energy Transfer Nucleic Acid Probes: Designs and Protocols. Edited by: V.V. Didenko(著作権)Humana Press Inc., Totowa, NJに記載されている。ニッキングおよび伸長の基質が外在性対照として使用される場合、検出可能な蛍光マーカーは、標的核酸増幅を検出するためのプローブにおいて使用されるものとは異なる検出可能な蛍光シグナルを提供するように選択される(例えば、FAMおよびCalRed)。好ましい態様において、遊離3'末端(即ち、蛍光レポーターやクエンチャーを有さない)は、ポリメラーゼ伸長反応において使用されるのを防ぐためにブロックされる。遊離3'は、3炭素スペーサー(C3-スペーサー)またはジデオキシヌクレオチドを使用してブロックされ得る。リン酸化、色素、蛍光体、クエンチャー、スペーサー、またはリンカーを含む、多数の修飾が、合成の間に遊離3'末端に付加され得、これにより伸長が妨げられる。
ニッキングおよび酵素基質分子は、反応におけるニッキング酵素およびポリメラーゼの活性を決定するために使用され得る。基質分子はそれ単独で、ニッキング酵素およびポリメラーゼの組み合わせを評価するために使用され得るか、ニッキング酵素およびポリメラーゼの最適な動作条件を同定するために、またはニッキング酵素およびポリメラーゼの品質を検査するために、使用され得る。本明細書に記載の方法において使用するためのポリメラーゼは、鎖置換活性と合わせて二本鎖DNA分子中のニック部位における3'ヒドロキシル末端を伸長するため、および/または、標的核酸分子に結合されたオリゴヌクレオチド(例えばプライマー)の3'ヒドロキシル末端を伸長するための、ヌクレオチドの組み込みを触媒することができる。例示的なポリメラーゼとしては、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス(Geobacillus stearothermophilus)としても分類されるバチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)から、ならびにゲオバチルス(Geobacillus)属を含む密接に関連する細菌の系統、単離された株、および種から単離された、DNAポリメラーゼIの誘導体および変異体(これらは、5'-3'エキソヌクレアーゼ活性が欠けているかまたは実質的に低減しており、鎖置換活性を有する)、ならびに、Bst DNAポリメラーゼI、Bsu DNAポリメラーゼ、Gst DNAポリメラーゼI、およびGka DNAポリメラーゼI、およびphi29 DNAポリメラーゼのラージフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。そのようなポリメラーゼはまた、5'-3'エキソヌクレアーゼ活性が欠けているかまたは実質的に低減されており、好熱性であるものを含み得る(例えば、Taq、Vent)。これに関して、本発明は、ニッキング酵素およびポリメラーゼの組み合わせの単位活性を定量するための手段も提供する。さらに、本発明の基質分子は、例えば、DNAメチル化を含む、様々な条件下での、またはDNA付加物/損傷生成物(例えば、アセトアルデヒド、シスプラチン、7,12-ジメチルベンゾアントラセン、マロンジアルデヒド、塩基除去修復の生成物、酸化的損傷生成物、ベンゾピレン、アフラトキシン、他のDNA反応性化合物)および/もしくはDNA結合タンパク質の存在下での、ポリメラーゼの処理能力を研究するために使用され得る(図3Aおよび3B)。さらに、処理能力を研究するために、(異なる複数の蛍光体を含む)1つまたは複数の蛍光体・クエンチャー対が、二重鎖内で共有結合され(例えば、ビオチン化され)得る(図3A)。例えば、1〜5個の蛍光体が、1チャネル当たり1つ、直接標識(例えば、スクシンイミジルエステル)によって結合されるか、またはビオチン化され、使用され得る。1つまたは複数の重複するクエンチャーが、反対側の鎖上で対になり得る。いくつかの場合において、重複するクエンチャーは、広いスペクトル領域をカバーし、複数の異なる蛍光体と対になり得る。このように、本発明の基質分子は修飾され得、ポリメラーゼ伸長および/または処理能力に対する修飾の効果が調べられ得る。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、DNAを増幅するために使用される一般的なサーモサイクリング依存核酸増幅技術であり、DNA融解とDNAポリメラーゼを使用したDNAの酵素的複製とのための反応物の加熱および冷却の反復サイクルからなる。リアルタイム定量的PCR(qPCR)は、生物学的試料中の所与の核酸配列のコピー数を定量するために使用される技術である。現在、qPCRは、反応の全体にわたるリアルタイムでの反応産物の検出を利用し、増幅プロファイルを、各反応の開始時に既知量の核酸(または未知の検査核酸に対する既知の相対比率の核酸)を含有する対照の増幅と比較する。典型的には、標準反応増幅曲線の対数部分に基づいて、対照の結果を使用して標準曲線を構築する。これらの値は、それらの増幅曲線がどこで標準対照量と匹敵するかに基づいて未知物の量を内挿するために使用される。
本発明は、等温ニッキング増幅アッセイにおいて増幅された標的核酸分子の検出と共に使用するための基質分子を提供する。そのようなアッセイは、当技術分野において公知であり、本明細書に記載されている。例えば、米国特許出願公開第2009/0081670号、PCT出願第2009/012246号、ならびに米国特許第7,112,423号および第7,282,328号を参照のこと;これらの各々はその全体が本明細書に組み入れられる。
プライマー設計のための従来の方法は、プライマー融解温度、プライマーアニーリング温度、GC(グアニンおよびシトシン)含有量、プライマー長、および、プライマーが標的核酸以外と相互作用することを最小化することに焦点を合わせてきた(例えば、www.premierbiosoft.com/tech_notes/PCR_Primer_Design.htmlを参照のこと)。これらの方法とは対照的に、形成の自由エネルギー(ΔG)の観点から表される安定なプライマー/二量体を形成するプライマーが、核酸増幅反応において予測可能に機能することが見出された。自由エネルギー(ΔG)と融解温度(Tm)は、主成分エンタルピー(ΔH)およびエントロピー(ΔS)を共有するが、ΔGとTm値は異なって導かれ、相関関係を有さず、所与のΔGを所与のTm値と関連付ける唯一の方法は、それらが由来するΔHおよびΔSの値を明確に知ることである(Manthey, “mFold, Delta G, and Melting Temperature”(著作権)2005 and 2011 Integrated DNA Technologies)。図1〜11は最適なプライマーの設計に関する。
本発明は、そのプライマー・標的形成が安定(ΔG≦約-20 kcal/molまたはそれ以上)であって核酸増幅反応性能を増強する可能性を有する3'認識配列を有する、プライマーを提供する。3'認識領域は、核酸分子に、例えば核酸分子の相補配列に、特異的に結合する。ある態様において、3'認識領域は、核酸配列の12、13、14、15、16、17、18、19、または20塩基以上と相補的である配列を有する。特定の態様において、3'認識領域は、1つまたは複数のイノシン塩基を含む。特定の態様において、3'認識領域は、多くとも2/12のイノシンを含む。様々な態様において、プライマー・標的融解温度は、アッセイの反応または伸長温度の8または6℃下の温度以上である(Tm≧アッセイ温度−8℃)。特定の態様において、3'認識配列は、12〜20、12〜17、または12〜14塩基を含む。特定の態様において、プライマー・標的形成は、自己二量体形成よりも安定である(例えば、ΔΔG≦約-15、-16、-17、-18、-19、-20 kcal/molまたはそれ以上)。好ましくは、3'認識配列は、プライマー・標的アニーリングに干渉する可能性を有する、自己相補配列、短い逆位反復(例えば>4塩基/反復)、または他の方法で分子内相互作用を促進する配列を含有しない。
本発明は、核酸増幅反応性能を増強する、自己二量体化することができる5'尾部領域を有するプライマーを提供する。理論に束縛されることなく、核酸増幅反応において、このプライマーはプライマー二量体として標的核酸にアニールする。例えば、ニッキング増幅プライマーは、標的認識配列に対するプライマーの結合特異性とは関係しない5'末端に存在するニッキング剤認識部位を有する。非特異的プライマー相互作用に由来する非特異的バックグラウンド産物は、それがなければ特異的産物の増幅のために利用されるはずである反応成分を捕捉する可能性を有する。様々な態様において、ホモ二量体形成が安定である(例えば、ΔG≦約-30、-35、-40、-45、-50、-55、-60 kcal/molまたはそれ以上)。様々な態様において、ホモ二量体は、伸長反応温度より高い融解温度を有する。特定の態様において、5'尾部領域はパリンドローム配列を有する。さらなる態様において、5'尾部領域は、少なくとも20塩基(例えば、20、21、22、23、24塩基)長である。追加の態様において、5'尾部領域は、80〜90%のGC含有量を有する。ある態様において、ホモ二量体形成は、より安定性が低い他のプライマー二量体コンフォメーション形成よりも安定である(例えば、ΔΔG≦約-12、-13、-14、-15、-16、-17、-18、-19、-20、-25、-30、-35、-40 kcal/molまたはそれ以上)。
に基づいて作製することができる。この鋳型に基づいて、以下の特性を有する537,824個の5'尾部配列が存在する:ΔG = -48 Kcal/モル〜-62 kcal/モル;ΔΔG < -40 kcal/モル;およびGC含有量68%〜84%。それらの内、1050個の選択配列が提供され、これは配列スペース全体(248,832)の0.2%を表す。例示的な5'尾部領域配列(22ヌクレオチド長)は、Nt.BstNBI認識配列を有し、以下の鋳型
に基づく。この鋳型に基づいて、以下の特性を有する248,832個の5'尾部配列が存在する:ΔG = -47 Kcal/モル〜-55 kcal/モル;ΔΔG < -40 kcal/モル;およびGC含有量72%〜82%。それらの内、200個の選択配列が提供され、これは配列スペース全体(248,832)の0.08%を表す。
本発明の方法および組成物は、検査試料中の核酸分子の増幅および/または同定のために有用である。標的配列は、核酸分子を含む事実上いかなる試料からも増幅される。
本発明のプライマーを使用する標的核酸増幅は、標的核酸分子を迅速に検出するために有用な特徴を有する。本発明の組成物および方法は、迅速な診断的回答が望まれる(例えば、20、15、10、9、8、7、6、5分間以下での検出可能な増幅)ヒトの診断において有用である。特定の態様において、本発明は、当技術分野におけるまたは臨床設定におけるヒトもしくは動物の診断におけるニッキング増幅反応アッセイの使用を提供する。他の態様において、本発明は、サーモサイクリング装置へのアクセスが利用できないかまたは極めて高価となる診断現場作業におけるニッキング増幅反応アッセイの使用を提供する。さらに他の態様において、本発明は、迅速な定量的回答が望まれる臨床設定におけるニッキング増幅反応アッセイの使用を提供する。
本発明は、少なくとも1つのポリメラーゼ停止分子(例えば、オリゴヌクレオチドが標的核酸分子に結合はできるが、検出可能オリゴヌクレオチドプローブを標的として利用する鋳型伸長は支持することができないようにする、ヌクレオチド修飾または他の部分)を含む、増幅不能な検出可能ポリヌクレオチドプローブを使用する、ニッキング増幅反応における標的核酸分子またはそのアンプリコンの定量的検出を提供する。理論に束縛されることを望むことなく、ポリメラーゼの進行を許容しない1つまたは複数の部分の存在は、オリゴヌクレオチドへの非核酸骨格付加においてまたは複製ポリメラーゼの失速を通じて、ポリメラーゼ停止を恐らく引き起こす(即ち、C3-スペーサー、損傷されたDNA塩基、その他のスペーサー部分、2'-OMe塩基)。従って、これらの構築物は、ニッキング増幅反応の過程において、プローブの不当な増幅を抑制または低減する。このことは、増幅を抑制するためにニッキング増幅反応の終了時に添加されなければならない従来の検出プローブからそれらを区別する。
本明細書に記載の方法は、一般的な目的のまたは特別にプログラムされたハードウェアまたはソフトウェアにおいて実施され得る。例えば、本方法は、コンピュータ可読媒体によって実施され得る。従って、本発明はまた、本発明のいずれかの態様によるアルゴリズムおよび/または方法を実施するように構成されたソフトウェアおよび/またはコンピュータプログラム製品も提供する。本発明において提供されるアルゴリズムおよび/または方法を実施できるソフトウェアをどのように構成するかは当業者に周知である。コンピュータ可読媒体は、非一過性および/または有形であり得る。例えば、コンピュータ可読媒体は、揮発性メモリー(例えば、ランダムアクセスメモリーなど)または非揮発性メモリー(例えば、読み出し専用メモリー、ハードディスク、フロッピーディスク、磁気テープ、光学ディスク、紙表、パンチカードなど)であり得る。コンピュータ実行可能指令は、適切なコンピュータ言語またはいくつかの言語の組み合わせで書かれてよい。基本的な計算生物学的方法は、例えば、Setubal and Meidanis et al., Introduction to Computational Biology Methods (PWS Publishing Company, Boston, 1997); Salzberg, Searles, Kasif, (Ed.), Computational Methods in Molecular Biology, (Elsevier, Amsterdam, 1998); Rashidi and Buehler, Bioinformatics Basics: Application in Biological Science and Medicine (CRC Press, London, 2000)およびOuelette and Bzevanis Bioinformatics: A Practical Guide for Analysis of Gene and Proteins (Wiley & Sons, Inc., 2nd ed., 2001)に記載されている。
本発明は、ニッキング酵素およびポリメラーゼの活性をアッセイするためのキットを提供する。様々な態様において、キットは本発明の基質分子を含む。本発明はまた、外在性対照として使用するための本発明の基質分子を含む、核酸分子の増幅のためのキットを提供する。そのようなキットは、対象から得られた生物学的試料中の核酸の検出または定量のために有用である。本発明のキットは、本明細書に記載されているように、例えば、DNAポリメラーゼ、順方向および逆方向プライマー、ならびに1つまたは複数のニッキング酵素、ならびに検出可能なプローブを含み得る。複数の病原体配列が増幅され、これらの標的配列に対して設計された鋳型が同じニッキング酵素についてのニッキング酵素部位を含む場合には、1つまたは2つのニッキング酵素が含まれていてもよい。これらの鋳型が異なるニッキング酵素によって認識される場合には、例えば3個以上などのように、より多くのニッキング酵素がキットに含まれていてもよい。
本発明は、一方の鎖において鎖の3'末端に共有結合している検出可能な蛍光レポーター分子に対して5'側にあるニック部位を有するオリゴヌクレオチド二重鎖であるニッキングおよび伸長反応の基質を提供する(図1Aおよび1B)。反対側の鎖の5'末端にあるクエンチャーは、レポーター分子が蛍光を発するのを防ぐ(図1Aおよび1B)。基質分子がニッキングされると、結果として生じる内部3'末端が、反対側の鎖を鋳型として使用して、ポリメラーゼによって伸長され得る(図1C〜1E)。ポリメラーゼ伸長は、鎖の、蛍光レポーターに連結された部分の置換をもたらす(図1E)。蛍光レポーターがクエンチャーから分離されると、当該レポーターは蛍光シグナルを生じる(図1E)。ニッキングおよび伸長のさらなるラウンドを防ぐまたは最小限にするために、基質分子に対して追加の改良がなされ得る(図1F)。
本発明の一局面において、外在性対照反応をチューニングすることができ、そのため、ニッキング増幅反応の所定の条件セットの下で実行される外在性対照反応をカスタマイズすることが可能である。未修飾および修飾ヌクレオチドを含む基質分子の異なる比率を使用して、反応速度を制御することができる(図8)。修飾されていない上側の鎖(A)に対し、二重メトキシ修飾オリゴヌクレオチド(G)を漸増した。修飾オリゴヌクレオチドの添加量によって、反応速度(勾配)を制御し、予め指定された時間で所望の閾値に達するようにチューニングすることができた。これらの結果は、外在性対照分子の混合物が、陽性反応対照としてだけではなく「反応タイマー」としても使用することができることを示している。
本発明の一局面において、基質分子は、反応条件を試験して、ニッキング酵素およびポリメラーゼの組み合わせの活性を決定し、それらの複合活性を特徴付けるために、使用することができる。ニッキング酵素およびポリメラーゼの特性(例えば、熱的特性)の差異に起因して、全体的なニッキングおよび伸長反応の活性を最大限にするように反応条件を最適化する可能性がある。本発明より以前には、そのような分析は利用不可能であった。修飾された上側の鎖を、ブロックされていない(3'末端がブロックされていない)下側の鎖と共に使用する。これらのオリゴヌクレオチドを用いて、ニッキング酵素および/またはポリメラーゼの活性を試験し、酵素機能の点で真の増幅反応を依然として模倣しながら、高い再現可能性で、非常に制御された反応を提供することができる。ブロックされた3'末端またはブロックされていない3'末端のいずれかが、所望の読み出しに依存して利用され得る。基質分子の反応に対するニッキング酵素濃度の効果を示す研究を行った(図10)。
必要時にサルモネラ菌を迅速に検出することが、介入してその蔓延を防ぐために必要とされる。サルモネラ菌由来のDNAの定性的検出のために、試験キットを作製した。検出アッセイは等温核酸増幅法に基づく。キットはまた、各反応におけるニッキング酵素およびポリメラーゼの活性を確認するために、外在性/内部対照を含む。アッセイを最適化するために、プライマーおよびビーコン配列のリストを最初に試験した。以下のプライマーを標的核酸分子の増幅のために使用した。
順方向プライマー
逆方向プライマー
接頭辞「m」で標識された塩基は、2'-O-メチルリボヌクレオチドの位置を示す。
外在性対照下側(BOT)3炭素スペーサー(C3-スペーサー):
HPLC精製
外在性対照上側(Topn):
HPLC精製
前述の記載から、様々な用途および条件に適合させるために本明細書に記載の発明に変更および改変がなされ得ることは明らかであろう。そのような態様も以下の特許請求の範囲の範囲内にある。
Claims (47)
- 核酸二重鎖を含む、ニッキングおよび伸長反応のための基質であって、該二重鎖が、
i)ニッキング酵素認識部位と、3'末端で共有結合された蛍光検出可能な標識とを含む、第1核酸鎖;および
ii)該第1鎖と二重鎖を形成することができる配列と、5'末端で共有結合されたクエンチャー部分とを有する、第2核酸鎖
を含むか、または
i)ニッキング酵素認識部位と、3'末端で共有結合されたクエンチャー部分とを含む、第1核酸鎖;および
ii)該第1鎖と二重鎖を形成することができる配列と、5'末端で共有結合された蛍光検出可能な標識とを有する、第2核酸鎖
を含む、前記基質。 - 前記第1核酸鎖が、ニッキング酵素によってニッキングされる、請求項1に記載の基質。
- 前記蛍光検出可能な標識が、FAM、TET、HEX、TAMRA、JOE、またはROXである、請求項1または2に記載の基質。
- 前記クエンチャー部分が、5' Iowa Black(登録商標)RQ (5IabRQ)、ダブシル(dabcyl)、ダブシル(dabsyl)、またはBlack Hole Quencher色素である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の基質。
- 前記第2核酸の3'末端が、C3スペーサー、ジデオキシヌクレオチド、リン酸化、色素、蛍光体、クエンチャー、スペーサー、またはリンカーで修飾されている、請求項1〜4のいずれか一項に記載の基質。
- 修飾ヌクレオチドを含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の基質。
- 前記第1核酸鎖が、ニック部位より5'側の位置1または2およびニック部位より3'側の位置1における1つまたは複数のヌクレオチドにおいて修飾されている、請求項1〜6のいずれか一項に記載の基質。
- 前記第1核酸鎖が、ニッキング認識部位とニック部位との間の1つまたは複数のヌクレオチドにおいて修飾されている、請求項1〜7のいずれか一項に記載の基質。
- 前記ニッキング酵素認識部位内の1つまたは複数の位置において修飾されている、請求項1〜8のいずれか一項に記載の基質。
- 1つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、2'-O-メチル、2'-メトキシエトキシ、2'-フルオロ、2'-ヒドロキシル(RNA)、2'-アリル、2'-O-[2-(メチルアミノ)-2-オキソエチル]、4'-チオ、4'-CH2-O-2'-架橋、4'-(CH2)2-O-2'-架橋、および2'-O-(N-メチルカルバメート)、メチル化、ビオチン化、ヌクレオチド付加物、または塩基アナログを含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の基質。
- 前記ニッキング酵素が、Nt.BstNBI、N.Bst9I、N.BstSEI、Nb.BbvCI、Nb.Bpu10I、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nt.AlwI、Nt.BbvCI、Nt.Bpu10I、Nt.BsmAI、Nt.BspD6I、Nt.BspQI、およびNt.CviPIIである、請求項1〜10のいずれか一項に記載の基質。
- 約30 bp〜約2 kb長、約100 bp〜約1 kb長、約100〜約500 bp長、約30〜約200 bp長、約30〜約60 bp長、約35〜約50 bp長である、請求項1〜11のいずれか一項に記載の基質。
- 前記核酸鎖が、約30〜約2000 nt長、約100〜約1000 nt長、約100〜約500 nt長、約30〜約100 nt長、約30〜約60 nt長、約35〜約50 nt長である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の基質。
- 前記核酸鎖のニック部位より3'側の長さが、約25 nt、約35 nt、約40 ntまたはそれ以上である、請求項1〜13のいずれか一項に記載の基質。
- 前記核酸鎖のニック部位より5'側の長さが、10 nt、約15 nt、約20 ntまたはそれ以上である、請求項1〜14のいずれか一項に記載の基質。
- 前記核酸鎖のニッキング酵素認識部位より5'側の長さが、約10 nt、約5 nt、約3 ntまたはそれ以下である、請求項1〜15のいずれか一項に記載の基質。
- 前記核酸鎖のニッキング酵素認識部位より5'側の長さが、4、3、2、または1 ntである、請求項16に記載の基質。
- 向かい合った核酸鎖上かつ前記二重鎖内で共有結合されている蛍光検出可能な標識およびクエンチャー部分の対を1つまたは複数含む、請求項1〜17のいずれか一項に記載の基質。
- 前記第1および第2核酸鎖が共有結合されている、請求項1〜17のいずれか一項に記載の基質。
- 以下の工程を含む、反応におけるニッキング酵素およびポリメラーゼの活性を検出する方法:
a)核酸二重鎖をニッキング酵素と接触させる工程であって、該二重鎖が
i)ニッキング酵素認識部位と、3'末端で共有結合された蛍光検出可能な標識とを含む、第1核酸鎖;および
ii)該第1鎖と二重鎖を形成することができる配列と、5'末端におけるクエンチャー部分とを有する、第2核酸鎖
または
i)ニッキング酵素認識部位と、3'末端で共有結合されたクエンチャー部分とを含む、第1核酸鎖;および
ii)該第1鎖と二重鎖を形成することができる配列と、5'末端で共有結合された蛍光検出可能な標識とを有する、第2核酸鎖
を含む、工程、
b)ニッキングされた該二重鎖をdNTPの存在下でポリメラーゼと接触させる工程、
c)ポリメラーゼ伸長を行い、それによって、該第1核酸鎖の、該蛍光検出可能な標識またはクエンチャー部分に共有結合された、ニック部位より3'側の部分を置換する工程、ならびに
d)該クエンチャーから分離された該蛍光検出可能な標識からのシグナルを検出し、それによって前記反応におけるニッキング酵素およびポリメラーゼの活性を検出する工程。 - 以下の工程を含む、ニッキング増幅反応において特異的産物を増幅させる方法:
a)ポリメラーゼ、dNTP、ニッキング酵素、および二重鎖の存在下で、標的核酸分子を、実質的に等温の条件下で、各々が標的核酸分子へ特異的に結合する2つ以上のプライマーと接触させる工程であって、二重鎖が
i)ニッキング酵素認識部位と、3'末端で共有結合された蛍光検出可能な標識とを含む、第1核酸鎖;および
ii)該第1鎖と二重鎖を形成することができる配列と、5'末端におけるクエンチャー部分とを有する、第2核酸鎖
または
i)ニッキング酵素認識部位と、3'末端で共有結合されたクエンチャー部分とを含む、第1核酸鎖;および
ii)該第1鎖と二重鎖を形成することができる配列と、5'末端で共有結合された蛍光検出可能な標識とを有する、第2核酸鎖
を含む、工程、
b)該標的核酸分子の少なくとも一部分を含むアンプリコンを生じさせる工程、
c)該二重鎖をニッキングし、ポリメラーゼ伸長を行い、それによって、該第1核酸鎖の、該蛍光検出可能な標識またはクエンチャー部分に共有結合された、ニック部位より3'側の部分を置換する工程、ならびに
d)該クエンチャーから分離された該蛍光検出可能な標識からのシグナルを検出し、それによって前記反応におけるニッキング酵素およびポリメラーゼの活性を検出する工程。 - 検出可能なポリヌクレオチドプローブの存在下で、前記核酸分子を2つ以上のプライマーと接触させる工程;ならびに
e)前記標的核酸分子またはそのアンプリコンへのオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションに特異的なシグナルを検出する工程であって、該シグナルが、試料中に存在する該標的核酸分子またはそのアンプリコンの量を示す、工程
をさらに含む、請求項21に記載の方法。 - 前記二重鎖からのシグナルの検出を陽性対照として使用する、請求項21または22に記載の方法。
- 前記二重鎖からのシグナルが規定の相対蛍光(RFU)に達する時が、前記ニッキング増幅反応のモニタリングの終了点を示す、請求項21〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記反応を実質的に等温の条件下で行う、請求項29に記載の方法。
- 前記反応が、プライマー、プローブ、および/または標的核酸分子をさらに含む、請求項20〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸鎖が、前記反応中に存在する他の核酸分子へ結合しない配列を有する、請求項20〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸二重鎖の蛍光検出可能な標識と、プローブの蛍光検出可能な標識とが異なる、請求項20〜27のいずれか一項または複数項に記載の方法。
- 前記第1核酸鎖へ共有結合された蛍光検出可能な標識が、FAM、TET、HEX、TAMRA、JOE、またはROXである、請求項20〜28のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2核酸鎖へ共有結合されたクエンチャー部分が、5' Iowa Black(登録商標)RQ (5IabRQ)、ダブシル(dabcyl)、ダブシル(dabsyl)、またはBlack Hole Quencher色素である、請求項20〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2核酸の3'末端が、C3スペーサー、ジデオキシヌクレオチド、リン酸化、色素、蛍光体、クエンチャー、スペーサー、またはリンカーで修飾されている、請求項20〜30のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸二重鎖が修飾ヌクレオチドを含む、請求項20〜31のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1核酸鎖が、ニック部位より5'側の位置1または2およびニック部位より3'側の位置1における1つまたは複数のヌクレオチドにおいて修飾されている、請求項20〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1核酸鎖が、ニッキング認識部位とニック部位との間の1つまたは複数のヌクレオチドにおいて修飾されている、請求項20〜33のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸二重鎖が、前記ニッキング酵素認識部位内の1つまたは複数の位置において修飾されている、請求項20〜34のいずれか一項に記載の方法。
- 1つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、2'-O-メチル、2'-メトキシエトキシ、2'-フルオロ、2'-ヒドロキシル(RNA)、2'-アリル、2'-O-[2-(メチルアミノ)-2-オキソエチル]、4'-チオ、4'-CH2-O-2'-架橋、4'-(CH2)2-O-2'-架橋、および2'-O-(N-メチルカルバメート)、メチル化、ビオチン化、ヌクレオチド付加物、または塩基アナログを含む、請求項20〜35のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ニッキング酵素が、Nt.BstNBI、N.Bst9I、N.BstSEI、Nb.BbvCI、Nb.Bpu10I、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nt.AlwI、Nt.BbvCI、Nt.Bpu10I、Nt.BsmAI、Nt.BspD6I、Nt.BspQI、およびNt.CviPIIである、請求項20〜36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリメラーゼが、Bst DNAポリメラーゼI、Bsu DNAポリメラーゼ、Gst DNAポリメラーゼI、およびGka DNAポリメラーゼIであり、他の態様において、例示的なポリメラーゼとしては、BST(ラージフラグメント)、DNAポリメラーゼI(大腸菌(E. coli))、DNAポリメラーゼI、ラージ(Klenow)フラグメント、Klenowフラグメント(3'-5' exo-)、T4 DNAポリメラーゼ、T7 DNAポリメラーゼ、Deep VentR(exo-)DNAポリメラーゼ、Deep VentR DNAポリメラーゼ、DyNAzyme、High-Fidelity DNAポリメラーゼ、Therminator、Therminator II DNAポリメラーゼ、AmpliTherm DNAポリメラーゼ、Taq DNAポリメラーゼ、Tth DNAポリメラーゼ、Tfl DNAポリメラーゼ、Tgo DNAポリメラーゼ、SP6 DNAポリメラーゼ、Tbr DNAポリメラーゼ、またはそれらの活性フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない、請求項20〜37のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸二重鎖が、約30 bp〜約2 kb長、約100 bp〜約1 kb長、約100〜約500 bp長、約30〜約200 bp長、約30〜約60 bp長、約35〜約50 bp長である、請求項20〜38のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸鎖が、約30〜約2000 nt長、約100〜約1000 nt長、約100〜約500 nt長、約30〜約100 nt長、約30〜約60 nt長、約35〜約50 nt長である、請求項20〜39のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸鎖のニック部位より3'側の長さが、約25 nt、約35 nt、約40 ntまたはそれ以上である、請求項20〜40のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸鎖のニック部位より5'側の長さが、10 nt、約15 nt、約20 ntまたはそれ以上である、請求項20〜41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸鎖のニッキング酵素認識部位より5'側の長さが、約10 nt、約5 nt、約3 ntまたはそれ以下である、請求項20〜42のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸鎖のニッキング酵素認識部位より5'側の長さが、4、3、2、または1 ntである、請求項43に記載の方法。
- 前記第1および第2核酸鎖が共有結合されている、請求項20〜44のいずれか一項に記載の方法。
- 修飾が異なる1つまたは複数の核酸二重鎖の使用を含む、請求項20〜45のいずれか一項に記載の方法。
- 反応におけるニッキング酵素およびポリメラーゼの活性を検出するためのキットであって、該キットが、核酸二重鎖を含むニッキングおよび伸長反応のための基質を含み、該二重鎖が、
a)ニッキング酵素認識部位と、3'末端で共有結合された蛍光検出可能な標識とを含む、第1核酸鎖;および
b)該第1鎖と二重鎖を形成することができる配列と、5'末端におけるクエンチャー部分とを有する、第2核酸鎖
または
i)ニッキング酵素認識部位と、3'末端で共有結合されたクエンチャー部分とを含む、第1核酸鎖;および
ii)該第1鎖と二重鎖を形成することができる配列と、5'末端で共有結合された蛍光検出可能な標識とを有する、第2核酸鎖
を含む、前記キット。
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