CN107532206A

CN107532206A - 底物分子

Info

Publication number: CN107532206A
Application number: CN201680020115.4A
Authority: CN
Inventors: S·A·朱迪斯
Original assignee: One Imperial Co
Current assignee: One Imperial Co
Priority date: 2015-01-30
Filing date: 2016-01-25
Publication date: 2018-01-02
Anticipated expiration: 2036-01-25
Also published as: RU2755495C2; JP2018503390A; CA2975328A1; AR103576A1; US20180037940A1; RU2017130477A3; JP7004570B2; US11220708B2; MX2017009833A; US20200157612A1; RU2017130477A; EP3250715A4; EP3250715A1; CN107532206B; WO2016123029A1; BR112017016350A2; US10570441B2; EP3250715B1

Abstract

本发明提供用于检验在反应中的切口酶和聚合酶活性的组合物和方法，其中，该反应牵涉核酸底物分子的用途，而该底物分子通过可检测的报告物质(如，荧光团)而检测切口酶和聚合酶延伸活性。

Description

底物分子

相关申请的交叉引用

本申请主张2015年1月30日提交的第62/110,237号美国临时专利申请案的优先权。该申请案通过引用而整体并入本文。

背景技术

因为靶标核酸的缺席(真阴性)或因为特定的扩增被抑制(假阴性)，核酸扩增可能无法成功反应。因此，理解反应失败的来源可能影响对阴性结果的诠释。通过排除由于反应成分带来的失败，阳性对照的使用可增加确认阴性结果为真阴性的信心。当使用核酸扩增反应作为检测传染剂的手段时，阳性对照特别可用于表明，阴性扩增代表真阴性试样。

据此，亟需改善的用于精确检测靶标核酸分子的方法。

发明内容

本发明提供用于测试在反应中的切口酶和聚合酶活性的组合物和方法，包括核酸底物的使用，其中，该核酸底物通过释放可检测的报告物质(如，荧光团)而检测切口酶和聚合酶延伸活性。

一方面，本发明提供用于切口和延伸反应的底物，其包括核酸双链，该双链具有第一核酸链，其具有切口酶识别位点和共价链接在3’端的荧光可检测标记物；以及第二核酸链，其具有能与该第一链双链化的序列以及链接在5’端的猝光剂部分；或者该双链具有第一核酸链，其具有切口酶识别位点和共价链接在3’端的猝光剂部分；以及第二核酸链，其具有能与第一链双链化的序列以及链接在5’端的荧光可检测标记物。

另一方面，本发明提供检测在反应中的切口酶和聚合酶活性的方法，包括：令核酸双链与切口酶接触，该双链具有：第一核酸链，其包含切口酶识别位点以及共价链接在3’端的荧光可检测标记物；以及第二核酸链，其具有能与第一链双链化的序列以及位于5’端的猝光剂部分；或者该双链具有：第一核酸链，其具有切口酶识别位点以及共价链接在3’端的猝光剂部分；以及第二核酸链，其具有能与第一链双链化的序列以及共价链接在5’端的荧光可检测标记物；令经切口的双链与聚合酶在dNTP的存在下接触；延伸该聚合酶，从而替换共价链接至该荧光可检测标记物或猝光剂部分的切口位点3’端的第一核酸链部分；以及，检测来自与该猝光剂分离的该荧光可检测标记物的信号，从而检测在反应中的切口酶和聚合酶活性。

又一方面，本发明提供在切口扩增反应中扩增特定产物的方法，包括：令靶标核酸分子在基本等温条件下与两种或更多种引物接触，在聚合酶、dNTP、切口酶、及双链的存在下，这些引物各自特异性地结合至靶标核酸分子，该双链具有：第一核酸链，包含切口酶识别位点和共价链接在3’端的荧光可检测标记物；以及第二核酸链，具有能与该第一链双链化的序列和位于5’端的猝光剂部分；或者该双链具有：第一核酸链，包含切口酶识别位点和共价链接在3’端的猝光剂部分；以及第二核酸链，具有能与该第一链双链化的序列和共价链接在5’端的荧光可检测标记物；生成包含所述靶标核酸分子的至少一部分的扩增子；将该双链切口并延伸该聚合酶，从而替换共价链接至该荧光可检测标记物或猝光剂部分的切口位点3’端的第一核酸链部分；以及，检测来自与该猝光剂分离的该荧光可检测标记物的信号，从而检测在反应中的切口酶和聚合酶活性。

另一方面，本发明提供在切口扩增反应中扩增特定产物的方法，包括：令靶标核酸分子在基本等温条件下与两种或更多种引物接触，在聚合酶、dNTP、切口酶、可检测的核苷酸探针、及双链的存在下，这些引物各自特异性地结合至靶标核酸分子，该双链具有：第一核酸链，包含切口酶识别位点和共价链接在3’端的荧光可检测标记物；以及第二核酸链，具有能与该第一链双链化的序列和位于5’端的猝光剂部分；或者该双链具有：第一核酸链，包含切口酶识别位点和共价链接在3’端的猝光剂部分；以及第二核酸链，具有能与该第一链双链化的序列和共价链接在5’端的荧光可检测标记物；生成包含所述靶标核酸分子的至少一部分的扩增子；将该双链切口并延伸该聚合酶，从而替换共价链接至该荧光可检测标记物或猝光剂部分的切口位点3’端的第一核酸链部分；检测来自与该猝光剂分离的该荧光可检测标记物的信号，从而检测在反应中的切口酶和聚合酶活性；以及，检测对于寡核苷酸探针杂交至该靶标核酸分子或其扩增子为特异性的信号，其中，该信号表明该样品或其扩增子中靶标核酸分子存在的数量。

又一方面，本发明提供一种用于检测在反应中的切口酶和聚合酶活性的试剂盒，该试剂盒含有用于切口和延伸反应的包含核酸双链的底物，该双链具有：第一核酸链，包含切口酶识别位点和共价链接在3’端的荧光可检测标记物；以及第二核酸链，具有能与该第一链双链化的序列和位于5’端的猝光剂部分；或者该核酸双链具有：第一核酸链，包含切口酶识别位点和共价链接在3’端的猝光剂部分；以及第二核酸链，具有能与该第一链双链化的序列和位于5’端的荧光可检测标记物。

本文中描绘的任何方面的多种具体实施例中，该底物或双链的长度为介于约30bp至约2kb之间、介于约100bp至约1kb之间、介于约100至约500bp之间、介于约30至约200bp之间、介于约30至约60bp之间、介于约35至约50bp之间。本文中描绘的任何方面的多种具体实施例中，该底物或双链的核酸链的长度为介于约30至约2000nt之间、介于约100至约1000nt之间、介于约100至约500nt之间、介于约30至约100nt之间、介于约30至约60nt之间、介于约35至约50nt之间。本文中描绘的任何方面的多种具体实施例中，切口位点3’端核酸链的长度为约25nt、约35nt、约40nt或更长。本文中描绘的任何方面的多种具体实施例中，切口位点5’端核酸链的长度为10nt、约15nt、约20nt或更长。某些具体实施例中，切口酶识别位点5’端核酸链的长度为约10nt、约5nt、约3nt或更短。特定具体实施例中，切口酶识别位点5’端核酸链的长度为4、3、2、或1nt。本文中描绘的任何方面的多种具体实施例中，该第一核酸链与第二核酸链共价链接。

本文中描绘的任何方面的多种具体实施例中，该底物包含改性核苷酸。本文中描绘的任何方面的多种具体实施例中，第二核酸的3’端以C3间隔物、二脱氧核苷酸、磷酸化作用、荧光团、间隔物、或链接物改性。本文中描绘的任何方面的多种具体实施例中，该底物或双链的第一核酸链在切口位点5’端位置1处(如，切口-1)、切口位点5’端位置2处(如，切口-2)、及切口位点3’端位置1处(如，切口+1)的一个或多个核苷酸改性。本文中描绘的任何方面的多种具体实施例中，该底物或双链的每一核酸链在切口识别位点与切口位点之间的一个或多个核苷酸(如，1、2、3、4、5个)改性。本文中描绘的任何方面的多种具体实施例中，该底物在切口酶识别位点内的一个或多个位置改性。本文中描绘的任何方面的多种具体实施例中，该改性核苷酸是包含2’-O-甲基、2'-甲氧基乙氧基、2'-氟、2’-羟基(RNA)、2'-烯丙基、2'-O-[2-(甲胺基)-2-氧代乙基]、4'-巯基、4'-CH₂-O-2'-桥、4'-(CH₂)₂-O-2'-桥、2'-O-(N-甲基胺基甲酸酯)、甲基化、生物素化、核苷酸加成物、或碱基类似物的改性核苷酸。

本文中描绘的任何方面的多种具体实施例中，该底物或双链具有与猝光剂部分配对的荧光可检测标记物。本文中描绘的任何方面的多种具体实施例中，该荧光可检测标记物是FAM、TET、HEX、TAMRA、JOE、或ROX。本文中描绘的任何方面的多种具体实施例中，该猝光剂部分是5’Iowa RQ(5IabRQ)、dabcyl、dabsyl、或Black Hole Quencher染料。本文中描绘的任何方面的多种具体实施例中，该底物或双链含有一对或多对共价链接(如，生物素化)于相反核酸链且位于该双链内部的荧光可检测标记物与猝光剂部分。

本文中描绘的任何方面的多种具体实施例中，该反应是在基本等温条件下实施的。本文中描绘的任何方面的多种具体实施例中，该反应进一步包含引物、探针、及/或靶标核酸分子。本文中描绘的任何方面的多种具体实施例中，该底物或双链的核酸链具有序列，且这些序列并不与该反应中存在的其它核酸分子结合。本文中描绘的任何方面的多种具体实施例中，该核酸双链的荧光可检测标记物与该探针的荧光可检测标记物不同(如，FAM与CalRed)。本文中描绘的任何方面的多种具体实施例中，使用所检测到的来自该双链的信号作为阳性对照。本文中描绘的任何方面的多种具体实施例中，当来自该双链的信号达到设定的相对荧光(RFU)时，表明该扩增反应的监控终点。本文中描绘的任何方面的多种具体实施例中，本发明包括使用具有不同改性的一种或多种核酸双链或底物。

本文中描绘的任何方面的多种具体实施例中，该底物或双链的第一核酸链切口酶切口。本文中描绘的任何方面的多种具体实施例中，该切口酶是Nt.BstNBI、N.Bst9I、N.BstSEI、Nb.BbvCI、Nb.Bpu10I、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nt.AlwI、Nt.BbvCI、Nt.Bpu10I、Nt.BsmAI、Nt.BspD6I、Nt.BspQI、及Nt.CviPII。本文中描绘的任何方面的多种具体实施例中，该底物或双链的第一核酸链与聚合酶接触。本文中描绘的任何方面的多种具体实施例中，该聚合酶是Bst DNA聚合酶I、Bsu DNA聚合酶、Gst DNA聚合酶I、及Gka DNA聚合酶I。其它具体实施例中，例示性聚合酶包括，但不限于，BST(大片段)、DNA聚合酶I(大肠杆菌)、DNA聚合酶I、大(Klenow)片段、Klenow片段(3'-5'外-)、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、Deep VentR(外-)DNA聚合酶、Deep VentR DNA聚合酶、DyNAzyme、高保真DNA聚合酶、Therminator、Therminator II DNA聚合酶、AmpliTherm DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、TthDNA聚合酶、Tfl DNA聚合酶、Tgo DNA聚合酶、SP6DNA聚合酶、Tbr DNA聚合酶、或其活性片段。

从详细说明书和权利要求书中，可明了本发明的其它特征和优势。

定义

“扩增子”意为在感兴趣的多核苷酸扩增过程中生成的多核苷酸。一个实施例中，在切口扩增反应过程中生成扩增子。

“扩增速率调节剂”意为能影响聚合酶延伸速率的试剂。

“碱基取代”意为核酸碱基聚合物的取代物，该取代物并不造成互补核苷酸链间杂交的显着破坏。

本公开內容中，“包含”、“含有”及“具有”等可具有其在美国专利法中所被认定的意义，且可意为“包括”等；同样，“主要由……组成”具有其在美国专利法中被认定的意义，且该术语是开放性的，允许存在超过其所引述者，只要被引述者的基础特征或新颖特征不为该超过其所引述者的存在所改变即可，但不包括现有技术具体实施例中存在的。

“互补”或“互补性”意为，通过传统的瓦特生-克里克(Watson-Crick)碱基配对或胡斯坦(Hoogsteen)碱基配对，核酸可与另一核酸序列形成氢键。互补碱基配对不仅包括G-C和A-T碱基配对，而且包括牵涉通用碱基如肌苷的碱基配对。互补性百分比表明核酸分子中，能与第二核酸序列形成氢键(如，Watson-Crick碱基配对)的邻接残基的百分比(如，总计10个核苷酸的第一寡核苷酸中的5、6、7、8、9、10个核苷酸与具有10个核苷酸的第二核酸序列形成碱基配对，分别代表50％、60％、70％、80％、90％、及100％互补性)。为了确定互补性百分比是至少某一百分比，计算核酸分子中可与第二核酸序列形成氢键(如，Watson-Crick碱基配对)的邻接残基的百分比，并四舍五入至最接近的整数(如，总计23个核苷酸的第一寡核苷酸中的12、13、14、15、16、或17个核苷酸与具有23个核苷酸的第二核酸序列形成碱基配对，分别代表52％、57％、61％、65％、70％、及74％互补性，且分别具有至少50％、50％、60％、60％、70％、及70％互补性)。本文中，“基本互补”指链之间的能在生物学条件下杂交的互补性。基本互补的序列具有60％、70％、80％、90％、95％、甚或100％互补性。此外，通过检查两条链的核苷酸序列而确定两条链能否在生物学条件下杂交的技术是该领域中广为人知的。

本文中，“双链”指通过两个单链核酸的相互反应而形成的双螺旋结构。双链典型是通过相对于彼此反平行取向的两个单链核酸间的碱基的成对氢键键结即“碱基配对”而形成的。双链中的碱基配对通常通过Watson-Crick碱基配对而出现，如，鸟嘌呤(G)与DNA和RNA中的胞嘧啶(C)形成碱基配对，腺嘌呤(A)与DNA中的胸腺嘧啶(T)形成碱基配对，且腺嘌呤(A)与RNA中的尿嘧啶(U)形成碱基配对。可形成碱基对的条件包括生理学或生物学相关条件(如，细胞内：pH 7.2，140mM钾离子；细胞外：pH 7.4，145mM钠离子)。再者，通过在相邻核苷酸之间堆栈作用来稳定化双链。本文中，可通过碱基配对或通过堆栈作用来建立或维持双链。通过两条互补性核酸链形成双链，该两条核酸链可以是基本互补或完全互补。单链核酸在一定数目的碱基上进行碱基配对称为“杂交”。

“检测”指鉴定待检测的分析质的存在、不存在或其量。

“可检测部分”意为一种组成，当链接至感兴趣的分子时，使得后者可通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、或化学手段检测。例如，可用的标记物包括放射性同位素、磁珠、金属珠、胶体颗粒、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如，常用于ELISA中的酶)、生物素、地高辛(digoxigenin)、或半抗原。

“片段”意为核酸分子的一部分。这一部分优选含有参考核酸分子或多肽整体长度的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％。片段可含有5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、或100个核苷酸。

“杂交”意为在多种严格条件下，在互补多核苷酸序列(如，本文中揭示的基因)或其部分之间形成双链分子(见，如，Wahl,G.M.and S.L.Berger(1987)MethodsEnzymol.152:399；Kimmel,A.R.(1987)Methods Enzymol.152:507)。杂交通过互补核酸碱基间的氢键键结而出现，该氢键键结可以是Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键键结。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是通过形成氢键而配对的互补核酸碱基。

“分离的多核苷酸”意为不具有基因的核苷酸(如，DNA、RNA)，作为本发明的核酸分子来源的生物体的天然出现的基因组中，该核苷酸处于核酸侧翼。该术语因此包括，例如，合并入载体内、自主复制质粒或病毒内、或原核生物或真核生物的基因组DNA内的重组DNA；或作为独立分子(例如，通过PCR或限制性核酸内切酶消解而生产的cDNA或基因组或cDNA片段)而不依赖其它序列而存在的重组DNA。此外，该术语包括从DNA分子转录的RNA分子，以及作为编码另外的多肽序列的杂化基因的一部分的重组DNA。

术语“分离的”、“纯化的”、或“生物学纯的”指一种材料，该材料在不同程度上不含其天然状态中发现的正常伴随该材料的组分。“分离的”表示从原始来源或周边分隔的程度。“纯化”表示高于“分离”的分隔程度。“纯化的”或“生物学纯的”蛋白质充分地不含其它材料，因此任何杂质均不在材料上影响该蛋白质的生物学性质，也不造成其它不利后果。换句话说，若本发明的核酸或肽基本上当通过重组DNA技术生产时不含细胞材料、病毒材料、或培养基，或当化学合成时不含化学前体，则该核酸或肽是纯的。典型使用分析化学技术如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高校液相色谱测定纯度和均质性。术语“纯化的”可表示，核酸或蛋白质在电泳凝胶中产生基本上一个条带。对于可改性如磷酸化或糖基化的蛋白质，不同改性可产生不同的分离的蛋白质，而该蛋白质可独立纯化。

“解链温度(Tm)”意为系统处于平衡状态的温度，其中，50％的分子群落为一种状态，而50％的群落为另一种状态。至于本发明的核酸，Tm是50％的群落为单链，而50％为双链(如，分子内或分子外)时的温度。

“监控反应”意为检测反应的进展。一种具体实施例中，监控反应进展包括检测切口活性、聚合酶延伸、及/或检测扩增反应的完成。

本文中，“获得试剂”中的“获得”包括合成、购买或其它获取途径。

本文中，术语“核酸”指脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、或改性核苷酸，及其单链或双链形式的聚合物。该术语涵盖含有已知核苷酸类似物或改性骨架残基或链接的核酸，该核酸是合成的、天然出现的、及非天然出现的，具有与参考核酸相似的结合性质，且以与参考核苷酸相似的模式被代谢。此类类似物的实例包括，而不限于，2’改性核苷酸(如，2’-O-甲基核糖核苷酸、2’-F核苷酸)。

本文中，“改性核苷酸”指具有一个或多个对核苷酸、核酸碱基、戊糖环、或磷酸基团的改性的核苷酸。例如，改性核苷酸不包括含有单磷酸腺苷、单磷酸鸟苷、单磷酸尿苷、和单磷酸胞苷的核糖核苷酸以及含有单磷酸脱氧腺苷、单磷酸脱氧鸟苷、单磷酸脱氧腺苷和单磷酸脱氧胞苷的脱氧核糖核苷酸。改性包括那些天然出现的和由改性核苷酸的酶如甲基转移酶造成的改性。改性核苷酸也包括合成的或非天然出现的核苷酸。核苷酸中合成的或非天然出现的改性包括那些具有2’改性如2’-O-甲基、2'-甲氧基乙氧基、2'-氟、2’-羟基(RNA)、2'-烯丙基、2'-O-[2-(甲胺基)-2-氧代乙基]、4'-巯基、4'-CH₂-O-2'-桥、4'-(CH₂)₂-O-2'-桥、及2'-O-(N-甲基氨基甲酸酯)的或那些包含碱基类似物的。

“核苷酸加成物”意为共价键结或另外固定至标准核苷酸碱基的部分。

“切口剂”意为一种化学整体，它能识别和结合至双链核酸分子中的特定结构，且当结合至其是被的特定结构时打破单链上毗连核苷酸之间的磷酸二酯键，从而在该切口位点之前的末端核苷酸上创建游离的3’-羟基。优选具体实施例中，该3’端可通过核酸外切酶不足的聚合酶得以延伸。例示性切口剂包括切口酶、RNA酶、DNA酶、及过渡金属螯合剂。

“回文”意为下述核酸序列，当在一条链上从5’至3’阅读或在互补链上从5’至3’阅读时，该序列是一致的或基本一致的。完美回文序列指具有两个相邻次序列的序列，因此当以5'至3'方向阅读一条次序列时，该次序列与以3’至5’方向阅读的另一次序列一致。

“聚合酶拦阻(polymerase-arresting)分子”意为与多核苷酸模板/引物关联的部分，其防止或显着减少聚合酶在多核苷酸模板上的前进。优选地，该部分被合并入该多核苷酸。一种优选具体实施例中，该部分防止聚合酶在该模板上前进。

“聚合酶延伸”意为聚合酶的正向前进，其将引入的单体与其在模板多核苷酸上的结合伙伴匹配。

本文中，“引物-二聚体”意为两种单体寡核苷酸引物的二聚体。在本发明的寡核苷酸引物中，单体引物的5’尾部区域二聚化。

“半定量”意为提供基于内部对照的相对数量的评估。

“特定产物”意为从引物寡核苷酸至互补靶标序列的杂交以及后续的聚合酶介导的靶标序列的延伸所得的产物。

“基本等温条件”意为处于单一温度下或并不显着变化的窄的温度范围内。一种具体实施例中，在基本等温条件下进行的反应是在变化仅为约1至5℃(如，变化幅度为1、2、3、4、或5度)的温度进行的。另一具体实施例中，该反应在处于仪器所使用的操作参数内的单一温度下进行。

“数量阈值方法”意为，提供基于超出或不超出比较性标准数量的对数量的评估。

“参考”意为标准或对照条件。该领域技术人员明显可知，适宜的参考是为了确定要素的效果而改变要素的情形。

“实验对象”意为哺乳动物，包括但不限于，人或非人哺乳动物，如牛、马、犬、羊、或猫。

“靶标核酸分子”意为待分析的多核苷酸。这一多核苷酸可以是靶标序列的正义链或反义链。术语“靶标核酸分子”也指原始靶标序列的扩增子。

本文中提供的范围理解为是该范围内全部数值的缩写。例如，1至50的范围理解为包括来自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50组成的群组的任何数字、数字的组合、或亚范围。

除非具体阐明或从语境可见，本文中，术语“或”理解为是包含在内的。除非具体阐明或从语境可见，本文中，术语“一(a)”、“一(an)”和“该”理解为单数或复数。

除非具体阐明或从语境可见，本文中，术语“约”理解为处于该领域正常公差之内，例如，处于均值的2标准差之内。“约”可理解为处于所阐明数值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、或0.01％内。除非从语境中明确排除，本文中提供的全部数字值均由术语“约”改性。

本文中变量的任何定义中，对于所列举化学基团的详述包括该变量作为任何单一基团或所列述基团的组合的定义。本文中对于变量或方面的具体实施例的详述，包括作为任何单一具体实施例或与任何其它具体实施例或其部分的组合的该具体实施例。

本文中提供的任何组合物或方法可与一种或多种本文中提供的任何其它组合物和方法组合。

附图说明

图1A至1F说明切口和延伸反应底物的结构和机制。图1A说明本发明的切口和延伸反应底物的结构。图1B说明一种在一条链上具有切口位点的寡核苷酸双链，该切口位点的位置相对于附加(如，共价链接)在该链3’端的可检测报告分子为5’。在所显示的实例中，该可检测报告分子是荧光团，其接近位于相反链5’端的猝光剂。当将两条链退火时，该3’荧光团(如，FAM、HEX)与猝光剂(如，5IabRQ、BHQ-1)彼此邻近，且荧光信号被猝灭。图1C显示，本发明的底物分子具有切口酶识别位点，且在结合于该位点的切口酶的存在下切口。图1D显示，本发明的经切口的底物分子在切口处具有可被聚合酶接触的自由的3’端。图1E显示，使用该互补链作为模板的聚合酶延伸。聚合酶延伸替代了切口位点的链的链接至可检测报告物质的3’端。当该可检测报告物质与猝光剂分离时，其发出荧光。图1F显示，该延伸反应的产物能再次切口。但是，该分子可被设计为防止或最小化进一步的切口和延伸循环。

图2A和2B显示，本发明的底物分子的切口和延伸导致信号的线性增加。图2A是一张示意图，显示在切口酶和聚合酶的存在下，来自本发明底物分子的信号随着反应进展的线性增加。当底物分子及/或其链不与任何其它反应组分相互作用时，则预期线性增加。例如，任何链的3’端可被荧光团或C3间隔物阻断。图2B是一张示意图，显示使用本发明的底物分子在切口扩增反应中作为外源性控制分子。该底物分子可用作对照，以显示切口酶和聚合酶在切口扩增反应中具有活性。可将切口扩增反应的反应终点设定为该外源性控制分子达到所设定RFU(相对荧光单位)的时间。例如，这可用来基于扩增信号的检测时间而将其表征为阳性或阴性。

图3A和3B说明本发明的“长体(longmer)”底物，在一个实施例中，该底物可用来研究聚合酶的可持续加工性。图3A说明本发明的该切口和“长体”底物分子的结构。图3B说明可用来研究其对于聚合酶可持续加工性的影响的改性和因子。

图4提供用来测试改性核苷酸对于本发明的底物分子性质的影响的序列。具有5’猝光剂5IabRQ(5’Iowa Black RQ)的寡核苷酸链ExogContBOT与下述具有3’荧光团36-FAM的每一寡核苷酸链配对：普通(无改性的核苷酸)、切口-2(在切口位点5’端的位置2处存在2’OMe)、切口+1(在切口位点3’端的位置1处存在2’OMe)、及切口-1(在切口位点5’端的位置1处存在2’OMe)。

图5A至5E说明，在多种浓度的切口酶、以及聚合酶的存在下，具有图4所揭示寡核苷酸链的底物分子的活性。结果显示，可使用此时核苷酸、底物分子相对于切口酶的量的浓度、及/或经不同改性的底物分子的混合物来调谐(tune)该底物分子的反应。图5A图式说明，在0.3U/μl切口酶的存在下，具有图4所示寡核苷酸链的底物分子的活性。图5B图式说明，在0.015U/μl切口酶的存在下，具有图4所示寡核苷酸链的底物分子的活性。图5C图式说明，在0.075U/μl切口酶的存在下，具有图4所示寡核苷酸链的底物分子的活性。图5D图式说明，在0.0375U/μl切口酶的存在下，具有图4所示寡核苷酸链的底物分子的活性。图5E图式说明，在0.0188U/μl切口酶的存在下，具有图4所示寡核苷酸链的底物分子的活性。

图6A至6D说明将图4A至4E中所示的图以具有3’荧光团36-FAM的未改性核苷酸链和改性核苷酸链组织的图。图6A说明，包含该具有5’猝光剂5IabRQ的寡核苷酸链ExogContBOT与具有3’荧光团36-FAM且无改性核苷酸的普通寡核苷酸链的反应曲线。图6B说明，包含该具有5’猝光剂5IabRQ的寡核苷酸链ExogContBOT与具有3’荧光团36-FAM且在切口位点5’端位置2处具有2’OMe的切口-2寡核苷酸链的反应曲线。图6C说明，包含该具有5’猝光剂5IabRQ的寡核苷酸链ExogContBOT与具有3’荧光团36-FAM且在切口位点5’端位置1处具有2’OMe的切口-1寡核苷酸链的反应曲线。图6D说明，包含该具有5’猝光剂5IabRQ的寡核苷酸链ExogContBOT与具有3’荧光团36-FAM且在切口位点3’端位置1处具有2’OMe的切口+1寡核苷酸链的反应曲线。

图7说明用以测定该底物分子中切口识别位点5’端核苷酸长度的效果的研究结果。显示具有特定寡核苷酸对的底物分子的反应曲线图。该底物分子的寡核苷酸链的序列显示在图式下方。

图8说明用以使用不同比率的包含未改性核苷酸和改性核苷酸的底物分子的效果的研究结果。显示具有特定比率的底物分子的反应的反应曲线图。未改性的和2’OMe改性的底物分子的寡核苷酸链序列显示在图式下方。这显示，可调谐该反应以通过使用不同比率的不同底物分子在预设时间达到所希望的阈值。

图9A和9B说明用以测定在底物分子内多个位置处的定位改性核苷酸的效果的研究结果。图9A是反应曲线图，说明使用具有图式下方所示序列(A至F)的底物分子的反应。图9B是反应曲线图，说明使用具有图式下方所示序列(A至F)的底物分子的反应。

图10说明了研究结果，显示底物分子可用来测试切口酶及/或聚合酶。

图11说明用于基于切口扩增反应的沙门氏菌试验的外源性/内部控制分子的最终定案序列。

具体实施方式

本发明提出用于切口和延伸反应的具有被猝灭的荧光团的核酸底物分子，通过切口酶和聚合酶对该底物的活性，该荧光团被释放并发出荧光。本发明的底物分子可被加入现有切口扩增反应中，并因此在切口扩增反应中用作外源性控制分子。就此而言，该外源性控制分子提供对于切口酶和聚合酶两者的酶活性的控制，而该活性存在于切口扩增反应中。尽管平行运行，该外源性控制反应不明显干涉初级扩增反应。例如，该外源性控制并不消耗大数量的反应组分如dNTP。该外源性控制可设计以最小化3’端的形成，而该形成可导致非特异性聚合酶延伸和背景干扰。如本文中所示，该外源性控制分子也可经“调谐”，以在特定时间开始(launch)。就其本身而言，本发明的底物分子可用于酶效能测试中或用来检查酶的品质。

切口和延伸底物分子

本发明提供切口和延伸底物分子，其可用来测试或证实在反应中的切口酶和聚合酶活性。参考图1A至1E，该底物分子包含寡核苷酸双链，其在一端以可检测报告物质(如，荧光团-猝光剂对；用于荧光能量转移(FRET)的供体-受体对)标记。一些具体实施例中，两条寡核苷酸链共价链接。该寡核苷酸双链含有切口酶识别位点，因此，当该分子切口时，通过切口而暴露的3’端可驱动聚合酶延伸，而该延伸导致可检测报告物质的活化。特定的具体实施例中，该可检测报告物质是与猝光剂分子(如，该领域中已知的任何相互反应的荧光团与猝光剂对或FRET供体-受体对)配对的荧光报告物质(如，FAM)。通过聚合酶的链替代活性以及荧光团与猝光剂分开，该荧光报告物质被激活。该荧光报告物质共价链接至该寡核苷酸双链的3’端或5’端，且该猝光剂分别链结在相反链的5’端或3’端。某些具体实施例中，该荧光团是FAM、TET、HEX、TAMRA、JOE、或ROX的一种或多种。多种具体实施例中，该猝光剂是dabcyl、dabsyl、Black Hole Quencher染料的一种或多种，包括5’IowaRQ(5IabRQ)。通常，该猝灭染料是激发态匹配的猝灭染料。例如，荧光团-猝光剂对及其选择揭示于Marras,Selection of Fluorophore and Quencher Pairs for FluorescentNucleic Acid Hybridization Probes in Methods in Molecular Biology:FluorescentEnergy Transfer Nucleic Acid Probes:Designs and Protocols.Edited by:V.V.Humana Press Inc.,Totowa,NJ中。当该切口和延伸底物用作外源性控制时，选择该可检测荧光标记物，以提供来自探针中所用的用于检测靶标核酸扩增的标记物(如，FAM和CalRed)的不同的可检测荧光信号。优选的具体实施例中，阻断游离的3’端(即，不具有荧光报告物质或猝光剂)以防止其用于聚合酶延伸反应中。可使用3碳间隔物(C3间隔物)或二脱氧核苷酸阻断游离的3’端。可在合成过程中将大量防止延伸的改性加至游离的3’端，其中，该改性包括磷酸化作用、染料、荧光团、猝光剂、间隔物、或链接物。

该切口和延伸底物可含有任何切口酶的切口酶识别位点。将该切口酶识别位点定位，因此从通过切口而暴露的3’端延伸导致聚合酶延伸和可检测报告物质的激活。当用作外源性控制分子时，该切口酶识别位点将是在切口扩增反应中使用的切口酶的识别位点。例示性切口酶包括，但不限于，N.Bst9I、N.BstSEI、Nb.BbvCI(NEB)、Nb.Bpu10I(Fermantas)、Nb.BsmI(NEB)、Nb.BsrDI(NEB)、Nb.BtsI(NEB)、Nt.AlwI(NEB)、Nt.BbvCI(NEB)、Nt.Bpu10I(Fermentas)、Nt.BsmAI、Nt.BspD6I、Nt.BspQI(NEB)、Nt.BstNBI(NEB)、及Nt.CviPII(NEB)。切口酶识别位点的序列提供于表1中。

表1.切口酶识别序列

特别的具体实施例中，该切口酶识别位点为Nt.BstNBI，以便与切口酶Nt.BstNBI合用，而该酶常用于切口扩增反应中。

该切口和延伸底物分子的长度可取决于多种因子，包括其预期用途。该底物分子的长度仅受限于可通过现有技术合成的多核苷酸的长度。然而，对于一些应用如其作为外源性反应控制的应用，可最小化该底物的长度以作成可用的游离dNTP或其它可用于核酸扩增的反应组分。在其它应用如其在研究聚合酶可持续加工性的应用中，可使用较长的底物。多种具体实施例中，该核苷酸双链的长度为介于约30bp至约2kb之间、介于约100bp至约1kb之间、介于约100至约500bp之间。其它具体实施例中，该双链的多核苷酸的长度为介于约30至约2000nt之间、介于约100至约1000nt之间、介于约100至约500nt之间。多种具体实施例中，该寡核苷酸双链的长度为介于约30至约100bp之间、介于约30至约60bp之间、介于约35至约50bp之间。其它具体实施例中，该双链的寡核苷酸的长度为介于约30至约100nt之间、介于约30至约60nt之间、介于约35至约50nt之间。同样，选择该底物分子的序列以最小化其对可用于该反应中的其它核酸分子序列的干扰，该其它核酸分子序列包括靶标核酸序列、引物序列、探针序列、及/或非特异性背景序列(如，生物样品中的基因组序列)。

切口酶识别位点及/或切口酶位点在该底物分子中的布局取决于多个因子，包括该切口酶本身。例如，使用当切口酶Nt.BstNBI时，该酶在其酶识别位点下游生成切口3’端，该切口3’端的寡核苷酸链的部分的双链解链温度高于最高反应温度。该切口3’端的寡核苷酸链的部分的长度为约25nt、约35nt、约40nt、或更长。因此，信号的生成与聚合酶造成的链替换结合偶合。

该切口5’端的寡核苷酸链的部分的长度为约10nt、约15nt、约20nt或更长。当该切口5’端寡核苷酸链的该长度部分的双链解链温度低于该反应温度，该游离3’端的聚合酶延伸被最小化。例如，且切口位点5’区域的序列可设计为在反应温度下不稳定并因此分解，防止从该游离的3’端延伸。或者，此“短体”可设计为自结合并“结束”反应。也已经发现，当一个或多个核苷酸位于该Nt.BstNBI酶识别位点的5’端时，该底物分子具有活性。1至约10个核苷酸、2至约5个核苷酸可存在于该Nt.BstNBI酶识别位点的5’端。缩短该切口酶识别位点5’端的寡核苷酸链，改变了反应速率并提供反应可调谐性。

2’OMe改性核苷酸在该底物分子中介于该切口酶识别位点与切口位点之间的布局可改变该底物反应的反应速率。一些具体实施例中，该第一核酸链在切口位点5’端位置1或2处以及切口位点3’端位置1处的一个或多个核苷酸改性。关于包含Nt.BstNB1识别和切口位点的双链，对应于编号(位置1、2、3、4等)的位置和方向性(5’或3’)的说明显示如下：

2’OMe改性核苷酸在该底物分子中的布局可用来“调谐”该反应(即，反应速率)。Nt.BstNBI的介于切口酶识别位点与切口位点之间的一个或多个核苷酸可以是2’OMe改性核苷酸。特别的具体实施例中，该一个或多个2’OMe改性核苷酸被定位在该切口位点5’端位置1或2及/或切口位点3’端位置1处的一个或多个位置。

也可使用改性核苷酸、支链核苷酸(即，T-fam)、或任何影响反应动力学的核苷酸来实现反应可调谐性，包括通过将改性核苷酸置于该切口序列链中；将改性核苷酸放置为与该切口序列链相反。也可通过将一种或多种未改性或改性的底物分子(如，以上/下寡核苷酸比率来调谐)及/或切口酶相对于底物分子浓度的摩尔浓度来实现反应可调谐性。

使用该底物分子的方法

该切口酶底物分子可用来测定在反应中的切口酶和聚合酶活性。就其本身而言，该底物分子可用来评估切口酶与聚合酶的组合，用来鉴定切口酶和聚合酶的最优工作条件，或用来检查切口酶和聚合酶的品质。用于本文中揭示方法中的聚合酶能催化核苷酸的合并，以延伸键结至靶标核酸分子的寡核苷酸(如，引物)的3'羟基端及/或具有链替换活性的双链DNA分子中切口位点处的3'羟基端。例示性聚合酶包括，但不限于，从嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)也归类为嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)分离以及从紧密相关的菌株、包含土芽孢杆菌属的隔离群和物种分离的DNA聚合酶I的衍生物和变体，该DNA聚合酶I缺少或具有大幅度降低的5'-3'核酸外切酶活性且具有链替换活性；以及Bst DNA聚合酶I、Bsu DNA聚合酶、Gst DNA聚合酶I、GkaDNA聚合酶I、及phi29DNA聚合酶的大片段。这些聚合酶也缺少或具有大幅度降低的5'-3'核酸外切酶活性且可包括那些嗜热的聚合酶(如，Taq、Vent)。就此而言，本发明也提供用来定量切口酶与聚合酶的组合的单位活性的手段。此外，本发明的底物分子可用以研究聚合酶在多种条件下的可持续加工性，该条件包括，举例而言，DNA甲基化或在DNA加成物/损伤产物(如，乙醛、顺铂、7,12-二甲基苯并蒽、丙二醛、碱基切除修复的产物、氧化硅损伤产物、苯并芘、黄曲霉毒素、其它DNA反应性化合物)及/或DNA结合蛋白(图3A和3B)的存在下。此外，对于研究可持续加工性，可将包括不同的多个荧光团的一种或多种荧光团-猝光剂对内在地共价链接(如，生物素化)于该双链内(图3A)。例如，可使用1至5个荧光团，酶通道一个，通过直接标记(如，琥珀酰亚胺酯)而生物素化或附加。一种或多种重叠的猝光剂可配对于相反链上。一些例子中，重叠猝光剂覆盖光谱的广阔面积，且可与多种不同的荧光团配对。因此，本发明的底物分子可改性，且检查该改性对聚合酶延伸及/或可持续加工性的影响。

本发明的底物分子也可加至现有切口扩增反应中，并因此可在切口扩增反应中用作外源性控制分子，例如，以核实真阴性反应。据此，该外源性控制分子在与该切口扩增反应所用者相同的反应温度下使用。信号的单纯存在或不存在可用作反应控制。此外，该外源性控制反应到达设定RFU的时间可标志反应的终点。该外源性控制分子也可被“调谐”至特定反应速率，因此改变到达设定RFU的时间。当该外源性控制反应在与切口扩增反应相同的反应中运行时，它并不明显地干扰初级扩增反应。该外源性控制并不消耗很大数量的反应组分，如dNTP或其它试剂。再者，该外源性控制可设计为最小化3’端的形成，该形成可导致非特异性聚合酶延伸和背景干扰。

核酸扩增方法

聚合酶链反应(PCR)是用来扩增DNA的常见热循环依赖性核酸扩增技术，由重复的使用DNA聚合酶的DNA解链和DNA的酶促复制反应的加热和冷却循环组成。实时定量PCR(qPCR)是用来将生物样品中给定核酸序列的副本数定量的技术。目前，qPCR使用贯穿该反应的实时反应产物检测，并将其扩增概况与对照物的扩增比较，其中，该对照物在各反应开始时含有已知数量的核酸(或已知相对比率的核酸与未知测试核酸)。该对照物的结果用来构建标准曲线，典型是基于该标准反应扩增曲线的对数部分。这些数值用来基于其扩增曲线与标准对照物数量而对未知数量进行插值。

除了PCR外，存在非热循环依赖性扩增系统或等温核酸扩增技术，包括而不限于：切口扩增反应、滚环扩增(RCA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、环介导扩增(LAMP)、链替换扩增(SDA)、转录介导扩增(TMA)、自持序列扩增(3SR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、单引物等温扩增(SPIA)、Q-β复制酶系统、及重组酶聚合酶扩增(RPA)。

等温切口扩增反应具有与PCR热循环的相似性。类似PCR，切口扩增反应采用与指为引物的靶标序列互补的寡核苷酸序列。此外，靶标序列的切口扩增反应导致靶标序列中的对数性增长，恰与其在标准PCR中所得者相同。不同于标准PCR，该切口扩增反应等温地进展。标准PCR中，增加温度以令DNA的两条链分开。在切口扩增反应中，靶标核酸序列在测试样品中存在的特定切口位点处切口。聚合酶浸润该切口位点，并开始切口的靶标核苷酸序列(所加入的外源性DNA)的互补链合成，同时伴有对现有互补DNA链的替换。该链替换复制过程排除了升温的需要。在这一点上，引物分子退火为被从所加入的外源性DNA替换的互补序列。现在，聚合酶从该模板的3’端延伸，创建与先前所替换的链互补的链。随后，第二寡核苷酸引物退火为新和成的互补链并延伸，作成包括该切口酶识别序列的DNA双链。随后，这一链容易被后续的聚合酶造成的链替换延伸切口，这导致在原始靶标DNA任一侧具有切口位点的DNA双链的生产。一旦合成之后，该分子继续通过具有新模板分子的被替换链的复制而指数性扩增。此外，通过该目标引入的切口位点处的切口转译合成的重复作用，扩增也从每一产物分子线性前进。该结果是靶标信号扩增的非常迅速的增长；比PCR热循环快得多，且扩增在少于10分钟的时间内有结果。

切口扩增试验

本发明提供一种底物分子，其用于检测在等温切口扩增试验中扩增的靶标核酸分子。这些实验是该领域中已知的和本文中揭示的。见，例如，美国专利申请案US 2009/0081670、PCT申请案PCT 2009/012246、及美国专利US 7,112,423和US 7,282,328，这些文献各自以其整体并入本文。

可用于本文中揭示的方法中的聚合酶能催化核苷酸并入，以延伸结合至靶标核酸分子的寡核苷酸(如，引物)的3'羟基端及/或双链DNA分子中切口位点处的3'羟基端，同时伴有链替换活性。这些聚合酶也缺少或具有大幅度降低的5'-3'核酸外切酶活性，且可包括那些嗜热性聚合酶。可用于牵涉在包含6个3’-端核苷酸的引物区域中的2’-改性核苷酸的方法中的DNA聚合酶，包括从嗜热脂肪芽孢杆菌，也归类为嗜热脂肪土芽孢杆菌分离的、以及从包含土芽孢杆菌属的紧密相关的菌株、隔离群和物种分离的DNA聚合酶I的衍生物和变体，其缺少或具有大幅度降低的5'-3'核酸外切酶活性且具有链替换活性。例示性聚合酶包括，但不限于，Bst DNA聚合酶I、Bsu DNA聚合酶、phi29DNA聚合酶、Gst DNA聚合酶I、及GkaDNA聚合酶I的大片段。其它具体实施例中，例示性聚合酶包括，但不限于，BST(大片段)、DNA聚合酶I(E.coli)、DNA聚合酶I、Large(Klenow)片段、Klenow片段(3'-5'外-)、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、Deep VentR(exo-)DNA聚合酶、Deep VentR DNA聚合酶、DyNAzyme、高保真DNA聚合酶、Therminator、Therminator II DNA聚合酶、AmpliTherm DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、Tfl DNA聚合酶、Tgo DNA聚合酶、SP6DNA聚合酶、Tbr DNA聚合酶。

可用于本文揭示的方法中的切口剂是一种化学整体，能识别并结合至双链核酸分子中的特定结构，且当结合至其识别的特定结构时，以显着高于破坏下方链上邻接核苷酸间的磷酸二酯键的速率破坏上方链上邻接核苷酸间的磷酸二酯键，从而在该切口位点之前的端核苷酸上创建游离的3’-羟基，且该切口位点可由5’-3’-核酸外切酶缺乏性链替换聚合酶来延伸。本文中揭露的方法的优选具体实施例中，该“切口剂”的上方链磷酸二酯键裂解速率达到100％，而下方链磷酸二酯键的裂解速率达到0％。可用于本文中揭示的方法中的切口剂可以是酶，即对多个底物分子起作用的自我再生催化剂；或仅以等摩尔比率方式对单一底物分子起作用的非再生性催化剂。

切口酶结合双链DNA且裂解该双链的一条链。在本发明的方法中，该切口酶裂解上方链(该链包含切口剂识别位点的5’-3’序列)。本发明的特别的具体实施例中，该切口酶仅裂解识别位点的3’下游的上方链。例示性具体实施例中，该反应包含切口酶的使用，该酶在结合位点的下游裂解或切口，因此该产物序列并不含有切口位点。使用裂解该结合位点下游的酶，令该聚合酶更容易延伸而不必替换该切口酶。理想上，该切口酶在与聚合酶相同的反应条件下起作用。例示性切口酶包括，但不限于，N.Bst9I、N.BstSEI、Nb.BbvCI(NEB)、Nb.Bpu10I(Fermantas)、Nb.BsmI(NEB)、Nb.BsrDI(NEB)、Nb.BtsI(NEB)、Nt.AlwI(NEB)、Nt.BbvCI(NEB)、Nt.Bpu10I(Fermentas)、Nt.BsmAI、Nt.BspD6I、Nt.BspQI(NEB)、Nt.BstNBI(NEB)、及Nt.CviPII(NEB)。切口酶识别位点的序列提供于表1中。

切口酶也包括通过改性限制性核酸内切酶而创建的工程化切口酶(NEBexpressions July 2006,vol 1.2)。当限制性核酸内切酶结合至DNA中的其识别位点时，每一酶内用于水解各链的两个催化位点驱动平行前进的两个独立的水解反应。改变的限制性酶可经工程化为仅水解该双链的一条链，以生产被“切口”(3′-羟基，5′-磷酸酯)而非被裂解的DNA分子。切口酶也可包括改性的CRISPR/Cas蛋白、类转录活化子效应子核酸酶(TALENs)、及具有切口酶活性的锌指核酸酶。

切口扩增反应典型包含核苷酸如，举例而言，二脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)。该反应也可在包括可检测部分的dNTP的存在下进行，该可检测部分包括但不限于，放射性标记物(如，³²P、³³P、¹²⁵I、³⁵S)、酶(如，碱性磷酸酶)、荧光标记物(如，异硫氰酸荧光素(FITC))、生物素、卵白素、地高辛、抗原、半抗原、或荧光染料。该反应进一步包含某些向该切口酶和聚合酶提供活性的盐和缓冲剂。

该切口扩增反应较佳在基本等温条件下进行，该条件下，反应温度在扩增反应过程中或多或少为恒定。因为稳定无需在较高温度与较低温度之间循环，所以该切口扩增反应可在难以进行传统PCR的条件下进行。典型地，该反应在介于约35℃与90℃之间(如，约35、37、42、55、60、65、70、75、80、或85℃)进行。较佳地，以高精确度维持该温度是必要的。能接受温度的一些变化性。

选择一组ΔΔG’s≤-15、-16、17、-18、-19、-20、-25、-30kcal/mol或更高的引物用于扩增。可通过增加一种或多种寡核苷酸(如，一种或多种引物及/或探针)的浓度及/或其比率来改变扩增反应的效能特征。高浓度的引物也有助于引物-二聚体的形成。多种具体实施例中，引物的浓度为100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000nM或更高。解链温度(Tm)和反应速率改性剂也可用来降低该寡核苷酸的解链温度，如(但不限于)乙二醇和甘油。此外，DNA聚合酶反应速率改性剂(如dNTP和镁浓度)可用来改变反应速率，以导致更大的定量精度。特别的具体实施例中，正向引物和反向引物的5’尾部序列具有相同的核酸序列。

本发明提供实时监控切口扩增反应的方法。一种具体实施例中，定量核酸扩增使用同时进行的靶标核酸扩增和已知数量的对照物扩增。靶标核酸的量可计算为绝对定量或基于该对照物(外源性或内源性对照物)来源的相对定量。

可通过将未知的对数阈扩增与一系列已知的靶标序列在一组独立的反应中或相同反应中比较，实现对未知核苷酸序列的定量；或因为内部内源性或外源性共扩增产物产生表明阳性结果(若未知者超出该阈值)或阴性结果(若未知者并未超出该阈值)的阈值，而实现对未知核苷酸序列的定量。

本发明还提供设计切口剂依赖性等温链替换扩增试验而无需对备选的正向引物及/或备选的反向引物的众多组合进行实验筛选的方法。经鉴别，该靶标序列内35至70bp长的区域的Tm≥该试验温度(如，约55℃)的中心部位具有12至20bp的序列。根据上述标准，鉴定紧邻该15至20bp长的中心区域的下游和上游12bp至20bp相邻序列。所选择的双链下游和上游序列的Tm彼此偏差少于±3℃。通过将用于稳定的二聚体形成引物的5’-尾部区域附加至具有12至20个碱基的上游相邻序列的5’-端以及具有12至20个碱基的下游相邻序列的互补链的5’-端，而创建正向引物与反向引物的靶标特异性对。当将该正向引物、反向引物与探针组合时，驱使与该探针互补的链的合成的引物，以约1.1:1至10:1的摩尔比相对于另一引物过量。该试验中引物的组合浓度不高于1000nM。该试验设计方法也可用以将预先验证的用于扩增子≤70bp的PCR试验转化为切口剂依赖性等温链替换扩增试验。

引物设计

用于引物设计的传统方法已经聚焦在引物解链温度、引物退火温度、GC(鸟嘌呤与胞嘧啶)含量、引物长度、以及最小化该引物与除靶标核酸外的全部的相互作用(见，如，www.premierbiosoft.com/tech_notes/PCR_Primer_Design.html)。与这些方法相反，已经发现，形成稳定的引物/二聚体的引物，以术语“生成自由能(ΔG)”表达，在核酸扩增反应中如预见地作用。虽然自由能(ΔG)和解链温度(Tm)共享主要组分焓(ΔH)和熵(ΔS)，ΔG值与Tm值的推导过程不同且不具有关联的关系，将给定ΔG与给定Tm值关联的唯一途径将从其所推导者明确知道ΔH值和ΔS值(Manthey,“mFold,Delta G,and MeltingTemperature”and 2011Integrated DNA Technologies)。图1至11涉及最优因为的设计。

可使用该领域中已知的公式计算分子间因为结构的生成自由能(ΔG)。大量程序可用于确定多种分子内引物结构和分子间因为结构并计算其ΔG，包括，例如，mfold和UNAfold预测算法(见，如，Markham and Zuker.UNAFold:Software for Nucleic AcidFolding and Hybridization.Bioinformatics:Volume 2,Chapter 1,pp 3-31,HumanaPress Inc.,2008；Zuker et al.Algorithms and Thermodynamics for RNA SecondaryStructure Prediction:A Practical Guide In RNA Biochemistry and Biotechnology,11-43,NATO ASI Series,Kluwer Academic Publishers,1999；M.Zuker.Prediction ofRNA Secondary Structure by Energy Minimization.Methods in Molecular Biology,267-294,1994；Jaeger et al.Predicting Optimal and Suboptimal SecondaryStructure for RNA.In Molecular Evolution:Computer Analysis of Protein andNucleic Acid Sequences,Methods in Enzymology 183,281-306,1990；Zuker.OnFinding All Suboptimal Foldings of an RNA Molecule.Science 244,48-52,1989)。OligoAnalyzer3.1是对于引物设计的此类mfold实施算法之一(www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/)。例如，参考OligoAnalyzer 3.1，可使用下述参数实施ΔG计算：靶标类型为DNA；寡核苷酸浓度为0.25μM；Na⁺浓度为60mM；Mg⁺⁺浓度为15mM；以及，dNTP浓度为0.3mM。

3’识别区域

本发明提供具有3’识别序列的引物，其引物靶标形成是稳定的(ΔG≤约-20kcal/mol或更大)且具有提升核酸扩增反应效能的潜力。该3’识别区域特异性地结合至核酸分子，例如，该核酸分子的互补序列。某些具体实施例中，该3’识别区域具有与核酸序列的12、13、14、15、16、17、18、19、或20个或更多碱基互补的序列。特别的具体实施例中，该3’识别区域包含一个或多个肌苷碱基。具体的具体实施例中，该3’识别区域包含不超过2/12个肌苷。多种具体实施例中，该引物-靶标解链温度大于或等于比该试验的反应或延伸温度低8℃或6℃的温度(Tm≥试验温度-8℃)。特定的具体实施例中，该3’识别序列包含12至20个、12至17个、或12至14个碱基。特定的具体实施例中，该引物-靶标的形成比自身二聚体的形成更稳定(如，ΔΔG≤约-15、-16、-17、-18、-19、-20kcal/mol或更高)。优选地，该3’识别序列并不含有自互补序列、短的反向重复序列(如，>4个碱基/重复序列)、或反而促进分子内相互反应的序列，而这些序列具有干扰引物-靶标退火的潜力。

一种具体实施例中，将引物设计为具有56℃的Tm，且在该引物末端具有4个可能无助于退火的序列特异性碱基。一种具体实施例中，该引物为16、17、18、19、20或21聚体。

特别地，本发明的具有3’识别序列的引物可用于切口扩增试验。此外，靶标特异性3’识别区域包含一个或多个2’改性核苷酸(如，2’-O-甲基、2'-甲氧基乙氧基、2'-氟、2’-烷基、2’-烯丙基、2'-O-[2-(甲胺基)-2-氧代乙基]、2’-羟基(RNA)、4’-巯基、4’-CH₂-O-2’-桥、4’-(CH₂)₂-O-2’-桥、乙基2'-O-(N-甲基胺基甲酸酯))。不受缚于理论，假设将一个或多个2’改性核苷酸并入该识别区域中减少或消除了引物/模板的分子间及/或分子内相互作用(如，引物-二聚体的生成)，并因此减少或消除了等温扩增中的背景信号。该2’改性核苷酸优选具有与靶标序列配对的碱基。特定的具体实施例中，该靶标特异性识别区域内的两个或更多个2’改性核苷酸(如，2、3、4、5或更多个2’改性核苷酸)是邻接的(如，改性核苷酸的嵌段)。一些具体实施例中，2’改性核苷酸的嵌段定位在该靶标特阴性识别区域的3’端。其它具体实施例中，2’改性核苷酸的嵌段定位在该靶标特异性识别区域的5’端。当2’改性核苷酸的嵌段定位在该靶标特异性识别区域的5’端时，该2’改性核苷酸可以通过一个或多个非改性核苷酸(如，2、3、4、5个或更多个2’未改性核苷酸)与该切口位点分开。申请人已经发现，一个或多个2’改性核苷酸或2’改性核苷酸嵌段的定位改变了扩增的动力学。当该一个或多个2’改性核苷酸或2’改性核苷酸的嵌段被定位在接近该识别区域的5’端或邻近该切口位点时，实时扩增反应显示检测时间缩短。此外，信号曲线收缩且该曲线的斜率改变。

相关具体实施例中，具有一个或多个2’改性核苷酸的引物的比率可用以改变检测时间及/或用于“调谐”该反应的反应效率，导致对于反应动力学的可预测控制。增加在该识别序列3’端的具有一个或多个2’改性核苷酸的引物与在该识别序列5’端的具有一个或多个2’改性核苷酸的比率，收缩了该信号曲线并改变了该曲线的斜率。较佳是能“调谐”反应，提供操纵检测时间以及反应效率两者的手段。使用内标对照的相对定量需要符合两个重要条件。首先，创建非竞争性反应条件有益于改性反应检测时间的能力。因此，通过影响在较晚时间点(相对于该兴趣的目标)可检测的控制反应，甚至当该感兴趣的靶标的初始丰度低时，该控制反应仍并不与感兴趣的特异性靶标竞争。第二，为了确保真实的相对丰度计算，需要该对照物和特异性靶标反应具有匹配的效率。通过控制每一反应的效率，使用“调谐”条件令反应能被匹配，从而容许令人满意的相对定量计算。调谐该反应可用以在定量PCR(qPCR)中匹配靶标核酸扩增与参考核酸扩增(如，内标)。此外，可改变靶标核酸及内标的扩增曲线，因此，其扩增反应的检测时间分开，同时对靶标核酸扩增和内标扩增提供相同的效率。通过在反应中使用寡核苷酸结构的具体组合和比率，可能创建能调谐反应效能的条件。

5’尾部二聚化区域

本发明提供具有能自身二聚体化的5’尾部2区域的引物，其提升核酸扩增反应效能。不受缚于理论，在核酸扩增反应中，该引物作为引物-二聚体而退火为靶标核酸。例如，切口扩增引物具有存在于5’端的切口剂识别位点，而该识别位点与该引物结合至靶标识别序列的特异性不相关。来自非特异性引物相互作用的非特异性背景产物，具有隔绝原本已经用于该特异性产物扩增的反应组分的潜力。多种具体实施例中，同源二聚体的生成是稳定的(如，ΔG≤约-30、-35、-40、-45、-50、-55、-60kcal/mol或更大)。多种具体实施例中，该同源二聚体的解链温度高于延伸反应温度。特定的具体实施例中，该5’尾部区域具有回文序列。其它具体实施例中，该5’尾部区域的长度为至少20个碱基(如，20、21、22、23、24个碱基)。另外的具体实施例中，该5’尾部区域的GC含量为80至90％。某些具体实施例中，同源二聚体的生成比其它较不稳定的引物二聚体构型的生成更为稳定(如，ΔΔG≤约-12、-13、-14、-15、-16、-17、-18、-19、-20、-25、-30、-35、-40kcal/mol或更大)。

特别地，本发明的具有5’尾部序列的引物可用于切口扩增反应中。对于在切口扩增反应中使用，该5’尾部区域包含一个或多个切口剂识别位点，且该5’尾部区域具有对称的反向序列。特定的具体实施例中，该5’尾部区域含有偶数个核苷酸(如，22、24个核苷酸)。将该切口位点设计为定位在该5’尾部区域3’端的核苷酸与该3’识别位点5’的核苷酸之间。不受缚于理论，当3’识别是单链时，切口酶并不在该切口位点裂解。然而，当3’识别区域是双链时(如，当在核酸扩增反应进程中将该引物并入双链靶标核酸分子内时)，出现了在切口位点的裂解。具有Nt.BstNBI识别序列的长度为24个核苷酸的例示性5’尾部区域可基于下述模板而生成：5’-NNNNGACTCNNNNNNGAGTCNNNN-3’。基于这一模板，存在具有下述性质的537,824个5’尾部序列：ΔG＝-48Kcal/mole至-62kcal/mol；ΔΔG<-40kcal/mol；以及，GC含量为68％至84％。这些之中，提供了1050个所选择的序列，代表了0.2％的整体序列空间(248,832)。具有Nt.BstNBI识别序列的长度为22个核苷酸的例示性5’尾部区域基于模板5’-NNNNGACTCNNNNGAGTCNNNN-3’。基于这一模板，存在具有下述性质的248,832个5’尾部序列：ΔG＝-47Kcal/mol至-55kcal/mol；ΔΔG<-40kcal/mol；以及，GC含量为72％至82％。这些之中，提供了200个所选择的序列，代表了0.08％的整体序列空间(248,832)。

靶标核酸分子

本发明的方法和组合物可用于测试样品中核酸分子的扩增及/或鉴定。该靶标序列被从几乎任何包含核酸分子的样品扩增。

例示性测试样品包括体液(如，唾液、汗液、泪液、体腔中积累的液体、尿液、精液、阴道分泌物、脑脊液、淋巴液、粪便、痰涎、分解液、呕吐物、汗液、乳汁、血液、血清、及血浆)、组织提取物、培养基(如，细胞如病原体细胞已经在其中生长的液体)、环境样品、农产品或其它食品、及其提取物、及DNA检定标签。若需要，在并入切口扩增反应之前，使用典型用于从生物样品分离核酸分子的任何标准方法纯化该样品。

一种具体实施例中，引物扩增病原体的靶标核酸，以检测样品中病原体的存在。对于环境应用，测试样品可包括水、可能已经暴露于被病原体污染的实验对象的建筑材料(如，干式墙、吊顶板、墙板、纤维织物、壁纸、及地板覆盖物)的液体提取物、环境拭片、或任何其它样品。

应用

使用本发明引物的靶标核酸扩增具有可用于靶标核酸分子的快速检测的特征。本发明的组合物和方法可用于希望快速诊断应答的人类诊断中(如，在20、15、10、9、8、7、6、5分钟或更短时间以内可检测的扩增)。特定的具体实施例中，本发明提供切口扩增反应试验在人类诊断或兽类诊断在临床设定或该领域中的用途。其它具体实施例中，本发明提供切口扩增反应试验在热循环设备不可用或将非常昂贵的诊断领域工作中的用途。再其它的具体实施例中，本发明提供切口扩增反应试验在希望快速定量应答的临床设定中的用途。

可检测的寡核苷酸探针

本发明提供使用不可扩增的可检测多核苷酸探针在切口扩增反应中对靶标核酸分子或其扩增子的定量检测，其中，该探针包含至少一种聚合酶拦阻分子(如，核苷酸改性或其它部分，其使得寡核苷酸能结合靶标核酸分子但不能支持使用该可检测寡核苷酸探针作为靶标的模板延伸)。不欲受缚于理论，不允许聚合酶前进的一个或多个部分的存在似乎在非核酸固件至该寡核苷酸的加成反应中或通过停止复制性聚合酶(即，C3间隔物、损伤的DNA碱基、其它间隔物部分、2’-OMe碱基)而造成了聚合酶拦阻。这些构建物因此防止或减轻了切口扩增反应进程中该探针的非法扩增。这将它们与传统检测探针区别开来，而传统检测探针必需在切口扩增反应末期加入以防止探针扩增。

传统检测探针已经证明不能实行切口扩增反应的实时定量。如果将传统检测探针并入切口扩增反应中，这些传统检测探针与靶标同时被扩增。由于在反应开始时该检测探针的起始分子的数量，这些检测分子的扩增屏蔽了合法靶标扩增子的检测。

本发明提供不可扩增的可检测多核苷酸探针，其包含至少一种聚合酶拦阻分子。本发明的聚合酶拦阻分子包括，但不限于，核苷酸改性或其它部分，其通过复制性DNA聚合酶阻断模板延伸，从而防止检测分子的扩增；但能允许与该靶标分子或该靶标分子扩增副本的适宜杂交或核苷酸间隔。一种具体实施例中，本发明的可检测寡核苷酸探针包含防止或减轻检测分子的非法扩增的3碳间隔物(C3间隔物)。

一种具体实施例中，可检测寡核苷酸探针包含一种或多种改性核苷酸碱基，该碱基改性核苷酸具有提升的与互补核苷酸的结合亲和性。改性碱基的实例包括，但不限于，2'氟酰胺化物及2'OMe RNA酰胺化物(也起聚合酶拦阻分子的作用)。本发明的可检测寡核苷酸探针可合成为具有不同颜色的荧光团，且可设计为与几乎任何靶标序列杂交。就其卓越的特异性而言，本发明的不可扩增的可检测多核苷酸探针用以检测样品中的单一靶标核酸分子，或用于与各自结合不同的靶标核酸分子的组合中。据此，本发明的不可扩增的可检测多核苷酸探针可用以在相同反应中检测一种或多种靶标核酸分子，令这些靶标被同步定量。本发明涵盖此类荧光团与本文中揭示的可检测寡核苷酸探针合用的用途。

在硬件及/或软件中的执行

本文中揭示的方法可使用通用或特异性编程的硬件或软件执行。例如，该方法可通过计算机可读媒体执行。据此，本发明也提供配置为实施根据本发明任何具体实施例的算法及/或方法的软件及/或计算机程序产品。该领域技术人员熟知如何配置可实施本发明中提供的算法及/或方法的软件。该计算机可读媒体可以是永久的及/或有形的。例如，计算机可读媒体可以是易失存储器(如，随机存取存储器等)或非易失性存储器(如，只读存储器、硬盘、软盘、磁带、光盘、纸质标签、大孔卡等)。计算机可执行指令可以适当的计算机语言或若干中语言的组合写入。基础计算生物学方法揭示于例如下述文献中：Setubal andMeidanis et al.,Introduction to Computational Biology Methods(PWS PublishingCompany,Boston,1997)；Salzberg,Searles,Kasif,(Ed.),Computational Methods inMolecular Biology,(Elsevier,Amsterdam,1998)；Rashidi and Buehler,Bioinformatics Basics:Application in Biological Science and Medicine(CRCPress,London,2000)；以及，Ouelette and Bzevanis Bioinformatics:A PracticalGuide for Analysis of Gene and Proteins(Wiley&Sons,Inc.,2^nd ed.,2001)。

本发明也可利用多种计算机程序产品和软件用于各种目的，如探针设计、数据管理、分析、和仪器操作(US 5,593,839、US 5,795,716、US 5,733,729、US 5,974,164、US 6,066,454、US 6,090,555、US 6,185,561、US 6,188,783、US 6,223,127、US 6,229,911及US6,308,170)。此外，本发明可具有优选的具体实施例，其包括用于在网络如因特网上提供基因组信息的方法，如US 10/197,621、US 10/063,559(公开号为US 20020183936)、US 10/065,856、US 10/065,868、US 10/328,818、US 10/328,872、US 10/423,403、及US 60/482,389中所示。

试剂盒

本发明提供用于检验切口酶和聚合酶活性的试剂盒。多种具体实施例中，该试剂盒包括本发明的底物分子。本发明还提供用于核酸分子扩增的试剂盒，包括用作外源性控制的本发明的底物分子。此类试剂盒可用于对从实验对象获得的生物样品中核酸的检测或定量。本发明的试剂盒可包含，例如，本文中揭示的DNA聚合酶、正向和反向引物、及一种或多种切口酶，以及可检测的探针。若多种病原体序列待扩增且涉及用于那些靶标序列的模板包含用于相同切口酶的切口酶位点，则可包括一种或两种切口酶。若该模板被不同的切口酶识别，该试剂盒内可包括多种切口酶，如3种或更多种。

一方面，本发明提供用于核酸扩增的试剂盒，其包含DNA聚合酶；主要引物、次要引物、具有对于该引物内切口酶结合位点的特异性的切口酶、及三磷酸脱氧核苷核苷酸(dNTP)(如，在含有对于扩增为足量的组分的缓冲溶液中)。多种具体实施例中，若该末端特异性识别区域包含一个或多个2’改性核苷酸，该主要引物和次要引物各自具有与靶标序列互补或基本上互补的3’端特异性识别区域序列；在3’端特异性识别区域序列上游含有切口酶结合位点的能与自身二聚化(如，自补)的5’端尾部区域。特定的具体实施例中，一种或多种引物是引物-二聚体构型的形式(如，通过在约Tm稳定加热并缓慢冷却而生产)。

本发明的试剂盒还包含一种或多种置于任何数目的独立容器、小包、管(如，<0.2ml、0.2ml、0.6ml、1.5ml、5.0ml、>5.0ml)、小瓶、微量滴定盘(如，<96孔、96孔、384孔、1536孔、>1536孔)、ArrayTape等中的组分，或该组分可以任何组合置于此类容器中。多种具体实施例中，该试剂盒进一步包含能结合至参考序列且扩增该序列的一对引物。特定的具体实施例中，该试剂盒包含引物-二聚体构型形式的一种或多种引物(如，通过在约Tm稳定加热并缓慢冷却而生产)。其它具体实施例中，该试剂盒包含含有该引物的无菌容器；该容器可以是盒子、安瓿、瓶、小瓶、管、袋、皮套、泡罩、或该领域中已知的其它适当容器。该容器可以由塑料、玻璃、层压纸板、金属箔、或适用于容纳核酸的其它材料作成。

该试剂盒的组分可例如存在于一个或多个容器内，例如，全部组分可存在于一个容器内，或者例如，该酶可存在于与引物分开的独立容器内。该组分可例如经干燥(如，粉末)或置于稳定缓冲液中(如，经化学稳定化、热稳定化)。干燥组分可通过例如冻干、真空和离心辅助干燥及/或环境干燥而制备。多种具体实施例中，该聚合酶和切口酶以冻干形式置于单一容器内，且该引物或可经冻干、冷冻干燥、或置于缓冲液中而置于不同的容器内。一些具体实施例中，该聚合酶、切口酶、及引物是以冻干形式置于单一容器内。其它具体实施例中，该聚合酶和切口酶可独立置于不同的容器内。

试剂盒可进一步包含，例如，反应中使用的dNTP或改性核苷酸、用于该反应的比色皿或其它容器、或装有用于将冻干组分再次水合的水或缓冲液小瓶。例如，所使用的缓冲液可适合于聚合酶和切口酶两者的活性。

本发明的试剂盒也可包含实施本文中揭示的一种或多种方法的使用指南，及/或对本文中揭示的一种或多种组合物或实际的说明。使用指南及/或说明可以是印刷形式，也可以包括在试剂盒插页中。试剂盒也可包括提供此类指南和说明的网址的书面说明。

除非明确说明，本发明的实践采用该领域技术人员认知范围内的传统分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学技术。此类技术在文献如《分子克隆：实验室手册(第二版)》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,second edition(Sambrook,1989))；《寡核苷酸合成》(Oligonucleotide Synthesis,(Gait,1984))；《动物细胞培养》(Animal Cell Culture,(Freshney,1987))；《酶学方法》《实验免疫学手册》(Methods in Enzymology,Handbook of Experimental Immunology,(Weir,1996))；《哺乳动物细胞用基因转移载体》(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells,(Miller andCalos,1987))；《分子生物学技术》(Current Protocols in Molecular Biology,(Ausubel,1987))；《PCR：聚合酶链反应》(PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis,1994))；《免疫学技术》(Current Protocols in Immunology,(Coligan,1991))中有完整解释。这些技术适用于本发明的多核苷酸和多肽的生产，且如此可考虑用于作成和实践本发明。特别可用于特定具体实施例的技术将在下文中探讨。

提出下列实施例，以向该领域技术人员提供对于如何作成并使用本发明的试验、筛选、及治疗方法的完全揭露和说明，且下述实施例不欲限制发明人所认为的其发明范畴。

[实施例]

实施例1.具有可检测报告物质的切口和延伸反应底物，其可用作外源性/内部控制分子。

本发明提供切口和延伸反应底物，其是在一条链上具有切口位点的寡核苷酸双链，该切口位点处在相对于共价链接在该链3’端的可检测荧光报告分子为5’(图1A和1B)。位于相反链5’端的猝光剂防止该曝光分子发出荧光(图1A和1B)。当该底物分子切口时，所得内部3’端可使用该相反链作为模板而通过聚合酶延伸(图1C至1E)。聚合酶延伸导致该链的链接至该荧光报告物的部分的替换(图1E)。当该荧光报告物与猝光剂分开时，该荧光报告物产生荧光信号(图1E)。可对底物分子作出额外的改善，以防止或最小化切口和延伸的进一步循环(图1F)。

该底物分子在切口酶和聚合酶的存在下的反应产生了线性信号，特别是当该寡核苷酸3’端被阻断而不进行进一步相互作用时(图2A)。该底物分子可作为外源性/内部对照加入切口扩增反应中，以显示切口酶和聚合酶在该反应中具有活性。当切口酶和聚合酶具有活性且平行运行时，该控制反应和该切口扩增反应两者均开始。将该控制反应设计为最小化反应组分的使用，因此最小化该扩增反应的影响。较佳地，可将切口扩增反应的反应终点设定为该外源性控制分子达到所设定RFU的时间(图2B)。例如，这可用以将扩增信号基于其检测时间而表征为阳性或阴性。

使用若干在环绕切口位点的多个位置具有改性核苷酸的底物分子实施研究(图4)。对于这些研究，该具有猝光剂的寡核苷酸的3’端未被阻断。该底物分子显示了预期的反应概况。当切口酶浓度相对高时，观察到了快速线性响应，大多数情况下，在5分钟内迅速达到最大RFU(图5A至5E和6A至6D)。特别地，在切口位点5’端第一位置具有2’OMe的切口-1底物分子，显示了比其它底物分子延迟的响应(图6C)。在相对较低浓度的切口酶，达到最大RFU的时间将会延长(图5D和5E)。

对GAGTC切口酶识别位点5’端寡核苷酸的部分的长度做出改变(图7)。基于斜率，上链A、B、C全部具有相等的活性。具有切口酶识别位点5’端两个核苷酸的上链D的反应曲线开始略微地改变。在具有切口酶识别位点5’端一个核苷酸的上链E中，观察到了反应响应的进一步下降。对于不具有切口酶识别位点5’端核苷酸的上链F，未观察氘反应。因此，当存在GAGTC切口识别位点5’侧的三个或更多个核苷酸时，这些数据显示该切口酶的完整活性。活性的差异提供了反应速率的选择，因此该外源性控制将与不同试验相容。

实施例2.外源性控制反应的可调谐性。

本发明的一方面，该外源性控制反应可经调谐，这令在给定的切口扩增反应条件下运行的外源性控制反应可定制。使用不同比率的包含未改性核苷酸和改性核苷酸的底物分子，可控制该反应速率(图8)。该非改性上链(A)标定为具有两个甲氧基改性寡核苷酸(G)。使用添加量的改性寡核苷酸，反应速率(斜率)得以控制，且将会经调谐以在预设时间达到所希望的阈值。这些结果显示，外源性控制分子的混合物可用作“反应计时器”以及阳性反应控制。

另一方面，通过将2’OMe改性核苷酸定位在切口位点和切口酶识别位点附近的底物分子内的多个位置，可调谐该外源性控制反应(图9A和9B)。经改性的上链(A至K和DE)与经C3间隔物阻断的下链组合。除了处于“切口-1”处(Nt.BstNBI切口位点之前的最末5’碱基)的上链D之外，其它全部获得了相对等值的结果。先前的结果也显示了使用较少切口酶而从上链B获得的小效果。使用置于切口识别位点(GAGTC)的全部2’OMe改性核苷酸，观察到相对等值的结果。当将2’OMe改性核苷酸置于切口位点任一侧时，见到了最值得注意的效果。

实施例3.使用切口和延伸反应底物检测切口酶和聚合酶活性。

本发明的一方面，该底物分子可用来测试反应条件以确定切口酶和聚合酶的组合的活性并表征其复合活性。由于切口酶与聚合酶性质(如，热性质)之间的差异，存在优化反应条件以最大化整体切口和延伸反应活性的潜力。本发明之前，这一分析不能利用。将经改性的上链与未阻断的下链(未阻断的3’端)合用。可使用这些寡核苷酸测试切口酶及/或聚合酶的活性，以提供非常受控的具有高复制性的反应，同时在酶功能方面模拟真实的扩增反应。依据所希望的读数，可使用经阻断或未阻断的3’端。实施研究，显示了切口酶浓度对于底物分子的反应的效果(图10)。

实施例4.用于对来自沙门氏菌的DNA进行定量检测的测试试剂盒，包括外源性/内部控制。

需要对沙门氏菌的快速、随时随地的检测，以进行干预并防止其传播。生成测试试剂盒，用于进行来自沙门氏菌的DNA的定量检测。该检测试验是基于等温核酸扩增方法的。该试剂盒也包括外源性/内部控制，以证实每一反应中切口酶和聚合酶的活性。首先测试一系列引物和信标序列的实验以进行优化。下述引物用于靶标核酸分子的扩增。

正向引物

5’-TGACTCCATATGGAGTCACATCACmCGAAATACmCmGmCmCmA-3’

5’-GACTCGATATCGAGTCTTTCCACmCGAAATACmCmGmCmCmA-3’*

5’-GAAAGACTCGCGAGTCTTTCCACmCGAAATACmCmGmCmCmA-3’

反向引物

5’-TGACTCCATATGGAGTCACATCGGmCATCATTATTATCTTTGmUmGmAmAmC-3’

5’-GACTCGATATCGAGTCTTTCCGGmCATCATTATTATCTTTGmUmGmAmAmC-3’*

5’-GAAAGACTCGCGAGTCTTTCCGGmCATCATTATTATCTTTGmUmGmAmAmC-3’

以前缀“m”标记的碱基表明2’-O-甲基核糖核苷酸的位置。

使用下述探针进行靶标核酸分子的检测：

“分子信标”检测探针

5’-CalRed_610nm-CGCCTGTGAACTTTATTGGCG-BHQ2-3’

下述寡核苷酸的双链用作外源性和内部控制(图11)：

外源性控制下部(BOT)3碳间隔物(C3间隔物)：

5’黑洞猝光剂(Black Hole Quencher，BHQ)-1

GGCCCGCGCGATGCACTCCGTGGCAGTGACTCTG

TAAT-c3间隔物3’

HPLC纯化

外源性控制上部(Topn)：

5’CAGAGTCACTGCCACGGAGTGCATCGCGCGGGCC/36-FAM/3’

HPLC纯化

在等温核酸扩增反应中测试上述引物和探针。从模拟的宠物食品或浓缩培养物制备测试样品。该扩增和检测反应显示高的信噪比、指数扩增的早期开始、大的扩增斜率、快速的检测时间、及重复试验反应中的低信号方差。全部靶标控制样品显示强烈的信号。该外源性/内部控制提供了一种手段，其检测切口酶和聚合酶的活性，同时最小化对等温核酸扩增反应的干扰。使用这一试验进一步测试并检测一系列超过100种沙门氏菌血清型。这些结果表明，前述反应和试剂可用于沙门氏菌的快速、精确的检测。

其它实施方式

从前述说明书可知，可对本文中揭示的发明作出变更和改性，以令其适用于多种用途和情况。这些实施方式也处于权利要求范畴内。

本文中，任何变量的定义中列举要素的详述包括该变量作为任何单一要素或所列述要素组合(或子组合)的定义。本文中实施方式的详述包括作为单一实施方式或与任何其它实施方式或其部分的组合。

本说明书中提及的全部专利和出版物通过引用而并入本文，引用程度为每一独立专利和出版物被明确且独立地表明通过引用被并入本文。

Claims

1.一种用于切口和延伸反应的底物，所述底物包含核酸双链，所述双链包含：

i)第一核酸链，包含切口酶识别位点和共价链接至3’端的荧光可检测标记物；以及

ii)第二核酸链，具有能与所述第一链双链化的序列以及共价链接至5’端的猝光剂；

或

i)第一核酸链，包含切口酶识别位点和共价链接至3’端的猝光剂；以及

ii)第二核酸链，具有能与所述第一链双链化的序列以及共价链接至5’端的荧光可检测标记物。

2.如权利要求1所述的底物，其中，所述第一核酸链通过切口酶切口。

3.如权利要求1或2所述的底物，其中，所述荧光可检测的标记物是FAM、TET、HEX、TAMRA、JOE、或ROX。

4.如权利要求1至3中任一项所述的底物，其中，所述猝光剂部分是5’IowaRQ(5IabRQ)、dabcyl、dabsyl、或Black Hole Quencher染料。

5.如权利要求1至4中任一项所述的底物，其中，所述第二核酸的3’端以C3间隔物、二脱氧核苷酸、磷酸化作用、染料、荧光团、猝光剂、间隔物或链接物改性。

6.如权利要求1至5中任一项所述的底物，包含改性核苷酸。

7.如权利要求1至6中任一项所述的底物，其中，所述第一核酸链在切口位点5’端位置1或2处以及切口位点3’端位置1处的一个或多个核苷酸改性。

8.如权利要求1至7中任一项所述的底物，其中，所述第一核酸链在切口识别位点与所述切口位点之间的一个或多个核苷酸改性。

9.如权利要求1至8中任一项所述的底物，其在所述切口酶识别位点内的一个或多个位置改性。

10.如权利要求1至9中任一项所述的底物，其中，所述一个或多个改性核苷酸包含2’-O-甲基、2'-甲氧基乙氧基、2'-氟、2’-羟基(RNA)、2'-烯丙基、2'-O-[2-(甲胺基)-2-氧代乙基]、4'-巯基、4'-CH₂-O-2'-桥、4'-(CH₂)₂-O-2'-桥、及2'-O-(N-甲基氨基甲酸酯)、甲基化、生物素化、核苷酸加成物、或碱基类似物。

11.如权利要求1至10中任一项所述的底物，其中，所述切口酶是Nt.BstNBI、N.Bst9I、N.BstSEI、Nb.BbvCI、Nb.Bpu10I、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nt.AlwI、Nt.BbvCI、Nt.Bpu10I、Nt.BsmAI、Nt.BspD6I、Nt.BspQI、及Nt.CviPII。

12.如权利要求1至11中任一项所述的底物，其中，其长度为介于约30bp至约2kb之间、介于约100bp至约1kbp之间、介于约100至约500bp之间、介于约30至约200bp之间、介于约30至约60bp之间、介于约35至约50bp之间。

13.如权利要求1至12中任一项所述的底物，其中，所述核苷酸链的长度为介于约30至约2000nt之间、介于约100至约1000nt之间、介于约100至约500nt之间、介于约30至约100nt之间、介于约30至约60nt之间、介于约35至约50nt之间。

14.如权利要求1至13中任一项所述的底物，其中，所述切口位点3’端的核酸链的长度为约25nt、约35nt、约40nt或更大。

15.如权利要求1至14中任一项所述的底物，其中，所述切口位点5’端的核酸链的长度为10nt、约15nt、约20nt或更长。

16.如权利要求1至15中任一项所述的底物，其中，所述切口位点5’端的核酸链的长度为约10nt、约5nt、约3nt或更短。

17.如权利要求16所述的底物，其中，所述切口酶识别位点5’端的核酸链的长度为4、3、2、或1nt。

18.如权利要求1至17中任一项所述的底物，包含共价链接至相反核酸链且处于所述双链内部的一对或多对荧光可检测标记物和猝光剂部分。

19.如权利要求1至17中任一项所述的底物，其中，所述第一核酸链与第二核酸链共价链接。

20.一种用于检测在反应中的切口酶和聚合酶活性的方法，包含：

a)令核酸双链与切口酶接触，所述双链包含：

i)第一核酸链，包含切口酶识别位点和共价链接在3’端的荧光可检测标记物；以及

ii)第二核酸链，具有能与所述第一链双链化的序列和位于5’端的猝光剂部分；

或

i)第一核酸链，包含切口酶识别位点和共价链接在3’端的猝光剂部分；以及

ii)第二核酸链，具有能与该第一链双链化的序列和共价链接在5’端的荧光可检测标记物；

b)令所述切口的双链与聚合酶在dNTP的存在下接触；

c)延伸所述聚合酶，从而替换共价链接至所述荧光可检测标记物或猝光剂部分的切口位点3’端的所述第一核酸链的部分；以及

d)检测来自与所述猝光剂分离的所述荧光可检测标记物的信号，从而检测所述反应中的切口酶和聚合酶活性。

21.一种用于在切口扩增反应中扩增特定产物的方法，所述方法包含：

a)令靶标核酸分子在实质等温条件下与两种或更多种引物接触，在聚合酶、dNTP、切口酶、及双链的存在下，所述引物各自特异性结合至靶标核酸分子，且所述双链包含：

或

ii)第二核酸链，具有能与所述第一链双链化的序列和共价链接在5’端的荧光可检测标记物；

b)生成包含所述靶标核酸分子的至少一部分的扩增子；

c)将所述双链切口并延伸所述聚合酶，从而替换共价链接至所述荧光可检测标记物或猝光剂部分的切口位点3’端的所述第一核酸链的部分；以及

d)检测来自与所述猝光剂分离的所述荧光可检测标记物的信号，从而检测在所述反应中的切口酶和聚合酶活性。

22.如权利要求21所述的方法，进一步包含令该核酸分子与两种或更多种引物在可检测的多核苷酸探针的存在下接触；以及

e)检测对于寡核苷酸探针杂交至所述靶标核酸分子或其扩增子为特异性的信号，而所述信号表明样品或其扩增子中所述靶标核酸分子存在的数量。

23.如权利要求21或22所述的方法，其中，将来自所述双链的信号的检测用作阳性对照。

24.如权利要求21至23中任一项所述的方法，其中，当来自所述双链的信号到达设定的相对荧光(RFU)时，表明监控所述切口扩增反应的终点。

25.如权利要求29所述的方法，其中，所述反应是在实质等温条件下实施的。

26.如权利要求20至24中任一项所述的方法，其中，所述反应进一步包含引物、探针、及/或靶标核酸分子。

27.如权利要求20至26中任一项所述的方法，其中，所述核酸链具有序列，所述序列并不结合至所述反应中存在的其它核酸分子。

28.如权利要求20至27中任一项所述的方法，其中，所述核酸双链的所述荧光可检测标记物与所述探针的荧光可检测标记物不同。

29.如权利要求20至28中任一项所述的方法，其中，所述链接至所述第一核酸链的所述荧光可检测标记物是FAM、TET、HEX、TAMRA、JOE、或ROX。

30.如权利要求20至29中任一项所述的方法，其中，链接至所述第二核酸链的所述猝光剂部分是5’IowaRQ(5IabRQ)、dabcyl、dabsyl、或Black Hole Quencher染料。

31.如权利要求20至30中任一项所述的方法，其中，所述第二核酸的3’端经C3间隔物、二脱氧核苷酸、磷酸化作用、染料、荧光团、猝光剂、间隔物、或链接物改性。

32.如权利要求20至31中任一项所述的方法，其中，所述核酸双链包含改性核苷酸。

33.如权利要求20至32中任一项所述的方法，其中，所述第一核酸链在切口位点5’端位置1或2处以及所述切口位点3’端位置1处的一个或多个核苷酸改性。

34.如权利要求20至33中任一项所述的方法，其中，所述第一核酸链在所述切口识别位点与所述切口位点之间的一个或多个核苷酸改性。

35.如权利要求20至34中任一项所述的方法，其中，所述核酸双链在所述切口酶识别位点内的一个或多个位置改性。

36.如权利要求20至35中任一项所述的方法，其中，所述一个或多个改性的核苷酸包含2’-O-甲基、2'-甲氧基乙氧基、2'-氟、2’-羟基(RNA)、2'-烯丙基、2'-O-[2-(甲胺基)-2-氧代乙基]、4'-巯基、4'-CH₂-O-2'-桥、4'-(CH₂)₂-O-2'-桥、及2'-O-(N-甲基胺基甲酸酯)、甲基化、生物素化、核苷酸加成物、或碱基类似物。

37.如权利要求20至36中任一项所述的方法，其中，所述切口酶是Nt.BstNBI、N.Bst9I、N.BstSEI、Nb.BbvCI、Nb.Bpu10I、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nt.AlwI、Nt.BbvCI、Nt.Bpu10I、Nt.BsmAI、Nt.BspD6I、Nt.BspQI、及Nt.CviPII。

38.如权利要求20至37中任一项所述的方法，其中，所述聚合酶是Bst DNA聚合酶I、BsuDNA聚合酶、Gst DNA聚合酶I、及Gka DNA聚合酶I。其它具体实施例中，例示性聚合酶包括，但不限于，BST(大片段),DNA聚合酶I(大肠杆菌),DNA聚合酶I、大(Klenow)片段、Klenow片段(3'-5'外)、T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、Deep VentR(外-)DNA聚合酶、Deep VentR DNA聚合酶、DyNAzyme、高保真DNA聚合酶、Therminator、Therminator II DNA聚合酶、AmpliTherm DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、Tfl DNA聚合酶、Tgo DNA聚合酶、SP6DNA聚合酶、Tbr DNA聚合酶、或其活性片段。

39.如权利要求20至38中任一项所述的方法，其中，所述核酸双链的长度为介于约30bp至约2kb之间、介于约100bp至约1kb之间、介于约100至约500bp之间、介于约30至约200bp之间、介于约30至约60bp之间、介于约35至约50bp之间。

40.如权利要求20至39中任一项所述的方法，其中，所述核酸链的长度为介于约30至约2000nt之间、介于约100至约1000nt之间、介于约100至约500nt之间、介于约30至约100nt之间、介于约30至约60nt之间、介于约35至约50之间。

41.如权利要求20至40中任一项所述的方法，其中，所述切口位点3’端的核酸链的长度为约25nt、约35nt、约40nt、或更长。

42.如权利要求20至41中任一项所述的方法，其中，所述切口位点5’端的核酸链的长度为10nt、约15nt、约20nt、或更长。

43.如权利要求20至42中任一项所述的方法，其中，所述切口酶识别位点5’端的所述核酸链的长度为约10nt、约5nt、约3nt、或更短。

44.如权利要求43所述的方法，其中，所述切口酶识别位点5’端的所述核酸链的长度为4、3、2、或1nt。

45.如权利要求20至44中任一项所述的方法，其中，所述第一核酸链与所述第二核酸链共价链接。

46.如权利要求20至45中任一项所述的方法，包含具有不同改性的一种或多种核酸双链的用途。

47.一种用于检测在反应中的切口酶和聚合酶活性的试剂盒，所述试剂盒包含用于切口和延伸反应的包含核酸双链的底物，所述双链包含：

a)第一核酸链，包含切口酶识别位点和共价链接在3’端的荧光可检测标记物；以及

b)第二核酸链，具有能与所述第一链双链化的序列和位于5’端的猝光剂部分；

或者

ii)第二核酸链，具有能与所述第一链双链化的序列和位于5’端的荧光可检测标记物。