CN110699482A - 一种橡树疫霉的特异性检测靶标Pr40993及其应用 - Google Patents

一种橡树疫霉的特异性检测靶标Pr40993及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种橡树疫霉(P.ramorum)的特异性检测靶标Pr40993及其应用，该检测靶标Pr40993的DNA序列如SEQ ID NO：1所示，蛋白序列如SEQ ID NO：2所示。同时，公开了特异性检测靶标Pr40993的引物及探针组合，其正向引物序列如SEQ ID NO：3所示，反向引物序列如SEQ ID NO：4所示，探针序列如SEQ ID NO：5所示。本发明发现了新的检测靶标，且基于该靶标的快速检测方法准确性高、特异性强、操作方便、实用性好、实现了恒温扩增，同时本发明设计的引物及探针组合用于RPA‑LFD检测技术，其特异性强，灵敏度高，为橡树疫霉(P.ramorum)的检测提供了新的技术平台。

Description

一种橡树疫霉的特异性检测靶标Pr40993及其应用
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，涉及一种橡树疫霉(P.ramorum)的特异性检测靶标Pr40993及其应用。
背景技术
橡树疫霉(P.ramorum)引起的橡树猝死病曾经引起美国西海岸橡树的成片猝死，其寄主广泛在加利福尼亚一些沿海地区，80％以上的栎属植物感病死亡，该病可在几周内将成材树危害致死。迄今在我国未见有该病害的报道。目前对该病害还没有有效的防治措施，加强检疫，防止病原菌的传播扩散是控制该病的最有效措施。南朝鲜、加拿大等国已禁止从美国加利福尼亚州、德国、荷兰等疫区进口各种栎属、石栎属、杜鹃花属、越桔属等的苗木、树皮、带皮原木、林地覆盖物、木屑、橡子、薪材、纸浆原材、果实等繁殖和非繁殖材料。该病原菌的研究处于起步阶段，为此应加强疫情监测，建立快速检测方法，为病害的风险及研究决策提供依据，从而有利于降低橡树疫病引起的损失。
目前橡树疫霉(P.ramorum)检测的主要方法有：发病组织病原菌的分离、PCR检测法、Real-time PCR检测法、杂交阵列技术(DNA microar ray and macro array)和环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal a mplification，LAMP)。这些诊断方法或程序繁琐、周期长，或成本高，或需要使用昂贵的仪器和试剂等。重组酶介导等温扩增(Recombinase Polymer ase Amplification，RPA)技术被公认是可以替代PCR的核酸检测技术。其原理是利用重组酶与引物结合形成蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。另外，RPA技术有多重工具酶匹配进行有效扩增，扩增效率远高于传统的PCR技术，所用时间更短，最短可在5min内实现。由于RPA技术具有扩增用时短、不需昂贵仪器、特异性好等特点，使其应用越来越广泛。RPA技术的最大特点是只需要1对引物即可在37℃左右的恒温条件下实现模板核酸的扩增，不需要通过高低温度循环实现核酸解链和退火，因此不需要昂贵的仪器设备。而且37℃的常规反应温度很容易满足，适合基层对病原菌的快速检测。
不同的靶标序列检测的特异性和灵敏度存在一定的差距，因选择的目标靶序列不同、片段大小不同，结果都会有很大差别。发掘特异性好的靶基因是目前所有检测技术的核心。靶标基因的选择要确保其在种内的不同菌株间的高度保守，而在种间变异性较高。综上所述，发掘高信赖度特异性分子检测靶标并基于新靶标建立灵敏、准确、高通量的RPA-LFD检测技术体系对提升对橡树疫霉的快速分子检测研究及其检测时所致病害早期诊断具有重要作用。目前，现有的橡树疫霉(P.ramorum)检测技术体系还不能完全满足使用需求。
发明内容
针对现有技术中橡树疫霉生物学检测方法所需周期长、检测方法特异性差、灵敏度低的问题，本发明的目的是提供一种新的橡树疫霉的检测靶标Pr40993及其靶标建立的RPA-LFD检测引物组合物。本发明另一目的是提供上述橡树疫霉菌的RPA-LFD检测方法。本发明建立的快速检测橡树疫霉的方法，通过特异性和灵敏度评价，可用于实际样品的检测，为橡树疫霉的现场检测提供一种灵敏、可靠的新方法。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
第一方面，本发明提供了橡树疫霉(P.ramorum)的特异性检测靶标Pr40993，其DNA序列如SEQ ID NO:1所示。DNA序列在基因组中的位置为scaffold_13：369292-369573(https://fungidb.org/fungidb/app/record/gene/PSURA_40993)
第二方面，本发明提供了橡树疫霉(P.ramorum)的特异性检测靶标Pr40993，其编码的蛋白序列如SEQ ID NO:2所示。
第三方面，本发明提供了检测靶标Pr40993在检测橡树疫霉(P.ramorum)中的应用。
第四方面，本发明提供了橡树疫霉(P.ramorum)的特异性检测靶标Pr40993的检测引物及探针组合，所述检测引物中，正向引物序列如SEQ ID NO：3所示，反向引物序列如SEQID NO：4所示，所述探针序列如SEQ ID NO：5所示。
第五方面，本发明提供了检测引物和探针组合在检测橡树疫霉(P.ramorum)中的应用。
第六方面，本发明提供了一种检测橡树疫霉(P.ramorum)的试剂盒，至少包括1次用量以上的所述的检测引物(SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4)和探针(SEQ ID NO:5)组合。
进一步地，所述试剂盒还包括：装有冻干酶粉的Twist Amp反应单元管、缓冲液Buffer、MgAc、去离子水、HybriDetect assay buffer、侧流层析试纸条。
第七方面，本发明提供了所述试剂盒在检测橡树疫霉(P.ramorum)中的应用。
第八方面，本发明提供了一种检测橡树疫霉(P.ramorum)的方法，包括以下步骤
1)提取待测样本DNA；
2)以DNA为模板，利用所述的引物(SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4)和探针(SEQ IDNO:5)组合或所述的检测橡树疫霉(P.ramorum)的试剂盒进行RPA扩增；
其中，所述RPA扩增：向装有冻干酶粉的0.2mL Twist Amp反应单元管(Twist Ampnfo kits，Twist)中加入缓冲液Buffer 29.5μL，10μM的上游引物(SEQ ID NO:3)2.1μL，10μM的下游引物(SEQ ID NO:4)2.1μL，探针(SEQ ID NO:5)0.6μL，DNA 2.0μL，MgAc 2.5μL加在PCR管盖内部，去离子水补足至50μL；将RPA扩增体系充分混匀，5,000×g离心10s，置于39℃金属浴上反应30min，温育4分钟，将反应管再次混匀，离心3-5s，放入水浴锅39℃继续反应30min。
3)应用侧流层析试纸条进行RPA扩增产物检测；
取RPA反应产物10μL加入190μL的HybriDetect assay buffer(MileniaBiotec,Giessen,Germany)进行稀释，稀释后取10μL滴在试纸条的HybriDetect 1strip。另一端试纸条垂直插入100μL的HybriDetect assay buffer中，室温放置5min。
当试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有橡树疫霉(P.ramorum)；当试纸条只有质控区出现一条棕色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有橡树疫霉(P.ramorum)。
Pr40993序列来源于Fungi DB网站https://fungidb.org/fungidb/(区域:PramPr-102_SC0013：369292-369573(+))；与常规PCR反应不同，RPA反应所需引物的长度通常为30-35bp，探针序列的长度为46-52bp，引物设计时为了避免形成引物内部及之间的二级结构，其长度的增加也使引物设计及选择难度的增加，因此，引物的设计和选择对RPA的结果至关重要。RPA技术正处于起步研究阶段，尚无专门的引物、探针设计软件，也没有大量的数据为其引物设计原则提供依据。因此，本发明的引物和探针组合是需要从靶标序列两端设计多对引物进行优化、筛选才能得到。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优势：
1)本发明提供了一个新的高信赖度特异性分子检测靶标Pr40993并基于新靶标建立灵敏、准确、高通量的RPA-LFD检测技术体系，对提升对疫霉属的快速分子检测研究及其检测时所致病害早期诊断具有重要作用。
2)操作方便：本发明提供的检测橡树疫霉的RPA-LFD方法克服了现有技术中橡树疫霉的生物学检测方法所需周期长、费时费力、繁琐、特异性差的问题及PCR检测技术需要热循环仪器，无法快速检测橡树疫霉的问题。本发明检测方法在等温条件下，能快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到橡树疫霉，不需要复杂仪器，能较好满足对橡树疫霉的现场检测。
3)本发明的方法与常规PCR相比，检测速度快，不必经过变性、退火、延伸三个步骤，RPA反应的最适温度在25℃-40℃之间，无需变性，在常温下20min左右即可完成反应。这样就实现了恒温扩增，不像PCR法必须要热循环，这样就摆脱了对热循环仪器的依赖，只要有稳定的热源RPA反应就可以发生，极大的扩展了RPA使用的范围，可以真正实现便携式的现场快速核酸检测。PCR反应时间需要1个半小时，而RPA仅需要反应15分钟，大大缩短了检测时间。而且RPA比PCR有更高的特异性与灵敏度，是普通PCR的10倍。
4)本发明可以用于带菌植株组织中橡树疫霉(P.ramorum)的快速检测，只需约0.5h即可完成检测过程，是一种检测橡树疫霉的有效手段。本发明为橡树疫霉的检测提供了新的检测靶标的发掘方法和技术平台，可用于橡树疫霉的高灵敏度快速检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1基于橡树疫霉(P.ramorum)新检测靶标Pr40993的RPA-LFD侧流层析试纸条特异性检测结果图；图中，1，2：橡树疫霉(Phytophthora r amorum)；3：雪松疫霉(P.lateralis)；4：丁香疫霉(P.syringae)；5：冬生疫霉(P.hibernalis)；6：瓜类疫霉(P.melonis)；7：致病疫霉(P.infestans)；8：恶疫霉(P.cactorum)；9：阴性对照。试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区内(Control line)，一条位于检测区(Test lin e)，则结果为阳性，表明样本中含有橡树疫霉(P.ramorum)；当试纸条只有质控区出现一条棕色条带，检测区(Test line)没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有橡树疫霉(P.ramorum)；图中显示第1条和第2条都显示2条带，其中一条带为质控线(Control line)，一条线为检测线，因此呈阳性，表明样本中含有橡树疫霉(P.ramorum)；其余只有一条质控线(Control line)的条带呈阴性。
图2是基于橡树疫霉(P.ramorum)新检测靶标Pr40993的RPA-LFD的侧流层析试纸条在属间的特异性检测结果图检测结果图；1，2：橡树疫霉(Phytophthora ramorum)；3：终极腐霉(Pythium ultimum)；4：木贼镰孢菌(Fusarium equiseti)；5：平头炭疽菌(Colletotrichum truncatum)；6：大丽轮枝菌(Verticiliumdahliae)；7：立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)；8：稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)；9：阴性对照；试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区内(Control line)，一条位于检测区(Test line)，则结果为阳性，表明样本中含有橡树疫霉(P.ramorum)；当试纸条只有质控区出现一条棕色条带，检测区(Test line)没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有橡树疫霉(P.ramorum)；图中显示第1条和第2条都显示2条带，其中一条带为质控线(Control line)，一条线为检测线，因此呈阳性，表明样本中含有橡树疫霉(P.ramorum)；其余只有一条质控线(Control line)的条带呈阴性。可见，以实施例1设计的引物进行RPA扩增反应后，LFD侧流层析试纸条检测结果显示2条棕色条带(图2)，目标条带清析，能有效检测出橡树疫霉(P.ramorum)。而其它真菌和卵菌只有在质控区出现一条棕色条带，阴性对照也只有在质控区出现一条棕色条带。
图3是基于橡树疫霉新检测靶标Pr40993的RPA-LFD侧流层析试纸条检测橡树疫霉(P.ramorum)的灵敏度试验结果图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
实施例1
通过全基因组序列比对获得了1000多个橡树疫霉(P.ramorum)特异性基因，并从中发掘出高信赖度特异性分子检测靶标Pr40993(DNA序列在基因组中的位置为scaffold_13：369292-369573)，其DNA序列如SEQ ID NO：1所示，其蛋白序列如SEQ ID NO：2所示。
并基于该新靶标建立灵敏、准确的RPA-LFD检测技术体系。
该RPA-LFD检测技术体系所使用的RPA-LFD检测引物组合物：由正向引物PraRPA-F(SEQ ID NO：3)、反向引物PraRPA-R(SEQ ID NO:4)和探针PraRPA-P(SEQ ID NO：5)组成；各引物及探针序列具体如下：
PraRPA-F：5'-CTGGCATTGCCACCGTAGCTGCCAGTGCCCGACGT-3'(SEQ ID NO：3)；
PraRPA-R：5'-GCGGATCGGGCAGTGGCAGCACCGTGCAGTCGACT-3'(SEQ ID NO：4)；
PraRPA-P：5'-FAM-ACTGCACGGTGCTGCCACTGCCCGATCCGC-THF-CGTCTTGCCGCCCGT-C3spacer-3'；(SEQ ID NO：5)。
采用该引物组合物检测橡树疫霉(P.ramorum)的方法：提取待检微生物的DNA，以提取的DNA为模板，利用所述的RPA-LFD引物组合物进行RPA-LFD；
样品检测：向装有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp反应单元管(Twist Amp Basickits，Twist)中加入缓冲液Buffer 29.5μL，10μM的上游引物2.1μL，10μM的下游引物2.1μL，探针0.6μL，DNA 2.0μL，MgAc 2.5μL加在PCR管盖内部，去离子水补足至50μL；将RPA扩增体系充分混匀，5,000×g离心10s，置于39℃金属浴上反应30min，温育4分钟，将反应管再次混匀，离心3-5s，放入水浴锅39℃继续反应30min。其中，所述RPA引物长度一般为30至35个核苷酸。引物过短会严重影响重组酶的活性，长引物并不一定能提高扩增性能，反而会增加形成二级结构的可能性，增大来自引物的噪音。此外，引物设计时应尽量避免容易形成二级结构、引物-引物互作、发夹结构的序列，减少引物二聚体的形成。扩增产物大小不超过500bp。
阴性对照：操作步骤同样品检测，将2.0μL模板DNA改为加入2.0μL灭菌ddH2O。RPA反应结束后，应用侧流层析试纸条进行扩增产物检测。当试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区内(Control line)，一条位于检测区(Test line)，则结果为阳性，表明样本中含有橡树疫霉(P.ram orum)；当试纸条只有质控区出现一条棕色条带，检测区(Test line)没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有橡树疫霉(P.ramorum)。
实施例2
为了验证RPA侧流层析试纸条检测方法的特异性，以橡树疫霉(P.ra morum)菌株和其它疫霉以及病原菌为供试材料(表1)，RPA侧流层析试纸条检测方法的结果显示橡树疫霉(P.ramorum)的试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区内(Control line)，一条位于检测区(Test line)，则结果为阳性，其它镰孢菌以及病原菌的试纸条只有质控区出现一条棕色条带，检测区(Test line)没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有橡树疫霉(P.ramorum)。
选择与橡树疫霉(P.ramorum)不同种(雪松疫霉；丁香疫霉；冬生疫霉；瓜类疫霉；致病疫霉；恶疫霉等)和不同属的菌(终极腐霉；木贼镰孢菌；平头炭疽菌；大丽轮枝菌；大丽轮枝菌；立枯丝核菌；稻瘟病菌等)的DNA作为模板，进行RPA-LFD(侧流层析试纸条检测)。
表1用于检测LAMP反应特异性的真菌和卵菌菌株及扩增结果
Figure BDA0002290056420000101
注：B.Tyler表示Brett Tyler教授；NFU表示南京林业大学；+表示发生了LAMP扩增；-表示无扩增；*No of isolates表示菌株的数量；aLoop-mediated amplification表示LAMP扩增
按照实施例1-2的方法进行检测，检测结果如图1和图2所示。
图1是基于高信赖度特异性分子检测靶标Pr40993的RPA-LFD检测技术在特异性检测结果图，1，2：橡树疫霉(P.ramorum)；3：雪松疫霉(P.lateralis)；4：丁香疫霉(P.syringae)；5：冬生疫霉(P.hibernalis)；6：瓜类疫霉(P.melonis)；7：致病疫霉(P.infestans)；8：恶疫霉(P.cactorum)；9：阴性对照；图中显示第1条和第2条都显示2条带，其中一条带为质控线(Control line)，一条线为检测线，因此呈阳性，表明样本中含有橡树疫霉(P.ramorum)；其余只有一条质控线(Control line)的条带呈阴性。
图2是基于高信赖度特异性分子检测靶标Pr40993的RPA-LFD侧流层析试纸条在属间的特异性检测结果图检测结果图；1，2：橡树疫霉(Phyto phthora ramorum)；3：终极腐霉(Pythium ultimum)；4：木贼镰孢菌(F usarium equiseti)；5：平头炭疽菌(Colletotrichum truncatum)；6：大丽轮枝菌(Verticiliumdahliae)；7：立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)；8：稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)；9：阴性对照；图中显示第1条和第2条都显示2条带，其中一条带为质控线(Control line)，一条线为检测线，因此呈阳性，表明样本中含有橡树疫霉(P.ramorum)；其余只有一条质控线(Control line)的条带呈阴性。
可见，以实施例1设计的引物及探针进行RPA扩增反应后，LFD侧流层析试纸条检测结果显示2条棕色条带(图1，图2)，目标条带清晰，其中，图1的检测条带显示本发明的检测引物和探针能够在不同的疫霉种之间有效检测出橡树疫霉，而其它疫霉菌只有在质控区出现一条棕色条带，阴性对照也只有在质控区出现一条棕色条带；其中，图2的检测条带显示本发明的检测引物和探针能够在不同的属之间有效检测橡树疫霉，而其它真菌和卵菌只有在质控区出现一条棕色条带，阴性对照也只有在质控区出现一条棕色条带。综上，本发明的检测引物和探针能够实现橡树疫霉的特异性检测。
实施例3
使用Nanodro 2000微量分光光度计测出实施例1提取DNA的浓度为100ng·μL-1。将其依次稀释为100pg·μL-1、10pg·μL-1、1pg·μL-1、100fg·μL-1、10fg·μL-1、1fg·μL-1，根据实施例1-2采用的引物、反应体系和反应条件，对不同浓度的DNA进行RPA-LFD检测。
结果如图3所示，25μL的反应体系中分别含有100ng·μL-1、10ng·μL-1、1ng·μL-1、100pg·μL-1、10pg·μL-1橡树疫霉(P.ramorum)DNA的试纸条出现两条棕色条带，呈阳性反应，25μL的反应体系中分别含有1pg·μL-1、100fg·μL-1、10fg·μL-1橡树疫霉(P.ramorum)DNA的纸条出现一条棕色条带，呈阴性反应；显色结果表明RPA-侧流层析试纸条技术的灵敏度达到10pg·μL-1(图3)；RPA检测时间仅需20min，且不需要PCR仪等昂贵的仪器设备，操作程序简便，更有利在生产中推广应用。
除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京林业大学
<120> 一种橡树疫霉的特异性检测靶标Pr40993及其应用
<130> 2019
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 282
<212> DNA
<213> 橡树疫霉（P.ramorum）
<400> 1
tgctgccagt gcccgatccg cccgtcttgc cgcccgtctt gctaccattg gagccactgg 60
cattgccacc gtagctgcca gtgcccgacg tcgtggtcgg cgcgggagtc gactgcacgg 120
tgctgccact gcccgatccg cccgtcttgc cgcccgtctt gctaccattg gagccactgg 180
cattgccacc gtagctgcca gtgcccgacg tcgtggtcgg cgcgggagtc gactgcacgg 240
tgctgccact gcccgatccg cccgtcttgc cgcccgtctt gc 282
<210> 2
<211> 94
<212> PRT
<213> 橡树疫霉（P.ramorum)
<400> 2
Cys Cys Gln Cys Pro Ile Arg Pro Ser Cys Arg Pro Ser Cys Tyr His
1 5 10 15
Trp Ser His Trp His Cys His Arg Ser Cys Gln Cys Pro Thr Ser Trp
20 25 30
Ser Ala Arg Glu Ser Thr Ala Arg Cys Cys His Cys Pro Ile Arg Pro
35 40 45
Ser Cys Arg Pro Ser Cys Tyr His Trp Ser His Trp His Cys His Arg
50 55 60
Ser Cys Gln Cys Pro Thr Ser Trp Ser Ala Arg Glu Ser Thr Ala Arg
65 70 75 80
Cys Cys His Cys Pro Ile Arg Pro Ser Cys Arg Pro Ser Cys
85 90
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence)
<400> 3
ctggcattgc caccgtagct gccagtgccc gacgt 35
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence)
<400> 4
gcggatcggg cagtggcagc accgtgcagt cgact 35
<210> 5
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> FAM修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> THF修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (45)..(45)
<223> C3spacer修饰
<400> 5
actgcacggt gctgccactg cccgatccgc cgtcttgccg cccgt 45

Claims (9)

1.橡树疫霉(P.ramorum)的特异性检测靶标Pr40993，其特征在于，其DNA序列如SEQ IDNO:1所示。
2.橡树疫霉(P.ramorum)的特异性检测靶标Pr40993，其特征在于，其编码的蛋白序列如SEQ ID NO:2所示。
3.权利要求1或2所述的检测靶标Pr40993在检测橡树疫霉(P.ramorum)中的应用。
4.权利要求1所述的橡树疫霉(P.ramorum)的特异性检测靶标Pr40993的检测引物及探针组合，其特征在于，所述检测引物中，正向引物序列如SEQ ID NO：3所示，反向引物序列如SEQ ID NO：4所示，所述探针序列如SEQ ID NO：5所示。
5.权利要求4所述的检测引物和探针组合在检测橡树疫霉(P.ramorum)中的应用。
6.一种检测橡树疫霉(P.ramorum)的试剂盒，其特征在于，至少包括1次用量以上的权利要求4所述的检测引物和探针组合。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：装有冻干酶粉的Twist Amp反应单元管、缓冲液Buffer、MgAc、去离子水、HybriDetect assay buffer、侧流层析试纸条。
8.权利要求7所述的试剂盒在检测橡树疫霉(P.ramorum)中的应用。
9.一种检测橡树疫霉(P.ramorum)的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取待测样本DNA；
2)以DNA为模板，利用权利要求4所述的引物和探针组合或权利要求6所述的检测橡树疫霉(P.ramorum)的试剂盒进行RPA扩增；
3)应用侧流层析试纸条进行RPA扩增产物检测；当试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有橡树疫霉(P.ramorum)；当试纸条只有质控区出现一条棕色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有橡树疫霉(P.ramorum)。
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