JP2012523219A - イネのジンクフィンガータンパク質転写因子dstならびに渇水および塩の耐性を調節するためのその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)配列番号2のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(b)1つもしくは複数のアミノ酸残基の置換、欠失、もしくは挿入を有し、かつ、植物における渇水および塩の感受性を増加させることができる、(a)に由来するポリペプチド、または
(c)Cys−2/His−2型ジンクフィンガー構造的ドメインを有しており、植物における渇水および塩の感受性を増加させることができる、(a)もしくは(b)のポリペプチドのポリペプチド相同体
の群から選択される。
(a)配列番号1の配列を含むヌクレオチド配列、
(b)配列番号1中のヌクレオチド1〜435を含むヌクレオチド配列、または
(c)(a)〜(b)のヌクレオチド配列のうちの一方に相補的なポリヌクレオチド配列
から選択されるものである。
(i)候補植物における、本発明のジンクフィンガータンパク質転写因子のレベル、本発明のポリヌクレオチドの発現レベル、および/または本発明のシス作用性要素と本発明のジンクフィンガータンパク質転写因子との結合レベルを検出するステップと、
(ii)ステップ(i)で検出された候補植物におけるレベルを、対照植物におけるレベルと比較し、候補植物におけるレベルが対照植物におけるそれよりも低い場合は、前記候補植物が渇水および塩に耐性の植物であるステップと
が含まれる、渇水および塩の耐性を有する植物をスクリーニングする方法を提供する。
(a)本発明の宿主細胞を発現に適した条件下で培養するステップと、
(b)ジンクフィンガータンパク質転写因子を培養培地から単離するステップと
が含まれることを特徴とする、ジンクフィンガータンパク質転写因子を調製する方法を提供する。
(i)上述の阻害剤(拮抗剤)を植物に直接施用すること、
(ii)上述の非保存的な突然変異配列を植物内に導入すること、または
(iii)非保存的な突然変異配列に特異的な分子マーカーを設計し、前記分子マーカーを用いて、非保存的な突然変異配列を有する突然変異植物を別のイネ種と交雑させることで導いた子孫をスクリーニングし、非保存的な突然変異配列を含有する個々の子孫を選択すること
が含まれる。
(1)植物細胞、植物組織または植物器官を、本発明のジンクフィンガータンパク質転写因子の非保存的な突然変異配列を含有する構築体または本発明のポリヌクレオチドの非保存的な突然変異配列を含有する構築体で形質移入するステップと;
(2)非保存的な突然変異配列を含有する植物細胞、植物組織、または植物器官を選択するステップと、
(3)植物をステップ(2)で得られた植物細胞、植物組織または植物器官から再生するステップと
が含まれ、得られたトランスジェニック植物が非トランスジェニック植物よりも高い渇水および塩の耐性を有する、トランスジェニック植物を調製する方法を提供する。
本発明では、用語「DSTタンパク質またはポリペプチド」、「DST遺伝子にコードされるタンパク質またはポリペプチド」、または「ジンクフィンガータンパク質転写因子」とは、本発明のDST遺伝子によってコードされているタンパク質またはポリペプチドをいう。これらの定義には、保存的な突然変異を有する上述のタンパク質またはポリペプチドの突然変異体、またはその相同ポリペプチドが含まれる。これらはすべてCys−2/His−2型ジンクフィンガー構造的ドメインを有しており、前記タンパク質またはポリペプチドの発現を阻害した場合に、植物における渇水または塩のストレスに対する耐性を増加させることができる。
本説明中で使用する前記「植物」には、(それだけには限定されないが)イネ科、アオイ科ワタ属植物、アブラナ科アブラナ属、キク科、ナス科、シソ科植物またはセリ科などが含まれる。好ましくは、前記植物はイネ科植物、より好ましくはイネ科作物である。たとえば、前記植物は、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、サトウキビ、ソルガム、シロイヌナズナ属、綿またはアブラナ、より好ましくはイネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、サトウキビまたはソルガムから選択され得る。
また、本発明は、DST遺伝子を含有するベクター、および遺伝子工学によって作製した前記ベクターを含有する宿主細胞、および遺伝子形質移入によって作製し、高レベルのDSTを発現するトランスジェニック植物にも関する。
(1)適切な宿主細胞を、本発明のDSTタンパク質をコードしているポリヌクレオチド(もしくは突然変異体)、または前記ポリヌクレオチドを含有する組換え発現ベクターで形質移入または形質転換させるステップと、
(2)宿主細胞を適切な培養培地中で培養するステップと、
(3)タンパク質またはポリペプチドを培養培地または細胞から単離および精製するステップと
が含まれる。
本説明中で使用する用語「シス作用性要素」とは、遺伝子の隣接領域に位置し、遺伝子発現に影響を与えることができる配列をいう。その機能は、遺伝子発現の調節に関与することである。シス作用性要素自体はどのようなタンパク質もコードしておらず、これは作用部位を提供するのみである。これは、トランス作用性因子と相互作用することでその機能がもたらされる。
本説明中に記載のように、本発明のDSTタンパク質、そのコード配列またはDSTタンパク質とシス作用性要素との結合は、植物における渇水および塩の耐性と密な関係性を有する。DSTタンパク質、そのコード配列またはDSTタンパク質とシス作用性要素との結合を阻害することは、植物において増強された渇水および塩の耐性をもたらすであろう。
本発明のDST遺伝子およびそのコードされているタンパク質の独特の特性によれば、本発明には、渇水および塩に耐性の植物をスクリーニングする方法がさらに含まれる。
本発明の主な利点には、
(1)DST遺伝子およびそのコードされているタンパク質またはポリペプチドを同定し、植物における渇水および塩の耐性とのその関係性を確認し、それにより、植物における渇水および塩の耐性を研究するための新しい方法を提供すること、
(2)増強された塩または渇水のストレス耐性を有するトランスジェニック植物を提供し、それにより、穀物、綿および油を生産および加工するための優れた原材料および生成物を提供すること、ならびに
(3)慣用の交雑方法を用いて、遺伝子移入を必要とせずに実現することができる、分子マーカーを用いて渇水および塩に耐性の子孫をスクリーニングする方法を提供し、それにより、遺伝子移入の安全性の懸念が回避されること
が含まれる。
イネDST遺伝子移入実験
1.高い渇水および塩の耐性を有するDST突然変異体の作製、その特徴および細胞内局在化
イネ種子を0.6%のEMS(エチルメタンスルホン酸)で処理して、約9,000個のイネ突然変異体系を含有するイネ突然変異体ライブラリを構築する。140mMの塩化ナトリウムの塩ストレス下で、イネ突然変異体ライブラリの大スケールスクリーニングを実施した。候補突然変異体を140mMの塩化ナトリウムの塩ストレスおよび20%のPEG4000の模擬渇水ストレスに繰り返し供することによって、塩および渇水の耐性の表現型を確認した。高度に渇水および塩に耐性の突然変異体(dst)が得られる。
野生型イネBACクローンをApaLI制限酵素で消化し、次いでT4 DNAポリメラーゼで平滑末端を生じさせ、その後、これをSalI制限酵素で消化する。したがって、4.6kbの野生型ゲノム断片(DST、プロモーター領域、およびストップコドンと共に下流領域を有する完全長ORFを含有する)が回収される。植物発現バイナリーベクターpCAMBIA1301(CAMBIAから購入)をEcoRIで消化し、次いでT4 DNAポリメラーゼで平滑末端を生じさせ、その後、これをSalIで消化し、その後、上述の回収した断片とライゲーションさせて、p−DSTプラスミドの構築を成功させ、これを突然変異体の形質転換および相補性実験の実施に使用する。すべての酵素はNew England Biolabsから購入する。
5’および3’末端のオリゴヌクレオチドをプライマー(配列番号4および5)として使用して、独特のコード領域(535bp)を有するDST断片をPCRによって増幅する。この断片をp1300RNAiベクター(カタラーゼイントロンをリンカーとして挿入し、両末端をポリAおよびポリTによって隣接させることで、pCAMBIA1300を改変することによって得られる)とライゲーションさせて、DST−RNAiプラスミドを構築する。
上述の2つの組換えプラスミドを、凍結溶融方法を用いてアグロバクテリウム属株EHA105内に移す。0.5〜1μg(約10μl)のプラスミドDNAをそれぞれ200μlのEHA105コンピテント細胞に加え、混合し、その後、氷上、液体窒素中および37℃の水浴中に次々、それぞれ5分間ずつ入れる。反応混合物を新鮮なYEB液体培養培地で1mlまで希釈し、その後、振盪しながら28℃で2〜4時間インキュベーションする。200μlのアリコートをとり、カナマイシン(Kan)抗生物質(50μg/ml)を含有するYEBプレート上に薄く塗る。プレートを28℃で2〜3日間インキュベーションする。得られたコロニーを、Kan(50μg/ml)を含有するYEBプレート上に3回画線して、単一コロニーを選択する。
トランスジェニック植物の栽培ならびに渇水および塩のストレスの試験
実施例1で得られたトランスジェニックイネの種子をとり、45℃のオーブン中で1週間インキュベーションして、休眠状態を中断させる。その後、これらを水道水に室温で3日間浸し、刺激して37℃で2日間発芽させる。発芽後、これらを96ウェルプレート中にスポット播種する。その後、これらを光インキュベーターに移し、30℃でインキュベーションし、1日13時間露光させた。1日後、温度を28℃および26℃まで徐々に下げ、これらをそれぞれ1日間インキュベーションし、20℃で夜に培養する。実生がすべて成長した後、水道水をイネ培養培地に置き換え、培養を続ける。
DST転写活性化の活性の分析
Matchmaker GAL4酵母二重ハイブリッド系3(Clontech)を用いてDST転写活性化を分析する。陽性対照ベクターpADを構築するために、NLSおよびGAL4活性化ドメイン(AD)配列をPCRによって増幅し、pGBKT7(Clontechから購入)のBamHI/SalI切断部位内に挿入して(プライマーは配列番号6および7である)、pGBKT7中のGAL4 DNA結合ドメイン(BD)と融合させる。
5’−AAAGGATCCAAGCGGAATTAATTCCCGAG−3’(配列番号6)、
5’−AAAGTCGACCCTCTTTTTTTGGGTTTGGTGG−3’(配列番号7)、
5’−AAAGGATCCTGATGGACTCCCCGTCGCCT−3’(配列番号8)、
5’−AAAGTCGACCGAGGCTCAAGTTGAGGTCGAG−3’(配列番号9)
である。
DSTタンパク質の分析および電気泳動移動度シフトアッセイ
1.原核タンパク質発現:
pGBKT7−DSTベクターをEcoRIおよびSalIで消化してDST完全長cDNAを得て、その後、これをpET32a(+)内に再構築する。組換えDSTを含有する原核発現ベクターpET32a(+)をBL21内に形質移入し、IPTGを用いて原核発現を誘導し、その後、Hisタグカラム(ビーズ)を用いてタンパク質を精製する。
慣用の方法を用いてウサギを上述の精製したタンパク質で免疫化して、抗DST抗体を産生させる。
様々な植物におけるDST遺伝子相同体の存在
データベース検索(http://plantta.jcvi.org/index.shtml)により、ソルガム(モロコシ(Sorghum bicolor))ゲノムにおける1個のDST遺伝子相同体(54.3%のタンパク質類似度)、トウモロコシ(Zea mays)ゲノムにおける3個の遺伝子相同体(51.7%、36.1%、および33.5%のタンパク質類似度)、オオムギ(Hordeum vulgare)ゲノムにおける1個のDST遺伝子相同体(38.4%のタンパク質類似度)、サトウキビ(Saccharum officinarum)ゲノムにおける3個の遺伝子相同体(38.2%、38.2%および34.5%のタンパク質類似度)が明らかとなる。
イネおよび他の作物のDST遺伝子分子マーカーの応用−作物における耐性を改善させるための、作物育種における補助的選択技法
化学的突然変異誘発(EMS)によって、DST遺伝子中の2つのヌクレオチド突然変異を生じさせ(ヌクレオチド205でAがGに突然変異しており、ヌクレオチド484でGがAに突然変異している)、2つのアミノ酸置換を生じさせ(位置69でアスパラギンがアスパラギン酸に突然変異しており、位置162でアラニンがスレオニンに突然変異している)、それにより、渇水耐性および塩耐性の表現型がもたらされる。増幅産物に第1の点突然変異および第2の点突然変異がそれぞれ含まれるように、以下の2つのプライマー対、SNP5およびSNP3を前記遺伝子中で設計する。
SNP−5S:ATGGACTCCCCGTCGCCT(配列番号10)
SNP−5A:GTGCGCCGGGAGAAGCCC(配列番号11)
SNP−3S:GCGGTGCCGACGTCGTTCCC(配列番号12)
SNP−3A:GCCGCCGTCGTCGTCGTCTTC(配列番号13)
Claims (14)
- 配列番号2のアミノ酸42〜85の配列を含むポリペプチド、その保存的な突然変異ポリペプチド、または、そのポリペプチド相同体を含むことを特徴とする、ジンクフィンガータンパク質転写因子。
- 前記ポリペプチドが、
(a)配列番号2のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(b)1つもしくは複数のアミノ酸残基が置換、欠失、もしくは挿入されており、植物における渇水および塩に対する感受性を増加させることができる、(a)に由来するポリペプチド、または
(c)Cys−2/His−2型ジンクフィンガー構造的ドメインを含み、植物における渇水および塩に対する感受性を増加させることができる、(a)〜(b)のポリペプチドのポリペプチド相同体
から選択されることを特徴とする請求項1に記載の転写因子。 - 請求項1に記載のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドの配列が、
(a)配列番号1の配列を含む配列、
(b)配列番号1の1〜435の配列を含む配列、または
(c)(a)〜(b)の配列のうちのいずれか一方に相補的な配列
から選択されることを特徴とする、請求項3に記載のポリヌクレオチド。 - 請求項3に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とするベクター。
- 請求項5に記載のベクターまたはその中に請求項3に記載のポリヌクレオチドが組み込まれているゲノムを含むことを特徴とする、遺伝子操作した宿主細胞。
- 配列番号3の配列を含み、かつ、請求項1に記載の転写因子と結合することができるシス作用性要素。
- 請求項1に記載のジンクフィンガータンパク質転写因子または請求項3に記載のポリヌクレオチドの、阻害剤または非保存的な突然変異配列。
- 植物における渇水および塩の耐性を改善させる方法であって、前記方法は、
請求項1に記載のジンクフィンガータンパク質転写因子を阻害すること、
請求項3に記載のポリヌクレオチドの発現を阻害すること、または
請求項7に記載のシス作用性要素と請求項1に記載のジンクフィンガータンパク質転写因子との間の結合を阻害すること
を含み、
前記方法は、好ましくは、前記植物において請求項8に記載の阻害剤を使用すること、または、請求項8に記載の非保存的な突然変異配列を生じさせることを含み、より好ましくは、配列番号1のヌクレオチド配列もしくは配列番号2のアミノ酸配列中に非保存的な突然変異を導入すること、または、前記ヌクレオチド配列もしくは前記アミノ酸配列の阻害剤を使用することを含み、より好ましくは、配列番号1のヌクレオチド配列中において、ヌクレオチド205のAからGへの突然変異、および、484位のGからAへの突然変異を導入すること、または、配列番号2のアミノ酸配列中において、アミノ酸69のアスパラギンからアスパラギン酸への突然変異、および、アミノ酸162のアラニンからスレオニンへの突然変異を導入することを含む、方法。 - 渇水および塩に耐性の植物を選択する方法であって、
(i)候補植物における、請求項1に記載のジンクフィンガータンパク質転写因子のレベル、請求項3に記載のポリヌクレオチドの発現レベル、および/または、請求項7に記載のシス作用性要素と請求項1に記載のジンクフィンガータンパク質転写因子との間の結合のレベルを決定するステップと、
(ii)ステップ(i)で決定された、候補植物におけるレベルを対照植物における対応するレベルと比較するステップであって、候補植物におけるレベルが対照植物におけるレベルのそれよりも低い場合は、候補植物が渇水および塩に耐性の植物である、ステップと
を含む、方法。 - 植物における渇水および塩の耐性を改善させることにおける、請求項1に記載のジンクフィンガータンパク質転写因子または請求項3に記載のヌクレオチド配列の、阻害剤または非保存的な突然変異配列の使用であって、
前記阻害剤が、好ましくは、前記転写因子または前記ヌクレオチド配列を標的とする、低分子干渉RNA、抗体、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、使用。 - 請求項11に記載の使用であって、
前記植物における渇水および塩の耐性を改善させることが、
(i)前記植物を前記阻害剤と直接接触させること、
(ii)前記非保存的な突然変異配列を前記植物内に導入すること、または
(iii)前記非保存的な突然変異配列に特異的な分子マーカーを設計し、、前記非保存的な突然変異配列を含有する突然変異体とイネ変異体との間のハイブリダイゼーションの子孫から、前記非保存的な突然変異配列を含有する個々の植物を選択するために、前記分子マーカーを使用すること
を含むことを特徴とし、
前記分子マーカーが、配列番号10および配列番号11のプライマー対、ならびに/または配列番号12および配列番号13のプライマー対を含む、使用。 - 植物における渇水および塩の耐性を改善させる方法であって、前記方法は、
(A)請求項1に記載のジンクフィンガータンパク質転写因子または請求項3に記載のヌクレオチド配列の、阻害剤または非保存的な突然変異配列を提供するステップと、
(B)(i)前記植物を阻害剤と直接接触させること、
(ii)前記非保存的な突然変異配列を前記植物内に導入すること、または
(iii)前記非保存的な突然変異配列に特異的な分子マーカーを設計し、前記分子マーカーを用いて、前記非保存的な突然変異配列を含有する突然変異体とイネ変異体との間のハイブリダイゼーションの子孫から、前記非保存的な突然変異配列を含有する個々の植物を選択すること
から選択される1つまたは複数の処理に前記植物を供するステップと
を含み、
前記分子マーカーが、配列番号10および配列番号11のプライマー対、ならびに/または、配列番号12および配列番号13のプライマー対を含む、方法。 - トランスジェニック植物を生成する方法であって、前記方法は、
(1)植物細胞、植物組織、または、植物器官を、請求項1に記載のジンクフィンガータンパク質転写因子の非保存的な突然変異配列または請求項3に記載のポリヌクレオチドの非保存的な突然変異配列を含有する構築物で形質転換させるステップと、
(2)前記非保存的な突然変異配列によって形質転換させた植物細胞、植物組織または植物器官を選択するステップと、
(3)ステップ(2)からの前記植物細胞、前記植物組織、または、前記植物器官から植物を再生させるステップと、
を含むことを特徴とし、
再生した植物が形質転換していない植物よりも高い渇水および塩の耐性を有する、方法。
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