CN1322125C - 水稻锌指蛋白基因OsZFP18的基因工程应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了首个水稻C2H2型锌指蛋白基因OsZFP18的基因工程应用方法。OsZFP18的cDNA序列SEQ ID NO.1及编码的氨基酸序列SEQ ID NO.2。本发明基因为水稻中首次报道的C2H2型锌指蛋白基因。OsZFP18参与水稻的穗发育以及盐胁迫应答，mRNA表达分析表明该基因受高盐的诱导。转基因实验证明该基因的超量表达提高了水稻的耐盐性。OsZFP18可作为目的基因导入植物，提高植物耐盐性。

Description

水稻锌指蛋白基因OsZFP18的基因工程应用

技术领域

本发明涉及一种水稻锌指蛋白基因OsZFP18的基因工程应用，属于基因工程领域，具体地讲涉及植物盐胁迫应答的锌指转录因子。

技术背景

C2H2型锌指蛋白广泛地存在于各种植物中，参与植物的生长发育与环境胁迫应答(黄骥等，2004)。在矮牵牛和拟南芥中已经先后克隆了近30个C2H2型锌指蛋白基因，研究结果表明其主要参与了植物在生殖生长阶段的发育过程，或参与高盐、低温、干旱等非生物胁迫反应。大豆此类锌指蛋白SCOF-1的研究表明，在拟南芥和烟草中过量表达SCOF-1显著增强了冷诱导蛋白基因的表达，从而提高了植物的耐冷性(Kim et al，2001)。最近的研究表明拟南芥C2H2型锌指蛋白可能通过抑制植物的生长和光合作用而节约能量用于抵御各类胁迫。因此植物C2H2型锌指蛋白对于改良植物对非生物胁迫的抗性具有重要的应用价值。

虽然小麦中首先报道了单子叶植物C2H2型锌指蛋白WZF1，但是尚未发现WZF1与胁迫应答的关系。水稻是重要的粮食作物以及单子叶植物的模式植物，迄今为止尚无关于水稻C2H2型锌指蛋白基因的功能描述。本发明从水稻中鉴定了单子叶植物第1个与非生物胁迫有关的C2H2型锌指蛋白OsZFP18，并研究了其与盐胁迫的关系，提出了利用OsZFP18基因进行水稻耐盐性遗传改良的方法。

发明内容

技术问题

本发明的目的在于公开一种单子叶植物C2H2型锌指蛋白基因的基因工程应用，该基因可作为目的基因导入植物，提高植物耐盐性，以进行植物品种改良。

技术方案  水稻锌指蛋白基因OsZFP18的基因工程应用，包括：

1)总RNA的提取

选用水稻品种“韭菜青”，待水稻幼苗长至3叶期后，用140mM NaCl进行处理，12小时后立即取叶片置于液氮中冷冻保存，取部分叶片，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mLEP管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内，匀浆后移至1.5mLEP管中，抽提总RNA，用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量；

2)水稻锌指蛋白基因OsZFP18的克隆

根据水稻锌指蛋白基因OsZFP18的全长编码序列，设计两端引物：

上游引物：GCTCGTCATTAAGAGCGAAAG，

下游引物：GAATCAACCACAACCGACCA

以步骤1)获得的总RNA为模板，经反转录合成cDNA第一链后，进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性4分钟，94℃变性30s，56℃复性1min，72℃延伸2min，33个循环后，72℃10min，将PCR产物进行克隆、测序后获得具有完整编码区的水稻锌指蛋白基因OsZFP18的cDNA序列；

3)植物表达载体的构建

根据水稻锌指蛋白基因OsZFP18的cDNA序列，见SEQ ID NO.1的全长编码序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入合适的限制性内切酶位点，以步骤2)中获得的PCR扩增产物为模板，经PCR扩增后，将OsZFP18的cDNA克隆至中间载体pGEM-T，进一步克隆到双元表达载体pCAMBIA1301；

4)转基因植株的获得

将步骤3)获得的表达载体转入农杆菌，进一步转入水稻，对获得的转基因植株进行PCR，Southern杂交以及RT-PCR验证后进行植物的耐逆性评价，转基因植株的T2代和对照植株进行180mM NaCl的持续处理，观察他们的生长表现，在耐盐处理3天后的表现明显优于对照组的转基因水稻植株即为获得的耐盐转基因植株。

有益效果

1、本发明公开了一种水稻C2H2型锌指蛋白基因(OsZFP18基因)及其所编码的蛋白质。该基因来自水稻(Oryza sativa L.)，可作为目的基因导入植物，提高植物耐盐性，以进行植物品种改良，所编码的蛋白质具有耐盐功能。

2、本发明人提供的OsZFP18基因功能是参予植物的盐胁迫应答反应，mRNA表达分析表明OsZFP18基因在高盐(140mM NaCl)诱导条件下表达增强。

3、本发明的OsZFP18基因来自水稻，具有适合于水稻等单子叶植物表达的优化密码子，其基因工程受体植物除了双子叶植物，如大豆、棉花、烟草等之外更加适合于水稻、玉米、小麦等单子叶植物。

4、利用本发明OsZFP18基因作为目的基因构建植物表达载体，其中可用任何一种启动子例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、Ubiquitin启动子或其它启动子，该表达载体中必要时可包括增强子，不论是转录增强子或翻译增强子。为了简化转化细胞的鉴定可使用选择性标记包括对抗生素抗性的酶，也可利用颜色变化(例如B-葡糖醛酸糖苷酶GUS)或发光(例如荧光素酶)来识别的化合物的酶类，也可用无标记选择。所用的表达载体可使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体等。转化方法可用经农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法或其它方法转化植物。

具体实施方式

实施例1

水稻锌指蛋白基因OsZFP18的分子克隆

选用水稻品种“韭菜青”(太湖流域粳稻地方品种，为强耐盐品种)，待水稻幼苗长至3叶期后，用140mM NaCl进行处理，12小时后立即取叶片置于液氮中冷冻保存。取部分叶片，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mLEP管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内。匀浆后移至1.5mLEP管中，抽提总RNA(TRIzolReagents，Invitrogen，USA)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。以来自于水稻盐诱导cDNA文库的EST序列S121搜索GenBank的水稻基因组数据库，经过EST比较和序列拼接得到全长883bp的水稻C2H2型锌指蛋白基因的序列，根据此序列分别设计两端引物ZF1：GCTCGTCATTAAGAGCGAAAG，ZF2：GAATCAACCACAACCGACCA，采用RT-PCR方法进行cDNA克隆，PCR反应程序为：94℃预变性4分钟，94℃变性30s，56℃复性1min，72℃延伸2min，33个循环后，72℃10min。最终将PCR产物进行克隆、测序获得了水稻C2H2型锌指蛋白基因OsZFP18的cDNA序列。

BLAST的结果及3D-PSSM数据库分析结果证明从水稻中新得到的基因确为一个编码C2H2型锌指蛋白转录因子基因。本发明的水稻锌指蛋白基因OsZFP18为水稻中的首次报道，同时也是单子叶植物中首次发现的与植物非生物胁迫有关的C2H2型锌指蛋白基因，有望应用于植物尤其是单子叶植物的抗逆遗传改良。

实施例2

OsZFP18的序列信息与特性分析

本发明的OsZFP18全长883bp，其开放阅读框位于53-568处。DNAssist软件分析表明OsZFP18共编码171个氨基酸，其中含有2个典型的Cys2/His2型锌指结构，Cys-Xaa-Cys和His-Xaaa-His区之间由12个主要为酸性或疏水性氨基酸组成的区段隔开，配位结构加上Phe和Leu所形成的疏水核心，确定了锌指的基本机构和形状。2个锌指结构都包含QALGGH的保守结构。经Blast程序比较发现，OsZFP18的编码蛋白与大豆锌指蛋白SCOF-1、小麦WZF1、拟南芥STZ的氨基酸相似性分别为33％、36％、30％。使用Compute pI/MW软件估算其pI＝5.19，MW＝17.9KDa。以OsZFP18搜索GenBank中现有水稻基因组(包括粳稻和籼稻)数据库，发现OsZFP18为单拷贝基因。

实施例3

OsZFP18的表达研究

用实例1中设计的OsZFP18两端引物进行半定量RT-PCR分析水稻幼苗地上部与地下部的表达，以水稻actin基因Racl(McElroy et al，1990)的表达为内参，结果表明，水稻幼苗OsZFPl8的表达在140mMNaCl处理下6h显著增强，24h时表达达最高，灰度扫描分析表明其表达量约为对照的10倍。

实验例4

正反义OsZFP18转基因水稻植株的获得

根据实施例1得到的OsZFP18的全长序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将OsZFP18的cDNA克隆至中间载体(如pGEM-T.Promega)，进一步克隆到双元表达载体(如改进的pCAMBIA1301)，在保证阅读框架正确的前提下鉴定好的表达载体，再将其转入农杆菌中，转入水稻品种中花11号。待获得的转基因植株进行PCR，Southern杂交以及RT-PCR验证后进行植物的耐盐性评价。即将转基因植株的T2代和对照植株进行180mM NaCl的持续处理，观察他们的生长表现，结果表明转基因水稻在1.2％NaCl处理3天后的表现明显优于对照组。同时转基因植株在表型上也与野生型有所不同，正义转基因植株的穗明显不同于野生型，穗形变大，但实粒数基本不变，收获的稻粒较野生型明显更宽更短；而反义OsZFP18的转基因植株则明显更矮。

上述实施例表明本发明中克隆的水稻锌指蛋白基因OsZFP18，为水稻中首次克隆的水稻C2H2型锌指蛋白基因，此类基因在单子叶植物的功能迄今未经描述。实验例3、4表明该基因与植物的盐胁迫密切相关。此类基因由于来源于单子叶植物，具有单子叶植物优化的密码子，与双子叶植物来源的锌指蛋白基因相比，更加适合于水稻、玉米、小麦等单子叶作物的抗逆性遗传改良。

本发明人从单子叶植物水稻(Oryza sativa L.)  中克隆了一个cDNA，它编码C2H2型锌指蛋白，命名为OsZFP18。mRNA表达分析表明OsZFP18在检测的水稻根、叶片、茎以及幼穗中表达，而且140mM NaCl的处理增强了OsZFP18的表达。转基因研究表明，将OsZFP18基因转入水稻，转基因植株在正常条件下的长势类似对照，但其穗形发生了改变，而且基因过量表达的转基因植株比对照有明显高的耐盐性。同时OsZFP18的反义转基因则较野生型明显变矮。该基因可作为目的基因导入植物，提高植物耐盐性，以进行植物品种改良。在本发明的方法中，可利用OsZFP18基因作为目的基因构建植物表达载体，其中可用任何一种启动子例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、Ubiquitin启动子或其它启动子，该表达载体中必要时可包括增强子，不论是转录增强子或翻译增强子。为了简化转化细胞的鉴定可使用选择性标记包括对抗生素抗性的酶，也可利用颜色变化(例如B-葡糖醛酸糖苷酶GUS)或发光(例如荧光素酶)来识别的化合物的酶类，也可用无标记选择。所用的表达载体可使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体等。转化方法可用经农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法或其它方法转化植物。

本发明涉及的序列及记号分列如下：

(1)SEQ ID NO.1的信息

(i)序列特征：

(A)长度：883bp

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO.1

(2)SEQ ID NO.2的信息

(i)序列特征：

(A)长度：171a.a

(B)类型：氨基酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(iii)序列描述：SEQ ID NO.2

序列表

<110>南京农业大学

<120>一种水稻锌指蛋白基因及其编码的蛋白质

<141>2004-12-30

<160>3

<170>PatentIn version 3.1

<210>SEQ ID NO.1

<211>883

<212>DNA

<213>水稻[Oryza sativa]

<221>CDS

<222>(53)..(568)

<221>3’UTR

<222>(569)..(883)

<221>mRNA

<222>(1)..(883)

<221>polyA_site

<222>(855)..(883)

<221>5’UTR

<222>(1)..(52)

<400>1

gctcgtcatt aagagcgaaa gaaagttact tggaattctt tggtttgttg ta atg aca    58

                                                          Met Thr

                                                          1

atc acg aga gaa gaa gcg gag agc aag gag atg gag agc cta cgg gtg     106

Ile Thr Arg Glu Glu Ala Glu Ser Lys Glu Met Glu Ser Leu Arg Val

    5                       10                  15

cac gcc agc gcg ctg ctc tcg ctg tcg tcg cct gca gcg tcg gcg tcg     154

His Ala Ser Ala Leu Leu Ser Leu Ser Ser Pro Ala Ala Ser Ala Ser

    20                  25                  30

cag ccg acg tcg tcg tcg tcg acg acg gag ggg gtg ttc gag tgc aag     202

Gln Pro Thr Ser Ser Ser Ser Thr Thr Glu Gly Val Phe Glu Cys Lys

35                  40                  45                  50

acg tgc agc aag cgg ttc ccg tcg ttc cag gcg ctg ggc ggg cac cgg     250

Thr Cys Ser Lys Arg Phe Pro Ser Phe Gln Ala Leu Gly Gly His Arg

                55                  60                  65

acg agc cac acg cgg ctg cag gcg aag ctg ctg agc gac ccc gcc gcg     298

Thr Ser His Thr Arg Leu Gln Ala Lys Leu Leu Ser Asp Pro Ala Ala

            70                  75                  80

gcg gcg gcg gcg gcg gcc gag agg gac agg gca cgc gtc cac gag tgc     346

Ala Ala Ala Ala Ala Ala Glu Arg Asp Arg Ala Arg Val His Glu Cys

        85                  90                  95

gcc gtg tgc ggg gtc gag ttc tcc atg ggg cag gcg ctc ggc ggc cac     394

Ala Val Cys Gly Val Glu Phe Ser Met Gly Gln Ala Leu Gly Gly His

    100                 105                 110

atg cgc cgg cac agg ggc gag acg ggc acg acg acc gtc gtg ctc gcg     442

Met Arg Arg His Arg Gly Glu Thr Gly Thr Thr Thr Val Val Leu Ala

115                 120                 125                 130

gac gcc gac gac tcg ggc ggc gcc acc gtg ccg cag ccg ccg gag ccc     490

Asp Ala Asp Asp Ser Gly Gly Ala Thr Val Pro Gln Pro Pro Glu Pro

                135                 140                 145

atg ccg gac ctg aac tac ccg ccg ctg gag gac gcc ggc gac ggc tcg     538

Met Pro Asp Leu Asn Tyr Pro Pro Leu Glu Asp Ala Gly Asp Gly Ser

            150                 155                 160

gag cct gag tta ctt aac ctt ctt gta taa gttgcatcga tagatataca       588

Glu Pro Glu Leu Leu Asn Leu Leu Val

        165                 170

tgtgaattga attggcgtct gtacatagat atggtggatg gattctttac caaatttgat   648

cgaaaaaaag aactaaattt tggagcgtga tgatcatagc atgtaagttg taacaaatga   708

ttgttaactg taagatagga attctattca tttgttctct tctgtacaaa attacaaata   768

ggttgattaa ttagttggtc ggttgtggtt gattctttgt aaaataccaa tttactagta   828

taaatatact gacagcttat tgtttcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa        883

<210>SEQ ID NO.2

<211>171

<212>PRT

<213>水稻[Oryza sativa]

<400>2

Met Thr Ile Thr Arg Glu Glu Ala Glu Ser Lys Glu Met Glu Ser Leu

1               5                   10                  15

Arg Val His Ala Ser Ala Leu Leu Ser Leu Ser Ser Pro Ala Ala Ser

            20                  25                  30

Ala Ser Gln Pro Thr Ser Ser Ser Ser Thr Thr Glu Gly Val Phe Glu

        35                  40                  45

Cys Lys Thr Cys Ser Lys Arg Phe Pro Ser Phe Gln Ala Leu Gly Gly

    50                  55                  60

His Arg Thr Ser His Thr Arg Leu Gln Ala Lys Leu Leu Ser Asp Pro

65                  70                  75                  80

Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Glu Arg Asp Arg Ala Arg Val His

                85                  90                  95

Glu Cys Ala Val Cys Gly Val Glu Phe Ser Met Gly Gln Ala Leu Gly

            100                 105                 110

Gly His Met Arg Arg His Arg Gly Glu Thr Gly Thr Thr Thr Val Val

        115                 120                 125

Leu Ala Asp Ala Asp Asp Ser Gly Gly Ala Thr Val Pro Gln Pro Pro

    130                 135                 140

Glu Pro Met Pro Asp Leu Asn Tyr Pro Pro Leu Glu Asp Ala Gly Asp

145                 150                 155                 160

Gly Ser Glu Pro Glu Leu Leu Asn Leu Leu Val

                165                 170

<210>3

<211>171

<212>PRT

<213>水稻[Oryza sativa]

<221>ZN_FING

<222>(49)..(69)

<221>ZN_FING

<222>(98)..(118)

<400>3

Met Thr Ile Thr Arg Glu Glu Ala Glu Ser Lys Glu Met Glu Ser Leu

1               5                   10                  15

Arg Val His Ala Ser Ala Leu Leu Ser Leu Ser Ser Pro Ala Ala Ser

            20                  25                  30

Ala Ser Gln Pro Thr Ser Ser Ser Ser Thr Thr Glu Gly Val Phe Glu

        35                  40                  45

Cys Lys Thr Cys Ser Lys Arg Phe Pro Ser Phe Gln Ala Leu Gly Gly

    50                  55                  60

His Arg Thr Ser His Thr Arg Leu Gln Ala Lys Leu Leu Ser Asp Pro

65                  70                  75                  80

Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Glu Arg Asp Arg Ala Arg Val His

                85                  90                  95

Glu Cys Ala Val Cys Gly Val Glu Phe Ser Met Gly Gln Ala Leu Gly

            100                 105                 110

Gly His Met Arg Arg His Arg Gly Glu Thr Gly Thr Thr Thr Val Val

        115                 120                 125

Leu Ala Asp Ala Asp Asp Ser Gly Gly Ala Thr Val Pro Gln Pro Pro

    130                 135                 140

Glu Pro Met Pro Asp Leu Asn Tyr Pro Pro Leu Glu Asp Ala Gly Asp

145                 150                 155                 160

Gly Ser Glu Pro Glu Leu Leu Asn Leu Leu Val

                165                 170

Claims (1)

1、水稻锌指蛋白基因OsZFP18的基因工程应用，包括：

1)总RNA的提取

选用水稻品种“韭菜青”，待水稻幼苗长至3叶期后，用140mM NaCl进行处理，12小时后立即取叶片置于液氮中冷冻保存，取部分叶片，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mLEP管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内，匀浆后移至1.5mLEP管中，抽提总RNA，用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量；

2)水稻锌指蛋白基因OsZFP18的克隆

根据水稻锌指蛋白基因OsZFP18的全长编码序列，设计两端引物：

上游引物：GCTCGTCATTAAGAGCGAAAG，

下游引物：GAATCAACCACAACCGAC CA

以步骤1)获得的总RNA为模板，经反转录合成cDNA第一链后，进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性4分钟，94℃变性30s，56℃复性1min，72℃延伸2min，33个循环后，72℃ 10min，将PCR产物进行克隆、测序后获得具有完整编码区的水稻锌指蛋白基因OsZFP18的cDNA序列；

3)植物表达载体的构建

根据水稻锌指蛋白基因OsZFP18的cDNA序列，见SEQ ID NO.1的全长编码序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点，以步骤2)中获得的PCR扩增产物为模板，经PCR扩增后，将OsZFP18的cDNA克隆至中间载体pGEM-T，进一步克隆到双元表达载体pCAMBIA1301；

4)转基因植株的获得

将步骤3)获得的表达载体转入农杆菌，进一步转入水稻，对获得的转基因植株进行PCR，Southern杂交以及RT-PCR验证后进行植物的耐逆性评价，转基因植株的T2代和对照植株进行180mM NaCl的持续处理，观察他们的生长表现，在耐盐处理3天后的表现明显优于对照组的转基因水稻植株即为获得的耐盐转基因植株。