HU225301B1 - Plant gene constructs and their use - Google Patents
Plant gene constructs and their use Download PDFInfo
- Publication number
- HU225301B1 HU225301B1 HU0001909A HUP0001909A HU225301B1 HU 225301 B1 HU225301 B1 HU 225301B1 HU 0001909 A HU0001909 A HU 0001909A HU P0001909 A HUP0001909 A HU P0001909A HU 225301 B1 HU225301 B1 HU 225301B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- ath1
- plants
- flowering
- plant
- gene
- Prior art date
Links
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 title description 6
- 101150111419 ATH1 gene Proteins 0.000 claims description 145
- 101100135611 Arabidopsis thaliana PAP12 gene Proteins 0.000 claims description 130
- 101100433747 Arabidopsis thaliana ABCA2 gene Proteins 0.000 claims description 129
- 101100288148 Arabidopsis thaliana KNAT5 gene Proteins 0.000 claims description 129
- 101150002428 Atoh1 gene Proteins 0.000 claims description 129
- 101100057132 Candida albicans (strain SC5314 / ATCC MYA-2876) ATC1 gene Proteins 0.000 claims description 129
- 102100029373 Transcription factor ATOH1 Human genes 0.000 claims description 128
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 claims description 88
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 22
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 20
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 11
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 6
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 claims description 5
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 claims description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 5
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 claims description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 151
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 52
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 37
- IXORZMNAPKEEDV-OBDJNFEBSA-N gibberellin A3 Chemical compound C([C@@]1(O)C(=C)C[C@@]2(C1)[C@H]1C(O)=O)C[C@H]2[C@]2(C=C[C@@H]3O)[C@H]1[C@]3(C)C(=O)O2 IXORZMNAPKEEDV-OBDJNFEBSA-N 0.000 description 34
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 31
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 28
- IXORZMNAPKEEDV-UHFFFAOYSA-N gibberellic acid GA3 Natural products OC(=O)C1C2(C3)CC(=C)C3(O)CCC2C2(C=CC3O)C1C3(C)C(=O)O2 IXORZMNAPKEEDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 24
- 239000005980 Gibberellic acid Substances 0.000 description 23
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 23
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 20
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 19
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 19
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 18
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 18
- 102100020720 Calcium channel flower homolog Human genes 0.000 description 16
- 101000932468 Homo sapiens Calcium channel flower homolog Proteins 0.000 description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 15
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 14
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 14
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 13
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 13
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 13
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 13
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 11
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 11
- 230000004044 response Effects 0.000 description 11
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 9
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 9
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 230000006870 function Effects 0.000 description 8
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 8
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 8
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 8
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 7
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 6
- 244000038559 crop plants Species 0.000 description 6
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 6
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 6
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 6
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 6
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 230000008121 plant development Effects 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 5
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 5
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 5
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 4
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 description 4
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 4
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 4
- 235000003228 Lactuca sativa Nutrition 0.000 description 4
- 108010067965 Phytochrome B Proteins 0.000 description 4
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 4
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 4
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 4
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 4
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 230000007330 shade avoidance Effects 0.000 description 4
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 4
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 4
- JXCKZXHCJOVIAV-UHFFFAOYSA-N 6-[(5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl)oxy]-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid;cyclohexanamine Chemical compound [NH3+]C1CCCCC1.O1C(C([O-])=O)C(O)C(O)C(O)C1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 JXCKZXHCJOVIAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 3
- 229930191978 Gibberellin Natural products 0.000 description 3
- 108700005087 Homeobox Genes Proteins 0.000 description 3
- 108090000051 Plastocyanin Proteins 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000003448 gibberellin Substances 0.000 description 3
- 230000002015 leaf growth Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004491 Antisense DNA Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 2
- 235000011299 Brassica oleracea var botrytis Nutrition 0.000 description 2
- 240000003259 Brassica oleracea var. botrytis Species 0.000 description 2
- 229920002160 Celluloid Polymers 0.000 description 2
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 2
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 2
- 241000218922 Magnoliophyta Species 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 101150048253 PHYA gene Proteins 0.000 description 2
- 108090000679 Phytochrome Proteins 0.000 description 2
- 108020004518 RNA Probes Proteins 0.000 description 2
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 description 2
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 2
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002390 adhesive tape Substances 0.000 description 2
- 239000003816 antisense DNA Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 101150081158 crtB gene Proteins 0.000 description 2
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 2
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 2
- 101150054900 gus gene Proteins 0.000 description 2
- 238000003898 horticulture Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 108091008695 photoreceptors Proteins 0.000 description 2
- 101150110490 phyB gene Proteins 0.000 description 2
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 2
- 230000032361 posttranscriptional gene silencing Effects 0.000 description 2
- 230000033458 reproduction Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 2
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 2
- 230000007103 stamina Effects 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 2
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 2
- 238000003828 vacuum filtration Methods 0.000 description 2
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 244000144725 Amygdalus communis Species 0.000 description 1
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 1
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 1
- 235000011331 Brassica Nutrition 0.000 description 1
- 241000219198 Brassica Species 0.000 description 1
- 235000014698 Brassica juncea var multisecta Nutrition 0.000 description 1
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 1
- 240000000385 Brassica napus var. napus Species 0.000 description 1
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 1
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 1
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 1
- 235000017647 Brassica oleracea var italica Nutrition 0.000 description 1
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 235000006618 Brassica rapa subsp oleifera Nutrition 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- 235000021538 Chard Nutrition 0.000 description 1
- 240000006740 Cichorium endivia Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 244000241257 Cucumis melo Species 0.000 description 1
- 235000015510 Cucumis melo subsp melo Nutrition 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 240000006497 Dianthus caryophyllus Species 0.000 description 1
- 235000009355 Dianthus caryophyllus Nutrition 0.000 description 1
- 241000208150 Geraniaceae Species 0.000 description 1
- 241000208152 Geranium Species 0.000 description 1
- RSQSQJNRHICNNH-UHFFFAOYSA-N Gibberellin A4 Natural products OC(=O)C1C2(CC3=C)CC3CCC2C2(OC3=O)C1C3(C)C(O)CC2 RSQSQJNRHICNNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HHDWSDSMWJQURA-UHFFFAOYSA-N Gibberellin A51 Natural products C12CCC(C3)C(=C)CC23C(C(O)=O)C2C3(C)C(=O)OC21CC(O)C3 HHDWSDSMWJQURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 206010018498 Goitre Diseases 0.000 description 1
- 241000208818 Helianthus Species 0.000 description 1
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 1
- 206010019909 Hernia Diseases 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000209504 Poaceae Species 0.000 description 1
- 108010059820 Polygalacturonase Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 235000007238 Secale cereale Nutrition 0.000 description 1
- 244000082988 Secale cereale Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 244000062793 Sorghum vulgare Species 0.000 description 1
- 244000300264 Spinacia oleracea Species 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PJVJTCIRVMBVIA-JTQLQIEISA-N [dimethylamino(ethoxy)phosphoryl]formonitrile Chemical compound CCO[P@@](=O)(C#N)N(C)C PJVJTCIRVMBVIA-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- GOOXRYWLNNXLFL-UHFFFAOYSA-H azane oxygen(2-) ruthenium(3+) ruthenium(4+) hexachloride Chemical compound N.N.N.N.N.N.N.N.N.N.N.N.N.N.[O--].[O--].[Cl-].[Cl-].[Cl-].[Cl-].[Cl-].[Cl-].[Ru+3].[Ru+3].[Ru+4] GOOXRYWLNNXLFL-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 235000003733 chicria Nutrition 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000012272 crop production Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000005059 dormancy Effects 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 230000005014 ectopic expression Effects 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 1
- 238000004299 exfoliation Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 230000004883 flower formation Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- RSQSQJNRHICNNH-NFMPGMCNSA-N gibberellin A4 Chemical compound C([C@@H]1C[C@]2(CC1=C)[C@H]1C(O)=O)C[C@H]2[C@@]2(OC3=O)[C@H]1[C@@]3(C)[C@@H](O)CC2 RSQSQJNRHICNNH-NFMPGMCNSA-N 0.000 description 1
- 201000003872 goiter Diseases 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 108010087711 leukotriene-C4 synthase Proteins 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 235000019713 millet Nutrition 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001151 other effect Effects 0.000 description 1
- 229930195732 phytohormone Natural products 0.000 description 1
- 210000000745 plant chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000002985 plastic film Substances 0.000 description 1
- 230000004983 pleiotropic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000013138 pruning Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 230000000754 repressing effect Effects 0.000 description 1
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 235000012045 salad Nutrition 0.000 description 1
- 230000021217 seedling development Effects 0.000 description 1
- 230000014639 sexual reproduction Effects 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 230000005082 stem growth Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008511 vegetative development Effects 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8291—Hormone-influenced development
- C12N15/8297—Gibberellins; GA3
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8262—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield involving plant development
- C12N15/827—Flower development or morphology, e.g. flowering promoting factor [FPF]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Physiology (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
(57) Kivonat
A találmány tárgyát ATH1-génterméket (azaz egy Arabidopsis thaliana homeobox-génterméket) tartalmazó növényi génkonstrukciók és alkalmazásuk képezi növények virágzásának szabályozására. A találmány tárgyát képezik a találmány szerinti konstrukciókat tartalmazó növények is.
A találmány szerinti megoldás alkalmas megváltoztatott virágzási sajátságokkal bíró tanszgenikus haszonnövények előállítására.
HU 225 301 Β1
A leírás terjedelme 22 oldal (ezen belül 9 lap ábra)
HU 225 301 Β1
A találmány tárgyát ATH1-génterméket (azaz egy Arabidopsis thaliana homeobox-génterméket) tartalmazó növényi génkonstrukciók és alkalmazásuk képezi növények virágzásának szabályozására. A találmány tárgyát képezik a találmány szerinti konstrukciókat tartalmazó növények is.
A találmány szerinti megoldás alkalmas új, előnyös virágzási sajátságokkal bíró haszonnövények előállítására.
A növények különböznek az állatoktól. A kifejlett növényi test posztembrionálisan alakul ki a sarj és a gyökér csúcsmerisztémáinak (apikális merisztéma) folyamatos aktivitása által. A sarj csúcsmerisztémája a növény embriogenezise alatt alakul ki, és a sziklevelekkel, hipokotil (szik alatti) szárral, embrionális gyökérrel és gyökérmerisztémával együtt építi fel az alapnövénytestet.
A sarj csúcsmerisztémája körülbelül száz sejt halmazából indul fejlődésnek, és ez a növény egész föld feletti részének forrása. A növény fejlődésének vegetatív fázisában ezen merisztémából alakulnak ki a levelek (levélrozetta), a szár és a nyugalmi hónaljmerisztémák. Ezt másodlagos virágkezdemények, szárlevelek és meghatározó virágmerisztémák kialakulása követi a virágzási indukció után. A virágzásban géntermékek komplex kölcsönhatása játszik szerepet, amelyek egy átkapcsolást szabályoznak a sarjmerisztéma jellegében. Ezen gének expressziójának mértékét meghatározó faktorok genotipikus és környezeti stimulusok, például megvilágítási időtartam, hőmérséklet és fénymennyiség. Az még nagyjából nem ismert, hogy milyen módon befolyásolják az átmenetet ezek a stimulusok.
A növényi életciklus egyik legfontosabb eseménye a reproduktív fázisba jutást biztosító döntő lépés. Sokféle környezeti és endogén szignál szabályozza a vegetatív fázisból való átmenetet a reproduktív fázisba. Fontos szignál a nap hosszúsága, hőmérséklet (vernalizáció), milyen mennyiségű tápanyag és víz áll rendelkezésre, valamint néhány fitohormon, különösen gibberellin (GA). Ezek a szignálok átkapcsolást indukálnak a vegetatív csúcsmerisztémák jellegében, amelyet virágzási fázisba való átmenetnek hívunk, és ez az átmenet alakítja ki a virágmerisztémát. Míg a vegetatív csúcsmerisztéma terméke a levélprimordium (levélkezdemény), a virágmerisztéma olyan primordiumot képez, amely másodlagos virágkezdeménnyé differenciálódik a korai generatív fázis alatt, és később virágokká ebben a fázisban. A növénynemesítési kutatásban ezen folyamat szabályozása nagyon fontos cél különféle haszonnövények esetén. Ez különösen érvényes a levélrózsás növényekre, például salátára, spenótra és cukorrépára, amelyek gyors szárnövekedést (felmagzást) mutatnak a virágzási fázisba való átmenet után, és ez a haszonnövényt használhatatlanná teszi.
A vegetatívból a reproduktív növekedésbe való átmenet egy döntő fejlődési esemény, és mivel ez a szexuális reprodukció első lépése, nagy jelentősége van a mezőgazdaságban, kertészetben és növénynemesítésben. A növénytermesztők siettetni vagy visszatartani szeretnék a virágzás idejét, vagy teljesen megakadályozni: például ilyen a „felmagzás” megakadályozása salátában vagy cukorrépában. A növényi virágzás molekuláris biológiájának jobb megértése számos módon lehetővé teszi ennek szabályozását vagy befolyásolását, amely jelentős gyakorlati előnyöket nyújt a mezőgazdaságban.
A PCT WO 96/14414 számú nemzetközi közzétételi irat szerint „Constans (CO) gént módosítják a virágzási mechanizmus módosítására növényekben.
A találmány szerint egy olyan megoldást javaslunk növény vegetatívból reproduktív növekedésbe való átmenetének befolyásolására, amelyben előállítunk olyan transzformált növényeket, amelyekben az átmenet késik vagy előrébb kerül ezen folyamatot befolyásolni képes, specifikus transzgének expressziója által. Ilyen géneket konstitutívan lehet expresszálni, vagy csak külső stimulusra, például környezeti vagy kémiai stimulusra adott válaszként lehet expresszálni.
Az ATH1 egy Arabidopsis thaliana homeobox-gén. Quaedvlieg és munkatársai írták le [Plánt Cell 7, 117-129 (1995), melyet a kitanítás részének tekintünk]: DNS-szekvenciáját az 1. ábrán adjuk meg. Fényindukált transzkripciós faktorok készletéből izolálták. Fiatal csíranövényekben és virágokban expresszálódik. Az ATH1-mRNS mennyisége etiolált csíranövényekben erősen fényfüggő (fitokróm) és fényadaptív is.
Kimutattuk, hogy az ATH1-fehérjetermék szerepet játszik a vegetatívból generatív növekedésbe való fejlődési átkapcsolásban. Az ATH1::GUS vizsgálatainak eredményeiből és eredeti 35S::ATH1-tanulmányokból azt a következtetést vonhatjuk le, hogy az ATH1 a vegetatív csúcsmerisztéma virágmerisztémába való átmenete során működik. Közelebbről meghatározva, az ATH1 antigibberellinként hat úgy, hogy represszálja a GA-szintézist vagy esetleg a GA-válasz folyamatsorát: ezt a 6. ábra szemlélteti.
ATH1::GUS-konstrukciókkal végzett vizsgálatainkban kimutattuk, hogy fiatal, fényen növesztett csíranövények ATH1-et expresszálnak a sarjcsúcsmerisztéma és a levélprimordium mindhárom rétegében. Fiatal, még fejlődő levelekben az ATH1 vaszkuláris szövetben expresszálódik. Ez az expresszió megszűnik kifejlett levelekben. Figyelemre méltó, hogy a merisztéma ATH1-expressziója a fejlődés vegetatív fázisára korlátozódik. Mihelyt az Arabidopsis elkezd virágozni (vegetatív állapotból generatív állapotba való átmenet), és a sarjcsúcsmerisztéma virágmerisztémává alakul, az ATH1-expresszió a merisztémában leszabályozódik. A virág kialakulásának fázisában az ATH1 kis mennyiségben expresszálódik a szár fejlődő vaszkuláris szövetében. A növény fejlődésének későbbi szakaszában, amikor a virágok kifejlődtek, az ATH1 a fiatal virág különböző részeiben expresszálódik (vacokban, azaz receptákulumban, csészelevelekben, azaz sepalumban és a porzólevelek, azaz stamina vaszkuláris szövetében). Hipotézisünk szerint az ATH1 szerepet játszik a növekedés vegetatív fázisából generatív fázisába való átmenetének szabályozásában, melyet továbbá ATH1-et szensz vagy antiszensz túltermelő fenotípusok virágzási ideje is alátámaszt. ATH1-et ektopikusan anti2
HU 225 301 Β1 szensz túltermelő növények korán virágzó fenotípust mutatnak, ezzel ellentétben ATH1-et túltermelő, szensz konstrukciót tartalmazó növények többsége későn virágzik. Túltermelést biztosító konstrukciót tartalmazó növények kis része az ATH1-mennyiségének koszuppresszió útján bekövetkezett csökkenése következtében korán virágzó, az ATH1 antiszensz túltermelő növényekhez hasonlóan, ezen növények fenotípusa későn virágzó (Shannon és Meeks-Wagner, 1991), túltermelő LEAFY- (Weigel és Nilsson, 1995), APETALA-1- (Manóéi és Yanofsky, 1995) és CONSTANS- (Putteril és munkatársai, 1995) mutánsok fenotípusára emlékeztet. Ezen eredmények alapján, az ATH1::GUS-adatokkal kombinálva azt a következtetést vonjuk le, hogy az ATH1 szerepet játszik a növekedés vegetatív fázisából generatív fázisába való átmenetének szabályozásában Arabidopsis thalianában, és valószínűleg virágzási időt meghatározó gén.
Ennek következtében ezt az átmenetet elősegíthetjük az ATH1-gén expressziójának gátlásával, vagy az átmenetet lassíthatjuk vagy meggátolhatjuk ezen expresszió elősegítésével.
Ennek megfelelően a találmány tárgya ATH1-génterméket kódoló, részleges vagy teljes DNS-szekvenciát tartalmazó növényi génkonstrukció, növényekben működőképes promoter vezérletével. A promoter előnyösen heterológ. A találmány tárgyát képezik továbbá ilyen növényi génkonstrukcióval transzformált növényi sejtek, valamint ilyen sejteket tartalmazó növények, amelyek módosított virágzási tulajdonságokkal rendelkeznek. A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás virágzási folyamat módosítására növényekben úgy, hogy a találmány szerinti konstrukcióval transzformálunk növényeket.
Génszekvenciák alkalmazását génexpresszió gátlására vagy elősegítésére ma már egészen jól értjük. Növényben hatékonyan működő promoter által szabályozott komplett génszekvencia általában túltermeli a génterméket, amely az így termelt fehérje hatásának amplifikációjához vezet. A géntermék mennyisége néha lecsökken: ezt a jelenséget „koszuppresszió-nak hívjuk. A géntermék mennyiségének csökkenését általában úgy is elérhetjük, hogy domináns negatív mutációt alkalmazunk, vagy megfordítjuk a génszekvencia orientációját a promoterhez képest, így „antiszensz” messenger RNS termelődik.
A találmány szerinti DNS-konstrukció lehet „antiszensz” konstrukció, amely „antiszensz” RNS-t állít elő, vagy „szensz” (a funkcionális fehérje legalább egy részét kódoló) konstrukció, amely „szensz” RNS-t állít elő. Az „antiszensz RNS” olyan RNS-szekvencia, amely komplementer a megfelelő mRNS bázisszekvenciájával: komplementer abban az értelemben, hogy az antiszensz szekvenciában (3-5’ irányban leolvasva) lévő minden egyes bázis (vagy a bázisok többsége) képes párosodni az mRNS-szekvenciában (5-3' irányban leolvasva) lévő megfelelő bázisokkal (G C-vel, A U-val). Ilyen antiszensz RNS-t termeltethetünk a sejtben olyan megfelelő DNS-konstrukcióval való transzformáció által, amelynek elrendezése olyan transzkriptum előállítását biztosítja, amelynek szekvenciája legalább részben komplementer a tárgyhoz tartozó gén kódolószálának legalább egy részletével (vagy ezzel lényegi homológiát mutató DNS-szekvencia legalább egy részletével). A „szensz RNS” olyan RNS-szekvencia, amely lényegében homológ a megfelelő mRNS-szekvencia legalább egy részletével. Ilyen szensz RNS-t termeltethetünk a sejtben olyan megfelelő DNS-konstrukcióval való transzformáció által, amely normálorientációban van elrendezve olyan transzkriptum előállítása céljából, amelynek szekvenciája legalább részben azonos a tárgyhoz tartozó gén kódolószálának legalább egy részletével (vagy ezzel lényegi homológiát mutató DNS-szekvencia legalább egy részletével). Alkalmas szensz konstrukciókat alkalmazhatunk génexpresszió gátlására (WO 91/08299 számú nemzetközi közzétételi iratban leírtak szerint), vagy funkcionális fehérjét kódoló és expresszáló szensz konstrukciót transzformálhatunk a növénybe a fehérje túltermeltetése céljából.
A találmány szerinti DNS-konstrukciók legalább 10 bázis (előnyösen legalább 35 bázis) hosszúságú bázisszekvenciát tartalmazhatnak RNS-be való transzkripció céljából. Elméletileg nincsen felső korlátja a bázisszekvenciának, olyan hosszú lehet, mint a sejt által termelt, tárgyhoz tartozó mRNS, de a könnyen kezelhetőség miatt általában a bázisok száma 100 és 1000 között van az alkalmazott szekvenciákban. Ilyen konstrukciók előállítását részletesen lentebb ismertetünk.
DNS-bázisszekvencia forrásaként cDNS-t vagy genomi DNS-t vagy szintetikus polinukleotidot alkalmazhatunk transzkripcióhoz. Arabidopsisbói származó, alkalmas ATH1-szekvenciák izolálását Quaedvlieg és munkatársai leírták (hivatkozás fentebb), hasonló módszereket alkalmazhatunk más növényekből származó ATH1-szekvenciák izolálására. Ezek nagyobb vagy kisebb mértékű homológiával rendelkezhetnek az Arabidopsisból származó ATH1-szekvenciával. így a teljes fehérjét vagy lényegében a teljes fehérjét kódoló szekvenciákhoz jutunk. Ebből megfelelő hosszúságú DNS-szekvenciákat restrikciós enzimek alkalmazásával vághatunk ki. Ha transzkripcióhoz a részleges bázisszekvencia forrásaként genomi DNS-t alkalmazunk, intron- vagy exonrégiókat vagy kombinációjukat alkalmazhatjuk.
Az ATH1 növényi sejtekben való expressziójának módosítására alkalmas konstrukciók előállítása céljából a cDNS-szekvenciát a fehérje-cDNS-ben megtalálható formában vagy a génszekvenciát a növény kromoszómájában található formában alkalmazhatjuk. Rekombináns DNS-konstrukciókat standardtechnikák szerint állíthatunk elő. Transzkripcióra alkalmazott DNS-szekvencia előállftása céljából például a kérdéses szekvenciát tartalmazó vektort restrikciós enzimekkel kezeljük megfelelő szegmensek kivágása céljából. Transzkripcióra alkalmazott DNS-szekvenciát előállíthatunk szintetikus oligonukleotidok összehibridizálásával és ligálásával, vagy az egyes végekhez hozzáadott alkalmas restrikciós hasítóhelyeket tartalmazó szinteti3
HU 225 301 Β1 kus oligonukleotidokat alkalmazva polimeráz-láncreakcióban (PCR). A DNS-szekvenciát azután promotert és szintézisirányban elhelyezkedő terminátorszekvenciákat tartalmazó vektorba klónozzuk. Ha antiszensz DNS-re van szükségünk, a klónozást úgy végezzük, hogy a kivágott DNS-szekvenciának arra a szálra vonatkozó orientációját megfordítjuk, amelyből kivágtuk.
Antiszensz RNS expresszálására alkalmas konstrukcióban az a szál, amelyik korábban a templátszál volt, a kódolószál lesz, és fordítva. A konstrukció bázisszekvenciája olyan RNS-t fog kódolni, amely komplementer a fehérje részleges vagy teljes mRNS-szekvenciájával. Tehát a két RNS-szál nemcsak bázisszekvenciájukban komplementer, hanem orientációjukban is (5'-től 3’-irányban).
Szensz RNS expresszálására alkalmas konstrukcióban a templát- és kódolószál megtartja az eredeti növényi gén elrendeződését és orientációját. Szensz RNS expresszálására alkalmas konstrukció bázisszekvenciája olyan RNS-t kódol, amely homológ az mRNS-szekvencia részével vagy egészével. A funkcionális fehérjét expresszáló konstrukciókban a gén teljes kódolórégiója transzkripciós szabályozószekvenciákhoz van kapcsolva, amely növényekben való expressziót tesz lehetővé.
A találmány szerinti konstrukciókat például az alábbiak szerint állíthatjuk elő. A kívánt bázisszekvenciát tartalmazó alkalmas vektort (például a pATH1-cDNSklónt) transzkripció céljából restrikciós enzimekkel kezeljük a szekvencia kivágása céljából. Az így kapott DNS-szálat egy második vektorba klónozzuk (kívánt esetben fordított orientációban), amely vektor kívánt promoterszekvenciát és a kívánt terminátorszekvenciát tartalmazza. Alkalmas promoter lehet karfiolmozaik-vírusból származó 35S-promoter, paradicsomból származó poligalakturonázgén promoterszekvenciája [Bírd és munkatársai, Plánt Molecular Biology 11, 651-662 (1988)] vagy más, fejlettségi állapot által szabályozott növényi promoter. Alkalmas terminátorszekvencia Agrobacterium tumefaciensbö\ származó nopalin-szintetáz-génből származik (nos 3’-vég).
A találmány szerinti DNS-konstrukcióban a transzkripciós iniciációs régió bármelyik, növényben működőképes promoterből származhat. A transzkripciós iniciációs régiót annak a DNS-szekvenciának a transzkripciójára pozícionálhatjuk, amelyik azt az RNS-t kódolja, amelyik komplementer az ATH1-fehérjét kódoló mRNS egy lényeges szakaszának bázisaival (teljes vagy részleges antiszensz DNS-konstrukció előállítása).
Növényekben működőképes transzkripciós iniciációs régió (vagy promoter) lehet konstitutív promoter (például a karfiolmozaik-vírusból származó 35S-promoter) vagy indukálható vagy fejlettségi állapot által szabályozott promoter, a körülményektől függően. Például kívánatos lehet egy fehérje aktivitásának módosítása a növény egy bizonyos fejlettségi állapotában. Konstitutív promoter alkalmazása arra utal, hogy a fehérje mennyiségét és funkcióit valamennyi növényi részben befolyásoljuk, míg szövetspecifikus promoter alkalmazása lehetővé teszi a génexpresszió és a befolyásolandó funkciók szelektívebb szabályozását. Tehát az antiszensz vagy szensz RNS csak abban a szervben képződik, amelyben hatására szükség van.
A találmány szerinti DNS-konstrukciókat növényekbe lehet inszertálni az ATH1-gén expresssziójának szabályozása céljából, amely a növény tulajdonságainak (főleg a virágzás) módosítását eredményezi. A konstrukció természetétől függően az ATH1-géntermék termelése növekedhet vagy csökkenhet, a növény életének minden szakaszában vagy egy adott stádiumában. Általában az várható, hogy a fehérje termelését csak azok a konstrukciók fokozzák, amelyek olyan RNS-t expresszálnak, amely homológ a lényegében teljes endogén fehérje mRNS-ével. Teljes hosszúságú szensz konstrukciók szintén gátolhatnak fehérjeexpressziót. Részleges DNS-szekvenciát tartalmazó konstrukciók, amelyek rövidebbek, mint a megfelelő teljes gén, általában gátolják a génexpressziót és a fehérjék termelését, akár szensz, akár antiszensz RNS expresszálására vannak kialakítva.
A találmány szerinti DNS-konstrukciókat a növényi célsejtbe transzformáljuk. A növényi célsejt lehet az egész növény része, vagy lehet izolált sejt vagy szövet része, melyet teljes növénnyé regenerálhatunk. A növényi célsejtet kiválaszthatjuk bármelyik egyszikű vagy kétszikű növényfajból. A növények származhatnak transzformált növényi sejtből a transzformánsok regenerálásával, és úgy, hogy előállítjuk a transzformánsok utódainak egymás utáni generációit.
A találmány szerinti konstrukciókat bármilyen növény transzformálására alkalmazhatjuk, bármilyen alkalmas transzformációs technika alkalmazásával, a találmány szerinti növények előállítása céljából. Egyszikű és kétszikű növényi sejteket egyaránt transzformálhatunk, szakember által ismert különféle módokon. Sok esetben ilyen növényi sejteket (különösen kétszikű növényi sejtek esetén) tenyészthetünk teljes növények regenerálása céljából, amelyek azt követően genetikailag módosított növények egymás után következő generációit reprodukálják. Bármilyen növények transzformálására alkalmas módszer alkalmazható. Például kétszikű növényeket, úgymint paradicsomot és dinnyét Agrobacteríumbói származó Ti-plazmidot alkalmazó technológiával transzformálhatunk, melyet Bevan [Nucleic Acids Research 12, 8711-8721 (1984)] vagy Fillatti és munkatársai [Biotechnology 5, 726-730 (1987)] írtak le. Ilyen transzformált növényeket szexuálisan vagy sejt- vagy szövettenyészetben reprodukálhatunk. Egyszikűeket génágyú alkalmazásával transzformálhatunk. Növények transzformálására szolgáló más módszer a mikroinjektálás és elektroporáció.
A találmány szerinti genetikailag módosított növények lehetnek például gabonafélék, például rizs és kukorica, búza, árpa, zab és rozs. Más fontos magtermésű növény lehet olajrepce (kanola), cukorrépa, napraforgó, szója és köles. A legtöbb haszonnövényt évente magról növesztik, és bármilyenfajta mag termelése a növény virágzási képességétől, megporozhatóságától és magképzésétől függ. Kertészetben a virágzás időzítésének szabályozása fontos. Azok a kertészeti növé4
HU 225 301 Β1 nyék, amelyek virágzási idejét szabályozni lehet: saláta, endíviasaláta és káposztazöldségfélék, például káposzta, brokkoli és karfiol, valamint szegfűfélék és gólyaorrfélék (Geránium).
A találmány szerint módosított növények fő tulajdonsága a korai vagy késői virágzás. Azok a genotípusok, amelyekben az ATH1-fehérje termelése gátolva van, általában korán virágoznak; azok a genotípusok, amelyekben ez a fehérje stimulálva van, későn virágoznak. Más hatások is megfigyelhetők a növény fenotípusán, például törpenövekedés, például a dohányban.
A virágzási idő szabályozása több okból is hasznos lehet. Például a virágzási időt abból a célból szabályozhatjuk, hogy az eladásra legkedvezőbb időpontban virágozzanak vagy hozzanak gyümölcsöt a növények. Hibridtermelésben a porzós és a termős szülői növények virágzását összhangba lehet hozni. Ennek a legkényelmesebb útja indukálható génpromoterek alkalmazása, amelyek külső stimulusra reszponzívek, például vegyszerek alkalmazására. Ilyen promoter például a kukoricából származó glutation-S-transzferáz II. izotermájának génpromotere, melyet ismert biztonságos herbicid ágens aktivál (WO 93/01294 számú nemzetközi közzétételi irat, ICI).
A felmagzás szabályozása számos haszonnövényfaj esetén gazdaságilag fontos lehet. Nagyszerű alkalmazási lehetőség lenne például cukorrépa esetén olyan variánsok előállítására, amelyek kevésbé hajlamosak a felmagzásra hidegkezelés után. A feldolgozóüzemek hosszabb ideig kiterjeszthetik tevékenységüket, a költségekben jelentős megtakarítást érhetnének el. Felmagzásra rezisztens változatokat nagyon korai évszakban (február) lehet vetni, sőt az adott év előtti ősszel (feltéve, ha a téli fagyok nem okoznak problémát). Továbbá azokban a variánsokban, amelyekben a felmagzás fokozott, gyorsabb az érés: keresztezést évente végezhetünk, a jelenlegi kétévi helyett.
A korán virágzó napraforgó földrajzi elterjedési területe kiterjeszthető. Termeszthető lenne még északabbra (Párizstól északra), és valószínűleg szárazabb régiókban, például Spanyolország egyes részein elkerülve a késő nyári száraz időszakot.
Zöldségekben a felmagzást például salátában és endiviasalátában lehet szabályozni. Ez lehetőséget biztosít a haszonnövények könnyebb nyári termesztésére. A jelenleg létező variánsok nyári körülmények között hajlamosak gyorsan felmagzani. Füvek esetén a csökkent mértékű felmagzás (vagy a felmagzás hiánya) jótékony hatású a takarmány céljából termesztett típusokra (javított tápanyagminőség) és a kényelmi célokat szolgáló típusokra (jobb minőségű gyep).
Alkalmanként előnyös transzgének expresszióját úgy időzíteni, hogy az a virágzás elkezdődésekor megálljon, vagy szuppresszálni természetesen előforduló géneket, ameddig a virágzás elkezdődik. Ezt megtehetjük úgy, hogy ATH1-promotert alkalmazunk transzgén expressziójának szabályozására, vagy természetes génnel homológ DNS transzkripciójának szabályozására. Ennek megfelelően a találmány külön tárgyát képezi továbbá olyan DNS-konstrukció, amely ATH1promotert tartalmaz heterológ DNS-hez kapcsolva úgy, hogy azt expresszálja növényi sejtekben, valamint a találmány tárgyát képezik ilyen DNS-konstrukcióval transzformált növényi sejtek.
Az ATH1 a vegetatív csúcsmerisztémában expresszálódik, és ezen expresszió leszabályozása egybeesik a virágzásba való átmenettel. ATH1 fokozott mértékű, konstitutív expressziója a virágzásba való átmenet drámai represszióját eredményezi Arabidopsisban és dohányban egyaránt; tehát Arabidopsis esetén a felmagzás elhalasztódik. Ezzel ellentétben az ATH1 repressziója korán virágzó fenotípust eredményez. Eredményeink alapján feltételezzük, hogy az ATH1 funkcióját a GA-bioszintézisen vagy GA-reszponzivitáson keresztül fejti ki. Várakozásaink szerint az ATH1-gén alapjául szolgál egy különösen hasznos, felmagzást szabályozó rendszernek.
Naphosszúság és virágzási fázisba való átmenet
A virágzási fázisba való átmenetet különösen alaposan tanulmányozták Arabidopsis thaliana esetén. Ez a faj a virágzási fázisba való átmenet tanulmányozására szolgáló modellrendszerré vált: genetikai szinten virágzás! időre mutánsok izolálásán keresztül; és molekuláris szinten olyan gének klónozásán keresztül, amelyek termékei a virágzási fázisba való átmenetben játszanak szerepet. Az Arabidopsis tipikus levélrozettás növény, amelyben a vegetatív levelek egymáshoz közel helyezkednek el a szárcsomók (nóduszok) közötti rövid távolság miatt. A virágzási fázisba való átmenetben az újonnan képződő szártagok gyorsan megnyúlnak („felmagzás”). A legtöbb Arabidopsis-ekotípusban a nap hossza a legfontosabb meghatározó tényező a virágzási fázisba való átmenethez. Az Arabidopsis fakultatív hosszú nappalos (LD) növény, ami azt jelenti, hogy a virágzási fázisba való átmenetet a hosszú nappalok siettetik (16 óra fény/8 óra sötét ciklus), de nincsen kényszerű előfeltétele. Hosszú nappalos (LD) körülmények között a virágzási fázisba való átmenet gyorsan iniciálódik, és csak néhány rozettalevél képződik (körülbelül 7 levél, 16-20 nap alatt a Col-O-ekotípusban). Rövid nappalokon növesztve (SD), például 8 óra fényen/16 óra sötétben, a virágzásba való átmenet sokkal tovább tart (körülbelül 60 napig), és teljes lombleveles rozetta alakul ki, amely több mint körülbelül 30 rozettalevéllel rendelkezik (Col-0ekotípus).
A gibberellinsav (GA) és a virágzási fázisba való átmenet
Régóta ismert, hogy GA-kezelés elősegíti a virágzási fázisba való átmenetet különböző növényfajokban. A legtöbb faj, amelyben az alkalmazott GA képes virágzás indukálására, hosszú-nappalos növény vagy hidegigényes növény, és közülük sok normálisan rozettaként nő indukció nélküli körülmények között. Ezenkívül számos kísérlet alapján feltételezzük, hogy az endogén GA-szint szerepet játszik a virágzásba való át5
HU 225 301 Β1 menet szabályozásában: virágzásba való átmenetet indukáló körülmények hatásukat az endogén GA-szint emelkedésén keresztül, valószínűleg a csúcsmerisztémánál vagy annak közelében fejtik ki.
GA-bioszintézisben detektív (GA-sorozat) vagy erre a hormonra inszenzitív (GAl-sorozat) Arabidopsis-mutánsok későn virágzó fenotípust mutatnak nemindukáló körülmények között, és a szigorú GA1-3-mutáns induktív körülmények között szintén késői virágzású (Wilson és munkatársai, 1992).
GA szerepe a virágzásba való átmenet
ATH1 -szabályozásában
Azt vizsgáltuk, hogy exogén GA képes-e legyőzni a konstitutív ATH1-expresszió inhibitorhatását dohányban. Feltűnő módon a GA-permetezés képes volt helyreállítani a későn virágzó fenotípust ΑΤΗ-1-et konstitutívan expresszáló dohányban. A GA szerepét a csökkent szártagmegnyúlás is mutatta ΑΤΗ-1-et expresszáló dohányban. Ezen eredmények alapján feltételezzük, hogy az ATH1 a GA-bioszintézis vagy alternatívaként GA-ra való reszponzibilitás represszoraként működik. A virágzásba való átmenetre kifejtett ATH1-túltermelés domináns hatását különféle haszonnövényekben kombinálhatjuk GA-adagolással ezen hatás megfordítása céljából. Ez különösen azért érdekes, mert az ATH1 szabályozatlan expressziója nem vezet pleiotrop fenotípusokhoz, és a túltermelő fenotípus teljesen visszafejleszthető. A teljes helyreállítás azt jelenti, hogy nem lesznek problémák az ATH1-transzformánsok reprodukcióját és szaporodását illetően: így a transzgenikus vonalak fenntartása (amely súlyos probléma lehet virágzó mutánsok esetén) visszaszorul. GA-átkapcsolást alkalmazva a növények bármikor visszaalakíthatok a vad típusú fejlődési állapotba, a növények normálisan virágzanak, és normálmagkészletet hoznak.
Ennek megfelelően a találmány további tárgyát képezi ATH1 túltermelésének gátlása genetikailag módosított növényekben a találmány szerinti gibberellines kezeléssel, például gibberellin A3-mal vagy A4/A7-tel.
A terméslndex fokozása
Ha a növények szorosan egymás mellett növekednek, „árnyékelkerülési szindróma” nyilvánul meg, amelyben a növények a szomszédjukról visszaverődő távoli vörös sugárzásra reagálnak. Ennek legnyilvánvalóbb eredménye a szárak és a levélnyelek (petiolusok) hosszanti növekedésének gyors és drámai fokozódása a levélnövekedés, tárolószervek termelésének és a reproduktív fejlődés rovására. Ismeretes, hogy phyA-gének dohányban való túltermeltetésével elnyomható az „árnyékelkerülési” válasz, fokozott termésindexet eredményezve (Robson és munkatársai, 1996). A termésindexet a teljes biomasszára vonatkoztatott levélbiomasszaként fejezzük ki. ATH1 túltermeltetése dohányban a szárnövekedés csökkenését okozza, míg a levélnövekedés és a változatlanul maradt levelek száma még növekszik is a vad típushoz viszonyítva. ATH1-et túltermelő fenotípusok és phyA-t túltermelő fenotípusok hasonlóak, ami alapján ATH1 túltermeltetését alkalmazhatjuk a termésindex növelésére haszonnövényekben.
A találmány szerinti megoldást az alábbi példákra és kísérletekre hivatkozva magyarázzuk tovább, amelyek a találmány szerinti megoldást bizonyos szempontokból szemléltetik, valamint az ábrákra hivatkozva, amelyekben:
az 1. ábrán megadjuk az ATHI-cDNS DNS-szekvenciáját;
a 2. ábra a pWP90-plazmid ábrázolása; a 3. ábra a pMOG23-plazmid ábrázolása; a 4. ábra a pVDH275-plazmid ábrázolása; az 5. ábrán lévő oszlopdiagram az ATH1 konstitutív expressziója által okozott törpenövekedést mutatja 90 napos dohánynövényeken;
a 6. ábra görbéi gibberellinkezelés hatását mutatják ATH1-et túltermelő dohánynövények magasságára;
a 7. ábrán lévő oszlopdiagram ATH1-et kismértékben és nagymértékben expresszáló növények virágzási idejét (a képződött rozettalevelek számaként kifejezve) mutatja vad típusú Arabidopsisboz hasonlítva (C24-ekotípus).
Általános módszerek
Növényanyag és a növények növesztés! körülményei
Vad genotípusként Arabidopsis thaliana Columbia és C24-ekotípusokat alkalmaztunk. Az ATH1-gén a 4. kromoszómán helyezkedik el, az mi431 (96,9 cM) és 06455 (97,9 cM) RFLP-markerek között. A növényi transzformációs kísérletekben Arabidopsis thaliana Columbiát alkalmaztunk vákuuminfiltrációs eljárásban, míg Arabidopsis thaliana C24-et alkalmaztunk gyökértranszformációs eljárásban.
A növényeket növesztés! kamrában növesztettük fluoreszcens fény alatt, 16 óra fotoperiódust 8 óra sötét periódus követett 22 °C állandó hőmérsékleten.
A virágzási idő mérése céljából a magokat nedvességgel átitattuk, és 4 °C-ra helyeztük 4 napig a nyugalmi állapot megszakítása céljából, és azután talajra szórtuk azokat. A csírázó magoncokat az első 1-2 hétre rendszerint csíráztatófedővel letakartuk a dehidratálódás megakadályozása céljából.
Arabidopsis növények transzformálása
Kiméra ATH1-GUS-géneket tartalmazó bináris konstrukciókat és 35S-antiszensz ATH1-géneket transzformáltunk Arabidopsis thaliana C24-ekotípusba, Agrobacterium tumefaciens által közvetített gyökértranszformációval, Valvekens és munkatársai (1988) által leírtak szerint. A transzformánsokat 50 mg/l kanamicint tartalmazó táptalajon szelektáltuk.
Kiméra 35S-ATH1-géneket tartalmazó bináris konstrukciókat transzformáltunk Arabidopsis thaliana Columbia-ekotípusba vákuuminfiltrációs eljárás (Bent és munkatársai, 1994; Bechtold és munkatársai, 1993) alkalmazásával, melyet kissé módosítottunk. A növé6
HU 225 301 Β1 nyékét külön-külön növesztettük 5,5 cm-es cserepekben. A növényeket azután transzformáltuk, amikor az első sziklevelek a másodlagos magburkokon megjelentek.
A megfelelő konstrukciót tartalmazó, 900 ml Agrobacterium tumefaciens tenyészeteket az infiltráció napját megelőző éjszakán növesztettük, a sejteket centrifugálással elkülönítettük, és azonos térfogatú infiltrációs tápközegben felszuszpendáltuk, amelyben 5% szacharóz helyett 2% szacharóz volt. A növényeket úgy infiltráltattuk, hogy az egész rozettát és másodlagos magburkot 10 percre alámerítettük 100 Hgmm vákuum alkalmazásával.
Transzformált magokat 50 mg/l kanamicint tartalmazó táptalajon szelektáltunk.
1. példa
ATH1-expresszié analízise
Totál RNS izolálása
Totál RNS-t De Vries és munkatársai (1988) által leírt módszer szerint izoláltunk a növényekből, melyen kisebb módosításokat végeztünk: (1) a növényi szövetet folyékony nitrogénben, fele térfogat fenol/extrakciós puffer jelenlétében megőröltük, és 65 °C-ra melegítettük vízfürdőn, és (2) az RNS-t etanol/nátrium-acetáttal csaptuk ki a LiCI-os kicsapás előtt és után.
Rnáz-védési vizsgálat
Az ATH1-fágmid Hindlll/Xhol fragmensét pBluescriptSK(-)-ba (Stratagene) klónoztuk, és Hindlll-enzimmel emésztettük T7-RNS-polimeráz-templát előállítása céljából. Az ATH1-RNS-próba megvéd egy 140 nukleotidból álló fragmenst. RNS-próbát T7-RNSpolimeráz (Pharmacia) és puffer alkalmazásával szintetizáltunk, a gyártó utasításai szerint, kivéve azt, hogy 160 pCi [32P]UTP-t (800 Ci/mmol) alkalmaztunk. Az Rnáz-védést 10 pg totál RNS és 10 pg tRNS alkalmazásával végeztük, Sambrook és munkatársai által (1989) leírt eljárás szerint. Az emésztett keverék 600 egység/ml Rnáz-T1-et (Gibco BRL) és 20 pg/ml Rnáz-A-t (Boehringer) tartalmazott. RNS:RNS-hibrideket szekvenáló gélelektroforézissel (6% poliakrilamid/7 M karbamid) vizsgáltuk, és autoradiográfiával tettük láthatóvá.
Kiméra ATH1-GUS-konstrukciók előállítása
Az ATH1-promoterszekvencia körülbelül 1300 nukleonjából álló Spel/Ncol fragmenst izoláltunk. Az Ncol-hasítóhely Klenow-polimerázzal való feltöltése után ezt a fragmenst GUS-gént tartalmazó, pBi101.1 jelű bináris vektor (Jefferson és munkatársai, 1987) egyedi Smal/Xbal hasítóhelyeibe inszertáltuk, így előállítottuk az ATH1-promoter és a GUS-gén közötti transzlációs fúziót. A kiméra gén által kódolt fehérje az ATH1 42 aminosavját tartalmazta GUS-fehérjéhez fuzionálva. A bináris konstrukciót tH 1,4-nek hívtuk. A tH1.4-et kompetens Agrobacterium tumefaciens LBA4404-sejtekbe transzformáltuk (Gelvin és Schilperoort, 1988). Arabidopsis vonalakat (C24-ekotípus) a lentebb leírtak szerint transzformáltunk.
GUS-aktivitás in situ lokalizálása transzgenikus
ATH1-GUS-t tartalmazó Arabidopsis thaliana vonalakban
Magoncokból és növényekből származó szöveteket gyűjtöttünk, és 1-16 óra hosszáig festettük 37 °C-on, 0,5 mg/ml X-Gluc-ot (Biosynth AG) tartalmazó n-dimetil-formamidos oldatban, amely 0,1% Triton Χ-100-at, 0,5 mM K4Fe(CN)6.H2O-ot, 0,5 mM K3Fe(CN)6-t és 50 mM nátrium-foszfát-puffert (pH 7,2) tartalmazott.
Fénymikroszkópos vizsgálatok
X-Gluc-kal való festés után a növényi szöveteket egy éjszakán át fixáltuk 1% glutáraldehidet és 4% formaldehidet és 50 mM nátrium-foszfát-puffert (pH 7,2) tartalmazó oldatban. Ezután a magoncokat vízmentesítettük fokozatosan növekvő etanolkoncentrációt alkalmazó lépésekben: 10%, 30%, 50%, 70%, 90% és 2*100% etanollal. Nagy növényi szöveteket először 1 %-os agarózba (Sigma) ágyaztunk. Az infiltrációt és a beágyazást Technovite 7100-ban (Kulzer, Hereaus) végeztük, a gyártó utasításai szerint. 4 pm-es metszeteket készítettünk egyszer használatos Adams-féle acélkéssel felszerelt, Reichert-Jung típusú rotációs készüléken. A metszeteket desztillált vízben oldott, 0,1 %-os Ruthenium-red (Sigma) alkalmazásával festettük 2 percig szobahőmérsékleten, és „Zeiss Axioskop”-on lefényképeztük „Kodak Professional Ektar 25” filmre.
Magoncokat a fentebb leírtak szerint fixáltunk és vízmentesítettünk. Technovit 7100-at infiltráltattunk 1 napig. Azután a magoncokat celluloid átlátszó fóliából (Amovis), kétoldalú ragasztószalagból, átlátszó fóliából és kétoldalú ragasztószalagból álló konstrukcióra vittük. Ez utóbbi három rétegből egy magoncot tartalmazó, középső régiót kivágtunk. Ezt követően a magoncokat Technovit 7100 oldatba vittük, és a középső régiót egy másik átlátszó fóliával betakartuk. Egy éjszakai, szobahőmérsékleten végbement polimerizáció után a magoncot tartalmazó műanyag lemezhez jutottunk. A lemezbe ágyazott magoncok kivágása céljából a celluloid lapot eltávolítottuk, és a lemezt kivágtuk, amely lehetővé tette a releváns magoncrégiók hosszirányú metszetekre vágását. A metszetekre vágást, festést és fényképezést a fentebb leírtak szerint végeztük.
ATH1-expresszió lokalizálása
Az ATH1-gén expresszióját Rnáz-védési vizsgálat alkalmazásával analizáltuk (Quaedvlieg és munkatársai, 1995). Nagy mennyiségű ATH1-mRNS-t detektáltunk a magoncok korai fejlődési szakasza alatt (2-6 naposán) és érett Arabidopsis növények virágaiban. Az ATH1-génexpresszió celluláris lokalizációját tH1.4 jelű kiméra ATH1-GUS-konstrukció Arabidopsis thalianába való bevitelével határoztuk meg. Különböző szöveteket festettünk meg X-gluc-kal, és teljes, tárgylemezre vitt preparátumokat és szövetmetszeteket készítettünk a GUS-aktivitás láthatóvá tételére (lásd lentebb).
ATH1-expresszió a vegetatív fejlődés alatt
Fényen növesztett, 5 napos magonc sarjcsúcsa sima és kétrétegű hártyából áll, körbezárva a közvetle7
HU 225 301 Β1 nül alatta lévő törzset. Ebben a stádiumban a merisztéma elkezdi kifejleszteni az első levélpár primordiumát (Mischke és Brown, 1965).
Azokban a növényekben, amelyeket tH1.4-gyel transzformáltunk, magas GUS-aktivitás volt a sarjcsúcsban. A sarjcsúcs metszetekre vágása kimutatta, hogy magas GUS-aktivitás volt a sarjcsúcsmerisztéma mindhárom rétegében, és átnyúlt a szubapikális régión, továbbhaladva lefelé, ahol a sziklevél alatti szár vaszkuláris szálai elágaznak a sziklevelekbe. Magas GUS-aktivitás volt az első levélpár primordiumában is.
ATH1-expresszió a virágzásba való átmenet és virágzás kezdeti szakasza alatt
A virágzás kezdeti fázisában először a sarjcsúcsmerlsztémából kifejlődik a szár, a szárlevelek és másodlagos virágkezdemények. Amint a virágzat kifejlődése előrehalad, a virágmerisztéma virágprimordiumot hoz létre. Azokban a növényekben, amelyeket tH1.4-gyel transzformáltunk, a GUS-aktivitás leszabályozódott a virágmerisztémában az átmeneti fázis alatt. Nem volt detektálható GUS-aktivitás a merisztémában. Kis mennyiségű GUS-aktivitás volt a levélerezet zónájában. Később, amikor a virágok kialakultak, GUS-aktivitás a fiatal virág különböző részeiben (vacokban, azaz receptákulumban, csészelevelekben, azaz sepalumban és a porzólevelek, azaz stamina vaszkuláris szövetében) jelen volt.
2. példa
ATH1 nyitott leolvasási fázis és promoterek fúzióinak előállítása
Az ATH1-cDNS-t a jól ismert és kereskedelemben rendelkezésre álló pBluescript SK(-)-vektor (Stratagene) egyedi EcoRI/Xhol restrikciós hasítóhelyébe klónoztuk.
2.1 ATH1 nyitott leolvasási fázis és
CaMV-35S-promoter fúziójának előállítása
Az ATH1-cDNS-szekvencia 1573 nukleotidját tartalmazó BamHI/SnaBI fragmensét (a BamHI-hasítóhelyet PCR-rel hoztuk létre, 35 nukleotidra szintézisirányban a transzlációs starthelytől) izoláltuk és a pWP90vektor egyedi BamHI/Smal klónozóhelyébe inszertáltuk, amely vektor dupla 35S-CaMV-promotert és egy nos-terminátort tartalmaz (lásd a 2. ábrát), így a dupla 35S-CaMV-promoter és az ATH1-cDNS közötti transzkripciós fúzióhoz jutottunk. Ezt a konstrukciót cH1.24-nek hívtuk, amelyet azután Sstl/EcoRV restrikciós enzimekkel hasítottunk, azután az így kapott Sstl/EcoRV inszertet a pMOG23 bináris vektor (lásd
3. ábra) egyedi Sstl/Smal restrikciós helyébe inszertáltuk. A bináris konstrukciót tH1.2-nek hívtuk. A tH1,2-t kompetens Agrobacterium tumefaciens pGV2260-sejtekbe (Caplan és munkatársai, 1985) transzformáltuk. Arabidopsis vonalakat (Col-O-ekotípus) vákuuminfiltrációval transzformáltunk a lentebb leírtak szerint.
2.2 Antiszensz ATH1 leolvasási fázis és
CaMV-35S-promoter fúziójának előállítása
Az ATH1-cDNS-szekvencia körülbelül 1830 nukleotidját tartalmazó BamHI/SnaBI fragmensét izoláltuk és a pWP90-vektor egyedi Smal/EcoRI klónozóhelyébe inszertáltuk (lásd a 2. ábrát), így a dupla 35S-CaMVpromoterből és antiszensz ATH1-fázisból álló transzkripciós fúzióhoz jutottunk. Az eredményül kapott konstrukciót cH1.22-nek hívtuk. A cH1.22-ből származó EcoRV/Sstl inszertet azután a pMOG23 bináris vektor (MOGEN) (lásd 3. ábra) egyedi Smal/Sacl restrikciós helyébe inszertáltuk. Ezt a bináris konstrukciót tH1.1-nek hívtuk, melyet kompetens Agrobacterium tumefaciens LBA4404-sejtekbe transzformáltunk. Arabidopsis vonalakat (C24-ekotípus) a lentebb leírtak szerint transzformáltunk.
2.3 ATH1 nyitott leolvasási fázis és hősokkpromoter fuzionálása
PCR-mutagenezis alkalmazásával egy további BamHl-hasítóhelyet hoztunk létre a pTT19-ben, amely vektor promotert, vezetőszekvenciát és Arabidopsis thaliana Hasp18.2 jelű hősokkgén 77 nukleotidból álló kódolószekvenciáját tartalmazta (Takahashi és Komeda, 1989). További BamHI-hasítóhely van a Hsp18.2 nem transzlálódó vezetőszekvenciában, a Hsp18.2 transzlációs starthelytől -710. nukleotidnál.
BamHI-restrikciós emésztéssel eltávolítottuk az 5’ nem transzlálódó vezetőszekvenciát és a Hsp18.2 kódolószekvencia 77 nukleotidját. Az így megmaradt konstrukciót vezetőszekvencia nélküli pTT19-nek hívtuk. Ezen vezetőszekvencia nélküli pTT19-et (amely csak Hsp18.2-promoterszekvenciát tartalmazott) a teljes ATH1-cDNS-szekvenciát tartalmazó BamHI/EcoRI fragmenshez fuzionáltuk, amely Hsp18.2-promoterből, ATH1-5’ nem transzlálódó vezetőszekvenciából és kódolószekvenciából álló transzkripciós fúziót eredményezett. A BamHI- és az EcoRI-hasítóhelyeket PCRmutagenezissel állítottuk elő, amely egy BamHI-restrikciós helyet eredményezett az ATH1-cDNS-szekvencia kezdeténél és egy EcoRI-restrikciós helyet közvetlenül a TAA stopkodontól szintézisirányban. Az így kapott HindlII/EcoRI fragmenst a pWP90-vektor (lásd 2. ábrát) egyedi HindlII/EcoRI restrikciós hasítóhelyébe inszertáltuk, és ezt az új konstrukciót azután részlegesen emésztettük Hindlll és EcoRV restrikciós enzimekkel. A legnagyobb HindlII/EcoRV restrikciós fragmenst azután HindlII/Smal-gyel hasított, pBIN19 jelű bináris vektorba (Frisch és munkatársai, 1995) inszertáltuk. Ezt a konstrukciót HspH1-nek hívtuk.
Hsp18.2-promotert és vezetőszekvencia nélküli ATH1 kódolószekvenciát tartalmazó transzkripciós fúziót is előállítottunk. Az ATH1-cDNS-ben PCR-mutagenezissel létrehoztunk egy extra BamHI-hasítóhelyet a transzlációs starthelytől közvetlenül szintézisiránnyal szemben. Ezen BamHI-hely emésztése az ATH1cDNS-ben lévő egyedi Xhol-hely emésztésével kombinálva egy körülbelül 680 nukleotidból álló fragmenst eredményezett, amely az ATH1 kódolószekvenciát tartalmazta. Ezt a 680 nukleotidból álló fragmenst kicseréltük egy körülbelül 980 nukloetidból álló nagy fragmensre, amelyhez úgy jutottunk, hogy a HspH1-et BamHI/Xhol restrikciós enzimekkel emésztettük. Ez eredményezte a HspH1B-t, amely vezetőszekvencia nélküli ATH1 kódolószekvenciát és a Hsp18.2-promotert tartalmazó transzkripciós fúzió.
HU 225 301 Β1
A HspH1-et és HspH1B-t egyaránt kompetens Agrobacterium tumefaciens LBA4404-sejtekbe transzformáltuk. Arabidopsis vonalakat (C24-ekotípus) a lentebb leírtak szerint transzformáltunk.
2.4 ATH1 nyitott leolvasási fázis és borsóból származó plasztocianinpromoter fúziójának előállítása Borsóból származó plasztocianin és ATH1 kódolószekvencia közötti transzkripciós fúziót lehet előállítani úgy, hogy ATH1 kódolószekvenciát pVDH275 (Pwee és Gray, 1993; Last és Gray, 1989) (lásd még a 4. ábrát) egyedi BamHI és Sáli restrikciós helyeibe inszertálunk. Az ATH1 kódolószekvenciájába további Sáli (közvetlenül az ATH1 start-ATG-től szintézisiránnyal szemben) és BamHI (közvetlenül az ATH1 stop-TAA után) restrikciós helyeket lehet létrehozni PCR-mutagenezissel. Az így kapott konstrukcióban az ATH1 kódolószekvencia borsóból származó plasztocianinpromoter és Agrobacteriumból származó nos-terminátor közé van inszertálva, amely konstrukciót Agrobacterium tumefaciens sejtekbe lehet transzformálni, azt követően növényt lehet vele transzformálni.
Extra ATH1 -kópiák bevitele Arabidopsisba
Extra ATH1-kópiákat lehet bevinni Arabidopsis növényekbe úgy, hogy transzformáljuk azokat extra, ATH1promotert és ATH1 kódolószekvenciát tartalmazó ATH1-lokuszokkal. Ezt úgy lehet végrehajtani, hogy az ATH1-cDNS-ből származó, körülbelül 1000 nukleotid nagyságú SnaBI/Ncol fragmenst fuzionáljuk a pBI101.1-ből származó, körülbelül 250 nukleotid nagyságú Sstl/EcoRI restrikciós fragmenshez, amely Agrobacteriumból származó nos-terminátort tartalmaz (Jefferson és munkatársai, 1987). Az így kapott fragmenst az ATH1 genomi kiónból származó, körülbelül 3,5 kb nagyságú Ncol-restrikciós fragmenshez (Quaedvlieg és munkatársai, 1995) fuzionálhatjuk. Az így kialakított körülbelül 4750 nukleotid nagyságú, ATH1-promotert, ATH1 kódolószekvenciát és nos-terminátort tartalmazó Ncol/EcoRI fragmenst inszertálhatjuk Ncol/EcoRI-gyel hasított pMTL23 jelű klónozóvektorba (Chambers és munkatársai, 1988). Az eredményül kapott konstrukció Stul/EcoRI restrikciós fragmensét azután EcoRI/Smal enzimekkel hasított pMOG23 jelű bináris vektorba inszertálhatjuk, Agrobacterium-sejteket transzformálhatunk, azt követően növénytranszformációra alkalmazhatjuk azt.
3. példa
Virágzást jellemzők befolyásolása CaMV-35S-promoter/ATH1-gén fúziójának alkalmazásával Virágzást idő mérése
A virágzási időt úgy mértük, hogy megszámoltuk a levelek (sziklevelek nélkül) számát a rozettában akkor, amikor a virágbimbók láthatók voltak. A levélszám és a virágzási idő közötti szoros összefüggést korábban már kimutatták (Koorneef és munkatársai, 1991; Bagnall, 1993).
ATH1 túltermeltetése késői virágzáshoz vezet
Az ATH1 növényi fejlődésben betöltött szerepébe való mélyebb betekintés céljából a teljes hosszúságú
ATH1-cDNS-szekvenciát karfiolmozaik-vírusból származó, konstitutív 35S-promoterhez fuzionáltuk, és az így előállított 35S::ATH1 kiméra gént Arabidopsis Col-0-ekotípusba transzformáltuk vákuuminfiltrációs eljárással. Hat, egymástól független, primer transzformánshoz jutottunk.
Valamennyi transzgenikus vonalon önbeporzást végeztünk. Az egyes független, transzgenikus vonalakból 40 egyedi magot csíráztattunk talajon, és a megváltozott fenotípusra osztályoztuk vad típusú növényekhez hasonlítva. Hat vonalból négy megváltozott fenotípust mutatott virágzási időre vonatkozóan. Ezen vonalak közül háromban az összes növény későn virágzott (körülbelül 14 rozettalevél volt a virágzásig, míg vad típusú Col-O-növényekben körülbelül 10 rozettalevél volt). A fennmaradt vonalban lévő növények körülbelül 85%-a ugyanilyen későn virágzó fenotípust mutatott, míg a növények 15%-a korán virágzó fenotípust mutatott (körülbelül 7 rozettalevél alapján), amely a tesztek alapján az ATH1-RNS hiányának tulajdonítható. Ezek a korán virágzó növények szintén későn virágzó fenotípust mutatnak, gyakran tökéletlen virágzattal és mutáns virágszervekkel.
4. példa
Korai virágzás ATH1 antiszensz expressziójával
ATH1 ektopikus expressziójához hasonlóan az ATH1-génfunkció gátlását szintén alkalmazhatjuk a virágzási idő befolyásolására. A génfunkció gátlását antiszensz ATH1 konstitutív túltermeltetésével értük el.
Teljes hosszúságú, antiszensz ATH1-cDNS-t fuzionáltunk karfiolmozaik-vírusból származó, konstitutív 35S-promoterhez, és az így előállított 35S::antiszensz ATH1-kiméragént Arabidopsis C24-ekotípusba transzformáltuk Valvekens-féle gyökértranszformációs eljárás szerint. Huszonkét független transzformánshoz jutottunk, és valamennyin önbeporzást végeztünk. Az egyes vonalakból 10 egyedi magot csíráztattunk talajon, és a megváltozott fenotípusra osztályoztuk C24 vad típusú növényekhez hasonlítva. Ezen vonalak közül ötben a növények korán virágzó fenotípust mutattak: a virágzás akkor kezdődött, amikor hat-tíz rozettalevél fejlődött ki, míg vad típusú növényeken körülbelül húsz levél fejlődött ki.
5. példa
Virágzási idő megváltoztatása Nicotiana tabacumbanATHI túltermeltetésével
Az ATH1-cDNS Arabidopslsban való ektopikus túltermeléséhez (karfiolmozaik-vírusból származó 35S-promoter által vezérelve) hasonlóan ez dohányban (Nicotiana tabacum cv. Samsun) is a virágzási idő késéséhez vezetett vad típusú dohányhoz hasonlítva. 35S::ATH1-dohánynövényekben a virágzás heteket vagy hónapokat késett. Ezek a növények szintén törpenövekedésűek voltak. Ez a törpenövekedés a virágzó fenotípushoz hasonlóan nyilvánvalóan összefüggésben van a transzgénexpresszió mértékével. A legszélsőségesebb esetben a növények egyáltalán nem virágoztak, és normálmagasságuknak csak egyötödét érték el, míg kevésbé szélsőséges esetekben a virág9
HU 225 301 Β1 zás csak egy vagy két hetet késett, és a magasságuk a normálérték körülbelül négyötödét érte el. A levélszám és alak normális volt ezen transzgenikus növény mindegyikében.
6-8. példák
GA hatása a találmány szerinti transzgenikus növényekre
A fentebb leírtak szerint ATH1 túltermeltetése hatékonyan represszálja a felmagzást (virágzás indukcióját). Feltételeztük, hogy az ATH1 a GA-szintézis vagy a GA-ra reszponzív folyamatsor represszora lehet (az elsőt feltételezzük). Az alábbi példák ezt a hipotézist demonstrálják és támasztják alá.
Általános módszerek
Dohánynövényeket (Nicotiana tabacum L. cv. Samsun NN) transzformáltunk úgynevezett levéllemez-eljárás (Horsch és munkatársai, 1985) alkalmazásával. Transzgenikus növényeket 300 pg/ml kanamicint és 2% szacharózt tartalmazó MS-táptalajon (Murashige és Skoog, 1962) szelektáltunk. A növényeket talajra vittük, és azután üvegházban növesztettük azokat 22 °C-on, 16 óra nappali világosságban, szükséges esetben ezt kiegészítettük mesterséges világítással. A gibberellin (GA) hatásait úgy teszteltük, hogy 100 mg/l Triton Χ-100-at tartalmazó 100 mM-os GA3-at levélen keresztül (permetezéssel) alkalmaztunk. A kontrollnövényeket csak 100 mg/l Triton Χ-100-at tartalmazó oldattal permeteztük be. A permetezés a vetés után 60 nappal kezdődött, amikor a vad típusú növények körülbelül 5 cm magasak voltak, és a 35SCaMV::ATH1-et tartalmazó növények körülbelül
2,5 cm magasak voltak, és a permetezést 3-4 napos intervallumonként folytattuk. Megmértük a növénymagasságot minden 3-4. napon, és ezt a virágzás kezdetéig folytattuk, amit a virágkezdemények megjelenése alapján határoztunk meg.
6. példa
Szensz ATH1 konstitutív túltermeltetése késleltetett virágzáshoz vezet 6.1 ATH1 túltermeltetése dohányban Az ATH1-gén transzgenikus növényekben való konstitutív expressziója céljából kódolórégióját 35S-CaMV-promoter vezérlete alá helyeztük, és az így kapott konstrukciót dohányba (Nicotiana tabacum L. cv. Samsun NN) transzformáltuk. Negyven független kanamicinrezisztens növényhez jutottunk, amelyek közül csak öt mutatott detektálható transzgénexpressziót. Az ATH1-mRNS mennyisége a magas szinttől (H1OE#4, #10 és #30 növények) a közepes/alacsony szintig (H1OE#35 és #37 növények) változott. Az ATH1 expressziójának mértékétől függően ezen növények virágzása heteket-hónapokat késett vad típusú növényekhez hasonlítva, amelyek 3-5 hónap múlva virágoztak az évszaktól függően. A legszélsőségesebb esetben (H1OE#4) a növények egyáltalán nem virágoztak az elöregedésig (több mint 15 hónappal a vetés után). A nagymértékű ATH1-expressziót mutató
H1OE#10 és #30 növények 15 hónap után virágoztak, míg a közepes/kismértékű túltermelést mutató H1OE#35 és #37 növények 6 hónapig nem virágoztak. A megváltozott virágzási Idejű fenotípussal rendelkező, ATH1-et túltermelő növények továbbá csökkent szárhosszúságot mutatnak, amely törpe növényeket eredményezett. Nyilvánvaló összefüggés van a fenotípus törpenövekedésének mértéke és a transzgénexpreszió mértéke között (lásd 5. ábrát). A legszélsőségesebb esetben a növények normálmagasságuknak csak egyötödét érték el. A levélszám változó volt, a vad típus kétszeresétől a normálig valamennyi transzgenikus növényben.
6.2ATH1 túltermelése megfordítható GA3-mal ATH1-et túltermelő fenotípust vissza lehet alakítani vad típusú fenotípussá GA3 alkalmazásával. Ha GA3-at 6.1 példa szerinti dohánynövények levelein alkalmazunk (100 mM GA3-mal permetezünk 3-4 napos intervallumonként), a vad típusú szárhosszúság tökéletes helyreállítását eredményezi (6. ábra). Ez a későn virágzó fenotípusra is igaz (az adatokat nem mutatjuk be).
7. példa
ATH1 túltermeltetése Arabidopsisóan
Az ATH1 növényi fejlődésben betöltött szerepébe való mélyebb betekintés céljából a teljes hosszúságú ATH1-cDNS-szekvenciát karfiolmozaik-virusból származó, konstitutív 35S-promoterhez fuzionáltuk, és a 35S::ATH1 kiméra gént Arabidopsisba transzformáltuk vákuuminfiltrációs eljárással. Hat, egymástól független, primer transzformánshoz jutottunk, és valamennyi transzgenikus vonalon önbeporzást végeztünk. Az egyes független, transzgenikus vonalakból 40 egyedi magot csíráztattunk talajon, és a megváltozott fenotípusra osztályoztuk vad típusú növényekhez hasonlítva. Hat vonalból négy megváltozott fenotípust mutatott virágzási időre vonatkozóan. Ezen vonalakból származó magok nem csíráztak jól, de ha mégis, megálltak a csíranövény-stádiumban. Mindkét jelenséget le lehetett küzdeni úgy, hogy a növényeket 10-5 M GA3-at tartalmazó növesztési táptalajra vittük, és ezen a táptalajon növesztettük azokat három napig. Ha helyreállítottuk és talajra vittük azokat, normálisan fejlődtek, kivéve a későn virágzó fenotípust. Rövid nappalos körülmények között a transzgenikus növények sokkal több rozettalevelet növesztettek (vegetatív levelek), mint a vad típusú növények (körülbelül 40 rozettalevél volt 100 nappal a csírázás után, és a növények még nem virágoztak, míg vad típusú növényekben körülbelül 30 rozettalevél képződött a virágzásig). Hosszú nappalos körülmények között ezen növények többségében a generatívból a vegetatív állapotba való részleges visszatérés zajlik le, melyet föld feletti rozetták (vegetatív levelek) kialakulása mutat a virágszáron. Egy extra kópia ATH1-cDNS-t Hsp18.2 hősokk promoter vezérlete alatt tartalmazó (C24-ekotípushoz tartozó) növények (HspH1B-növények) szintén későn virágzó fenotípust mutatnak. Sőt, hősokk nélkül (ismeretes, hogy ennek a promoternek van egy alapaktivitása indukció nélkül) ilyen konstrukciót tartalmazó növények sokkal később virágoznak
HU 225 301 Β1 hosszú nappalos körülmények között, mint a vad típusú növények (30,5 rozettalevél képződött vad típusban, viszont 61 rozettalevél képződött HspHIB-növényekben, lásd a 7. ábrát).
8. példa
Korai virágzás ATH1 antiszensz expressziójával
Az ATH1 ektopikus túltermeléséhez hasonlóan az ATH1-génfunkció megszüntetése szintén betekintést nyújt az ATH1 növényi fejlődésben betöltött szerepébe. A génfunkció megszüntetését antiszensz ATH1 konstitutív túltermeltetésével értük el. Teljes hosszúságú antiszensz ATH1-cDNS-t fuzionáltunk karfiolmozaik-vírusból származó, konstitutív 35S-promoterhez, és a 35S::antiszensz ATH1 kiméra gént Arabidopsis C24-ekotípusba transzformáltuk Valvekens-féle gyökértranszformációs eljárás szerint. Huszonkét független transzformánshoz jutottunk, és valamennyin önbeporzást végeztünk. Az egyes vonalakból 10 egyedi magot csíráztattunk talajon, és a megváltozott fenotípusra osztályoztuk C24 vad típusú növényekhez hasonlítva. Ezen vonalak közül ötben a növények korán virágzó fenotípust mutattak: a virágzás akkor kezdődött, amikor tíz rozettalevél fejlődött ki, míg vad típusú növényekben körülbelül harminc levél fejlődött ki (lásd 7. ábrát).
9. példa
Árnyékelkerülési válasz
Ha a növények szorosan egymás mellett növekednek, „árnyékelkerülési szindróma” nyilvánul meg, amelyben a növények a fény vörös/távoli vörös csökkent arányára reagálnak amiatt, mert a levéllomb kiszűri a vörös fényt. Ennek eredménye a szárak és a levélnyelek (petiolusok) hosszanti növekedésének gyors és drámai fokozódása a levélnövekedés, tárolószervek termelésének és a reproduktív fejlődés rovására, amely csökkent termésindexet okoz (a termésindexet a teljes biomasszára vonatkoztatott levélbiomasszaként fejezzük ki).
Feltételezések szerint az árnyékelkerülési választ túlnyomórészt fitokróm-B közvetíti, és kimutatták, hogy a fitokróm túltermelése eliminálja az árnyékelkerülési választ, amely szántóföldön növesztett dohány fokozott termésindexét eredményezi (Robson és munkatársai, 1996).
Fitokróm-B hiánya szintén az árnyékelkerülési válasz elvesztéséhez vezet, sőt, induktív körülmények között ez a szármegnyúlás csökkenését eredményezi nem induktív körülményekhez hasonlítva.
Laboratóriumban az árnyékelkerülési választ okozó helyzetet úgy modellezhetjük, hogy folytonos fehér fényhez (Wc) különböző arányban hozzáadunk távoli vörös fényt (Frc). Ilyen körülmények között vad típusú Arabidopsis növények (C24 wt) tipikus árnyékelkerülési választ mutattak [megnyúlt hipokotil szárak (Wc+Frc)ben, csak Wc-ben nőtt hipokotil szárhoz viszonyítva], míg árnyékelkerülési választ nem mutató, fitokróm-B fotoreceptormutánsok ellentétes választ adtak (hipokotil szár hosszúság csökkenése). Az antiszensz ATH1-növényeken szintén csökkent a hipokotil szár hosszúság, és a legszigorúbb antiszensz növényeken (mint ATH1#3) ez a csökkenés hasonló volt phyB-mutánsok magjánál megfigyeltekhez. Tehát levonhatjuk azt a következtetést, hogy aktív fitokróm-B-hiányhoz hasonlóan az Ath1 az árnyékelkerülési válasz elvesztését eredményezi.
Antiszensz ATH1-növények (mint ATH1), C24 vad típusú növények (C24 wt) és a phy-B fotoreceptormutáns (phyB) árnyékelkerülési vizsgálatának eredményeit az alábbiakban bemutatjuk. A magoncokat 2 napig növesztettük folytonos fehér fényen, melyet 4 napos növesztés követett ugyanilyen fényben, vagy 4 napig távoli vörös fénnyel kiegészített fehér fényben. A hipokotil szárhosszúságot 6 napos növesztés után megmértük. Az alábbi eredményeket kaptuk.
C24 wt Wc = hipokotil szár hossza 5,5 mm
Wc+Frc = hipokotil szár hossza 7,5 mm
PhyB Wc = hipokotil szár hossza 9,5 mm
Wc+Frc = hipokotil szár hossza 7,3 mm
Antiszensz Wc = hipokotil szár hossza 9,0 mm
ATH1#3 Wc+Frc = hipokotil szár hossza 5,0 mm
Antiszensz Wc = hipokotil szár hossza 9,8 mm
ATH1#7 Wc+Frc = hipokotil szár hossza 8,0 mm
Antiszensz Wc = hipokotil szár hossza 7,5 mm
ATH1#23 Wc+Frc = hipokotil szár hossza 7,0 mm
Hivatkozások jegyzéke Bagnall, 1993: Ann. Bot. 71:75-83 Bechtold etal., 1993: C. R. Acad. Sci. Paris,
Life Sciences 316:1194-1199 Bent etal., 1994: Science 265:1856-1960 Caplan etal., 1985: J. Bacteriology 161:655-664 Chambers et al., 1988: Gene 68:139-149 Frisch etal., 1995: Plánt Mól. Bioi. 27:405-409 Gelvin and Schilperoort, 1988: Plánt Molecular Biology Manual: Dordrecht: Kluwer Academic Publisher. Jefferson et al., 1987: EMBO J. 6:3901-3907 Koorneef ef a/., 1991: Mól. Gén. Génét. 229:57-66 Lastand Gray, 1989: Plánt Mól. Bioi. 12:655-666 Mandel and Yanofski, 1995: Natúré 377:523-524 Putteril etal., 1995: Cell 80:847-857 Pwee and Gray, 1993: Plánt J. 3:437-449 Quaedvlieg etal., 1995: The Plánt Cell 7:117-129 Shannon and Meeks-Wagner, 1991: The Plánt Cell: 877-892
Takahashi and Komeda, 1989: Mól. Gén. Génét. 219:365
Takahashi etal., 1992: Plánt J. 2:751-761 Weigel and Nilsson, 1995: Natúré 377:495-500 Horsch, R., Fry, F., Hoffman, N., Eichholtz, D., Rogers, S. and Fraley, R. (1985). A simple and generál method fór transferring genes intő plants. Science 227, 1229-1231.
Murashige, T. and Skoog, F. (1962). A revised médium fór rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plánt. 15, 473-479.
Robson, P. R. H., McCormac, A. C., Irvine, A. S., and Smith, H. (1996). Genetic engineering of harvest index in tobacco through overexpression of a phytochrome gene. Natúré Biotechnology 14(8), 995-998.
HU 225 301 Β1
Wilson, R. N., Heckman, J. W., and Sommerville, C. R. (1992). Gibberellin is requirad fór flowering in Arabidopsis thaliana under short days. Plánt. Phys. 100, 403-408.
Claims (4)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás virágzás módosítására növényekben, azzal jellemezve, hogy a növényeket ATH1-génterméket 10 kódoló, növényekben működőképes promoter által vezérelt, teljes vagy részleges DNS-szekvenciát tartalmazó konstrukcióval transzformáljuk.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a virágzási folyamatot a növények ATH1-fehérje termelődését gátló konstrukcióval történő transzformálásával elősegítjük.
- 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ATH1-gén által termelt RNS-sel antiszensz RNS expresszálására alkalmassá tett konstrukciót alkalmazunk.
- 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a virágzási folyamatot a növények rekombináns ATH1-fehérje termelődését elősegítő konstrukcióval történő transzformálásával késleltetjük.HU 225 301 Β1Int. Cl.: C12N 15/82O 0 Ο Η Ο Εχ O © cN (J oo E-< xpU H e> Η Ο (MΠ *S 1 e § < η < Ex ExΟ Η o <© Ex «-< 0
o u o * í o 0 o ex o Εχ o © < CM ζ J © Εχ xp < O < © n < xj« Λ d χρ Ex © O © 0 © O < ° Εχ o Ex O Γ* 0 n Ex cn Ex © f-l 0 CN Ex cn 0 m uEx υΕχ o<ΕχUEx ©© onΕχ s§ExOΕχ laExExUExEx <ΕχExOO o 0 m u
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9709789.3A GB9709789D0 (en) | 1997-05-14 | 1997-05-14 | Plant gene constructs and their use |
| GBGB9727458.3A GB9727458D0 (en) | 1997-12-30 | 1997-12-30 | Plant gene constructs and their use |
| PCT/IB1998/000821 WO1998051800A1 (en) | 1997-05-14 | 1998-05-14 | Plant gene constructs and their use |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP0001909A2 HUP0001909A2 (hu) | 2000-09-28 |
| HUP0001909A3 HUP0001909A3 (en) | 2002-04-29 |
| HU225301B1 true HU225301B1 (en) | 2006-09-28 |
Family
ID=26311533
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0001909A HU225301B1 (en) | 1997-05-14 | 1998-05-14 | Plant gene constructs and their use |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6864051B1 (hu) |
| EP (2) | EP1647598A1 (hu) |
| AR (1) | AR015667A1 (hu) |
| AT (1) | ATE311454T1 (hu) |
| AU (1) | AU753726B2 (hu) |
| CA (1) | CA2288641A1 (hu) |
| DE (1) | DE69832600T2 (hu) |
| DK (1) | DK0981621T3 (hu) |
| ES (1) | ES2255158T3 (hu) |
| HU (1) | HU225301B1 (hu) |
| NZ (1) | NZ500737A (hu) |
| WO (1) | WO1998051800A1 (hu) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ524131A (en) * | 2000-08-18 | 2005-03-24 | Advanta Seeds B | Ectpoic expression of the homeobox transcription factor Ath1 in genetically modified herbicide resistant grasses to delay, inhibit or reduce flowering |
| DE10043902A1 (de) * | 2000-09-06 | 2002-03-14 | Max Planck Gesellschaft | Modifizierung des Phänotyps von Pflanzen durch ektopische Expression von Homöoboxgenen |
| RU2010137785A (ru) * | 2008-02-12 | 2012-03-20 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи (US) | Доминантная мутация и ген скороспелости у подсолнечника (helianthus annuus) |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5744693A (en) * | 1992-10-02 | 1998-04-28 | California Institute Of Technology | Plants having altered floral development |
| GB9422083D0 (en) * | 1994-11-02 | 1994-12-21 | Innes John Centre | Genetic control of flowering |
| GB9518731D0 (en) | 1995-09-13 | 1995-11-15 | Innes John Centre | Flowering genes |
-
1998
- 1998-05-14 CA CA002288641A patent/CA2288641A1/en not_active Abandoned
- 1998-05-14 NZ NZ500737A patent/NZ500737A/en unknown
- 1998-05-14 WO PCT/IB1998/000821 patent/WO1998051800A1/en not_active Application Discontinuation
- 1998-05-14 EP EP05109849A patent/EP1647598A1/en not_active Withdrawn
- 1998-05-14 HU HU0001909A patent/HU225301B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1998-05-14 AR ARP980102242A patent/AR015667A1/es active IP Right Grant
- 1998-05-14 AU AU72298/98A patent/AU753726B2/en not_active Ceased
- 1998-05-14 ES ES98919436T patent/ES2255158T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-14 DE DE69832600T patent/DE69832600T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1998-05-14 AT AT98919436T patent/ATE311454T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-05-14 DK DK98919436T patent/DK0981621T3/da active
- 1998-05-14 US US09/423,575 patent/US6864051B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-05-14 EP EP98919436A patent/EP0981621B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0981621B1 (en) | 2005-11-30 |
| NZ500737A (en) | 2001-06-29 |
| CA2288641A1 (en) | 1998-11-19 |
| EP0981621A1 (en) | 2000-03-01 |
| US6864051B1 (en) | 2005-03-08 |
| EP1647598A1 (en) | 2006-04-19 |
| AU7229898A (en) | 1998-12-08 |
| ES2255158T3 (es) | 2006-06-16 |
| DK0981621T3 (da) | 2006-04-03 |
| AU753726B2 (en) | 2002-10-24 |
| WO1998051800A1 (en) | 1998-11-19 |
| DE69832600D1 (de) | 2006-01-05 |
| DE69832600T2 (de) | 2006-09-21 |
| ATE311454T1 (de) | 2005-12-15 |
| HUP0001909A3 (en) | 2002-04-29 |
| HUP0001909A2 (hu) | 2000-09-28 |
| AR015667A1 (es) | 2001-05-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2263214T3 (es) | Gen rht del trigo para el control genetico del crecimiento y desarrollo vegetal. | |
| ES2260795T3 (es) | Control genetico de floracion. | |
| Yokoyama et al. | The Arabidopsis ERECTA gene is expressed in the shoot apical meristem and organ primordia | |
| Chory et al. | Mutations in the DET1 gene affect cell-type-specific expression of light-regulated genes and chloroplast development in Arabidopsis | |
| US6670526B1 (en) | Arabidopsis ESD4 gene and method to control flowering time | |
| Ascenzi et al. | Molecular genetic analysis of the drought-inducible linker histone variant in Arabidopsis thaliana | |
| KR101790010B1 (ko) | 수발아 저항성을 증진시키는 벼 유래 유전자 및 이의 용도 | |
| Dai et al. | Promoter elements controlling developmental and environmental regulation of a tobacco ribosomal protein gene L34 | |
| Zhao et al. | Overexpression of a GmGBP1 ortholog of soybean enhances the responses to flowering, stem elongation and heat tolerance in transgenic tobaccos | |
| US20100138962A1 (en) | Use of plant chromatin remodeling genes for modulating plant architecture and growth | |
| WO2011049243A1 (ja) | バイオマスが増大し、かつ環境ストレス耐性が向上した形質転換植物およびその作出方法 | |
| CA2762432A1 (en) | Light-regulated promoters | |
| US6114602A (en) | Method for the induction of genetic parthenocarpy in plants | |
| US6864051B1 (en) | Plant gene constructs and their use | |
| CA2296761A1 (en) | Process of producing transgenic plants in which flowering is inhibited, and dna sequences used in said process | |
| Wang et al. | Analysis and localization of the water-deficit stress-induced gene (lp3) | |
| US7238864B2 (en) | Acetolactate synthase gene promoter | |
| Yang et al. | FUSCA3, A multi-role regulator in the process of plant growth and development | |
| KR100833475B1 (ko) | 어린 식물의 발생 또는 분화를 촉진하는 ＯｓＭＳＲＰＫ1유전자 | |
| KR100897763B1 (ko) | 파이토시스타틴 유전자 발현에 의한 발아 지연 및 시스테인단백질 분해효소 활성 억제가 가능한 형질전환 식물체 | |
| KR100781075B1 (ko) | 식물 스트레스 저항성을 증가시키는 ＯｓＭＳＲＰＫ1유전자 | |
| PL190228B1 (pl) | Sposób modyfikowania kwitnienia w roślinach | |
| CZ401499A3 (cs) | Konstrukce rostlinných genů a jejich použití | |
| JP2001352851A (ja) | トランスジェニック植物及びその作製方法 | |
| US20070192895A1 (en) | Isolated DNA molecule for enhancing gene expression of a coding sequence, fragment, genetic variant, cassette, vector, cell, plant and seed containing said molecule |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |