KR100826140B1 - 감자 유래의 복합재해저항성 관련 유전자 및 이를 이용한복합재해저항성 작물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 복합재해저항성 용도를 가지는 유전자에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 내동성을 조절하는 유전자로 알려진 StEREBP유전자의 복합재해저항성 유전자로의 용도에 관한 것이다.

본 발명에 따르면 내재해성과 내병성을 동시에 지닌 복합재해저항성 유전자전환 작물의 제공이 가능하여 여러 가지 재해가 복합적으로 발생하는 농업현장에서 크게 활용될 수 있을 것이다.

감자, StEREBP, 복합재해저항성, 내염성, 세균병 저항성, 역병 저항성

Description

감자 유래의 복합재해저항성 관련 유전자 및 이를 이용한 복합재해저항성 작물{Multiple stress tolerant gene StEREBP and their utilization for stress tolerant crops}

도 1은 저온에 의해 발현이 차이를 보이는 감자EREBP유전자의 염기서열과 추정 아미노산 서열 및 promoter의 부위를 포함하고 있다.

도 2는 감자 StEREBP 유전자를 GFP 발현 단백질과 결합 후 양파 표피세포에서 일시적으로 발현시킨 후 분석하여 StEREBP 유전자가 핵으로 이동하는 것을 증명한 사진이다.

도 3은 대장균에서 발현시킨 StEREBP 단백질을 프로모터의 특정염기서열과 결합하는 부위를 분석한 결과 GCC 엘리먼트(element)와 강하게 결합하고 DRE 엘리먼트(element)와도 결합하는 결과를 보여주는 사진이다.

도 4는 StEREBP유전자를 상시발현하는 35S promoter의 조절을 받도록 벡터를 제작하여 수미 감자에 형질 전환된 형질 전환체(A)들과 이들의 StEREBP유전자 발현을 노던(Northern) 방법으로 분석(B)한 도면이다.

도 5는 StEREBP를 35S 프로모터의 조절을 받도록 벡터를 제작하여 감자에 형질 전환 후 발현이 강한 StEREBP #10 형질 전환체와 대조구인 수미감자의의 mRNA를 분리하여 microarray 분석을 하여 하부 유전자의 발현을 증폭을 조사한 결과 도 면이다.

도 6은 도 5에서 microarray 분석결과 발현을 증폭시킨 유전자들을 기능별로 그루핑하여 보여주는 표로 병 방어에 관련된 전사인자 워키(wrky), 병 방어 유전자 글루타네이즈이다.

도 7은 도 6의 microarray 분석 결과를 확인하기 위해 일부 유전자들을 RT-PCR로 발현검정 결과 StEREBP 에 의해 발현이 증폭된 클론들이 microarray에서도 발현이 증가한 결과를 보여주는 사진이다.

도 8은 형질 전환 담배를 세균병균을 처리 후 병원균의 증식을 조사한 도면이다.

도 9는 형질 전환 담배를 이용하여 역병균을 처리 후 발병상태를 정밀검정하기 위하여 현미경으로 촬영한 도면이다.

도 10은 형질 전환 감자를 이용하여 NaCl을 처리 후 뿌리의 발육을 비교한 도면이다.

본 발명은 복합재해저항성 용도를 가지는 유전자에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 내동성을 조절하는 유전자로 알려진 StEREBP유전자의 복합재해저항성 유전자로의 용도에 관한 것이다.

농작물은 고착생활을 하기 때문에, 온도, 수분 등의 재해와 수많은 병원균(곰팡이, 세균, 바이러스 등)들의 공격을 받게 되어, 그로 인한 생산량의 감소는 일찍이 기록돼 왔다. 이러한 환경과 병원균에 의한 농작물의 피해를 줄이고 생산성을 향상시키기 위하여 일반적으로 농약이 사용되어오고 있으나, 농약의 사용은 환경오염이라는 심각한 문제를 새로이 야기할 뿐 아니라 섭취할 경우 인체에도 영향을 준다.

불량 환경과 병에 대한 방어효과를 증진시키기 위해 염류, 냉해 등 환경에 의해 유도되는 stress 관련 유전자나 병원균에 의해 유도되는 PR(pathogenesis responsive) 유전자들이 식물에 도입하였으나 하나의 유전자가 복잡한 자연환경에서 저항성을 증진시키기는 어려움이 많아 여러 유전자를 한 식물체에 도입하는 gene pyramiding, 여러 유전자의 발현을 증폭시키는 전사인자의 사용이 시도되었다. 그러나 생물적 스트레스(biotic stress)인 병과 무생물적 스트레스(abiotic stress)인 염해 등을 동시에 방어할 수 있는 유전자를 사용할 경우 하나의 유전자가 재해, 병원균등에 대해 효과를 보일 것으로 기대된다.

본 발명은 염, 냉해 등 무생물적 재해와 세균병저항성, 역병저항성 등 생물적 재해에 대하여 저항성을 나타내는 감자 유래의 StEREBP 유전자 및 이를 이용한 작물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 다른 목적 및 장점들은 하기에 설명될 것이며, 본 발명의 실시에 의해 알게 될 것이다. 또한, 본 발명의 목적 및 장점들은 특허 청구 범위에 나타낸 수단 및 조합에 의해 실현될 수 있다.

상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 감자 유래의 서열목록 1의 작물 병 저항성 및 재해저항성 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명의 유전자로 형질 전환된 병 저항성 및 재해 저항성을 가지는 작물이 제공된다.

또한, 본 발명의 유전자를 pBI121벡터에 35S promoter의 조절을 받도록 하여 형질 전환된 Agrobacterium tumefaciens LBA4404(기탁번호: KACC 95058P)가 제공된다.

본 발명에서 StEREBP 유전자를 선발하기 위하여, 저온 처리한 감자에서 cDNA 유전자 은행을 작성하여 역노던법(reverse northern)으로 특정 유전자를 추출한 다음, 유전자 염기서열분석 및 상동성 분석을 통하여 내재해성 유전자로 추정되는 유전자를 선발하고, 이를 저온, 염해, 한발, 병, 화학물질 등을 처리하여 발현 분석하였다. StEREBP가 여러 유전자의 발현을 조절하는 마스터 스위치 역할을 하는지 확인하기 위하여 유전자를 GFP(Green fluorescence protein)유전자와 결합하여 양파세포에서 유전자 총으로 유전자가 세포의 어느 부위에서 기능을 하는지 조사였으며 StEREBP 유전자가 핵으로 이동함을 확인하였다. 또한, EMSA(electrophoretic gel mobility shift assay)에 의해 EREBP 단백질이 결합하는 모티프(motif)를 확인하였다.

상기와 같이 선발된 유전자는 감자에서 병원균이나 저온, NaCl 등이 처리될 때 발현이 증폭되는 유전자로서, "StEREBP유전자"로 명명하였다.

본 발명의 상기 StEREBP 유전자는 식물 형질 전환을 위한 Binary vector인 pBI121벡터에 35S promoter의 조절을 받도록 제작하여 Agrobacterium tumefaciens LBA4404에 형질 전환 후 기탁번호 KACC 95058P로 미생물기탁기관인 KACC에 등록하였다.

StEREBP 유전자의 기능분석을 위하여 저온 이외에 염해, 병원균, ABA등 화학물질 처리 시 유전자의 발현양상을 조사하였다. StEREBP 유전자의 염기서열을 분석하여 추정아미노산 서열의 기능을 분석한 결과 ERF domain을 지니고 있었다. EREBP 유전자의 식물체 내에서 작용 부위를 알기 위해 GFP 유전자와 결합하여 양파세포를 이용하여 targeting 부위를 확인 한 결과 핵으로 targeting 됨을 증명하였다. StEREBP유전자를 대장균에서 과발현시켜 단백질을 분리한 후 단백질과 결합하는 DNA를 찾기 위해 엠사(EMSA)분석을 한 결과 StEREBP 단백질은 병 방어 유전자들이 많이 지니고 있는 GCC 엘리먼트(element)와 결합력이 강하고 내재해성 유전자들이 많이 지니고 있는 DRE엘리먼트(element) 와 결합은 하지만 결합력이 작은 결과를 얻었다.

이상과 같이 핵에서 작용하고 병 방어 유전자들을 조절하는 것으로 추정되는 StEREBP 유전자의 형질 전환체들의 병 방어 효과를 보기 위해 식물 형질 전환벡터에 실어 아그로박테리움(agrobacterium)을 이용해 형질 전환된 담배와 감자의 생물 검정 결과 담배에서 역병저항성, 세균병저항성이 크게 증진됨을 확인하였다. StEREBP 유전자가 과발현된 감자에서 신호전달경로의 하부 유전자 발현 조절을 분 석하였으며 병 방어에 관련된 워키전사인자(wrky), 병 저항성 유전자 등의 발현을 크게 증폭시켰다. StEREBP는 병 방어 신호전달경로에 관련된 유전자로 역병과 세균병 등 다양한 병원균에 대한 저항성을 증진시킬 뿐 아니라 염해 냉해 등 내재해성에도 증진효과를 보여 복합재해저항성 작물 육종에 유용한 유전자로 여겨진다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

실시예 1 : 감자에 저온처리와 발현에 차이를 보이는 유전자들의 선발

4℃와 25℃로 조절된 2개의 생장상내에서 감자를 각각 처리한 후 4℃에 서 발현량이 증폭된 유전자를 Reverse Northern 방법으로 선발하였다. 노던 혼성화 (Northern hybridization) 분석에 의한 유전자의 발현 증폭을 확인하고 각각을 염기서열 분석하고 상동성을 검색한 결과를 바탕으로 선발한 StEREBP 유전자는 구조 유전자가 216개의 아미노산을 코드하는 것으로 추정되었다 (도 1).

실시예 2 : StEREBP 유전자의 식물체 내에서 핵으로 이동

상기에서 분리된 유전자는 식물체 내에서 작용하는 부위를 확인하고자 StEREBP 유전자와 smGFP 단백질 유전자와 결합하여 35S promoter의 조절을 받도록 클로닝 하였다. 제작된 벡터를 유전자 총을 이용하여 양파 표피세포에 도입하고 12 시간 후 형광 현미경으로 GFP(Green Fluorescence Protein) 유전자의 발현을 관찰하였다.

원래 GFP 는 세포 전체에서 발현이 되지만 StEREBP 유전자와 결합한 GFP는 핵에서만 발현되므로 EREBP 유전자는 핵으로 이동함을 확인하였고 결과는 도 2에 도시하였다.

실시예 3 : StEREBP 단백질의 promoter motif와 binding assay

StEREBP 유전자를 GST와 fusion하여 GST-StEREBP벡터를 제작하고 BL21균에 도입한 후 IPTG농도, 처리시간, 배양온도 등의 조건을 조절하여 대장균에서 발현시켰다. 발현이 증폭된 단백질을 분리하여 단백질과 유전자의 프로모터(promoter)에 있는 특정 염기서열부위와의 결합을 EMSA(Electrophoretic mobility Shift Assay) 실험으로 분석하였다. StEREBP단백질은 GCC부위에 강하게 결합하는 양상을 관찰하였고 DRE/CRT 염기서열과는 약하게 결합하는 것을 알 수 있었다 (도 3). 즉 StEREBP 는 두 종류의 시스액팅 엘리먼트(cis-acting element)와 결합할 수 있으나 그 역할을 수행함에 있어 병 방어와 관련된 GCC box와 더욱 밀접하게 관계될 것으로 추측된다.

실시예 4: 감자 형질 전환체 제작 및 형질 전환에서 SEREBP 유전자의 발현분석

StEREBP 유전자를 상시 발현하도록 35S promoter의 조절을 받도록 벡터를 제 작하여 감자품종 수미에 형질 전환 하였다. 형질 전환된 10종의 클론을 얻었다. 상기에서 얻어진 형질 전환체들을 대상으로 구조유전자 부위가 삽입되었는지의 여부를 확인하기 위해 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시하였다. 독립적으로 재분화된 10개의 식물체로부터 분리된 genomic DNA를 주형으로, 제작된 StEREBP 유전자 specific 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 하였다. 프라이머는 PCR후 산물의 크기가 270bp가 되도록 제작되었다. 결과는 도 5(A)에 보여지고 있다. 형질 전환된 클론들의 발현을 StEREBP 구조유전자를 프로브(probe)로 사용하여 노던(Northern) 분석으로 비교한 결과 #1, #10 클론은 발현이 강하고 #2, #3, #9 클론은 발현이 중정도이고 #8 클론은 발현이 약하며 나머지 클론들은 PCR로 확인할 때 밴드를 형성하여 형질 전환은 이루어졌으나 발현이 거의 되지 않았다(도 4).

실시예 6 : StEREBP 과발현 감자에서 microarray 분석에 의한 하부 유전자 발현 조절 확인

실시예 5에서 얻어진 형질 전환체중 발현이 강했던 #10번 클론과 대조인 수미 감자를 조직배양 병에서 3주간 증식하고 지상부를 각각 채취하여 RNA를 분리하였다. 분리된 Total RNA에서 mRNA를 분리하고 이들을 이용하여 cy5와 cy3로 labelling하여 TIGER의 감자 10K chip을 이용하여 발현이 증폭되는 클론들을 분석하였다.

1) StEREBP 과발현 감자에서 증폭된 유전자들

Microarray 분석 결과 발현이 증폭된 유전자들의 promoter가 motif들을 갖고 있는지를 Genome sequencing이 완료된 애기장대를 이용하여 실시하였다.

발현이 증폭된 감자 TC번호에 해당되는 애기장대 GI번호 클론의 translation start로부터 -1000bp에 해당하는 부위에 core DRE element(CCGAC), GCC element(GCCGAC)를 지니고 있는 클론들을 분석하였다. 약 log2이상 발현이 증가된 401개 클론 중 89개 클론이 -1000의 promoter 부위에 DRE나 GCC element를 지니고 있었다. 그중 5개 클론은 GCC element를, 79개 클론은 DRE element를, 5개 클론은 GCC와 DRE 모두를 지니고 있었다(도 5 ).

워키전사인자(WRKY), PR(pathogenesis related)단백질인 β-glucanase, 병 저항성 단백질의 구조와 유사한 LRR 도메인을 지니고 있는 유전자 등 병 저항성 혹은 방어 유전자군에 속하는 유전자들의 발현이 증폭되었으며 또한 내재해성에 관련된 ABF 유전자의 발현도 증폭됨을 확인 하였다( 도 6 ).

2) 알티피시알(RT-PCR)에 의한 microarray 결과의 검증

Microarray의 분석 결과를 검증하기 위하여 일부 발현 증폭된 클론의RT-PCR을 실시하였다. 일반 Control 감자 (수미: Superior)에 비해 EREBP 유전자를 발현 시킨 감자에서 Microarray 분석 결과와 유사하게 발현량이 증가되고 특히 엘알알(LRR), 내재해성 관련 전사인자(Myc), 워키전사인자(WRKY)는 RT-PCR 결과도 microarray 결과와 같이 발현이 크게 증폭되었다( 도 7 ).

실시예 7: 형질 전환 담배에서 세균병저항성 검정

형질 전환 담배T1세대 종자를 파종 후 온실에서 3주간 생육 후 새로 나온 2번째 잎의 뒷면에 감자 풋마름병(Ralstonia solanacerum) 균을 10⁶농도로 10mM MgCl₂용액에 희석하여 잎의 뒷면에 바늘이 없는 1ml 시린지로 투입하였다. 접종 후 1, 2, 3, 4일에 세균이 투입된 부분을 절단하여 무게를 재고 갈아 희석 후 petridish에 도말하여 균총 수를 측정하였다. 동일 방법으로 3회 반복 실험 후 얻은 결과를 보면 StEREBP가 형질 전환된 담배는 균총 수가 대조구(Xanthi)에 비해 1/3로 감소하여 내병성이 증진됨을 확인하였다(도 8).

실시예 8: 형질 전환 담배에서 역병저항성 검정

역병 저항성은 T1 종자를 3주간 온실에서 키워 4엽기에 생육기가 비슷하고 신선한 잎을 채취하여 plate에서 멸균수로 포화된 여지를 넣어 습도를 유지하며 Phytophthora tabacii를 접종하고 약 20℃ 상온에서 병원균 감염을 현미경으로 조사하였다(도 9).

실시예 9: 형질 전환 감자에서 내염성 검정

StEREBP 유전자 형질 전환 감자를 0, 50, 75, 100mM의 NaCl을 각각 함유한 MS 배지에 옮겨 지하부의 생육을 비교하였다. 75mM NaCl을 함유하지 않은 배지(B)와 NaCl을 함유한 배지(A)에서 유전자가 도입되지 않은 식물체와 형질 전환체에서 뿌리 생육을 나타낸 도면이다(도 10).

본 발명에 따르면 STEREBP 유전자의 발현에 따라 식물이 보유한 다양한 유전자들을 인위적으로 발현되어 그 식물체가 병 및 불량환경에 저항하는 자체 방어기작을 단시간 내에 유도시킬 수 있다.

본 발명은 종래까지 행하여 오던 단일 유전자 형질 전환체 육성방법을 통해서 얻은 결과에 비해 여러 유전자의 발현을 조절하는 전사인자를 발현 증폭시켜 병과 환경재해 등에 복합적으로 효과가 있는 기술로서 실제 작물재배에 활용도가 높을 것이다. 예를 들어, 병 및 불량환경에 의한 재해는 농작물 수확감소의 가장 큰 원인 (50% 이상 감소)으로서 작물재배 한계의 결정적 요인으로 작용하고 있으며 자연 상태에서 단일 재해에 의한 경우보다 재해나 병충해 등이 복합적으로 작물재배에 피해를 준다. 본 발명의 유전자를 이용하여 형질 전환한 작물은 여러 종류의 복합적인 재해에 저항성이 증진되어 농업적으로 실용화에 효과가 있을 것으로 기대된다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (3)

1. 감자 유래의 서열목록 1의 작물 병 저항성 및 재해 저항성 유전자.
2. 제 1 항의 유전자로 형질 전환된 병 저항성 및 재해 저항성을 가지는 작물.
3. 제 1 항의 유전자를 pBI121벡터에 35S promoter의 조절을 받도록 하여 형질 전환된 Agrobacterium tumefaciens LBA4404(기탁번호: KACC 95058P).

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