BRPI0614215A2

BRPI0614215A2 - método para transformação de milho e construto de dna

Info

Publication number: BRPI0614215A2
Application number: BRPI0614215-0A
Authority: BR
Inventors: Kangfeng Mei; Todd Jones; Fang-Ming Lai; Luke Mankin; Hee-Sook Song
Original assignee: Basf Plant Science Gmbh
Priority date: 2005-07-27
Filing date: 2006-07-18
Publication date: 2011-03-22
Also published as: WO2007014844A3; EP1910544A2; AR053954A1; CN101228281A; US20090038025A1; WO2007014844A2; CA2616579A1; AU2006274964A1

Abstract

MéTODO PARA TRANSFORMAçãO DE MILHO E CONSTRUTO DE DNA. A presente invenção refere-se a métodos aperfeiçoados para a incorporação de DNA no genoma de uma planta de milho Zea mays, baseados na seleção de D-alanina ou D-serina. A transformação é preferencialmente mediada por Agrobacterium.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOPARA TRANSFORMAÇÃO DE MILHO E CONSTRUTO DE DNA".

Antecedentes da Invenção

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a métodos aperfeiçoados para aincorporação de DNA no genoma de uma planta de milho Zea mays, basea-dos em seleção de D-alanina ou D-serina. A transformação é preferencial-mente mediada por Agrobacterium.

Descrição da Técnica Relacionada

Durante a década passada, tornou-se possível a transferênciade genes de uma ampla gama de organismos para plantas de cultivo pelatécnica de DNA recombinante. Este avanço propiciou o aparecimento deoportunidades imensas para melhorar a resistência das plantas a pestes,doenças e herbicidas e para modificar processos de síntese biológica deforma a alterar a qualidade das plantas produzidas. Vários métodos foramtentados para a transformação de plantas monocotiledôneas. Um dos méto-dos de transformação mais amplamente utilizado é o de "biolística". No mé-todo de "biolística" (liberação de DNA mediada por bombardeamento de mi-croesferas), partículas microscópicas são revestidas com DNA e aceleradaspor um dispositivo mecânico até uma velocidade alta o suficente para pene-trar a parede celular e o núcleo do vegetal. O DNA estrangeiro incorpora-seao DNA do hospedeiro e resulta em célula transformada. Há muitas varia-ções ao método de "biolística" (Sanford 1990; Fromm 1990; Christou 1988;Sautter 1991).

Embora amplamente utilizado em plantas dicotiledôneas, atransferência de genes mediada por Agrobacterium foi decepcionante quan-do seu uso foi adaptado para monocotiledôneas. Tentativas efetuadas por byHiei et al. (1994) sugeriram ser possível obter plantas de arroz transgênicoapós transformação mediada por Agrobacterium, porém constatou que aescolha das cepas especificamente utilizadas e de vetores era fundamentalpara o êxito em se obter transgênicos. Um artigo por Ishida et al. (1996) indi-cou que a transformação do milho de alta-eficiência era possível por cocultu-ra de embriões imaturos com A. tumefaciens. Em ambos os relatórios, sobretransformação em arroz e milho, um vetor superbinário pTOK233, contendocópias adicionais dos genes virB, virC e virG, foi utilizado para que fosseatingida transformação de alta eficiência. A WO 95/06722 e EP-A1 672 752expõem um método de transformação de monocotiledôneos utilizando escu-telo de embriões imaturos com A. tumefaciens. A EP-A1 0 709 462 descreveum método para transformação de plantas monocotiledôneas, em que a me-lhora indica a inclusão de um período de recuperação após a etapa de cocul-tivo, sem dispositivo de seleção por um dia. Foram relatados outros métodospara a transformação de plantas monocotiledôneas incluindo, por exemplo, o"método do tubo de pólen" (WO 93/18168; Luo 1988), macroinjeção de DNAem perfilhos florais (Du 1989; De Ia Pena 1987), injeção de Agrobacteriumem cariopses (WO 00/63398), incubação de tecidos de sementes em solu-ções de DNA (Tõpfer 1989). A injeção direta de DNA estrangeiro no óvulo deplanta fertilizada no início da embriogênese foi exposta na WO 94/00583.

Todos os métodos de transformação do milho não são eficientese requerem a presença de um marcador de seleção para distinguir célulastransformadas e formas vegetais não-transformadas. São empregados prin-cipalmente marcadores de seleção negativa, os quais conferem resistênciacontra um agente fitotóxico (como herbicida ou antibiótico). Os marcadoresde seleção negativa empregados no milho, conhecidos até esta data, limi-tam-se principalmente à fosfinotricina acetiltransferases (PAT; também de-nominado resistência Bialophos®; bar; de Block 1987; EP 0 333 033; US 4975 374), 5-enol-piruvil-shiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS; conferindoresistência a Glyphosate® (N-(fosfonometil)glicina); Shah 1986) e sulfoniluréia e imidazolinona inibidoras da acetolactato sintase (por exemplo, o geneXl 12 ahas2, US 6 653 529; o gene mutado XA17 ahas, Bernnasconi 1995,US 4 761 373; US 5 304 732; Anderson & Gregeson 1989; Currie 1995; Ne-whouse 1991).

Transformações múltiplas subseqmentes de plantas de milho,contendo mais de uma construção (necessárias para algumas das caracte-rísticas mais complicadas de alto valor e para empilhamento de genes), sãocomplicadas visto ser limitada a disponibilidade de marcadores de seleçãoadequados. A esta situação, combinam-se exigências reguladoras mais res-tritivas e questões ambientais que têm como resultado opções menos viá-veis de marcadores de resistência a antibióticos (como resistência à higro-micina ou canamicina). Sistemas alternativos de marcadores de seleção,como um sistema à base de enzimas metabolizadoras de D-aminoácidos(por exemplo, D-aminoácido desidratases ou oxidases), foram descritos re-centemente de maneira generalizada (WO 03/060133). Até esta data, contu-do, não foi descrita adoção e/ou otimização deste sistema para uso em mi-lho. Dessa forma, o objetivo da presente invenção é prover um método me-lhorado e eficiente para transformação de plantas Zea mays, fundamentadoem seleção de D-aminoácidos. Este objetivo é atingido pela presente inven-ão.

Sumário da Invenção

Uma primeira concretização da invenção refere-se a um métodopara geração de planta transgênica Zea mays, compreendendo as etapas dea. introdução em uma célula ou tecido da Zea mays de umaconstrução de DNA compreendendo

i) pelo menos uma primeira construção de expressão, compreendendoum promotor de ubiquitina (constitutivo?) e, ligado ao mesmo de modoa permitir operação, uma seqmência de ácidos nucleicos que codificauma enzima capaz de metabolizar D-alanina e/ou D-serina,

ii) pelo menos uma segunda construção de expressão, conferindo à refe-rida planta Zea mays uma característica agronomicamente valiosa, e

b. incubação da referida célula ou tecido da Zea mays da etapaa) em um meio de seleção compreendendo D-alanina e/ou D-serina e/ou umderivado destas, em uma concentração total de aproximadamente 1 mM a100 mM, por-um período de tempo de pelo menos 5 dias, e

c. transferência da referida célula ou tecido da Zea mays da eta-pa b) para um meio de regeneração e a regeneração e seleção de plantasZea mays que incluem a referida construção de DNA.

Preferencialmente, a enzima capaz de metabolizar D-alanina ouD-serina é selecionada do grupo constituído por D-serina amônia-liases (EC4.3.1.18), D-aminoácido oxidases (EC 1.4.3.3) e D-alanina transaminases(EC 2.6.1.21). Mais preferencialmente, a enzima capaz de metabolizar D-alanina ou D-serina é selecionada do grupo constituído por D-serina amônia-Iiases (EC 4.3.1.18) e D-aminoácido oxidases (EC 1.4.3.3). Ainda mais pre-ferencialmente para o método da invenção, a enzima capaz de metalizar D-serina é selecionada do grupo constituído por

i) a d-serina amônia-liase do E.coli, conforme codificada pela SEQ IDNO: 2, e

ii) enzimas que tenham a mesma atividade enzimática e identidade deseqmência de pelo menos 80% à da seqmência, conforme codificadapela SEQ ID NO: 2, e

iii) enzimas codificadas por uma seqmência de ácidos nucleicos capazesde hibridizar para complementar a seqmência descrita pela SEQ IDNO: 1,

e em que a seleção é efetuada em meio compreendendo D-serina em umaconcentração de aproximadamente 1 mM a 100 mM.

Ainda mais preferencialmente para o método da invenção, a en-zima capaz de metalizar D-serina e D-alanina é selecionada do grupo consti-tuído por

i) a D-amioácido oxidase do Rhodotorula gracilis, conforme codificadapela SEQ ID NO: 4, e -

ii) enzimas que tenham a mesma atividade enzimática e identidade deseqmência de pelo menos 80% à da seqmência, conforme codificadapela SEQ ID NO: 4, e

iii) enzimas codificadas por uma seqmência de ácidos nucleicos capazesde hibridizar para complementar a seqmência descrita pela SEQ IDNO: 3,

e em que a seleção é efetuada em meio compreendendo D-alanina e/ou D-serina em uma concentração total de aproximadamente 1 mM a 100 mM.

O promotor que permite operação ligado à enzima capaz de me-tabolizar D-alanina ou D-serina é um aspecto importante da invenção. Prefe-rencialmente, o promotor da ubiquitina é um promotor de ubiquitina de mo-nocotiledôneo, mais preferencialmente, um promotor de Zea mays. Aindamais preferencialmente, o promotor de ubiquitina é selecionado do grupoconstituído por

a) seqmências compreendendo a seqmência, conforme descrita pela SEQID NO: 5, e

b) seqmências compreendendo, pelo menos, um fragmento de pelo me-nos 50 pares de base consecutivas da seqmência, conforme descritapela SEQ ID NO: 5 e com atividade de promotor na Zea mays,

c) seqmências compreendendo uma seqmência, cuja identidade de seq-mência seja pelo menos 60% à da seqmência, conforme descrita pelaSEQ ID NO: 5 e com atividade de promotor na Zea mays,

d) seqmências compreendendo uma seqmência que hibridiza para a se-qmência, conforme descrita pela SEQ ID NO: 5 e com atividade depromotor na Zea mays,

A seqüência descrita pela SEQ ID NO: 5 é o núcleo de promotordo promotor de ubiquitina da Zea mays. Em uma concretização preferida, éempregada não só a região do promotor e a seqüência que regula a trans-crição, mas também uma região 5' não-traduzida e/ou um íntron. Mais prefe-rencialmente, é utilizada a região que abrange o promotor, a região 5' não-traduzida e o primeiro íntron do gene de ubiquitina da Zea mays, ainda maispreferencialmente7~a região~descrita pela SEQ ID NO: 6. Dessa forma, emoutra concretização preferida, o promotor da ubiquitina, utilizado no métododa invenção, é selecionado do grupo constituído por

a) seqmências compreendendo a seqüência, conforme descrita pela SEQID NO: 6, e

b) seqmências compreendendo, pelo menos, um fragmento de pelo me-nos 50 pares de base consecutivas da seqüência, conforme descritapela SEQ ID NO: 6 e com atividade de promotor na Zea mays,

c) seqmências compreendendo uma seqüência, cuja identidade de se-qüência seja pelo menos 60% à da seqüência, conforme descrita pelaSEQ ID NO: 6 e com atividade de promotor na Zea mays,d) seqmências compreendendo uma seqüência que hibridiza para a se-qüência, conforme descrita pela SEQ ID NO: 6 e com atividade depromotor na Zea mays.

Em uma concretização preferida da invenção, a seleção da eta-pa b) é efetuada utilizando D-alanina em uma concentração de aproximada-mente 3 a aproximadamente 15 mM ou D-serina em uma concentração deaproximadamente 7 a aproximadamente 30 mM. O tempo total de seleção,sob condições de desdiferenciação, é de aproximadamente 3 a 4 semanas.

Mais preferencialmente, a seleção da etapa b) é efetuada emduas etapas, usando uma primeira etapa de seleção de aproximadamente 5a 20 dias e, em seguida, transferindo as células sobreviventes ou tecido paraum segundo meio de seleção, contendo essencialmente a mesma composi-ção do primeiro meio de seleção, por mais 5 a 20 dias.

Vários métodos podem ser empregados para introduzir constru-ções de DNA da invenção nas plantas de milho. Preferencialmente, a intro-dução da referida construção de DNA é mediada por um método seleciona-do do grupo constituído por transformação mediada por Rhizobiaceae etransformação mediada por bombardeamento de partículas. Mais preferen-cialmente, a transformação é mediada por uma bactéria Rhizobiaceae, sele-cionada do grupo de cepas bacterianas desarmadas de Agrobacterium tu-mefaciens ou Agrobacterium rhizogenes. Em outra concretização preferida,a bactériadosolo é uma variante da cepa desarmada da cepa K599 do A-grobacterium rhizogenes (NCPPB 2659). Estas cepas são descritas no pedi-do de patente US provisional N0 60/606789, depositado em 02 de setembrode 2004, aqui incorporado, em sua totalidade, por referência.

Em uma concretização preferida da invenção, o método da in-venção compreende as seguintes etapas

a. isolamento de um embrião imaturo de uma planta Zea mays, e

b. cocultivo do referido embrião imaturo isolado, o qual não submetido aum tratmento de desdiferenciação, com uma bactéria que pertence aogênero Rhizobiaceae, compreendendo, pelo menos, um T-DNA trans-gênico, o referido T-DNA compreendendoi) pelo menos uma primeira construção de expressão, compreen-dendo um promotor de ubiquitina e, ligada ao mesmo de modoque permite operação, uma seqüência de ácidos nucleicos quecodifica uma enzima capaz de metabolizar D-alanina e/ou D-serina,

ii) pelo menos uma segunda construção de expressão, conferindo àreferida planta Zea mays uma característica agronomicamente va-liosa, e

c. a transferência dos embriões imaturos cocultivados para um meio derecuperação, o referido meio de recuperação sem uma quantidade fito-tóxica eficaz de D-serina ou D-alanina, e

d. a indução de formação de calo embriogênico e seleção de calo trans-gênico em um meio compreendendo,

i) uma quantidade eficaz de pelo menos um composto auxina, e

ii) D-alanina e/ou D-serina em uma concentração total de aproxima-damente 1 mM a 100 mM, e

e. regeneração e seleção de plantas contendo o T-DNA transgênico doreferido calo transgênico.

Em uma concretização preferida da invenção, a seleção da eta-pa b) é efetuada utilizando D-alanina em uma concentração de aproximada-mente 3 a aproximadamente 15 mM ou D-serina em uma concentração deaproximadamente 7 a aproximadamente 30 mM. Mais preferencialmente, aseleção da etapa b) é efetuada em duas etapas, usando uma primeira etapade seleção de aproximadamente 5 a 20 dias e, em seguida, transferindo ascélulas sobreviventes ou tecido para um segundo meio de seleção, contendoessencialmente a mesma composição do primeiro meio de seleção, por mais5 a 20 dias.

No referido método preferido, o meio de recuperação da etapa c)compreende, preferencialmente,

i. uma quantidade eficaz de pelo menos um antibiótico que iniba ou su-prima o crescimento da bactéria do solo, e

ii. L-prolina em uma concentração de aproximadamente 1 g/l a aproxima-damente 10g/l, e

iii. nitrato de prata em uma concentração de aproximadamente 1 μΜ aaproximadamente 50 μΜ,

iv. uma quantidade eficaz de pelo menos um composto auxina.

No referido meio de recuperação preferido da etapa c), a quanti-dade eficaz do composto auxina é, preferencialmente, equivalente a umaconcentração de aproximadamente 0,2 mg/l a aproximadamente 6 mg/l 2,4-D. Preferencialmente, o meio empregado durante o cocultivo compreende deaproximadamente 1 μΜ a aproximadamente 10 μΜ de nitrato de prata e/ou(preferencialmente, "e") de aproximadamente 50 mg/l a aproximadamente1.000 mg/l de L-cisteína.

Virtualmente qualquer planta Zea mays pode funcionar comofonte para o material destinado à transformação. Preferencialmente, a referi-da planta Zea mays, embrião imaturo, célula ou tecido é selecionado do gru-po de plantas Zea mays constituído por naturais, híbridas, F1 entre naturais,F1 entre uma natural e uma híbrida, F1 entre uma natural e uma variedadenaturalmente polinizada, variedades comerciais de F1, qualquer cruzamentode F2 ou de autopolinização entre as variedades mencionadas acima e aprogênie de qualquer um dos supramencionados. Mais preferencialmente, areferida célula ou tecido ou o referido embrião imaturo da Zea mays é isola-do de um cruzamento de um híbrido (HilIA χ A188) com uma linhagem natu-ralrselecionada do grupo do qual uma semente representativa foi depositadajunto à American Type Culture Collection, sob a Designação de Depósito dePatente PTA-6170 e PTA-6171.

O método da invenção, especialmente se utilizado com D-aminoácido oxidases, pode ser vantajosamente acoplado à técnica de exci-são de marcador, usando as propriedades de dupla função da D-aminoácidooxidase. Dessa forma, uma concretização da invenção refere-se a um méto-do compreendendo as etapas de:

i) transformação de células da planta Zea mays com uma primeira cons-trução de DNA compreendendo

a) pelo menos uma primeira construção de expressão, compreen-dendo um promotor de ubiquitina e, ligada ao mesmo de modoque permite operação, uma seqüência de ácido nucleico que co-difica uma enzima do tipo D-aminoácido oxidase, em que o pri-meiro cassete de expressão é flanqueado por seqmências quepermitem a deleção específica do referido primeiro cassete deexpressão, e

b) pelo menos um segundo cassete de expressão, adequado paraconferir uma característica agronomicamente valiosa à referidaplanta, em que o referido segundo cassete de expressão não es-tá localizado entre as referidas seqmências que permitem a dele-ção específica do referido primeiro cassete de expressão, e

ii) tratamento das referidas células transformadas da planta Zea mays daetapa i) com um primeiro composto selecionado do grupo constituídopor D-alanina, D-serina ou derivados destes, em uma concentração Α-totóxica, e a seleção de células da planta compreendendo em seus ge-nomas a referida primeira construção de DNA, conferindo resistênciaàquelas referidas células transformadas da planta contra o referidoprimeiro composto pela expressão da referida D-aminoácido oxidase, e

iii) indução da deleção do referido primeiro cassete de expressão, do ge-noma das referidas células transformadas da planta, e o tratamentodas referidas células da planta com um segundo composto, seleciona-do do grupo constituído porD-isoleucina, D-valina e derivados destes,em uma concentração tóxica para as células da planta, compreenden-do ainda o referido primeiro cassete de expressão, e dessa forma, aseleção de células da planta compreendendo o referido segundo cas-sete de expressão, porém desprovido do referido primeiro cassete deexpressão.

Preferencialmente, o promotor da ubiquitina e/ou a D-aminoácido oxidase são definidos conforme acima.

Outra concretização da invenção refere-se a uma construção deexpressão recombinante, compreendendo um promotor de ubiquitina e, liga-da ao mesmo de modo que permite operação, uma seqüência de ácidos nu-cleicos que codifica uma enzima capaz de metabolizar D-alanina ou D-serina, em que o referido promotor é heterólogo, em relação à referida se-qüência que codifica a enzima. Preferencialmente, o promotor da ubiquitinae/ou a D-aminoácido oxidase são definidos conforme acima.

Ainda outra concretização da invenção refere-se a uma constru-ção de DNA, compreendendo

i) pelo menos uma primeira construção de expressão, compreendendoum promotor de ubiquitina e, ligada ao mesmo de modo que permiteoperação, uma seqüência de ácidos nucleicos que codifica uma enzimacapaz de metabolizar D-alanina e/ou D-serina,

Preferencialmente, o promotor da ubiquitina e/ou a D-aminoácido oxidase são definidos conforme acima. Preferencialmente, a re-ferida construção de DNA compreende características que permitem a dele-ção de marcador, preferencialmente a referida construção compreende

a) uma primeira construção de expressão, compreendendo uma seqüên-cia de ácido nucleico que codifica uma D-aminoácido oxidase, opera-conalmente ligada a um promotor de ubiquitina, em que o referido pri-meiro cassete de expressão é flanqueado por seqmências que permi-tem a deleção específica do referido primeiro cassete de expressão, e

b) pelo menos um segundo cassete de-expressão, adequado para conferiruma característica agronomicamente valiosa à referida planta, em queo referido segundo cassete de expressão não está localizado entre asreferidas seqmências que permitem a deleção específica do referidoprimeiro cassete de expressão.

Mais preferencialmente, as referidas seqmências que permitemdeleção específica do referido primeiro cassete de expressão são seleciona-das do grupo de seqmências constituídas por

a) sítios de recombinação para uma recombinase específica das seqmên-cias, arranjados de forma que a recombinação entre os referidos sítiosque flanqueia a recombinação resulta em deleção das seqmências nomeio do genoma, e

b) seqmências homólogas AeA' com comprimento e homologia suficientepara assegurar uma recombinação homóloga entre A e A11 e com umaorientação que - na recombinação entre AeA'- resultará em deleçãodas seqmências no meio do genoma.

Ainda mais preferencialmente, a referida construção (para dele-ção de marcador) compreende, pelo menos, um sítio de reconhecimentopara uma nuclease de seqüência específica, localizada entre as referidasseqmências que permite a deleção específica do referido primeiro cassetede expressão.

Outras concretizações da invenção referem-se a um vetor, com-preendendo uma construção de expressão ou uma construção de DNA1 se-lecionadas entre as da invenção, uma célula transgênica ou organismo não-humano, compreendendo uma construção de expressão, uma construção deDNA ou um vetor da invenção. Preferencialmente a referida célula transgê-nica ou organismo não-humano é uma célula de planta e/o o referido orga-nismo é um organismo de planta, mais preferencialmente uma célula daplanta Zea mays e/ou uma planta Zea mays.

Dessa forma, outra concretização da invenção refere-se a umaplanta Zea mays transgênica, e fértil, compreendendo em seu genoma umaconstrução de DNA estavelmente integrada, compreendendo

a) ~pelo~ menos uma~primeira construção de ~expressão;~compreendendo

um promotor de ubiquitina e, ligada ao mesmo de modo que permiteoperação, uma seqüência de ácidos nucleicos que codifica uma enzimacapaz de metabolizar D-alanina e/ou D-serina,

b) pelo menos uma segunda construção de expressão, conferindo à refe-rida planta Zea mays uma característica agronomicamente valiosa.

Preferencialmente, a planta de milho, empregada para transfor-mação, é obtida pelo cruzamento de um híbrido (HilIA χ A188) com uma Ii-nhagem natural, selecionada do grupo, do qual uma semente representativafoi depositada junto à coleção American Type Culture Collection, sob a De-signação de Depósito de Patente PTA-6170 e PTA-6171. Preferencialmente,o promotor da ubiquitina e/ou a D-aminoácido oxidase são definidas, con-forme acima. Concretizações adicionais da invenção referem-se a plantasque descedem de uma planta de milho da invenção, de plantas híbridas enaturais, produzidas a partir de qualquer planta de milho da inveção, men-cionada acima, e partes das referidas plantas de milho. Partes preferidassão selecionadas do grupo constituído por tecido, células, pólen, óvulo, raí-zes, folhas, sementes, micrósporos e partes vegetativs.

Os métodos e composições da invenção podem ser vantojamen-te empregados em abordagens que visam o empilhamento de genes (ouseja, para transformações múltiplas subseqmentes). Dessa forma, outra con-cretização das invenções refere-se a um método para transformação sub-seqmente de pelo menos duas construções de DNA em uma planta Zeamays, compreendendo as etapas de

a) uma transformação com uma primeira construção, a referida constru-ção, pelo menos, uma construção de expressão, compreendendo umpromotor de ubiquitina e, ligada ao mesmo de modo que permite ope-ração, uma seqüência de ácidos nucleicos que codifica uma enzimacapaz de metabolizar D-alanina e/ou D-serina,e

b) uma transformação com uma segunda construção, a referida constru-ção, compreendendo um segundo gene marcador de seleção que nãoconfere resistência contra D-alanina ou D-serina.

Preferencialmenterxrreferido-segundo gene marcador confereresistência contra, pelo menos, um composto selecionado do grupo constitu-ído por fosfinotricina, glifosato e herbicidas do tipo sulfonil uréia e imidazoli-nona. Mais preferencialmente, o gene do marcador é selecionado do grupode genes mutantes Xl 12 ahas e genes mutantes XA17 ahas.

As plantas de milho, providas por este método, são incluídastambém. Assim, outra concretização refere-se a uma planta de milho, com-preendendo

a) uma primeira construção de expressão, compreendendo um promotorde ubiquitina e, ligada ao mesmo de modo que permite operação, umaseqüência de ácidos nucleicos que codifica uma enzima capaz de me-tabolizar D-alanina e/ou D-serina,

b) uma segunda construção de expressão de um gene marcador de sele-ção, que não confere resistência contra D-alanina ou D-serina.

Além disso, o gene da dsdA e dao, provido de acordo com opresente, pode ser empregado também em transformações subseqmentes.

Dessa forma, outra concretização da invenção refere-se a um método paratransformação subseqmente de pelo menos duas construções de DNA emuma planta Zea mays, compreendendo as etapas de

a) uma transformação com uma primeira construção, a referida constru-ção compreendendo uma construção de expressão, compreendendoum promotor da planta e, ligada ao mesmo de modo que permite ope-ração, uma seqüência de ácidos nucleicos que codifica uma enzima dotipo dsdA, e a seleção com D-serina,e

b) uma transformação com uma segunda construção, a referida constru-ção compreendendo uma construção de expressão, compreendendoum promotor da planta e, ligada ao mesmo de modo que permite ope-ração, uma seqüência de ácidos nucleicos que codifica uma enzima dotipo dao, e a seleção com D-alanina.

Um objetivo adicional da invenção refere-se a plantas que des-cendem de uma planta de milho da invenção, plantas híbridas e planta natu-rais das referidas plantas descendentes, e parte das plantas de milho, ante-riormente mencionadas. Partes preferidas são selecionadas do grupo consti-tuído por tecido, células, pólen, óvulo, raízes, folhas, sementes, micrósporose partes vegetativs.

Descrição dos Desenhos

Figura 1 - Efeito da D-alanina inibição da germinação de embri-ões imaturos de milho dissecados.

Figura 2 - Efeito da D-serina na inibição da germinação de em-briões imaturos de milho dissecados.

Definições Gerais

Os ensinamentos, métodos, seqmências, etc. empregados edescritos nos pedidos de patentes internacionais WO 03/004659 (SISTE-MAS RECOMBINANTES E MÉTODO PARA REMOVER SEQMÊNCIAS DEÁCIDOS NUCLEICOS DO GENOMA DE ORGANISMOS EUCARIÓTICOS),WO 03/060133 (CRESCIMENTO VEGETAL SELETIVO UTILIZANDO -AMINOÁCIDOS), no pedido de patente internacional PCT/EP 2005/002735,no pedido de patente internacional PCT/EP 2005/002734, e no pedido depatente US provisional N0 60/612 432, depositado em 23.09.2004, são aquiincorporados por referência no presente pedido de patente.

Deverá ser entendido que esta invenção não se restringe à me-todologia, protocolos, linhagens de células, espécies ou gêneros de plantas,construções e reagentes específicos, descritos como tanto.

Deverá ser entendido também que a terminologia utilizada nopresente visa somente descrever concretizações específicas e não limitar aabrangência da presente invenção, a qual será limitada somente pelas rei-vindicações anexadas. Cabe observar que, conforme utilizadas no presentee nas reivindicações anexadas, as formas no singular "um", "e" e "o", inclu-em referências no plural, salvo se o contexto ditar claramente em contrário.Dessa forma, por exemplo, referência a "um vetor" é uma referência a um oumais vetores e inclui equivalentes do mesmo, conhecidos daqueles versadosna técnica, e assim por diante.

O termo "aproximadamente" é utilizado no presente pretendendosignificar grosso modo, em torno de ou na região de. Quando o termo "apro-ximadamente"~for utilizado" junto "com um'intervalo numérico; ele modificaaquele intervalo, estendendo os limites acima e abaixo dos valores numéri-cos apresentados. De modo geral, o termo "aproximadamente" é utilizado nopresente para modificar um valor numérico acima e abaixo do valor declara-do, em uma variação de 20 por cento, preferencialmente 10 por cento, maispreferencialmente 5 por cento acima ou abaixo (superior ou inferior).

Conforme utilizada no presente, a palavra "ou" significa qualquercomponente de uma determinada lista, e inclui também qualquer combina-ção de componentes daquela lista.

"Característica agronomicamente valiosa" inclui qualquer fenóti-po em um organismo vegetal, útil ou vantajoso para produção de alimentosou produtos alimentícios, incluindo partes de plantas e produtos vegetais.Produtos agrícolas não-alimentados, como papel e outros, estão incluídostambém. Uma lista parcial de características agronomicamente valiosas in-clui resistência à peste, vigor, tempo de desenvolvimento (tempo para colhei-ta), teor nutritivo reforçado, novos padrões de crescimento, sabores ou co-res, sal, tolerância a calor, seca e frio e similares. Preferencialmente, ca-racterísticas agronomicamente valiosas não incluem genes de marcadoresselecionáveis (por exemplo, genes que codificam resistência a herbicidas ouantibióticos, utilizados somente para facilitar a detecção ou seleção de célu-Ias transformadas), genes de biossíntese de hormônios levando à produçãode hormônio vegetal (por exemplo, auxinas, giberlinas, citocininas, ácidoabscísico e etileno, utilizados somente para seleção) ou genes repórteres(por exemplo, luciferase, glicuronidase, cloranfenicol acetil transferase(CAT), etc.). Estas importantes características agronomicamente valiosaspodem incluir melhora de resistência à peste (por exemplo, Melchers 2000),vigor, tempo de desenvolvimento (tempo para colheita), teor nutritivo refor-çado, novos padrões de crescimento, sabores ou cores, sal, resistência acalor, a seca e frio (por exemplo, Sakamoto 2000; Saijo 2000; Yeo 2000;Cushman 2000) e similares. Aqueles com conhecimento técnico reconhece-rão que há inúmeros polinucleotídeos que podem ser escolhidos para confe-rir estas e outras características agronomicamente valiosas.

Conforme utilizada no presente; a expressão "seqüência de ami-noácidos" refere-se a uma lista de abreviações, letras, caracteres ou pala-vras que representam resíduos de aminoácidos. Aminoácidos podem serreferidos, no presente, pelo símbolo de suas três letras habitualmente co-nhecidas ou por símbolos de uma letra, recomendados pela Comissão deNomenclatura Bioquímica do IUPAC-IUB. Da mesma forma, nucleotídeospodem ser referidos por-seus códigos-de uma letra, comumente aceitos. Asabreviações utilizadas no presente, para aminoácidos, são códigos conven-cionais de uma letra. A, alanina; B, asparagina ou ácido aspártico; C, cisteí-na; D ácido aspártico; E, glutamato, ácido glutâmico; F, fenilalanina; G, glici-na; H histidina; I isoleucina; K, lisina; L, leucina; M, metionina; N, asparagina;Ρ, prolina; Q, glutamina; R1 arginina ; S, serina; T, treonina; V, valina; W1 trip-tofano; Y, tirosina; Z, glutamina ou ácido glutâmico (consultar L. Stryer, Bio-chemistry, 1988, W. H. Freeman and Company, New York). A letra "x", con-forme utilizada no presente, em uma seqüência de aminoácidos pode repre-sentar qualquer resíduo de aminoácido.

O termo "ácido nucleotídeo" refere-se a desoxirribonucleotídeosou ribonucleotídeos, e polímeros ou híbridos destes, na configuração de fitasimples ou dupla, no sentido senso ou antissenso.

A frase "seqüência de ácidos nucleotídeos", conforme utilizadano presente, refere-se a uma lista consecutiva de abreviações, letras, carac-teres ou palavras que representam nucleotídeos. Em uma concretização, umácido nucleotídeo pode ser uma "sonda", representando um ácido nucleotí-deo curto, geralmente contando em seu comprimento com menos de 100nucleotídeos. Geralmente, o comprimento de uma sonda de ácidos nucleotí-deos varia de aproximadamente 50 nucleotídeos a 10 nucleotídeos. Uma"região-alvo" de um ácido nucleotídeo é uma porção de um ácido nucleotí-deo identificada como de interesse. Uma "região codificadora" de um ácidonucleotídeo é a porção do ácido nucleotídeo que é transcrita e traduzida, demaneira específica para a seqüência, de forma a produzir um determinadopolipeptídeo ou proteína, quando colocada sob o controle de seqmênciasreguladoras apropriadas. A região codificadora refere-se à codificação deste-polipeptídeo ou-proteína. Salvo se-indicado de outra forma, uma determina-da seqüência de ácidos nucleotídeos abrange implicitamente também vari-antes conservadoramente modificadas desta (por exemplo, substituiçõesdegeneradas de códons) e seqmências complementares, além de a seqüên-cia explicitamente indicada. O termo "ácido nucleico" é utilizado alternada-mente no presente com "gene", "cDNA", "mRNA", "oligonucleotídeo" e "poli-nucleotídeo".

O termo "seqüência de nucleotídeos de interesse" refere-se aqualquer seqüência de nucleotídeos, cuja manipulação pode ser considera-da desejável por qualquer motivo (por exemplo, confere qualidades melho-radas) por especialistas comuns da técnica. Estas seqmências de nucleotí-deos incluem, entre outras, seqmências de codificação de genes estruturais(por exemplo, genes repórteres, genes marcadores de seleção, oncogenes,genes de resistência a fármacos, fatores de crescimento, etc.) e seqmênciasreguladoras que não codificam um mRNA ou produto proteico, (por exemplo,seqüência de promotor, seqüência de poliadenilação, seqüência terminado-ra, seqüência reforçadora, etc.). Uma seqüência de ácidos nucleicos de inte-resse pode codificar preferencialmente uma característica agronomicamentevaliosa.

O significado do termo "antissenso" deverá ser entendido comoum ácido nucleico contendo uma seqüência complementar de uma seqüên-cia alvo, por exemplo, uma seqüência de RNA mensageiro (mRNA), para aqual é buscado inicialmente o bloqueio de expressão, por hibridização com aseqüência alvo.

O significado do termo "senso" deverá ser entendido como umfator de transcrição de proteína envolvido na expressão de um determinadogene. De acordo com uma concretização preferida, o ácido nucleico com-preende um gene de interesse e elementos que possibilitam a expressão doreferido gene de interesse.

Conforme utilizado no presente, o termo "complementar" ou"complementação" são utilizados em referência a seqmências de nucleotí-deos que obedecem as regras de pareamento de bases. Por exemplo, a se-qüência 5-AGT-3L complementa a seqúencia 5'-AGT-3'. A complementaçãopode ser "parcial" ou "total". Complementação "parcial" é quando a combi-nação de uma ou mais bases do ácido nucleotídeo não obedece as regrasde pareamento de bases. Complementação "total" ou "completa", entre áci-dos nucleicos, significa que cada uma e todas as bases do ácido nucleicocombinam-se com outra base de acordo com as regras de pareamento debases. O grau de complementação entre fitas de ácidos nucleicos afeta sig-nificativamente a eficiência e força de hibridização entre fitas de ácidos nu-cleicos. Um "complemento" de uma seqüência de ácidos nucleicos, confor-me utilizado no presente, refere-se a uma seqüência de nucleotídeos cujosácidos nucleicos exibem complementação total com os ácidos nucleicos daseqüência de ácidos nucleotídeos.

O termo "genoma" ou "DNA genômico" refere-se a informaçãogenética hereditária de um organismo hospedeiro. O referido DNA genômicocompreende o DNA do núcleo (também referido como DNA cromossômico),porém também o DNA de plastídeos (por exemplo, cloroplastos) e outrasorganelas celulares (por exemplo, mitocôndria). Preferencialmente, os ter-mos genoma e DNA genômico referem-se ao DNA cromossômico do núcleo.

O termo "DNA cromossômico" ou "seqüência de DNA cromos-sômico" deve ser entendido como o DNA genômico do núcleo da célula, in-dependente do status do ciclo em que a célula se encontra. DNA cromossô-mico poderia, portanto, ser organizado em cromossomos ou cromotídeos,podendo estar condensados ou desenovelados. Uma inserção no DNA cro-mossômico pode ser demonstrada e analisada por vários métodos conheci-dos na técnica como, por exemplo, análise por reação em cadeia da polime-rase (PCR), análise de Southern blot, hibridização in situ por fluorescência(FISH) e PCR in situ.

Preferencialmente, o termo "isolado", quando utilizado em rela-ção a um ácido nucleico, como em "uma seqüência isolada de ácidos nuclei-cos", refere-se a uma seqüência de ácidos nucleicos, identificada e separa-da de pelo menos um ácido nucleico contaminante, ao qual está habitual-mente associada em sua origem natural. Ácido nucleico isolado é o ácidonucleico presente em umã configuração ou arranjo, diferente dó que o en-contrado na natureza. Por outro lado, ácidos nucleicos não-isolados são áci-dos nucleicos, como DNA e RNA, encontrados no estado em que existem nanatureza. Por exemplo, uma determinada seqüência de DNA (por exemplo,um gene) é encontrada no cromossomo da célula hospedeira, próxima a ge-nes vizinhos; seqmências de RNA, como uma seqüência específica de RNAque codifica uma proteína específica, estão presentes na célula misturados ainúmeros outros mRNAs que codificam uma pluralidade de proteínas. Con-tudo, uma seqüência isolada de ácidos nucleicos compreendendo a SEQ IDNO:1 inclui, a título de exemplo, as seqmências de ácidos nucleicos em célu-las que contêm habitualmente a SEQ ID NO:1, podendo esta seqüência deácido nucleico estar dentro ou fora do cromossomo, diferentemente do localem que está presente em células naturais, ou, então, pode ser flanqueadapor uma seqüência diferente de ácidos nucleicos daquela presente na natu-reza. A seqüência isolada de ácidos nucleicos pode ocorrer em fita simplesou dupla. Quando uma seqüência de ácidos nucleicos tiver que ser utilizadapara expressar uma proteína, a seqüência de ácidos nucleicos conterá, nomínimo, pelo menos uma parte da fita senso ou de codificação (isto é, a se-qüência de ácidos nucleicos pode ser em fita simples). Alternativamente, elapode conter fitas senso e antissenso (ou seja, a seqüência de ácidos nuclei-cos pode ser em fita dupla).

Conforme utilizado no presente, o termo "purificado" refere-se amoléculas, seqmências de ácidos nucleicos ou aminoácidos, que são remo-vidas de seu ambiente natural, isoladas ou separadas. Uma "seqüência iso-lada de ácidos nucleicos" é, portanto, uma seqüência purificada de ácidosnucleicos. Moléculas "substancialmente purificadas" são aquelas pelo menos60% livres, preferencialmente, pelo menos 75% livres e, mais preferencial-mente, pelo menos 90% livres de outros componentes aos quais estão natu-ralmente associadas.

Uma "construção de polinucleotídeos" refere-se a um ácido nu-cleico criado, pelo menos parcialmente, por processos recombinantes. Otermo "construção de DNA" refere-se a uma construção de polinucleotídeosconstituída por dèoxirribonucleotídeos. A construção pode ser de fita simples-ou - preferencialmente - de fita dupla. A construção pode ser circular oulinear. O versado na técnica está familiarizado com uma variedade de ma-neiras para se obter uma construção de DNA. As construções podem serpreparadas por meio de técnicas habituais de recombinação e de clonagem,conforme descritas, por exemplo, em Maniatis 1989, Silhavy 1984 e em Au-subel 1987.

O termo "tipo selvagem", "natural" ou de "origem natural" signif-ca, a respeito de um organismo, polipeptídeo ou seqüência de ácidos nuclei-cos, que o referido organismo é o existente em natureza ou está disponívelem, pelo menos, um organismo existente em natureza e não foi modificado,não sofreu mutações ou foi, de outra forma, manipulado pelo homem.

O termo "gene estrangeiro" refere-se a qualquer ácido nucleico(por exemplo, seqüência de genes), introduzido no genoma de uma célulapor manipulações experimentais e pode incluir seqmencias gênicas encon-tradas naquela célula, desde que o gene introduzido contenha alguma modi-ficação (por exemplo, um ponto de mutação, a presença de um gene marca-dor selecionável, etc.), em relação ao gene que exista na natureza.

Os termos "seqüência heteróloga de ácidos nucleicos" ou "DNAheterólogo" são utilizados alternadamente para fazer referência a uma se-quência de nucleotídeos, ligada ou manipulada para se ligar a uma seqüên-cia de ácidos nucleicos á qual não está ligada na natureza ou a qual estáligada em uma localização diferente na natureza. DNA heterólogo não é en-dógeno em relação à célula a qual é introduzido, porém aquele obtido deoutra célula. Geralmente, embora não necessário, este DNA heterólogo codi-fica RNA e proteínas que não são produzidas naturalmente pela célula naqual ocorre a sua expressão. Uma seqüência promotora que regula a trans-crição ou outro elemento genético é considerada "heterológa", em relação àoutra seqüência (por exemplo, que codifica uma seqüência de marcador ouuma característica agronomicamente relevante), se as referidas duas seq-mências não se combinam ou se ligadas de modo diferente do que o quepermite operação em seu ambiente natural. Preferencialmente, as referidasseqmências não são ligadas de modo que permite operação em seu ambien-te natural (isto é, provêem de genes diferentes). Mais preferencialmente, aseqüência reguladora está ligada covalentemente e adjacente a um ácidonucleico do qual não é adjacente em seu ambiente natural.

O termo "transgene", conforme utilizado no presente, refere-se aqualquer seqüência de ácidos nucleicos, introduzida no genoma de uma cé-lula ou que foi-manipulada por manipulações experimentais, conduzidas pelohomem. Preferencialmente, a referida seqüência é resultante em um geno-ma diferente do que ocorre naturalmente em um organismo (por exemplo, areferida seqüência, se endógeno para o referido organismo, é introduzida emum local diferente de sua localização natural, ou o número de suas cópiasestá aumentado ou diminuído). Um transgene pode ser uma "seqüência deDNA endógena", uma "seqüência de DNA exógena" (por exemplo, um geneestrangeiro) ou uma seqüência de DNA heteróloga. O termo "seqüência deDNA endógena" refere-se a uma seqüência de nucleotídeos, encontradanaturalmente na célula na qual é introduzida, desde que esta não contenhaqualquer modificação (por exemplo, um ponto de mutação, a presença deum gene de marcador selecionável, etc.), em relação à seqüência natural-mente existente.

O termo "transgênico" ou "recombinante" quando utilizado emreferência a uma célula ou organismo (por exemplo, a respeito de uma plan-ta Zea mays ou célula de planta) refere-se a uma célula ou organismo quecontém um transgene, ou cujo genoma foi alterado pela introdução de umtransgene. Um organismo ou tecido transgênico pode compreender uma oumais células transgênicas. Preferencialmente, o organismo ou tecido é subs-tancialmente constituído por células transgênicas (ou seja, mais de 80%,preferencialmente 90%, mais preferencialmente 95%, e o mais preferível,99% das células no referido organismo ou tecido são transgênicas).

Um "polipeptídeo recombinante" é um polipeptídeo que não o-corre naturalmente e que difere, em termos de seqüência, de um polipeptí-deo que ocorre naturalmente em pelo menos um resíduo de aminoácido.

Métodos preferidos para produção do referido polipeptídeo e/ou ácido nucle-- ico recombinante pode compreender mutagênese dirigida ou não dirigida,embaralhamento de DNA ou outros métodos de recombinação recursiva.

Os termos "homologia" ou "identidade", quando utilizados emrelação a ácidos nucleicos, refere-se a grau de complementariedade. Homo-logia ou identidade entre dois ácidos nucleicos deve ser entendida como aidentidade da seqüência de ácidos nucleicos, em cada caso, ao longo detodo o comprimento da seqüência, calculada por comparação com a ajudado programa de algorítimo GAP (Wisconsin Package Versão 10.0, Universi-dade de Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA) comos parâmetros estabelecidos da forma como segue:

Peso por Lacun ("Gap Weight"): 12<table>table see original document page 23</column></row><table>

Por exemplo, uma seqüência com pelo menos 95% de homolo-gia (ou identidade) em relação à seqüência SEQ ID NO: 1, em nível de ácidonucleico, deve ser entendida como uma seqüência que, em comparaçãocom a seqüência SEQ ID NO: 1 pelo programa de algorítimo acima com oconjunto de parâmetros acima, possui, pelo menos, 95% de homologia. Ahomologia pode ser parcial (ou seja, menos de 100 % de identidade de se-quência) ou completa (ou seja, 100% de identidade de seqüência).

O termo "hibridização", conforme utilizado no presente, inclui"qualquer processo pelo qual uma fita de ácido nucleico junta-se à fita com-plementar por pareamento de bases". (Coombs 1994). A hibridização e aforça da hibridização (ou seja, a força da associação entre os ácidos nuclei-cos) é afetada por fatores como o grau de complementação entre os ácidosnucleicos, a adstringência das condições envolvidas, o Tm do híbrido forma-do e a relação G:C entre os ácidos nucleicos. Conforme utilizado no presen-te, o termo "Tm" é utilizado em referência à "temperatura de fusão". A tem-peratura de fusão é aquela em que a metade do número total de moléculasde fitas duplas de ácidos nucleicos está dissociada em fitas simples. A e-quação para o cálculo da Tm de ácidos nucleicos é bem-conhecida na técni-ca. Conforme indicado por referências padrões, uma estimativa simples dovalor de Tm pode ser calculada pela equação: Tm=81,5 + 0,41 (% G+C),quando um ácido nucleico está em solução aquosa em NaCI a 1 M (consul-tar, Anderson and Young, Quantitative Filter Hybridization1 in Nucleic AcidHybridization (1985)). Outras referências incluem cômputos mais complica-dos que levam em conta características estruturais além de característicasda seqüência para o cálculo de Tm.

Um exemplo de condições de banho altamente adstringente éNaCI a 0,15 M a 72°C por aproximadamente 15 minutos. Um exemplo decondições adstringentes é um banho de 0,2 X SSC a 65°C por 15 minutos(consultar, Sambrook, infra, para obter uma descrição de tampão SSC). Umbanho de alta adstringência é freqmentemente precedido por um banho debaixa adstringência para remover o sinal de fundo da sonda. Um exemplo debanho de adstringência média para um duplex de, por exemplo, mais de 100nucleotídeos é 1 X SSC a 45°C por 15 minutos. Um exemplo de banho debaixa adstringência para um duplex de, por exemplo, mais de 100 nucleotí-deos é 4 X SSC a 40°C por 15 minutos. Para sondas curtas (por exemplo,de aproximadamente 10 a 50 nucleotídeos), condições adstringentes envol-vem tipicamente concentrações de sal inferiores a aproximadamente 1,5 M1mais preferencialmente de aproximadamente 0,01 a 1,0 M, concentração doíon de Na (ou de outros sais) em pH 7,0 a 8,3, e a temperatura é, tipicamen-te, pelo menos em torno de 30°C e, pelo menos, em torno de 60°C parasondas longas (por exemplo, >50 nucleotídeos). Pode-se obter tambémcondições adstringentes com o acréscimo de agentes desestabilizantes co-mo formamida. De modo geral, um sinal para relação sonora de 2x (ou maisalta) àquela observada para uma sonda não relacionada, em um determina-do ensaio de hibridização, indica detecção de uma hibridização específica. Eainda, ácidos nucleicos não se hibridizam, sob condições adstringentessubstancialmente idênticas, se as proteínas que eles codificam forem subs-tancialmente idênticas. Isso ocorre, por exemplo, quando uma cópia de umácido nucleico é criada, utilizando a degeneração máxima de códons que épermitida pelo código genético.

São selecionadas-condições muito adstringentes para igualar àsde Tm de uma determinada sonda. Um exemplo de condições altamente ads-tringentes para hibridização de ácidos nucleicos complementares, com maisde 100 resíduos complementares, em filtração por Southern ou Northernblot, é formamida a 50%, por exemplo, hibridização em formamida a 50%,NaCI a 1 M, SDS a 1% a 37°C e um banho em 0,1 χ SSC a temperatura de60 a 65°C. Condições exemplares de baixa adstringência incluem hibridiza-ção com uma solução tampão de formamida em concentração de 30 a 35%,NaCI a 1 M, SDS a 1% (dodecil sulfato de sódio) a 37°C e um banho em 1Xa 2X SSC (20 X SSC = NaCI a 3,0/citrato trissódico a 0,3 M) a temperaturade 50 a 55°C. Condições exemplares de adstringência moderada incluemhibridização em formamida em concentração de 40 a 45%, NaCI a 1,0 M1SDS a 1% a 37°C e banho em 0,5 X a 1 X SSC a temperatura de 55 a 60°C.

O termo "equivalente" quando em referência a uma condição dehibridização, conforme esta se relaciona a uma condição de hibridização deinteresse, significa que as duas condições de hibridição levam à hibridizaçãode seqmências de ácidos nucleicos com o mesmo intervalo percentual (%)de homologia. Por exemplo, se uma condição de hibridização de interesselevar à hibridização de uma primeira seqüência de ácidos nucleicos com ou-tras seqmências de ácidos nucleicos que possuem de 80% a 90% de homo-logia, relativa á primeira seqüência de ácidos nucleicos, nesse caso, a outracondição de hibridização é dita como sendo equivalente à condição de hibri-dização de interesse, se esta outra condição de hibridização levar também àhibridização da primeira seqmencia de ácidos nucleicos com as outras seq-mências de ácidos nucleicos que possuem de 80% a 90% de homologia, emrelação à primeira seqüência de ácidos nucleicos.

Quando utilizado em referência à hibridização de ácidos nuclei-cos, é conhecido pela técnica que inúmeras condições equivalentes podemser empregadas para incluir condições de alta ou baixa adstringência; fato-res como o comprimento e natureza (DNA, RNA1 composição de bases) dasonda e natureza do alvo (DNA, RNA, composição de bases, presente emsolução ou imobilizado, etc.) e a concentração de sais e de outros compo-nentes (por exemplo, a ausência ou presença de formamida, sultafo de dex-trano, polietileno glicol) são considerados e a solução da hibridização podeser variada para gerar condições de hibridização de baixa ou alta adstrin-gência diferentes, porém equivalentes, às condições listadas acima. Versa-dos na técnica sabem que enquanto níveis mais altos de adstringência po-dem ser preferidos para reduzir ou eliminar a ligação não-específica, níveismais baixos de adstringências podem ser os escolhidos para detectar umnumero maior de seqmências de ácidos nucleicos com homologias diferentes.

O termo "gene" refere-se a uma região codificadora, combinadaao peptídeo de alguma maneira de modo que permita operação. Um geneinclui regiões reguladoras não-traduzidas de DNA (por exemplo, promotores,reforçadores, repressores, etc.), que precedem (upstream) e que sucedem(downstream) a região condificadora (fase de leitura aberta, ORF), bem co-mo, quando aplicável, seqmências interferentes (ou seja, íntrons) entre regi-ões codificadoras individualizadas (ou seja, éxons). O termo "gene estrutu-ral", conforme utilizado no presente, visa significar uma seqüência de DNA,transcrita no mRNA, e que, em seguida, é traduzida em uma seqüência deaminoácidos, característica de um polipeptído específico.

Conforme utilizado no presente, o termo "região codificadora",quando em referência a um gene estrutural, refere-se às seqmências de nu-cleotídeos que codificam os aminoácidos presentes no polipeptídeo inicial,resultantes da tradução de uma molécula de mRNA. A região codificadora édelimitada, em eucariotos, na extremidade 5' pela trinca de nucleotídeo"ATG" que codifica o iniciador metionina, e na extremidade 3' por uma dastrês trincas que especificam códons de parada (ou seja, TAA, TAG, TGA).

Além de conter íntrons, as formas genômicas de um gene podem incluir tam-bém seqmências localizadas em ambas as extremidades 5' e 3' das seq-mências que estão presentes no RNA transcrito. Estas seqmências são refe-ridas como seqmências ou regiões "flanqueadoras" (estas seqmências flan-queadoras estão localizadas em 5' e 3' para as seqmências não-traduzidas,presentes no mRNA transcrito). A região flanqueadora 5' pode conter seq-mências reguladoras7como as de promotores e reforçadores, que controlamou influenciam a transcrição do gene. A região flanqueadora 3' pode conterseqmências que comandam o término da transcrição, clivagem pós-transcricional e poliadenilação.

Os termos "polipeptídeo", "peptídeo", "oligopeptídeo", "produtogenético", "produto de expressão" e "proteína" são utilizados alternadamen-te, no presente, em referência a um polímero ou oligômero de resíduos con-secutivos de aminoácidos.

O termo "isolado", conforme utilizado no presente, significa queum material foi removido de seu ambiente natural. Por exemplo, um polinu-cleotídeo ou polipeptídeo, que existe naturalmente e está presente em umanimal vivo não é isolado, porém o mesmo polinucleotídeo ou polipeptídeo édito isolado quando separado de algum ou de todos os materiais co-existentes no sistema natural. Estes polinucleotídeos podem fazer parte deum vetor e/ou estes polinucleotídeos ou polipeptídeos poderiam fazer partede uma composição e serem isolados se este vetor ou composição não fizerparte de seu ambiente original.

A expressão "organismo geneticamente modificado" ou "GMO"refere-se a qualquer organismo que compreende DNA transgênico. Exem-plos destes organismos incluem plantas, animais e micro-organismos.

O termo "célula" ou "célula de planta", conforme utilizado no pre-sente, refere-se a uma única célula. O termo "células" refere-se a uma popu-lação de células. A população pode ser uma população pura, compreenden-do um único tipo de célula. Da mesma forma, a população pode compreen-der mais de um tipo de célula. Na presente invenção, não há limite sobre onúmero de tipos de células que uma população de células pode compreen-der. As células podem ser sincronizadas ou não. Uma célula de planta, nocontexto desta invenção, pode ser isolada (por exemplo, em cultura de sus-pensão) ou estar compreendida em um tecido ou órgão de planta ou naplanta em qualquer estágio de desenvolvimento.

O termo "órgão", a respeito de uma planta (ou "órgão de planta")significa partes de uma planta e pode incluir (porém sem estar limitada aosmesmos), por exemplo, raízes, frutos, brotos, tronco, folhas, anteras, sépa-Ias1 pétalas, pólen, sementes, etc.

O termo "tecido", a respeito de uma planta (ou "tecido de planta")significa um arranjo de múltiplas células da planta, incluindo tecidos da plan-ta diferenciados e não diferenciados. Tecidos de uma planta podem constitu-ir parte de um órgão da planta (por exemplo, a epiderme de uma folha deplanta), porém podem constituir também tecidos de tumores (por exemplo,tecido de calo) e vários tipos de células em cultura (por exemplo, células ú-nicas, protoplastos, embriões, calos, protocormos, etc.). O tecido de plantaspode estar presente in planta, em cultura de órgão, cultura de tecido ou cul-tura de célula.O termo "planta", conforme utilizado no presente, refere-se auma multiplicidade de células de plantas com estrutura amplamente diferen-ciadas e que estão presentes em qualquer estágio do desenvolvimento deuma planta. Estas estruturas incluem um ou mais órgãos da planta, entreeles, fruto, broto, tronco, folha, pétala de flor, etc.

O termo "DNA cromossômico" ou "seqüência de DNA cromos-sômico" deve ser entendido como o DNA genômico do núcleo da célula, in-dependente do status do ciclo em que a célula se encontra. DNA cromossô-mico poderia, portanto, ser organizado em cromossomos ou cromatídeos,podendo estar condensados ou desenovelados. Uma inserção no DNA cro-mossômico pode ser demonstrada e analisada por vários métodos conheci-dos na técnica como, por exemplo, análise por PCR, análise de Southernblot, hibridização in situ por fluorescência (FISH) e PCR in situ.

O termo "gene estrutural", conforme utilizado no presente, visasignificar uma seqüência de DNA, transcrita no mRNA, e que, em seguida, étraduzida em uma seqüência de aminoácidos, característica de um polipep-tído específico.

O termo "expressão" refere-se à biossíntese de um produto ge-nético. Por exemplo, no caso de um gene estrutural, a expressão envolvetranscrição do gene estrutural no mRNA e - opcionalmente - a tradução sub-seqmente do mRNA em um ou mais polipeptídeos.

O termo "cassete de expressão" ou "construção de expressão",conforme utilizado no presente, pretende signicar a combinação de qualquerseqüência de ácidos nucleicos que pode ser expressa e ligada, de modo quepermite operação, a uma seqüência de promotor e - opcionalmente - ele-mentos adicionais (como, por exemplo, seqmências terminadora e/ou depoliadenilação) que facilitam a expressão da referida seqüência de ácidosnucleicos.

"Promotor", "elemento promotor" ou "seqüência de promotor",conforme utilizados no presente, refere-se às seqmências de nucleotídeosna extremidade 5' de uma seqüência de nucleotídeos que comanda a inicia-ção da transcrição (ou seja, é capaz de controlar a transcrição da seqüênciade nucleotídeo no mRNA). Um promotor está tipicamente, embora não ne-cessariamente, localizado na extremidade 5' (ou seja, a montante (upstre-am)) de uma seqüência de nucleotídeos de interesse (por exemplo, próximoao sítio de iniciação transcricional de um gene estrutural), cuja transcrição nomRNA é controlada por ele, fornecendo um sítio para ligação específica paraRNA polimerase e outros fatores de transcrição para iniciação transcricional.Seqmências de promotores são necessárias, porém nem sempre suficientes,para levar à expressão de um gene a juzante (downstream). De modo geral,promotores eucarióticos incluem uma seqüência de DNA característica, ho-móloga à caixa de consenso 5'-TATAAT-3' (TATA), 5' aproximadamente 10-30 bp até o sítio de iniciação transcricional (cap), o qual, por convenção, énumerado +1. Bases 3' até o sítio cap recebem números positivos, enquantoque bases 5' até o sítio cap recebem números negativos, refletindo a suadistância do sítio cap. Outro componente do promotor, a caixa CAAT, 5' ge-ralmente de 30 a 70 bp da caixa TATA e possui homologia à forma canônica5'-CCAAT-3' (Breathnach 1981). Em plantas, a caixa CAAT é, às vezes,substituída por uma seqüência conhecida como a caixa AGGA1 uma regiãocom resíduos adenina, flanqueando simetricamente a trinca G(ou T)NG(Messing 1983). Outras seqmências que conferem influências reguladorassobre a transcrição podem ser encontradas na região do promotor e esten-derem-se até 5' com 1000 bp ou mais do sítio cap. O termo "constitutivo",quando em referência a um promotor, significa que o promotor é capaz decomandar a transcrição de uma seqüência de ácidos nucleicos, ligada demodo que permite operação, na ausência de um estímulo (por exemplo,choque térmico, produtos químicos, luz, etc.). Tipicamente, promotores cons-titutivos são capazes de comandar a expressão de um transgene em subs-tancialmente qualquer célula e qualquer tecido.

- - Controle regulador refere-se à modulação da expressão gênica,induzida por elementos da seqüência do DNA, localizados primariamente,porém não exclusivamente, a montante de (5' a) o sítio de iniciação detranscrição. A regulação pode resultar em resposta de completa a nenhumaa estímulos ambientais, ou pode resultar em variações no nível da expres-são gênica. Nesta invenção, os elementos reguladores do choque térmicoatuam intensificando temporariamente o nível de expressão gênica a juzanteem resposta à elevação súbita de temperatura.

O sinal de poliadenilação refere-se a qualquer seqüência de áci-dos nucleicos capaz de efetuar o processamento do mRNA, geralmente ca-racterizado pela adição de traços de ácido poliadenílico às extremidades 3'dos precursores do mRNA. O próprio segmento de DNA do sinal de poliade-nilação pode ser composto de segmentos derivados de diversas fontes, na-turalmente existentes ou sintéticas, podendo ser de um DNA genômico ouum cDNA derivado de RNA. Sinais de poliadenilação são comumente reco-nhecidos pela presença de homologia à forma canônica 5-AATAA-3', embo-ra variação de distância, leitura ("readthrough") parcial e múltiplas seqmên-cias canônicas em tandem não sejam incomuns (Messing 1983). Deve serreconhecido que um "sinal de poliadenilação" canônico pode, de fato, provo-car o término da transcrição e não a poliadenilação propriamente dita (Mon-tell 1983).

Elementos de choque térmico referem-se a seqmências de DNAque regulam a expressão gênica em resposta ao estresse de elevações sú-bitas de temperatura. A resposta é observada como uma intensificação ime-diata, apesar de transitória, no nível de expressão de um gene downstream.

O trabalho original de genes em choque térmico foi efetuado com drosófilas,porém muitas outras^espécies, incluindo plantas (Barnett , 1980) exibiramrepostas análogas a estresse. O componente primário fundamental do ele-mento de choque término foi descrito em drosófilas que tinham a seqüênciade consenso 5'-CTGGAATNTTCTAGA-3' (em que, N=A, T1 C, ou G) e de-vendo ser localizada na região entre os resíduos de bp 66 até 47 bp, a mon-tante do sítio de iniciação transcricional (Pelham 1982). Uma cópia de oligo-nucleotídeos quimicamente sintetizados desta seqüência de consenso podesubstituir a seqüência natural, termos de conferir capacidade de indução porchoque térmico. ·

Seqmência líder refere-se a uma seqüência de DNA, compreen-dendo em torno de 100 nucleotídeos, localizada entre o sítio de iniciaçãotranscricional e o sítio de iniciação de tradução. Incorporada na seqüêncialíder, há uma região que especifica o sítio de ligação de ribossomos.

Introns ou seqmências interferentes referem-se, neste trabalho,àquelas regiões da seqüência de DNA que são transcritas junto com as se-qmências de codificação (éxons), porém que são removidas na formação domRNA maduro. Podem existir íntrons em qualquer local dentro de uma se-qüência transcrita - entre seqmências de codificação do mesmo gene ou degenes diferentes, dentro da seqüência de codificação de um gene, interrom-pendo ou dividindo suas seqmências de aminoácidos e dentro da região dopromotor (5' até o sítio de iniciação de tradução). íntrons no transcrito primá-rio são extirpados e as seqmências de codificação são simultânea e preci-samente ligadas para formar o mRNA maduro. As junções de íntrons e é-xons formam os sítios de splice. A seqüência de bases de um íntron iniciacom GU e finaliza com AG. O mesmo sinal de splicing é encontrado em mui-tos eucariotos mais desenvolvidos.

O termo "vínculo operável" ou "ligado de modo que permita ope-ração" deve ser entendido para significar, por exemplo, o arranjo seqmenci-ado de um elemento regulador (por exemplo, um promotor) com uma se-qüência de ácidos nucleicos a ser expressa e, se apropriado, outros elemen-tos reguladores (como, por exemplo, um finalizador), de modo que cada e-Iemento regulador possa cumprir a sua função pretendida visando permitir,modificar, facilitar ou, de outra forma, influenciar a expressão da referida se-qüência de ácidos nucleicos. O resultado da expressão depende do arranjodas seqmências de ácidos nucleicos, em relação ao sentido senso ou antis-senso do RNA. Para essa finalidade, um vínculo direto, no contexto químico,não é necessariamente requerido. Seqmências de controle genético como,por exemplo, seqmências reforçadoras, podem exercer as suas funções so-bre a seqüência alvo, a partir de posições distantes ou, de fato, a partir deoutras moléculas de DNA. Arranjos preferidos são aqueles em que a se-quência de ácidos nucleicos a ser expressa por recombinação está posicio-nada atrás da seqüência que atua como promotor, de forma que as duasseqmências estão ligadas covalentemente entre si. A distância entre a se-quência do promotor e a seqüência de ácidos nucleicos a ser expressa porrecombinação é preferencialmente menor do que 200 pares de base, espe-cialmente preferível menor do que 100 pares de base, muito especialmentepreferível menor do que 50 pares de base. Vínculo operável e cassete deexpressão podem ser gerados por meio de técnicas costumeiras de recom-binação e de clonagem, conforme descritas (por exemplo, em Maniatis,1989; Silhavy, 1984; Ausubel, 1987; Gelvin, 1990). Contudo, outras seqmên-cias que, por exemplo, atuam como Iigante com sítios de clivagem específi-cos de enzimas de restrição, ou como peptídeo de sinal, podem ser posicio-nadas também entre as duas seqmências. A inserção de seqmências podelevar também à expressão de proteínas de fusão. Preferencialmente, o cas-sete de expressão, constituído por um vínculo de promotor e seqüência deácidos nucleicos a ser expressa, pode estar presente em uma configuraçãointegrada a um vetor e ser inserido no genoma de uma planta, por exemplo,por transformação.

O termo "transformação", conforme utilizado no presente, refere-se à introdução de um material genético (por exemplo, um transgene) emuma célula. A transformação de uma célula pode ser estável ou transitória. Otermo "transformação transitória" ou "transitoriamente transformado" refere-se à introdução de um ou mais transgenes em uma célula, na ausência deintegração do transgene no genoma da célula hospedeira. Transformação-transitória pode serdetectada, porexemplo; por ensaio imunoenzimático deabsorção direta (ELISA) que detecta a presença de um polipeptídeo codifi-cado por um ou mais dos trangenes. Alternativamente, transformação transi-tória pode ser detectada pela constatação da atividade da proteína (por e-xemplo, α-glicuronidase), codificada pelo transgene (por exemplo, o gene uidA), conforme demonstrado no presente (por exemplo, ensaio histoquímicodá atividade da enzima GUS por coloração com X-gluc, o qual fornece umprecipitado azul na presença da enzima GUS, e um ensaio por quimiolumi-nescência da atividade da enzima GUS, utilizando o kit GUS-Light (Tropix).

O termo "transformante transitório" refere-se a uma célula que incorporoutransitoriamente um ou mais transgenes. Por outro lado, o termo "transfor-mação estável" ou "estavelmente transformado" refere-se à introdução e in-tegração de um ou mais transgenes no genoma de uma célula, resultando,preferencialmente, na integração ao cromossomo e hereditariedade estávelpor meio de meiose. A transformação estável de uma célula pode ser detec-tada por hibridição em Southern blot de DNA genômico da célula com seq-mências de ácidos nucleicos, capazes de se ligarem a um ou mais dostransgenes. Alternativamente, a transformação estável de uma célula podeser detectada também pela reação em cadeia da polimerase do DNA genô-mico da célula, a qual amplifica seqmências de transgenes. O termo "trans-formante estável" refere-se a uma célula que integrou estavelmente um oumais transgenes no DNA genômico (incluindo o DNA dos plastídeos e donúcleo), essa integração ocorrendo preferencialmente no DNA cromossômi-co do núcleo. Dessa forma, um transformante estável diferencia-se de umtransformante transitório em que, o DNA genômico do transformante estávelcontém um ou mais transgenes, enquanto que o DNA genômico do trans-formante transitório não contêm transgene. A transformação inclui também aintrodução de material genético em células da planta, sob a forma de vetoresde vírus de plantas, envolvendo replicação epicromossômica e expressão dogene que pode exibir propriedades variáveis, relativas à estabilidade da mei-ose. A transformação inclui também a introdução de material genético emcélulas da planta, sob a forma de vetores de vírus de plantas, envolvendo-replicação epicromossômica-e expressão do gene que pode exibir proprie-dades variáveis, relativas à estabilidade da meiose. Preferencialmente, otermo "transformação" inclui introdução de material genético em células daplanta, resultando em integração cromossômica e hereditariedade estávelpor meio de meiose.

Os termos "infectar" e "infecção" por uma bactéria referem-se àcoincubação de uma-amostra biológica alvo (por exemplo, célula, tecido,etc.) com a bactérica sob condições tais que seqmências de ácidos nuclei-cos contidas na bactéria são introduzidas em uma ou mais células da amos-tra biológica alvo.

O termo "Agrobacterium" refere-se a uma bactéria do solo fitopa-togênica e gram negativa em forma de bastonete, causadora da galha-da-coroa. O termo "Agrobacterium" inclui, entre outras, as cepas do Agrobacte-rium tumefaciens, (o qual causa tipicamente galha-de-coroa em plantas in-fectadas) e do Agrobacterium rhizogenes (qüe causa a doença caracterizadapor raízes em cabeleira em plantas hospedeiras infectadas). A infecção deuma célula vegetal pelo Agrobacterium leva geralmente à produção de opi-nas (por exemplo, nopalina, agropina, octapina, etc.) pela célula infectada.

Dessa forma, cepas de Agrobacterium que levam à produção de nopalina(por exemplo, as cepas LBA4301, C58, A208) são referidas como Agrobac-teria do "tipo nopalina'; cepas de Agrobacterium que levam à produção deoctopina (por exemplo, as cepas LBA4404, Ach5, B6) são referidas comoAgrobacteria do "tipo octopina" e cepas de Agrobacterium que levam à pro-dução de agropina (por exemplo, as cepas EHA105, EHA101, A281) sãoreferidas como Agrobacteria do "tipo agropina".

Os termos "bombardear", "bombardeamento" e "bombardeamen-to biolístico" referem-se ao processo de aceleração de partículas, direciona-das a uma amostra biológica alvo (por exemplo, célula, tecido, etc.) para per-furar a membrana de uma célula na amostra biológica alvo e/ou a entradadas partículas na amostra biológica alvo. Métodos de bombardeamento bio-lístico são conhecidos na técnica (por exemplo, a patente U.S. 5 584 807,cujo conteúdo é aqui incorporado por referência) e estão à disposição no- mercado (por exemplo, o acelerador de micropartículas movido a gás hélio(PDS-1000/He) (BioRad)).

O termo "microperfuração", quando utilizado em referência a umtecido vegetal, refere-se à introdução de perfurações microscópicas naqueletecido. A microperfuração pode ser realizada, por exemplo, por bombardea-mento de partículas, conforme descrito no presente.

A-"eficiência de transformação" ou "freqmência de transforma-ção", conforme utilizado no presente, pode ser determinada pelo número decélulas transformadas (ou organismos transgênicos desenvolvidos de célu-las individuais transformadas), recuperadas sob condições experimentaisconvencionais ou normalizadas, em termos de quantidade de células postasem contato com DNA estrangeiro, quantidade de DNA liberado, tipo e condi-ções de liberação de DNA, condições gerais da cultura, etc. Por exemplo,quando embriões imaturos isolados são utilizados como matéria-prima paratransformação, a freqmência de transformação pode ser expressa como onúmero de linhagens de plantas transgênicas obtidas por 100 embriões ima-turos isolados transformados.

Descrição Detalhada da Invenção

Uma primeira concretização da invenção refere-se a um métodopara geração de planta transgênica Zea mays, compreendendo as etapas dea. introdução de uma construção de DNA em uma célula ou tecido de Zeamays, compreendendo

i) pelo menos uma primeira construção de expressão, compreen-dendo um promotor de ubiquitina e, ligada ao mesmo de modoque permite operação, uma seqüência de aminoácidos que codi-fica uma enzima capaz de metabolizar D-alanina e/ou D-serina,

ii) pelo menos uma segunda construção de expressão, conferindo àreferida planta Zea mays uma característica agronomicamentevaliosa, e

b. incubação da referida célula ou tecido de Zea mays da etapa a) em ummeio de seleção compreendendo D-alanina e/ou D-serina e/ou um de-rivado destas, em uma concentração total de aproximadamente 1 mM a

-------100 mM, por um-período de-tempo de, pelo menos, 5 dias, e

c. a transferência da referida célula ou tecido de Zea mays da etapa b)para um meio de regeneração e a regeneração e seleção de plantasZea mays que compreendam a referida construção de DNA.

Uma característica importante da invenção é que o promotor daubiquitina, preferencialmente o promotor de ubiquitina da Zea mays, conse-gue induzir a expressão, de ambos-os~genes das enzimas que metabolizamD-alanina e/ou D-serina. O uso do promotor da ubiquitina leva, supreenden-temente, a uma eficiência de transformação uniformemente mais alta do quecom outros promotores normalmente utilizados em plantas monocotiledô-neas, como o promotor ahas da Zea mays (Patente U.S. N0 5 750 866) ou opromotor ScBV (Patente U.S. Número 6 489 462). Em comparação a estespromotores, a eficiência de transformação utilizando o promotor da ubiquitinafoi mais alta (em alguns casos em, pelo menos, 100%) e/ou a aplicabilidade,mais ampla, embora estes promotores sejam descritos na técnica como po-tentes promotores constitutivos. Os motivos para esse desempenho surpre-endentemente superior do promotor da ubiquitina são desconhecidos. Noentanto, sabe-se que a seleção ideal necessita a expressão do marcador daseleção nas células pertinentes do tecido-alvo (o qual posteriormente desdi-ferencia e regenera nas plantas transgênicas), no momento certo e para aconcentração certa (suficientemente alta para assegurar uma seleção efici-ente, porém, não tão alta que impeça possíveis efeitos negativos para ascélulas). O funcionamento superior e a eficiência do promotor de ubiquitinado milho, em especial, podem indicar também que as células transgênicasdo milho necessitam ter uma quantidade suficiente da enzima que metaboli-za D-alanina e/ou D-serina (por exemplo, as proteínas DSDA ou DAO), exó-gena (não-nativa) para o milho, para que sobrevivam à pressão imposta so-bre elas pela seleção. Estes efeitos podem depender do promotor e/ou mar-cador, de forma que certas combinações de promotores e marcadores têmum desempenho melhor do que outras.

Ademais, o promotor da ubiquitina aparentemente possui maisflexibilidade para a seqüência do gene marcador que metaboliza os D-aminoácidosrOutros promotores às vezes operam muito bem com um mar-cador específico, porém menos com outro. Dessa forma, o promotor da ubi-quitina pode ser empregado como promotor padrão para induzir, no milho, aexpressão de enzimas que metabolizam D-aminoácidos. O uso dos promoto-res de Zea mays resulta em alta eficiência de transformação, comparável ade outros sistemas estabelecidos de seleção, como o sistema de seleçãoahas.

Os marcadores utilizados no presente, derivados de seqmênciasprovenientes de bactérias ou levedura, são comumente encontrados em se-res humanos e produtos derivados de animais ou alimentíceos. Em umaconcretização preferida, os marcadores e o método provido no presentepossibilitam que a seqüência do marcador seja removida facilmente! Ade-mais, é provido no presente um protocolo para transformação do milho, emdetalhes e aperfeiçoado, que possibilita uma transformação eficiente em es-cala industrial. As plantas obtidas pelo método da invenção são férteis epossuem fenótipo normal. A transformação operou bem tanto na linhagemhíbrida como na natural. Demonstramos ser possível o empilhamento dosmarcadores de seleção dsdA (primário) e daol (secundário) ou ahas (primá-rio) e dsdA (secundário), indicando a compatibilidade do sistema ahas sys-tem com o sistema de seleção por D-aminoácido.

1. O Construto de DNA da Invenção

Outra concretização da invenção refere-se a um construto deDNA, compreendendo

i) pelo menos um primeiro construto de expressão, compreendendo umpromotor de ubiquitina e, ligada ao mesmo de modo que permite ope-ração, uma seqüência de aminoácidos que codifica uma enzima capazde metabolizar D-alanina e/ou D-serina,

ii) pelo menos um segundo construto de expressão, conferindo à referidaplanta Zea mays uma característica agronomicamente valiosa.

O promotor da ubiquitina e/ou a enzima capaz de metabolizar D-alanina ou D-serina são definidos abaixo detalhadamente.

1.1 O Primeiro Construto de Expressão da Invenção

Uma concretização da invenção refere-se a um construto de ex-pressão recombinante, compreendendo um promotor de ubiquitina e, ligadoao mesmo de modo a permitir operação, uma seqüência de ácidos nucleicosque codifica uma enzima capaz de metabolizar D-alanina ou D-serina, emque o referido promotor é heterólogo, em relação à referida seqüência quecodifica a enzima.

O promotor-da ubiquitina e/ou a enzima capaz de metabolizar D-alanina ou D-serina são definidos abaixo detalhadamente.

—1.1.1 A Enzima Capaz de Metoblizar D-alanina ou D-serina

O versado na técnica conhece inúmeras seqmências que sãoadequadas para metabolização de D-alanina e/ou D-serina. O termo "enzimacapaz de metabolizar D-alanina ou D-serina" significa, preferencialmente,uma enzima que converte e/ou metaboliza D-alanina e/ou D-serina com ati-vidade, pelo menos duas vezes (pelo menos, 100% mais alta), preferencial-mente, pelo menos, três vezes, mais preferencialmente, pelo menos, cincovezes, ainda mais preferencialmente, pelo menos dez vezes, e o mais prefe-rível pelo menos, 50 ou 100 vezes mais atividade para a conversão do que oL-aminoácido (isto é, D-alanina e/ou D-serina) e - mais preferencialmente-também de qualquer outro D- e/ou L-aminoácido ou aminoácido aquiral.

Preferencialmente, a enzima capaz de metabolizar D-alanina ouD-serina é selecionada do grupo constituído por D-serina amônia-liase (D-serina desidratase; EC 4.3.1.18; antiga E.C. 4.2.1.14), D-aminoácido oxida-ses (EC 1.4.3.3) e D-alanina transaminases (EC 2.6.1.21). Mais preferenci-almente, a enzima capaz de metabolizar D-alanina ou D-serina é seleciona-da do grupo constituído por D-serina amônia-liase (D-serina desidratase; EC4.3.1.18; antiga E.C. 4.2.1.14) e D-aminoácido oxidases (EC 1.4.3.3).

O termo " D-serina amônia-liase" (D-serine desidratases; EC4.3.1.18; antigaEC 4. 2.1.14) significa enzimas que catalizam a conversão deD-serina para piruvato e amônia. A reação catalizada envolve provavelmentea eliminação inicial de água (portanto, a classificação original da enzima co-mo EC 4.2.1.14), seguida pela isomerização e hidrólise do produto com que-bra da ligação C-N. Para obter exemplos de enzima adequada, consultarhttp://www.expasy.Org/enzyme/4.3.1" 18:"

O termo "D-alanina transaminases" (EC 2.6.1.21).significa enzi-mas que catalizam a reação da D-alanina com 2-oxoglutarato para piruvato eD-glutamato. O D-glutamato é muito menos tóxico, para plantas, do que a D-alanina. http://www.expasy.Org/enzyme/2.6.1.21.

O termo D-amino ácido oxidase (EC 1.4.3.3; abreviado, DAAO,DAMOX ou DAO) refere-se à enzima que converte um D-aminóácido em 2-oxoácido empregando, preferencialmente, Oxigênio (O2) como substrato eproduzindo peróxido de hidrogênio (H2O2) como coproduto (Dixon 1965a,b,c;Massey 1961; Meister 1963). A DAAO pode ser descrita pelo Comitê deNomenclatura da União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular(IUBMB) com o número da EC (Comissão de Enzima) EC 1.4.3.3. Geralmen-te, uma enzima DAAO da classe EC 1.4.3.3. é uma flavoenzima FAD quecataliza a oxidação de D-aminoácidos neutros e básicos em seus cetoácidoscorrespondentes. DAAOs foram caracterizadas e sequenciadas em fungos evertebrados, nos quais sabe-se estão localizadas nos peroxissomos. Foidemonstrado (Miyano, 1991) que a conservação de uma histidina na DAAOera importante para a ação catalítica da enzima. Em uma concretização pre-ferida da invenção, uma DAAO refere-se a uma proteína que compreenda aseguinte seqüência de consenso:

[LIVM]-[LIVM]-H*-[NHA]-Y-G-x-[GSA]-[GSA]-X-G-X5-G-X-A

em que, resíduos de aminoácidos apresentados em parênteses representamresíduos alternativos para a respectiva posição, x representa qualquer resí-duo de aminoácido e índices numéricos indicam o número respectivo de re-síduos de aminoácidos consecutivos. A abreviação para cada resíduo deaminoácido possui o significado padrão da IUPAC, conforme definido abaixo.

A D-amino ácido oxidase (Número EC 1.4.3.3) pode ser isolada de váriosorganismos, incluindo, entre outros, porco, homem, rato, levedura, bactériaou fungo. Exemplos de organismos são Candida tropicalis, Trigonopsis vari-abilis, Neurospora crassa, Chlorella vulgaris e Rhodotorula gracilis. Um poli-peptídeo adequado que metaboliza D-aminoácidos pode ser uma enzima deeucariotos, por exemplo, de uma levedura (por exemplo, Rhodotorula graci-lis), fungo ou animalou pode ser-uma enzima de procarioto, por exemplo, deuma bactéria como Escherichia coli. Para obter exemplos de enzima ade-quada, consultar http://www.expasy.Org/enzyme/1.4.3.3.

Exemplos de polipeptídeos adequados que metabolizam D-aminoácidos são apresentados na Tabela 1. As seqmências de ácidos nu-cleicos que codificam as referidas enzimas podem ser encontradas em ban-cos de dados (por exemplo, sob~o n° de conta do Genbank U60066, A56901,AF003339, Z71657, AF003340, U63139, D00809, Z50019, NC_003421,AL939129, AB042032). Conforme demonstrado acima, a DAAO de diversasespécies diferentes foi caracterizada e demonstrado que diferiam ligeiramen-te em termos de afinidade por substratos (Gabler 2000), porém, de maneirageral, elas exibiam uma ampla especificidade de substratos, conduzindo adesaminação por oxidação de todos os D-aminoácidos.

Tabela 1: Enzimas adequadas para metabolização de D-serina e/ou D-alanina. Enzimas especialmente preferidas são apresentadas em negrito.

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Especialmente preferidos neste contexto são o gene daol (EC:1.4. 3.3 : GenBank Conta n°: U60066), da levedura Rhodotorula gracilis(Rhodosporidium toruloides) e o gene dsda do E. coli (D-serina desidratase(D-serina desaminase)) (EC: 4.3. 1.18; GenBank Conta n°: J01603). O genedaol é especialmente vantajoso uma vez que ele pode ser empregado comomarcador de dupla função (consultar o pedido de patente internacionalPCT/EP 2005/002734).

Enzimas adequadas que metabolizam D-aminoácidos incluemtambém fragmentos, mutantes, derivados, variantes e alelos dos polipeptí-deos exemplificados acima. Fragmentos, mutantes, derivados, variantes ealelos adequados são aqueles que retêm as características funcionais daenzima metabolizadora de D-aminoácido, conforme definida acima. Umaseqüência para pode ser alterada para produção de um mutante, variante ouderivado por um ou mais entre a adição, inserção, exclusão ou substituiçãode um ou mais nucleotídeos no ácido nucleico, levando à adição, inserção,exclusão ou substituição de um ou mais aminoácidos no polipeptídeo codifi-cado. Evidentemente, estão incluídas alterações ao ácido nucleico que nãoacarretam diferença à seqüência de aminoácidos codificados.

Mais preferencialmente para o método da invenção, a enzimacapaz de metalizar D-serina é selecionada do grupo constituído por

i) a d-serina amônia-liase do E.coli, conforme codificada pela SEQ IDNO: 2, e

ii) enzimas com a mesma atividade enzimática e identidade de seqüênciapelo menos 80% (preferencialmente, pelo menos, 85%, mais preferen-cialmente, pelo menos, 90%, ainda mais preferencialmente, pelo me-nos, 95%, o mais preferível, pelo menos, 98%) à da seqüência, con-forme codificada pela SEQ ID NO: 2, e

iii) enzimas codificadas por uma seqüência de ácidos nucleicos capazesde hibridizar para complementar a seqüência descrita pela SEQ ID NO: 1,

e em que a seleção é feita em um meio compreendendo D-serina em umaconcentração de aproximadamente 1 mM a 100 mM (mais preferencialmentede aproximadamente 5 mM a aproximadamente 50 mM, ainda mais prefe-rencialmente de aproximadamente 7 mM a aproximadamente 30 mM, o maispreferível de aproximadamente 10 a 20 mM).

"Mesma atividade", no contexto de uma D-serina amônia-liase,significa a capacidade de metabolizar D-serina, preferencialmente como omais preferido dos substratos. Metabolização significa a reação da Iiase es-pecificada acima. Hibridização segundo iii) significa hibridização preferenci-almente sob condições de baixa adstringência (com solução tampão de 30 a35% de formamida, NaCI a 1 M, SDS a 1% a 37°C e banho em 1X a 2X deSSC a uma temperatura de 50 a 55°C), mais preferencialmente, condiçõesde adstringência moderada (em formamida de 40 a 45%, NaCI a 1,0 M1 SDSa 1% a 37°C e banho em 0,5 X a 1 X SSC a uma temperatura de 55 a 60°C),e o mais preferível sob condições muito adstringentes (formamida a 50%,NaCI a 1 M NaCI, SDS a 1% a 37°C e banho em 0,1 x SSC a uma tempera-tura de 60 a 65°C).

i) a D-amioácido oxidase do Rhodotorula gracilis, conforme codificadapela SEQ ID NO: 4, e

ii) enzimas com a mesma atividade enzimática e identidade de seqüênciapelo menos 80% (preferencialmente, pelo menos, 85%, mais preferen-cialmente, pelo menos, 90%, ainda mais preferencialmente, pelo me-nos, 95%, o mais preferível, pelo menos, 98%) à da seqüência, con-forme codificada pela SEQ ID NO: 4, e

iii) enzimas codificadas por uma seqüência de ácidos nucleicos capazesde hibridizar para complementar a seqüência descrita pela SEQ ID NO: 3,

e em que a seleção é feita em um meio compreendendo D-alanina e/ou D-serina em uma concentração total de aproximadamente 1 mM a 100 mM(mais preferencialmente de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 50mM, ainda mais preferencialmente de aproximadamente 3 mM a aproxima-damente 20 mM, o mais preferível de aproximadamente 5 a 15 mM).

Mutantes e derivados das seqmências especificadas podemcompreender também enzimas com uma ou mais características melhoradas(Ki, especificidade de substrato, etc.), porém, compreendendo ainda a açãode metabolização referente à D-serina e/ou D-serina. Estas seqmências eproteínas englobam também seqmências e proteína que derivam de proces-so de indução de mutação ou de recombinação, como (embaralhamento) deDNA Com este processo, uma ou mais seqmências diferentes de codificaçãopodem ser manipuladas para dar origem a um novo polipeptídeo que possuaas propriedades desejadas. Dessa maneira, bibliotecas de polinucleotídeosrecombinantes são geradas, a partir de uma população de polipeptídeos deseqmências relacionadas, compreendendo regiões de seqmências que pos-suem identidade de seqüência expressiva e que podem ser recombinados invitro ou in vivo, dando origem a produtos homólogos. Polinucleotídeos quecodificam uma possível enzima podem ser modulados, por exemplo, comprotocolos de embaralhamento de DNA. O embaralhamento de DNA é umprocesso que introduz rápida, fácil e eficientemente mutações ou rearranjos,preferencialmente de modo aleatório, em uma molécula de DNA ou para ge-rar trocas de seqmências de DNA entre duas ou mais moléculas de DNA,preferencialmente de modo aleatório. A molécula de DNA, resultante de seuembaralhamento, é uma molécula de DNA embaralhada e que não existenaturalmente, derivada pelo menos de um modelo de molécula de DNA. ODNA embaralhado codifica uma enzima modificada, relacionada à enzimacodificada pelo DNA do modelo, e possui, preferencialmente, uma atividadebiológica alterada, relacionada à enzima codificada pelo DNA do modelo. Oembaralhamento de DNA pode ser derivado de um processo de recombina-ção e-mutação-recursivas e ser conduzido por fragmentação aleatória deuma combinação de genes relacionados, seguido pela remontagem dosfragmentos por um processo semelhante ao da reação em cadeia da polime-rase. Consultar, por exemplo, Stemmer 1994 a,b; Crameri 1997; Moore1997; Zhang 1997; Crameri 1998; US 5 605 793, US 5 837 458, US 5 830721 and US 5 811 238. A enzima semelhante a dsdA ou dao resultante, co-dificada pelo-DNA embaralhado, pode possuir seqmências diferentes de a-minoácidos da versão original da enzima. Exemplos de intervalos para iden-tidade de seqüência são especificados acima.

"Mesma atividade", no contexto de uma D-aminoácido oxidase,significa a capacidade de metabolizar um amplo espectro de D-aminoácidos(preferencialmente, pelo menos, D-serina e/ou D-alanina). Metabolizaçãosignifica a reação de oxidação especificada acima. Hibridização segundo iii)significa hibridização preferencialmente sob condições de baixa adstringên-cia (com solução tampão de 30 a 35% de formamida, NaCI a 1 M, a 1% SDSa 37°C e banho em 1X a 2X de SSC a uma temperatura de 50 a 55°C), maispreferencialmente, condições de adstringência moderada (em formamida de40 a 45%, NaCI a 1,0 M, SDS a 1% a 37°C e banho em 0,5 X a 1 X SSC auma temperatura de 55 a 60°C), e o mais preferível sob condições muitoadstringentes (formamida a 50%, NaCI a 1 M NaCI, SDS a 1% a 37°C e ba-nho em 0,1 x SSC a uma temperatura de 60 a 65°C).

As concentrações e tempos preferidos para a seleção são espe-cificados em detalhes abaixo. A seleção é realizada de preferência utilizandoD-alanina em uma concentração de aproximadamente 3 a aproximadamente15 mM ou D-serina em uma concentração de aproximadamente 7 a aproxi-madamente 30 mM. O tempo total de seleção, sob condições de desdiferen-ciação, é preferencialmente em torno de 3 a 4 semanas.

A enzima mètabolizadora de D-aminoácidos da invenção podeser expressa no citosol, peroxissomo ou em outro compartimento intracelularda célula vegetal. A compartimentalização da enzima mètabolizadora dos D-aminoácidos pode ser obtida pela fusão da seqüência de ácidos nucleicosque codifica o polipeptídeo da DAAO com uma seqüência de um peptídeo detrânsito,^gerando uma prõteínã~de fusão. Os produtos do gene expressadossem estes peptídeos de trânsito geralmente acumulam-se no citosol.

1.1.2 O Promotor da Ubiquitina

A enzima que metaboliza D-alanina e/ou D-serina está acopladaa um promotor da ubiquitina, preferencialmetne um promotor de ubiquitinavegetal, mais preferencialmente um promotor de ubiquitina de plantas mono-cotiledôneas e ainda mais preferencialmente um promotor de ubiquitina daZea mays.

O termo "promotor de ubiquitina", conforme utilizado no presen-te, significa a região do DNA genômico de até 5000 pares de base (bp) amontante do códon de início do gene ou de um sítio mapeado de início detradução de uma ubiquitina ou de proteína semelhante à ubiquitina, no gene.

A ubiquitina é um polipeptídeo abundante de 76 aminoácidos, encontradaem todas as células eucarióticas. Há diversos genes diferentes que codifi-cam a ubiquitina e a homologia destes, em nível de aminoácido, é bastantealta. Por exemplo, o homem e o camundongo possuem muitos genes dife-rentes que codificam ubiquitina, cada um localizado em um local diferente nocromossomo. Funcionalmente, todos os genes de ubiquitina são participan-tes essenciais do mecanismo proteolítico da célula dependente de ubiquiti-na. Cada gene de ubiquitina está associado a um promotor que induz a suaexpressão. Promotor da ubiquitina é a região do DNA genômico de até 5,000pares de base (bp) a montante do códon de início do gene ou de um sítiomapeado de início de tradução de uma ubiquitina ou de proteína semelhanteà ubiquitina, no gene.

O termo "sistema de regulação de ubiquitina da planta" refere-seà seqüência 5' de nucleotídeos de aproximadamente 2 kb até o sítio de iníciode tradução do gene de ubiquitina de uma planta (preferencialmente do mi-lho) e compreende seqmências que orientam a iniciação da transcrição, suaregulação, o controle do nível de expressão, a indução de genes envolvidoscom estresse e intensificação de expressão em resposta a estresse. O sis-tema regulador compreendendo funções de promotor e de regulação é aseqüência de DNA que fornece controle da regulação ou modulação da ex-pressão do gene:

Vários genes de ubiquitina de vegetais estão descritos (Callis1989, 1990). Há a descrição de promotores de plantas dicotiledôneas, comode batata (Garbarino 1992), tabaco (Genschick 1994), tomate (Hoffman1991), salsa (Kawalleck 1993; W003/102198, aqui incorporadas por referên-cia), Arabidopsis (Callis 1990; Holtorf 1995;UBQ8, GenBank conta n°:NMJ11814; GenBank Conta n0:--NMJ15119; UBQ5; GenBank Conta n°:NMJ16090).

De acordo com o mesmo, o promotor da ubiquitina da invençãoé um fragmento de DNA (de preferência, com 2 kb de comprimento), o refe-rido fragmento de DNA compreendendo um sistema regulador de ubiquitinade vegetal, em que o referido sistema regulador contém um promotor inclu-indo um sítio de início de transcrição e, preferencialmente, um ou mais ele-mentos de choque térmico, na posição 5', em relação ao sítio de iniciação detranscrição e, preferencialmente, um íntron na posição 3', em relação ao sítiode iniciação de transcrição, em que o referido sistema regulador é capaz deregular a expressão no milho. De preferência, a expressão é a de um geneconstitutivo e induzível, de forma que o nível de expressão do referido geneconstitutivo, em monocotiledôneos, é em torno de um terço daquele obtidona expressão induzida do referido gene em monocotiledôneos.

De preferência, são promotores de ubiquitina de plantas mono-cotiledôneas. Há descrição deste tipo de promotores para milho (Christensen1992, 1996) Transgenic Res 5:213-218), arroz (RUBQ1, RUBQ2, RUBQ3 eRUBQ4; promotores de RUBQ1 e RUBQ2 são adequados para expressãoconstitutiva; US 6 528 701).

O mais preferido é o promotor de ubiquitina da Zea mays, con-forme descrito nas patentes U.S. N- 5 614 399, 5 510 474, 6 020 190, 6 054574 e 6 068 994. O promotor regular a expressão um gene de poliubiquitinado milho, contendo 7 repetições tandem. A expressão deste gene de ubiqui-tina do milho foi constitutiva em 25°C e induzida por choque térmico a 42°C.O promotor foi utilizado com êxito em várias plantas monocotiledôneas (C-hristensen 1996). Na região do promotor ubil do milho, constatou-se que acaixa TATA box estava na posição -30 e que duas séqmêricias de choquetérmico que se sobrepunham, 5'-CTGGTCCCCTCCGA-3' e CTCGA-GATTCCGCT-3', estavam nas posições -214 e -204. As caixas de CCAATcanônica e de GC não foram encontradas na região do promotor, porém aseqüência 5-CACGGCA-3' (função desconhecida) ocorreu quatro vezes, nasposições -236, -122, -96 e -91 da região do promotor (Christensen 1992).Foram descritos os promotores Ubi-1 e Ubi-2 e o seu padrão de expressãoda Zea mays (US 6 054 574; Christensen 1992).

Mais preferencialmente, o promotor de ubiquitina é selecionadodo grupo constituído por

a) seqmências compreendendo a seqüência, conforme descritapela SEQ ID NO: 5, e

b) seqmências compreendendo pelo menos um fragmento de,pelo menos, 50 (preferencialmente de, pelo menos, 100, mais preferencial-mente de, pelo menos, 250, ainda mais preferencialmente de, pelo menos,500 e o mais preferível de pelo menos 1000) pares de base consecutivos daseqüência, conforme descrita pela SEQ ID NO: 5 e com atividade de promo-tor em Zea mays,

c) seqmências compreendendo uma seqüência com pelo menos60% (preferecialmente, pelo menos, 70%, mais preferencialmente, pelo me-nos, 80%, ainda mais preferencialmente, pelo menos, 90% e o mais preferí-vel, de pelo menos, 95%) de identidade em relação à seqüência, conformedescrita pela SEQ ID NO: 5 e com atividade de promotor em Zea mays,

d) seqmências compreendendo uma seqüência que hibridizapara a seqüência, conforme descrita pela SEQ ID NO: 5 e com atividade depromotor na Zea mays,

"Atividade de promotor" em Zea mays significa a capacidade derealizar a transcrição de uma seqüência de ácidos nucleicos, ligada de modoque permite operação, em pelo menos uma célula ou tecido de uma plantaZea mays ou derivada de uma planta Zea mays. Preferencialmente, significauma atividade de transcrição constitutiva, permitindo a expressão na maioriados tecidos e na maior parte dos estágios de desenvolvimento. O elemento"de choque térmico, relacionado à atividade do promotor de ubiquitina da Zeamays, pode estar presente, porém não é necessário.

Hibridização segundo iii) significa hibridização preferencialmentesob condições de baixa adstringência (com solução tampão de formamidade 30 a 35%, NaCI a 1 M, SDS a 1% a 37°C e banho em 1X a 2X de SSC auma temperatura de 50 a 55°C), mais preferencialmente, condições de ads-tringência moderada (em formamida de 40 a 45%, NaCI a 1,0 M, SDS a 1%a 37°C e banho em 0,5 X a 1 X SSC a uma temperatura de 55 a 60°C), e omais preferível sob condições muito adstringentes (formamida a 50%, NaCIa 1 M NaCI, SDS a 1% a 37°C e banho em 0,1 x SSC a uma temperatura de60 a 65°C).A seqüência descrita pela SEQ ID NO: 5 é o promotor central dopromotor de ubiquitina da Zea mays. Em uma concretização preferida, nãosó é empregada a região do promotor, como seqüência que regula a trans-crição, mas também uma região 5' não-traduzida e/ou um íntron. O promotorde ubiquitina é preferencialmente empregado em combinação com um ín-tron, mais preferencialmente com um íntron que intensifica expressão. Esteíntron pode ser o íntron natural 1 do gene ubil (MubG1 contém um íntroncom 1004 pares de base (bp) íntron em sua região 5' não-traduzida; Liu1995). Mais preferencialmente, o sistema do promotor de ubiquitina é carac-terizado por um comprimento de aproximadamente 2 kb, compreendendoainda, na seguinte ordem, iniciando-se com o elemento mais na posição 5' eprosseguindo até a região 3' terminal do referido fragmento de DNA:

(a) um ou mais elementos de choque térmico, que podem estarsobrepostos ou não;

(b) um promotor compreendendo um sítio de iniciação de trans-crição; e

(c) um íntron de aproximadamente 1 kb em comprimento.Mais preferencialmente, é utilizada a região que abrange o pro-motor, a região 5' não-traduzida e o primeiro íntron do gene de ubiquitina daZea mays, ainda mais preferencialmente, a região descrita pela SEQ ID NO:6. Dessa forma, em outra concretização preferida, o promotor da ubiquitina,utilizado no método da invenção, é selecionado do grupo constituído por

a) seqmências compreendendo a seqüência, conforme descritapela SEQ ID NO: 6, e

b) seqmências compreendendo pelo menos um fragmento de,pelo menos, 50 (preferencialmente de, pelo menos, 100, mais preferencial-mente de, pelo menos, 250, ainda mais preferencialmente de, pelo menos,500 e o mais preferível de pelo menos 1000) pares de base consecutivos daseqüência, conforme descrita pela SEQ ID NO: 6 e com atividade de promo-tor em Zea mays,

c) seqmências compreendendo uma seqüência com pelo menos60% (preferecialmente, pelo menos, 70%, mais preferencialmente, pelo me-nos, 80%, ainda mais preferencialmente, pelo menos, 90% e o mais preferí-vel, de pelo menos, 95%) de identidade em relação à seqüência, conformedescrita pela SEQ ID NO: 6 e com atividade de promotor em Zea mays,

d) seqmências compreendendo uma seqüência que hibridizapara a seqüência, conforme descrita pela SEQ ID NO: 6 e com atividade depromotor na Zea mays,

Hibridização segundo iii) significa hibridização preferencialmentesob condições de baixa adstringência (com solução tampão de formamidade 30 a 35%, NaCI a 1 M, SDS a 1% a 37°C e banho em 1X a 2X de SSC auma temperatura de 50 a 55°C), mais preferencialmente, condições de ads-tringência moderada (em formamida de 40 a 45%, NaCI a 1,0 M, SDS a 1%a 37°C e banho em 0,5 X a 1 X SSC a uma temperatura de 55 a 60°C), e omais preferível sob condições muito adstringentes (formamida a 50%, NaCIa 1 M NaCI1 SDS a 1% a 37°C e banho em 0,1 x SSC a uma temperatura de60 a 65°C).

Dessa forma, o promotor de ubiquitina utilizado da invenção po-de sr também um fragmento do promotor descrito pela SEQ ID NO: 5 ou 6ou um derivado das mesmas. Fragmentos podem incluir versões truncadasdo promotor, conforme descrito pela SEQ ID NO: 5 ou 6, em que seqmên-cias não essenciais foram removidas. Seqmências encurtadas são altamentevantajosas, uma vez que são mais fáceis de manipular e, às vezes, otimiza--das-em termos de perfil de expressão genética. Um meio eficiente e destina-do ao preparo de promotores encurtados ou truncados baseia-se na identifi-cação de supostos elementos reguladores dentro da seqüência do promotor.

Ele pode ser iniciado pela comparação entre seqmências de promotor, cujade maneira única semelhante. Seqmências compartilhadas entre promotorescom padrões semelhantes de expressão são possíveis pretendentes para aligação de fatores de transcrição e são, desse modo, possivelmente os ele-mentos que conferem padrões de expressão. A confirmação destes preten-sos elementos reguladores pode ser obtida por análise por deleção de cadapretensa região reguladora, seguida por análise funcional de cada constru-ção deletada por análise de um gene repórter que se liga funcionalmente acada construção. Assim, uma vez tendo sido fornecida a seqüência inicial dopromotor, qualquer número diferente de mutantes, resultantes de deleção,do promotor inicial pode ser prontamente preparado.

Fragmentos funcionalmente equivalentes de um promotor deubiquitina (por exemplo, conforme descritos pela SEQ ID NO: 5 ou 6) podemser obtidos pela remoção ou exclusão de seqmências não-essenciais sem aexclusão da essencial. O estreitamento da seqüência de nucleotídeos, regu-ladora da transcrição, para os seus elementos essenciais mediadores datranscição pode ser realizado in vitro por mutações de deleção do tipo tenta-tiva-e-seta de deleção, ou in silico usando rotinas de busca de elementos depromotor. Regiões essenciais para atividade de promotor freqmentementeexibem agrupamentos de certos elementos conhecidos do promotor. Estaanálise pode ser conduzida, usando algoritimos de computador disponíveiscomo PLACE ("Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements"\ Higo 1999), obanco de dados BIOBASE "Transfac" (Biologische Datenbanken GmbH,Braunschweig; Wingender 2001) ou o banco de dados PIantCARE (Lescot2002). Preferencialmente, fragmentos funcionais equivalentes de uma entreas seqmências de nucleotídeos da invenção que regulam a transcrição com-preendem pelo menos 100 pares de base, preferencialmente, pelo menos200 pares de base, mais preferencialmente, pelo menos, 500 pares de basede uma seqüência de nucleotídeo reguladora de transcrição, conforme des-crita pela SEQ ID NO: 5 ou 6. Mais preferencialmente, este fragmento iniciaa partir da extremidade 3' das seqmências indicadas.

Fragmentos especialmente preferidos são aqueles equivalentesa seqmências de nucleotídeos que regulam transcrição e que são obtidospor deleção da região que codifica a região 5' não-traduzida do mRNA, des-sa forma, fornecendo somente a região do promotor (não-transcrita). A regi-ão 5' não-traduzida pode ser facilmente determinada por métodos conheci-dos na técnica (como análise de 5-RACE). Assim, a região do promotor cen-tral, conforme é descrita pela SEQ ID NO: 5, é um fragmento da seqüênciadescrita pela SEQ ID NO: 6, a qual compreende ainda a região 5' não-traduzida e o íntron.Derivados podem incluir também, por exemplo, seqmências mo-dificadas do promotor de Zea mays, as quais, por exemplo, não incluem osdois elementos sobrepostos de choque térmico. Estas seqmências são des-critas, por exemplo, no pedido de patente US Pat. Appl. 20030066108 (W001/18220).

1.1.3 Elementos Adicionais

Os cassetes de expressão da invenção (ou os vetores nos quaisestes estão compreendidos) podem compreender ainda elementos funcio-nais e seqmências genéticas de controle, além do promotor da ubiquitina. Ostermos "elementos funcionais" ou "seqmências genéticas de controle" deve-rão ser entendidos no sentido amplo e se referem a todas as seqmênciasque afetam a materialização ou a função do cassete de expressão de acordocom a invenção. Por exemplo, seqmências genéticas de controle modificama transcrição e tradução. Seqmências genéticas de controle são descritas,(por exemplo, por Goeddel 1990 e Gruber 1993, e as referências citadaspelos mesmos).

De preferência, os cassetes de expressão, de acordo com a in-venção, incluem um promotor da ubiquitina funcional em plantas a montantede (upstream) 5' da seqüência de ações nucleicos (por exemplo, que codifi-ca a enzima que metaboliza D-aminoácidos) e a juzante de (downstream) 3'de uma seqüência terminadora e de sinais de poliadenilação e, se apropria-do, outros elementos habituais de regulação, em cada caso, ligado de modoque permite operação à seqüência de ácidos nucleicos a ser expressa.

Seqüências genéticas de controle e elementos funcionais inclu-em também as regiões 5' não-traduzidas, intros ou regiões 3' não-codificadores de genes, como, por exemplo, o íntron actina-1 ou os íntronsAdhl-S 1, 2 e 6 (referência geral: The Maize Handbook, Capítulo 116, Free-Iing and Walbot, Eds., Springer, New York (1994)). Foi demonstrado que e-Ias podem desempenhar um papel importante na regulação da expressãogenética. Desse modo, foi demonstrado que seqmências 5' não-traduzidaspodem intensificar a expressão transitória de genes heterólogos. Exemplosde seqmências reforçadoras de tradução que podem ser mencionadas inclu-em a seqüência líder 5' do vírus mosaico do tabaco (Gallie 1987) e similares.Ademais, elas podem promover a especificidade de tecidos (Rouster 1998).

Sinais de poliadenilação adequados como seqmências genéticasde controle são sinais de poliadenilação de vegetais, preferencialmente a-queles que correspondem a sinais de T-DNA poliadenilação do Agrobacteri-um tumefaciens. Exemplos de seqmências terminadoras particularmenteadequadas são a OCS (octopina sintase) terminadora e a NOS (nopalinasintase) terminadora.

Elementos funcionais que podem estar compreendidos em umvetor da invenção incluem

i) Origens de replicação que asseguram a replicação dos casse-tes de expressão ou vetores de acordo com a invenção em, por exemplo,E.coli. Exemplos que podem ser mencionados são ORI (origem de replica-ção de DNA), o pBR322 ori ou o P15A ori (Sambrook et al.: Molecular Clo-ning. A Laboratory Manual, 2a ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, NY, 1989),

ii) Sítios múltiplos de clonagem (MCS) para possibilitar e facilitara inserção de uma ou mais seqmências de aminoácidos,

iii) Seqüências que tornam possível a recombinação homóloga,deleção de marcador ou insrção no genoma de um organismo hospedeiro.

Métodos baseados no sistema cre/lox (Sauer 1998; Odell 1990; Dale 1991),FLP/FRT (Lysnik 1993) ou Ac/Ds (Wader 1987; US 5 225 341; Baker 1987;Lawson 1994) permitem a remoção, se apropriada ao tecido específico e/ouinduzível, de uma seqüência específica do DNA do genoma do organismohospedeiro. Seqüências de controle podem, neste contexto, significar as se-qüências flanqueadoras específicas (por exemplo, seqüências lox) que per-mitem remoção posterior (por exemplo, por meio de cre recombinase) (con-sultar também o pedido de patente internacional PCT/EP 2005/002734),

iv) Elementos, por exemplo, seqüências de fronteiras que tornampossível a transferência mediada pelo Agrobacterium em células vegetaispara transferência e integração no genoma vegetal, como por exemplo, afronteira direita ou fronteira esquerda do T-DNA ou a região vir.1.2. O Segundo Cassete de Expressão

De preferência, ao construto de DNA inserida no genoma daplanta-alvo compreende, pelo menos, um segundo cassete de expressão, oqual confere à planta Zea mays uma característica agronomicamente rele-vante. Essa característica pode ser obtida pela expressão de marcadores deseleção, genes de características, RNA antissenso ou RNA de fita dupla. Oversado na técnica conhece inúmeras seqüências que podem ser utilizadasneste contexto, por exemplo, para aumentar a qualidade do alimento e pro-duto alimentíceo, para produzir substâncias químicas, para refinar produtosquímicos ou farmacêuticos (por exemplo, vitaminas, óleos, carboidratos;Dunwell 2000), conferindo resistência a herbicidas ou levando à esterilidademasculina. Além disso, o crescimento, rendimento e resistência contra fato-res de estresse abióticos e bióticos (por exemplo, como, fungos, vírus ouinsetos) podem ser reforçados. Propriedades vantajosas podem ser conferi-das por superexpressão de proteínas ou por diminuição da expressão deproteínas endógenas por exemplo, pela expressão de um RNA antissensocorrespondente (Sheehy 1988; US 4 801 340; Mol 1990) ou RNA de fita du-pla (Matzke 2000; Fire 1998; Waterhouse 1998; WO 99/32619; WO99/53050; WO 00/68374; WO 00/44914; WO 00/44895; WO 00/49035; WO00/63364).

Para expressar estas seqüências, todos os promotores adequa-dos para expressão de genes no milho podem ser empregados. De prefe-rência, a referida segunda construção de expressão não compreende umpromotor idêntico ao promotor utilizado para expressar a enzima que meta-boliza D-aminoácidos. A expressão pode ser, por exemplo, constitutiva, in-duzível ou dependente de desenvolvimento. São conhecidos vários promoto-res de expressão em monocotiledôneos como o milho, como o promotor deactina do arroz (McEIroy 1990), o promotor H3 histona do milho (Lepetit1992; Atanassova 1992), o promotor de uma proteína rica em prolina do trigo(WO 91/13991). Promotores que são ainda mais preferidos são aqueles quepermitem uma expressão específica da semente em monocotiledôneos, co-mo os promotores descritos em WO 99/16890 (promotores do gene de hor-deína, do gene de glutelina, do gene de orizina, do gene de prolamina, dogene de gliadina, do gene de zeína, do gene de casirina ou do gene de se-calina).

2. A Transformação e Método de Seleção da Invenção

2.1 Origem e Preparo do Material Vegetal

Vários materiais de plantas podem ser empregados para o pro-cesso de transformação exposto no presente. Estes materiais de plantaspodem incluir, entre outros, por exemplo, folha, raiz ou seções do caule, em-briões imaturos, pólen, porém, também, calo, protoplastos ou suspensões decélulas vegetais. Preferencialmente, o material da planta é um embrião ima-turo. O material pode ser pré-tratado (por exemplo, por indução de desdife-renciação antes de transformação) ou não.

O material da planta utilizado para transformação (por exemplo,o embrião imaturo) pode ser obtido ou isolado de virtualmente qualquer vari-edade ou planta Zea mays. Preferencialmente, a referida planta Zea maysutilizada como fonte para o material de transformação é obtido do grupoconstituído por variedades naturais, híbridas, F1 entre variedades naturais,F1 entre uma variedade natural e uma híbrida, F1 entre uma variedade natu-ral e uma naturalmente polinizada, variedades comerciais de F1, qualquercruzamento de F2 ou de autopolinização entre as variedades mencionadasacima e a progênie de qualquer um dos supramencionados. Todas as com-binações de genitores masculino e feminino para as linhagens e cruzamen-tos supramencionados estão incluídas.

Variedades adequadas de Zea mays incluem, entre outras,P3732, A188, H84, B37Ht, Mo17Ht, W117Ht, Oh43, H99, W64A Ht rhm, F1(A188 χ Black Mexican Sweet), F1 (A188 χ B73Ht), F1 (B73Ht χ A188), F1(H84 χ A188), F1 (Mo17Ht χ A188) e F1 (C103 χ A188). Estas variedadesestão disponíveis como sementes de depósitos, como os da coleção Ameri-can Type Culture Collection (ATCC) e outros depósitos de material de se-mentes conhecidos na técnica. Mais preferencialmente, o embrião imaturo éisolado de um cruzamento de plantas F1ou F2 (HilIA χ A188) com uma li-nhagem natural. Sementes de milho F1 de genótipo Hil IAxAI 88 podem ser,preferencialmente, produzidas pelo cruzamento de HiIIA (genitor feminino)com a linhagem natural A188 (genitor masculino), e plantadas na estufa,como doadoras de pólen. Sementes F2 de (HillAxA188) são produzidas porautopolinização de plantas F1 (HillAxA188), na estufa ou no campo, e plan-tadas na estufa como doadoras de pólen.

Mais preferidas como linhagens naturais para o cruzamento complantas F1 ou F2 (HilIA χ A188) são as linhagens selecionadas do grupo cujasemente representativa foi depositada, sob o Tratado de Budapeste, junto àcoleção American Type Culture Collection (Manasses, VA 20110-2209, EU-A), sob a Designação de Depósito de Patente PTA-6170 (para sementes dalinhagem BPS553) e PTA-6171 (para sementes da linhagem BPS631).

Plantas híbridas (ou calo, tecido, embriões imaturos ou outromaterial vegetal das mesmas) de BPS553x(HillAxA188) ouBPS631 x(HilIAxAI 88) são produzidas, na estufa, de preferência utilizando alinhagem natural BPS553 ou BPS631, como o genitor feminino, e plantas deF1 ou F2 (HillAxA188) como o genitor masculino. Estes embriões imaturoshíbridos demonstraram uma capacidade de transformação extraordinaria-mente alta em comparação com embriões imaturos somente (HilIA χ A188),conhecidos na técnica como um dos materiais mais propensos à transforma-ção proveniente de Zea mays (Ishida et al. 1996, Frame et al. 2002). A ca-pacidade de transformação de um embrião imaturo híbrido, resultante de umcruzamento entre um híbrido (HilIA χ A188) das linhagens BPS553 possui,pelo menos, duas vezes a eficiência daquela para um embrião (HilIA χ A188)(para comparação, consultar o Exemplo 7 abaixo). Conseqmentemente, oresultado dos cruzamentos supramencionados fornece um material superiorpara transformação da Zea mays. As referidas linhagens naturais foram de-positadas, sob o Tratado de Budapest junto à coleção American Type Cultu-re Collection (Manasses, VA 20110-2209, EUA), sob a Designação de De-pósito de Patente PTA-6170 (para sementes da linhagem BPS553) e PTA-6171 (para sementes da linhagem BPS631).

Outros objetos da invenção referem-se a descendentes da refe-rida planta de milho (como por exemplo, linhagens naturais), plantas naturaisou híbridas produzidas a partir dos referidos descendentes e partes dasplantas acima mencionadas. Estas partes podem incluir, entre outros, tecido,células, pólen, óvulo, raízes, folhas, sementes, micrósporos e partes vegeta-tivas.

Plantas Zea mays para isolamento de embriões imaturos sãocultivadas e polinizadas conforme conhecido na técnica, preferencialmenteconforme descrito abaixo nos exemplos.

a. o isolamento de um embrião imaturo de uma planta Zea mays, e

b. o cocultivo do referido embrião imaturo isolado, o qual não foi submeti-do a tratamento de desdiferenciação, com uma bactéria pertencente aogênero Rhizobiaceae, compreendendo, pelo menos, um T-DNA trans-gênico, o referido T-DNA compreendendo

i) pelo menos um primeiro construto de expressão, compreendendoum promotor de ubiquitina e, ligada ao mesmo de modo a permitiroperação, uma seqüência de aminoácidos que codifica uma en-zima capaz de metabolizar D-alanina e/ou D-serina,

ii) pelo menos um segundo construto de expressão, conferindo àreferida planta Zea mays uma característica agronomicamentevaliosa, e

c.—a transferência dos embriões-imaturos cocultivados para um meio derecuperação, o referido meio de recuperação desprovido de uma quan-tidade fitotóxica eficaz de D-serina ou D-alanina, e

d. a indução de formação de calo embriogênico e a seleção de calo trans-gênico em um meio compreendendo,

i. uma quantidade eficaz de pelo menos um composto auxina, e

ii. D-alanina e/ou D-serina em uma concentração total de aproxima-damente 1 mM a 100 mM, e

e. a regeneração e seleção de plantas contendo o T-DNA transgênico doreferido calo transgênico.

O termo "embrião imaturo", conforme utilizado no presente, sig-nifica o embrião de uma semente imatura que está no estágio de desenvol-vimento inicial e maturação após polinização. O estágio de desenvolvimentodos embriões imaturos a serem tratados pelo método da presente invençãonão é limitado, e os embriões coletados podem estar em qualquer estágioapós a polinização. Embriões preferidos são aqueles coletados em no míni-mo 2 dias após a sua fertilização. Também preferidos são escutelas de em-briões imaturos, capazes de induzir calo desdiferenciado com capacidadepara regenerar plantas normais após ter sido transformado pelo métodomencionado abaixo.

Em uma concretização preferida, o embrião imaturo está no es-tágio de no mínimo 2 dias após polinização. Mais preferencialmente, os em-briões imaturos são isolados de espigas de plantas de milho (preferencial-mente a primeira espiga a surgir), colhidas de 7 a 14 dias (preferencialmentede 8 a 11 dias) após polinização (DAP). O momento exato da colheita variadependendo das condições de crescimento e variedade de milho. O tama-nho de embriões imaturos é um bom indicativo de seu estágio de desenvol-vimento. O comprimento ideal de embriões imaturos para transformação éde aproximadamente 1 a 1,6 mm, incluindo o comprimento do escutelo. Oembrião deve ser translúcido, não opaco.

Em uma concretização preferida da invenção, os embriões ima-turos são isolados e postos diretamente sobre a superfície de um meio soli-dificado de cocultivo sem etapas adicionais de lavagem. Embora os métodosdescritos na técnica incluam todos diversas etapas de preparo e lavagem,todos eles são omissos em relação à referida melhora de tempo e custossignificativamente poupados. Com a presente invenção, a etapa de infecçãopelo Agrobacterium ocorre no meio de co-culltivo, em vez de em um tubocontendo células em suspensão de Agrobacterium, conhecido da técnica.

De preferência, o embrião imaturo é submetido à transformação(cocultivo) sem pré-tratamento de desdiferenciação. O tratamento dos em-briões imaturos com uma enzima que degrada a parede celular ou por lesão(por exemplo, o corte com estilete ou perfuração com agulhas) é opcional.

No entanto, esta etapa de degradação ou lesão não é necessária e é omitidaem uma concretização preferida da invenção.

O termo "desdiferenciação" ou "tratamento de desdiferenciação"ou "pré-tratamento de desdiferenciação" significa um processo para se obteraglomerados celulares, como calo, que exibem crescimento desorganizadopelo cultivo de células diferenciadas de tecidos vegetais em um meio dedesdiferenciação. Mais especificamente, o termo "desdiferenciaçaõ", con-forme utilizado no presente, pretendeu significar o processo de formação decélulas que se dividem rapidamente, sem uma função específica no contextodo organismo vegetal. Estas células possuem freqmentemente uma potênciaaumentada no que concerne à sua capacidade de se desenvolver em váriostecidos vegetais. De preferência, o termo pretende signifcar a reversão detecidos especializados ou diferenciados em uma forma mais pluripotente outotipotente A desdiferenciação pode levar à reprogramação de um tecidovegetal (reversão inicial para células não-diferenciadas e não-especializadas, em seguida, para novas e diferentes vias). O termo "totipo-tência", conforme utilizado no presente, pretende significar uma célula vege-tal que contenha toda a informação genética e/ou celular necessária paraformar uma planta completa. A desdiferenciação pode ser iniciada por certosreguladores de crescimento vegetal (por exemplo, os compostos auxina e/oucitoquinina), especialmente por certas combinações e/ou concentrações destes.

2.2 Procedimentos para Transformação

2.2.1 Técnicas Gerais

Um construto de DNA, de acordo com a invenção, pode ser van-tajosamente introduzida em células com vetores nos quais o referido cons-truto de DNA está inserido. Exemplos de vetores podem ser plasmídeos,cosmídeos, fagos, vírus, retrovírus ou Agrobacteria. Em uma concretizaçãovantajosa, o-cassete de expressão é introduzido por meio de vetores deplasmídeos. Vetores preferidos são aqueles que permitem a integração es-tável do cassete de expressão no genoma do hospedeiro.

O construto do DNA pode ser introduzida nas células vegetaise/ou organismos pretendidos por qualquer um dos diversos meios conheci-dos de especialistas na técncia, um processo denominado transformação(consultar também Keown 1990). Foram descritos vários processos de trans-formação adequados para Zea mays.

Por exemplo, os construtos de DNA podem ser introduzidos dire-tamente nas células vegetais, utilizando métodos de balística, como bom-bardeamento de partículas de DNA, ou o construto de DNA pode ser intro-duzido utilizando técnicas como eletroporação e microinjeção de uma célula.

Técnicas de transformação mediadas por partículas (também conhecidascomo "biolísticas") estão descritas em, por exemplo, EP-A1 270,356; US 5100 792, EP-A-444 882, EP-A-434 616; Klein 1987; Vasil 1993; e Becker1994). Estes métodos envolvem penetração de células por partículas pe-quenas com ácido nucleico dentro da matriz de pequenas esferas ou partícu-las ou sobre a superfície. O aparelho de biolística PDS-1000 Gene Gun (Bio-rad, Hercules, CA) usa pressão de hélio para acelerar microesferas detungstênio ou ouro, revestidas com DNA, dirigidas contra as células alvo. Oprocesso pode ser aplicado a uma ampla gama de tecidos e células de or-ganismos, inclusive de plantas. Há outros métodos de transformação conhe-cidos por versados na técnica.

Outras técnicas incluem microinjeção (WO 92/09696, WO94/00583, EP-A 331 083, EP-A 175 966, Green 1987), transformação medi-ada por polietileno glicol (PEG) (Paszkowski 1984; Lazzeri 1995), liberaçãodegene-inserido em Iipossomo (WO 93/24640;-Freeman 1984) e eletropora-ção (EP-A 290 395, WO 87/06614; Fromm 1985; Shimamoto 1992).

No caso de injeção ou eletroporação de DNA em células vege-tais, ao construto de DNA a ser transformado não precisa atender a qualquerrequisito em particular (de fato, cassetes de expressão "descobertos" podemser utilizados). Podem ser utilizados plasmídeos comuns, como aqueles dasérie pUC.

Além e em preferência a técnicas de transformação "direta", atransformação pode ser realizada também por infecção bacteriana por meiode bactérias do solo, como Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacteriumrhizogenes. Essas cepas contêm um plasmídeo (plasmídeo Ti ou Ri). Partedeste plasmídeo, denominado T-DNA (DNA transferido), é transferido para aplanta após a infecção pelo Agrobacterium e integrado no genoma da célulada planta. Embora desenvolvida originalmente para plantas dicotiledôneas, atransformação mediada por Agrobacterium é empregada para métodos detransformação de monocotiledôneos (Hiei 1994). A transformação é descrita,por exemplo, para arroz, milho, trigo, aveia e cevada (revista em Shimamo-to1994; Vasil et al. 1992; Vain 1995; Vasil 1996; Wan & Lemaux 1994).

Em relação à transformação mediada por agrobactérias, aoconstruto de DNA da invenção pode ser combinada com regiões adequadasque flanqueiam o T-DNA e a introdução de um vetor hospedeiro convencio-nal do Agrobacterium tumefaciens. As funções de virulência do hospedeiroA. tumefaciens orientarão a inserção de um transgene e de gene(s) marca-dores) adjacente(s) (se presente) no DNA da célula da planta quando estafor infectada pela bactéria. Assim, o construto de DNA da invenção é de pre-ferência integrado em plasmídeos específicos, adequados para transforma-ção mediada por agrobactérias, em um vetor condutor ou intermediário ouem um vetor binário. Se, por exemplo, um plasmídeo Ti ou Ri for utilizadopara a transformação, pelo menos a fronteira direita, porém, na maioria doscasos, a fronteira direita e esquerda do T-DNA do plasmídeo Ti ou Ri estáligada ao cassete de expressão a ser introduzida como uma região flanque-adora. Vetores binários, capazes de se replicarem em E. eoli e em Agrobac-terium,- são utilizados de preferêcia. Eles podem ser transformados direta-mente no Agrobaeterium (Holsters 1978).

2.2.2 Transformação Mediada por Agrobacterium (cocultivo)

A bactéria do solo empregada para transferência de T-DNA noembrião imaturo pode ser qualquer espécie da famílian Rhizobiaeeae. A fa-mília Rhizobiaeeae compreende os gêneros Agrobaeterium, Rhizobium, Si-norhizobium e-Allorhizobium, .gêneros incluídos na subclasse alfa-2 de Pro-teobactérias com base em características ribossômicas. Os membros destafamília são aeróbicos e gram-negativos. As células normalmente possuem aforma de bastonetes (0,6 - 1,0 pm por 1,5 - 3,0 pm), existem isoladamenteou em pares, não são capazes de formar endospóros e se movimentam pormeio de um a seis flagelos peritríqueos. Uma quantidade considerável delimo polissacarídeo extracelular é produzido durante o crescimento em meiocontendo carboidrato. Rhizobiaceae como Sinorhizobium meliloti, Sinorhizo-bium medicae, Sinorhizobium fredii, Rhizobium sp são especialmente prefe-ridos. NGR234, Rhizobium sp. BR816, Rhizobium sp. N33, Rhizobium sp.GRH2, Sinorhizobium saheli, Sinorhizobium terangae, Rhizobium Iegumino-sarum biovar trifolii, Rhizobium Ieguminosarum biovar viciae, Rhizobium Ie-guminosarum biovar phaseoli, Rhizobium tropici, Rhizobium etli, Rhizobiumgalegae, Rhizobium gallicum, Rhizobium giardinii, Rhizobium hainanense,Rhizobium mongolense, Rhizobium lupini, Mesorhizobium Ioti, Mesorhizobi-um huakuii, Mesorhizobium ciceri, Mesorhizobium mediterraneium, Mesorhi-zobium tianshanense, Bradyrhizobium elkanni, Bradyrhizobium japonicum,Bradyrhizobium liaoningense, Azorhizobium caulinodans, Allobacterium un-dicola, Phyllobacterium myrsinacearum, Agrobacterium tumefaciens, Agro-baeterium radiobaeter, Agrobaeterium rhizogenes, Agrobaeterium vitis e A-grobaeterium rubi. São também preferidos as cepas e método descritos emBroothaerts W et al. (2005) Nature 433:629-633.

A natureza monofilética do Agrobaeterium, Allorhizobium e Rhi-zobium e a sua circunscrição genérica fenotípica comum justifam seremcombinados em um único gênero, Rhizobium. A classificação e caracteriza-ção de cepas do Agrobaeterium, incluindo a desdiferenciação do Agrobacte-rium tumefaciens e Agrobaeterium rhizogenes e suas classes variadas detipos de opinas, são práticas bem-conhecidas na técnica (consultar, por e-xemplo, Laboratory guide for Identification of plant pathogenic bactéria, 3aedição. (2001) Schaad, Jones, and Chun (eds.) ISBN 0890542635; por e-xemplo, o artigo de Moore et al. publicado no mesmo). Análises recentesdemonstram que a classificação por suas propriedades fitopatogênicas podenão ser justificada. De acordo com o mesmo, métodos mais avançados ba-seados em análise e comparação genômica (como seqmênciamento de 16SrRNA; RFLP1Rep-PCR, etc.) são empregados para elucidar a relação dasvárias cepas (consultar, por exemplo, Young 2003, Farrand 2003, de Bruijn1996, Vinuesa 1998). As relações filogenéticas de membros do gênero A-grobacterium por dois métodos demonstrando a relação de cepas K599 doAgrobacterium são apresentadas em Llob 2003 (figura 2).

É conhecido na técnica que não só o Agrobacterium, mas tam-bém outras bactérias do solo são capazes de mediar transferência de T-DNA1 desde que possuam os elementos funcionais pertinentes para a trans-ferência de T-DNA de um plasmídeo Ri ou Ri (Klein & Klein 1953; Hooykaas1977; van Veen 1988).

De preferência, a bactéria do solo pertence ao gênero Agrobac-terium. O termo "Agrobacterium" refere-se a uma bactéria do solo fitopato-gênica e gram-negativa em forma de bastonete. As espécies de Agrobacte-rium, Agrobacterium tumefaciens (sinônimo, Agrobacterium radiobacter),Agrobacterium rhizogenes, Agrobacterium rubi e Agrobacterium vitis, juntocom Allorhizobium undicola, formam um grupo monofilético com todas asespécies Rhizobium, com base em análises comparativas de 16S rDNA(Sawada 1993, Young 2003). Agrobacterium é um gênero artificial que com-preende espécies fitopatogênicas.

O termo plasmídeo Ti1 conforme utilizado no presente, refere-sea um plasmídeo capaz de se replicar em Agrobacterium e que se encontra,em seu estado natural, na forma "armada", mediando uma galha-da-coroaem plantas infectadas por Agrobacterium. A infecção de uma célula vegetalpor uma forma natural, "armada" de um plasmídeo Ti do Agrobacterium levageralmente à-produção-de-opinas (por-exemplo, nopalina, agropina, octapi-na, etc.) pela célula infectada. Dessa forma, cepas de Agrobacterium quelevam à produção de nopalina (por exemplo, as cepas LBA4301, C58, A208)são referidas como Agrobacteria do "tipo nopalina"; cepas de Agrobacteriumque levam à produção de octopina (por exemplo, as cepas LBA4404, Ach5,B6) são referidas como Agrobacteria do "tipo octopina" e cepas de Agrobac-terium que levam à produção-de agropina (por exemplo, as cepas EHA105,EHA101, A281) são referidas como Agrobacteria do "tipo agropina". Plasmí-deo Ti desarmado significa um plasmídeo Ti desprovido das propriedades demediador de galha-da-coroa, porém, de outro modo, fornecendo as funçõesnecessárias para infecção da planta. De preferência, a região de T-DNA doreferido plasmídeo "desarmado" foi modificada de forma que, além das se-qüências de fronteira, nenhuma outra seqüência interna funcional do Ti podeser transferida para o genoma da planta. Em uma concretização preferida,quando se utiliza um sistema de vetor binário, toda a região de T-DNA (inclu-indo as fronteiras do T-DNA) é deletada.

O termo plasmídeo Ri, conforme utilizado no presente, refere-sea um plasmídeo capaz de se replicar em Agrobacterium e que se encontra,em seu estado natural, na forma "armada", mediando a doença caracteriza-da por raízes em cabeleira em plantas infectadas por Agrobacterium. A in-fecção de uma célula vegetal por uma forma natural, "armada" de um plas-mídeo Ri do Agrobacterium leva geralmente à produção de opinas (deriva-dos de amino açúcar, produzidos nas células tranformadas da planta, como,por exemplo, agropina, cucumopina, octapina, miquipina, etc.) pela célulainfectada. Cepas de Agrobacterium rhizogenes são tradicionalmente distin-guidas em subclasses da mesma maneira que as cepas de A. tumefaciens osão. As cepas mais comuns são as cepas do tipo agropina (por exemplo,caracterizadas pelo plasmídeo Ri pRi-A4), cepas do tipo manopina (por e-xemplo, caracterizadas pelo plasmídeo Ri pRi8196) e cepas do tipo cucu-mopina (por exemplo, caracterizadas pelo plasmídeo Ri pRi2659). Algumasoutras cepas são do tipo miquimopina (por exemplo, caracterizadas peloplasmídeo Ri pRi1723). Miquimopina e cucumopina são estereoisômeros,porém nenhuma homologia foi constatada entre os plasmídeos Ri em nívelde nucleotídeo (Suzuki 2001). Plasmídeo Ri desarmado significa um plasmí-deo Ri desprovido das propriedades de mediador de doença de raízes emcabeleira, porém, de outro modo, fornecendo as funções necessárias parainfecção da planta. De preferência, a região de T-DNA do referido plasmídeo"desarmado" foi modificada de forma que, além das seqüências de fronteira,nenhuma outra seqüência interna funcional do Ri pode ser transferida para ogenoma da planta. Em uma concretização preferida, quando se utiliza umsistema de vetor binário, toda a região de T-DNA (incluindo as fronteiras doT-DNA) é deletada.

Os plasmídeos Ti e Ri do A. tumefaciens e A. rhizogenes, res-pectivamente, transportam genes responsáveis pela transformação genéticada planta (Kado 1991). Vetores são baseados no plasmídeo Ti ou Ri de A-grobacteríum e utilizam um sistema natural de transferência de DNA para ogenoma da planta. Como parte desse parasitismo altamente desenvolvido, oAgrobacterium transfere uma parte definida de sua informação genômica (oT-DNA; flanqueado por repetições de aproximadamente 25 bp, denominadasfronteira direita e esquerda) para o DNA cromossômico da célula da planta(Zupan 2000). A referida transferência de DNA é mediada pela ação combi-nada dos genes denominados vir (parte original dos plasmídeos Ti). Parautilização deste sistema natural, os plasmídeos Ti foram desenvolvidos semos genes originais que induziam tumores ("vetores desarmados"). Ainda ou-tro aperfeiçoamento, os assim chamados "sistemas de vetor binário", o T-DNA foi fisicamente separado dos outros elementos funcionais do plasmídeoTi (por exemplo, os genes vir), pela incorporação em um vetor condutor,permitindo uma manipulação mais fácil (EP-A 120 516; US 4 940 838). Estesvetores binários compreendem (além do T-DNA desarmado com suas se-qüências de fronteira), seqüências procarióticas para replicação tanto emAgrobacterium como em E. coli. Uma das vantagens da transformação me-diada por Agrobacterium é que, de modo geral, somente o DNA flanqueadopelas fronteiras é transferido para o genoma e, de preferência, somente umacópia é inserida. Descrições de sistemas de vetores de Agrobacterium e demétodos para transferência genética-mediada por Agrobaeterium são conhe-cidas na técnica (Miki 1993; Gruber 1993; Moloney 1989).

Portanto, em relação à transformação mediada por Agrobaeteria,a composição genética (por exemplo, compreendendo um cassete de ex-pressão) é integrada nos plasmídeos específicos, em um vetor condutor ouintermediário ou em um vetor binário. Se, por exemplo, um plasmídeo Ti ouRi for utilizado para_a_transformação,_pelo menos a fronteira,direita, porém,na maioria dos casos, a fronteira direita e esquerda do T-DNA do plasmídeoTi ou Ri está ligada ao cassete de expressão a ser introduzida como umaregião flanqueadora. São utilizados, de preferência, vetores binários. Vetoresbinários são capazes de se replicarem tanto em E.eoli como em Agrobaete-rium. Eles podem compreender um gene marcador de seleção e um Iiganteou poliligante (para inserção de, por exemplo, o cassete de expressão a sertransferido), flanqueado pela seqüência da fronteira direita e esquerda do T-DNA. Eles podem ser transferidos diretamente para Agrobacterium (Holsters1978). O gene marcador de seleção permite a seleção de agrobactériastransformadas e é, por exemplo, o gene nptll que confere resistência à ca-namicina. O Agrobacterium que atua como o organismo hospedeiro, nestecaso, deve já conter um plasmídeo com a região vir. A última é necessáriapara a transferência do T-DNA para a célula da planta. Agrobacterium trans-formado desta maneira pode ser utilizado para transformar células de plan-tas. O uso de T-DNA para transformação de células vegetais foi estudado edescrito extensamente (EP 120 516; Hoekema 1985; An 1985).

Vetores binários comuns baseiam-se em plasmídeos de uma"ampla gama de hospedeiros", como o pRK252 (Bevan 1984) ou pTJS75(Watson 1985), derivados do plasmídeo do tipo P RK2. A maioria destes ve-tores é derivada de pBIN19 (Bevan 1984). Diversos vetores binários são co-nhecidos, alguns dos quais disponíveis no mercado como, por exemplo,pBI101.2 ou pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. EUA). Vetores adicionaisforam melhorados em termos de tamanho e manipulação (por exemplo,pPZP; Hajdukiewicz 1994). Sistemas melhorados de vetores são descritostambém na patente WO 02/00900.

De preferência, a bactéria do solo é uma bactéria que pertence àfamília Agrobaeterium, mais preferencialmente uma cepa desarmada do A-grobaeterium tumefaeiens ou rhizogenes. Em uma concretização preferida,cepas de Agrobaeterium que podem ser utilizadas na prática da invençãoincluem cepas do tipo octapina, por exemplo, LBA4404 ou do tipo agropina,por exemplo, EHA101 ou EHA105. Cepas adequadas de A. tumefaeiens,para transferência de DNA, incluem, por exemplo, EHA101pEHA101 (Hood1986), EHA105[pEHA105] (Li 1992), LBA4404[pAL4404] (Hoekema 1983),C58C1[pMP90] (Koncz & Schell 1986) e C58C1[pGV2260] (Deblaere 1985).Outra cepa adequada é a cepa do tipo nopalina, Agrobaeterium tumefaeiensC58. Outras cepas adequadas incluem A. tumefaeiens C58C1 (Van Larebe-ke 1974), Α136 (Watson 1975) ou LBA4011 (Klapwijk 1980). Em outra con-cretização preferida, a bactéria do solo é uma variante da cepa desarmadada cepa K599 do Agrobacterium rhizogenes (NCPPB 2659). Estas cepassão descritas no pedido de patente US provisional N0 60/606.789, deposita-do em 02 de setembro de 2004, aqui incorporado, em sua totalidade, porreferência.

De preferência, estas cepas compreendem uma variante desar-mada de um plasmídeo Ti ou Ri, fornecendo as funções necessárias paratransferência de T-DNA para as células da planta (por exemplo, os genesvir). Em uma concretização preferida, a cepa de Agrobacterium utilizada pa -ra transformar o tecido vegetal pré-cultivado com o composto fenólico daplanta, contém um plasmídeo Ti do tipo L,L-succinamopina, preferencialmen-te, desarmado, como o pEHA101. Em uma concretização preferida, a cepade Agrobacterium utilizada para transformar o tecido vegetal pré-cultivadocom o composto fenólico da planta, contém um plasmídeo Ti do tipo octopi-na, preferencialmente, desarmado, como o pAL4404. Geralmente, quandose usa plasmídeos Ti do tipo octopina ou plasmídeos auxiliares, é preferívelque o gene virF seja deletado ou inativado (Jarschow 1991).

O método da invenção pode ser utilizado também em combina-ção com cepas específicas de Agrobacterium para aumentar ainda mais aeficiência de transformação, como cepas de Agrobacterium em que a ex-pressão do gene vir-e/ou a sua indução é alterada pela-presença dos genesmutantes ou quiméricos virA ou virG (por exemplo, Hansen 1994; Chen eWinans 1991; Scheeren-Groot, 1994). São ainda preferidas combinações dacepa LBA4404 do Agrobaeterium tumefaeiens (Hiei 1994) com plasmídeossuper virulentos. Estes são, de preferência, vetores à base de PTOK246 (I-shida 1996).

Um vetor binário ou qualquer outro vetor pode ser modificadopor técnicas comuns de recombinação de DNA, multiplicado em E. eoli eintroduzido no Agrobaeterium, por exemplo, por eletroporação ou outras téc-nicas de transformação (Mozo 1991).

O Agrobaeterium é de preferência cultivado e utilizado de manei-ra semelhante àquela descrita em Ishida (Ishida 1996). O vetor compreen-dendo a cepa do Agrobacterium pode, por exemplo, ser cultivado por 3 diasem meio YP (5g/l de extrato de levedura, 10 g/l de peptona, 5 g/l de NaCI1 15g/l de ágar, pH 6,8), complementado com o antibiótico apropriado (por e-xemplo, 50 mg/l de espectinomicina). As bactérias são coletadas do meiosólido, utilizando uma alça, e novamente colocadas em suspensão. Em umaconcretização preferida da invenção as culturas de Agrobacterium são inici-adas pelo uso de alíquotas congeladas a uma temperatura de -80°C.

A transformação dos embriões imaturos, pelo Agrobacterium,pode ser conduzida simplesmente pelo contato dos embriões imaturos como Agrobacterium. A concentração de Agrobaeterium utilizada para infecção ecocultivo pode necessitar ser variada. Por exemplo, é preparada uma sus-pensão de células do Agrobaeterium com densidade de população aproxi-madamente de 105 a 10111 preferencialmente de 106 a 1010, mais preferenci-almente em torno de 108 células ou cfu/ml e os embriões imaturos são sub-mersos nesta suspesão por aproximadamente de 3 a 10 minutos. Os embri-ões imaturos resultantes são, em seguida, cultivados em meio sólido pordiversos dias, juntos com o Agrobaeterium.

Em outra concretização preferida para a etapa de infecção e co-cultivo, uma suspensão da bactéria do solo (por exemplo, Agrobaeteria) nomeio de cocultivo ou infecção é aplicada diretamente em cada embrião, e aquantidade excedente de líquido cobrindo o embrião é removida. A remoçãopode ser efetuada por meios variados, de preferência, por secagem por ven-tilação ar ou absorção. Esse procedimento poupa tempo e trabalho e reduzdanos não intencionais mediados pelas agrobactérias por uso excessivo dasmesmas. Em uma concretização preferida, são empregadas aproximada-mente de 1 a aproximadamente 10 μΙ de uma suspensão da bactéria do solo(por exemplo, Agrobaeteria). De preferência, o embrião imaturo é infectadodiretamente pela Agrobaeterium no meio de cocultivo. De preferência, a con-centração empregada de bactérias é de 106 a 1011 cfu/ml.

Para tratamento por Agrobaeterium de embriões imaturos isola-dos, as bactérias são ressuspensas em um meio de cocultivo compatívelcom plantas. A complementação do meio de cocultura com inibidores de eti-Ieno (por exemplo, nitrato de prata), compostos que absorvem fenol (comopolivinilpirrolidona, Perl 1996) ou antioxidantes (como compostos de tiol, porexemplo, ditiotreitol, L-cisteína, Olhoft 2001), que podem diminuir necrose detecidos em virtude de respostas de defesa da planta (como oxidação fenóli-ca) podem melhorar ainda mais a eficiência da transformação mediada porAgrobacterium. Em outra concretização preferida, o meio de cocultivo com-preende, pelo menos, um composto de tiol, preferencialmente selecionadodo grupo constituído por tiossulfato de sódio, ditiotrietol (DTT) e cisteína. Depreferência, a concentração é em torno de 1 mM a 10mM de L-cisteína, 0,1M a 5 mM de DTT e/ou 0,1 M a 5 mM de tiossulfato de sódio. De preferên-cia, o meio empregado durante o cocultivo compreende de aproximadamen-te 1 μΜ a aproximadamente 10 μΜ de nitrato de prata e/ou (preferencial-mente "e") de aproximadamente 50 mg/l a aproximadamente 1.000 mg/l deL-cisteína. Isso resulta em uma vulnerabilidade altamente reduzida do em-brião imaturo contra danos mediados pelo Agrobacterium (como necroseinduzida) e melhora imensamente a eficiência global da transformação.

Podem ser empregados períodos de cocultivo que variam dealgumas horas a 7 dias. O cocultivo de Agrobacterium com os embriões ima-turos isolados é conduzido geralmente por aproximadamente 12 horas a a-proximadamente cinco dias, preferencialmente por aproximadamente 1 dia aaproximadamente 3 dias.

Em uma concretização melhorada da invenção, os embriões i-maturos isolados e/ou as agrobactérias podem ser tratados por um compos-to fenólico antes ou durante o cocultivo com o Agrobacterium. "Compostosfenólicos de plantas" ou "fito-fenólicos", adequados, no escopo da invenção,são aqueles isolados de moléculas fenólicas substituídas, capazes de induziruma resposta quimiotática, principalmente aqueles capazes de induzir au-mento da expressão do gene vir em um plasmídeo Ti-plasmid que contenhaAgrobaeterium sp., particularmente um plasmídeo Ti que contenha Agrobae-terium tumefaeiens. Métodos para medir respostas quimiotáticas contracompostos fenólicos de plantas foram, por exemplo, descritos (Ashby 1988)e métodos para medir indução da expressão do gene vir são bem conheci-dos (Stachel 1985; Bolton 1986). O pré-tratamento e/ou tratamento durante ococultivo do Agrobacterium possui, pelo menos, dois efeitos benéficos: Indu-ção dos genes vir de plasmídeos Ti ou plasmídeos auxiliares (Van Wordra-gen 1992; Jacq 1993; James 1993; Guivarc'h 1993) e intensificação da com-petência para incorporação do DNA estrangeiro no genoma da célula vegetal.

Compostos fenólicos de plantas preferidos são aqueles encon-trados em exsudatos de lesões de células de plantas. Um dos compostosfenólicos de plantas mais bem conhecido é a acetosiringona, presente emvárias células lesadas ou intactadas, embora em concentrações diferentes.

No entanto, a acetosiringona (3,5-dimetóxi-4-hidroxiacetofenona) não é oúnico fenólico de planta que pode induzir a expressão de genes vir. Outrosexemplos são α-hidróxi-acetosiringona, ácido sinapínico (ácido 3,5-dimetóxi-4-hidroxicinâmico), ácido siríngico (ácido 4-hidróxi-3,5 dimetoxibenzóico),ácido ferúlico (ácido 4-hidróxi-3-metoxicinâmico), catecol (1,2-dihidroxibenzeno), ácido p-hidroxibenzóico (ácido 4-hidroxibenzóico), ácidoβ-resorcílico (ácido 2,4-dihidroxibenzóico), ácido protocatechuico (ácido 3,4-dihidroxibenzóico), ácido pirrogálico (ácido 2,3,4-trihidroxibenzóico), ácidogálico (ácido 3,4,5-trihidroxibenzóico) e vanilina (3-metóxi-4-hidroxibenzaldeído), sendo estes compostos fenólicos conhecidos ou capa-zes de substituir acetosiringona no meio de cultivo com resultados seme-lhantes. Conforme utilizadas no presente, as moléculas mencionadas sãoreferidas como compostos fenólicos de plantas.

Compostos fenólicos de plantas podem ser acrescentados aomeio de cultura da planta, isoladamente ou em combinação com outroscompostos fenólicos de plantas. Uma combinação particularmente preferidade compostos fenólicos de plantas compreende, pelo menos, acetosiringonae ácido p-hidroxibenzóico, porém prevê-se que outras combinações de doisou mais compostos fenólicos de plantas atuarão também sinergisticamentepara reforçar a eficiência de transformação.

Ademais, certos compostos, como osmoprotetores (por exemplo,L-prolina, de preferência, em uma concentração de aproximadamente 700mg/l, ou betaína), fitohormônios (inter alia, NAA), opinas ou açúcares atuamsinergisticamente quando acrescentados em combinação com compostosfenólicos de plantas.

Em uma concretização da invenção, é preferível que o compostofenólico de plantas, principalmente acetosiringona seja acrescentado aomeio antes do contato dos embriões imaturos isolados com as agrobactérias(por exemplo, de diversas horas a um dia). Acredita-se que o período exatoem que as células cultivadas são incubadas no meio contendo o compostofenólico de plantas, como acetosiringona, não é fundamental e somente limi-ta o tempo durante o qual os embriões imaturos começam a se diferenciar.

Acredita-se também que a concentração do composto fenólicode plantas no meio tenha efeito sobre o desenvolvimento de competênciapara integração da transformação. O intervalo ideal da concentração decompostos fenólicos de plantas no meio pode variar dependendo da varie-dade da Zea mays da qual os embriões imaturos derivaram, porém prevê-seque em torno de 100 μM a 700 μΜ seja uma concentração adequada paramuitos propósitos. No entanto, podem ser utilizadas concentrações tão bai-xas quanto aproximadamente 25 μΜ para se obter um bom efeito sobre aeficiência de transformação. Da mesma forma, prevê-se que concentraçõesmais altas, de até aproximadamente 1000 μΜ produzirão efeitos semelhan-tes. Concentrações comparáveis aplicam-se a outros compostos fenólicosde plantas, e concentrações ideais podem ser estabelecidas facilmente porexperimentação de acordo com esta invenção.

Os Agrobacteria a serem cocultivados com os embriões imaturosisolados podem ser pré-incubados com acetosiringona ou outro compostofenólico de planta, conforme conhecido por versado na técnica, ou utilizadosdiretamente após isolamento de-seu meio de cultura. Condições de induçãoparticularmente adaptadas para Agrobacterium tumefaciens foram descritaspor Vernade et aí. (1988). A eficiência da-transformação com Agrobacteriumpode ser intensificada por inúmeros outros métodos conhecidos na técnica,como, por exemplo, infiltração a vácuo (WO 00/58484), choque térmico e/oucentrifugação, acréscimo de nitrato de prata, sonicação, etc.

Foi observado nesta invenção que a eficiência de transformaçãodos embriões imaturos isolados por Agrobacterium pode ser significativa-mente melhorada pela manutenção do pH do meio de cocultivo em um inter-valo de 5,4 a 6,4, preferencialmente, 5,6 a 6,2, especialmente preferível de5,8 a 6,0. Em uma concretização melhorada da invenção, a estabilização dopH neste intervalo é mediada por combinação de tampões MES e de hidro-genofosfato de potássio.

2.3 Recuperação

Células transformadas, ou seja, aquelas que compreendem oDNA integrado ao DNA da célula do hospedeiro, podem ser selecionadasdas células não-transformadas utilizando, de preferência, o método de sele-ção da invenção.

Antes de um meio de transferência para um de recuperação e/oude seleção, especialmente no caso de transformação, mediada por Agrobac-terium, certas outras etapas intermediárias podem ser empregadas. Por e-xemplo, qualquer agrobactéria que restar da etapa de cocultivo poderá serremovida (por exemplo, por uma etapa de lavagem). A fim de prevenir novocrescimento da referida bactéria, o meio de recuperação e/ou seleção sub-sequentemente empregado compreende, de preferência, um bactericida (an-tibiótico), adequado para impedir crescimento de Agrobacterium. Antibióticosbactericidas preferidos a serem empregados incluem, por exemplo, carbeni-cilina (500 mg/l) ou Timentin® (GlaxoSmithKline; mistura de ticarcilina dissó-dica e clavulanato de potássio; 0,8 g de Timentin® contêm 50 mg de ácidoclavulânico com 750 mg de ticarcilina). Quimicamente, ticarcilina dissódica éo sal dissódico do ácido N-(2-carbóxi-3,3-dimetil-7-oxo-4-tia-1-azabiciclo[3.2.0]hept-6-il)-3-tio-fenemalonâmico. Quimicamente, clavulanatode potássio é (Z)-(2R, 5R)-3-(2-hidroxietilideno)-7-oxo-4-oxa-1-azabiciclo[3.2.0] heptano-2-carboxilato) de potássio.

E preferível que a etapa que segue diretamente o procedimentode transformação (por exemplo, cocultivo) não compreenda uma quantidadefitotóxica eficaz de D-alanina e/ou D-serina, ou derivados destes (os quaissão utilizados subseqmentemente para transformação). Dessa forma, estaetapa tem a intenção de permitir a regeneração do tecido transformado,promover o início da formação do calo embriogênico no embrião infectadopor Agrobacterium e eliminar as demais células de Agrobacterium. De acor-do com o mesmo, em uma concretização preferida, o método da invençãocompreende a etapa de transferência do tecido transformado alvo (por e-xemplo, os embriões imaturos cocultivados) para um meio de recuperação(utilizado na etapa c), compreendendo

i. uma quantidade eficaz de pelo menos um antibiótico que iniba ou su-prima o crescimento da bactéria do solo, e/ou (preferencialmente "e")

ii. L-prolina em uma concentração de aproximadamente 1 g/l a aproxima-damente 10g/l, e/ou (preferencialmente "e")

De preferência, o referido meio de recuperação não contém umaquantidade fitotóxica eficaz de D-alanina e/ou D-serina ou um derivado des-tes. O meio de recuperação pode compreender ainda uma quantidade eficazde pelo menos um regulador de crescimento vegetal (por exemplo, umaquantidade eficaz de um composto de auxina). Dessa forma, o meio de re-cuperação da etapa c) compreende, de preferência

ii. L-prolina em uma concentração de aproximadamente 1 g/l a aproxima-damente 10g/I, e

iv. uma quantidade eficaz de pelo menos um composto auxina.

Exemplos de meios de recuperação preferidos são fornecidosabaixo nos Exemplos (A-4 ou A-5). O período de recuperação pode durar emtorno de 1 dia a em torno de 14 dias, preferencialmente em torno de 5 dias aem torno de 8 dias. De preferência, o lado do escutelo é mantido erguido,durante este período, e não embebido no meio.2.4 Seleção

Após a etapa de recuperação, o tecido-alvo (por exemplo, osembriões imaturos) é transferido e incubado em um meio de seleção. O meiode seleção compreende D-alanina e/ou D-serina, ou um derivado destes, emconcentração fitotóxica (ou seja, em uma concentração que finalize ou, pelomenos, retarde o crescimento das células não-transformadas). O termo "fito-tóxico", "fitotoxicidade" ou "efeito fitotóxico", conforme utilizado no presente,pretende significar qualquer efeito mensurável negativo sobre a fisiologia deuma planta ou célula vegetal, resultando em sintomas que incluem (entreoutros), por exemplo, redução ou comprometimento de crescimento, reduçãoou comprometimento de fotossíntese, redução ou comprometimento de divi-são celular, redução ou comprometimento de regeneração (por exemplo, deuma planta amadurecida de uma cultura de células, calo ou parte aérea,etc.), redução ou comprometimento de fertilidade, etc. Fitotoxicidade podeincluir ainda efeitos como necrose ou apoptose. Uma concretização preferidaleva a uma redução de crescimento ou capacidade de regeneração de pelomenos 50%, preferencialmente, pelo menos, 80%, mais preferencialmente,pelo menos, 90%, em comparação a uma planta que não foi tratada com oreferido composto fitotóxico.

O composto específico empregado para seleção é escolhido de-pendendo de qual proteína marcadora é expressa. Por exemplo, se a D--serina-amônia-liase do E.eo//'for-empregado, a seleção é efetuada em ummeio compreendendo D-serina. Se a D-aminoácido oxidase do Rhodotorulagracilis for empregada, a seleção é efetuada em um meio compreendendoD-alanina e/ou D-serina.

O fato de D-aminoácidos serem empregados não descarta apresença de estruturas de L-aminoácidos ou de L-aminoácidos. Para algu-mas aplicações, pode ser preferível (por exemplo, por.motivos de custo) a-plicar uma mistura racêmica de D e L-aminoácidos (ou uma mistura com teorenriquecido de D-aminoácidos). De preferência, a.relação do D-aminoácidopara o L-enantiômero corresponente é de pelo menos 1:1, preferencialmen-te, 2:1, mais preferencialmente, 5:1 e o mais preferível, 10:1 ou 100:1. O usode D-alanina tem a vantagem de que misturas racêmicas de D and L-alaninapodem ser aplicadas sem interfências ou efeitos prejudiciais do L-enantiômero. Por conseguinte, em uma concretização melhorada, uma mis-tura racêmica de D/L-alanina é empregada, como composto.

O termo "derivado", referente a D-alanina ou D-serina, significacompostos químicos que compreendem a estrutura do respectivo D-aminoácido de D-alanina ou D-serina, porém, quimicamente modificada.Conforme utilizado no presente, o termo "estrutura de D-aminoácido" (como"estrutura de D-serina") pretende incluir o D-aminoácido, bem como análo-gos, derivados e mimetizações do D-aminoácido que mantêm a atividadefuncional do composto. Conforme utilizado no presente, um "derivado" refe-re-se também a uma forma de D-serina ou D-alanina em que um ou maisgrupos de reação no composto formaram derivados com um grupo substitu-inte. O D-aminoácido empregado pode ser modificado por um grupo quemodifica o amino terminal ou carbóxi terminal ou por modificação da cadeialateral. O grupo que modifica o amino terminal pode ser, por exemplo, sele-cionado do grupo constituído por fenilacetíla, difenilacetíla, trifenilacetíla, bu-tanoíla, isobutanoíla, hexanoíla, propioníla, 3-hidroxibutanoíla, 4-hidroxibutanoíla, 3-hidroxipropionoíla, 2,4-dihidroxibutiroíla, 1-Adamantanocarboníla, 4-metilvaleríla, 2-hidroxifenilacetíla, 3-hidroxifenilacetíla, 4-hidroxifenilacetíla, 3,5-dihidróxi-2-naftoíla, 3,7-dihidróxi-2-naftoíla, 2-hidroxicinamoíla, 3-hidroxicinamoíla, 4-hidroxicinamoíla, hidroci-namoíla, 4-formilcinamoíla, 3-hidróxi-4-metoxicinamoíla, 4-hidróxi-3-metoxicinamoíla, 2-carboxicinamoíla, 3,4,-dihidróxi-hidrocinamoíla, 3,4-dihidroxicinamoíla, trans-cinamoíla, (±)-mandelíla, (±)-mandelil-(±)-mandelíla,glicolíla, 3-formilbenzoíla, 4-formilbenzoíla, 2-formilfenoxiacetíla, 8-formil-l-naftoíla, 4-(hidroximetil)benzoíla, 3-hidroxibenzoíla, 4-hidroxibenzoíla, 5-hidantoinacetíla, L-hidro-orotíla,. 2,4rdihidroxibenzoíla, 3-benzoilpropanoíla,(±)-2,4-d ih id róxi-3,3-d imetilbutanoíla, DL-3-(4-hidroxifenil)lactíla, 3-(2-hidroxifenil)propioníla, 4-(2-hidroxifenil)propioníla, D-3-fenil-lactíla, 3-(4-hidroxifenil)propioníla, L-3-fenil-lactíla, 3-piridilacetíla, 4-piridilacetíla, isonico-tinoila, 4-quinolinacarboxíla, 1-isoquinolinacarboxíla e 3-isoquinolinacar-boxíla. O grupo que modifica o terminal carbóxi pode ser, por exemplo, sele-cionado do grupo constituído por um grupo amida, um grupo alquil amida,um grupo aril amida e um grupo hidróxi. O "derivado", conforme utilizado nopresente, pretende incluir moléculas que imitam a estrutura química de umaestrutura do respectivo D-aminoácido e retêm as propriedades funcionais daestrutura do D-aminoácido. Abordagens para desenhar aminoácidos ou aná-logos, derivados e mimetizações de peptídeos são conhecidas na técnica(por exemplo, consultar Farmer 1980; Ball 1990; Morgan 1989; Freidinger1989; Sawyer 1995; Smith 1995; Smith 1994; Hirschman 1993). Outras pos-síveis modificações incluem substituições com N-alquíla (ou aríla) ou ligaçãocruzada na estrutura principal para construir estruturas lactâmicas e outrascíclicas. Outros derivados incluem derivados hidroximetíla do C terminal,derivados que foram modificados por oxigênio (por exemplo, hidroximetilbenzil éter de C terminal), derivados com modificações no N terminal, inclu-indo amidas substituídas, como alquilamidas e hidrazidas. Ademais, podeser empregada estrutura de D-aminoácido compreendendo compostos her-bicidas. Estes compostos são descritos, por exemplo, na patente US 5 059239 e podem incluir (entre outros) metil éster de N-benzoil-N-(3-cloro-4-fluorofenil)-DL-alanina, N-benzoil-N-(3-cloro-4-fluorofenil) -DL-alanina, etiléster de N-benzoil-N-(3-cloro-4-fluorofenil)-DL-alanina, N-benzoil-N-(3-cloro-4-fluorofenil)-D-alanina, metil éster de isopropil éster de N-benzoil-N-(3-cloro-"4-fluorofenil)-D-alanina ou N-benzoil-N-(3-cloro-4-fluorofenil)-D-alanina.

O composto da seleção pode ser utilizado em combinação comoutras substâncias. Para fins de aplicação, o composto de seleção pode serutilizado também junto com os adjuvantes convencionalmente empregadosna técnica da formulação e são, por conseguinte, formulados de maneiraconhecida, por exemplo, em concentrados de emulsões, pomadas de reves--timento,-soluções diretamente pulverizadas ou diluídas, emulsões diluídas,pós-hidratantes, pós em solução, pó, granulados, além de cápsulas de, porexemplo, substâncias em polímeros. Dependendo da natureza das composi-ções que serão utilizadas, os modos de aplicação, como pulverizar, atomi-zar, recobrir com pó, espalhar pó, revestir ou despejar, são escolhidos deacordo com os objetivos pretendidos e as circunstâncias predominantes. Noentanto, o composto da seleção é mais preferencialmente aplicado direta-mente ao meio. Representa uma vantagem o fato de que soluções de esto-que contendo o composto de seleção possam ser preparadas e armazena-das a temperatura ambiente por um período prolongado sem perda da efici-ência de seleção.

A concentração ideal do composto de seleção (isto é, D-alanina,D-serina, derivados destes ou qualquer combinação destes) pode variar de-pendendo do tecido-alvo empregado para transformação, porém, de maneirageral (e, de preferência, para transformação de embrião imaturo), a concen-tração total (ou seja, a soma em caso de mistura) de D-alanina, D-serina ouderivados destes situa-se no intervalo de aproximadamente 1 mM a aproxi-madamente 100. Por exemplo, se a D-serina amônia-liase de E.coli for em-pregada, a seleção é efetuada em um meio compreendendo D-serina (porexemplo, incorporada a placas de meio MS de ágar solidificado), preferenci-almente em uma concentração de aproximadamente 1 mM a aproximada-mente 100 mM, mais preferencialmente de aproximadamente 5 mM a apro-ximadamente 50 mM, ainda mais preferencialmente de aproximadamente 7mM a aproximadamente 30 mM e mais preferível de aproximadamente 10 a20 mM. Se for empregada D-aminoácido oxidase de Rhodotorula gracilis, aseleção éfetuada em um meio compreendendo D-alanina e/ou D-serina (porexemplo, incorporadas em placas de meio MS em ágar solidificado), prefe-rencialmente em uma concentração total de aproximadamente 1 mM a 100mM, mais preferencialmente de aproximadamente 2 mM a aproximadamente50 mM, ainda mais preferencialmente de aproximadamente 3 mM a aproxi-madamente 20 mM e mais preferível de aproximadamente 5 a 15 mM.

Além disso, o tempo de seleção pode variar dependendo do te-cido-alvo utilizado e-o protocolo de regeneração empregado. Geralmente, otempo de seleção é de pelo menos 5 dias. Mais especificamente, o tempototal de seleção, sob condições de desdiferenciação (ou seja, indução docalo) é de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 semanas, preferenci-almente, de 3 a 7 semanas, mais preferencialmente de 3 a 4 semanas. Noentanto, o tempo preferido de seleção, sob as condições de desdiferencia-ção, é de que esta seja empregada por no máximo 70 dias. No meio do pe-ríodo de seleção, o calo pode ser transferido paa meio de seleção fresco,uma ou mais vezes. Para o protocolo específico fornecido no presente, onúmero preferido de etapas de meio de seleção (ou seja, uma transferênciapara novo meio de seleção) é que sejam empregadas 2 etapas. De prefe-rência, a seleção é efetuada em duas etapas, usando uma primeira etapa deseleção de aproximadamente 5 a 20 dias e, em seguida, transferindo as cé-lulas sobreviventes ou tecido para um segundo meio de seleção, contendoessencialmente a mesma composição do primeiro meio de seleção, por mais5 a 20 dias. No entanto, é possível também aplicar uma única etapa de seleção.

De preferência, o referido meio de seleção é também um meiode desdiferenciação compreendendo, pelo menos, um regulador adequadode crescimento de plantas para indução de formação de calo embriogênico.

O termo "regulador de crescimento de plantas" (PGR), conforme utilizado nopresente, significa compostos naturais ou sintéticos (que não existem natu-ralmente) que são capazes de regular o crescimento e desenvolvimento deplantas. PGRs podem atuar isoladamente ou em conjunto com um outro ououtros tipos de compostos mais outros compostos (por exemplo, açúcares,aminoácidos). Mais especificamente, o meio empregado para indução de~calo embriogênico-e seleção compreende

i. uma quantidade eficaz de pelo menos um composto auxina, e

ii. uma quantidade eficaz de um agente de seleção, que permitaseleção de células compreendendo o transgênico.

Além disso, o meio de indução de calo embriogênico pode com-preender opcionalmente uma quantidade eficaz de pelo menos um antibióti-co que iniba ou suprima o crescimento das bactérias do solo (conforme defi-nidas acima).

O termo "auxina" ou "compostos auxina" compreendem compos-tos que estimulam o alongamento e divisão celular, a diferenciação de tecidovascular, o desenvolvimento de frutos, a formação de raízes adventícias, aprodução de etileno e, em altas concentrações, induzem a desdiferenciação(formação de calo). A auxina mais comum que ocorre naturalmente é o ácidoindolacético (IAA)1 que é transportado por polaridade em raízes e troncos.Auxinas sintéticas são utilizadas extensamente na agricultura moderna.

Compostos sintéticos auxinas compreendem o ácido indol-3-butírico (IBA),ácido naftilacético (NAA) e o ácido 2,4-diclorfenoxiacético (2,4-D).

De preferência, quando utilizado como o único composto auxina,2,4-D é empregado em uma concentração de aproximadamente 0,2 mg/l aaproximadamente 6 mg/l, mais preferencialmente de aproximadamente 0,3 aaproximadamente 2 mg/l e o mais preferível, aproximadamente 1,5 mg/l. Seoutros compostos auxina ou combinações destes forem utilizados, as suascombinações preferidas são escolhidas de maneira que o efeito de desdife-renciação seja igual ao efeito obtido com as concentrações de 2,4-D especi-ficadas acima, quando utilizado como o único composto auxina. Dessa for-ma, a quantidade eficaz do auxina é preferencialmente equivalente a umaconcentração de aproximadamente 0,2 mg/l a aproximadamente 6 mg/l(mais preferencialmente de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 2 mg/le o mais preferível, aproximadamente 1,5 mg/l) de 2,4-D.

Além disso, combinação de auxinas diferentes pode ser empre-gada, por exemplo, uma combinação de 2,4-D e Picloram. De preferência,2,4-D, em uma concentração de aproximadamente 0,5 mg/l, pode ser com--binado a unrou mais tipos de compostos auxinas, por exemplo, Picloram,em uma concentração de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 mg/l,para melhorar a qualidade/quantidade de formação de calo embriogênico.

O meio pode ser ainda opcionalmente complementado com umou mais reguladores adicionais de crescimento de planta como, por exem-plo, compostos citoquininas (por exemplo, 6-benzilaminopurina) e/ou outroscompostos auxinas. Estes compostos incluem, entre outros, IAA, NAA, IBA,citoquininas, auxinas, quinetinas, glifosato e tiadiazorun. Compostos citoqui-ninas compreendem, por exemplo, 6-isopenteniladenina (IPA) e 6-benziladenina/6-benzilaminopurina (BAP).

A presença das enzimas metabolizadoras de D-aminoácidos nãodescarta que marcadores adicionais sejam empregados.

A seleção (aplicação do composto de seleção) pode finalizarapós o período de desdiferenciação e seleção. No entanto, é preferido apli-car também a seleção durante o período subseqmente de regeneração (emparte ou durante todo o período) e até mesmo durante o enraizamento.

2.5 Regeneração

A formação de parte áerea e de raiz, a partir de células desdife-renciadas, pode ser induzida de maneira conhecida. As partes aéreas obti-das podem ser plantadas e cultivadas. Células transformadas da planta, de-rivadas por quaisquer técnicas de transformação acima, podem ser cultiva-das para regenerarem uma planta completa que possua o genótipo trans-formado e, dessa forma, o fenótipo desejado. Estas técnicas de regeneraçãobaseiam-se em manipulação de certo fitohormônios em um meio de cresci-mento de cultura de tecido. A regeneração de plantas, a partir de protoplas-tos cultivadas, é descrita (por exemplo, em Evans 1983; Binding 1985). Aregeneração pode ser obtida também a partir do calo da planta, explantes,embriões somáticos (Dandekar 1989; McGranahan 1990), órgãos ou partesdestes. Estas técnicas de regeneração estão descritas de maneira geral (porexemplo, em Klee 1987). Outras técnicas de regeneração disponíveis sãorevistas em Vasil 1984, e Weissbach 1989.

Após o período de desdiferenciação e seleção (conforme descri-ta acima); as células resultantes (por exemplo, calo embriogênico em matu-ração) são transferidas para um meio que permita a conversão de rebentostransgênicos. De preferência, este meio não compreende auxinas, como 2,4-D, em uma concentração que leve à desdiferenciação. Em uma concretiza-ção preferida, este meio pode compreender um ou mais compostos selecio-nados do grupo constituído por:

i) citoquininas corno, por exemplo, zeatina, em uma concentra-ção, de preferência, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 10 mg/l,mais preferencialmente de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 5 mg/l,

ii) uma quantidade eficaz de pelo menos um antibiótico que inibaou suprima o crescimento da bactéria do solo (conforme definida acima), eiii) uma quantidade eficaz de um agente de seleção (por exem-plo, D-alanina, D-serina ou derivados destes), permitindo a selação de célu-las transgênicas (por exemplo, compreendendo o T-DNA transgênico).

O calo embriogênico é, de preferência, incubado neste meio atéque as partes aéreas sejam formadas e transferidas em seguida para ummeio de enraizamento. Esta incubação pode levar de 1 a 5, preferencialmen-te de 2 a 3 semanas. Partes aéreas ou rebentos regenerados (ou seja, par-tes aéreas com raízes) são transferidos para caixas de Phytatray ou Magen-ta, contendo meio de enraizamento (como o meio descrito na receita A-8) eincubados até que rebentos enraizados tenham se desenvolvido (geralmentede 1 a 4 semanas, de preferência 2 semanas). As mudas enraizadas sãotransferidas para solo Metromix e cultivadas até plantas amadurecidas, con-forme descrito na técnica (consultar exemplos). Em uma concretização pre-ferida da invenção, um procedimento melhorado é empregado e rebentosregenerados sobre placas são diretamente transplantados para MetroMix naestufa, omitindo a etapa na caixa de enraizamento e, pelo mesmo, poupandotempo e trabalho.

As plantas resultantes podem ser cultivadas e hibridizadas damaneira costumeira. Duas ou mais gerações devem ser cultivadas para as-segurar que a integração genômica é estável e hereditária. Por exemplo, noestágio de floração, os pendões de plantas transgênicas são cobertos comsacos de papel marrom para evitar a perda de pólen. A polinização é execu-tada nas plantas transgênicas. É melhor que as plantas transgênicas façamautopolinização. Se o espigamento e antese não forem sincronizados, umdoador de pólen do tipo selvagem ou planta recipiente com o mesmo ante-cedente genético da planta To transgênica deve estar à disposição para exe-cução de polinização cruzada. Sementes Ti são colhidas, desidratadas earmazenadas apropriadamente j;om. a identificação adequada no saco desementes. Após a colheita das sementes Ti transgênicas, as plantas To, in-cliundo o solo e vaso devem ser embalados em sacos próprios e submetidosà autoclave (embalagem com sacos duplos). Outras características impor-tantes da invenção incluem a progênie das plantas transgênicas, preparadaspelos métodos expostos, bem como as células derivadas desta progênie eas sementes obtidas desta progênie.

2.6 Geração de Descendentes

Após a transformação, seleção e regeneração de uma plantatransgênica (compreendendo a construção de DNA da invenção), são gera-dos descendentes que, em virtude da atividade do promotor de excisão, sãosubmetidos à excsão e não possuem a(s) sequência(s) marcadora(s) e cas-sete de expressão para a endonuclease.

Descendentes podem ser gerados por propagação sexual ouassexuada. A propagação assexual pode ser realizada pela introdução deembriogênese somática por técnicas bem-conhecidas na técnica. De prefe-rência, os descedentes são gerados por propagação sexual/fertilização. Afertilização pode ser realizada por autofecundação (autopolinização) ou cru-zamento com outras plantas transgênicas ou não-transgênicas. A plantatransgênica da invenção pode funcionar como genitor materno ou paterno.

Após o processo de fertilização, as sementes são colhidas, ger-minadas e cultivadas até plantas amadurecidas. O isolamento e identificaçãode descendentes que passaram pelo processo de excisão podem ser efetu-ados em qualquer estágio de desenvolvimento da planta. Métodos para areferida identificação são bem conhecidos na técnica e podem compreender,por exemplo, análise por PCR, Northern blot, Southern blot investigação defenótipo (por exemplo,-para um-marcador-de seleção negativo).

Os descedentes podem compreender uma ou mais cópias dogene da característica agronomicamente valiosa. De preferência, são isola-dos os descendentes que compreendem somente uma cópia do referido ge-ne da característica.

Também de acordo com a invenção, são as células, culturas decélulas, partes^como, por exemplo, no caso de organismos transgênicos deplantas, raízes, folhas e similares, derivados dos organismos transgênicosdescritos acima, e material de propagação transgênica (como sementes oufrutos).

Plantas geneticamente modificadas de acordo com a invençãoque podem ser consumidas por seres humanos ou animais, podem ser utili-zadas também como alimento ou produto alimentíceo, por exemplo, direta-mente ou seguindo um processamento por si. Nesse ponto, a deleção de,por exemplo, resistências a antibióticos e/ou herbicidas, conforme forem fre-qmentemente introduzidas ao serem geradas as plantas transgênicas, fazsentido por motivos de aceitação dos consumidores, porém, também, pelasegurança do produto.

Um outro objetivo da invenção refere-se ao uso dos organismostransgênicos, descritos acima, de acordo com a invenção, e as células, cul-turas de células, partes como, por exemplo, no caso de organismos transgê-nicos de plantas, raízes, folhas e similares derivados das mesmas, e materi-al de propagação transgênica, como sementes ou frutos, para a produção dealimento ou produtos alimentíceos, farmacêuticos ou produtos químicos refi-nados. Mais uma vez, a deleção de, por exemplo, resistências a antibióticose/ou herbicidas é vantajosa por motivo de aceitação de clientes, porém,também a segurança do produto.

O significado de produtos químicos refinados deverá ser enten-dido como enzimas, vitaminas, aminoácidos, açúcares, ácidos graxos, sabo-res, aromas e colorantes naturais e sintéticos. Especialmente preferida é aprodução de tocoferóis e tocotrienóis, além de carotenoides. A cultura dosorganismos hospedeiros transformados e o isolamento dos organismos hos--pedeirosdo meio de cultura são conduzidos por métodos conhecidos do es-pecialista. Foi feita a descrição da produção de produtos farmacêuticos co-mo, por exemplo, antibióticos ou vacinas (por exemplo, por Hood 1999; Ma 1999).

3. Outras Modificações

3.1. Contra-seleção e Deleção Subseqmente de Marcador

A primeira construção de expressão da enzima que metabolizaD-aminoácidos pode ser, de preferência, construída de maneira a permitir adeleção subseqmente do marcador, especialmente quando a referida enzi-ma é um D-aminoácido oxidase que pode ser empregado tanto em seleçãonegativa como na contra-seleção (por exemplo, como marcador de duplafunção) Estes métodos estão descritos em detalhes em (ADD)1 cujo conteú-do é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência neste pedido.

Para essa finalidade, o primeiro cassete de expressão é, de pre-ferência, flanqueado por seqüências que permitem deleção específica doreferido primerio cassete de expressão. Esta concretização da invenção usaa propriedade da D-amino oxidase (DAAO) de funcionar como marcador dedupla função, ou seja, marcador que não só permite (dependendo do subs-trato utilizado), como marcador de seleção negativa, e marcador de seleçãocontrária. Diferentemente de D-aminoácidos como D-serina e D-alanina (quesão altamente fitotóxicas para plantas e cuja toxicidade é anulada pela D-aminoácido oxidase), D-valina e D-isoleucina não são tóxicas para plantasdo tipo selvagem, porém, são convertidas em compostos tóxicos por plantasque expressam a D-aminoácido oxidase, DAAO. Os achados de que a ex-pressão da DAAO atenua a toxicidade da D-serina e D-alanina, porém, induzalterações metabólicas que tornam D-isoleucina e D-valina tóxicas, demons-tram que a enzima fornecer um marcador selecionável, de função dupla edepedente de substrato em plantas.

Desse modo, outra concretização da invenção refere-se a ummétodo de produção de uma planta transgenica Zea mays, compreendendoi) a transformação de células da planta Zea mays com um primeiro cons-truto de DNA compreendendo

a) pelo menos um primeiro construto de expressão, compreendendoum promotor de ubiquitina e, ligada ao mesmo de modo que per-mite operação, uma seqüência de ácido nucleico que codifica umaenzima do tipo D-aminoácido oxidase, em que o primeiro cassetede expressão é ladeado por seqüências que permitem a deleçãoespecífica do referido primeiro cassete de expressão, e

b) pelo menos um segundo cassete de expressão, adequado paraconferir à referida planta uma característica agronomicamente va-liosa, em que o referido segundo cassete de expressão não estálocalizado entre as referidas seqüências que permitem a deleçãoespecífica do referido primeiro cassete de expressão, eii) o tratamento das referidas células transformadas da planta Zea maysda etapa i) com um primeiro composto selecionado do grupo constituí-do por D-alanina, D-serina ou derivados destes, em uma concentraçãofitotóxica, e a seleção de células da planta compreendendo em seusgenomas a referida primeira construção de DNA, conferindo resistênciaàquelas referidas células transformadas da planta contra o referidoprimeiro composto pela expressão da referida D-aminoácido oxidase, e

iii) indução da deleção do referido primeiro cassete de expressão do ge-noma das referidas células transformadas da planta, e o tratamentodas referidas células da planta com um segundo composto, seleciona-do do grupo constituído por D-isoleucina, D-valina e derivados destes,em uma concentração tóxica para as células da planta, compreenden-do ainda o referido primeiro cassete de expressão, e dessa forma, aseleção de células da planta compreendendo o referido segundo cas-sete de expressão, porém desprovido do referido primeiro cassete deexpressão.

Promotores preferidos de ubiquitina e seqüências preferidas deD-aminoácido oxidase são descritos acima.

De preferêcia, a deleção do primeiro cassete de expressão podeser realizada por vários meios conhecidos na técnica, incluindo, entre outros,um ou mais dos seguintes métodos:

a) recombinação induzida por recombinase específica da se-qüência, em que o referido primeiro cassete de expressão é flanqueado porsítios de recombinação correspondentes, de maneira que a recombinaçãoentre os referidos sítios de recombinação flanqueadores resulta em deleçãodas seqüências entre elas do genoma,

b) Recombinação homóloga entre seqüências de homologia A eA1 que flanqueiam o referido primeiro cassete de expressão, de preferênciainduzida por rompimento de fita dupla específica da seqüência, entre as se-quências homologas, causado por uma endonuclease de seqüência especí-fica, em que as referidas seqüências de homologia AeA' possuem compri-mento e homologia suficientes para assegurar recombinação homóloga en-tre A and A', e tendo uma orientação que - na recombinação entre AeA'-levará à excisão do referido primeiro cassete de expressão do genoma dareferida planta.

Há vários meios disponíveis para o versado na técnica combinaro mecanismo que induz a deleção /excisão com a construção do DNA dainvenção que compreende o marcador de seleção de função dupla, a D-aminoácido oxidase. De preferência, uma recombinase ou endonuclease,que podem ser empregadas no método da invenção, podem ser expressaspor um método selecionado do grupo constituído por:

a) incorporação de um segundo cassete de expressão para ex-pressão da recombinase ou endonuclease específica da seqüência, ligadaoperacionalmente a um promotor da planta, na referida construção do DNA,de preferência, junto com o referido primeiro cassete de expressão flanque-ado pelas referidas seqüências que permitir a deleção específica,

b) incorporação de um segundo cassete de expressão para ex-pressão da recombinase ou endonuclease específica da seqüência, ligadaoperacionalmente a um promotor da planta, nas células da planta ou plantas,utilizadas como material-alvo para a transformação e, pelo mesmo, gerandolinhagens máster de células ou células,

c) incorporação de um segundo cassete de expressão para aexpressão da recombinase ou endonuclease específica da seqüência, ligadaoperacionalmente a um promotor da planta, em um construto de DNA sepa-rada, que é transformada por cotransformação com a referida primeira cons-trução de DNA nas referidas células da planta,

d) incorporação de um segundo cassete de expressão para ex-pressão da recombinase ou endonuclease específica da seqüência, opera-cionalmente ligada a um promotor da planta, nas células da planta ou plan-tas que são subseqüentemente- cruzadas com plantas compreendendo aconstrução de DNA da invenção.

Em outra concretização preferida, o mecanismo de dele-ção/excisão pode ser induzido ou ativado de maneira a prevenir uma dele-ção/excisão prematura do marcador de dupla função. De preferêcia, estaexpressão e/ou atividade de uma recombinase ou endonuclease específicada seqüência, preferencialmente empregada, pode ser induzida e/ou ativadapor um método selecionado do grupo constituído por

a) expressão induzível pela ligação operacional da seqüênciaque codifica a referida recombinase ou endonuclease a um promotor induzível,

b) ativação induzível, pelo emprego de uma recombinase ou en-donuclease modificada, compreendendo um domínio ligante-de ligação, emque a atividade da referida recombinase ou endonuclease modificada podeser modificada por tratamento de um composto com atividade de ligaçãopara o referido domínio ligante-de ligação.

Preferencialmente, assim, o método da invenção resulta em umacélula de planta ou planta cuja seleção é livre de marcador.

Outro objetivo da invenção refere-se a construções de DNA quesão adequadas para o emprego no método da invenção. Um construto deDNA adequada para ser utilizada na presente invenção compreende, de pre-ferência

a) um primeiro construto de expressão, compreendendo umaseqüência de ácido nucleico que codifica uma D-aminoácido oxidase, ligadade modo que permite operação a um promotor de ubiquitina, em que o refe-rido primeiro cassete de expressão é flanqueado por seqüências que permi-tem a deleção específica do referido primeiro cassete de expressão, e

b) pelo menos um segundo cassete de expressão, adequadopara conferir à referida planta uma característica agronomicamente valiosa,em que o referido segundo cassete de expressão não está localizado entreas referidas seqüências que permitem a deleção específica do referido pri-meiro cassete de expressão.

- Promotores-^referidos-de ubiquitina e seqüências preferidas deD-aminoácido oxidase são descritos acima.

Para assegurar a deleção/exclusão do marcador, o cassete deexpressão para a D-aminoácido oxidase (a primeira construção de expres-são) compreendido na construção de DNA da invenção é flanqueado porsítios de recombinação para uma recombinase de seqüência específica demaneira que a recombinação induzida entre os referidos sítios de recombi-nação flanqueadores resulta em deleção do referido primerio cassete de ex-pressão do genoma. De preferência, as referidas seqüências que permitemdeleção específica do referido primeiro cassete de expressão são seleciona-das do grupo de seqüências constituídas por

a) sítios de recombinação para uma recombinase específica dasseqüências, arranjados de forma que a recombinação entre os referidos sí-tios de recombinação flanqueadores resulta em deleção das seqüências nomeio do genoma, e

b) seqüências homólogas A e A1 com comprimento e homologiasuficiente para assegurar uma recombinação homóloga entre A e A', e comuma orientação que - na recombinação entre AeA'- resultará em deleçãodas seqüências no meio do genoma.

De preferência, o construto compreende pelo menos um sítio dereconhecimento para uma seqüência específica de nuclease, localizado en-tre as referidas seqüências, permitindo deleção específica do referido primei-ro cassete de expressão (especialmente para a variante b acima).

Há vários sítios de recombinação e recombinases específicas deseqüência conhecidos na técnica que podem ser empregados para o propó-sito da invenção. O versado na técnica está familiarizado com uma varieda-de de sistemas para a remoção orientada para o sítio de seqüências de áci-dos nucleicos introduzidas por recombinação. Eles têm como base as re-combinases utilizadas específicas da seqüência. Diversos sistemas de re-combinação, específicos de seqüências, são descritos, como o sistemaCre/lox do bacteriófago P1 (Dale1991; Russell 1992; Osborne 1995), o sis-tema FLP/FRT de levedura (Kilby 1995; Lyznik 1996), a recombinase Gin dofago Mu, a recombinase Pin do E. coli ou o sistema R/RS do plasmídeopSR1 (Onouchi 1995; Sugita 2000). Além disso, um sistema baseado emsítios attP e recombinase do bacteriófago Lambda pode ser empregado(Zubko 2000). Outros métodos adequados para recombinação com os méto-dos descritos no presente são descritos nas patentes WO 97/037012 e WO02/10415.

Em uma concretização preferida, a deleção/excisão da seqüên-cia do marcador duplo é deletada por recombinação homóloga, induzida poruma quebra de dupla fita específica de uma seqüência. Os princípios bási-cos são expostos na patente WO 03/004659, aqui incorporada por referêncianeste pedido. Para esta finalidade, a primeira construção de expressão (quecodifica o marcador de função dupla) é flanqueada por seqüências homólo-gas A e A', em que as referidas seqüências homólogas possuem compri-mento e homologia suficiente para assegurar recombinação homóloga entreA e A', e com uma orientação que - na recombinação entre AeA'- levará àexcisão do primeiro cassete de expressão do genoma. Ademais, a seqüên-cia flanqueada pelas referidas seqüências homólogas compreende ainda,pelo menos, uma seqüência de reconhecimento de pelo menos 10 pares debase com orientação para indução de quebras em sítios do DNA de fita du-pia por uma enzima que induz quebras de DNA de fita dupla específicas daseqüência, preferencialmente, uma DNA endonuclease, específica da se-qüência, mais preferencialmente uma "homing" endonuclease e o mais pre-ferível uma endonuclease selecionada do grupo constituído por I-Scel1 I-Ceul, l-Cpal, l-Cpall, I-Crel e I-Chul ou quimeras dos mesmos com domíniosde ligante-de ligação.

O cassete de expressão para a endonuclease ou recombinase(compreendendo uma recombinase ou endonuclease, específicas de se-qüência, ligada de modo a permitir operação a um promotor da planta) podeser incluído na construção de DNA da invenção. De preferência, o referidosegundo cassete de expressão é, junto com o referido primeiro cassete deexpressão, flanqueado pelas referidas seqüências que permitem deleçãoespecífica.

Em outra concretização, a expressão e/ou atividade da referidarecombinase ou endonuclease específica da seqüência pode ser induzidae/ou ativada para evitar a deleção/excisão prematura do marcador de duplafunção durante um perído em que sua ação como marcador de seleção ne-gativa ainda é necessária. De preferência, a indução/ativação pode ser reali-zada por um método selecionado do grupo constituído por

Outras concretizações da invenção referem-se a vetores trans-gênicos compreendendo um construto de DNA da invenção. Células trans-gênicas ou organismos não-humanos compreendem um construto de DNAou vetor da invenção. De preferência, as referidas células ou organismosnão-humanos são células de plantas ou plantas, preferencialmente plantasde uso agrícola.

A presente invenção possibilita a geração de células transgêni-cas e organismos sem marcadores, de preferência plantas, uma maneiraprecisamente previsível com alta eficiência.

As preferências para a etapa (ii) de contra-seleção, no que con-cerne a escolha de composto, concentração, modo de aplicação para D-alanina, D-serina ou derivados destes são descritas acima no contexto doesquema geral de seleção.

Para a etapa (iii) da contra-seleção, o composto é selecionadodo grupo de compostos compreendendo uma estrutura de D-isoleucina ouD-valina. Mais preferencialmente, o composto é selecionado do grupo consti-tuído por D-isoleucina e D-valina. O mais preferível é que o composto oucomposição utilizada para contra-seleção compreenda D-isoleucina.

Quando aplicada por intermédio do meio de cultura celular (porexemplo, incorporada às placas do meio MS de ágar solidificado), a D-isoleucina pode ser empregada em concentrações de aproximadamente 0,1mM a aproximadamente 100 mM, preferencialmente de aproximadamente 1mM a aproximadamente 50 mM, mais preferencialmente de aproximadamen-te 10 mM a aproximadamente 30 mM. Quando aplicada por intermédio domeio de cultura celular (por exemplo, incorporada às placas do meio MS deágar solidificado), a D-valina pode ser empregada em concentrações de a-proximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM, preferencialmente deaproximadamente 5 mM a aproximadamente 50 mM, mais preferencialmentede aproximadamente 15 mM a aproximadamente 30 mM.

Dessa forma, o uso do método descrito acima torna possívelcriar uma planta Zea mays livre de marcadores. Os termos "livre de marca-dores" ou "seleção livre de marcadores", conforme utilizados no presente,pretendem significar uma célula ou organismo que não é capaz de expressaruma proteína de seleção funcional (codificada pelo cassete de expressão b,conforme definido acima) que foi inserida na referida célula ou organismo,em combinação com o gene que codifica a característica agronomicamentevaliosa. A seqüência que codifica a referida proteína marcadora de seleçãopode estar ausente em parte ou, de preferência, inteiramente. Ademais, opromotor operacionalmente ligado à mesma pode ser disfuncional pela au-sência parcial ou completa. A planta resultante pode, contudo, compreenderoutras seqüências que podem funcionar como um marcador de seleção. Porexemplo, a planta pode compreender, como característica agronomicamentevaliosa, um gene que confere resistência à herbicida. No entanto, o maispreferido é que a planta resultante não compreenda qualquer marcador deseleção.

Várias outras características e concretizações da presente in-venção tornar-se-ão evidentes para versados na técnica em vista da presen-te exposição. Todos os documentos mencionados nesta especificação sãoaqui incorporados, em sua totalidade, por referência neste pedido. Certascaracterísticas e concretizações da invenção serão ilustradas a seguir, a títu-lo de exemplo e fazendo referência à figura descrita abaixo.

3.2 Empilhamento de Genes

- Os métodos e composições da invenção permitem transforma-ção subseqmente. As enzimas que metabolizam D-serina e/ou D-alanina sãocompatíveis e não interferem com outros marcadores de seleção e sistemasde seleção. É, portanto, possível transformar plantas transgênicas existen-tes, compreendendo outro marcador de seleção, com as construções da in-venção ou transformar subseqmentemente as plantas obtidas pelo métododa invenção (e compreendendo os construtos de expressão para a enzimaque metaboliza D-serina e/ou D-alanina) com outro marcador. Este, umaoutra concretização da invenção, refere-se a um método para transformaçãosubseqmente de pelo menos dois construtos de DNA em uma planta Zeamays, compreendendo as etapas de:

a) transformação com um primeiro construto, o referido constru-to, pelo menos, um construto de expressão, compreendendo um promotorde ubiquitina e, ligada ao mesmo de modo que permite operação, uma se-qüência de aminoácidos que codifica uma enzima capaz de metabolizar D-alanina e/ou D-serina,e

b) transformação com um segundo construto, em que o referidoconstruto compreende um segundo gene marcador de seleção que não con-fere resistência contra D-alanina ou D-serina.

De preferência, o referido segundo gene de marcação é ummarcador de seleção negativa, conferindo resistência a compostos biocidascomo inibidores metabólicos (não D-aminoácido) (por exemplo, 2-desoxiglicose-6-fosfato, WO 98/45456), antibióticos (por exemplo, canamici-na, G 418, bleomicina ou higromicina) ou herbicidas (por exemplo, fosfinotri-eina ou glifosato). São exemplos:

- Fosfinotricina acetiltransferases (PAT; também denominadoBialophos® resistance; bar; de Block 1987; Vasil 1992, 1993; Weeks 1993;Becker 1994; Nehra 1994; Wan & Lemaux 1994; EP 0 333 033; US 4 975 374)

- 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS), conferindoresistência a Glyphosate® (N-(fosfonometil)glicina) (Shah 1986; Della-Cioppa 1987)

- enzimas que degradam Glyphosate® (Glyphosate® oxidorredu-tase; gox),

- Dehalogenases (deh) que inativam Dalapon®- acetolactato sintases que inativam a sulfonil uréia e/ou imidazo-Iinona (ahas ou ALS; por exemplo, ahas mutado/variantes de ALS com, porexemplo, a mutação S4, Xl 12, XA17 e/ou Hra).

- Nitrilases que degram Bromoxynil® (bxn)

- Genes de resistência à canamicina ou geneticina (G418) (NP-TH; NPTI) que codificam para, por exemplo, neomicina fosfonotransferases(Fraley 1983; Nehra 1994)

- higromicina fosfotransferase (HPT) que faz a mediação da re-sistência à higromicina (Vanden Elzen 1985).

- dihidrofolato redutase (Eichholtz 1987)

Diversos esquemas de tempo podem ser empregados para osdiversos genes de marcadores de seleção. Em caso de genes de resistência(por exemplo, contra herbicidas), a seleção é empregada, de preferência,durante toda a fase de indução de calo, por aproximadamente 4 semanas epor mais de, pelo menos, 4 semanas de regeneração. Este esquema de se-leção pode ser aplicado para todos os regimes de seleção. É possível ainda(embora não explicitamente preferido) manter a seleção também durantetodo o esquema de regeneração, incluindo o enraizamento. Por exemplo,com o gene de resistência à fosfinotricina (bar), como o marcador seletivo,fosfinotricina em uma concentração de aproximadamente 1 a 50 mg/l podeser incluída no meio. Por exemplo, com os genes mutados ahas, como omarcador seletivo, PURSUIT® em uma concentração de aproximadamente100 a aproximadamente 1500 nM pode ser incluído no meio. Concentraçõestípicas para seleção são de aproximadamente 500 a aproximadamente 1000 nM.

Em uma concretização preferida da invenção, o marcador deseleçã negativa é um gene ahas, conferindo resistência contra herbicidas dotipo sulfonil uréia e/ouJmidazolinona. O referido gene ahas pode ser o genemutante Xl 12 ahas 2. Linhagens de milho do mutante Xl 12 com o gene mu-tado ahas2 demonstram ser altamente resistente a imazetapir (PURSUIT®),porém sensíveis a imazaquina (SCEPTER®) e susceptíveis a herbicidas desulfonil uréia. O gene Xl 12 ahas2 isolado da linhagem mutante do milho a-copiado com a seleção baseada em herbicida contendo imidazolinona foiutilizado com sucesso na técnica de transformação de milho, arroz e trigo(US 6 653 529). A seleção para construções compreendendo o marcador deseleção o gene ahas mutante XI12 pode ser conduzida, por exemplo, comPURSUlT®. Outro gene ahas adequado é o gene ahas mutante XA17. Mu-tantes XA17 de milho demonstram ser altamente resistentes tanto contra aimazetapir como a imazaquina (SCEPTER®) e ligeiramente tolerante a her-bicidas contendo sulfonil uréia. Como gene XA17 do milho confere tolerânciadiferenciada para compostos diferentes da imidazolinona e herbicidas desulfonil uréia, ele pode ser utilizado na transformação de plantas como ummarcador de seleção com a escolha do uso de imazetapir, imazaquina ousulfonil uréia como o reagente da seleção. O gene ahas mutado XA17 e seupromotor podem ser isolados da linhagem de mutantes XA17. A seqüênciafoi isolada e o gene caracterizado (Bemnasconi 1995). O mutante XA17 e oseu fenótipo foram descritos (US 4 761 373; US 5 304 732; Anderson & Gre-geson 1989; Currie 1995; Newhouse 1991). A seleção pode ser conduzidacom o herbicida SCEPTER® ou com compostos de sulfonil uréia para sele-ção. Consequentemente, a combinação dos vários mutantes ahas permiteum empilhamento eficiente de genes, fornecendo um mecanismo para trans-formação dupla.

De preferência, o referido segundo marcador confere resistênciacontra, pelo menos, um composto selecionado do grupo constituído por fos-finotricina, glifosato e herbicidas do tipo sulfonil uréia e imidazolinona. Maispreferencialmente, o referido segundo gene marcador é um gene ahas deresistência e o mais preferível é que confira resistência contra um compostoselecionado do grupo de genes ahas mutantes XM 2 e XA17.

Outra concretização da invenção refere-se a uma planta de mi-lho, compreendendo

a) um primeiro construto de expressão, compreendendo umpromotor de ubiquitina e, ligada a este de modo a permitir operação, umaseqüência de aminoácidos que codifica uma enzima capaz de metabolizarD-alanina e/ou D-serina, eb) um segundo construto de expressão para um gene marcadorde seleção que não confere resistência contra D-alanina ou D-serina.

De preferência, o referido segundo gene marcador é definidoconforme acima e o mais preferível é que confira resistência contra, pelomenos, um composto selecionado do grupo constituído por fosfinotricina,glifosato e herbicidas do tipo sulfonil uréia e imidazolinona.

As combinações a seguir são as especialmente preferidas:

1) Uma primeira transformação com um gene ahas marcador deseleção, seguida por uma segunda transformação com um gene marcadorde seleções dsdA;

2) Uma primeira transformação com um gene ahas marcador deseleção, seguida por uma segunda transformação com um gene marcadorde seleções daol;

3) Uma primeira transformação com um gene dsdA marcador deseleção, seguida por uma segunda transformação com um gene marcadorde seleções ahas;

4) Uma primeira transformação com um gene daol marcador deseleção, seguida por uma segunda transformação com um gene marcadorde seleções ahas;

Além do empilhamento com um segundo construto de expressãopara um gene marcador de seleção, a qual não confira resistência contra D-alanina ou D-serina, os genes dsdA e daol podem ser empilhados também.Por exemplo, pode ser efetuada uma primeira seleção utilizando o gene ds-dA gene e D-serina, como agente de seleção, e uma segunda seleção podeser efetuada subseqmentemente utilizando o gene daol e D-alanina, comoagente de seleção. Dessa forma, outra concretização da invenção refere-sea um método para transformação subsequente de pelo menos dois constru-tos de DNAjem_uma.planta Zea mays, compreendendo as etapas de

a) transformação com um primeiro construto, o referido construtocompreendendo um construto de expressão, compreendendo um promotorda planta e, ligada ao mesmo de modo a permitir operação, uma seqüênciade ácidos nucleicos que codifica uma enzima do tipo dsdA, e a seleção comD-serina, e

a) transformação com um segundo construto, o referido constru-to compreendendo um construto de expressão, compreendendo um promo-tor da planta (preferencialmente um promotor de ubiquitina, conforme defini-do acima) e, ligada a este de modo a permitir operação, uma seqüência deácidos nucleicos que codifica uma enzima do tipo dao, e seleção com D-alanina.

Seqüências

1. SEQ ID NO:1 - Seqmência de ácido nucleico que codifica ogene de D-serina desidratase de E. coli (dsdA).

2. SEQ ID NO:2 - Seqmência de aminoácidos que codifica a D-serina desidratase de E. coli (dsdA).

3. SEQ ID NO:3 - Seqmência de ácidos nucleicos que codifica ogene de D-aminoácido oxidase de Rhodosporidium toruloides

4. SEQ ID NO:4 - Seqmência de aminoácidos que codifica a D-aminoácido oxidase de Rhodosporidium toruloides

5. SEQ ID NO:5 - Seqmência de ácidos nucleicos que codifica aregião do promotor central de ubiquitina de Zea mays

6. SEQ ID NO:6 - Seqmência de ácidos nucleicos que codifica opromotor de ubiquitina de Zea mays, compreendendo ainda a região 5' não-traduzida e o primeiro íntron

7. SEQ ID NO:7 - Seqmência de ácidos nucleicos que codifica opromotor central de 275 bp do vírus baciloforme da cana de açúcar

8. SEQ ID NO:8 - Seqmência de ácidos nucleicos que codifica opromotor do vírus baciloforme da cana de açúcar

9. SEQ ID NO:9 - Seqmência de ácidos nucleicos que codifica aregião T-DNA do construto RLM175

10. SEQ ID N0:10 - Seqmência de ácidos nucleicos que codi-fica a região T-DNA do construto RLM151

11. SEQ ID NO:11 - Seqmência de aminoácidos que codifica aD-serina desidratase de E. coli (dsdA).

12. SEQ ID NO: 12 - Seqmência de ácidos nucleicos que codificaa região T-DNA do construto RLM255

13. SEQ ID NO: 13 - Seqmência de aminoácidos que codificaD-aminoácido oxidase de Rhodosporidium toruloides

14. SEQ ID NO:14 - Seqmência de ácidos nucleicos que codificaa região T-DNA do construto RLM220

15. SEQ ID NO: 15 - Seqmência de ácidos nucleicos que codificaa região T-DNA do construto RLM242

16. SEQ ID NO: 16 - Seqmência de aminoácidos que codifica aD-aminoácido oxidase de Rhodosporidium toruloides

17. SEQ ID NO: 17 - Seqmência de ácidos nucleicos que codificaa região T-DNA do construto RLM241

18. SEQ ID NO: 18 - Seqmência de aminoácidos que codificaD-aminoácido oxidase de Rhodosporidium toruloides

19. SEQ ID NO: 19 - Seqmência de ácidos nucleicos que codificaa região T-DNA do construto RLM240

20. SEQ ID N0:20 - Seqmência de aminoácidos que codifica aD-serina desidratase de E. coli (dsdA).

21. SEQ ID NO:21 - Seqmência de ácidos nucleicos que codificaa região T-DNA do construto RLM239

22. SEQ ID NO:22 - Seqmência de aminoácidos que codifica aD-serina desidratase de E. coli (dsdA).

Depósito sob o-Tratado de Budapeste

Esta invenção faz referência a um depósito efetuado sob o Tra-tado de Budapeste, em relação ao pedido de patente US Provisional N060/693 321, depositado em 23.06.2005, aqui incorporado por referência,neste pedido de patente, para o seguinte material:

1. Semente de linhagem BPS553 de Zea mays\ Designação deDepósito de Patente PTA-6170.

2. Semente de linhagem BPS631 de Zea mays\ Designação deDepósito de Patente PTA-6171.

O depósito foi efetuado junto à coleção American Type CultureCollection (ATCC), Manassas, VA 20110-2209 EUA, em 26 de agosto de2004.

Exemplos

Métodos Gerais:

Salvo se indicado de outra forma, os produtos químicos e rea-gentes nos Exemplos foram obtidos da Sigma Chemical Company (St. Louis1MO). Os materiais para meio de cultura de células foram obtidos da Gib-co/BRL (Gaithersburg, MD) ou DIFCO (Detroit, Ml). As etapas de clonagemforam conduzidas para as finalidades da presente invenção, como, por e-xemplo, a transformação de células de E. coli, proliferação de bactérias, mul-tiplicação de fagos e análises de seqüência de DNA recombinante foramconduzidos conforme descritas por Sambrook (1989). Os exemplos a seguirsão apresentados a título de ilustração e não de restrição.Receitas de Meios:

A-1. Meio YP de milho (para crescimento de Agrobacterium)

<table>table see original document page 99</column></row><table>

Ajustar pH para 6,8 com NaOH a 1 M. Para meio sólido, acres-centar 3 g de ágar (EM Science) por frasco de 250 ml. Transferir uma alíquo-ta de 100 ml do meio para cadã"frasco de 250 ml, levar à autoclave, deixarresfriar e solidificar em frascos. Para preparo em placas, o meio no frasco éderretido em forno de micro-ondas e o frasco é colocado em banho-maria eresfriado até 55°C. Quando resfriado, acrescentar espectinomicina (SigmaS-4014) até uma concentração final de 50 ml/l, misturar bastante e despejarsobre as placas.

A-2. Meio LS-inf de Milho

<table>table see original document page 99</column></row><table><table>table see original document page 100</column></row><table>

Ajustar pH para 5,2 com HCI a 1 M1 filtrar esterilizado, dispensarem alíquotas de 100 ml, acrescentar acetosiringona (100 μΜ) ao meio, ime-diatamente antes de usar para infecção por Agrobacterium (50 μΙ até 100 mldo meio - estoque em 200 mM).

A-3. Meio 1.5LSAs de milho (para cocultivo)

<table>table see original document page 100</column></row><table><table>table see original document page 101</column></row><table>

Ajustar o pH do meio para 5,8 com NaOh a 1 M, pesar 4 g deAgar Purificado da Sigma por frasco (8g/l) e dispensar 500 ml de meio porfrasco, submeter à autoclave. Quando resfriado, acrescentar:

<table>table see original document page 101</column></row><table>

*opcional para genótipos BPS553x(HillAxA188).

Despejar o meio resultante em placas de Petri de 100 χ 20 mm(o meio contendo acetoseringona deve ser utilizado fresco, sem ter sido ar-mazenado por tempo prolongado).

A-4. Meio de recuperação de milho -1 : Meio IM

<table>table see original document page 101</column></row><table>

Medir aproximadamente % do volume total de ddH20 desejado,acrescentar sacarose e sais, agitar até dissolver. Depois que todos os ingre-dientes estiverem dissolvidos, completar até o volume final e ajustar o pHpara 5,8, utilizando KOH a 1M. Transferir uma alíquota de 500 ml/l para umfrasco, adicionar 0,9 g de gelrite em cada frasco do líquido e identificar apro-priadamente com rótulos. Submeter à autoclave por 20 minutos em ciclo Ii-quido. Depois de concluída a autoclave, colocar os frascos em banho-mariapara resfriar até 55°C e acrescentar os seguintes componentes.<table>table see original document page 102</column></row><table>

Despejar o meio resultante em placas de Petri de 100 X 20 mm,sob capela de fluxo laminar, e deixar que o meio permaneça na capela du-rante a noite para prevenir excesso de condensação.

A-6. Meio de Seleção

<table>table see original document page 102</column></row><table>

Ajustar pH para 5,8 com NaOH a 1 M. Acrescentar Agar Purifi-cado Sigma (8g/l), dispensar 500 ml do meio por frasco de 1 litro, submeter àautoclave, quando resfriado, acrescentar:

<table>table see original document page 102</column></row><table><table>table see original document page 103</column></row><table>

A-7. Meio de Regeneração de Milho

<table>table see original document page 103</column></row><table><table>table see original document page 104</column></row><table>

Ajustar pH para 5,8 com NaOH a 1 M. Pesar 4 g de Agar Purifi-cado da Sigma por frasco (8g/l). Dispensar 500 ml de meio por frasco, sub-meter à autoclave e deixar solidificar em frascos. Para uso, levar ao aparelhode microondas até derreter o meio, quando resfriado, acrescentar:

<table>table see original document page 104</column></row><table>

Despejar em placas de Petri de 100 χ 20 mmA-8. Meio de enraizamento de milho (enraizamento)

<table>table see original document page 104</column></row><table><table>table see original document page 105</column></row><table>

Ajustar pH do meio para pH 5,8 com NaOH a 1 M1 acrescentar 1g de Geirite por frasco (2g/l), dispensar 500 ml do meio por frasco, submeterà autoclave, despejar em Phyatrays descartáveis.

<table>table see original document page 105</column></row><table>

A-9. Solução de estoque de D-serina (1 M): D-serina a 1 M (armazenar emtemperatura ambiente)A-10. Solução de estoque de D-alanina (1 M): D-alanina a 1 M (armazenarem temperatura ambiente)

A-11. Estoque de acetosiringona (200 mM em DMSO), armazenar a - 20°C.

2. Sumário do Protocolo

Este protocolo serve para linhagens híbridas e linhagens natu-rais.

Tabela 2: Sumário do Protocolo de Transformação

<table>table see original document page 106</column></row><table><table>table see original document page 107</column></row><table>

Exemplo 1: Protocolo Básico de Transformação

1.1 Preparo de Plantas Doadoras de Híbridos

O método das invenções opera igualmente para linhagens natu-rais e híbridas e variedades de vários genótipos de Zea mays. Foram em-pregadas as seguintes linhagens naturais de Zea mays para as seguintesetapas:

1. HillA: GenitorA de Hill; depósito n°:T0940A, Maize Geneticsand Genomics Database1 fornecido pela Maize Genetics Cooperation - StockCenter USDA/ARS & Crop Sci/UIUC, S-123 Turner Hall1 1102 S. GoodwinAvenue1 Urbana IL USA 61801-4798; http://www.maizegdb.org/stock.php.

2. A188: Agronomy & Plant Genetics, 411 Borlaug Hall1 Univ ofMinnesota, Saint Paul MN 55108.

3. BPS533 (Designação de Depósito de Patente da ATCC PTA-6170)

4. BPS631 (Designação de Depósito de Patente da ATCC PTA-6171)

Sementes de milho F1 de genótipo HiIIAxAI88 são produzidaspelo cruzamento de HiIIA (genitor feminino) com a linhagem natural A188(genitor masculino), e plantadas na estufa, como doadoras de pólen. Semen-tes F2 de (HillAxA188) são produzidas por autopolinização de plantas F1(HillAxA188), na estufa ou no campo, e plantadas na estufa como doadorasde pólen. Embriões imaturos híbridos de BPS553x(HillAxA188) ouBPS631 x(HillAxA188) são produzidos na estufa, utilizando a linhagem natu-ral BPS553 (Designação de Depósito de Patente da ATCC PTA-6170) ouBPS631 (Designação de Depósito de Patente da ATCC PTA-6171), comogenitor feminino, e as plantas F1 ou F2 (HillAxA188), como genitor masculino.

Duas sementes são semeadas em vasos contendo Metromix.

Quando as sementes germinam e criam raízes, uma muda/vaso é mantidapara produção de embriões imaturos e a segunda muda é descartada; Alter-nativamente, as sementes são inicialmente colocadas em vasos de 10,16 χ10,16 cm (4x4 polegadas) e as mudas, transplantads para vasos de 25,4 cm(10 polegadas), duas semanas depois da semeadura das sementes. Apro-ximadamente uma colher de sopa de Osmocote 14-14-14 (um tipo de fertili-zante de liberação prolongada) é acrescentada à superfície de cada vaso. Atemperatura na estufa é mantida a 24°C, durante a noite, e 28°C durante odia. A irrigação é efetuada automaticamente, porém, complementada manu-almente todos os dias, conforme necessário. As plantas são regadas duasvezes por semana com um fertilizante de Peters 20-20-20 em uma diluiçãode 1:15. É efetuado controle de rotina contra insetos e doença.

1.1.1 Preparo de Plantas Doadoras de Linhagem Natural

Sementes das linhagens naturais BPS553 ou BPS631 são se-meadas diretamente em vasos de 10,16 cm (4 polegadas) e as mudas,transplantadas para vasos de 25,4 cm (10 polegadas), duas semanas após asemeadura. Alternativamente, as sementes são semeadas em vasos de 25,4cm (10 polegadas). É conduzida a autopolinização ou a polinização de mu-das. As condições de crescimento são as mesmas, conforme acima para alinhagem híbrida.

1.1.2 Polinização Manual

Toda planta de milho é monitorada para detecção da parte aéreade espigas e, quando esta surge, elas são cobertas com um saco brancopequeno para parte aérea de espiga (Lawson). Quando as partes aéreas daespiga começaram a produzir pendões, estes foram cortados e as espigasforam recobertas com o saco de parte aérea de espiga. O pendão da mesmaplanta é envolvido em um saco de papel marrom (desde que o pendão tenhainiciado a antese). Na manhã seguinte, o pendão é balançado para removero pólen e anteras para dentro do saco. O saco é removido, em seguida, e opólen espalhado sobre os pendões da parte aérea da espiga. A polinizaçãoé efetuada entre 8 e 10 horas da manhã. Prender o saco de papel marromsobre a parte aérea da espiga e em torno do tronco do milho. Após a polini-zação, o pendão é removido da planta para reduzir a quantidade de pólen(alérgenos para muitas pessoas) na estufa.

A fim de assegurar polinizações sincronizadas para os mesmosgenótipos e, dessa forma, evitar colheitas/transformação durante o final desemana, as partes aéreas de espigas das plantas que floresceram primeirosão cortadas de novo. Um grupo de plantas, por exemplo, > 5 a 10 plantassão, então, polinizadas no mesmo dia. Por exemplo, se a data programadada transformação for 19 de agosto de 2002, a data ideal de polinização é,portanto, em torno de 09 a 10 de agosto de 2002. As partes aéreas da espi-ga que estiverem prontas antes de 09 de agosto de 2002 (por exemplo, 07ou 08 de agosto) devem ser cortadas novamente. Esta prática, no entanto,depende da qualidade/quantidade de polens sobre uma planta. A polinizaçãode mudas é necessária para linhagens naturais. Por exemplo, BPS553 ouBPS631 podem se autopolinizar ou mudas do mesmo genótipo podem serpolinizadas.

1.1.3 Colheita e Pré-tratamento de Espigas

As espigas de plantas de milho (a primeira espiga que aparece éa melhor) são colhidas de 8 a 14 dias (em dia 10) após a polinização (DAP).

O momento exato da colheita varia dependendo das condições de cresci-mento e variedade de milho. O tamanho de embriões imaturos é um bomindicativo de seu estágio de desenvolvimento. O comprimento ideal de em-briões imaturos para transformação é de aproximadamente 1 a 1,5 mm, in-cluindo o comprimento do escutelo. O embrião deve ser translúcido, não o-paco. Embriões imaturos com tamanho maior do que 2,0 mm não devem serutilizados de preferência nos genótipos HilI. Se a espiga estiver pronta, masnão puder ser utilizada para transformação naquele dia, ela pode ser colhi-da, colocada no saco de polinização e armazenada em um saco plástico emum refrigerador a 4°C por 1 a 3 dias.)

1.2 Preparo de Aarobacterium

O estoque de glicerol Agrobacterium é armazenado a -80°C.Inoculados de Agrobacterium^ são retirados dos estoques de glicerol e ali-nhados em meio YP de Agar (A-1), contendo antibióticos apropriados (porexemplo, espectinomicina a 50 mg/l e/ou tetraciclina a 10 mg/l). As culturasde bactérias são incubadas no escuro a 28°C por 1 a 3 dias, ou até que co-lônias isoladas sejam visíveis (normalmente, são precisos 2 dias para queocorra crescimento de agro culturas quando retiradas diretamente do refrige-rador a -80°C). A placa obtida pode ser armazenada a 4°C por 1 mês e utili-zada como placa máster para criação de estrias bacterianas em células fres-cas. As células frescas, provenientes de uma única colônia na placa máster,devem ser semeadas em linha no Agar YP junto com o antibiótico apropria-do com pelo menos dois dias de antecedência da transformação. Estas cul-turas bacterianas podem ser incubadas no escuro a 28°C por 1 a 3 dias.

Alternativamente, pode ser preparado estoque de Agrobacteriumcongelado: Semear em linha as células de Agrobacterium, obtidas do esto-que congelado em uma placa B-YP-002 (YP+50 mg/l de espectinomicina +10 mg/l de tetraciclina) ou em uma placa contendo o meio YP/ou LB com 50a 100 mg/l de canamicina, dependendo dos genes marcadores de seleçãobacteriana no plasmídeo. Cultivar a 28°C por 2 a 3 dias. Salvar o materialcomo placa máster e armazenas a 4°C por até um mês. Retirando da placamáster, semear uma alça de células de agrobactérias em um frasco conten-do 25 ml do meio líquido B-YP-000, complementado com espectinomicina a50 mg/l mais tetraciclina a 10 mg/l ou canamicina a 50-100 mg/l, respectiva-mente. Cultivar em um misturador, programado para 300 rpm e 28°C por 2 a3 dias. Preparar o estoque de agrobactérias congeladas, misturando 1 parteda cultura de agrobactérias acima com 1 parte de glicerol estéril a 30%.Submeter a vórtice e misturar bem, dispensando 10 μΙ da mistura de Agro-bacterium/gIicerol em um tubo Eppendorf de 50 μΙ. Armazenar a -80°C.

Uma a duas alças cheias (2 mm de diâmetro) da cultura bacteri-ana é suspensa em 1,0 a 1,8 ml do meio LS-inf, complementado com aceto-siringona a 100 μΜ. O resultado é uma suspensão bacteriana com densida-de óptica aproximada (OD6oo) entre 0,5 a 2,0. Submeter a vórtice por 0,5 a 3horas. O vórtice é conduzido, fixando-se (por exemplo, com uma fita adesi-va) o tubo de microcentrifugação horizontalmente (em vez de verticalmente)na plataforma da centrífuga para assegurar uma dispersão melhor das célu-las de Agrobacterium na solução. Misturar 100 μΙ da suspensão contendocélulas de Agrobacterium com 900 μΙ de solução LS-inf em uma cubeta emedir a OD6oo- Ajustar a OD da solução original de Agrobacterium para 0,6 a2,0 com solução LS-Inf (com acetosiringona a 100 μΜ). A suspensão de A-grobacteríum é de preferência submetida a vórtice no meio de LS-inf + ace-tosiringona por pelo menos 0,5 a 3 horas antes de ser conduzida a infecção.Preparar esta suspensão antes de iniciar a colheita dos embriões.

Alternativamente, suspensões de Agrobacterium para transfor-mação de milho podem ser preparadas da forma como segue: dois dias an-tes da transformação, de estoque a -80°C, semear as agrobactérias em es-trias, de um tubo para uma placa, contendo B-YP-002 (YP solidificado YP+espectinomicina a 50 mg/l mais tetraciclina a 10 mg/l ou canamicina a 50-100 mg/l, respectivamente, dependendo do marcador de seleção bacterianautilizado) e cultivar a 28°C no escuro por dois dias. Cerca de 1 a 4 horas an-tes da transformação, colocar um copinho de células bacterianas em 1,5 mldo meio M-LS-002 (LS inf + acetosiringona a 200 μΜ) em um tubo de Ep-pendorf de 2 rril . Submeter o tubo a vórtice para "dispensar as células bacte-rianas na solução e agitar o tubo a 1.000 rpm por 1 a 4 horas. A OD6oo deveser no intervalo de 0,6 a 1,0 ou aproximadamente 108cfu/ml.

Para os exemplos seguintes, foram empregadas a cepaLBS4404 de Agrobacterium tumefaeiens e a cepa K599 desarmada do A-grobaeterium (NCPPB 2659), transformada com o plasmídeo de vetor bináriopBPSMM232. O pBPSMM232 contém o gene ahas (como marcador de se-leção) e o gene repórter gus.

1.3 Isolamento de Embriões Imaturos

1.3.1 Esterilização de Superfície

As espigas são colhidas da estufa de 8 a 12 dias após a polini-zação. A palha e o espigamento são completamente removidos e as espigassão transportadas no saco marrom de polinização de volta para o laboratóriode cultura de tecido. O sabugo é removido na capela esterilizada. Um par depinças longo é inserido na extremidade basal da espiga e a pinça é utilizadapara manipular o sabugo. Opcionalmente, quando insetos /fungos estiverempresentes na espiga, esta deve ser inicialmente esterilizada com água sani-tária comercial a 20% (alternativamente, uma solução de Clorox a 30% por15 min) e, em seguida, lavada três vezes com água esterilizada. Enquanto osabugo é mantido seguro pela pinça, a espiga é completamente pulverizadacom etanol a 70% e, em seguida, lavada com ddH20 esterilizada.

1.3.2 Preparo de Inoculação de Aarobacterium de Embriões Imaturos1.3.2.1 Método-1: O Método do "Tubo" Modificado

O sabugo seguro pela pinça é colocado em uma placa de Petrigrande. Pode ser utilizado um aparelho de dissecação. A parte superior(2/3's) dos grãos foi cortada e removida com um estilete n° 10 (a título desegurança, o corte nos grãos é efetuado, fazendo o corte distante da mãoque está segurando a pinça). Os embriões imaturos são, em seguida, sepa-rados dos grãos no sabugo com um estilete (estilete n° 11 ou 15): a lâminado estilete é inserida em um ângulo na extremidade do grau. O endospermaé levantado para cima; o embrião está abaixo do endosperama. Os embriõesextirpados são coletados em um tubo de microcentrifugação (ou uma placade-Petri pequena), contendo aproximadamente 1,5 a 1,8 ml de suspensãode Agrobacterium em meio líquido LS-inf, contendo acetosiringona (consultaracima; A-2). Cada tubo pode conter até 100 embriões. O tubo contendo osembriões é misturado manualmente diversas vezes e o tubo/placa é deixadoem repouso em temperatura ambiente (20 a 25°C) por 30 min. Remover oexcesso de suspensão bacteriana do tubo/placa com uma pipeta. Transferiros embriões imaturos e bactérias no meio residual de LS-inf para uma placade Petri plate contendo o meio de cocultivo em ágar. Transferir quaisquerembriões imaturos que restagem no tubo de microcentrifugação por meio deuma alça estéril. Remover o excesso de suspensão bacteraiana com umapipeta. Colocar os embriões imaturos no meio de cocultivo com o lado planopara baixo (escutelo para cima). Não embeber os embriões no meio. Deixara cobertura da placa aberta, na capela estéril, por aproximadamente 15 minpara permitir a evaporação do excesso de líquido que recobre os embriõesimaturos (secagem por ventilação). Lacrar as placas de Petri com fita adesi-va Micropore da 3M. Podem ser colocados em torno de 100 embriões sobreuma placa de Petri para o cocultivo. Lacrar a placa e envolver uma folha depapel alumínio. Incubar as placas no escuro a 22°C por 2 a 3 dias. Retirar de3 a 5 embriões imaturos para coloração por GUS1 se um construto de GUSfor utilizada para avaliar a expressão transitório de GUS.

1.3.2.2 Método-2: O Método da "Gota"

Embriões imaturos extirpados são colocados diretamente nomeio de cocultivo (consultar o meio A-3), com o lado plano voltado para bai-xo (escutelo para cima). Cada placa (placa de 20x100 mm) pode abrigar até.100 embriões imaturos. Aplicar 5 μΙ de suspensão diluída de células de A-grobacterium em cada embrião imaturo com uma pipeta repetidora. Removero excesso de líquido que recobrir os embriões imaturos, deixando a cobertu-ra da placa aberta na capela por aproximadamente 15 min. Lacrar a placacom fita adesiva Micropore da 3M e envolver em papel alumínio. Incubar aplaca no escuro a 22°C por 2 a 3 dias. Retirar de 3 a 5 embriões para colo-ração por GUS se um construto de GUS tiver sido utilizada para avaliar aexpressão transitória de GUS.

1.4 Recuperação

Após o cocultivo, transferir os embriões para o meio de recupe-ração (A-4 ou A-5) e incubar as placas no escuro a 27°C por aproximada-mente 5 a 7 dias. Manter o escutelo erguido e não embebido nos meios.

1.5 Seleção

Transferir embriões maduros para o 1o meio de seleção (A-6).Aproximadamente de 25 a 50 embriões imaturos podem ser colocados emcada placa. Tomar cuidado para manter os embriões na mesma orientação(escutelo para cima). Não embeber os embriões no meio. Lacrar as placasde Petri com fita adesiva micropore da 3M. Incubar no escuro a 27°C por 10a 14 dias (Primeira seleção). Fazer culturas secundárias de todos os embri-ões imaturos que produzem calos variados no 2o meio de seleção (A-6).Tentar evitar a transferência de calo viscoso ou amolecido. Neste estágio,utilizar tesouras para remover qualquer parte aérea que tenha se formado(tentar remover todo o embrião do escutelo, se possível, e descartá-lo).

Prender firmemente o calo no meio - não deixar que fique embebido pelomeio. Cobrir as placas com fita adesiva Micropore da 3M e colocá-las noescuro a 27°C. Incubar por 2 semanas sob as mesmas condições da primei-ra seleção (Segunda seleção). Utilizando uma pinça fina, extirpar o calo re-generável do escutelo, sob microscopia estereoscópica. O calo regenerávelé esbranquiçado/amarelado, compacto, não é viscoso e pode apresentarestruturas semelhantes a embriões. Transferir o calo para o 2o meio de sele-ção fresco (A-6), envolver em fita adesiva Micropore da 3M e incubar no es-curto a 27°C por 2 semanas. Prenderfirmemente o calo no meio - não deixarque fique embebido no meio. Tomar cuidado para agrupar e marcar pedaçosde calo que se soltam do mesmo embrião.

1.6 Regeneração de Plantas Transformadas

Extirpar o calo proliferado (esbranquiçado com formação de es-truturas embriônicas), da mesma maneira da conduzida para a 2a seleção, etransferir para o meio de regeneração (A-7) em placas de 25x100 mm. Pren-der firmemente o calo no meio - não deixar que fique embebido no meio.Cobrir as placas com fita adesiva Micropore da 3M e deixá-las sob ilumina-ção a 25 ou 27°C. Tomar cuidado para reunir os pedaços do calo que sesoltarem do mesmo embrião e enumerá-los por embrião.

Incubar sob iluminação (cerca de 2.000 lux; 14/1 Oh luz/escuro) a25 ou 27°C por 2 a 3 semanas ou até que estruturas semelhantes a parteaérea estejam visíveis. Transferir para meio de regeneração fresco, se ne-cessário. Transferir seções de calo com partes aéreas regeneradas, ou es-truturas semelhantes, para caixas Phytatray ou Magenta, contendo meio deenraizamento (A-8) e incubar por 2 semanas sob as mesmas condições daetapa acima ou até que rebentos enraizados tenham se desenvolvido. Após2 a 4 semanas no meio de enraizamento, transferir o calo ainda com áreasverdes (porém que não regeneraram mudas) para novas Phytotrays de enra-izamento. São coletadas amostras de mudas para análise de TaqMan visan-do determinar o número de inserções de T-DNA.

1.7 Plantas Transqênicas na Estufa

Transferir as mudas enraizadas para o solo Metromix na estufa ecobrir cada uma com cúpula de plástico por pelo menos 1 semana, até queas mudas tenham se estabelecido, manter as plantas com rega diária ecomplementar com fertilizante líquido, duas vezes por semana. Quando asplantas alcançarem os estágios de 3 a 4 folhas, elas são fertilizadas comOsmocote. As plantas que sobreviverem são transplantadas para vasos de10" contendo MetroMix e uma colher de chá de Osmocote®.

No estágio de floração, os pendões das plantas transgênicassão envolvidos por sacos de papel marrom para impedir que o pólen se per-ca. A polinização é conduzida nas plantas transgênicas. É melhor que ocorraautopolinização nas plantas transgênicas. Se o espigamento e antese nãoestiverem sincronizados, um doador de pólen do tipo selvagem ou plantarecipiente com o mesmo antecedente genético da planta transgênica To de-ve estar disponível para a execução de polinização cruzada. As sementes Tisão colhidas, desidratadas e armazenadas adequadamente com uma etique-ta no saco da semente. Após a colheita de sementes transgênicas Ti, asplantas T0, incluindo o solo e vaso, ensacados, são colocadas em sacos esubmetidas a autoclave (embalados em dois sacos).

Exemplo 2: Vetores de Transformação Utilizados para Avaliação dos GenesdsdA e daol

Foram produzidos diversos vetores de tranformação contendo ogene dsdA ou o gene dao 1. Para efeito de comparação, foi utilizada nosexperimentos de transformação um construto compreendendo o marcadorde seleção (Tabela 3).

Tabela- 3: Descrição de vetores de transformação utilizados para os experi-mentos que estabelecem a transformação com os genes dsdA e daol comoo marcador de seleção. (EcdsdA = dsdA de E.coll·, daol = gene da D-aminoácido oxidase; p-ScBV = promotor ScBV; p-Ubi = promotor de ubi demilho; t-OCS3" = finalizador OCS3'; t-NOS = nos finalizador; PsFedI = se-quência de líder de tradução)

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Exemplo 3: Estabelecimento de Curvas de Extermínio com D-serina e D-alanina

A fim de estabelecer as concentrações eficazes de D-serina e deD-alanina que inibem ò crescimento de céluals de milho cultivadas em teci-do, foi aplicado um sistema de bioensaio, utilizando embriões imaturos. Em-briões imaturos com 2 mm de comprimento foram dissecados em meio degerminação com os agentes de seleção, e incubados a 27°C em iluminação.

Os comprimentos do galho e da raiz primária de uma muda germinada forammedidos 7 dias depois da operação no embrião (Figuras 1 e 2).

No experimento de inibição de germinação de embrião imaturo,ocorre inibição de crescimento significativa quando as concentrações de D-alanina são acima de 2 mM, especialmente quando atingem 10 mM (figura1). Resultados semelhantes indicam que a concentração de D-serina acimade 9 mM provoca inibição acentuada do crescimento (Figura 2). Testes pos-teriores de inibição de crescimento, com D-serina e D-alanina em tecido decultura de calo, confirmaram as concentrações inibidoras eficazes destes D-aminoácidos (Dados não mostrados).

Exemplo 4: Efeito de Concentrações de D-serina em Meio de Seleção sobrea Transformação

O efeito de concentrações de D-serina no meio de seleção, so-bre a eficiência da transformação, foi determinado utilizado o vetor de trans-formação LM179 (consultar a Tabela 3). Foram obtidas eficiências de trans-formação acima de 20% com intervalos de D-serina que variaram de 5 a 15mM (Tabela 3.1). Sem acrescentar D-serina no meio de seleção (D-serina a0 mM), cada pedaço de calos em cultura foi transferido para o meio de rege-neração com seleção de D-serina a 15 mM e, portanto, os calos não trans-gênicos foi exterminados nesta etapa. Com D-Ser a 20 mM no meio de sele-ção, a eficiência da transformação mostra ter reduzido (com uma réplica)para 2% (Tabela 3.1). Portanto, concentrações de D-Ser, variando de 5 a 15,foram aplicadas no nosso-protocolo de transformação.

Tabela 4: Efeito de concentrações de D-serina (D-Ser) no meio de seleçãosobre as eficiências de transformação no genótipo de milhoJ553x(HillAxA188). O vetor LM179 foi utilizado nos experimentos. Foramderivados dados de quatro experimentos diferentes. Os supostos calostransgênicos, do controle de D-Ser a 0 mM, foram transferidos para o meiode regeneração com D-Ser a 10 mM, e as plantas que sobreviveram foramconfirmadas pelo ensaio de Taqman.

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Exemplo 5: Comparação de Transformação com ahas e dsdA como os Mar-cadores de Seleção

Foram obtidas eficiências de transformação semelhantes comdois regimes de seleção: dsdA/D-serina a 10 mM e a/?as/Pursuit a 750 nMcom ambos os vetores LM179 e MM232 (Tabela 4). O vetor LM179 contémambos os marcadores de seleção, ahas e dsdA, enquanto que o MM232contém somente o marcador ahas (Tabela 3). Os resultados de transforma-ção indicam que o marcador de seleção dsdA fornece a mesma eficiência detransformação que o marcador de seleção ahas.

Tabela 5: Comparação de eficiências de transformação com dois sistemasde seleção: dsdA/D-Serine e ahas/Pursuit com o vetor LM179 (Tabela 3), emgenótipo J553x(HillAxA188), usando MM232 como o vetor de controle detransformação.

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Exemplo 6: Estabelecimento de transformação com gene daol e o efeito daseqüência líder de tradução (PsFedI) sobre a transformação

Foram obtidas eficácias de transformação semelhantes com osvetores LM198 e LM199 (consultar a Tabela 3), indicando não haver efeitosignificativo da seqüência líder de tradução em frente da seqüência de codi-ficação observada no genótipo J553x(HillAxA188) (Tabela 6). Houve umaseleção apertada com D-Ala a 10 mM no meio de seleção, regeneração e deenraizamento, uma vez que não houve alternativa quando embriões madu-ros foram infectados com a cepa do Agrobacterium que continham MM232 eselecionado em D-Ala a 10 mM (Tabela 6). Além disso, a combinação dogene daol de códon otimizado e da seqüência líder de tradução (PsFedl,vetor LM226) não resultou em eficiência de transformação mais alta na li-nhagem de modelo do milho (Tabela 7). Por outro lado, não há diferençassignificativas nas eficiências de transformação, usando vetores contendodaol não otimizado com líder de tradução (vetor LM224) ou daol com códonotimizado sem a líder de tradução (vetor LM225). Os resultados indicam,portanto, que a otimização do códon dos genes dsdA e daol genes não pro-picia reforço adicional à transformação no genótipo do modelo.Tabela 6: O efeito de seqüência líder de tradução (PsFed) sobre a eficiênciade transformação com o gene daol como o marcador de seleção emJ553x(HillAxA188). O vetor LM199 contém o gene daol com códon otimiza-do e a seqüência líder de tradução. O vetor LM198 contém o gene daol comcódon otimizado sem a seqüência líder de tradução.

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Tabela 7: Efeito de otimização de códon e seqüência líder de tradução sobreas eficiências de transformação com gene daol gene emJ553x(HillAxA188). Os experimentos de transformação, usando o vetorLM226 contendo o gene daol com códon otimizado com a seqüência líderde tradução apresentaram uma eficiência relativamente mais baixa do queos outros dois vetores.

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Exemplo 7: Efeito de dois D-aminoácidos diferentes, D-Ser e D-Ala1 sobre atransformação com o gene daol como o marcador de seleção.

A proteína DA01 possui uma variedade maior de D-aminoácidos, por exemplo, D-Ser e D-Ala como os substratos, em compara-ção à proteína DSDA que usa somente a D-serina como o substrato. Umexperimento comparativo, portanto, foi conduzido para determinar o efeito deD-Ser e D-Ala sobre a transformação. Foram geradas plantas transgênicacom a D-Ser e a D-Ala como os agentes de seleção, com eficiências detransformações semelhantes (Tabela 8). O resultado indica que os dois D-aminoácidos operam igualmente bem como os agentes de seleção para asconstruções do gene daol no modelo do genótipo.

Tabela 8: Comparação do uso de dois D-aminoácidos diferentes, D-serina eD-alanina, como os agentes de seleção, sobre as eficiências de transforma-ção em J553x(HillAxA188). Foram utilizados dois vetores de transformação,LM198 e LM199, neste experimento.

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Exemplo 8: Comparação de três marcadores de seleção: ahas, dsdA e daol

Foram conduzidos experimentos de transformação para compa-rar eficiências de transformação com três marcadores de seleção/sistemasde agentes de seleção, a saber, ahas/Pursuit; c/scM/D-Serina e dao7/D-Ala.

As eficiências de transformação médias de 31%, 42% e 31% foram obtidascom os vetores de MM232/Pursuit, LM166/D-Ser e LM205/D-Ala, respecti-vamente. Tanto a D-ser como a D-ala deram origem a uma seleção muitoapertada, uma vez que não houve alternativas quando embriões imaturosforam infectados com uma cepa de Agrobacterium contendo o vetor MM232e selecionado em D-Ser a 10 mM ou D-ala a 10 mM (Tabela 9).

Tabela 9: Comparação de eficiências de transformação com três sistemasde seleção: (1) ahas/750 nM Pursuit; (2) dsdA/10 mM D-Alanine e (3)"dao1/10 mM D-serina.

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Exemplo 9: Retransformação (Empilhamento de gene) com o gene dsdA e odaol

Devido à especificidade do substrato da proteína dsdA (princi-palmente D-serina) e a variedade mais ampla de substrato utilizada pela pro-teína daol, as plantas transgênicas primárias contendo o gene dsdA sãosensíveis à D-alanina e podem ser retransformadas com o gene daol usan-do a D-alanina como o agente de seleção. Um experimento de Retransfor-mação foi conduzido pela retransformção de embriões imaturos transgênicosT1 primários de dsdA, contendo LM179 (consultar a Tabela 3) T-DNA com aconstrução LM205 (consultar a Tabela 3), contendo daol e gus (Tabela 10).

Como as plantas transgênicas primárias contêm os dois genes,dsdA e ahas, os embriões imaturos não-infectados conseguiram sobreviveras seleções com D-serina (Tratamento 1) e Pursuit (Tratamento 2), porémnão sobreviveram a seleção com D-alanina (Tratamento 3). Após a infecçãocom uma cepa de Agrobacterium contendo o plasmídeo LM205, foi geradoum evento transgênico positivo, tanto com gene dsdA como com o daol,sendo este confirmado em nível molecular (Tabela 10, Tratamento 4).

Tabela 10: Experimento de retransformação para empilhamento dos genesdsdA e daol. Plantas transgênicas primárias contendo T-DNA de LM179 (p-Ubi::ahas::ahas)

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Exemplo 10: Retransformação de plantas transgênicas primárias contendoahas com construto contendo dsdA ou daol

A fim de testar a capacidade dê empilhar gene ahas com genesdsdA ou daol, plantas transgênicas primárias, contendo o gene ahas, foramretransformadas com construto contendo o gene dsdA. Foram gerados even-tos trangênicos confirmados, contendo dsdA e ahas, indicando que os mar-cadores de seleção dsDa e ahas podem ser empilhados com dois agentesde seleção Pursuit e D-serina.

Os experimentos de empilhamento de genes com ahas (eventosprimários) e daol (transformação secundária) e dsdA (eventos primários) /oudaol (eventos primários) com ahas (nesta data, a transformação secundáriaestá em curso).

Tabela 11: Experimentos de empilhamento de marcador de seleção entreahas e dsdA. A seleção foi realizada utilizando tanto pursuit a 750 nM comoD-serina a 15 mM (para construções de dsdA).

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Tabela 12: Avaliação de empilhamento de genes com construções contendoos marcadores de seleção ahas e daol. O material transgênico primário uti-lizado para os experimentos de empilhamento de genes foi embriões imatu-ros homozigotos T2 e continha o marcador mutado ahas e re-transformadocom um construto daol, LM255, utilizando D-serina e/ou D-alanina comoagente de seleção.

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Exemplo 11: Teste de Pulverização de D-serina e D-alanina na Estufa

Foram conduzidos experimentos pela pulverização de mudas demilho do tipo selvagem (genótipo J553x(HillAxA188)) com D-serina ou D-alanina na estufa. Foram testadas quatro doses pulverizadas de D-serina ouD-alanina: O1 100, 1.000 e 10.000 g/Ac. Não foram observados sintomas delesões nas plantas, mesmo com a concentração mais alta avaliada de10.000 g/ac (dados não mostrados).

Exemplo 12: Avaliação do efeito de promotores diferentes no uso dos genesdsdA ou daol, como marcadores de seleção, na transformação de uma li-nhagem de híbrido (BPS553 χ (HillAxA188) e de uma natural (BPS553).

Os dados da transformação sugerem que o gene dsDa, induzidopelo promotor de ubiquitina de milho (construção LM151) atua mais eficaz-mente em cultura de tecido de milho e propicia um nível mais alto de eficiên-cia de transformação na linhagem do híbrido. Não há diferença observadaem eficiência de transformação quando o gene daol é induzido pelo ScBV(LM242) ou promotor de ubiquitina de milho (LM255), tanto na linhagem hí-brida como na natural. Os genes dsdA e daol combinados com o promotorahas de milho (LM239 e LM241) não produziram eventos transgênicos.

Tabela 13: Sumário de experimentos de transformação, conduzidos para avalia-ção de construções com promotores diferentes, induzidos pelos genes dsdA edaol. Os dados do experimento estão reunidos por genótipo e construções.

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*Genótipo A = BPS553x(HillAxA188); B = BPS553. ** N0 Els = número deembriões imaturos infectados; ET (%) = eficiência da transformação (%); DP= erro padrão da média.

Exemplo 13: Melhora da eficiência enzimática das proteínas DSDA e DA01

As proteínas DSDA e DA01 são modificadas, buscando melho-rar a eficiência enzimática por meio de embaralhamento de gene. As proteí-nas sintéticas DSDA e/ou DA01 são produzidas pela combinação aleatóriade domínios derivados de seqüências do DNA de DSDA e/ou DA01 comfragamentos de DNA1 potencialmente funcionais, de outros genes de proteí-nas. As seqüências quiméricas resultantes de DNA são expressas no siste-ma microbiano, por exemplo, E.coli, e as proteínas são submetidas a análisepara caracterização da cinética enzimática.

REFERÊNCIAS

As referências listadas abaixo e todas as referências citadas nopresente são aqui incorporadas por referência neste pedido, na medida emque complementem, expliquem, forneçam antecedente ou descrevam méto-dos, técnicas e/ou composições empregados no presente.

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171. US 5 100 792

172. US 5 225 341

173. US 5 304 732

174. US 5 605 793

175. US 5 750 866

176. US 5 811 238

177. US 5 830 721

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222. WO 00/44914

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LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> BASF Plant Science GmbH

<120> MÉTODO PARA TRANSFORMAÇÃO DE MILHO E CONSTRUTO DE DNA

<130> AE20050616 / PF 56914 US

<160> 22

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1329

<212> DNA<213> Escherichia coli<220>

<221> CDS<222> (1) .. (1329)<223> Gene de D-serina desidratase [dscLA] de Ε. coli/CDS<400> 1

atg gaa aac gct aaa atg aac tcg etc ate gcc cag tat ccg ttg gta 48

Met Glu Asn Ala Lys Met Asn Ser Leu Ile Ala Gln Tyr Pro Leu Val1 5 10 15

aag gat ctg gtt gct ctt aaa gaa acc acc tgg ttt aat cct ggc acg 96

Lys Asp Leu Val Ala Leu Lys Glu Thr Thr Trp Phe Asn Pro Gly Thr

20 25 30

acc tca ttg gct gaa ggt tta cct tat gtt ggc ctg acc gaa cag gat 144

Thr Ser Leu Ala Glu Gly Leu Pro Tyr Val Gly Leu Thr Glu Gln Asp 35 40 45

gtt cag gac gcc cat gcg cgc tta tcc cgt ttt gea ccc tat ctg gea 192

Val Gln Asp Ala His Ala Arg Leu Ser Arg Phe Ala Pro Tyr Leu Ala

50 55 60

aaa gea ttt cct gaa act gct gcc act ggg ggg att att gaa tca gaa 240

Lys Ala Phe Pro Glu Thr Ala Ala Thr Gly Gly Ile Ile Glu Ser Glu65 70 75 80

ctg gtt gcc att cca gct atg caa aaa cgg ctg gaa aaa gaa tat cag 288

Leu Val Ala Ile Pro Ala Met Gln Lys Arg Leu Glu Lys Glu Tyr Gln85 90 95

caa ccg ate age ggg caa ctg tta ctg aaa aaa gat age cat ttg ccc 336

Gln Pro Ile Ser Gly Gln Leu Leu Leu Lys Lys Asp Ser His Leu Pro

100 105 110

att tcc ggc tcc ata aaa gea cgc ggc ggg att tat gaa gtc ctg gea 384

Ile Ser Gly Ser Ile Lys Ala Arg Gly Gly Ile Tyr Glu Val Leu Ala

115 120 125

cac gea gaa aaa ctg gct ctg gaa gcg ggg ttg ctg acg ctt gat gat 432

His Ala Glu Lys Leu Ala Leu Glu Ala Gly Leu Leu Thr Leu Asp Asp<table>table see original document page 135</column></row><table>Glu Pro Thr His Ser Pro305 310

cac gat cag att tct gttHis Asp Gln Ile Ser Val325

gcg gat ggc ctt gca gttAla Asp Gly Leu Ala Val340

atg gag cgt ctg ctg gatMet Glu Arg Leu Leu Asp355

tat gac atg ctt ggc tggTyr Asp Met Leu Gly Trp370

cct tcg gca ctg gcg ggtPro Ser Ala Leu Ala Gly385 390

gta agt tac caa cag atgVal Ser Tyr Gln Gln Met

405

acc act cat ctg gtg tggThr Thr His Leu Val Trp420

gag atg aat caa tat ctgGlu Met Asn Gln Tyr Leu435

<210> 2<211> 442<212> PRT<213> Escherichia coli<400> 2

Met Glu Asn Ala Lys Met

Cys Met Leu Leu Gly Val His315

cag gat att ggt ate gac aacGln Asp Ile Gly Ile Asp Asn330gca tcaAla Ser345

tat accTyr Thr

ggt cgcGly Arg

ggc ttcGly Phe360ctg gcgLeu Ala375

atg gccMet Ala

cac ggtHis Gly

gcg acgAla Thr

gca aaaAla Lys440

cag gaaGln Glu

gga cctGly Pro

ttc agePhe Ser410gga ggtGly Gly425

ggc cgtGly Arg

ggc ttt gtcGly Phe Val

ctt age gatLeu Ser Asp365

gaa ggt attGlu Gly Ile

380cag cgc gtgGln Arg Val395

gca gaa caaAla Glu Gln

gga atg gtgGly Met Val

taa

Thr Gly Leu320

ctt acc gcaLeu Thr Ala

335ggg cgg gcaGly Arg Ala350

caa acc atgGln Thr Met

cgt ctt gaaArg Leu Glu

tgt gca tcaCys Ala Ser400

ctg cgt aatLeu Arg Asn

415ccg gaa gaaPro Glu Glu430

1008

1056

1104

1152

1200

1248

1296

1329

Asn Ser Leu Ile Ala Gln Tyr Pro Leu Val1 5 10 15

Lys Asp Leu Val Ala Leu Lys Glu Thr Thr Trp Phe Asn Pro Gly Thr

20 25 30

Thr Ser Leu Ala Glu Gly Leu Pro Tyr Val Gly Leu Thr Glu Gln Asp

35 40 45

Val Gln Asp Ala His Ala Arg Leu Ser Arg Phe Ala Pro Tyr Leu Ala

50 55 60

Lys Ala Phe Pro Glu Thr Ala Ala Thr Gly Gly Ile Ile Glu Ser Glu65 70 75 80

Leu Val Ala Ile Pro Ala Met Gln Lys Arg Leu Glu Lys Glu Tyr Gln

85 90 95

Gln Pro Ile Ser Gly Gln Leu Leu Leu Lys Lys Asp Ser His Leu Pro

100 105 110

Ile Ser Gly Ser Ile Lys Ala Arg Gly Gly Ile Tyr Glu Val Leu Ala

115 120 125

His Ala Glu Lys Leu Ala Leu Glu Ala Gly Leu Leu Thr Leu Asp Asp

130 135 140

Asp Tyr Ser Lys Leu Leu Ser Pro Glu Phe Lys Gln Phe Phe Ser Gln145 150 155 160

Tyr Ser Ile Ala Val Gly Ser Thr Gly Asn Leu Gly Leu Ser Ile Gly

165 170 175

Ile Met Ser Ala Arg Ile Gly Phe Lys Val Thr Val His Met Ser Ala

180 185 190

Asp Ala Arg Ala Trp Lys Lys Ala Lys Leu Arg Ser His Gly Val Thr

195 200 205

Val Val Glu Tyr Glu Gln Asp Tyr Gly Val Ala Val Glu Glu Gly Arg

210 215 220

Lys Ala Ala Gln Ser Asp Pro Asn Cys Phe Phe Ile Asp Asp Glu Asn225 230 235 240

Ser Arg Thr Leu Phe Leu Gly Tyr Ser Val Ala Gly Gln Arg Leu Lys

245 250 255

Ala Gln Phe Ala Gln Gln Gly Arg Ile Val Asp Ala Asp Asn Pro Leu260 265 270

Phe Val Tyr Leu Pro Cys Gly Val Gly Gly Gly Pro Gly Gly Val Ala

275 280 285

Phe Gly Leu Lys Leu Ala Phe Gly Asp His Val His Cys Phe Phe Ala

290 295 300

Glu Pro Thr His Ser Pro Cys Met Leu Leu Gly Val His Thr Gly Leu305 310 315 320

His Asp Gln Ile Ser Val Gln Asp Ile Gly Ile Asp Asn Leu Thr Ala

325 330 335

Ala Asp Gly Leu Ala Val Gly Arg Ala Ser Gly Phe Val Gly Arg Ala

340 345 350

Met Glu Arg Leu Leu Asp Gly Phe Tyr Thr Leu Ser Asp Gln Thr Met

355 360 365

Tyr Asp Met Leu Gly Trp Leu Ala Gln Glu Glu Gly Ile Arg Leu Glu

370 375 380

Pro Ser Ala Leu Ala Gly Met Ala Gly Pro Gln Arg Val Cys Ala Ser385 390 395 400

Val Ser Tyr Gln Gln Met His Gly Phe Ser Ala Glu Gln Leu Arg Asn

405 410 415

Thr Thr His Leu Val Trp Ala Thr Gly Gly Gly Met Val Pro Glu Glu

420 425 430

Glu Met Asn Gln Tyr Leu Ala Lys Gly Arg435 440

<210> 3<211> 1107<212> DNA

<213> Rhodosporidium toruloides<220>

<221> CDS<222> (1) . . (1107)

<223> D-aminoácido oxidase de Rhodosporidium toruloides<4 00> 3atg cac tcg cag aag cgc gtc gtt gtc ctc gga tca ggc gtt ate ggt 48

Met His Ser Gln Lys Arg Val Val Val Leu Gly Ser Gly Val Ile Gly1 5 10 15

ctg age age gcc ctc ate ctc gct cgg aag ggc tac age gtg cat att 96

Leu Ser Ser Ala Leu Ile Leu Ala Arg Lys Gly Tyr Ser Val His Ile20 25 30

ctc gcg cgc gac ttg ccg gag gac gtc tcg age cag act ttc gct tca 144

Leu Ala Arg Asp Leu Pro Glu Asp Val Ser Ser Gln Thr Phe Ala Ser35 40 45

cca tgg gct ggc gcg aat tgg acg cct ttc atg acg ctt aca gac ggt 192

Pro Trp Ala Gly Ala Asn Trp Thr Pro Phe Met Thr Leu Thr Asp Gly

50 55 60

cct cga caa gea aaa tgg gaa gaa tcg act ttc aag aag tgg gtc gag 240

Pro Arg Gln Ala Lys Trp Glu Glu Ser Thr Phe Lys Lys Trp Val Glu65 70 75 80

ttg gtc ccg acg ggc cat gcc atg tgg ctc aag ggg acg agg cgg ttc 288

Leu Val Pro Thr Gly His Ala Met Trp Leu Lys Gly Thr Arg Arg Phe

85 90 95

gcg cag aac gaa gac ggc ttg ctc ggg cac tgg tac aag gac ate acg 336

Ala Gln Asn Glu Asp Gly Leu Leu Gly His Trp Tyr Lys Asp Ile Thr100 105 110

cca aat tac cgc ccc ctc cca tet tcc gaa tgt cca cct ggc gct ate 384

Pro Asn Tyr Arg Pro Leu Pro Ser Ser Glu Cys Pro Pro Gly Ala Ile115 120 125

ggc gta acc tac gac acc ctc tcc gtc cac gea cca aag tac tgc cag 432

Gly Val Thr Tyr Asp Thr Leu Ser Val His Ala Pro Lys Tyr Cys Gln

130 135 140

tac ctt gea aga gag ctg cag aag ctc ggc gcg acg ttt gag aga cgg 480

Tyr Leu Ala Arg Glu Leu Gln Lys Leu Gly Ala Thr Phe Glu Arg Arg145 150 155 160

acc gtt acg tcg ctt gag cag gcg ttc gac ggt gcg gat ttg gtg gtc 528

Thr Val Thr Ser Leu Glu Gln Ala Phe Asp Gly Ala Asp Leu Val Val165 170 175

aac gct acg gga ctt ggc gcc aag tcg att gcg ggc ate gac gac caa 576

Asn Ala Thr Gly Leu Gly Ala Lys Ser Ile Ala Gly Ile Asp Asp Gln

180 185 190

gcc gcc gag cca ate cgc ggg caa acc gtc ctc gtc aag tcc cca tgc 624

Ala Ala Glu Pro Ile Arg Gly Gln Thr Val Leu Val Lys Ser Pro Cys

195 200 205

aag cga tgc acg atg gac tcg tcc gac ccc gct tet ccc gcc tac ate 672

Lys Arg Cys Thr Met Asp Ser Ser Asp Pro Ala Ser Pro Ala Tyr Ile

210 215 220

att ccc cga cca ggt ggc gaa gtc ate tgc ggc ggg acg tac ggc gtg 720

Ile Pro Arg Pro Gly Gly Glu Val Ile Cys Gly Gly Thr Tyr Gly Val225 230 235 240

gga gac tgg gac ttg tet gtc aac cca gag acg gtc cag cgg ate ctc 768

Gly Asp Trp Asp Leu Ser Val Asn Pro Glu Thr Val Gln Arg Ile Leu

245 250 255

aag cac tgc ttg cgc ctc gac ccg acc ate tcg age gac gga acg ate 816

Lys His Cys Leu Arg Leu Asp Pro Thr Ile Ser Ser Asp Gly Thr Ile260 265 270

gaa ggc ate gag gtc ctc cgc cac aac gtc ggc ttg cga cct gea cga 8 64

Glu Gly Ile Glu Val Leu Arg His Asn Val Gly Leu Arg Pro Ala Arg

275 280 285

cga ggc gga ccc cgc gtt gag gea gaa cgg ate gtc ctg cct ctc gac 912

Arg Gly Gly Pro Arg Val Glu Ala Glu Arg Ile Val Leu Pro Leu Asp290 295 300

cgg aca aag tcg ccc ctc tcg ctc ggc agg ggc age gea cga gcg gcg 960

Arg Thr Lys Ser Pro Leu Ser Leu Gly Arg Gly Ser Ala Arg Ala Ala305 310 315 320

aag gag aag gag gtc acg ctt gtg cat gcg tat ggc ttc tcg agt gcg 1008

Lys Glu Lys Glu Val Thr Leu Val His Ala Tyr Gly Phe Ser Ser Ala

325 330 335

gga tac cag cag agt tgg ggc gcg gcg gag gat gtc gcg cag ctc gtc 1056Gly Tyr Gln Gln Ser Trp Gly Ala Ala Glu Asp Val Ala Gln Leu Val

340 345 350

gac gag gcg ttc cag cgg tac cac ggc gcg gcg cgg gag tcg aag ttg 1104Asp Glu Ala Phe Gln Arg Tyr His Gly Ala Ala Arg Glu Ser Lys Leu 355 360 365

tag 1107

<210> 4<211> 368<212> PRT<213> Rhodosporidium toruloides<400> 4

Met His Ser Gln Lys Arg Val Val Val Leu Gly Ser Gly Val Ile Gly1 5 10 15

Leu Ser Ser Ala Leu Ile Leu Ala Arg Lys Gly Tyr Ser Val His Ile

20 25 30

Leu Ala Arg Asp Leu Pro Glu Asp Val Ser Ser Gln Thr Phe Ala Ser

35 40 45

Pro Trp Ala Gly Ala Asn Trp Thr Pro Phe Met Thr Leu Thr Asp Gly50 55 60

Pro Arg Gln Ala Lys Trp Glu Glu Ser Thr Phe Lys Lys Trp Val Glu65 70 75 80

Leu Val Pro Thr Gly His Ala Met Trp Leu Lys Gly Thr Arg Arg Phe

85 90 95

Ala Gln Asn Glu Asp Gly Leu Leu Gly His Trp Tyr Lys Asp Ile Thr

100 105 110

Pro Asn Tyr Arg Pro Leu Pro Ser Ser Glu Cys Pro Pro Gly Ala Ile

115 120 125

Gly Val Thr Tyr Asp Thr Leu Ser Val His Ala Pro Lys Tyr Cys Gln130 135 140

Tyr Leu Ala Arg Glu Leu Gln Lys Leu Gly Ala Thr Phe Glu Arg Arg145 150 155 160

Thr Val Thr Ser Leu Glu Gln Ala Phe Asp Gly Ala Asp Leu Val Val165 170 175

Asn Ala Thr Gly Leu Gly Ala Lys Ser Ile Ala Gly Ile Asp Asp Gln

180 185 190

Ala Ala Glu Pro Ile Arg Gly Gln Thr Val Leu Val Lys Ser Pro Cys

195 200 205

Lys Arg Cys Thr Met Asp Ser Ser Asp Pro Ala Ser Pro Ala Tyr Ile

210 215 220

Ile Pro Arg Pro Gly Gly Glu Val Ile Cys Gly Gly Thr Tyr Gly Val225 230 235 240

Gly Asp Trp Asp Leu Ser Val Asn Pro Glu Thr Val Gln Arg Ile Leu

245 250 255

Lys His Cys Leu Arg Leu Asp Pro Thr Ile Ser Ser Asp Gly Thr Ile

260 265 270

Glu Gly Ile Glu Val Leu Arg His Asn Val Gly Leu Arg Pro Ala Arg

275 280 285

Arg Gly Gly Pro Arg Val Glu Ala Glu Arg Ile Val Leu Pro Leu Asp

290 295 300

Arg Thr Lys Ser Pro Leu Ser Leu Gly Arg Gly Ser Ala Arg Ala Ala305 310 315 320

Lys Glu Lys Glu Val Thr Leu Val His Ala Tyr Gly Phe Ser Ser Ala

325 330 335

Gly Tyr Gln Gln Ser Trp Gly Ala Ala Glu Asp Val Ala Gln Leu Val

340 345 350

Asp Glu Ala Phe Gln Arg Tyr His Gly Ala Ala Arg Glu Ser Lys Leu355 360 365

<210> 5<211> 275<212> DNA<213> Zea mays<220>

<221> promotor<222> (1) .. (275)<223> Promotor central de 275 bp de ubiquitina de Zea mays<220>

<221> misc_signal<222> (61)..(74)

<223> Similar ao elemento de choque térmico consenso<220>

<221> misc_signal<222> (71). . (84)

<223> Similar ao elemento de choque térmico consenso<220>

<221> sinal_TATA<222> (246) .. (254)<223> TATA Box<400> 5

aaccagcagc gtcgcgtcggctggacccct ctcgagagttaattgcgtgg cggagcggcacggcaccggc agctacggggcgccgtaata aatagacacc<210> 6<211> 1988<212> DNA<213> Zea mays<220>

<221> promotor<222> (1)..(1988)<223> Região do promotor de ubiquitina de iüea mays com s ■ υτκ e<220>

<221> promotor<222> (1) . . (899)

<223> Região do promotor de ubiquitina de Zea mays<220>

gccaagcgaa gcagacggca cggcatctct gtcgctgcct 60

ccgctccacc gttggacttg ctccgctgtc ggcatccaga 120

gacgtgagcc ggcacggcag gcggcctcct cctcctctca 180

gattcctttc ccaccgctcc ttcgctttcc cttcctcgcc 240

ccctccacac cctct 275<221> misc_signal

<222> (685) .. (698)

<223> Similar ao elemento de choque térmico consenso<220>

<221> misc_signal

<222> (695)..(708)

<223> Similar ao elemento de choque térmico consenso<220>

<221> sinal_TATA

<222> (870) . . (878)

<223> TATA Box<220>

<221> 5'UTR

<222> (900)..(1988)

<220>

<221> íntron<222> (983) . . (1988)

<223> íntron do gene de ubiquitina de Zea Mays<400> 6

tgcagtgcag cgtgacccgg tcgtgcccct ctctagagat aatgagcatt gcatgtctaa 60

gttataaaaa attaccacat attttttttg tcacacttgt ttgaagtgca gtttatctat 120

ctttatacat atatttaaac tttactctac gaataatata atctatagta ctacaataat 180

atcagtgttt tagagaatca tataaatgaa cagttagaca tggtctaaag gacaattgag 240

tattttgaca acaggactct acagttttat ctttttagtg tgcatgtgtt ctcctttttt 300

tttgcaaata gcttcaccta tataatactt catccatttt attagtacat ccatttaggg 360

tttagggtta atggttttta tagactaatt.tttttagtac atctatttta ttctatttta 420

gcctctaaat taagaaaact aaaactctat tttagttttt ttatttaata gtttagatat 480

aaaatagaat aaaataaagt gactaaaaat taaacaaata ccctttaaga aattaaaaaa 540

actaaggaaa catttttctt gtttcgagta gataatgcca gcctgttaaa cgccgtcgac 600

gagtctaacg gacaccaacc agcgaaccag cagcgtcgcg tcgggccaag cgaagcagac 660

ggcacggcat ctctgtcgct gcctctggac ccctctcgag agttccgctc caccgttgga 720

cttgctccgc tgtcggcatc cagaaattgc gtggcggagc ggcagacgtg agccggcacg 780gcaggcggcc tcctcctcct ctcacggcac cggcagctac gggggattcc tttcccaccg 840 ctccttcgct ttcccttcct cgcccgccgt aataaataga çaccccctcc acaccctctt 900 tccccaacct cgtgttgttc ggagcgcaca cacacacaac cagatctccc ccaaatccac 960 ccgtcggcac ctccgcttca aggtacgccg ctcgtcctcc cccccccccc ccctctctac 1020 cttctctaga tcggcgttcc ggtccatggt tagggcccgg tagttctact tctgttcatg 1080 tttgtgttag atccgtgttt gtgttagatc cgtgctgcta gcgttcgtac acggatgcga 1140 cctgtacgtc agacacgttc tgattgctaa cttgccagtg tttctctttg gggaatcctg 1200 ggatggctct agccgttccg cagacgggat cgatttcatg attttttttg tttcgttgca 1260 tagggtttgg tttgcccttt tcctttattt caatatatgc cgtgcacttg tttgtcgggt 1320 catcttttca tgcttttttt tgtcttggtt gtgatgatgt ggtctggttg ggcggtcgtt 1380 ctagatcgga gtagaattct gtttcaaact acctggtgga tttattaatt ttggatctgt 1440 atgtgtgtgc catacatatt catagttacg aattgaagat gatggatgga aatatcgatc 1500 taggataggt atacatgttg atgcgggttt tactgatgca tatacagaga tgctttttgt 1560 tcgcttggtt gtgatgatgt ggtgtggttg ggcggtcgtt cattcgttct agatcggagt 1620 agaatactgt ttcaaactac ctggtgtatt tattaatttt ggaactgtat gtgtgtgtca 1680 tacatcttca tagttacgag tttaagatgg atggaaatat cgatctagga taggtataca 1740 tgttgatgtg ggttttactg atgcatatac atgatggcat atgcagcatc tattcatatg 1800 ctctaacctt gagtacctat ctattataat aaacaagtat gttttataat tatttcgatc 1860 ttgatatact tggatgatgg catatgcagc agctatatgt ggattttttt agccctgcct 1920 tcatacgcta tttatttgct tggtactgtt tcttttgtcg atgctcaccc tgttgtttgg 1980

<210> 7

<211> 275

<212> DNA

<213> Vírus baciliforme de cana-de-açúcar<220>

<221> promotor

<222> (1) . . (275)

<223> Promotor central de 275 bp do vírus baciliforme de cana-de-açúcar

<220>

<221> sinal_TATA

<222> (224) . . (243)<223> TATA Box<400> 7

gattgaggag gcattgacgt cagggatgac cgcagcggag agtactgggc ccattcagtg 60gatgctccac tgagttgtat tattgtgtgc ttttcggaca agtgtgctgt ccactttctt 120ttggcacctg tgccacttta ttccttgtct gccacgatgc ctttgcttag cttgtaagca 180aggatcgcag tgcgtgtgtg acaccacccc ccttccgacg ctctgcctat ataaggcacc 240gtctgtaagc tcttacgatc atcggtagtt cacca 275

<210> 8<211> 1398<212> DNA

<213> Vírus baciliforme de cana-de-açúcar<220>

<221> promotor<222> (1) .. (1398)<223> Região do promotor do vírus baciliforme de cana-de-açúcar<220>

<221> Região de sinal<222> (98) .. (118)<223> Fator de choque térmico<220>

<221> Região de sinal<222> (365)..(385)<223> Fator de choque térmico<220>

<221> Região de sinal<222> (606)..(626)<223> Fator de choque térmico<220>

<221> Região de sinal<222> (705) . . (719)

<223> Elemento de choque térmico<220><221> sinal TATA

<222> (1345)..(1364) <223> TATA L Box <4 00> 8 aatcctggct agcaacactg aactatgcca gaaaccacat caaagatatg ggcaagcttc 60 ttggcccatt atatccaaag acctcagaga aaggtgagcg aaggctcaat tcagaagatt 120 ggaagctgat caataggatc aagacaatgg tgagaacgct tccaaatctc actattccac 180 cagaagatgc atacattatc attgaaacag atgcatgtgc aactggatgg ggagcagtat 240 gcaagtggaa gaaaaacaag gcagacccaa gaaatacaga gcaaatctgt aggtatgcca 300 gtggaaaatt tgataagcca aaaggaacct gtgatgcaga aatctatggg gttatgaatg 360 gcttagaaaa gatgagattg ttctacttgg acaaaagaga gatcacagtc agaactgaca 420 gtagtgcaat cgaaaggttc tacaacaaga gtgctgaaca caagccttct gagatcagat 480 ggatcaggtt catggactac atcactggtg caggaccaga gatagtcatt gaacacataa 540 aagggaagag caatggttta gctgacatct tgtccaggct caaagccaaa ttagctcaga 600 atgaaccaac ggaagagatg atcctgctta cacaagccat aagggaagta attccttatc 660 cagatcatcc atacactgag caactcagag aatggggaaa caaaattctg gatccattcc 720 ccacattcaa gaaggacatg ttcgaaagaa cagagcaagc ttttatgcta acagaggaac 780 cagttctact ctgtgcatgc aggaagcctg caattcagtt agtgtccaga acatctgcca 840 acccaggaag gaaattcttc aagtgcgcaa tgaacaaatg ccattgctgg tactgggcag 900 atctcattga agaacacatt caagacagaa ttgatgaatt tctcaagaat cttgaagttc 960 tgaagaccgg tggcgtgcaa acaatggagg aggaacttat gaaggaagtc accaagctga 1020 agatagaaga gcaggagttc gaggaatacc aggccacacc aagggctatg tcgccagtag 1080 ccgcagaaga tgtgctagat ctccaagacg taagcaatga cgattgagga ggcattgacg 1140 tcagggatga ccgcagcgga gagtactggg cccattcagt ggatgctcca ctgagttgta 1200 ttattgtgtg cttttcggac aagtgtgctg tccactttct tttggcacct gtgccacttt 1260 attccttgtc tgccacgatg cctttgctta gcttgtaagc aaggatcgca gtgcgtgtgt 1320 gacaccaccc cccttccgac gctctgccta tataaggcac cgtctgtaag ctcttacgat 1380 catcggtagt tcaccaag 1398

<210> 9

<211> 5035

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Vetor binário RLM175 derivado de pSBll<220>

<221> Região estrutural

<222> (5)..(132)

<223> Borda esquerda de T-DNA de pSBll<220>

<221> Região de ligação

<222> (51)..(75)

<223> Região de repetição da borda esquerda de T-DNA de pSBl<220>

<221> Região estrutural

<222> (232)..(376)

<223> Borda direita de T-DNA de pSBll<220>

<221> Região de ligação

<222> (272)..(295)

<223> Região de repetição da borda direita de T-DNA de pSBl<220>

<221> Região estrutural

<222> (777) . . (3511)

<223> Alvo dè recombinação de pSBl<220>

<221> Origem de replicação

<222> (2654) .. (2934)

<223> Origem de replicação ColEI de pSBll<220>

<221> misc_feature

<222> (3074) .. (3334)

<223> Sitio ColEI BOM de pSBll

<220>

<221> misc feature<222> (3793)..(4608)

<223> cds que codifica ο gene de se;

<400> 9

agtggtgatt ttgtgccgag ctgccggtcgtattgtggtg taaacaaatt gacgcttagaatgtactgaa ttggatccgc ccgggcggtacgtaccggtt aattaatcta gaggcgcgccttcccgcctt cagtttaaac tatcagtgttagaaaagagc gtttattaga ataatcggattcgtccattt gtatgtgcat gccaaccacatgcgataatg acttctgttc aaccacccaatccaaaaaga tcccttggct cgtctgggtctgatccctca acgcggtcgc ggacgtagcggacgctgtcg aaaagcgtga tctgcttgtccacgcgccaa agttccgtca caggatgatcccgggtctgt ggcgggaact ccacgaaaatcttgaagacg aaagggcctc gtgatacgcctggtttctta gacgtcaggt ggcacttttctatttttcta aatacattca aatatgtatcttcaataata ttgaaaaagg aagagtatgaccttttttgc ggcattttgc cttcctgtttaagatgctga agatcagttg ggtgcacgaggtaagatcct tgagagtttt cgccccgaagttctgctatg tggcgcggta ,ttatcccgtggcatacacta ttctcagaat gacttggttgcggatggcat gacagtaaga gaattatgcacggccaactt acttctgaca acgatcggagacatggggga tcatgtaact cgccttgatccaaacgacga gcgtgacacc acgatgccgggtattcagtg tcgctgattt gtattgtctgcaattaatac gatacctgcg tcataattgaacgttgtgat atgtagatga taatcattat

eção de resistência à canamicina de Tn903

gggagctgtt ggctggctgg tggcaggata 60

caacttaata acacattgcg gacgttttta 120

ccgaattcgc ggccgcaagc ttgtacaacg 180

gggcccggcc ggccagatct tgattgtcgt 240

tgacaggata tattggcggg taaacctaag 300

atttaaaagg gcgtgaaaag gtttatccgt 360

gggttcccct cgggagtgct tggcattccg 420

acgtcggaaa gcctgacgac ggagcagcat 4 80

ggctagaagg tcgagtgggc tgctgtggct 54 0

cagcgccgaa aaatcctcga tcgcaaatcc 600

gctctttcgg ccgacgtcct ggccagtcat 660

tggcgcgagt tgctggatct cgccttcaat 720

atccgaacgc agcaagatcg tcgaccaatt 780

tatttttata ggttaatgtc atgataataa 840

ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt 900

cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc 960

gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc 1020

ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa 1080

tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg 1140

aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag 1200

ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc 12 60

agtactcacc agtcacagaa aagcatctta 1320

gtgctgccat aaccatgagt gataacactg 1380

gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca 1440

gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac 1500

gggggggggg gggggacatg aggttgcccc 1560

aagttgtttt tacgttaagt tgatgcagat 1620

ttatttgacg tggtttgatg gcctccacgc 1680

cactttacgg gtcctttccg gtgatccgac 1740aggttacggg gcggcgacct cgcgggttttcgtttccgtt cttcttcgtc ataacttaataggaaacgac aggtgctgaa agcgagcttttgtccgtgga atgaacaatg gaaccccccctgcgcaaact attaactggc gaactacttaggatggaggc ggataaagtt gcaggaccacttattgctga taaatctgga gccggtgagcggccagatgg taagccctcc cgtatcgtagtggatgaacg aaatagacag atcgctgagatgtcagacca agtttactca tatatactttaaaggatcta ggtgaagatc ctttttgatatttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtagtttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaagtttgccgga tcaagagcta ccaactctttagataccaaa tactgtcctt ctagtgtagctagcaccgcc tacatacctc gctctgctaaataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaacgggctgaac ggggggttcg tgcacacagctgagatacct acagcgtgag ctatgagaaaacaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaagaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcgttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcctacggttcct ggccttttgc tggccttttgattctgtgga taaccgtatt accgcctttgcgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgaggtccttacgca tctgtgcggt atttcacaccctgatgccgc atagttaagc cagtatacactgcgccccga cacccgccaa cacccgctgaatccgcttac agacaagctg tgaccgtctcgtcatcaccg aaacgcgcga ggcagcagatctacaataga catcgagccg gaaggtgatgggccagtttt tacccaagac ttcgcctcta

cgctatttat gaaaattttc cggtttaagg 1800

gtttttattt aaaataccct ctgaaaagaa 1860

ttggcctctg tcgtttcctt tctctgtttt 1920

cccccccccc tgcagcaatg gcaacaacgt 1980

ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact 2040

ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt 2100

gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg 2160

ttatctacac gacggggagt caggcaacta 2220

taggtgcctc actgattaag cattggtaac 2280

agattgattt aaaacttcat rtttaattta 2340

atctcatgac caaaatccct taacgtgagt 2400

aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt 24 60

caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt ZSZU

ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc 2580

cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg 2640

tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg 2700

gacgatagtt accggataag gcgcagcggt 27 60

ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac 2820

gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg 2880

caggagagcg cacgagggag cttccagggg 2940

ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat 3000

tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt 3060

ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg 3120

agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa 3180

aagcggaaga gcgcctgatg cggtattttc 3240

gcatatggtg cactctcagt acaatctgct 3300

tccgctatcg ctacgtgact gggtcatggc 3360

cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc 3420

cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc 3480

cccccgatca agtagataca ctacatatat 3540

tttactttcc tgaaatcccc agcaatttta 3600

acataaatta tagttaccaa atctggcaaa 3660agggttgacc gggggggggg ggaaagccac

gcacaagata aaaatatatc atcatgaaca

acaaggggtg ttatgagcca tattcaacgg

tccaacatgg atgctgattt atatgggtat

ggtgcgacaa tctatcgatt gtatgggaag

ggcaaaggta gcgttgccaa tgatgttaca

gaatttatgc ctcttccgac catcaagcat

ctcaccactg cgatccccgg gaaaacagca

ggtgaaaata ttgttgatgc gctggcagtg

tgtaattgtc cttttaacag cgatcgcgta

aataacggtt tggttgatgc gagtgatttt

caagtctgga aagaaatgca taagcttttg

yyLyQULLUL CclCLLyclLacl CC L CdL CCCC

gttggacgag tcggaatcgc agaccgatac

ggtgagtttt ctccttcatt acagaaacgg

gatatgaata aattgcagtt tcatttgatg

aattggttgt aacactggca gagcattacg

taaatcgaac ttttgctgag ttgaaggatc

gttccgtggc aaagcaaaag ttcaaaatca

tcaaccgtgg ctccctcact ttctggctgg

caacgctctg tcatcgttac aatcaacatg

acccggcagc ttagttgccg ttcttccgaa

ccttacaacg gctctcccgc tgacgccgtc<210> 10<211> 4503

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Região de T-DNA de RLM151,contendo uiti cassete de seJ

gttgtgtctc aaaatctctg atgttacatt 3720ataaaactgt ctgcttacat aaacagtaat 3780gaaacgtctt gctcgaggcc gcgattaaat 3840aaatgggctc gcgataatgt cgggcaatca 3900cccgatgcgc cagagttgtt tctgaaacat 3960gatgagatgg tcagactaaa ctggctgacg 4020tttatccgta ctcctgatga tgcatggtta 4080ttccaggtat tagaagaata tcctgattca 4140ttcctgcgcc ggttgcattc gattcctgtt 4200tttogtctcg ctcaggcgca atcacgaatg 4260gatgacgagc gtaatggctg gcctgttgaa 4320ccattctcac cggattcagt cgtcactcat 4380gacgagggga aaccaacagg ttgtattgat 4 4 4 Ucaggatcttg ccatcctatg gaactgcctc 4500ctttttcaaa aatatggtat tgataatcct 4560ctcgatgagt ttttctaatc agaattggtt 4620ctgacttgac gggacggcgg ctttgttgaa 4680agatcacgca tcttcccgac aacgcagacc 4740ccaactggtc cacctacaac aaagctctca 4800atgatggggc gattcaggga tcacaggcag 4860ctaccctccg cgagatcatc cgtgtttcaa 4920tagcatcggt aacatgagca aagtctgccg 4980ccggactgat gggctgcctg tatcg 5035

um vetor binário do tipo RLM175-

<220><221>

Região estrutural<222> (1) . . (128)

<223> Borda esquerda de T-DNA de pSBll<220>

<221> Região de ligação

<222> (47) .. (71)

<223> Left T-DNA border. repeat from pSBll<220>

<221> promotor

<222> (162)..(2149)

<223> Região do promotor de ubiquitina de Zea mays including intron<220>

<221> intron

<-ΔΔΔ> 1J.J.44) . . UHb))

<223> íntron de ubiquitina de Zea Mays MubGl<220>

<221> CDS

<222> (2192)..(3520)

<223> CDS de D-serina desaminase de E. coli [dsdA]<220>

<221> terminador

<222> (3562)..(4270)

<223> Região do terminador de octapina sintase de Agrobacterium tumefaciens<220>

<221> Região estrutural

<222> (4359)..(4503)

<223> Borda direita de T-DNA de pSBll<220>

<221> Região de ligação

<222> (4399) .. (4422)

<223> Região direita de T-DNA de pSBll

<400> 10gtgattttgt gccgagctgc cggtcggggagtggtgtaaa caaattgacg cttagacaacactgaattgg atccgcccgg gcggtaccaagtcgtgcccc tctctagaga taatgagcattatttttttt gtcacacttg tttgaagtgcctttactcta cgaataatat aatctatagtatataaatga acagttagac atggtctaaatacagtttta tctttttagt gtgcatgtgtatataatact tcatccattt tattagtacaatagactaat ttttttagta catctatttttaaaactcta ttttagtttt tttatttaattgactaaaaa ttaaacaaat accctttaagtgtttcgagt agataatgcc agcctgttaacagcgaacca gcagcgtcgc gtcgggccaatgcctctgga cccctctcga gagttccgctccagaaattg cgtggcggag cggcagacgttctcacggca ccggcagcta cgggggattctcgcccgccg taataaatag acaccccctccggagcgcac acacacacaa ccagatctccaaggtacgcc gctcgtcctc cccccccccccggtccatgg ttagggcccg gtagttctactgtgttagat ccgtgctgct agcgttcgtactgattgcta acttgccagt gtttctctttgcagacggga tcgatttcat gattttttttttcctttatt tcaatatatg ccgtgcacttttgtcttggt tgtgatgatg tggtctggtttgtttcaaac tacctggtgg atttattaattcatagttac gaattgaaga tgatggatgggatgcgggtt ttactgatgc atatacagagtggtgtggtt gggcggtcgt tcattcgttccctggtgtat ttattaattt tggaactgtagtttaagatg gatggaaata tcgatctagg

gctgttggct ggctggtggc aggatatatt 60

ttaataacac attgcggacg tttttaatgt 120gcttccgcgg ctgcagtgca gcgtgacccg 180

tgcatgtcta agttataaaa aattaccaca 24 0

agtttatcta tctttataca tatatttaaa 300

actacaataa tatcagtgtt ttagagaatc 360

ggacaattga gtattttgac aacaggactc 420

tctccttttt ttttgcaaat agcttcacct 480

tccatttagg gtttagggtt aatggttttt 540

attctatttt agcctctaaa ttaagaaaac 600

agtttagata taaaatagaa taaaataaag 660

aaattaaaaa aactaaggaa acatttttct 720

acgccgtcga cgagtctaac ggacaccaac 780

gcgaagcaga cggcacggca tctctgtcgc 840

ccaccgttgg acttgctccg ctgtcggcat 900

gagccggcac ggcaggcggc ctcctcctcc 960

ctttcccacc gctccttcgc tttcccttcc 1020

cacaccctct ttccccaacc tcgtgttgtt 1080

cccaaatcca cccgtcggca cctccgcttc 1140

cccctctcta ccttctctag atcggcgttc 1200

ttctgttcat gtttgtgtta gatccgtgtt 1260

cacggatgcg acctgtacgt cagacacgtt 1320

ggggaatcct gggatggctc tagccgttcc 1380

gtttcgttgc atagggtttg gtttgccctt 1440

gtttgtcggg tcatcttttc atgctttttt 1500

gggcggtcgt tctagatcgg agtagaattc 1560

tttggatctg tatgtgtgtg ccatacatat 1620

aaatatcgat ctaggatagg tatacatgtt 1680

atgctttttg ttcgcttggt tgtgatgatg 1740

tagatcggag tagaatactg tttcaaacta 1800

tgtgtgtgtc atacatcttc atagttacga 1860

ataggtatac atgttgatgt gggttttact 1920gatgcatata catgatggca tatgcagcat ctattcatat gctctaacct tgagtaccta 1980

tctattataa taaacaagta tgttttataa ttatttcgat cttgatatac ttggatgatg. 2040

gcatatgcag cagctatatg tggatttttt tagccctgcc ttcatacgct atttatttgc 2100

ttggtactgt ttcttttgtc gatgctcacc ctgttgtttg gtgttacttc tgcagggtac 2160

ggatcctcat ctaagcgcaa agagacgtac t atg gaa aac gct aaa atg aac 2212

Met Glu Asn Ala Lys Met Asn1 5

tcg ctc ate gcc cag tat ccg ttg gta aag gat ctg gtt gct ctt aaa 2260

Ser Leu Ile Ala Gln Tyr Pro Leu Val Lys Asp Leu Val Ala Leu Lys

10 15 20

gaa acc acc tgg ttt aat cct ggc acg acc tca ttg gct gaa ggt tta 2308

Glu Thr Thr Trp Phe Asn Pro Gly Thr Thr Ser Leu Ala Glu Gly Leu

Su 35

cct tat gtt ggc ctg acc gaa cag gat gtt cag gac gcc cat gcg cgc 2356

Pro Tyr Val Gly Leu Thr Glu Gln Asp Val Gln Asp Ala His Ala Arg40 45 50 55

tta tcc cgt ttt gea ccc tat ctg gea aaa gea ttt cct gaa act gct 2404

Leu Ser Arg Phe Ala Pro Tyr Leu Ala Lys Ala Phe Pro Glu Thr Ala60 65 70

gcc act ggg ggg att att gaa tca gaa ctg gtt gcc att cca gct atg 2452

Ala Thr Gly Gly Ile Ile Glu Ser Glu Leu Val Ala Ile Pro Ala Met

75 80 85

caa aaa cgg ctg gaa aaa gaa tat cag caa ccg ate age ggg caa ctg 2500

Gln Lys Arg Leu Glu Lys Glu Tyr Gln Gln Pro Ile Ser Gly Gln Leu90 95 100

tta ctg aaa aaa gat age cat ttg ccc att tcc ggc tcc ata aaa gea 2548

Leu Leu Lys Lys Asp Ser His Leu Pro Ile Ser Gly Ser Ile Lys Ala

105 110 115

cgc ggc ggg att tat gaa gtc ctg gea cac gea gaa aaa ctg gct ctg 2596

Arg Gly Gly Ile Tyr Glu Val Leu Ala His Ala Glu Lys Leu Ala Leu120 125 130 135

gaa gcg ggg ttg ctg acg ctt gat gat gac tac age aaa ctg ctt tet 2644Glu Ala Gly Leu Leu Thr Leu Asp Asp Asp Tyr Ser Lys Leu Leu Ser

140 145 150

ccg gag ttt aaa cag ttc ttt age caa tac age att gct gtg ggc tca 2692

Pro Glu Phe Lys Gln Phe Phe Ser Gln Tyr Ser Ile Ala Val Gly Ser155 160 165

acc gga aat ctg ggg tta tca ate ggc att atg age gcc cgc att ggc 2740Thr Gly Asn Leu Gly Leu Ser Ile Gly Ile Met Ser Ala Arg Ile Gly

170 175 180

ttt aag gtg aca gtt cat atg tet gct gat gcc cgg gea tgg aaa aaa 2788Phe Lys Val Thr Val His Met Ser Ala Asp Ala Arg Ala Trp Lys Lys185 190 195

gcg aaa ctg cgc age cat ggc gtt acg gtc gtg gaa tat gag caa gat 2836Ala Lys Leu Arg Ser His Gly Val Thr Val Val Glu Tyr Glu Gln Asp200 205 210 215

tat ggt gtt gcc gtc gag gaa gga cgt aaa gea gcg cag tet gac ccg 2884Tyr Gly Val Ala Val Glu Glu Gly Arg Lys Ala Ala Gln Ser Asp Pro

220 225 230

aac tgt ttc ttt att gat gac gaa aat tcc cgc acg ttg ttc ctt ggg 2932

Asn Cys Phe Phe Ile Asp Asp Glu Asn Ser Arg Thr Leu Phe Leu Gly235 240 245

tat tcc gtc gct ggc cag cgt ctt aaa gcg caa ttt gcc cag caa ggc 2980Tyr Ser Val Ala Gly Gln Arg Leu Lys Ala Gln Phe Ala Gln Gln Gly

250 255 260

cgt ate gtc gat gct gat aac cct ctg ttt gtc tat ctg ccg tgt ggt 3028Arg Ile Val Asp Ala Asp Asn Pro Leu Phe Val Tyr Leu Pro Cys Gly265 270 275

gtt ggc ggt ggt cct ggt ggc gtc gea ttc ggg ctt aaa ctg gcg ttt 307 6Val Gly Gly Gly Pro Gly Gly Val Ala Phe Gly Leu Lys Leu Ala Phe280 285 290 295

ggc gat cat gtt cac tgc ttt ttt gcc gaa cca acg cac tcc cct tgt 3124Gly Asp His Val His Cys Phe Phe Ala Glu Pro Thr His Ser Pro Cys300 305 310atg ttg tta ggc gtc cat aca gga tta cac gat cag att tct gtt cag 3172

Met Leu Leu Gly Val His Thr Gly Leu His Asp Gln Ile Ser Val Gln

315 320 325

gat att ggt ate gac aac ctt acc gea gcg gat ggc ctt gea gtt ggt 3220

Asp Ile Gly Ile Asp Asn Leu Thr Ala Ala Asp Gly Leu Ala Val Gly330 335 340

cgc gea tca ggc ttt gtc ggg cgg gea atg gag cgt ctg ctg gat ggc 3268Arg Ala Ser Gly Phe Val Gly Arg Ala Met Glu Arg Leu Leu Asp Gly345 350 355

ttc tat acc ctt age gat caa acc atg tat gac atg ctt ggc tgg ctg 3316Phe Tyr Thr Leu Ser Asp Gln Thr Met Tyr Asp Met Leu Gly Trp Leu360 365 370 375

gcg cag gaa gaa ggt att cgt ctt gaa cct tcg gea ctg gcg ggt atg 3364

Ala Gln Glu Glu Gly Ile Arg Leu Glu Pro Ser Ala Leu Ala Gly Met 380 385 390

gcc gga cct cag cgc gtg tgt gea tca gta agt tac caa cag atg cac 3412Ala Gly Pro Gln Arg Val Cys Ala Ser Val Ser Tyr Gln Gln Met His

395 400 405

ggt ttc age gea gaa caa ctg cgt aat acc act cat ctg gtg tgg gcg 34 60Gly Phe Ser Ala Glu Gln Leu Arg Asn Thr Thr His Leu Val Trp Ala410 415 420

acg gga ggt gga atg gtg ccg gaa.gaa gag atg aat caa tat ctg gea 3508Thr Gly Gly Gly Met Val Pro Glu Glu Glu Met Asn Gln Tyr Leu Ala425 430 435

aaa ggc cgt taa taacgtttca acgcagcatg gatcgtaccg agctcaatcg 3560

Lys Gly Arg440

atcctgcttt aatgagatat gcgagacgcc tatgatcgca tgatatttgc tttcaattct 3620gttgtgcacg ttgtaaaaaa cctgagcatg tgtagctcag atccttaccg ccggtttcgg 3680ttcattctaa tgaatatatc acccgttact atcgtatttt tatgaataat attctccgtt 3740caatttactg attgtaccct actacttata tgtacaatat taaaatgaaa acaatatatt 3800gtgctgaata ggtttatagc gacatctatg atagagcgcc acaataacaa acaattgcgt 3860tttattatta caaatccaat tttaaaaaaa gcggcagaac cggtcaaacc taaaagactg 3920attacataaa tcttattcaa atttcaaaag tgccccaggg gctagtatct acgacacacc 3980gagcggcgaa ctaataacgc tcactgaagg gaactccggt tccccgccgg cgcgcatggg 4040tgagattcct tgaagttgag tattggccgt ccgctctacc gaaagttacg ggcaccattc 4100aacccggtcc agcacggcgg ccgggtaacc gacttgctgc cccgagaatt atgcagcatt 4160tttttggtgt atgtgggccc caaatgaagt gcaggtcaaa ccttgacagt gacgacaaat 4220cgttgggcgg gtccagggcg aattttgcga caacatgtcg aggctcagca ggatgggccc 4280aggtacagaa ttcgcggccg tacaacgcgt accggttaat taatctagag gcgcgccggg 4340cccggccggc cagatcttga ttgtcgtttc ccgccttcag tttaaactat cagtgtttga 4400caggatatat tggcgggtaa acctaagaga aaagagcgtt tattagaata atcggatatt 4 4 60taaaagggcg tgaaaaggtt tatccgttcg tccatttgta tgt 4503

<210> 11<211> 442<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Construto sintético<4 00> 11

Met Glu Asn Ala Lys Met Asn Ser Leu Ile Ala Gln Tyr Pro Leu Val

1 5 10 15

Lys Asp Leu Val Ala Leu Lys Glu Thr Thr Trp Phe Asn Pro Gly Thr

20 25 30

Thr Ser Leu Ala Glu Gly Leu Pro Tyr Val Gly Leu Thr Glu Gln Asp35 40 45

Val Gln Asp Ala His Ala Arg Leu Ser Arg Phe Ala Pro Tyr Leu Ala50 55 60

Lys Ala Phe Pro Glu Thr Ala Ala Thr Gly Gly Ile Ile Glu Ser Glu65 70 75 80

Leu Val Ala Ile Pro Ala Met Gln Lys Arg Leu Glu Lys Glu Tyr Gln

85 90 95

Gln Pro Ile Ser Gly Gln Leu Leu Leu Lys Lys Asp Ser His Leu Pro100 105 110Ile Ser Gly Ser Ile Lys Ala Arg Gly Gly Ile Tyr Glu Val Leu Ala

115 120 125

His Ala Glu Lys Leu Ala Leu Glu Ala Gly Leu Leu Thr Leu Asp Asp

130 135 140

Asp Tyr Ser Lys Leu Leu Ser Pro Glu Phe Lys Gln Phe Phe Ser Gln145 150 155 160

Tyr Ser Ile Ala Val Gly Ser Thr Gly Asn Leu Gly Leu Ser Ile Gly

165 170 175

Ile Met Ser Ala Arg Ile Gly Phe Lys Val Thr Val His Met Ser Ala

180 185 190

Asp Ala Arg Ala Trp Lys Lys Ala Lys Leu Arg Ser His Gly Val Thr

195 200 205

Val Val Glu Tyr Glu Gln Asp Tyr Gly Val Ala Val Glu Glu Gly Arg

210 215 220

Lys Ala Ala Gln Ser Asp Pro Asn Cys Phe Phe Ile Asp Asp Glu Asn225 230 235 240

Ser Arg Thr Leu Phe Leu Gly Tyr Ser Val Ala Gly Gln Arg Leu Lys

245 250 255

Ala Gln Phe Ala Gln Gln Gly Arg Ile Val Asp Ala Asp Asn Pro Leu

260 265 270

Phe Val Tyr Leu Pro Cys Gly Val Gly Gly Gly Pro Gly Gly Val Ala

275 280 285

Phe Gly Leu Lys Leu Ala Phe Gly Asp His Val His Cys Phe Phe Ala

290 295 300

Glu Pro Thr His Ser Pro Cys Met Leu Leu Gly Val His Thr Gly Leu305 310 315 320

His Asp Gln Ile Ser Val Gln Asp Ile Gly Ile Asp Asn Leu Thr Ala

325 330 335

Ala Asp Gly Leu Ala Val Gly Arg Ala Ser Gly Phe Val Gly Arg Ala

340 345 350

Met Glu Arg Leu Leu Asp Gly Phe Tyr Thr Leu Ser Asp Gln Thr Met355 360 365Tyr Asp Met Leu370

Pro Ser Ala Leu385

Val Ser Tyr Gln

Thr Thr His Leu420

Glu Met Asn Gln

435<210> 12<211> 4254<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Região de T-DNA de RLM255, um vetor binário do tipoRLM175 contendo um cassete de seleção

<220>

<221> Região estrutural<222> (1) . . (128)

<223> Borda esquerda de T-DNA de pSBll<220>

<221> Região de ligação<222> (47) . . (71)

<223> Região esquerda T-DNA de pSBll<220>

<221> promotor<222> (162) .. (2149)

<223> Região do promotor de ubiquitina de Zea mays com intron<220>

<221> Xntron<222> (1144) .. (2149)

158

Gly Trp Leu Ala Gln Glu Glu Gly Ile Arg Leu Glu

375 380

Ala Gly Met Ala Gly Pro Gln Arg Val Cys Ala Ser390 395 400

Gln Met His Gly Phe Ser Ala Glu Gln Leu Arg Asn405 410 415

Val Trp Ala Thr Gly Gly Gly Met Val Pro Glu Glu

425 430

Tyr Leu Ala Lys Gly Arg

440<223> Zea mays unbiquitin gene íntron MubGl<220>

<221> CDS

<222> (2192) .. (3298)

<223> D-aminoácido oxidase de Rhodosporidium toruloides<220>

<221> terminador

<222> (3327) .. (4035)

<221> Região estrutural

<222> (4110) .. (4254)

<223> Borda direita de T-DNA de pSBll<220>

<222> (4150) .. (4173)

<223> Região direita de T-DNA de pSBll

<400> 12

gtgattttgt gccgagctgc cggtcgggga gctgttggct ggctggtggc aggatatatt 60

gtggtgtaaa caaattgacg cttagacaac ttaataacac attgcggacg tttttaatgt 120

actgaattgg atccgcccgg gcggtaccaa gcttccgcgg ctgcagtgca gcgtgacccg 180

gtcgtgcccc tctctagaga taatgagcat tgcatgtcta agttataaaa aattaccaca 240

tatttttttt gtcacacttg tttgaagtgc agtttatcta tctttataca tatatttaaa 300

ctttactcta cgaataatat aatctatagt actacaataa tatcagtgtt ttagagaatc 360

atataaatga acagttagac atggtctaaa ggacaattga gtattttgac aacaggactc 420

tacagtttta tctttttagt gtgcatgtgt tctccttttt ttttgcaaat agcttcacct 480

atataatact tcatccattt tattagtaca tccatttagg gtttagggtt aatggttttt 540

atagactaat ttttttagta catctatttt attctatttt agcctctaaa ttaagaaaac 600

taaaactcta ttttagtttt tttatttaat agtttagata taaaatagaa taaaataaag 660

tgactaaaaa ttaaacaaat accctttaag aaattaaaaa aactaaggaa acatttttct 720

tgtttcgagt agataatgcc agcctgttaa acgccgtcga cgagtctaac ggacaccaac 780cagcgaacca gcagcgtcgc gtcgggccaatgcctctgga cccctctcga gagttccgctccagaaattg cgtggcggag cggcagacgttctcacggca ccggcagcta cgggggattctcgcccgccg taataaatag acaccccctccggagcgcac acacacacaa ccagatctccaaggtacgcc gctcgtcctc cccccccccccggtccatgg ttagggcccg gtagttctactgtgttagat ccgtgctgct agcgttcgtactgattgcta acttgccagt gtttctctttgcagacggga tcgatttcat gattttttttttcctttatt tcaatatatg ccgtgcacttttgtcttggt tgtgatgatg tggtctggtttgtttcaaac tacctggtgg atttattaattcatagttac gaattgaaga tgatggatgggatgcgggtt ttactgatgc atatacagagtggtgtggtt gggcggtcgt tcattcgttccctggtgtat ttattaattt tggaactgtagtttaagatg gatggaaata tcgatctagggatgcatata catgatggca tatgcagcattctattataa taaacaagta tgttttataagcatatgcag cagctatatg tggattttttttggtactgt ttcttttgtc gatgctcaccggatccggcg cgccactagt cccgggccac

gtt gtc ctc gga tca ggc gtt ateVal Val Leu Gly Ser Gly Val Ile10 15

gct cgg aag ggc tac age gtg catAla Arg Lys Gly Tyr Ser Val His25 30

gcgaagcaga cggcacggca tctctgtcgc 840

ccaccgttgg acttgctccg ctgtcggcat 900

gagccggcac ggcaggcggc ctcctcctcc 960

ctttcccacc gctccttcgc tttcccttcc 1020

cacaccctct ttccccaacc tcgtgttgtt 1080

cccaaatcca cccgtcggca cctccgcttc 1140

cccctctcta ccttctctag atcggcgttc 1200

ttctgttcat gtttgtgtta gatccgtgtt 1260

cacggatgcg acctgtacgt cagacacgtt 1320

ggggaatcct gggatggctc tagccgttcc 1380

gtttcgttgc atagggtttg gtttgccctt 1440

gtttgtcggg tcatcttttc atgctttttt 1500

gggcggtcgt tetagategg agtagaattc 1560

tttggatctg tatgtgtgtg ccatacatat 1620

aaatatcgat ctaggatagg tatacatgtt 1680

atgctttttg ttcgcttggt tgtgatgatg 1740

tagatcggag tagaatactg tttcaaacta 1800

tgtgtgtgtc atacatcttc atagttacga 1860

ataggtatac atgttgatgt gggttttact 1920

etatteatat gctctaacct tgagtaccta 1980

ttatttcgat cttgatatac ttggatgatg 2040

tagccctgcc ttcatacgct atttatttgc 2100

ctgttgtttg gtgttacttc tgcagggtac 2160

c atg cac tcg cag aag cgc gtc 2212Met His Ser Gln Lys Arg Val1 5

ggt ctg age age gcc ctc ate ctc 2260Gly Leu Ser Ser Ala Leu Ile Leu20

att ctc gcg cgc gac ttg ccg gag 2308Ile Leu Ala Arg Asp Leu Pro Glu35gac gtc tcg ageAsp Val Ser Ser40

acg cct ttc atgThr Pro Phe Met

gaa tcg act ttcGlu Ser Thr Phe75

atg tgg ctc aagMet Trp Leu Lys90

ctc ggg cac tggLeu Gly His Trp105

tet tcc gaa tgtSer Ser Glu Cys120

tcc gtc cac geaSer Val His Ala

aag ctc ggc gcgLys Leu Gly Ala155

gcg ttc gac ggtAla Phe Asp Gly170

aag tcg att gcgLys Ser Ile Ala185

caa acc gtc ctcGln Thr Val Leu

cag act ttc gctGln Thr Phe Ala45

acg ctt aca gacThr Leu Thr Asp60

aag aag tgg gtcLys Lys Trp Val

ggg acg agg cggGly Thr Arg Arg95

tac aag gac ateTyr Lys Asp Ile110

cca cct ggc gctPro Pro Gly Ala125

cca aag tac tgcPro Lys Tyr Cys140

acg ttt gag agaThr Phe Glu Arg

gcg gat ttg gtgAla Asp Leu Val175

ggc ate gac gacGly Ile Asp Asp190

gtc aag tcc ccaVal Lys Ser Pro

tca cca tgg gctSer Pro Trp Ala50

ggt cct cga caaGly Pro Arg Gln65

gag ttg gtc ccgGlu Leu Val Pro80

ttc gcg cag aacPhe Ala Gln Asn

acg cca aat tacThr Pro Asn Tyr115

ate ggc gta accIle Gly Val Thr130

cag tac ctt geaGln Tyr Leu Ala145

cgg acc gtt acgArg Thr Val Thr160

gtc aac gct acgVal Asn Ala Thr

caa gcc gcc gagGln Ala Ala Glu195

tgc aag cga tgcCys Lys Arg Cys

ggc gcg aat tggGly Ala Asn Trp55

gea aaa tgg gaaAla Lys Trp Glu70

acg ggc cat gccThr Gly His Ala85

gaa gac ggc ttgGlu Asp Gly Leu100

cgc ccc ctc ccaArg Pro Leu Pro

tac gac acc ctcTyr Asp Thr Leu135

aga gag ctg cagArg Glu Leu Gln150

tcg ctt gag cagSer Leu Glu Gln165

gga ctt ggc gccGly Leu Gly Ala180

cca ate cgc gggPro Ile Arg Gly

acg atg gac tcgThr Met Asp Ser200 205 210 215

tcc gac ccc gct tct ccc gcc tac ate att ccc cga cca ggt ggc gaa 2884

Ser Asp Pro Ala Ser Pro Ala Tyr Ile Ile Pro Arg Pro Gly Gly Glu220 225 230

gtc ate tgc ggc ggg acg tac ggc gtg gga gac tgg gac ttg tct gtc 2932Val Ile Cys Gly Gly Thr Tyr Gly Val Gly Asp Trp Asp Leu Ser Val

235 240 245

aac cca gag acg gtc cag cgg ate ctc aag cac tgc ttg cgc ctc gac 2980Asn Pro Glu Thr Val Gln Arg Ile Leu Lys His Cys Leu Arg Leu Asp250 255 260

ccg acc ate tcg age gac gga acg ate gaa ggc ate gag gtc ctc cgc 3028Pro Thr Ile Ser Ser Asp Gly Thr Ile Glu Gly Ile Glu Val Leu Arg

265 270 275

cac aac gtc ggc ttg cga cct gea cga cga ggc gga ccc cgc gtt gag 307 6His Asn Val Gly Leu Arg Pro Ala Arg Arg Gly Gly Pro Arg Val Glu280 285 290 295

gea gaa cgg ate gtc ctg cct ctc gac cgg aca aag tcg ccc ctc tcg 3124

Ala Glu Arg Ile Val Leu Pro Leu Asp Arg Thr Lys Ser Pro Leu Ser300 305 310

ctc ggc agg ggc age gea cga gcg gcg aag gag aag gag gtc acg ctt 3172Leu Gly Arg Gly Ser Ala Arg Ala Ala Lys Glu Lys Glu Val Thr Leu

315 320 325

gtg cat gcg tat ggc ttc tcg agt gcg gga tac cag cag agt tgg ggc 3220

Val His Ala Tyr Gly Phe Ser Ser Ala Gly Tyr Gln Gln Ser Trp Gly330 335 340

gcg gcg gag gat gtc gcg cag ctc gtc gac gag gcg ttc cag cgg tac 3268Ala Ala Glu Asp Val Ala Gln Leu Val Asp Glu Ala Phe Gln Arg Tyr

345 350 355

cac ggc gcg gcg cgg gag tcg aag ttg tag ggcgggattc ctgcaggagc 3318

His Gly Ala Ala Arg Glu Ser Lys Leu360 365

tcaatcgatc ctgctttaat gagatatgcg agacgcctat gatcgcatga tatttgcttt 3378caattctgtt gtgcacgttg taaaaaacct gagcatgtgt agctcagatc cttaccgccg 3438gtttcggttc attctaatga atatatcacc cgttactatc gtatttttat gaataatatt 34 98ctccgttcaa tttactgatt gtaccctact acttatatgt acaatattaa aatgaaaaca 3558atatattgtg ctgaataggt ttatagcgac atctatgata gagcgccaca ataacaaaca 3618attgcgtttt attattacaa atccaatttt aaaaaaagcg gcagaaccgg tcaaacctaa 3678aagactgatt acataaatct tattcaaatt tcaaaagtgc cccaggggct agtatctacg 3738acacaccgag cggcgaacta ataacgctca ctgaagggaa ctccggttcc ccgccggcgc 37 98gcatgggtga gattccttga agttgagtat tggccgtccg ctctaccgaa agttacgggc 3858accattcaac ccggtccagc acggcggccg ggtaaccgac ttgctgcccc gagaattatg 3918cagcattttt ttggtgtatg tgggccccaa atgaagtgca ggtcaaacct tgacagtgac 3978gacaaatcgt tgggcgggtc cagggcgaat tttgcgacaa catgtcgagg ctcagcagga 4 038tgggcccagg tacagaattc gcggccgctt aattaatcta gaggcgcgcc gggcccggcc 4098ggccagatct tgattgtcgt ttcccgcctt cagtttaaac tatcagtgtt tgacaggata 4158tattggcggg taaacctaag agaaaagagc gtttattaga ataatcggat atttaaaagg 4218gcgtgaaaag gtttatccgt tcgtccattt gtatgt 4254

<210> 13<211> 368<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Construto sintético<400> 13

Met His Ser Gln Lys Arg Val Val Val Leu Gly Ser Gly Val Ile Gly1 5 10 15

Leu Ser Ser Ala Leu Ile Leu Ala Arg Lys Gly Tyr Ser Val His Ile20 25 30

Leu Ala Arg Asp Leu Pro Glu Asp Val Ser Ser Gln Thr Phe Ala Ser

35 40 45

Pro Trp Ala Gly Ala Asn Trp Thr Pro Phe Met Thr Leu Thr Asp Gly

30 50 55 60

Pro Arg Gln Ala Lys Trp Glu Glu Ser Thr Phe Lys Lys Trp Val Glu65 70 75 80Leu Val Pro Thr Gly His Ala Met Trp Leu Lys Gly Thr Arg Arg Phe

85 90 95

Ala Gln Asn Glu Asp Gly Leu Leu Gly His Trp Tyr Lys Asp Ile Thr

100 105 110

Pro Asn Tyr Arg Pro Leu Pro Ser Ser Glu Cys Pro Pro Gly Ala Ile

115 120 125

Gly Val Thr Tyr Asp Thr Leu Ser Val His Ala Pro Lys Tyr Cys Gln

130 135 140

Tyr Leu Ala Arg Glu Leu Gln Lys Leu Gly Ala Thr Phe Glu Arg Arg145 150 155 160

Thr Val Thr Ser Leu Glu Gln Ala Phe Asp Gly Ala Asp Leu Val Val

165 170 175

Asn Ala Thr Gly Leu Gly Ala Lys Ser Ile Ala Gly Ile Asp Asp Gln

180 185 190

Ala Ala Glu Pro Ile Arg Gly Gln Thr Val Leu Val Lys Ser Pro Cys

195 200 205

Lys Arg Cys Thr Met Asp Ser Ser Asp Pro Ala Ser Pro Ala Tyr Ile

210 215 220

Ile Pro Arg Pro Gly Gly Glu Val Ile Cys Gly Gly Thr Tyr Gly Val225 1 230 235 240

Gly Asp Trp Asp Leu Ser Val Asn Pro Glu Thr Val Gln Arg Ile Leu

245 250 255

Lys His Cys Leu Arg Leu Asp Pro Thr Ile Ser Ser Asp Gly Thr Ile

260 265 270

Glu Gly Ile Glu Val Leu Arg His Asn Val Gly Leu Arg Pro Ala Arg

275 280 285

Arg Gly Gly Pro Arg Val Glu Ala Glu Arg Ile Val Leu Pro Leu Asp

290 295 300

Arg Thr Lys Ser Pro Leu Ser Leu Gly Arg Gly Ser Ala Arg Ala Ala305 310 315 320

Lys Glu Lys Glu Val Thr Leu Val His Ala Tyr Gly Phe Ser Ser Ala325 330 335Gly Tyr Gln Gln Ser Trp Gly Ala Ala Glu Asp Val Ala Gln Leu

340 345 350

Asp Glu Ala Phe Gln Arg Tyr His Gly Ala Ala Arg Glu Ser Lys

355 360 365

<210> 14

<211> 5035

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Vetor binário de RLM220 derivado de pSBll<220>

<221> Região estrutural

<222> (5) .. (132)

<223> Borda esquerda de T-DNA de pSBll<220>

<221> Região de ligação

<222> (51)..(75)

<223> Região esquerda T-DNA de pSBll<220>

<221> Região estrutural

<222> (232)..(376)

<223> Borda direita de T-DNA de pSBll<220>

<221> Região de ligação

<222> (272)..(295)

<223> Região direita de T-DNA de pSBll<220>

<221> Região estrutural

<222> (777) . . (3511)

<223> Alvo de recombinação de pSBl

<220><221> Origem de replicação<222> (2654) .. (2934)

<223> Origem de replicação ColEI de pSBll<220>

<221> Região estrutural<222> (3074)..(3334)<223> Sitio ColEI BOM de pSBll<220>

<221> misc_feature<222> (3793) . . (4608)

<223> cds que codifica o gene de seleção de resistência à canamicina de Tn903<400> 14

agtggtgatt ttgtgccgag ctgccggtcg gggagctgtt ggctggctgg tggcaggata 60tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata acacattgcg gacgttttta 120atgtactgaa ttggatccgc ccgggcggta ccgaattcgc ggccgcaagc ttgtacaacg 180cgtaccggtt aattaatcta gaggcgcgcc gggcccggcc ggccagatct tgattgtcgt 240ttcccgcctt cagtttaaac tatcagtgtt tgacaggata tattggcggg taaacctaag 300agaaaagagc gtttattaga ataatcggat atttaaaagg gcgtgaaaag gtttatccgt 360tcgtccattt gtatgtgcat gccaaccaca gggttcccct cgggagtgct tggcattccg 420tgcgataatg acttctgttc aaccacccaa acgtcggaaa gcctgacgac ggagcagcat 480tccaaaaaga tcccttggct cgtctgggtc ggctagaagg tcgagtgggc tgctgtggct 540tgatccctca acgcggtcgc ggacgtagcg cagcgccgaa aaatcctcga tcgcaaatcc 600gacgctgtcg aaaagcgtga tctgcttgtc gctctttcgg ccgacgtcct ggccagtcat 660cacgcgccaa agttccgtca caggatgatc tggcgcgagt tgctggatct cgccttcaat 720ccgggtctgt ggcgggaact ccacgaaaat atccgaacgc agcaagatcg tcgaccaatt 780cttgaagacg aaagggcctc gtgatacgcc tatttttata ggttaatgtc atgataataa 840tggtttctta gacgtcaggt ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt 900tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc 960ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc 1020ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa 1080aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg 1140gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag 1200ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgtg ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgccgg gggggggggg gggggacatg aggttgcccc gtattcagtg tcgctgattt gtattgtctg aagttgtttt tacgttaagt tgatgcagat caattaatac gatacctgcg tcataattga ttatttgacg tggtttgatg gcctccacgc acgttgtgat atgtagatga taatcattat cactttacgg gtcctttccg gtgatccgac aggttacggg gcggcgacct cgcgggtttt cgctatttat gaaaattttc cggtttaagg cgtttccgtt cttcttcgtc ataacttaat gtttttattt aaaataccct ctgaaaagaa aggaaacgac aggtgctgaa agcgagcttt ttggcctctg tcgtttcctt tctctgtttt tgtccgtgga atgaacaatg gaaccccccc CCCCCCCCCC tgcagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg

12601320138014401500156016201680174018001860192019802040210021602220228023402400246025202580264027002760282028802940300030603120attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa 3180

cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcctgatg cggtattttc 3240

tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatggtg cactctcagt acaatctgct 3300

ctgatgccgc atagttaagc cagtatacac tccgctatcg ctacgtgact gggtcatggc 3360

tgcgccccga cacccgccaa cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc 3420

atccgcttac agacaagctg tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc 3480

gtcatcaccg aaacgcgcga ggcagcagat cccccgatca agtagataca ctacatatat 3540

ctacaataga catcgagccg gaaggtgatg tttactttcc tgaaatcccc agcaatttta 3600

ggccagtttt tacccaagac ttcgcctcta acataaatta tagttaccaa atctggcaaa 3660

agggttgacc gggggggggg ggaaagccac gttgtgtctc aaaatctctg atgttacatt 3720

gcacaagata aaaatatatc atcatgaaca ataaaactgt ctgcttacat aaacagtaat 3780

acaaggggtg ttatgagcca tattcaacgg gaaacgtctt gctcgaggcc gcgattaaat 3840

tccaacatgg atgctgattt atatgggtat aaatgggctc gcgataatgt cgggcaatca 3900

ggtgcgacaa tctatcgatt gtatgggaag cccgatgcgc cagagttgtt tctgaaacat 3960

ggcaaaggta gcgttgccaa tgatgttaca gatgagatgg tcagactaaa ctggctgacg 4020

gaatttatgc ctcttccgac catcaagcat tttatccgta ctcctgatga tgcatggtta 4080

ctcaccactg cgatccccgg gaaaacagca ttccaggtat tagaagaata tcctgattca 4140

ggtgaaaata ttgttgatgc gctggcagtg ttcctgcgcc ggttgcattc gattcctgtt 4200

tgtaattgtc cttttaacag cgaccgcgta tttcgtctcg ctcaggcgca atcacgaatg 4260

aataacggtt tggttgatgc gagtgatttt gatgacgagc gtaatggctg gcctgttgaa 4320

caagtctgga aagaaatgca taagcttttg ccattctcac cggattcagt cgtcactcat 4380

ggtgatttct cacttgataa ccttattttt gacgagggga aattaatagg ttgtattgat 4440

gttggacgag tcggaatcgc agaccgatac caggatcttg ccatcctatg gaactgcctc 4500

ggtgagtttt ctccttcatt acagaaacgg ctttttcaaa aatatggtat tgataatcct 4560

gatatgaata aattgcagtt tcatttgatg ctcgatgagt ttttctaatc agaattggtt 4 620

aattggttgt aacactggca gagcattacg ctgacttgac gggacggcgg ctttgttgaa 4 680

taaatcgaac ttttgctgag ttgaaggatc agatcacgca tcttcccgac aacgcagacc 4740

gttccgtggc aaagcaaaag ttcaaaatca ccaactggtc cacctacaac aaagctctca 4800

tcaaccgtgg ctccctcact ttctggctgg atgatggggc gattcaggga tcacaggcag 4 8 60

caacgctctg tcatcgttac aatcaacatg ctaccctccg cgagatcatc cgtgtttcaa 4 920

acccggcagc ttagttgccg ttcttccgaa tagcatcggt aacatgagca aagtctgccg 4980

ccttacaacg gctctcccgc tgacgccgtc ccggactgat gggctgcctg tatcg 5035<210> 15

<211> 3160

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Região T-DNA de RLM242 a RLM220-contém um vetor tipo binárioseleção cassetre p-ScBV::c-daol::t-NOS.

<220>

<221> Região estrutural

<222> (1). . (128)

<223> Borda esquerda de T-DNA de pSBll<220>

<221> Região de ligação

<222> (47).. (71)

<223> Região esquerda T-DNA de pSBll<220>

<221> promotor

<222> (154) .. (1551)

<223> Região do promotor do virus baciliforme de cana-de-açúcar<220>

<221> CDS

<222> (1572)..(2678)

<223> D-aminoácido oxidase de Rhodosporidiiim toruloides<220>

<221> terminador

<222> (2700) .. (2966)

<223> Agrobacterium tumefaciens nopaline synthase terminator region<220>

<221> Região estrutural

<222> (3016)..(3160)

<223> Borda direita de T-DNA de pSBll<220><221> Região de ligação<222> (3056)..(3079)

<223> Região direita de T-DNA de pSBll

<400> 15

gtgattttgt gccgagctgc cggtcggggagtggtgtaaa caaattgacg cttagacaacactgaattgg atccgcccgg gcggtacatcccagaaacca catcaaagat atgggcaagcagaaaggtga gcgaaggctc aattcagaagtggtgagaac gcttccaaat ctcactattccagatgcatg tgcaactgga tggggagcagcaagaaatac agagcaaatc tgtaggtatgcctgtgatgc agaaatctat ggggttatgatggacaaaag agagatcaca gtcagaactgagagtgctga acacaagcct tctgagatcagtgcaggacc agagatagtc attgaacacatcttgtccag gctcaaagcc aaattagctcttacacaagc cataagggaa gtaattccttgagaatgggg aaacaaaatt ctggatccatgaacagagca agcttttatg ctaacagaggctgcaattca gttagtgtcc agaacatctgcaatgaacaa atgccattgc tggtactggggaattgatga atttctcaag aatcttgaagaggaggaact tatgaaggaa gtcaccaagcaccaggccac accaagggct atgtcgccagacgtaagcaa tgacgattga ggaggcattggggcccattc agtggatgct ccactgagttctgtccactt tcttttggca cctgtgccacttagcttgta agcaaggatc gcagtgcgtgctatataagg caccgtctgt aagctcttaccccgggccac c atg cac tcg cag aag

gctgttggct ggctggtggc aggatatatt 60

ttaataacac attgcggacg tttttaatgt 120

ttaaatcctg gctagcaaca ctgaactatg 180

ttcttggccc attatatcca aagacctcag 240

attggaagct gatcaatagg atcaagacaa 300

caccagaaga tgcatacatt atcattgaaa 360

tatgcaagtg gaagaaaaac aaggcagacc 420

ccagtggaaa atttgataag ccaaaaggaa 480

atggcttaga aaagatgaga ttgttctact 540

acagtagtgc aatcgaaagg ttctacaaca 600

gatggatcag gttcatggac tacatcactg 660

taaaagggaa gagcaatggt ttagctgaca 720

agaatgaacc aacggaagag atgatcctgc 780

atccagatca tccatacact gagcaactca 840

tccccacatt caagaaggac atgttcgaaa 900

aaccagttct actctgtgca tgcaggaagc 960

ccaacccagg aaggaaattc ttcaagtgcg 1020

cagatctcat tgaagaacac attcaagaca 1080

ttctgaagac cggtggcgtg caaacaatgg 1140

tgaagataga agagcaggag ttcgaggaat 1200

tagccgcaga agatgtgcta gatctccaag 1260

acgtcaggga tgaccgcagc ggagagtact 1320

gtattattgt gtgcttttcg gacaagtgtg 1380

tttattcctt gtctgccacg atgcctttgc 1440

tgtgacacca ccccccttcc gacgctctgc 1500

gatcatcggt agttcaccaa gctcgaggat 1560

cgc gtc gtt gtc ctc gga tca ggc 1610Met His Ser Gln Lys Arg Val Val Val Leu Gly Ser Gly1 5 10

gtt ate ggt ctg age age gcc etc ate etc gct cgg aag ggc tac age 1658Val Ile Gly Leu Ser Ser Ala Leu Ile Leu Ala Arg Lys Gly Tyr Ser 15 20 25

gtg cat att etc gcg cgc gac ttg ccg gag gac gtc tcg age cag act 1706

Val His Ile Leu Ala Arg Asp Leu Pro Glu Asp Val Ser Ser Gln Thr30 35 40 45

ttc gct tca cca tgg gct ggc gcg aat tgg acg cct ttc atg acg ctt 1754Phe Ala Ser Pro Trp Ala Gly Ala Asn Trp Thr Pro Phe Met Thr Leu

50 55 60

aca gac ggt cct cga caa gea aaa tgg gaa gaa tcg act ttc aag aag 1802

Thr Asp Gly Pro Arg Gln Ala Lys Trp Glu Glu Ser Thr Phe Lys Lys65 70 75

tgg gtc gag ttg gtc ccg acg ggc cat gcc atg tgg ctc aag ggg acg 1850Trp Val Glu Leu Val Pro Thr Gly His Ala Met Trp Leu Lys Gly Thr

80 85 90

agg cgg ttc gcg cag aac gaa gac ggc ttg ctc ggg cac tgg tac aag 1898

Arg Arg Phe Ala Gln Asn Glu Asp Gly Leu Leu Gly His Trp Tyr Lys 95 100 105

gac ate acg cca aat tac cgc ccc ctc cca tet tcc gaa tgt cca cct 1946Asp Ile Thr Pro Asn Tyr Arg Pro Leu Pro Ser Ser Glu Cys Pro Pro110 115 120 125

ggc gct ate ggc gta acc tac gac acc ctc tcc gtc cac gea cca aag 1994Gly Ala Ile Gly Val Thr Tyr Asp Thr Leu Ser Val His Ala Pro Lys

130 135 140

tac tgc cag tac ctt gea aga gag ctg cag aag ctc ggc gcg acg ttt 2042Tyr Cys Gln Tyr Leu Ala Arg Glu Leu Gln Lys Leu Gly Ala Thr Phe145 150 155

gag aga cgg acc gtt acg tcg ctt gag cag gcg ttc gac ggt gcg gat 2090Glu Arg Arg Thr Val Thr Ser Leu Glu Gln Ala Phe Asp Gly Ala Asp160 165 170ttg gtg gtc aac gct acg gga ctt ggc gcc aag tcg att gcg ggc ate 2138Leu Val Val Asn Ala Thr Gly Leu Gly Ala Lys Ser Ile Ala Gly Ile

175 180 185

gac gac caa gcc gcc gag cca ate cgc ggg caa acc gtc ctc gtc aag 2186Asp Asp Gln Ala Ala Glu Pro Ile Arg Gly Gln Thr Val Leu Val Lys190 195 200 205

tcc cca tgc aag cga tgc acg atg gac tcg tcc gac ccc gct tet ccc 2234Ser Pro Cys Lys Arg Cys Thr Met Asp Ser Ser Asp Pro Ala Ser Pro210 215 220

gcc tac ate att ccc cga cca ggt ggc gaa gtc ate tgc ggc ggg acg 2282Ala Tyr Ile Ile Pro Arg Pro Gly Gly Glu Val Ile Cys Gly Gly Thr

225 230 235

tac ggc gtg gga gac tgg gac ttg tet gtc aac cca gag acg gtc cag 2330Tyr Gly Val Gly Asp Trp Asp Leu Ser Val Asn Pro Glu Thr Val Gln 240 245 250

cgg ate ctc aag cac tgc ttg cgc ctc gac ccg acc ate tcg age gac 2378Arg Ile Leu Lys His Cys Leu Arg Leu Asp Pro Thr Ile Ser Ser Asp

255 260 265

gga acg ate gaa ggc ate gag gtc ctc cgc cac aac gtc ggc ttg cga 2426

Gly Thr Ile Glu Gly Ile Glu Val Leu Arg His Asn Val Gly Leu Arg270 275 280 285

cct gea cga cga ggc gga ccc cgc gtt gag gea gaa cgg ate gtc ctg 24 7 4

Pro Ala Arg Arg Gly Gly Pro Arg Val Glu Ala Glu Arg Ile Val Leu290 295 300

cct ctc gac cgg aca aag tcg ccc ctc tcg ctc ggc agg ggc age gea 2522Pro Leu Asp Arg Thr Lys Ser Pro Leu Ser Leu Gly Arg Gly Ser Ala

305 310 315

cga gcg gcg aag gag aag gag gtc acg ctt gtg cat gcg tat ggc ttc 2570Arg Ala Ala Lys Glu Lys Glu Val Thr Leu Val His Ala Tyr Gly Phe 320 325 330

tcg agt gcg gga tac cag cag agt tgg ggc gcg gcg gag gat gtc gcg 2 618

Ser Ser Ala Gly Tyr Gln Gln Ser Trp Gly Ala Ala Glu Asp Val Ala335 340 345

cag ctc gtc gac gag gcg ttc cag cgg tac cac ggc gcg gcg cgg gag 2666

Gln Leu Val Asp Glu Ala Phe Gln Arg Tyr His Gly Ala Ala Arg Glu350 355 360 365

tcg aag ttg tag ggcgggattc ctgcaggagc tcgaatttcc ccgatcgttc 2718Ser Lys Leu

aaacatttgg caataaagtt tcttaagatt gaatcctgtt gccggtcttg cgatgattat 2778catataattt ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgtt 2838atttatgaga tgggttttta tgattagagt cccgcaatta tacatttaat acgcgataga 2898aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa attatcgcgc gcggtgtcat ctatgttact 2958agatcgggaa ttccttaatt aatctagagg cgcgccgggc ccggccggcc agatcttgat 3018tgtcgtttcc cgccttcagt ttaaactatc agtgtttgac aggatatatt ggcgggtaaa 3078cctaagagaa aagagcgttt attagaataa tcggatattt aaaagggcgt gaaaaggttt 3138atccgttcgt ccatttgtat gt 3160

<210> 16<211> 368<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Construto sintético<400> 16

Met His Ser Gln Lys Arg Val Val Val Leu Gly Ser Gly Val Ile Gly1 5 10 15

25 Leu Ser Ser Ala Leu Ile Leu Ala Arg Lys Gly Tyr Ser Val His Ile20 25 30

Leu Ala Arg Asp Leu Pro Glu Asp Val Ser Ser Gln Thr Phe Ala Ser

35 40 45

Pro Trp Ala Gly Ala Asn Trp Thr Pro Phe Met Thr Leu Thr Asp Gly

50 55 60

85 90 95

Ala Gln Asn Glu Asp Gly Leu Leu Gly His Trp Tyr Lys Asp Ile Thr

100 105 110

Pro Asn Tyr Arg Pro Leu Pro Ser Ser Glu Cys Pro Pro Gly Ala Ile

115 120 125

Gly Val Thr Tyr Asp Thr Leu Ser Val His Ala Pro Lys Tyr Cys Gln

130 135 140

Tyr Leu Ala Arg Glu Leu Gln Lys Leu Gly Ala Thr Phe Glu Arg Arg145 150 155 160

Thr Val Thr Ser Leu Glu Gln Ala Phe Asp Gly Ala Asp Leu Val Val

165 170 175

Asn Ala Thr Gly Leu Gly Ala Lys Ser Ile Ala Gly Ile Asp Asp Gln

180 185 190

Ala Ala Glu Pro Ile Arg Gly Gln Thr Val Leu Val Lys Ser Pro Cys

195 200 205

Lys Arg Cys Thr Met Asp Ser Ser Asp Pro Ala Ser Pro Ala Tyr Ile

210 215 220

Ile Pro Arg Pro Gly Gly Glu Val Ile Cys Gly Gly Thr Tyr Gly Val225 230 235 240

Gly Asp Trp Asp Leu Ser Val Asn Pro Glu Thr Val Gln Arg Ile Leu

245 250 255

Lys His Cys Leu Arg Leu Asp Pro Thr Ile Ser Ser Asp Gly Thr Ile

260 265 270

Glu Gly Ile Glu Val Leu Arg His Asn Val Gly Leu Arg Pro Ala Arg

275 280 285

Arg Gly Gly Pro Arg Val Glu Ala Glu Arg Ile Val Leu Pro Leu Asp

290 295 300

Arg Thr Lys Ser Pro Leu Ser Leu Gly Arg Gly Ser Ala Arg Ala Ala305 310 315 320

Lys Glu Lys Glu Val Thr Leu Val His Ala Tyr Gly Phe Ser Ser Ala325 330 335Gly Tyr Gln Gln Ser Trp Gly Ala Ala Glu Asp Val Ala Gln Leu Val

340 345 350

Asp Glu Ala Phe Gln Arg Tyr His Gly Ala Ala Arg Glu Ser Lys Leu

355 360 365

<210> 17<211> 2560<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Região T-DNA de RLM241, a RLM220-contém vetor tipo bináriouma seleção cassette p-ZmAHASL::c-daol::t-NOS.

<220>

<221> Região estrutural<222> (1) . . (128)

<223> Borda esquerda de T-DNA de pSBll<220>

<221> Região de ligação<222> (47)..(71)

<223> Região esquerda T-DNA de pSBll<220>

<221> promotor<222> (153) .. (952)

<223> Promotor AHASL2 [XI12] e regiões 5'UTR de

gene de aceto-hidroxiácido sintase (AHA5108) de Z. Mays

<220>

<221> CDS

<222> (972) . . (2078)'

<223> D-aminoácido oxidase de Rhodosporidium toruloides<220>

<221> terminador<222> (2111)..(2363)

<223> Região sintaxe terminal Agrobacterium tumefaciens<220>

<221> Região estrutural

<222> (2416)..(2560)

<223> Right T-DNA Border from pSBll

<220>

<221> Região de ligação

<222> (2456)..(2479)

<223> Região direita de T-DNA de pSBll

<400> 17

gtgattttgt gccgagctgc cggtcgggga gctgttggct ggctggtggc aggatatatt 60

gtggtgtaaa caaattgacg cttagacaac ttaataacac attgcggacg tttttaatgt 120

actgaattgg atccgcccgg gcggtacatg caggtcaacg gatcacctat caacatccca 180

gctaaaaaca gtaaaaaggg ggaaaacgtg ggtgagttga gtctgtcttg tggaaaaaac 240

gttttagttt ctcctggaat taacaataaa aacagttgaa caagattgac tgttcctccg 300

ggagggtttg gaacatcgtt acagatgtga gcgaaaggtg aggaaacaga gcggagggct 360

tggaggtgac ctcggtagtc gacgccggag ttgagcctga tgacgacacc gtactggcgt 420

accaggccta gtagtgaaca ccgggcctga agctgtcgcc gccgctgctc atcttgtggg 480

ctgtgcccgg tgtccctgtt gcggattgcg ggtggcagcc tggcaggtgg gtgcgacccg 540

tttggactcc ctgatctggg ccctttgtgt cagtaccgtc tgtactccga tgacatgcac 600

accgtcgtcc acagtcaagt ccacaatctc ccctcttttt ttaacggaat agttcaaaat 660

ctccttgacg cacgctatcg tgtaccagcg ctcactggac accacgtttg taatccacgc 720

cgacacgtcg gtcccacgtc gacaggcccc accgtccggt ctgtagcgtg tacgtattcg 780

ggcgacggac gtgtcgtcgt cgtcttgcga gtcccattcc catcaccatc tgagccacac 840

atcctctgaa caaaagcagg gaggcctcta cgcacatccc cctttctccc actccgtgtc 900

cgtggcaccc accccaaacc ctcgcgccgc ctccgagaca gccgccgcaa cctcgaggat 960

cccgggccac c atg cac tcg cag aag cgc gtc gtt gtc ctc gga tca ggc 1010Met His Ser Gln Lys Arg Val Val Val Leu Gly Ser Gly1 5 10

gtt ate ggt ctg age age gcc ctc ate ctc gct cgg aag ggc tac age 1058Val Ile Gly Leu Ser Ser Ala Leu Ile Leu Ala Arg Lys Gly Tyr Sergtg cat att ctc gcg cgc gac ttg ccg gag gac gtc tcg age cag act 1106

Val His Ile Leu Ala Arg Asp Leu Pro Glu Asp Val Ser Ser Gln Thr

30 35 40 45

ttc gct tca cca tgg gct ggc gcg aat tgg acg cct ttc atg acg ctt 1154

Phe Ala Ser Pro Trp Ala Gly Ala Asn Trp Thr Pro Phe Met Thr Leu

50 55 60

aca gac ggt cct cga caa gea aaa tgg gaa gaa tcg act ttc aag aag 1202

Thr Asp Gly Pro Arg Gln Ala Lys Trp Glu Glu Ser Thr Phe Lys Lys65 70 75

tgg gtc gag ttg gtc ccg acg ggc cat gcc atg tgg ctc aag ggg acg 1250

Trp Val Glu Leu Val Pro Thr Gly His Ala Met Trp Leu Lys Gly Thr

80 85 90

agg cgg ttc gcg cag aac gaa gac ggc ttg ctc ggg cac tgg tac aag 1298

Arg Arg Phe Ala Gln Asn Glu Asp Gly Leu Leu Gly His Trp Tyr Lys

95 100 105

gac ate acg cca aat tac cgc ccc ctc cca tet tcc gaa tgt cca cct 134 6

Asp Ile Thr Pro Asn Tyr Arg Pro Leu Pro Ser Ser Glu Cys Pro Pro110 115 120 125

ggc gct ate ggc gta acc tac gac acc ctc tcc gtc cac gea cca aag 1394

Gly Ala Ile Gly Val Thr Tyr Asp Thr Leu Ser Val His Ala Pro Lys

130 135 140

tac tgc cag tac ctt gea aga gag ctg cag aag ctc ggc gcg acg ttt 1442Tyr Cys Gln Tyr Leu Ala Arg Glu Leu Gln Lys Leu Gly Ala Thr Phe145 150 155

gag aga cgg acc gtt acg tcg ctt gag cag gcg ttc gac ggt gcg gat 14 90

Glu Arg Arg Thr Val Thr Ser Leu Glu Gln Ala Phe Asp Gly Ala Asp

160 165 170

ttg gtg gtc aac gct acg gga ctt ggc gcc aag tcg att gcg ggc ate 1538Leu Val Val Asn Ala Thr Gly Leu Gly Ala Lys Ser Ile Ala Gly Ile 175 180 185

gac gac caa gcc gcc gag cca ate cgc ggg caa acc gtc ctc gtc aag 1586

Asp Asp Gln Ala Ala Glu Pro Ile Arg Gly Gln Thr Val Leu Val Lys190 195 200 205

tcc cca tgc aag cga tgc acg atg gac tcg tcc gac ccc gct tct ccc 1634

Ser Pro Cys Lys Arg Cys Thr Met Asp Ser Ser Asp Pro Ala Ser Pro210 215 220

gcc tac ate att ccc cga cca ggt ggc gaa gtc ate tgc ggc ggg acg 1682Ala Tyr Ile Ile Pro Arg Pro Gly Gly Glu Val Ile Cys Gly Gly Thr

225 230 235

tac ggc gtg gga gac tgg gac ttg tct gtc aac cca gag acg gtc cag 1730Tyr Gly Val Gly Asp Trp Asp Leu Ser Val Asn Pro Glu Thr Val Gln 240 245 250

egg ate ctc aag cac tgc ttg cgc ctc gac ccg aee ate tcg age gac 1778

Arg Ile Leu Lys His Cys Leu Arg Leu Asp Pro Thr Ile Ser Ser Asp

255 260 265

gga acg ate gaa ggc ate gag gtc ctc cgc cac aac gtc ggc ttg cga 1826

Gly Thr Ile Glu Gly Ile Glu Val Leu Arg His Asn Val Gly Leu Arg270 275 280 285

cct gea cga cga ggc gga ccc cgc gtt gag gea gaa egg ate gtc ctg 1874Pro Ala Arg Arg Gly Gly Pro Arg Val Glu Ala Glu Arg Ile Val Leu290 295 300

cct ctc gac egg aca aag tcg ccc ctc tcg ctc ggc agg ggc age gea 1922Pro Leu Asp Arg Thr Lys Ser Pro Leu Ser Leu Gly Arg Gly Ser Ala

305 310 315

cga gcg gcg aag gag aag gag gtc acg ctt gtg cat gcg tat ggc ttc 1970

Arg Ala Ala Lys Glu Lys Glu Val Thr Leu Val His Ala Tyr Gly Phe 320 325 330

tcg agt gcg gga tac cag cag agt tgg ggc gcg gcg gag gat gtc gcg 2018Ser Ser Ala Gly Tyr Gln Gln Ser Trp Gly Ala Ala Glu Asp Val Ala

335 340 345

cag ctc gtc gac gag gcg ttc cag egg tac cac ggc gcg gcg egg gag 2066

Gln Leu Val Asp Glu Ala Phe Gln Arg Tyr His Gly Ala Ala Arg Glu350 355 360 365

tcg aag ttg tag ggcgggattc ctgcaggagc tcgaatttcc ccgatcgttc 2118Ser Lys Leu

aaacatttgg caataaagtt tcttaagatt gaatcctgtt gccggtcttg cgatgattat 2178

catataattt ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgtt 2238

atttatgaga tgggttttta tgattagagt cccgcaatta tacatttaat acgcgataga 2298

aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa attatcgcgc gcggtgtcat ctatgttact 2358

agatcgggaa ttccttaatt aatctagagg cgcgccgggc ccggccggcc agatcttgat 2418

tgtcgtttcc cgccttcagt ttaaactatc agtgtttgac aggatatatt ggcgggtaaa 2478

cctaagagaa aagagcgttt attagaataa tcggatattt aaaagggcgt gaaaaggttt 2538

atccgttcgt ccatttgtat gt 2560<210> 18<211> 368<212> PRT<213> Artificial

<220>

<223> Construto sintético<400> 18

Met His Ser Gln Lys Arg Val Val Val Leu Gly Ser Gly Val Ile Gly1 5 10 15

Leu Ser Ser Ala Leu Ile Leu Ala Arg Lys Gly Tyr Ser Val His Ile20 25 30

Leu Ala Arg Asp Leu Pro Glu Asp Val Ser Ser Gln Thr Phe Ala Ser

35 40 45

Pro Trp Ala Gly Ala Asn Trp Thr Pro Phe Met Thr Leu Thr Asp Gly

50 55 60

Pro Arg Gln Ala Lys Trp Glu Glu Ser Thr Phe Lys Lys Trp Val Glu65 70 75 80

Leu Val Pro Thr Gly His Ala Met Trp Leu Lys Gly Thr Arg Arg Phe85 90 95

Ala Gln Asn Glu Asp Gly Leu Leu Gly His Trp Tyr Lys Asp Ile Thr100 105 110

Pro Asn Tyr Arg Pro Leu Pro Ser Ser Glu Cys Pro Pro Gly Ala Ile115 120 125

Gly Val Thr Tyr Asp Thr Leu Ser Val His Ala Pro Lys Tyr Cys Gln

130 135 140

Tyr Leu Ala Arg Glu Leu Gln Lys Leu Gly Ala Thr Phe Glu Arg Arg145 150 155 160

Thr Val Thr Ser Leu Glu Gln Ala Phe Asp Gly Ala Asp Leu Val Val

165 170 175

Asn Ala Thr Gly Leu Gly Ala Lys Ser Ile Ala Gly Ile Asp Asp Gln

180 185 190

Ala Ala Glu Pro Ile Arg Gly Gln Thr Val Leu Val Lys Ser Pro Cys

195 200 205

Lys Arg Cys Thr Met Asp Ser Ser Asp Pro Ala Ser Pro Ala Tyr Ile

210 215 220

Ile Pro Arg Pro Gly Gly Glu Val Ile Cys Gly Gly Thr Tyr Gly Val225 230 235 240

Gly Asp Trp Asp Leu Ser Val Asn Pro Glu Thr Val Gln Arg Ile Leu

245 250 255

Lys His Cys Leu Arg Leu Asp Pro Thr Ile Ser Ser Asp Gly Thr Ile

260 265 270

Glu Gly Ile Glu Val Leu Arg His Asn Val Gly Leu Arg Pro Ala Arg

275 280 285

Arg Gly Gly Pro Arg Val Glu Ala Glu Arg Ile Val Leu Pro Leu Asp

290 295 300

Arg Thr Lys Ser Pro Leu Ser Leu Gly Arg Gly Ser Ala Arg Ala Ala305 310 315 320

Lys Glu Lys Glu Val Thr Leu Val His Ala Tyr Gly Phe Ser Ser Ala

325 330 335

Gly Tyr Gln Gln Ser Trp Gly Ala Ala Glu Asp Val Ala Gln Leu Val

340 345 350

Asp Glu Ala Phe Gln Arg Tyr His Gly Ala Ala Arg Glu Ser Lys Leu

355 360 365

<210> 19<211> 3411

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> T-DNA region from RLM240, a RLM220-type binary vector containinga p-ScBV::c-dsdA::t-NOS selection cassette.

<220>

<221> Região estrutural

<222> (1)..(128)

<223> Borda esquerda de T-DNA de pSBll<220>

<221> Região de ligação

<222> (47) . . (71)

<223> Região esquerda T-DNA de pSBll<220>

<221> promotor

<222> (154)..(1551)

<223> Região do promotor do virus baciliforme de cana-de-açúcar<220>

<221> CDS

<222> (1588)..(2916)

<223> Gene de D-serina desidratase [dsdA] de E. coli/CDS<220>

<221> terminador<222> (2962) .. (3214)

<223> Região sintaxe terminal Agrobacterium tumefaciens<220>

<221> Região estrutural<222> (3267)..(3411)

<223> Borda direita de T-DNA de pSBll<220>

<221> Região de ligação<222> (3307)..(3330)

<223> Região direita de T-DNA de pSBll

<400> 19

gtgattttgt gccgagctgc cggtcgggga gctgttggct ggctggtggc aggatatatt 60

gtggtgtaaa caaattgacg cttagacaac ttaataacac attgcggacg tttttaatgt 120

actgaattgg atccgcccgg gcggtacatc ttaaatcctg gctagcaaca ctgaactatg 180

ccagaaacca catcaaagat atgggcaagc ttcttggccc attatatcca aagacctcag 240

agaaaggtga gcgaaggctc aattcagaag attggaagct gatcaatagg atcaagacaa 300

tggtgagaac gcttccaaat ctcactattc caccagaaga tgcatacatt atcattgaaa 360

cagatgcatg tgcaactgga tggggagcag tatgcaagtg gaagaaaaac aaggcagacc 420

caagaaatac agagcaaatc tgtaggtatg ccagtggaaa atttgataag' ccaaaaggaa 480

cctgtgatgc agaaatctat ggggttatga atggcttaga aaagatgaga ttgttctact 54 0

tggacaaaag agagatcaca gtcagaactg acagtagtgc aatcgaaagg ttctacaaca 600

agagtgctga acacaagcct tctgagatca gatggatcag gttcatggac tacatcactg 660

gtgcaggacc agagatagtc attgaacaca taaaagggaa gagcaatggt ttagctgaca 720

tcttgtccag gctcaaagcc aaattagctc agaatgaacc aacggaagag atgatcctgc 780

ttacacaagc cataagggaa gtaattcctt atccagatca tccatacact gagcaactca 840

gagaatgggg aaacaaaatt ctggatccat tccccacatt caagaaggac atgttcgaaa 900

gaacagagca agcttttatg ctaacagagg aaccagttct actctgtgca tgcaggaagc 960

ctgcaattca gttagtgtcc agaacatctg ccaacccagg aaggaaattc ttcaagtgcg 1020

caatgaacaa atgccattgc tggtactggg cagatctcat tgaagaacac attcaagaca 1080

gaattgatga atttctcaag aatcttgaag ttctgaagac cggtggcgtg caaacaatgg 1140

aggaggaact tatgaaggaa gtcaccaagc tgaagataga agagcaggag ttcgaggaat 1200

accaggccac accaagggct atgtcgccag tagccgcaga agatgtgcta gatctccaag 12 60

acgtaagcaa tgacgattga ggaggcattg acgtcaggga tgaccgcagc ggagagtact 1320

gggcccattc agtggatgct ccactgagtt gtattattgt gtgcttttcg gacaagtgtg 1380

ctgtccactt tcttttggca cctgtgccac tttattcctt gtctgccacg atgcctttgc 1440

ttagcttgta agcaaggatc gcagtgcgtg tgtgacacca ccccccttcc gacgctctgc 1500

ctatataagg caccgtctgt aagctcttac gatcatcggt agttcaccaa gctcgaggat 1560

cctcatctaa gcgcaaagag acgtact atg gaa aac gct aaa atg aac tcg ctc 1614

Met Glu Asn Ala Lys Met Asn Ser Leu1 5

ate gcc cag tat ccg ttg gta aag gat ctg gtt gct ctt aaa gaa acc 1662Lle Ala Gln Tyr Pro Leu Val Lys Asp Leu Val Ala Leu Lys Glu Thr10 15 20 25

acc tgg ttt aat cct ggc acg acc tca ttg gct gaa ggt tta cct tat 1710Thr Trp Phe Asn Pro Gly Thr Thr Ser Leu Ala Glu Gly Leu Pro Tyr

30 35 40

gtt ggc ctg acc gaa cag gat gtt cag gac gcc cat gcg cgc tta tcc 1758

Val Gly Leu Thr Glu Gln Asp Val Gln Asp Ala His Ala Arg Leu Ser45 50 55

cgt ttt gea ccc tat ctg gea aaa gea ttt cct gaa act gct gcc act 1806

Arg Phe Ala Pro Tyr Leu Ala Lys Ala Phe Pro Glu Thr Ala Ala Thr

60 65 70

ggg ggg att att gaa tca gaa ctg gtt gcc att cca gct atg caa aaa 1854Gly Gly Ile Ile Glu Ser Glu Leu Val Ala Ile Pro Ala Met Gln Lys75 80 85

cgg ctg gaa aaa gaa tat cag caa ccg ate age ggg caa ctg tta ctg 1902

Arg Leu Glu Lys Glu Tyr Gln Gln Pro Ile Ser Gly Gln Leu Leu Leu90 95 100 105

aaa aaa gat age cat ttg ccc att tcc ggc tcc ata aaa gea cgc ggc 1950Lys Lys Asp Ser His Leu Pro Ile Ser Gly Ser Ile Lys Ala Arg Gly

110 115 120

ggg att tat gaa gtc ctg gea cac gea gaa aaa ctg gct ctg gaa gcg 1998Gly Ile Tyr Glu Val Leu Ala His Ala Glu Lys Leu Ala Leu Glu Ala125 130 135

ggg ttg ctg acg ctt gat gat gac tac age aaa ctg ctt tet ccg gag 2046Gly Leu Leu Thr Leu Asp Asp Asp Tyr Ser Lys Leu Leu Ser Pro Glu

140 145 150

ttt aaa cag ttc ttt age caa tac age att gct gtg ggc tca acc gga 2094Phe Lys Gln Phe Phe Ser Gln Tyr Ser Ile Ala Val Gly Ser Thr Gly155 160 165

aat ctg ggg tta tca ate ggc att atg age gcc cgc att ggc ttt aag 2142Asn Leu Gly Leu Ser Ile Gly Ile Met Ser Ala Arg Ile Gly Phe Lys

170 175 180 185

gtg aca gtt cat atg tct gct gat gcc cgg gca tgg aaa aaa gcg aaa 2190

Val Thr Val His Met Ser Ala Asp Ala Arg Ala Trp Lys Lys Ala Lys

190 195 200

ctg cgc age cat ggc gtt acg gtc gtg gaa tat gag caa gat tat ggt 2238

Leu Arg Ser His Gly Val Thr Val Val Glu Tyr Glu Gln Asp Tyr Gly

205 210 215

gtt gcc gtc gag gaa gga cgt aaa gca gcg cag tct gac ccg aac tgt 2286

Val Ala Val Glu Glu Gly Arg Lys Ala Ala Gln Ser Asp Pro Asn Cys220 225 230

ttc ttt att gat gac gaa aat tcc cgc acg ttg ttc ctt ggg tat tcc 2334

Phe Phe Ile Asp Asp Glu Asn Ser Arg Thr Leu Phe Leu Gly Tyr Ser235 240 245

gtc gct ggc cag cgt ctt aaa gcg caa ttt gcc cag caa ggc cgt ate 2382

Val Ala Gly Gln Arg Leu Lys Ala Gln Phe Ala Gln Gln Gly Arg Ile

250 255 260 265

gtc gat gct gat aac cct ctg ttt gtc tat ctg ccg tgt ggt gtt ggc 2430

Val Asp Ala Asp Asn Pro Leu Phe Val Tyr Leu Pro Cys Gly Val Gly

270 275 280

ggt ggt cct ggt ggc gtc gca ttc ggg ctt aaa ctg gcg ttt ggc gat 2478

Gly Gly Pro Gly Gly Val Ala Phe Gly Leu Lys Leu Ala Phe Gly Asp

285 290 295

cat gtt cac tgc ttt ttt gcc gaa cca acg cac tcc cct tgt atg ttg 2526

His Val His Cys Phe Phe Ala Glu Pro Thr His Ser Pro Cys Met Leu300 305 310

tta ggc gtc cat aca gga tta cac gat cag att tct gtt cag gat att 2574

Leu Gly Val His Thr Gly Leu His Asp Gln Ile Ser Val Gln Asp Ile315 320 325

ggt ate gac aac ctt acc gca gcg gat ggc ctt gca gtt ggt cgc gca 2622

Gly Ile Asp Asn Leu Thr Ala Ala Asp Gly Leu Ala Val Gly Arg Ala

330 335 340 345tca ggc ttt gtc ggg cgg gca atg gag cgt ctg ctg gat ggc ttc tat 2670

Ser Gly Phe Val Gly Arg Ala Met Glu Arg Leu Leu Asp Gly Phe Tyr

350 355 360

acc ctt age gat caa acc atg tat gac atg ctt ggc tgg ctg gcg cag 2718

Thr Leu Ser Asp Gln Thr Met Tyr Asp Met Leu Gly Trp Leu Ala Gln

365 370 375

gaa gaa ggt att cgt ctt gaa cct tcg gca ctg gcg ggt atg gcc gga 27 66

Glu Glu Gly Ile Arg Leu Glu Pro Ser Ala Leu Ala Gly Met Ala Gly

380 385 390

cct cag cgc gtg tgt gca tca gta agt tac caa cag atg cac ggt ttc 2814

Pro Gln Arg Val Cys Ala Ser Val Ser Tyr Gln Gln Met His Gly Phe

395 400 405

age gca gaa caa ctg cgt aat acc act cat ctg gtg tgg gcg acg gga 2862

Ser Ala Glu Gln Leu Arg Asn Thr Thr His Leu Val Trp Ala Thr Gly

410 415 420 425

ggt gga atg gtg ccg gaa gaa gag atg aat caa tat ctg gca aaa ggc 2910

Gly Gly Met Val Pro Glu Glu Glu Met Asn Gln Tyr Leu Ala Lys Gly

430 435 440

cgt taa taacgtttca acgcagcatg gatcgtaccg agetegaatt tccccgatcg 2966

Arg

ttcaaacatt tggcaataaa gtttcttaagtatcatataa tttctgttga attacgttaagttatttatg agatgggttt ttatgattag

agaaaacaaa atatagcgcg caaactaggaactagatcgg gaattcctta attaatctaggattgtcgtt tcccgccttc agtttaaactaaacctaaga gaaaagagcg tttattagaatttatccgtt cgtccatttg tatgt

<210> 20

<211> 442<212> PRT

attgaatcct gttgccggtc ttgcgatgat 3026

gcatgtaata attaacatgt aatgcatgac 3086

agtcccgcaa ttatacattt aatacgcgat 3146

taaattatcg cgcgcggtgt catctatgtt 3206

aggcgcgccg ggcccggccg gccagatctt 3266

atcagtgttt gacaggatat attggcgggt 3326

taatcggata tttaaaaggg cgtgaaaagg 3386

3411<213> Artificial<220>

<223> Construto sintético<400> 20

Met Glu Asn Ala Lys Met Asn Ser Leu Ile Ala Gln Tyr Pro Leu Val1 5 10 15

Lys Asp Leu Val Ala Leu Lys Glu Thr Thr Trp Phe Asn Pro Gly Thr

20 25 30

Thr Ser Leu Ala Glu Gly Leu Pro Tyr Val Gly Leu Thr Glu Gln Asp

35 40 45

Val Gln Asp Ala His Ala Arg Leu Ser Arg Phe Ala Pro Tyr Leu Ala

50 55 60

Lys Ala Phe Pro Glu Thr Ala Ala Thr Gly Gly Ile Ile Glu Ser Glu65 70 75 80

Leu Val Ala Ile Pro Ala Met Gln Lys Arg Leu Glu Lys Glu Tyr Gln

85 90 95

Gln Pro Ile Ser Gly.Gln Leu Leu Leu Lys Lys Asp Ser His Leu Pro

100 105 110

Ile Ser Gly Ser Ile Lys Ala Arg Gly Gly Ile Tyr Glu Val Leu Ala

115 120 125

His Ala Glu Lys Leu Ala Leu Glu Ala Gly Leu Leu Thr Leu Asp Asp

130 135 140

Asp Tyr Ser Lys Leu Leu Ser Pro Glu Phe Lys Gln Phe Phe Ser Gln145 150 155 160

Tyr Ser Ile Ala Val Gly Ser Thr Gly Asn Leu Gly Leu Ser Ile Gly

165 170 175

Ile Met Ser Ala Arg Ile Gly Phe Lys Val Thr Val His Met Ser Ala

180 185 190

Asp Ala Arg Ala Trp Lys Lys Ala Lys Leu Arg Ser His Gly Val Thr

195 200 205

Val Val Glu Tyr Glu Gln Asp Tyr Gly Val Ala Val Glu Glu Gly Arg210 215 220Lys Ala Ala Gln Ser Asp Pro Asn Cys Phe Phe Ile Asp Asp Glu Asn225 230 235 240

Ser Arg Thr Leu Phe Leu Gly Tyr Ser Val Ala Gly Gln Arg Leu Lys

245 250 255

Ala Gln Phe Ala Gln Gln Gly Arg Ile Val Asp Ala Asp Asn Pro Leu

260 265 270

Phe Val Tyr Leu Pro Cys Gly Val Gly Gly Gly Pro Gly Gly Val Ala

275 280 285

Phe Gly Leu Lys Leu Ala Phe Gly Asp His Val His Cys Phe Phe Ala

290 295 300

Glu Pro Thr His Ser Pro Cys Met Leu Leu Gly Val His Thr Gly Leu305 310 315 320

His Asp Gln Ile Ser Val Gln Asp Ile Gly Ile Asp Asn Leu Thr Ala

325 330 335

Ala Asp Gly Leu Ala Val Gly Arg Ala Ser Gly Phe Val Gly Arg Ala

340 345 350

Met Glu Arg Leu Leu Asp Gly Phe Tyr Thr Leu Ser Asp Gln Thr Met

355 360 365

Tyr Asp Met Leu Gly Trp Leu Ala Gln Glu Glu Gly Ile Arg Leu Glu

370 375 380

Pro Ser Ala Leu Ala Gly Met Ala Gly Pro Gln Arg Val Cys Ala Ser385 390 395 400

Val Ser Tyr Gln Gln Met His Gly Phe Ser Ala Glu Gln Leu Arg Asn

405 410 415

Thr Thr His Leu Val Trp Ala Thr Gly Gly Gly Met Val Pro Glu Glu

420 425 430

Glu Met Asn Gln Tyr Leu Ala Lys Gly Arg

435 440

<210> 21<211> 2811<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Vetor tipo binário contendo região T-DNA de RLM239a seleção cassete p-ZmAHASL::c-dsdA::t-NOS.

<220>

<221> Região estrutural

<222> (1)..(128)

<223> Borda esquerda de T-DNA de pSBll<220>

<221> Região de ligação

<222> (47)..(71)

<223> Região esquerda T-DNA de pSBll<220>

<221> promotor

<222> (153).. (952)

<223> Promotor AHASL2 [XI12] e regiões 5'UTR de

gene de aceto-hidroxiácido sintase (AHA5108) de Z.

<220>

<221> CDS

<222> (988)..(2316)

<223> Gene de D-serina desidratase [dsdA] de E. coli/CDS<220>

<221> terminador<222> (2362) .. (2614)

<223> Região sintaxe terminal Agrobacterium tumefaciens<220>

<221> Região estrutural<222> (2667) .. (2811)

<223> Borda direita de T-DNA de pSBll<220>

<221> Região de ligação<222> (2707) .. (2730)

<223> Região direita de T-DNA de pSBll<400> 21

gtgattttgt gccgagctgc cggtcgggga gctgttggct ggctggtggc aggatatatt 60

gtggtgtaaa caaattgacg cttagacaac ttaataacac attgcggacg tttttaatgt 120

actgaattgg atccgcccgg gcggtacatg caggtcaacg gatcacctat caacatccca 180

gctaaaaaca gtaaaaaggg ggaaaacgtg ggtgagttga gtctgtcttg tggaaaaaac 24 0

gttttagttt ctcctggaat taacaataaa aacagttgaa caagattgac tgttcctccg 300

ggagggtttg gaacatcgtt acagatgtga gcgaaaggtg aggaaacaga gcggagggct 360

tggaggtgac ctcggtagtc gacgccggag ttgagcctga tgacgacacc gtactggcgt 420

accaggccta gtagtgaaca ccgggcctga agctgtcgcc gccgctgctc atcttgtggg 480

ctgtgcccgg tgtccctgtt gcggattgcg ggtggcagcc tggcaggtgg gtgcgacccg 540

tttggactcc ctgatctggg ccctttgtgt cagtaccgtc tgtactccga tgacatgcac 600

accgtcgtcc acagtcaagt ccacaatctc ccctcttttt ttaacggaat agttcaaaat 660

ctccttgacg cacgctatcg tgtaccagcg ctcactggac accacgtttg taatccacgc 720

cgacacgtcg gtcccacgtc gacaggcccc accgtccggt ctgtagcgtg tacgtattcg 780

ggcgacggac gtgtcgtcgt cgtcttgcga gtcccattcc catcaccatc tgagccacac 84 0

atcctctgaa caaaagcagg gaggcctcta cgcacatccc cctttctccc actccgtgtc 900

cgtggcaccc accccaaacc ctcgcgccgc ctccgagaca gccgccgcaa cctcgaggat 960

cctcatctaa gcgcaaagag acgtact atg gaa aac gct aaa atg aac tcg ctc 1014Met Glu Asn Ala Lys Met Asn Ser Leu

1 5

ate gcc cag tat ccg ttg gta aag gat ctg gtt gct ctt aaa gaa acc 1062Ile Ala Gln Tyr Pro Leu Val Lys Asp Leu Val Ala Leu Lys Glu Thr1 5 20 25

25 acc tgg ttt aat cct ggc acg acc tca ttg gct gaa ggt tta cct tat 1110Thr Trp Phe Asn Pro Gly Thr Thr Ser Leu Ala Glu Gly Leu Pro Tyr

30 35 40

gtt ggc ctg acc gaa cag gat gtt cag gac gcc cat gcg cgc tta tcc 1158Val Gly Leu Thr Glu Gln Asp Val Gln Asp Ala His Ala Arg Leu Ser45 50 55

cgt ttt gea ccc tat ctg gea aaa gea ttt cct gaa act gct gcc act 1206Arg Phe Ala Pro Tyr Leu Ala Lys Ala Phe Pro Glu Thr Ala Ala Thr60 65 70

ggg ggg att att gaa tca gaa ctg gtt gcc att cca gct atg caa aaa 1254

Gly Gly Ile Ile Glu Ser Glu Leu Val Ala Ile Pro Ala Met Gln Lys

75 80 85

cgg ctg gaa aaa gaa tat cag caa ccg ate age ggg caa ctg tta ctg 1302

Arg Leu Glu Lys Glu Tyr Gln Gln Pro Ile Ser Gly Gln Leu Leu Leu90 95 100 105

aaa aaa gat age cat ttg ccc att tcc ggc tcc ata aaa gea cgc ggc 1350

Lys Lys Asp Ser His Leu Pro Ile Ser Gly Ser Ile Lys Ala Arg Gly

110 115 120

ggg att tat gaa gtc ctg gea cac gea gaa aaa ctg gct ctg gaa gcg 1398Gly Ile Tyr Glu Val Leu Ala His Ala Glu Lys Leu Ala Leu Glu Ala

125 130 135

ggg ttg ctg acg ctt gat gat gac tac age aaa ctg ctt tet ccg gag 1446

Gly Leu Leu Thr Leu Asp Asp Asp Tyr Ser Lys Leu Leu Ser Pro Glu140 145 150

ttt aaa cag ttc ttt age caa tac age att gct gtg ggc tca acc gga 1494Phe Lys Gln Phe Phe Ser Gln Tyr Ser Ile Ala Val Gly Ser Thr Gly155 160 165

aat ctg ggg tta tca ate ggc att atg age gcc cgc att ggc ttt aag 1542Asn Leu Gly Leu Ser Ile Gly Ile Met Ser Ala Arg Ile Gly Phe Lys170 175 180 185

gtg aca gtt cat atg tet gct gat gcc cgg gea tgg aaa aaa gcg aaa 1590

Val Thr Val His Met Ser Ala Asp Ala Arg Ala Trp Lys Lys Ala Lys190 195 200

ctg cgc age cat ggc gtt acg gtc gtg gaa tat gag caa gat tat ggt 1638

Leu Arg Ser His Gly Val Thr Val Val Glu Tyr Glu Gln Asp Tyr Gly

205 210 215

gtt gcc.gtc gag gaa gga cgt aaa gea gcg cag tet gac ccg aac tgt 1686

Val Ala Val Glu Glu Gly Arg Lys Ala Ala Gln Ser Asp Pro Asn Cys220 225 230

ttc ttt att gat gac gaa aat tcc cgc acg ttg ttc ctt ggg tat tcc 1734Phe Phe Ile Asp235

gtc gct ggc cagVal Ala Gly Gln250

gtc gat gct gatVal Asp Ala Asp

ggt ggt cct ggtGly Gly Pro Gly285

cat gtt cac tgcHis Val His Cys300

tta ggc gtc catLeu Gly Val His315

ggt ate gac aacGly Ile Asp Asn330

tca ggc ttt gtcSer Gly Phe Val

acc ctt age gatThr Leu Ser Asp365

gaa gaa ggt attGlu Glu Gly Ile380

cct cag cgc gtgPro Gln Arg Val395

Asp Glu Asn Ser240

cgt ctt aaa gcgArg Leu Lys Ala255

aac cct ctg tttAsn Pro Leu Phe270

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ttt ttt gcc gaaPhe Phe Ala Glu305

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Leu Gly Tyr Ser

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atg cac ggt ttcMet His Gly Pheage gea gaa caa ctg cgt aat acc act cat ctg gtg tgg gcg acg gga 2262

Ser Ala Glu Gln Leu Arg Asn Thr Thr His Leu Val Trp Ala Thr Gly410 415 420 425

ggt gga atg gtg ccg gaa gaa gag atg aat caa tat ctg gea aaa ggc 2310

Gly Gly Met Val Pro Glu Glu Glu Met Asn Gln Tyr Leu Ala Lys Gly

430 435 440

cgt taa taacgtttca acgcagcatg gatcgtaccg agetegaatt tccccgatcg 2366

Arg

ttcaaacatt tggcaataaa gtttcttaag attgaatcct gttgccggtc ttgcgatgat 2426

tatcatataa tttctgttga attacgttaa gcatgtaata attaacatgt aatgcatgac 2486

gttatttatg agatgggttt ttatgattag agtcccgcaa ttatacattt aatacgcgat 254 6

agaaaacaaa atatagcgcg caaactagga taaattatcg cgcgcggtgt catctatgtt 2606

actagatcgg gaattcctta attaatctag aggcgcgccg ggcccggccg gccagatctt 2666

gattgtcgtt tcccgccttc agtttaaact atcagtgttt gacaggatat attggcgggt 2726

aaacctaaga gaaaagagcg tttattagaa taatcggata tttaaaaggg cgtgaaaagg 2786

tttatccgtt cgtccatttg tatgt 2811

<210> 22<211> 442<212> PRT

<213> Artificial<220>

<223> Construto sintético<400> 22

Met Glu Asn Ala Lys Met Asn Ser Leu Ile Ala Gln Tyr Pro Leu Val1 5 10 15

Lys Asp Leu Val Ala Leu Lys Glu Thr Thr Trp Phe Asn Pro Gly Thr

20 25 30

Thr Ser Leu Ala Glu Gly Leu Pro Tyr Val Gly Leu Thr Glu Gln Asp 35 40 45

Val Gln Asp Ala His Ala Arg Leu Ser Arg Phe Ala Pro Tyr Leu Ala50 55 60Lys Ala Phe Pro Glu Thr Ala Ala Thr Gly Gly Ile Ile Glu Ser Glu65 70 75 80

Leu Val Ala Ile Pro Ala Met Gln Lys Arg Leu Glu Lys Glu Tyr Gln

85 90 95

Gln Pro Ile Ser Gly Gln Leu Leu Leu Lys Lys Asp Ser His Leu Pro

100 105 110

Ile Ser Gly Ser KLe Lys Ala Arg Gly Gly Ile Tyr Glu Val Leu Ala

115 120 125

His Ala Glu Lys Leu Ala Leu Glu Ala Gly Leu Leu Thr Leu Asp Asp

130 135 140

Asp Tyr Ser Lys Leu Leu Ser Pro Glu Phe Lys Gln Phe Phe Ser Gln145 150 155 160

Tyr Ser Ile Ala Val Gly Ser Thr Gly Asn Leu Gly Leu Ser Ile Gly

165 170 175

Ile Met Ser Ala Arg Ile Gly Phe Lys Val Thr Val His Met Ser Ala

180 185 190

Asp Ala Arg Ala Trp Lys Lys Ala Lys Leu Arg Ser His Gly Val Thr

195 200 205

Val Val Glu Tyr Glu Gln Asp Tyr Gly Val Ala Val Glu Glu Gly Arg

210 215 220

Lys Ala Ala Gln Ser Asp Pro Asn Cys Phe Phe Ile Asp Asp Glu Asn225 230 235 240

Ser Arg Thr Leu Phe Leu Gly Tyr Ser Val Ala Gly Gln Arg Leu Lys

245 250 255

Ala Gln Phe Ala Gln Gln Gly Arg Ile Val Asp Ala Asp Asn Pro Leu

260 265 270

Phe Val Tyr Leu Pro Cys Gly Val Gly Gly Gly Pro Gly Gly Val Ala

275 280 285

Phe Gly Leu Lys Leu Ala Phe Gly Asp His Val His Cys Phe Phe Ala

290 295 300

Glu Pro Thr His Ser Pro Cys Met Leu Leu Gly Val His Thr Gly Leu305 310 315 320His Asp Gln Ile Ser Val Gln Asp Ile Gly Ile Asp Asn Leu Thr Ala

325 330 335

Ala Asp Gly Leu Ala Val Gly Arg Ala Ser Gly Phe Val Gly Arg Ala

340 345 350

Met Glu Arg Leu Leu Asp Gly Phe Tyr Thr Leu Ser Asp Gln Thr Met355 360 365

Tyr Asp Met Leu Gly Trp Leu Ala Gln Glu Glu Gly Ile Arg Leu Glu

370 375 380

Pro Ser Ala Leu Ala Gly Met Ala Gly Pro Gln Arg Val Cys Ala Ser385 390 395 400

Val Ser Tyr Gln Gln Met His Gly Phe Ser Ala Glu Gln Leu Arg Asn

405 410 415

Thr Thr His Leu Val Trp Ala Thr Gly Gly Gly Met Val Pro Glu Glu

420 425 430

Glu Met Asn Gln Tyr Leu Ala Lys Gly Arg435 440

Claims

1. Método para geração de planta Zea mays transgênica carac-terizado pelo fato de que compreende as etapas dea. introdução de um construto de DNA em uma célula ou tecido de Zeamays, compreendendoi) pelo menos um primeiro construto de expressão, compreendendoum promotor de ubiquitina e, ligada ao mesmo de modo que per-mite operação, uma seqüência de aminoácidos que codifica umaenzima capaz de metabolizar D-alanina e/ou D-serina,ii) pelo menos um segundo construto de expressão, conferindo àreferida planta Zea mays uma característica agronomicamente va-liosa, eb. incubação da referida célula ou tecido de Zea mays da etapa a) em ummeio de seleção, compreendendo D-alanina e/ou D-serina e/ou um de-rivado destas, em uma concentração total de aproximadamente 1 mM a100 mM, por um período de tempo de, pelo menos, 5 dias, ec. transferência da referida célula ou tecido de Zea mays da etapa b) paraum meio de regeneração e a regeneração e seleção de plantas Zeamays, compreendendo o referido construto de DNA.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o método compreende as seguintes etapasa. isolamento de um embrião imaturo de uma planta Zea mays, eb. cocultivo do referido embrião imaturo isolado, o qual não foi submetidoa tratamento de desdiferenciação, com uma bactéria pertencente aogênero Rhizobiaceae, compreendendo, pelo menos, um T-DNA trans-gênico, o referido T-DNA compreendendoi) pelo menos um primeiro construto de expressão, compreendendoum promotor de ubiquitina e, ligada ao mesmo de modo que per-mite operação, uma seqüência de aminoácidos que codifica umaenzima capaz de metabolizar D-alanina e/ou D-serina,ii) pelo menos um segundo construto de expressão, conferindo àreferida planta Zea mays uma característica agronomicamentevaliosa, ec. a transferência dos embriões imaturos cocultivados para um meio derecuperação, o referido meio de recuperação sem uma quantidade fito-tóxica eficaz de D-serina ou D-alanina, ed. a indução de formação de calo embriogênico e a seleção de calotransgênico em um meio compreendendo,i) uma quantidade eficaz de pelo menos um composto auxina, eii) D-alanina e/ou D-serina em uma concentração total de aproxima-damente 1 mM a 100 mM, ee. a regeneração e seleção de plantas contendo o T-DNA transgênico doreferido calo transgênico.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelofato de que o meio de recuperação da etapa c) compreendei) uma quantidade eficaz de pelo menos um antibiótico que iniba ou su-prima o crescimento da bactéria do solo, eii) L-prolina em uma concentração de aproximadamente 1 g/l a aproxima-damente 10 g/l, eiii) nitrato de prata em uma concentração de aproximadamente 1 μΜ aaproximadamente 50 μΜ,iv) uma quantidade eficaz de pelo menos um composto auxina.

4. Método de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizadopelo fato de que a quantidade eficaz do composto de auxina é equivalente auma concentração de aproximadamente 0,2 mg/l a aproximadamente 6 mg/l 2,4-D.

5. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelofato de que o meio empregado durante o cocultivo compreende de aproxi-madamente 1 μΜ a aproximadamente 10 μΜ de nitrato de prata e/ou de a-proximadamente 50 mg/l a aproximadamente 1.000 mg/l de L-cisteína.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-5, caracterizado pelo fato de que a enzima capaz de metabolizar D-alaninaou D-serina é selecionada do grupo constituído por D-serina amônia-liases(EC 4.3.1.18), D-aminoácido oxidases (EC 1.4.3.3) e D-alanina transamina-ses (EC 2.6.1.21).

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a enzima capaz de metabolizar D-serina éselecionada do grupo constituído pori) a d-serina amônia-liase do E.coli, conforme codificada pela SEQ IDNO: 2, eii) enzimas que tenham a mesma atividade enzimática e identidade deseqüência de pelo menos 80% à da seqüência, conforme codificadapela SEQ ID NO: 2, eiii) enzimas codificadas por uma seqüência de ácidos nucleicos capazesde hibridizar para complementar a seqüência descrita pela SEQ ID NO: 1,e em que a seleção é efetuada em um meio compreendendo D-serina emuma concentração de aproximadamente 1 mM a 100 mM.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a enzima capaz de metabolizar D-serina ea D-alanina é selecionada do grupo constituído pori) a D-amioácido oxidase do Rhodotorula gracilis, conforme codificadapela SEQ ID NO: 4, eii) enzimas que tenham a mesma atividade enzimática e identidade deseqüência de pelo menos 80% à da seqüência, conforme codificadapela SEQ ID NO: 4, eiii) enzimas codificadas por uma seqüência de ácidos nucleicos capazesde hibridizar para complementar a seqüência descrita pela SEQ ID NO: 3,e em que a seleção é efetuada em meio compreendendo D-alanina e/ou D-serina em uma concentração total de aproximadamente a 1 mM a 100 mM.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o promotor da ubiquitina é o promotor daubiquitina de milho.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o promotor da ubiquitina é selecionado dogrupo constituído pora) seqüências compreendendo a seqüência, conforme descrita pela SEQID NO: 5, eb) seqüências compreendendo, pelo menos, um fragmento de pelo menos 50 pares de base consecutivas da seqüência, conforme descrita pelaSEQ ID NO: 5 e com atividade de promotor em Zea mays,c) seqüências compreendendo uma seqüência cuja identidade de se-qüência é pelo menos 60% à da seqüência, conforme descrita pelaSEQ ID NO: 5 e com atividade de promotor em Zea mays, d) seqüências compreendendo uma seqüência que hibridiza para a se-qüência, conforme descrita pela SEQ ID NO: 5 e com atividade depromotor na Zea mays,

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o promotor da ubiquitina é selecionado dogrupo constituído pora) seqüências compreendendo a seqüência, conforme descrita pela SEQID NO: 6, eb) seqüências compreendendo, pelo menos, um fragmento de pelo menos 50 pares de base consecutivas da seqüência, conforme descrita pelaSEQ ID NO: 6 e com atividade de promotor em Zea mays,c) seqüências compreendendo uma seqüência cuja identidade de se-qüência é pelo menos 60% à da seqüência, conforme descrita pelaSEQ ID NO: 6 e com atividade de promotor em Zea mays,d) seqüências compreendendo uma seqüência que hibridiza para a se-quência, conforme descrita pela SEQ ID NO: 6 e com atividade depromotor na Zea mays,

12. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizadopelo fato de que a seleção da etapa b) da reivindicação 1 ou etapa d) da rei-vindicação 2 é efetuada utizando D-alanina em uma concentração de apro-ximadamente 3 a aproximadamente 15 mM ou D-serina em uma concentra-ção de aproximadamente 7 a aproximadamente 30 mM.

13. Método de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 12, caracteri-zado pelo fato de que o tempo total de seleção, sob condições de desdife-renciação, é de aproximadamente 3 a 4 semanas.

14. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizadopelo fato de que a seleção da etapa b) da reivindicação 1 é efetuada em du-as etapas, usando uma primeira etapa de seleção de aproximadamente 5 a 20 dias e, em seguida, transferindo as células sobreviventes ou tecido paraum segundo meio de seleção, contendo essencialmente a mesma composi-ção do primeiro meio de seleção, por mais 5 a 20 dias.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a introdução do referido construto de DNAé mediada por um método selecionado do grupo constituído por transforma-ção mediada por Rhizobiaceae e transformação mediada por bombardea-mento de partículas.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pe-lo fato de que a bactéria Rhizobiaceae é uma bactéria desarmada Agrobac-terium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes.

17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que a referida planta Zea mays, embrião ima-turo, célula ou tecido é selecionado do grupo de plantas Zea mays constituí-do por naturais, híbridas, F1 entre naturais, F1 entre uma natural e uma hí-brida, F1 entre uma natural e uma variedade naturalmente polinizada, varie-dades comerciais de F1, qualquer cruzamento de F2 ou de autopolinizaçãoentre as variedades mencionadas acima e a progênie de qualquer um dossupramencionados.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pe-lo fato de que a referida célula ou tecido de Zea mays ou o referido embriãoimaturo é isolado de um cruzamento de um híbrido (HilIA χ A188) com umalinhagem natural, selecionada do grupo, cuja semente representativa foi de-positada junto à coleção American Type Culture Collection, sob a Designa-ção de Depósito de Patente PTA-6170 e PTA-6171.

19. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o método compreende as seguintes etapasi) transformação de células da planta Zea mays com um primeiro constru-to de DNA compreendendoa) pelo menos um primeiro construto de expressão, compreendendoum promotor de ubiquitina e, ligada ao mesmo de modo que per-mite operação, uma seqüência de ácido nucleico que codificauma enzima do tipo D-aminoácido oxidase, em que o primeirocassete de expressão é flanqueado por seqüências que permitema deleção específica do referido primeiro cassete de expressão, eb) pelo menos um segundo cassete de expressão, adequado paraconferir à referida planta uma característica agronomicamente va-liosa, em que o referido segundo cassete de expressão não estálocalizado entre as referidas seqüências que permitem a deleçãoespecífica do referido primeiro cassete de expressão, eii) tratamento das referidas células transformadas da planta Zea mays daetapa i) com um primeiro composto selecionado do grupo constituídopor D-alanina, D-serina ou derivados destas, em uma concentração fi-totóxica, e a seleção de células da planta compreendendo em seus ge-nomas a referida primeira construção de DNA, conferindo resistênciaàquelas referidas células transformadas da planta contra o referidoprimeiro composto pela expressão da referida D-aminoácido oxidase, eiii) indução da deleção do referido primeiro cassete de expressão, do ge-noma das referidas células transformadas da planta, e o tratamentodas referidas células da planta com um segundo composto, seleciona-do do grupo constituído por D-isoleucina, D-valina e derivados destes,em uma concentração tóxica para as células da planta, compreenden-do ainda o referido primeiro cassete de expressão, e pelo mesmo, a se-leção de células da planta compreendendo o referido segundo cassetede expressão, porém desprovido do referido primeiro cassete de ex-pressão.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pe-lo fato de quea) o promotor da ubiquitina é definido conforme em qualquer reivindicaçãode 9 a 11, e/oub) as D-aminoácido oxidases são definidas conforme na reivindicação 6 ou 8.

21. Construto de expressão recombinante, caracterizado pelofato de que compreende um promotor de ubiquitina e, a ele ligada de modooperacional uma seqüência de ácidos nucleicos que codifica uma enzimacapaz de metabolizar D-alanina ou D-serina, em que o referido promotor éheterólogo, em relação à referida seqüência que codifica a enzima.

22. Construto de expressão recombinante de acordo com a rei-vindicação 21, caracterizado pelo fato de quea) o promotor da ubiquitina é como definido conforme em qualquer reivin-dicação 9 a 11, e/oub) a enzima capaz de metabolizar D-alanina ou D-serina é como definidaem qualquer reivindicação 6 a 8.

23. Construto de DNA caracterizado pelo fato de que compreendei) pelo menos um primeiro construto de expressão, compreendendo umpromotor de ubiquitina e, ligada ao mesmo de modo que permite ope-ração, uma seqüência de aminoácidos que codifica uma enzima capazde metabolizar D-alanina e/ou D-serina,ii) pelo menos um segundo construto de expressão, conferindo à referidaplanta Zea mays uma característica agronomicamente valiosa.

24. Construto de DNA de acordo com a reivindicação 23, carac-terizado pelo fato de que compreendea) um primeiro cassete de expressão compreendendo uma seqüência deácido nucleico que codifica uma D-aminoácido oxidase, ligada a umpromotor de ubiquitina de modo que permite operação, em que o refe-rido primeiro cassete de expressão é flanqueado por seqüências quepermitem a deleção específica do referido primeiro cassete de expres-são, eb) pelo menos um segundo cassete de expressão, adequado para conferirà referida planta uma característica agronomicamente valiosa, em queo referido segundo cassete de expressão não está localizado entre asreferidas seqüências que permitem a deleção específica do referidoprimeiro cassete de expressão.

25. Construto de DNA de acordo com a reivindicação 24, carac-terizado pelo fato de que as referidas seqüências que permitem deleção es-pecífica do referido primeiro cassete de expressão são selecionadas do gru-po de seqüências constituído pora) sítios de recombinação para uma recombinase específica das seqüên-cias, arranjados de forma que a recombinação entre os referidos sítiosde recombinação flanqueadores resulta em deleção das seqüências nomeio do genoma, eb) seqüências homólogas AeA' com comprimento e homologia suficientepara assegurar uma recombinação homóloga entre A e A', e com umaorientação que - na recombinação entre A e A1 - resultará em deleçãodas seqüências no meio do genoma.

26. Construto de acordo com a reivindicação 24 ou 25, caracteri-zado pelo fato de que o referido construto compreende, pelo menos, um sítiode reconhecimento para uma nuclease de seqüência específica, localizadaentre as referidas seqüências que permite a deleção específica do referidoprimeiro cassete de expressão.

27. Vetor caracterizado pelo fato de que compreende um cons-truto de expressão como definido na reivindicação 21 ou 22, ou um construtode DNA como definido nas reivindicações 23 a 26.

28. Célula ou organismo não-humano transgênico, caracterizadapelo fato de que compreende um construto de expressão como definido nareivindicação 21 ou 22, um construto de DNA como definido em qualqueruma das reivindicações 23 a 26 ou um vetor da reivindicação 27.

29. Célula ou organismo não-humano de acordo com a reivindi-cação 28, caracterizada pelo fato de que a referida célula é uma célula vege-tal e/ou o referido organismo é uma planta.

30. Célula ou organismo não-humano de acordo com a reivindi-cação 28 ou 29, caracterizada pelo fato de que a referida célula é uma célulada planta Zea mays e/ou o referido organismo é uma planta Zea mays.

31. Planta de milho como definida na reivindicação 30, caracteri-zada pelo fato de que a referida planta foi obtida pelo cruzamento de um hí-brido (HilIA χ A188) com uma linhagem natural, selecionada do grupo cujasemente representativa foi depositada junto à coleção American Type Cultu-re Collection sob a Designação de Depósito de Patente PTA-6170 e PTA-6171.

32. Planta caracterizada pelo fato de que descende de umaplanta de milho como definida na reivindicação 30 ou 31.

33. Planta híbrida caracterizada pelo fato de ser produzida a par-tir da planta de milho como definida na reivindicação 30 a 32.

34. Planta natural caracterizada pelo fato de ser produzida a par-tir da planta de milho como definida em qualquer uma das reivindicações 30a 32.

35. Parte de uma planta de milho caracterizada pelo fato de sercomo definida nas reivindicações 30 a 34.

36. Método para transformação subsequente de pelo menos doisconstrutos de DNA em uma planta Zea mays, caracterizado pelo fato de quecompreende as etapas dea) uma transformação com um primeiro construto, o referido construtocompreendendo, pelo menos, um construto de expressão que compre-ende um promotor-de ubiquitina e, ligada ao mesmo de modo que per-mite operação, uma seqüência de aminoácidos que codifica uma enzi-ma capaz de metabolizar D-alanina e/ou D-serina,eb) uma transformação com um segundo construto, em que o referidoconstruto compreende um segundo gene marcador de seleção que nãoconfere resistência contra D-alanina ou D-serina.

37. Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pe-lo fato de que o referido segundo gene marcador confere resistência contra,pelo menos, um composto selecionado do grupo constituído por fosfinotrici-na, glifosato e herbicidas do tipo sulfonil uréia e imidazolinona.

38. Método de acordo com a reivindicação 36 ou 37, caracteri-zado pelo fato de que o gene do marcador é selecionado do grupo de genesmutantes Xl 12 ahas e genes mutantes XA17 ahas.

39. Planta de milho, caracterizada pelo fato de que compreendea) um primeiro construto de expressão, compreendendo um promotor deubiquitina e, ligado ao mesmo de modo que permite operação, uma se-qüência de aminoácidos que codifica uma enzima capaz de metaboli-zar D-alanina e/ou D-serina, eb) um segundo construto de expressão para um gene marcador de sele-ção que não confere resistência contra D-alanina ou D-serina.

40. Método para transformação subsequente de pelo menos doisconstrutos de DNA em uma planta Zea mays, caracterizado pelo fato de quecompreende as etapas dea) uma transformação com um primeiro construto, o referido construtocompreendendo um construto de expressão, compreendendo um pro-motor da planta e, ligado ao mesmo de modo que permite operação,uma seqüência de ácidos nucleicos que codifica uma enzima do tipodsdA, e a seleção com D-serina, eb) uma transformação com um segundo construto, o referido construtocompreendendo um construto de expressão, compreendendo um pro-motor da planta e, ligado ao mesmo de modo que permite operação,uma seqüência de ácidos nucleicos que codifica uma enzima do tipodao, e a seleção com D-alanina.