CN1643147A

CN1643147A - 监测和调节基因沉默的方法和工具

Info

Publication number: CN1643147A
Application number: CNA038060388A
Authority: CN
Inventors: P·沃特豪斯; S·韦斯利; C·赫利维尔
Original assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Current assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Priority date: 2002-03-14
Filing date: 2003-03-12
Publication date: 2005-07-20
Anticipated expiration: 2023-03-12
Also published as: CA2478910A1; CA2478910C; CN1643147B; EP1490489A1; EP1490489B1; ATE469968T1; WO2003076620A1; US20030175783A1; ES2346645T3; JP2006503548A; DE60332820D1; US20140196160A1; AU2003212089A1; AU2003212089B2; EP1490489A4

Abstract

提供了使用双链RNA监测和调节真核生物中基因表达降低的方法和工具，该双链RNA除了包含与目标基因同源的核苷酸序列的dsRNA区域外，还包含设计下降的另外dsRNA区域。

Description

监测和调节基因沉默的方法和工具

发明领域

本发明涉及使用能够改变目标基因表达的dsRNA，或编码这种dsRNA的基因来改变真核生物中基因表达的方法，如在植物，以及动物如线虫、昆虫和节肢动物，哺乳动物包括人，或酵母、真菌或霉菌中。也提供了包含这种dsRNA或其编码基因的非人真核生物。

在第一个方面，本发明提供了通过测定第二个基因沉默的程度来监测真核细胞中目标基因沉默的方法和工具，其中目标基因和第二个基因的沉默是通过向真核细胞提供的单一起始dsRNA分子的作用而获得的。

在第二个方面，本发明提供了调节真核细胞中目标基因的沉默程度的方法和工具，通过在提供给真核细胞的单一最初dsRNA分子中包括诱导目标基因沉默的目标dsRNA以外，还包括一定量与目标dsRNA无关的dsRNA序列，其比例反映目标基因沉默的期望调节程度。

背景技术

直到最近，获知了调节真核生物中基因表达的两个主要方法，本领域称作“反义”下调或“有义”下调。

近来的工作证明使用编码RNA的嵌合构建体可以使沉默效率在数量和质量水平上大大提高，该RNA通过分别与目标序列互补和同源的反义和有义RNA核苷酸序列之间的碱基配对能够形成双链RNA。这种双链RNA(dsRNA)也称作发夹RNA(hpRNA)或干扰RNA(RNAi)。

已经描述了使用dsRNA下调目标核苷酸系列的表达作为说明作用未知的核酸功能的方便分析方法(见如WO 99/53050或WO 00/01846)。调节基因沉默的dsRNA也可以用于调节生物中一个或更多目标基因的表达以获得具有所期望的表型或性状的修饰生物(WO 99/53050)。

对于上面提及的申请，拥有一种容易监测目标核酸的定量和定性下调的方法将有用。尤其是通过由下调引起的表型分析确定目标基因表达下调的情况劳动强度大、费钱、耗时、需要使用专门的分析方法等。当调节基因沉默的dsRNA用于未知基因的功能鉴定/证实时，通过定义不能获知寻找的表型时，可能急需具有监测沉默效率的其他方法。

此外，能够调节生物中特定目标基因和基因沉默程度将很方便，如通过产生显示出各个程度的dsRNA调节基因沉默的生物群体并鉴定具有期望程度沉默的生物。

Fire等人，1998描述了在秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)中实验导入双链RNA造成的特异的基因干扰。

WO 99/32619提供了将RNA导入活细胞来抑制那个细胞中目标基因的基因表达的方法。该方法可以在体外或体内实施。该RNA具有含双链结构的区域。抑制是序列特异性的，因为RNA双螺旋区域的核苷酸序列或目标基因的一部分是相同的。

Waterhouse等人1998描述了通过同时表达有义和反义RNA诱导植物中的病毒抗性和基因沉默。该有义和反义RNA可以位于具有自身互补性的一个转录物中。

Hamilton等人1998描述了具重复DNA的转基因，即其5’非翻译区拷贝反转，引起番茄中高效率ACC氧化酶表达的转录后抑制。

WO 98/53083描述了增强生物内目标基因抑制的构建体和方法，包括将载体内多核苷酸区的全部或部分的反向重复序列插入基因沉默载体。

WO 99/53050提供了降低真核细胞中目的核酸的表型表达的方法和工具，尤其是在植物细胞中，通过导入编码直接针对目标核酸的有义和反义RNA分子的嵌合基因。通过有义和反义核苷酸序列的区域之间的碱基配对或通过导入RNA分子自身，这些分子能够形成双链RNA区域。优选，该RNA分子同时包括有义和反义核苷酸序列。

WO 99/49029通常涉及改变基因表达的方法和改变转基因生物的细胞、组织或器官中内源基因表达的合成基因，尤其是转基因动物或植物。也提供了合成的基因和基因构建体，它们能够形成dsRNA，当导入生物体时，能够抑制、延迟或降低生物体中内源基因或目标基因的表达。

WO 99/61631涉及使用基因的有义和反义RNA片段改变植物中目标基因表达的方法。该有义和反义RNA片段能够配对并形成双链RNA分子，由此改变基因表达。本发明也涉及植物，和使用这些方法获得的后代和种子。

WO 00/01846提供了鉴定在细胞中导致特定表型的DNA的方法，该方法包括a)将该细胞DNA的cDNA或基因组文库构建于合适的载体中，方向相对适当转录因子与启动子结合时，启动子能够启动cDNA或DNA转录为双链(ds)RNA；b)将该文库导入包含该转录因子的一个或更多细胞，和c)鉴定和分离包括该文库的细胞的特定表型和从负责提供该表型的文库中鉴定该DNA或cDNA片段。使用这个技术，也可能指定已知DNA序列的功能，通过a)鉴定细胞中DNA序列的同源物，b)从细胞中分离该相关DNA同源物或其片段，c)将同源物或其片段克隆进入适当的载体，方向相对于适当的启动子，该启动子当与转录因子结合时能够启动所述DNA同源物或片段的dsRNA转录，和d)将该载体导入来自步骤a)的包含该转录因子的细胞。

WO 00/44914也描述了使用双链RNA在体内和体外减弱基因表达的组合物和方法，尤其是在斑马鱼中。

WO 00/49035描述了使细胞中内源基因表达沉默的方法，该方法包括在细胞中过度表达内源基因的核酸分子和包括与内源基因的核酸分子互补的核酸分子的反义分子，其中细胞中内源基因的核酸分子和反义分子的过度表达使得内源基因的表达沉默。

Smith等人，2000以及WO 99/53050描述了含有dsRNA的内含子进一步增加沉默效率。含发夹RNA的内含子通常称作ihpRNA。

如上面提及的参考文献所阐明，dsRNA调节基因沉默是广泛真核生物中发生的现象，包括植物、酵母或真菌、昆虫、节肢动物和脊椎动物，包括哺乳动物。

WO 93/23551描述了抑制两个或更多目标基因的方法，它包括将具有与每个目标基因同源的不同DNA区域的单一控制基因和适于从这些不同区域转录抑制每个目标基因表达的反义或有义RNA的植物中可操作的启动子导入植物。

WO 99/49029描述了同时靶向在特定细胞中共表达的几个目标基因的表达的方法，例如通过使用包含基本上与每个所述共表达目标基因等同的核苷酸序列的分散核酸分子或外来核酸分子。

然而，上面提及的现有参考文献无一针对用表型监测目标基因沉默程度的问题，该问题很困难或实践中不可能测定。现有技术在提供使用dsRNA调节或微调特定目标基因沉默程度的方法方面有缺陷。

下述不同实施方案和权利要求已经解决了这些和其它问题。

发明概述

本发明提供了监测真核生物细胞中目标基因表达降低的方法，如在植物、动物、酵母、真菌或霉菌中，包括步骤：

a)给真核细胞提供包含第一区域、第二区域、第三区域和第四区域的dsRNA，其中

i)第一区域包含与来自所述目标基因有义核苷酸区域的19个连续核苷酸具有至少94％序列同一性的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列；

ii)第二区域包含与来自所述目标基因的所述有义核苷酸区域的19个连续核苷酸的互补核苷酸序列具有至少94％序列同一性的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列；

iii) 第一区域和第二区域能够形成双链RNA区域；

iv)第三区域包含与来自稳定整合于真核细胞基因组且不同于目标基因的第二个基因，如内源基因或转基因的有义核苷酸区域的19个连续核苷酸具有至少94％序列同一性的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列；

v)第四区域包含与来自第二个基因的有义核苷酸区域的19个连续核苷酸的互补序列具有至少94％序列同一性的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列；

vi)第三区域和第四区域能够形成双链RNA区域；和

b)通过分析所述第二个基因表达的降低，监测目标基因表达的降低。

可以从嵌合基因转录的dsRNA包括在真核生物细胞内，该嵌合基因包括：

c)在真核细胞中起作用的启动子区域；可操作连接于

d)当转录时产生dsRNA分子的DNA区域；和

e)在真核生物细胞中起作用的转录终止和聚腺苷酸化区域。

本发明的一个目的也提供了所述的RNA分子以及这种RNA分子测定目标基因表达降低的用途。

本发明的另一个目的是提供测定真核细胞中目标基因表达降低的DNA分子，其包括

a)在真核细胞中起作用的启动子区域；可操作连接于

b)当转录时产生dsRNA分子的DNA区域；其中dsRNA包括第一、第二、第三和第四区域；

i)第一区域包含与来自目标基因有义核苷酸区域的19个连续核苷酸具有至少94％序列同一性的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列；

ii)第二区域包含与来自目标基因的有义核苷酸区域的19个连续核苷酸的互补核苷酸序列具有至少94％序列同一性的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列；

iii)第一区域和第二区域能够形成双链RNA区域；

iv)第三区域包含与真核细胞中存在的不同于目标基因的第二个基因的有义核苷酸区域的19个连续核苷酸具有至少94％序列同一性的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列；

vi)第三区域和第四区域能够形成双链RNA区域；和

c)在真核生物细胞中起作用的转录终止和聚腺苷酸化区域，其中所述第二个基因是真核生物的内源基因或稳定整合到真核生物细胞基因组的转基因，以及这种DNA分子通过测定第二个基因表达降低来测定目标基因表达的用途。

本发明也提供了包含如这里所述的RNA分子或DNA分子的非人真核生物。

本发明也提供在dsRNA调节基因沉默的真核生物群体中鉴定具有期望的目标基因沉默程度的生物的方法，包括：

a)给真核生物的细胞提供包含第一区域、第二区域、第三区域和第四区域的dsRNA，

iii)第一区域和第二区域能够形成双链RNA区域；

vi)第三区域和第四区域能够形成双链RNA区域；和

b)通过选择具有期望的第二个基因的沉默程度的生物，鉴定具有期望的目标基因的沉默程度的生物。

本发明进一步的目的是提供调节真核生物细胞中目标基因表

达降低的方法，包括步骤：

a)给真核细胞提供包含第一区域、第二区域、第三区域和第四区域的dsRNA，

ii)第二区域包含与来自目标基因的有义核苷酸区域的19个连续核苷酸的互补序列具有至少94％序列同一性的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列；

iii)第一区域和第二区域能够形成双链RNA区域；

iv)第三区域和第四区域包含与目标基因的核苷酸序列具有低于50％的序列同一性和能够形成双链RNA的互补核苷酸序列；

其中目标基因是真核细胞中的内源基因或稳定整合到真核细胞基因组的转基因。通过第三和第四区域之间碱基配对能够形成的双链RNA的大小可以等于或大于第一和第二区域之间碱基配对能够形成的双链RNA的大小。

本发明也提供了适合调节真核生物细胞中目标基因表达程度的dsRNA分子，能够产生这种dsRNA分子的嵌合基因，和含有这种dsRNA分子或嵌合基因的非人类生物。

附图简述

图1显示了用FLC/CHS构建体转化的T1植物的种子，在UV光下显示荧光，与C24野生型(C24)、含CaMV35S启动子(GUS)控制下的嵌合GUS基因的C24野生型和纯合CHS沉默系(CHS)进行比较。数字表示转基因植物细胞系开花的天数。

图2显示了由转基因植物系制备的RNA的RNA印迹分析，包括针对FLC和CHS的编码dsRNA的基因，用FLC探针(上板)和CHS探针(下板)(图2A)探测。图2B是从FLC表达检测到的mRNA量对从CHS表达检测到的mRNA量的图示。

详细实施方案的描述

本发明基于预料不到的观察结果，当真核细胞，如植物细胞，包含双链RNA(dsRNA)，其中dsRNA同时包含至少两个目的基因的互补反义和有义区域，所有目的基因的表达沉默程度之间存在对应性。该对应性进一步依赖于设计降低不同目标基因表达的反义和有义区域的相对大小。这种对应性可以方便地用于监测基因沉默，该基因的表达产生了监测器不能直接利用的表型。这可以通过将适合降低或沉默这种基因表达的互补有义和反义区域，与适合降低或沉默其表达产生可以直接方式监测的表型的基因表达的互补有义和反义区域相联系来完成。

因此，在本发明的一个实施方案中，提供了监测真核细胞中目标基因表达降低或沉默的方法，包括步骤

-给真核细胞提供包含第一区域、第二区域、第三区域和第四区域的dsRNA，其中

-第一区域包含与来自目标基因有义核苷酸区域的19个连续核苷酸具有至少94％序列同一性的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列；

-第二区域包含与来自目标基因的有义核苷酸区域的19个连续核苷酸的互补序列具有至少94％序列同一性的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列；

-第一区域和第二区域能够形成双链RNA区域；优选在第一和第二区域的全部长度上形成，和至少在提及的19个核苷酸的长度上；

-第三区域包含与真核细胞中存在的不同于目标基因的第二个基因的有义核苷酸区域的19个连续核苷酸具有至少94％的序列同一性的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列。

-第四区域包含与来自相同的第二个基因的有义核苷酸区域的19个连续核苷酸的互补序列具有至少94％序列同一性的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列；

-第三区域和第四区域能够形成双链RNA区域；优选在第一和第二区域的全部长度上形成，和至少在提及的19个核苷酸的长度上；和

-通过分析第二个基因表达的降低，监测目标基因沉默程度的表达。

优选，当第三和第四区域形成双链RNA的同时，第一和第二区域能够形成双链RNA区域。

不同于目标基因的第二个基因用作报道基因监测目标基因沉默的程度和本文称报道基因时，应该理解这个术语用于指真核细胞中存在和不同于目标基因的第二个基因。

对于本发明的目的，不论第二个基因是正常存在于真核细胞的内源基因，还是在某些历史点通过人为干预被导入真核细胞的转基因，是等同的，转基因优选以稳定方式整合到真核细胞基因组。

优选，报道基因应该具有一种表型，在费用、专业程度、时间、劳力、使用的设备等需要条件方面，对该表型的分析比对目标基因的分析更直接。

也优选，报道基因的沉默不应该对宿主细胞或宿主生物的活力有不利影响，尽管缺乏不利影响可能依赖于特定条件。

方便地，报道基因的表达可以产生可见的表型，尽管该表型的可视化可能仍有条件。

适合将本发明方法应用于植物细胞和植物的报道基因的实例包括但不限于Chalcone合成基因(CHS，其表达下调导致种子外皮颜色中UV荧光化合物的蓄积)；八氢蕃茄红素去饱和基因(PDS，其基因表达下调导致光漂白)，花位点C(FLC，其基因表达下调导致早开花)，乙烯不敏感基因2(EIN2，其基因下调产生对乙烯不敏感的植物，和将在含1-氨基环丙烷-1-羧酸(AAC)的介质中生长)，可视标记基因如种子外皮颜色基因(如玉米中的R基因)，植物可表达GUS或GFP基因，植物色素B等等。

适合将本发明方法应用于动物细胞和动物的报道基因的实例包括但不限于可操作连接适合动物细胞的表达区域的GUS或GFP基因，还有基因如秀丽线虫中的unc，它的沉默引起线虫特征性的扭曲模式，等等。

适合将本发明方法应用于真菌细胞的报道基因的实例包括但不限于可操作连接适合真菌细胞的表达区域的GUS或GFP基因，还有其沉默引起营养缺陷生长的基因(如trpC)，营养缺陷生长是在极限培养基中容易筛选的表型。不言而喻在这些情况下，沉默真菌细胞文库的主要拷贝需要在允许生长的条件下维持，如在所需要的营养化合物存在下。

优选，该报道基因应该至少在目标基因表达的情况下表达。

与目标基因和/或报道基因的19个连续核苷酸的核苷酸序列至少94％等同或互补的19个核苷酸和/或报道基因可以包括在较大RNA分子内。这种RNA分子将具有小如19bp至等于目标基因大小长度之间的核苷酸序列，其具有变化的整体序列同一性程度。

对于本发明的目的，两个相关核苷酸或氨基酸序列的“序列同一性”，以百分比表示，是指两个最佳比对序列中具有等同残基位置的数量(×100)除以相比较的位置数量。缺口，即比对中残基存在于一个序列中，但是不存在另一序列中的的一个位置，被认为是具有不等同残基的位置。两个序列的比对由Needleman和Wunsch算法来实施(Needleman和Wunsch 1970)。计算机辅助的上述序列比对可以使用标准软件程序来方便地实施，如GAP，它是Wisconsin包10.1版(Genetics Computer Group，Madision，Wisconsin，USA)，使用缺省分值矩阵，缺口产生惩罚是50，缺口延伸惩罚是3。当这种序列具有至少大约75％的同一性，特别是至少大约80％，更特别至少大约85％，非常特别大约90％，尤其是大约95％，更尤其大约100％，非常特别是等同时，序列以“基本类似”表示。很清楚，当RNA序列与DNA序列基本类似或具有某种程度的序列同一性时，认为DNA序列中的胸腺嘧啶(T)等于RNA序列中的尿嘧啶(U)。因此，当本申请中陈述19个连续核苷酸的序列与19个核苷酸序列具有94％的序列同一性时，这是指第一个序列的19个核苷酸中至少18个与第二个序列的19个核苷酸中至少18个等同。

因此提及的有义或反义核苷酸区域长度可以是大约50nt，100nt，200nt，300nt，500nt，1000nt，2000nt或甚至大约5000nt或更长，每个具有分别大约40％，50％，60％，70％，80％，90％或100％的总体序列同一性。序列越长，对于总体序列同一性的要求越不严格。

第一、第二、第三和第四区域每个可以被具有与整个目标或报道基因的核苷酸序列无关的核苷酸序列的间隔区域分隔开。

对于本发明的目的，尽管区域是顺续命名的，但是dsRNA分子中dsRNA区域的顺序不重要。换句话说，如第一或第二区域或第三或第四区域位于RNA分子的5’还是3’都没有关系。

这里使用的“包含”被解释为说明所涉及的一定特征、整体、步骤或成分的存在，但是不排除一个或更多特征、整体、步骤或成分，或它们的组合的存在或加入。因此，如包含核苷酸或氨基酸序列的核酸或蛋白，可以包含比实际引用的更多的核苷酸或氨基酸，即内含在更大的核酸或蛋白中。包含限定的功能或结构的DNA区域的嵌合基因可以包含另外的DNA区域等。

因此如这里限定的包含第一、第二、第三和第四区域的dsRNA分子可以另外包括，如与如目标基因具有至少94％序列同一性或互补的具有19个核苷酸的核苷酸区域的第五和第六区域，该目标基因可以是与第一目标基因相同的目标基因或可以是不同的目标基因。

在本发明的一个实施方案中，dsRNA分子可以进一步包含一个或更多区域，该区域与不同于第一区域限定的19个连续核苷酸的来自目标基因有义核苷酸的19个连续核苷酸区域具有至少94％序列同一性，和一个和多个区域，该区域与不同于第二区域限定的19个连续核苷酸的来自目标基因有义核苷酸的互补序列的19个连续核苷酸具有至少94％序列同一性，其中这些另外的区域可以在它们自身当中碱基配对。类似地，dsRNA也可以包含另外的一个或更多区域，该区域与不同于第三区域的19个核苷酸的报道基因的19个连续核苷酸区域具有至少94％序列同一性，和一个和多个区域，该区域与报道基因的19个连续核苷酸的互补区域具有至少94％序列同一性，其中这些另外的区域能够在它们之间进行碱基配对。再次，不需要特定顺序的区域，而且这些区域可以彼此分散。因此，如直接针对目标基因沉默的dsRNA区域可以与直接针对报道基因沉默的dsRNA区域互换，当然只要互补RNA区域之间仍可能进行碱基配对。

方便地，可以通过导入及可能的整合嵌合基因，其转录产生这种dsRNA导入而将所述的dsRNA导入宿主细胞。因此本发明也旨在提供包含下述的这种嵌合基因，其包含：

能够在目的真核生物细胞中表达的启动子或启动子区域；可操作地连接DNA区域，该DNA区域当转录时产生包含第一区域、第二区域、第三区域和第四区域的dsRNA，其中

-第一区域包含与来自目标基因有义核苷酸序列的19个连续核苷酸具有至少94％序列同一性的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列；

-第二区域包含与来自目标基因的有义核苷酸序列的19个连续核苷酸的互补序列具有至少94％序列同一性的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列；

-第一区域和第二区域能够形成双链RNA区域；优选在第一和第二区域的全部长度上，和至少在提及的第一和第二区域的19个核苷酸之间；

-第三区域包含与真核细胞中存在的不同于目标基因的第二个基因的有义核苷酸序列的19个连续核苷酸具有至少94％的序列同一性的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列。

-第四区域包含与来自相同的第二个基因的有义核苷酸序列的19个连续核苷酸的互补序列具有至少94％序列同一性的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列；

-第三区域和第四区域能够形成双链RNA区域；优选在第一和第二区域的全部长度上，和至少在提及的19个核苷酸的长度上；

和其中第一和第二区域之间形成的双链RNA区域和第三和第四区域之间形成的双链RNA区域长度大约相等；和

-适合所选真核细胞的转录终止和聚腺苷酸化区域。

这里使用的术语“启动子”表示转录起始过程中被DNA依赖性RNA聚合酶识别和结合(直接或间接)的任何DNA。启动子包括转录起始位点和转录起始因子及RNA聚合酶的结合位点，并且可以包含各种其它位点(如增强子)，其中可以结合基因表达调节蛋白。

这里使用的术语“调节区域”指参与驱动给定DNA序列如编码蛋白或多肽的DNA的转录和控制(即调节)转录时间和水平的任何DNA。例如，5’调节区域(或“启动子区域”)是位于编码序列上游(即5’)的DNA序列，且其包含启动子和5’非翻译引导序列。3’调节区域是位于编码序列下游(即3’)的DNA序列，且其包含合适的转录终止(和/或调节)信号，包括一个或更多聚腺苷酸化信号。

本发明的一个实施方案中，启动子是组成型启动子。在本发明的另一个实施方案中，通过例如但不限于激素、化学化合物，机械脉冲、非生物或生物应力条件的外部或内部刺激增强启动子活性(诱导型启动子)。该启动子的活性可以以时间和空间方式来调节(组织特异性启动子；发育调节的启动子)。

在本发明的特定实施方案中，启动子是可在植物中表达的启动子。这里使用的术语“在植物中表达的启动子”是指能够控制(启动)植物细胞中转录的DNA序列。这包括植物来源的任何启动子，但也包括能够指导植物细胞转录的非植物来源的任何启动子，即病毒或细菌来源的某些启动子，如CaMV35S(Hapster等人，1988)，地下红花草病毒(subterranean clover virus)启动子4号和7号(WO9606932)，或T-DNA基因启动子，但也包括组织特异性或器官特异性启动子，包括但不限于种子特异性启动子(如WO 89/03887)，器官原基特异性启动子(An等人，1996)，茎特异性启动子(Keller等人，1988)，叶特异性启动子(Hudspeth等人，1989)，叶肉特异性启动子(如光诱导型Rubisco启动子)，根特异性启动子(Keller等人，1989)，块茎特异性启动子(Keil等人，1989)，维管组织特异性启动子(Peleman等人，1989)，雄蕊选择性启动子(WO 89/10396，WO 92/13956)，裂开带特异性启动子(WO97/13865)等等。

在本发明的另一个特定实施方案中，启动子是可在真菌中表达的启动子。这里使用的术语“可在真菌中表达的启动子”是指能够控制(启动)真菌细胞中的转录的DNA序列，例如但不限于能够控制(启动)真菌细胞中转录的构巢曲霉(A.Nidulans)trpC基因启动子，或啤酒酵母GAL4启动子。

在本发明的另一个特定实施方案中，启动子是可在动物中表达的启动子。这里使用的术语“可在动物中表达的启动子”是指能够控制(启动)动物细胞中转录的DNA序列，例如但不限于SV40晚期和早期启动子、巨细胞病毒CMV-IE启动子、RSV-LTR启动子、SCSV启动子、SCBV启动子等等。

对本发明有用的dsRNA分子也可以通过体外转录产生。为此，根据本发明的嵌合基因的启动子可以是被噬菌体单一亚基RNA聚合酶识别的启动子，如被噬菌体单一亚基RNA聚合酶识别的启动子，如来自大肠杆菌噬菌体T7，T3，1，11，W31，H，Y，A1，122，cro，C21，C22，和C2的RNA聚合酶；恶臭假单胞菌噬菌体gh-1；鼠伤寒杆菌噬菌体SP6；粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)噬菌体IV；柠檬酸杆菌噬菌体VillI；和克雷白氏杆菌噬菌体第11[Hausmann，Current Topics inMicrobiology and Immunology，75：77-109(1976)；Korsten等人，J.Gen Virol.43：57-73(1975)；Dunn等人，Nature New Biology，230：94-96(1971)；Towle等人，J.Biol.Chem.250：1723-1733(1975)；Butler and Chamberlin，J.Biol.Chem.，257：5772-5778(1982)]。这种启动子的实例分别是T3 RNA聚合酶特异性启动子和T7 RNA聚合酶特异性启动子。待用作CIG中第一启动子的T3启动子可以是McGraw etal，Nucl.Acid Res.13：6753-6766(1985)所述的T3基因的任何启动子。或者，T3启动子可以是为了被T3 RNA聚合酶识别而在核苷酸位置-10，-11和-12被修饰的T7启动子[(Klement等人，J.Mol.Biol.215，21-29(1990)]。优选的T3启动子是与T3启动子具有“一致”序列的启动子，如美国专利5,037,745所述。根据本发明可以与T7 RNA聚合酶联合使用的T7启动子包括由Dunn和Studier，J.Mol.Biol.166：477-535(1983)所述的T7基因之一的启动子。优选的T7启动子是与T7启动子具有“一致”序列的启动子，如Dunn和Studier(前述)所述。

在本领域技术人员熟知的条件下，受体载体DNA接触适当噬菌体单一亚单位RNA聚合酶可以产生大量dsRNA。所产生的dsRNA接着可以用于传递给倾向于基因沉默的细胞，如植物细胞、真菌细胞或动物细胞。dsRNA可以通过脂质体或其它转染试剂(如来自CloTech的Clonfection转染试剂或CalPhos哺乳动物转染试剂盒)导入动物细胞并可以通过适当目标基因的沉默用在治疗包括人的动物的方法中。可以通过很多不同方法将dsRNA导入细胞。例如，通过显微注射、dsRNA包裹颗粒的轰击、将细胞或生物浸透在dsRNA溶液中、在dsRNA存在下电穿孔细胞膜、脂质体介导的dsRNA传递和化学制剂如磷酸钙介导的转染、病毒感染、转化等等来给予dsRNA。dsRNA可以与增加细胞摄取RNA，稳定退火链，或增加目标基因抑制的成分一起导入。在整个动物的情况下，方便地通过注射或灌注到生物的腔或间质腔隙，或通过口服、局部、肠胃外(包括皮下、肌内或静脉内给予)、阴道、直肠、鼻内、眼或腹膜内给予而全身导入dsRNA。也可以通过可植入的延长释放装置给予dsRNA。

根据本发明的能够产生dsRNA的嵌合基因也可以装配适合dsRNA在特定原核宿主中表达的任何原核生物启动子。原核宿主可以用作dsRNA的来源，如通过将它喂养给动物，如线虫或昆虫，其中通过报道基因表达降低来显示和监测目标基因的沉默。在这种情况下，将很清楚目标基因和报道基因应该是存在于目标真核生物细胞并且不存在于原核宿主生物的基因。因此可以在一个宿主生物中产生根据本发明的dsRNA或能够产生这种dsRNA分子的嵌合基因。dsRNA可以给予另一个目标生物(如通过喂养，口服给药，作为裸DNA或RNA分子或包裹在脂质体，病毒颗粒或减毒病毒颗粒，或在惰性颗粒上等)和引起另一个生物中目标基因和报道基因的基因表达降低。在这种情况下，将很清楚目标基因和报道基因应该是存在于目标(真核)生物而非宿主生物的细胞。

适合的转录终止和聚腺苷酸化区域包括但不限于SV40聚腺苷酸化信号，HSV TK聚腺苷酸化信号，根癌土壤杆菌的胭脂氨酸合成酶基因终止子，CaMV 35S转录物的终止子，地下矮化三叶草病毒的终止子，构巢曲霉(Aspergillus nidulans)trpC终止子等等。

本发明也旨在提供dsRNA分子，它可以通过从这些嵌合基因转录而获得，而且它对根据本发明的方法有用。

本发明的另一个目的是提供包含本发明的dsRNA分子，或含有能够产生本发明dsRNA分子的嵌合基因的真核细胞，和真核非人生物。在优选实施方案中，嵌合基因被稳定整合到真核生物细胞的基因组中。

在另一个优选的实施方案中，嵌合基因可于DNA分子上提供，该DNA分子能够在真核生物细胞中自主复制，如病毒载体。嵌合基因或dsRNA也可以瞬时提供给真核生物细胞。

根据本发明这第一个方面的dsRNA分子也可以用于在dsRNA调节的基因沉默的生物群体内鉴定具有期望的目标基因沉默程度的生物。为此，产生一群含有dsRNA的生物，其中dsRNA包含第一区域、第二区域、第三区域和第四区域，其中第一区域包含与来自目标基因有义核苷酸序列的19个连续核苷酸具有至少94％序列同一性的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列。第二区域包含与来自目标基因的有义核苷酸区域的19个连续核苷酸的互补序列具有至少94％序列同一性的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列。第三区域包含与真核细胞中存在的不同于目标基因的第二个基因的有义核苷酸序列的19个连续核苷酸具有至少94％的序列同一性的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列。第四区域包含与来自相同的第二个基因的有义核苷酸序列的19个连续核苷酸的互补序列具有至少94％序列同一性的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列。第一区域和第二区域及第三和第四区域能够形成双链RNA区域；优选在第一和第二区域或第三和第四的全部长度上，和至少在提及的19个核苷酸片段之间，和其中第一和第二区域之间形成的双链RNA区域和第三和第四区域之间形成的双链RNA区域长度大约相等。接着分析这群含dsRNA的生物中报道基因表达的下调和选择并分离其中报道基因表达下调与期望程度对应的含dsRNA的生物。

包含两个或更多目标基因的双链互补有义和反义RNA区域的dsRNA的存在所诱导的两个或更多基因的沉默程度的对应性也可以用于调节那些目标基因沉默的程度。两个或更多基因的沉默程度对应性依赖于双链互补有义和反义RNA区域的相对大小。因此，一个特定基因的沉默程度可以通过将碱基配对也能够形成双链RNA的额外无关互补序列包含进入设计用于沉默特定目标基因表达的包含互补有义和反义RNA区域的同一dsRNA分子来调节。

本发明不限于具体实施方式，认为负责从dsRNA产生大约21nt的小RNA分子的真核细胞中的酶(如果蝇中的DICER)可以通过将额外的dsRNA序列(即互补RNA分子)包含进入dsRNA而被饱和，该额外的序列与待沉默的目标基因的核苷酸序列无关。

因此，在本发明的一个实施方案中，提供了调节真核生物中目标基因表达降低的方法，包括步骤：

-第二区域包含与来自目标基因有义核苷酸序列的19个连续核苷酸的互补序列具有至少94％序列同一性的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列；

-第一区域和第二区域能够形成双链RNA区域；优选在第一和第二区域的全部长度上，和至少在提及的19个核苷酸的片段之间；

-第三区域和第四区域包含与目标基因的核苷酸序列无关且能够形成双链RNA的互补核苷酸序列。第三和第四区域之间碱基配对能够形成双链RNA的大小优选等于或大于第一和第二区域之间碱基配对能够形成的双链RNA的大小。根据期望的沉默调节程度，第三/第四区域的大小也可以小于第一/第二区域的大小。

优选，在第三和第四区域形成双链RNA同时，第一和第二区域能够形成双链RNA区域。此外，优选，目标基因是真核细胞的内源基因或稳定整合到真核细胞基因组中的转基因。

如这里所用，当无关序列和目标序列之间的总体序列同一性低于50％，特别是低于45％，更特别低于35％时，序列被述为与目标基因“无关”。优选无关序列应该不具有与目标基因的19个连续核苷酸片段或其互补物至少94％序列等同的核苷酸序列。

包含相同dsRNA分子的真核生物不同系之间发生的目标基因表达下调的自然变异将向基因沉默范围更低移动。这是由于包括了与目标基因无关的额外dsRNA核苷酸序列，它们可操作连接第一和第二RNA区域形成的dsRNA。

第三和第四区域之间碱基配对能够形成双链RNA的大小与第一和第二区域之间碱基配对能够形成的双链RNA的大小的比率可以从0，1至20变化，优选从1至10。所提及的比率越大，包含dsRNA的真核生物群中更多生物将具有更低程度的基因沉默(即更高水平的目标基因表达)。

与目标基因的19个连续核苷酸的核苷酸序列至少94％等同或互补的第一或第二RNA区域的19个核苷酸可以包括在更长RNA分子中。这种更长RNA分子将具有小如19bp至等于目标基因大小的长度之间变化的核苷酸序列，并具有变化的总体序列同一性。

因此所提及的有义或反义核苷酸区域可以是大约50nt，100nt，200nt，300nt，500nt，1000nt，2000nt或甚至5000nt或更长长度，每个分别具有大约40％，50％，60％，70％，80％，90％或100％的总体序列同一性。序列越长，对于总体序列同一性的要求越不严格。

第一、第二、第三和第四区域每个可以被具有与目标或报道基因的核苷酸序列无关的核苷酸序列的间隔区域分隔开。

方便地，dsRNA分子可以通过从包含能够转录DNA区域的启动子或启动子区域的嵌合基因转录而导入真核细胞或生物，该嵌合基因当转录时产生根据本发明这个方面的dsRNA。应该理解与本发明第一个方面相关提及的关于合适启动子等的不同实施方案与可以应用于这里。

本发明也旨在提供dsRNA或能够产生根据本发明第二个方面的这种dsRNA分子的嵌合基因，以及包含这种dsRNA或嵌合基因的非人真核生物。

使用美国专利申请60/244067和60/333743(并入这里作为参考)或WO02/059294所述的工具和方法，通过重组克隆可以方便地构建本发明嵌合基因的反转重复部分。根据美国专利申请60/244067或uS60/333743的载体可以被修饰而包括能够形成双链RNA基因的第三和第四区域，其中第三和第四区域能够下调标记基因的表达，如EIN2、PHYB、FLC和CHS。

为了增加效率(如WO 99/53050所述)，根据本发明的编码dsRNA的嵌合基因优选包含内含子，优选在第二和第三区域之间的区域。这里使用的“内含子”或插入序列用于指较大转录区域内的DNA区域，它在核中被转录产生更大RNA的一部分的RNA区域，然而，当转移到细胞质时，所述对应内含子序列的RNA被从较大RNA中除去。对应的RNA也称作内含子或插入序列。内含子序列两侧接剪接位点，且将适当的剪接位点加入具有适当分支点的任何序列可以产生合成内含子。内含子的实例包括pdk2内含子，来自蓖麻子的过氧化氢酶内含子，来自棉花的δ12去饱和酶内含子，来自拟南芥的δ12去饱和霉内含子，来自玉米的遍在蛋白质内含子或来自SV40的内含子。

本发明的一个实施方案中，联合本发明的第一和第二方面，可以给真核细胞提供dsRNA分子，以通过分析如这里所述的第二个或报道基因的下调来监测目标基因表达下调。在这种实施方案中，具有目标基因或其互补物序列的dsRNA的大小和具有第二个基因或其互补物的序列的dsRNA的大小之间的比率在2和10之间。期望这样通过鉴定第二个基因表达被有效下调的微生物，将鉴定目标基因表达严重下调的一群微生物。

这里所述的方法和工具可以应用于任何真核生物，其中发生了基因沉默，包括但不限于植物(如玉米、棉花、拟南芥、水稻、蔬菜、大豆、烟草、树等)、无脊椎动物(如昆虫、贝类、软体动物、甲壳动物如螃蟹、龙虾和对虾)、脊椎动物(鱼、鸟类动物、哺乳动物、人)、酵母和真菌等。

下列非限制性实施例描述了通过分析第二个基因来监测dsRNA调节的目标基因表达沉默的方法和工具，以及调节真核细胞中dsRNA介导的基因沉默程度的方法和工具。

在实施例中除非另外指明，所有重组DNA技术都根据Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY和Ausubel等人(1994)Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols，USA的1和2卷所述标准方案来实施。由BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications，UK联合出版的R.D.D.Croy的Plant Molecular Biology Labfax(1993)描述了植物分子工作的标准材料和方法。标准分子生物技术的其它参考文献包括Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ThirdEdition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY，Volumes I and11 of Brown(1998)Molecular Biology LabFax，Second Edition，Academic Press(UK)。在Dieffenbach and Dveksler(1995)PCR Primer：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，和McPherson at al.(2000)PCR-Basics：From Background to Bench，First Edition，Springer Verlag，Germany可以找到聚合酶链式反应的标准材料和方法。

贯穿本说明书和实施例，下列序列作为参考：

SEQ ID NO 1：CHS/FLC片段的PCR反应的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO 2：CHS/FLC片段的PCR反应的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO 3：CHS/FLC片段的PCR反应的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO 4：CHS/FLC片段的PCR反应的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO 5：attB1重组位点。

SEQ ID NO 6：attB2重组位点。

SEQ ID NO 7：pHELLSGATE 8。

实施例

实施例1.靶向两个基因的ihpRNA构建体给出化学计算量的沉默。

靶向两个基因的ihpRNA构建体的构建。

构建编码靶向两个不同基因的ihpRNA构建体的嵌合基因，在有义反向，包含300nt花位点C(FLC)基因(GenBank登记号AF116527，碱基620-920)，之后是300nt查耳酮合成酶(CHS)基因(GenBank登记号Y18603，碱基147-532)，和与提及的300nt CHS互补的核苷酸序列，之后是与提及的300nt FLC互补的核苷酸序列。

用具有下列序列的寡核苷酸引物扩增300bp的FLC片段和将所得产物克隆进pGEM T-easy(Promega，Madison，WI)产生CHS/FLC插入物：

-5′CTCGAGTCTAGAGGAGCAGAAGCTGAGATGGAG 3′(SEQ ID NO 1)(引物138)

-5′CTGCAGGAATAAGGTACAAAGTTCATC 3′(SEQ ID NO 2)(引物136)

用具有下列序列的寡核苷酸引物扩增CHS片段并且也克隆入pGEMT-easy：

-5′CTGCAGGCACTGCTAACCCTGAGAAAC 3′(SEQ ID NO 3)(引物133)

-5′GGTACCTTGACTTGGGCTGGCCCCACT 3′(SEQ ID NO 4)(引物143)

从含CHS片段的pGEM T-easy CHS切出300bp片段并插入pGEMT-easy FLC的PstI位点。用具有与138和143相同基因特异性序列的引物，但用F1 TaqDNA聚合酶(Fisher Biotec，Subiaco，WA，澳大利亚)使用制造商的方案分别在它们的5’末端被修饰也包含编码重组位点attB1(GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT；SEQ ID NO 5)和attB2(GGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT；SEQ ID NO 6)的核苷酸序列，来扩增所产生的CHS/FLC嵌合插入物。

添加3倍体积的TE和两倍体积30％(W/V)PEG 3000，30mM MgCl₂并在13000g离心15分钟来沉淀PCR产物。以含2μl BP克隆酶缓冲液(Invitrogen)，1-2μl PCR产物，150ng质粒载体和2μl BP克隆酶(Invitrogen)的10μl总体积实施PCR产物与pDONR201(Invitrogen，Groningen，荷兰)的重组反应。在室温(25℃)孵育反应1小时至过夜。孵育后，添加1μl蛋白酶K(2μg/μl；Invitrogen)并在37℃孵育10分钟。1-2μl混合物用于转化大肠杆菌DH5α，在适当抗生素上选择菌落。消化DNA小量制备物或以PCR检测克隆。

以含2μl LR克隆酶缓冲液(Invitrogen)，2μl pDONR201克隆(大约150ng)，300ng pHellsgate 8和2μl LR克隆酶(Invitrogen)的10μl总体积实施pDONR201克隆至pHellsgate 8的重组反应。在室温过夜孵育反应，蛋白酶处理并用于转化DH5α，如BP克隆酶反应。

pHELLSGATE 8是适合以产生目的插入DNA的反转重复的方式重组克隆的载体。PCT申请PCT/AU02/00073，US 60/264,067或US优先申请US 60/333,743(全部文件并入这里作为参考)描述了pHELLSGATE 8及其用于重组克隆的用途。PHELLSGATE 8包含下列DNA编码元件

·根癌土壤杆菌T-DNA区域的右边界序列

·CaMV 35S启动子区域；

·attR1重组位点；

·来自大肠杆菌的ccdB选择标记基因；

·attR2重组位点；

·pdk2(Flavineria trinerva丙酮酸正磷酸盐二激酶内含子2)内含子序列；

·attR2重组位点；

·ccdB选择标记基因；

·attR1重组位点；

·来自根癌土壤杆菌章鱼肉碱合成酶基因(ocs)的终止区域；

·两侧连接胭脂氨酸合成酶基因(nos)启动子和nos终止子的嵌合nptII基因；

·根癌土壤杆菌T-DNA区域的左边界序列；

·大肠杆菌的复制起始点和链霉素抗性基因。

SEQ ID NO 7表示了pHELLSGATE 8的完整序列。

如上所述PCR扩增插入物CHS/FLC的重组克隆时，由此产生的嵌合基因包括：

-CaMV35S启动子区域；

-对应于FLC的碱基620-920的核苷酸序列；

-对应于CHS的碱基147-532的核苷酸序列；

-pdk2内含子

-与CHS的碱基147-532互补的核苷酸序列；

-与FLC的碱基620-920互补的核苷酸序列；

-ocs终止区域。

这个嵌合基因和可在植物中表达的可选择标记基因一起位于土壤杆菌T-DNA边界序列之间。该载体因此可导入包含所需辅助功能的土壤杆菌并用于转化植物细胞。

植物转化

拟南芥C24生态型的转化是通过花浸渍方法(Clough and Bent，1998)。在补充了100mg/l timentin和50mg/l卡那霉素的琼脂固化的MS培养基上选择植物。

其中FLC或CHS基因沉默的植物的表型分析方法

通过转移给MS板和在开花期与C24野生型植物和flc突变系比较开花的天数和玫瑰花形叶子来打分，从而给T1 FLC ihpDNA植物打分。其中FLC基因表达降低或消除的植物系开花早于野生型C24生态型。通过降低查耳酮合成酶基因(CHS)表达造成花青素生物合成阻滞导致UV光下观察到的种子荧光增加的丙二酰CoA蓄积。

用ihpCHS/FLC构建体转化的所有T1植物开花早于野生型C24(36天)并晚于转座子标记的flc-13系(17天；Sheldon et al，1999)。检测在不同时间开花的来自四个ihp CHS/FLC植物的种子与野生型C24，35S：：GUS系和纯合ihpRNA-沉默CHS系相比(Wesley et al，2001)的荧光(图1)。HPLC分析也确定查耳酮合成途径中不同中间体的浓度。

CHS ihpRNA系显示出强烈荧光，反映在这个系中丙二酰CoA蓄积，而野生型C24和35S：：GUS系在UV光下未显示荧光。所检测的四个ihp CHS/FLC系全部显示出一些荧光，最早开花的系显示出最强荧光。

实施例2.在ihpRNA茎中用额外非目标序列稀释调节CHS基因沉默程度

为了检测在iphRNA或dsRNA分子中内含与目标DNA序列无关的额外核苷酸对目标基因沉默程度的影响，产生很多嵌合基因，各在反义和有义方向(分别称作CHS_反义和CHS_有义)包含100bp来自CHS的核苷酸序列(对应于GenBank登记号Y18603)。

逐渐增多的与CHS基因无关的核苷酸序列(从100bp至900bp；称作额外-NNN-nt_有义或额外-NNN-nt_反义)以反义和有义方向插入。无关核苷酸序列来自FLC基因(对应于GenBank登记号Nr AF116527)。

用attB1和attB2延伸引物PCR扩增不同的CHS/额外核苷酸构建体并如实施例1所述导入pHELLSGATE 8。由此所产生的质粒含有下列嵌合dsRNA基因。

1.<CaMV35S-CHS_有义-额外-100-nt_有义-pdk2内含子-额外-100-nt_反义-CHS_反义-ocs终止子>或

2.<CaMV35S-CHS_有义-额外-300-nt_有义-pdk2内含子-额外-300-nt_反义-CHS_反义-ocs终止子>或

3.<CaMV35S-CHS_有义-额外-500-nt有义-pdk2内含子-额外500-nt反义-CHS_反义-ocs终止子>或

4.<CaMV35S-CHS_有义-额外-900-nt有义-pdk2内含子-额外-900-nt_反义-CHS_反义-ocs终止子>

如实施例1所述产生了包含四个上述嵌合基因之一的转化的拟南芥植物系，和如实施例1所述对每个植物系种子的监测CHS基因沉默的UV光下荧光打分。根据荧光程度对独立转基因系进行分类。表1总结了结果。

表1：显示不同类型荧光的独立转基因系数量

	荧光水平
	荧光水平					-	+	++	+++
100nt CHS+100额外nt	12	0	20	0		-	+	++	+++
100nt CHS+100额外nt	12	0	20	0	100nt CHS+300额外nt	11	18	11	1
100nt CHS+500额外nt	5	7	13	0	100nt CHS+300额外nt	11	18	11	1
100nt CHS+500额外nt	5	7	13	0	100nt CHS+900额外nt	18	8	3	0

从这些结果可知，很清楚在ihpRNA构建体中额外核苷酸序列对目标序列的比率越高，获得具有较低程度荧光的转基因植物系的比率越高，即具有较低程度的CHS目标基因表达沉默。

在ihpRNA或dsRNA中包含额外、无关序列有效使转基因系群体中沉默分布向更低范围的基因沉默移动。

实施例3.包含同时编码靶向FLC和CHS的dsRNA区域的嵌合基因的转基因植物系的RNA印迹分析

从包含两个FLC-CHS发夹构建体的不同拟南芥植物系制备RNA。一个构建体是修饰的Hellsgate 12载体(见WO 02/059294)，具有与内含子相邻的FLC发夹，CHS片段插入在attR位点。另一个构建体是修饰的Hellsgate 12，具有与内含子相邻的CHS发夹，FLC片段插入在attR位点。电泳两个等同的凝胶并印迹并且用FLC或CHS反义RNA探针来探测。RNa酶处理该印迹以确保信号是特异性的。图2A表示所产生的放射自显影。表2总结了不同探针和系的杂交量估计并在图2B中图示。看来每个系中FLC和CHS信号的量之间有很好的线性直接相关性，表明一个基因沉默的地方，另一个基因也相同程度地沉默。

表2.使用FLC或CHS反义探针对不同植物中杂交信号的估计

植物	FLC mRNA	CHSmRNA
植物	FLC mRNA	CHSmRNA	HG12 2FLC+2CHS#1	13867	15154
HG12 2FLC+2CHS#2	21962	26467	HG12 2FLC+2CHS#1	13867	15154
HG12 2FLC+2CHS#2	21962	26467	HG12 2FLC+2CHS#3	40434	40096
HG12 2FLC+2CHS#4	0	0	HG12 2FLC+2CHS#3	40434	40096
HG12 2FLC+2CHS#4	0	0	HG12 2FLC+2CHS#5	41122	38987
HG12 2FLC+2CHS#6	16609	23091	HG12 2FLC+2CHS#5	41122	38987
HG12 2FLC+2CHS#6	16609	23091	HG12 2FLC+2CHS#7	18417	3357
HG12 2FLC+2CHS#8	16463	17400	HG12 2FLC+2CHS#7	18417	3357
HG12 2FLC+2CHS#8	16463	17400	HG12 2FLC+2CHS#9	47210	59680
HG12 2FLC+2CHS#10	10792	18879	HG12 2FLC+2CHS#9	47210	59680
HG12 2FLC+2CHS#10	10792	18879	HG12 2CHS+2FLC#1	3399	9694
HG12 2CHS+2FLC#2	3692	14317	HG12 2CHS+2FLC#1	3399	9694
HG12 2CHS+2FLC#2	3692	14317	HG12 2CHS+2FLC#3	1725	51004
HG12 2CHS+2FLC#4	4620	16067	HG12 2CHS+2FLC#3	1725	51004
HG12 2CHS+2FLC#4	4620	16067	HG12 2CHS+2FLC#5	21826	38643
HG12 2CHS+2FLC#7	13288	34043	HG12 2CHS+2FLC#5	21826	38643
HG12 2CHS+2FLC#7	13288	34043	HG12 2CHS+2FLC#8	6716	5949
HG12 2CHS+2FLC#9	3027	8036	HG12 2CHS+2FLC#8	6716	5949
HG12 2CHS+2FLC#9	3027	8036	HG12 2CHS+2FLC#10	1021	4677
C24野生型	23376	36279	HG12 2CHS+2FLC#10	1021	4677

参考文献

An et al.，1996 The Plant Cell 8，15-30

Butler and Chamberlin，1982 J.Biol.Chem.，257：5772-5778

Dunn and Studier 1983 J.Mol.Biol.166：477-535

Dunn et al.，1971 Nature New Biology，230：94-96

Fire et al.，1998 Nature 391，806-811

Hamilton et al.1998 Plant J.15：737-746

Hapster et al.，1988 Mol.Gen.Genet.212，182-190

Hausmann，1976 Current Topics in Microbiology and Immunology，75：77-109

Hudspeth et al.，1989 Plant Mol Biol 12：579-589

Keil et al.，1989 EMBO J.8：1323-1330

Keller et al.，1988 EMBO J，7：3625-3633

Keller et al.，1989 Genes Devel.3：1639-1646

Klement et al.，1990 J.Mol.Biol.215，21-29

Korsten et al.，1975 J.Gen Virol.43：57-73

McGraw et al，1 985 Nucl.Acid Res.13：6753-6766

Needleman and Wunsch 1970

Peleman et al.，1989 Gene 84：359-369

Smith et al.，2000 Nature 407：319-320

Towle et al.，J.Biol.Chem.250：1723-1733(1975)

Waterhouse et al.1998 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13959-13964

序列表

<110>Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization

<120>监测和调节基因沉默的方法和工具

<130>COLINA-PCT

<150>US 60363852

<151>2003-03-14

<160>7

<170>PatentIn version 3.0

<210>1

<211>33

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR扩增CHS/FLC片段的寡核苷酸

<400>1

ctcgagtcta gaggagcaga agctgagatg gag 33

<210>2

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR扩增CHS/FLC片段的寡核苷酸

<400>2

ctgcaggaat aaggtacaaa gttcatc 27

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR扩增CHS/FLC片段的寡核苷酸

<400>3

ctgcaggcac tgctaaccct gagaaac 27

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR扩增CHS/FLC片段的寡核苷酸

<400>4

ggtaccttga cttgggctgg ccccact 27

<210>5

<211>29

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>attB1重组位点

<400>5

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggct 29

<210>6

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>attB2重组位点

<400>6

ggaccacttt gtacaagaaa gctgggt 27

<210>7

<211>17476

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>质粒pHELLSGATE 8

<400>7

ggccgcacta gtgatatccc gcggccatgg cggccgggag catgcgacgt cgggcccaat 60

tcgccctata gtgagtcgta ttacaattca ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg 120

gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg 180

cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc 240

gaatggaaat tgtaaacgtt aatgggtttc tggagtttaa tgagctaagc acatacgtca 300

gaaaccatta ttgcgcgttc aaaagtcgcc taaggtcact atcagctagc aaatatttct 360

tgtcaaaaat gctccactga cgttccataa attcccctcg gtatccaatt agagtctcat 420

attcactctc aatccaaata atctgcaatg gcaattacct tatccgcaac ttctttacct 480

atttccgccc ggatccgggc aggttctccg gccgcttggg tggagaggct attcggctat 540

gactgggcac aacagacaat cggctgctct gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag 600

gggcgcccgg ttctttttgt caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga actgcaggac 660

gaggcagcgc ggctatcgtg gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac 720

gttgtcactg aagcgggaag ggactggctg ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc 780

ctgtcatctc accttgctcc tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc aatgcggcgg 840

ctgcatacgc ttgatccggc tacctgccca ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag 900

cgagcacgta ctcggatgga agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcat 960

caggggctcg cgccagccga actgttcgcc aggctcaagg cgcgcatgcc cgacggcgag 1020

gatctcgtcg tgacccatgg cgatgcctgc ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgc 1080

ttttctggat tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcg 1140

ttggctaccc gtgatattgc tgaagagctt ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg 1200

ctttacggta tcgccgctcc cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgag 1260

ttcttctgag cgggactctg gggttcgaaa tgaccgacca agcgacgccc aacctgccat 1320

cacgagattt cgattccacc gccgccttct atgaaaggtt gggcttcgga atcgttttcc 1380

gggacgccgg ctggatgatc ctccagcgcg gggatctcat gctggagttc ttcgcccacc 1440

ccgatccaac acttacgttt gcaacgtcca agagcaaata gaccacgaac gccggaaggt 1500

tgccgcagcg tgtggattgc gtctcaattc tctcttgcag gaatgcaatg atgaatatga 1560

tactgactat gaaactttga gggaatactg cctagcaccg tcacctcata acgtgcatca 1620

tgcatgccct gacaacatgg aacatcgcta tttttctgaa gaattatgct cgttggagga 1680

tgtcgcggca attgcagcta ttgccaacat cgaactaccc ctcacgcatg cattcatcaa 1740

tattattcat gcggggaaag gcaagattaa tccaactggc aaatcatcca gcgtgattgg 1800

taacttcagt tccagcgact tgattcgttt tggtgctacc cacgttttca ataaggacga 1860

gatggtggag taaagaagga gtgcgtcgaa gcagatcgtt caaacatttg gcaataaagt 1920

ttcttaagat tgaatcctgt tgccggtctt gcgatgatta tcatataatt tctgttgaat 1980

tacgttaagc atgtaataat taacatgtaa tgcatgacgt tatttatgag atgggttttt 2040

atgattagag tcccgcaatt atacatttaa tacgcgatag aaaacaaaat atagcgcgca 2100

aactaggata aattatcgcg cgcggtgtca tctatgttac tagatcgaat taattccagg 2160

cggtgaaggg caatcagctg ttgcccgtct cactggtgaa aagaaaaacc accccagtac 2220

attaaaaacg tccgcaatgt gttattaagt tgtctaagcg tcaatttgtt tacaccacaa 2280

tatatcctgc caccagccag ccaacagctc cccgaccggc agctcggcac aaaatcacca 2340

ctcgatacag gcagcccatc agtccgggac ggcgtcagcg ggagagccgt tgtaaggcgg 2400

cagactttgc tcatgttacc gatgctattc ggaagaacgg caactaagct gccgggtttg 2460

aaacacggat gatctcgcgg agggtagcat gttgattgta acgatgacag agcgttgctg 2520

cctgtgatca aatatcatct ccctcgcaga gatccgaatt atcagccttc ttattcattt 2580

ctcgcttaac cgtgacaggc tgtcgatctt gagaactatg ccgacataat aggaaatcgc 2640

tggataaagc cgctgaggaa gctgagtggc gctatttctt tagaagtgaa cgttgacgat 2700

gtcgacggat cttttccgct gcataaccct gcttcggggt cattatagcg attttttcgg 2760

tatatccatc ctttttcgca cgatatacag gattttgcca aagggttcgt gtagactttc 2820

cttggtgtat ccaacggcgt cagccgggca ggataggtga agtaggccca cccgcgagcg 2880

ggtgttcctt cttcactgtc ccttattcgc acctggcggt gctcaacggg aatcctgctc 2940

tgcgaggctg gccggctacc gccggcgtaa cagatgaggg caagcggatg gctgatgaaa 3000

ccaagccaac caggggtgat gctgccaact tactgattta gtgtatgatg gtgtttttga 3060

ggtgctccag tggcttctgt ttctatcagc tgtccctcct gttcagctac tgacggggtg 3120

gtgcgtaacg gcaaaagcac cgccggacat cagcgctatc tctgctctca ctgccgtaaa 3180

acatggcaac tgcagttcac ttacaccgct tctcaacccg gtacgcacca gaaaatcatt 3240

gatatggcca tgaatggcgt tggatgccgg gcaacagccc gcattatggg cgttggcctc 3300

aacacgattt tacgtcactt aaaaaactca ggccgcagtc ggtaacctcg cgcatacagc 3360

cgggcagtga cgtcatcgtc tgcgcggaaa tggacgaaca gtggggctat gtcggggcta 3420

aatcgcgcca gcgctggctg ttttacgcgt atgacagtct ccggaagacg gttgttgcgc 3480

acgtattcgg tgaacgcact atggcgacgc tggggcgtct tatgagcctg ctgtcaccct 3540

ttgacgtggt gatatggatg acggatggct ggccgctgta tgaatcccgc ctgaagggaa 3600

agctgcacgt aatcagcaag cgatatacgc agcgaattga gcggcataac ctgaatctga 3660

ggcagcacct ggcacggctg ggacggaagt cgctgtcgtt ctcaaaatcg gtggagctgc 3720

atgacaaagt catcgggcat tatctgaaca taaaacacta tcaataagtt ggagtcatta 3780

cccaaccagg aagggcagcc cacctatcaa ggtgtactgc cttccagacg aacgaagagc 3840

gattgaggaa aaggcggcgg cggccggcat gagcctgtcg gcctacctgc tggccgtcgg 3900

ccagggctac aaaatcacgg gcgtcgtgga ctatgagcac gtccgcgagc tggcccgcat 3960

caatggcgac ctgggccgcc tgggcggcct gctgaaactc tggctcaccg acgacccgcg 4020

cacggcgcgg ttcggtgatg ccacgatcct cgccctgctg gcgaagatcg aagagaagca 4080

ggacgagctt ggcaaggtca tgatgggcgt ggtccgcccg agggcagagc catgactttt 4140

ttagccgcta aaacggccgg ggggtgcgcg tgattgccaa gcacgtcccc atgcgctcca 4200

tcaagaagag cgacttcgcg gagctggtat tcgtgcaggg caagattcgg aataccaagt 4260

acgagaagga cggccagacg gtctacggga ccgacttcat tgccgataag gtggattatc 4320

tggacaccaa ggcaccaggc gggtcaaatc aggaataagg gcacattgcc ccggcgtgag 4380

tcggggcaat cccgcaagga gggtgaatga atcggacgtt tgaccggaag gcatacaggc 4440

aagaactgat cgacgcgggg ttttccgccg aggatgccga aaccatcgca agccgcaccg 4500

tcatgcgtgc gccccgcgaa accttccagt ccgtcggctc gatggtccag caagctacgg 4560

ccaagatcga gcgcgacagc gtgcaactgg ctccccctgc cctgcccgcg ccatcggccg 4620

ccgtggagcg ttcgcgtcgt ctcgaacagg aggcggcagg tttggcgaag tcgatgacca 4680

tcgacacgcg aggaactatg acgaccaaga agcgaaaaac cgccggcgag gacctggcaa 4740

aacaggtcag cgaggccaag caggccgcgt tgctgaaaca cacgaagcag cagatcaagg 4800

aaatgcagct ttccttgttc gatattgcgc cgtggccgga cacgatgcga gcgatgccaa 4860

acgacacggc ccgctctgcc ctgttcacca cgcgcaacaa gaaaatcccg cgcgaggcgc 4920

tgcaaaacaa ggtcattttc cacgtcaaca aggacgtgaa gatcacctac accggcgtcg 4980

agctgcgggc cgacgatgac gaactggtgt ggcagcaggt gttggagtac gcgaagcgca 5040

cccctatcgg cgagccgatc accttcacgt tctacgagct ttgccaggac ctgggctggt 5100

cgatcaatgg ccggtattac acgaaggccg aggaatgcct gtcgcgccta caggcgacgg 5160

cgatgggctt cacgtccgac cgcgttgggc acctggaatc ggtgtcgctg ctgcaccgct 5220

tccgcgtcct ggaccgtggc aagaaaacgt cccgttgcca ggtcctgatc gacgaggaaa 5280

tcgtcgtgct gtttgctggc gaccactaca cgaaattcat atgggagaag taccgcaagc 5340

tgtcgccgac ggcccgacgg atgttcgact atttcagctc gcaccgggag ccgtacccgc 5400

tcaagctgga aaccttccgc ctcatgtgcg gatcggattc cacccgcgtg aagaagtggc 5460

gcgagcaggt cggcgaagcc tgcgaagagt tgcgaggcag cggcctggtg gaacacgcct 5520

gggtcaatga tgacctggtg cattgcaaac gctagggcct tgtggggtca gttccggctg 5580

ggggttcagc agccagcgct ttactggcat ttcaggaaca agcgggcact gctcgacgca 5640

cttgcttcgc tcagtatcgc tcgggacgca cggcgcgctc tacgaactgc cgataaacag 5700

aggattaaaa ttgacaattg tgattaaggc tcagattcga cggcttggag cggccgacgt 5760

gcaggatttc cgcgagatcc gattgtcggc cctgaagaaa gctccagaga tgttcgggtc 5820

cgtttacgag cacgaggaga aaaagcccat ggaggcgttc gctgaacggt tgcgagatgc 5880

cgtggcattc ggcgcctaca tcgacggcga gatcattggg ctgtcggtct tcaaacagga 5940

ggacggcccc aaggacgctc acaaggcgca tctgtccggc gttttcgtgg agcccgaaca 6000

gcgaggccga ggggtcgccg gtatgctgct gcgggcgttg ccggcgggtt tattgctcgt 6060

gatgatcgtc cgacagattc caacgggaat ctggtggatg cgcatcttca tcctcggcgc 6120

acttaatatt tcgctattct ggagcttgtt gtttatttcg gtctaccgcc tgccgggcgg 6180

ggtcgcggcg acggtaggcg ctgtgcagcc gctgatggtc gtgttcatct ctgccgctct 6240

gctaggtagc ccgatacgat tgatggcggt cctgggggct atttgcggaa ctgcgggcgt 6300

ggcgctgttg gtgttgacac caaacgcagc gctagatcct gtcggcgtcg cagcgggcct 6360

ggcgggggcg gtttccatgg cgttcggaac cgtgctgacc cgcaagtggc aacctcccgt 6420

gcctctgctc acctttaccg cctggcaact ggcggccgga ggacttctgc tcgttccagt 6480

agctttagtg tttgatccgc caatcccgat gcctacagga accaatgttc tcggcctggc 6540

gtggctcggc ctgatcggag cgggtttaac ctacttcctt tggttccggg ggatctcgcg 6600

actcgaacct acagttgttt ccttactggg ctttctcagc cgggatggcg ctaagaagct 6660

attgccgccg atcttcatat gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac 6720

cgcatcaggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg 6780

cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat 6840

aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc 6900

gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc 6960

tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga 7020

agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt 7080

ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcaa tgctcacgct gtaggtatct cagttcggtg 7140

taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc 7200

gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg 7260

gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc 7320

ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg 7380

ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc 7440

gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatat 7500

caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt 7560

taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa 7620

aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa 7680

tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc 7740

tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct 7800

gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca 7860

gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt 7920

aaacaagtgg cagcaacgga ttcgcaaacc tgtcacgcct tttgtgccaa aagccgcgcc 7980

aggtttgcga tccgctgtgc caggcgttag gcgtcatatg aagatttcgg tgatccctga 8040

gcaggtggcg gaaacattgg atgctgagaa ccatttcatt gttcgtgaag tgttcgatgt 8100

gcacctatcc gaccaaggct ttgaactatc taccagaagt gtgagcccct accggaagga 8160

ttacatctcg gatgatgact ctgatgaaga ctctgcttgc tatggcgcat tcatcgacca 8220

agagcttgtc gggaagattg aactcaactc aacatggaac gatctagcct ctatcgaaca 8280

cattgttgtg tcgcacacgc accgaggcaa aggagtcgcg cacagtctca tcgaatttgc 8340

gaaaaagtgg gcactaagca gacagctcct tggcatacga ttagagacac aaacgaacaa 8400

tgtacctgcc tgcaatttgt acgcaaaatg tggctttact ctcggcggca ttgacctgtt 8460

cacgtataaa actagacctc aagtctcgaa cgaaacagcg atgtactggt actggttctc 8520

gggagcacag gatgacgcct aacaattcat tcaagccgac accgcttcgc ggcgcggctt 8580

aattcaggag ttaaacatca tgagggaagc ggtgatcgcc gaagtatcga ctcaactatc 8640

agaggtagtt ggcgtcatcg agcgccatct cgaaccgacg ttgctggccg tacatttgta 8700

cggctccgca gtggatggcg gcctgaagcc acacagtgat attgatttgc tggttacggt 8760

gaccgtaagg cttgatgaaa caacgcggcg agctttgatc aacgaccttt tggaaacttc 8820

ggcttcccct ggagagagcg agattctccg cgctgtagaa gtcaccattg ttgtgcacga 8880

cgacatcatt ccgtggcgtt atccagctaa gcgcgaactg caatttggag aatggcagcg 8940

caatgacatt cttgcaggta tcttcgagcc agccacgatc gacattgatc tggctatctt 9000

gctgacaaaa gcaagagaac atagcgttgc cttggtaggt ccagcggcgg aggaactctt 9060

tgatccggtt cctgaacagg atctatttga ggcgctaaat gaaaccttaa cgctatggaa 9120

ctcgccgccc gactgggctg gcgatgagcg aaatgtagtg cttacgttgt cccgcatttg 9180

gtacagcgca gtaaccggca aaatcgcgcc gaaggatgtc gctgccgact gggcaatgga 9240

gcgcctgccg gcccagtatc agcccgtcat acttgaagct aggcaggctt atcttggaca 9300

agaagatcgc ttggcctcgc gcgcagatca gttggaagaa tttgttcact acgtgaaagg 9360

cgagatcacc aaggtagtcg gcaaataatg tctaacaatt cgttcaagcc gacgccgctt 9420

cgcggcgcgg cttaactcaa gcgttagaga gctggggaag actatgcgcg atctgttgaa 9480

ggtggttcta agcctcgtac ttgcgatggc atcggggcag gcacttgctg acctgccaat 9540

tgttttagtg gatgaagctc gtcttcccta tgactactcc ccatccaact acgacatttc 9600

tccaagcaac tacgacaact ccataagcaa ttacgacaat agtccatcaa attacgacaa 9660

ctctgagagc aactacgata atagttcatc caattacgac aatagtcgca acggaaatcg 9720

taggcttata tatagcgcaa atgggtctcg cactttcgcc ggctactacg tcattgccaa 9780

caatgggaca acgaacttct tttccacatc tggcaaaagg atgttctaca ccccaaaagg 9840

ggggcgcggc gtctatggcg gcaaagatgg gagcttctgc ggggcattgg tcgtcataaa 9900

tggccaattt tcgcttgccc tgacagataa cggcctgaag atcatgtatc taagcaacta 9960

gcctgctctc taataaaatg ttaggagctt ggctgccatt tttggggtga ggccgttcgc 10020

ggccgagggg cgcagcccct ggggggatgg gaggcccgcg ttagcgggcc gggagggttc 10080

gagaaggggg ggcacccccc ttcggcgtgc gcggtcacgc gccagggcgc agccctggtt 10140

aaaaacaagg tttataaata ttggtttaaa agcaggttaa aagacaggtt agcggtggcc 10200

gaaaaacggg cggaaaccct tgcaaatgct ggattttctg cctgtggaca gcccctcaaa 10260

tgtcaatagg tgcgcccctc atctgtcagc actctgcccc tcaagtgtca aggatcgcgc 10320

ccctcatctg tcagtagtcg cgcccctcaa gtgtcaatac cgcagggcac ttatccccag 10380

gcttgtccac atcatctgtg ggaaactcgc gtaaaatcag gcgttttcgc cgatttgcga 10440

ggctggccag ctccacgtcg ccggccgaaa tcgagcctgc ccctcatctg tcaacgccgc 10500

gccgggtgag tcggcccctc aagtgtcaac gtccgcccct catctgtcag tgagggccaa 10560

gttttccgcg aggtatccac aacgccggcg gccggccgcg gtgtctcgca cacggcttcg 10620

acggcgtttc tggcgcgttt gcagggccat agacggccgc cagcccagcg gcgagggcaa 10680

ccagcccggt gagcgtcgga aagggtcgac atcttgctgc gttcggatat tttcgtggag 10740

ttcccgccac agacccggat tgaaggcgag atccagcaac tcgcgccaga tcatcctgtg 10800

acggaacttt ggcgcgtgat gactggccag gacgtcggcc gaaagagcga caagcagatc 10860

acgattttcg acagcgtcgg atttgcgatc gaggattttt cggcgctgcg ctacgtccgc 10920

gaccgcgttg agggatcaag ccacagcagc ccactcgacc ttctagccga cccagacgag 10980

ccaagggatc tttttggaat gctgctccgt cgtcaggctt tccgacgttt gggtggttga 11040

acagaagtca ttatcgtacg gaatgccagc actcccgagg ggaaccctgt ggttggcatg 11100

cacatacaaa tggacgaacg gataaacctt ttcacgccct tttaaatatc cgttattcta 11160

ataaacgctc ttttctctta ggtttacccg ccaatatatc ctgtcaaaca ctgatagttt 11220

aaactgaagg cgggaaacga caatctgatc atgagcggag aattaaggga gtcacgttat 11280

gacccccgcc gatgacgcgg gacaagccgt tttacgtttg gaactgacag aaccgcaacg 11340

attgaaggag ccactcagcc ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc 11400

attaatgcag ctggcacgac aggtttcccg actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa 11460

ttaatgtgag ttagctcact cattaggcac cccaggcttt acactttatg cttccggctc 11520

gtatgttgtg tggaattgtg agcggataac aatttcacac aggaaacagc tatgaccatg 11580

attacgccaa gctatttagg tgacactata gaatactcaa gctatgcatc caacgcgttg 11640

ggagctctcc catatcgacc tgcaggcggc cgctcgacga attaattcca atcccacaaa 11700

aatctgagct taacagcaca gttgctcctc tcagagcaga atcgggtatt caacaccctc 11760

atatcaacta ctacgttgtg tataacggtc cacatgccgg tatatacgat gactggggtt 11820

gtacaaaggc ggcaacaaac ggcgttcccg gagttgcaca caagaaattt gccactatta 11880

cagaggcaag agcagcagct gacgcgtaca caacaagtca gcaaacagac aggttgaact 11940

tcatccccaa aggagaagct caactcaagc ccaagagctt tgctaaggcc ctaacaagcc 12000

caccaaagca aaaagcccac tggctcacgc taggaaccaa aaggcccagc agtgatccag 12060

ccccaaaaga gatctccttt gccccggaga ttacaatgga cgatttcctc tatctttacg 12120

atctaggaag gaagttcgaa ggtgaaggtg acgacactat gttcaccact gataatgaga 12180

aggttagcct cttcaatttc agaaagaatg ctgacccaca gatggttaga gaggcctacg 12240

cagcaggtct catcaagacg atctacccga gtaacaatct ccaggagatc aaataccttc 12300

ccaagaaggt taaagatgca gtcaaaagat tcaggactaa ttgcatcaag aacacagaga 12360

aagacatatt tctcaagatc agaagtacta ttccagtatg gacgattcaa ggcttgcttc 12420

ataaaccaag gcaagtaata gagattggag tctctaaaaa ggtagttcct actgaatcta 12480

aggccatgca tggagtctaa gattcaaatc gaggatctaa cagaactcgc cgtgaagact 12540

ggcgaacagt tcatacagag tcttttacga ctcaatgaca agaagaaaat cttcgtcaac 12600

atggtggagc acgacactct ggtctactcc aaaaatgtca aagatacagt ctcagaagac 12660

caaagggcta ttgagacttt tcaacaaagg ataatttcgg gaaacctcct cggattccat 12720

tgcccagcta tctgtcactt catcgaaagg acagtagaaa aggaaggtgg ctcctacaaa 12780

tgccatcatt gcgataaagg aaaggctatc attcaagatc tctctgccga cagtggtccc 12840

aaagatggac ccccacccac gaggagcatc gtggaaaaag aagacgttcc aaccacgtct 12900

tcaaagcaag tggattgatg tgacatctcc actgacgtaa gggatgacgc acaatcccac 12960

tatccttcgc aagacccttc ctctatataa ggaagttcat ttcatttgga gaggacacgc 13020

tcgagacaag tttgtacaaa aaagctgaac gagaaacgta aaatgatata aatatcaata 13080

tattaaatta gattttgcat aaaaaacaga ctacataata ctgtaaaaca caacatatcc 13140

agtcactatg aatcaactac ttagatggta ttagtgacct gtagtcgacc gacagccttc 13200

caaatgttct tcgggtgatg ctgccaactt agtcgaccga cagccttcca aatgttcttc 13260

tcaaacggaa tcgtcgtatc cagcctactc gctattgtcc tcaatgccgt attaaatcat 13320

aaaaagaaat aagaaaaaga ggtgcgagcc tcttttttgt gtgacaaaat aaaaacatct 13380

acctattcat atacgctagt gtcatagtcc tgaaaatcat ctgcatcaag aacaatttca 13440

caactcttat acttttctct tacaagtcgt tcggcttcat ctggattttc agcctctata 13500

cttactaaac gtgataaagt ttctgtaatt tctactgtat cgacctgcag actggctgtg 13560

tataagggag cctgacattt atattcccca gaacatcagg ttaatggcgt ttttgatgtc 13620

attttcgcgg tggctgagat cagccacttc ttccccgata acggagaccg gcacactggc 13680

catatcggtg gtcatcatgc gccagctttc atccccgata tgcaccaccg ggtaaagttc 13740

acgggagact ttatctgaca gcagacgtgc actggccagg gggatcacca tccgtcgccc 13800

gggcgtgtca ataatatcac tctgtacatc cacaaacaga cgataacggc tctctctttt 13860

ataggtgtaa accttaaact gcatttcacc agtccctgtt ctcgtcagca aaagagccgt 13920

tcatttcaat aaaccgggcg acctcagcca tcccttcctg attttccgct ttccagcgtt 13980

cggcacgcag acgacgggct tcattctgca tggttgtgct taccagaccg gagatattga 14040

catcatatat gccttgagca actgatagct gtcgctgtca actgtcactg taatacgctg 14100

cttcatagca cacctctttt tgacatactt cgggtagtgc cgatcaacgt ctcattttcg 14160

ccaaaagttg gcccagggct tcccggtatc aacagggaca ccaggattta tttattctgc 14220

gaagtgatct tccgtcacag gtatttattc ggcgcaaagt gcgtcgggtg atgctgccaa 14280

cttagtcgac tacaggtcac taataccatc taagtagttg attcatagtg actggatatg 14340

ttgtgtttta cagtattatg tagtctgttt tttatgcaaa atctaattta atatattgat 14400

atttatatca ttttacgttt ctcgttcagc tttcttgtac aaagtggtct cgaggaattc 14460

ggtaccccag cttggtaagg aaataattat tttctttttt ccttttagta taaaatagtt 14520

aagtgatgtt aattagtatg attataataa tatagttgtt ataattgtga aaaaataatt 14580

tataaatata ttgtttacat aaacaacata gtaatgtaaa aaaatatgac aagtgatgtg 14640

taagacgaag aagataaaag ttgagagtaa gtatattatt tttaatgaat ttgatcgaac 14700

atgtaagatg atatactagc attaatattt gttttaatca taatagtaat tctagctggt 14760

ttgatgaatt aaatatcaat gataaaatac tatagtaaaa ataagaataa ataaattaaa 14820

ataatatttt tttatgatta atagtttatt atataattaa atatctatac cattactaaa 14880

tattttagtt taaaagttaa taaatatttt gttagaaatt ccaatctgct tgtaatttat 14940

caataaacaa aatattaaat aacaagctaa agtaacaaat aatatcaaac taatagaaac 15000

agtaatctaa tgtaacaaaa cataatctaa tgctaatata acaaagcgca agatctatca 15060

ttttatatag tattattttc aatcaacatt cttattaatt tctaaataat acttgtagtt 15120

ttattaactt ctaaatggat tgactattaa ttaaatgaat tagtcgaaca tgaataaaca 15180

aggtaacatg atagatcatg tcattgtgtt atcattgatc ttacatttgg attgattaca 15240

gttgggaagc tgggttcgaa atcgataagc ttggatcctc tagaccactt tgtacaagaa 15300

agctgaacga gaaacgtaaa atgatataaa tatcaatata ttaaattaga ttttgcataa 15360

aaaacagact acataatact gtaaaacaca acatatccag tcactatgaa tcaactactt 15420

agatggtatt agtgacctgt agtcgactaa gttggcagca tcacccgacg cactttgcgc 15480

cgaataaata cctgtgacgg aagatcactt cgcagaataa ataaatcctg gtgtccctgt 15540

tgataccggg aagccctggg ccaacttttg gcgaaaatga gacgttgatc ggatttcaca 15600

actcttatac ttttctctta caagtcgttc ggcttcatct ggattttcag cctctatact 15660

tactaaacgt gataaagttt ctgtaatttc tactgtatcg acctgcagac tggctgtgta 15720

taagggagcc tgacatttat attccccaga acatcaggtt aatggcgttt ttgatgtcat 15780

tttcgcggtg gctgagatca gccacttctt ccccgataac ggagaccggc acactggcca 15840

tatcggtggt catcatgcgc cagctttcat ccccgatatg caccaccggg taaagttcac 15900

gggagacttt atctgacagc agacgtgcac tggccagggg gatcaccatc cgtcgcccgg 15960

gcgtgtcaat aatatcactc tgtacatcca caaacagacg ataacggctc tctcttttat 16020

aggtgtaaac cttaaactgc atttcaccag tccctgttct cgtcagcaaa agagccgttc 16080

atttcaataa accgggcgac ctcagccatc ccttcctgat tttccgcttt ccagcgttcg 16140

gcacgcagac gacgggcttc attctgcatg gttgtgctta ccagaccgga gatattgaca 16200

tcatatatgc cttgagcaac tgatagctgt cgctgtcaac tgtcactgta atacgctgct 16260

tcatagcaca cctctttttg acatacttct gttcttgatg cagatgattt tcaggactat 16320

gacactagcg tatatgaata ggtagatgtt tttattttgt cacacaaaaa agaggctcgc 16380

acctcttttt cttatttctt tttatgattt aatacggcat tgaggacaat agcgagtagg 16440

ctggatacga cgattccgtt tgagaagaac atttggaagg ctgtcggtcg actaagttgg 16500

cagcatcacc cgaagaacat ttggaaggct gtcggtcgac tacaggtcac taataccatc 16560

taagtagttg attcatagtg actggatatg ttgtgtttta cagtattatg tagtctgttt 16620

tttatgcaaa atctaattta atatattgat atttatatca ttttacgttt ctcgttcagc 16680

ttttttgtac aaacttgtct agagtcctgc tttaatgaga tatgcgagac gcctatgatc 16740

gcatgatatt tgctttcaat tctgttgtgc acgttgtaaa aaacctgagc atgtgtagct 16800

cagatcctta ccgccggttt cggttcattc taatgaatat atcacccgtt actatcgtat 16860

ttttatgaat aatattctcc gttcaattta ctgattgtac cctactactt atatgtacaa 16920

tattaaaatg aaaacaatat attgtgctga ataggtttat agcgacatct atgatagagc 16980

gccacaataa caaacaattg cgttttatta ttacaaatcc aattttaaaa aaagcggcag 17040

aaccggtcaa acctaaaaga ctgattacat aaatcttatt caaatttcaa aaggccccag 17100

gggctagtat ctacgacaca ccgagcggcg aactaataac gttcactgaa gggaactccg 17160

gttccccgcc ggcgcgcatg ggtgagattc cttgaagttg agtattggcc gtccgctcta 17220

ccgaaagtta cgggcaccat tcaacccggt ccagcacggc ggccgggtaa ccgacttgct 17280

gccccgagaa ttatgcagca tttttttggt gtatgtgggc cccaaatgaa gtgcaggtca 17340

aaccttgaca gtgacgacaa atcgttgggc gggtccaggg cgaattttgc gacaacatgt 17400

cgaggctcag caggacctgc aggcatgcaa gctagcttac tagtgatgca tattctatag 17460

tgtcacctaa atctgc 17476

Claims

1.一种监测真核生物细胞中目标基因表达降低的方法，所述方法包括步骤

a)给真核细胞提供包含第一区域、第二区域、第三区域和第四区域的dsRNA

i)所述第一区域包含与来自所述目标基因有义核苷酸区域的19个连续核苷酸具有至少94％序列同一性的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列；

ii)所述第二区域包含与来自所述目标基因的所述有义核苷酸区域的19个连续核苷酸的互补核苷酸序列具有至少94％序列同一性的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列；

iii)所述第一区域和所述第二区域能够形成双链RNA区域；

iv)所述第三区域包含与所述真核细胞中存在的不同于所述目标基因的第二个基因的有义核苷酸区域的19个连续核苷酸具有至少94％序列同一性的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列；

v)所述第四区域包含与来自所述第二个基因的所述有义核苷酸区域的所述19个连续核苷酸的互补序列具有至少94％序列同一性的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列；

vi)所述第三区域和所述第四区域能够形成双链RNA区域；和

b)通过分析所述第二个基因表达的降低，监测所述目标基因表达的降低。

2.权利要求1的方法，其中所述真核生物是植物。

3.权利要求1的方法，其中所述真核生物是动物。

4.权利要求1的方法，其中所述真核生物是酵母、真菌或霉菌。

5.权利要求1或权利要求2的方法，其中真核生物选自棉花、马铃薯、玉米、小麦、水稻、甘蔗、油菜籽、拟南芥、甜菜、烟草和大豆。

6.权利要求1或权利要求3的方法，其中所述真核生物选自昆虫、贝类动物、软体动物、甲壳动物、螃蟹、龙虾、对虾、鱼、鸟类动物、哺乳动物和人。

7.权利要求1-6任一项的方法，其中所述第二个基因是所述真核细胞中存在的内源基因。

8.权利要求1-6任一项的方法，其中所述第二个基因是稳定整合到所述真核细胞基因组的转基因。

9.权利要求2或5的方法，其中所述第二个基因选自PDS，EIN2，FLC和PhyB。

10.权利要求1-6任一项的方法，其中所述真核细胞包含功能性表达的GUS或GFP基因，且所述第二个基因是GUS或GFP基因。

11.权利要求1-10任一项的方法，其中所述第一和第二区域，和所述第三和第四区域长度大约300nt。

12.权利要求1-11任一项的方法，其中所述dsRNA从所述真核生物细胞中包含的嵌合基因转录，所述嵌合基因包含：

a)在所述真核细胞中起作用的启动子区域；可操作连接

b)当转录时产生所述dsRNA分子的DNA区域；和

c)在所述真核生物中起作用的转录终止和聚腺苷酸化区域。

13.根据权利要求12的方法，其中所述嵌合基因被稳定整合到所述真核生物细胞的基因组中。

14.如权利要求1-13任一项中所述的RNA分子。

15.根据权利要求14的RNA分子用于测定目标基因表达降低的用途。

16.一种测定真核生物细胞中目标基因表达降低的DNA分子，包含

a)在所述真核细胞中起作用的启动子区域；可操作连接

b)当转录时产生dsRNA分子的DNA区域，所述dsRNA包含第一、第二、第三和第四区域；

ii)所述第二区域包含与来自目标基因的所述有义核苷酸区域的19个连续核苷酸的互补核苷酸序列具有至少94％序列同一性的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列；

iii)所述第一区域和所述第二区域能够形成双链RNA区域；

vi)所述第三和第四区域能够形成双链RNA区域；和

c)在所述真核生物中起作用的转录终止和聚腺苷酸化区域，其中所述第二个基因是所述真核生物的内源基因或稳定整合到所述真核生物细胞基因组的转基因。

17.根据权利要求16的DNA分子通过测定所述第二个基因表达降低来测定所述目标基因表达的用途。

18.包含根据权利要求14的RNA分子的非人真核生物。

19.包含根据权利要求16的DNA分子的非人真核生物。

20.根据权利要求18或19的非人真核生物，其为植物。

21.根据权利要求18或19的非人真核生物，其为动物。

22.根据权利要求18或19的非人真核生物，其为酵母、真菌或霉菌。

23.在dsRNA调节基因沉默的真核生物群体中鉴定具有期望的目标基因的沉默程度的生物的方法，包括：

a)给所述真核生物的细胞提供包含第一区域、第二区域、第三区域和第四区域的dsRNA，

iii)所述第一区域和所述第二区域能够形成双链RNA区域；

vi)所述第三区域和所述第四区域能够形成双链RNA区域；和

b)通过选择具有期望的所述第二个基因的沉默程度的所述生物，鉴定具有所述期望的所述目标基因的沉默程度的所述生物。

24.一种调节真核生物细胞中目标基因表达降低的方法，包括步骤

ii)所述第二区域包含与来自所述目标基因的所述有义核苷酸区域的19个连续核苷酸的互补序列具有至少94％序列同一性的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列；

iii)所述第一区域和所述第二区域能够形成双链RNA区域；

iv)所述第三区域和所述第四区域包含与所述目标基因的核苷酸序列具有低于50％的序列同一性和能够形成双链RNA的互补核苷酸序列；

其中所述目标基因是所述真核细胞中的内源基因或是稳定整合到所述真核细胞基因组中的转基因。

25.权利要求24的方法，其中所述第三和第四区域之间碱基配对能够形成的双链RNA的大小等于或大于所述第一和所述第二区域之间碱基配对能够形成的双链RNA的大小。

26.权利要求24或25的方法，其中所述真核生物是植物。

27.权利要求24或25的方法，其中所述真核生物是动物。

28.权利要求24或2 5的方法，其中所述真核生物是酵母、真菌或霉菌。

29.权利要求2 6的方法，其中所述植物选自棉花、马铃薯、玉米、小麦、水稻、甘蔗、油菜籽、拟南芥、甜菜、烟草或大豆。

30.权利要求27的方法，其中所述动物选自昆虫、贝类动物、软体动物、甲壳动物、螃蟹、龙虾、对虾、鱼、鸟类动物、哺乳动物和人。

31.一种调节真核生物细胞中目标基因表达的RNA分子，包含第一区域、第二区域、第三区域和第四区域，

iii)所述第一区域和所述第二区域能够形成双链RNA区域；

其中所述目标基因是所述真核细胞中的内源基因或是稳定整合到所述真核细胞基因组的转基因。

32.能够产生根据权利要求31的dsRNA分子的DNA分子，其包含当转录时产生所述dsRNA分子的DNA区域，所述DNA区域可操作连接启动子和转录终止和聚腺苷酸化信号。

33.根据权利要求31的RNA分子用于调节真核生物中目标基因表达降低的用途。

34.根据权利要求32的DNA分子用于调节真核生物中目标基因表达降低的用途。

35.包含根据权利要求32的DNA分子的非人真核生物。

36.包含根据权利要求31的RNA分子的非人真核生物。