CN1187219A - 选择转基因植物细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于增加在异养培养条件下培养的转化的和非转化的植物细胞混合物中的转化植物细胞的数量的选择方法。根据该方法,在一种培养基中,在异养培养条件下培养转化的和非转化的植物细胞混合物,所述培养基含有非转化植物细胞增殖和生长所需的基本营养和约1.5—3倍标准量的磷,其中不含支持所述生长和增殖的碳源。由加密碳源替代所利用的碳源,所述加密碳源不支持所述的非转化植物细胞的生长和增殖。转化的植物细胞有插入到至少含有一个表达盒的其基因组中的异源DNA片段。该表达盒含有一个异源DNA选择性标记片段,该片段包括编码异源酶的第一异源基因,该基因的表达将加密碳源转化为在异养培养条件下支持转化植物细胞生长和增殖的碳源。另外,本发明还涉及提高在延迟的选择性培养条件下培养的转化的和非转化的植物细胞混合物中转化植物细胞的数量的选择方法。

Description

选择转基因植物细胞的方法
技术领域
本发明涉及遗传工程转化的植物，更具体地说涉及选择在异养培养条件下培养的转化的植物细胞的方法、用于选择性地增加从在异养培养条件下培养的转化的和非转化的植物细胞混合物中再生的转化植物的数量的方法，以及涉及转化的生根植物和用于形成转化植物的试剂盒。
背景领域
目前使用的用于选择转基因植物细胞的技术包括对加入到再生培养基中的毒性物质有抗性的原核基因的利用，其中所述毒性物质不是细胞生长所必需的。这些毒性添加物是以毒性浓度加入的抗菌素、除草剂、氨基酸或氨基酸类似物。虽然通常可有效地选择遗传工程修饰的植物细胞，但是这些系统有局限。例如，它们可能对某些类型的植物是无效的，或它们造成遗传工程改造植物的异常表现型。另外，这些选择剂的利用具有不令人满意的副作用，因此产生了令公众关注的环境安全问题。
已经将抗菌素例如卡那霉素、G418、潮霉素、博来霉素和链霉素等用于转基因植物的选择[Bevan等人，自然，394：184-187(1983)；Dekeyser等人，植物生理学，90：217-223(1989)；Hille等人，植物分子生物学，7：171-176(1986)；Jones等人，Mol.Gen.Gen.，210：86-91(1987)；Mulsant等人，体细胞分子遗传学，14：243-252(1988)；Vanden Elzen等人，植物分子生物学，5：299-302(1985)；Waldron等人，植物分子生物学，5：103-108(1985)]。但是，不是所有的植物对所述抗菌素同样敏感，通常使用的卡那霉素作为禾本科植物的选择剂是无效的；来自该组的一些作物能够忍受高达800毫克/升的卡那霉素[Dekeyser等人，植物生理学，90：217-223(1989)；Hauptmann等人，植物生理学，86：1216-1222(1988)]。
另外，由于其对真核细胞的高毒性，抗菌素的使用从根本上说(但不是必然的)有负面作用。例如，由于干扰蛋白质的合成，潮霉素有广谱的原核细胞和真核细胞毒性[Waldron等人，植物分子生物学，5：103-108(1985)]。博来霉素是用于人癌症治疗的细胞毒性药剂并且已知具有肺毒性[Gatignol等人，FEBS Lett.，230：171-175(1988)；Hille等人，植物分子生物学，7：171-176(1986)；Mulsant等人，体细胞分子遗传学，14：243-252(1988)]。许多抗菌素也是潜在的过敏源。因此，在常规的转基因植物选择中过度地使用抗菌素能够损害研究人员的健康。还可能导致由于转基因植物细胞的裂解，编码抗菌素抗性的DNA被细菌吸收，使细菌具有抗菌素抗性，从而对公众健康造成威胁。
已经有人建议将除草剂例如chlorsulfuron、2，4-D、草甘瞵、phosphinotricin和其它用作选择剂[De Block等人，EMBO J.，6：2513-2518(1987)；Dekeyser等人，植物生理学，90：217-223(1989)；Li等人，植物生理学，100：662-668(1992)；Streber等人，生物/技术，7：811-816(1989)；Shah等人，科学，233：478-481(1986)；White等人，核酸研究，18：1062(1990)]。在鉴定转基因植物时使用除草剂抗性能够导致转基因植物生长加快，因为它们在作物轮作变换几年后成为除草剂抗性植物。与野生型的异型杂交也是办法。如果对除草剂抗性机理是基于脱毒过程，那么可能它的一种或多种代谢产物有毒性(Stalker等人，科学，242：419-423(1988))。此外，抗除草剂的作物的使用可能将会提高环境中除草剂的负载量。
由于在高浓度使用时能够抑制细胞生长，一些氨基酸例如赖氨酸和苏氨酸或赖氨酸的衍生物氨基乙基半胱氨酸(ACE)也可以用作为选择剂[Shaul等人，The Plant J.，2：203-209(1992)；Perl等人，生物/技术，11：715-718(1993)]。在该选择系统中，使转基因细胞在选择条件下能生长的选择标记基因的表达，导致转基因细胞过量产生特定的氨基酸，从而抵抗选择压力。在一些情况下，将会导致异常的植物发育[Shaul等人，The Plant J.，2：203-209(1992)]。而且，在这样的系统中选定的转基因植物永久性地改变了其氨基酸组成，这影响了转基因植物的营养价值[Perl等人，生物/技术，11：715-718(1993)]。
为了能够通用，可选择标记必须满足一定的标准。选择必须是严谨的，只有最小量的非转化植物组织能够从选择过程中逃生。选择过程应该大量地独立转化，并且不会显著干扰再生。另外，该标记应该在大量的植物品种中运作良好，应该有对转化组织进行评分的检测方法用于证实标记基因的表达。
与选择性标记相关的另一个现象是，一旦借助于标记选定了转化植物细胞并且再生出生根植物，该标记基因则继续在成熟的、自养生长的植物中表达。因此，如上所述，转基因植物能够永久性地表达被改变了的氨基酸组成或表达抗菌素抗性基因。一旦完成了选定和再生，自养生根植物则在最小程度上或完全不表达该标记是有利的。
本发明提供了满足上述标准并同时避免了毒性或对环境不安全物质的转化植物细胞的选择方法。本发明还提供了在异养培养条件下，选择性地增加从转化的和非转化的植物细胞的混合物中再生出的转化植物细胞数量的方法。本发明还提供了在选择过程结束后，使选择性标记的表达可被降低或停止的方式。
发明简述
本发明涉及使在异养条件下培养的转化植物细胞选择性地生长的方法。还涉及用于选择性地提高自异养培养条件下培养的转化的和非转化的植物细胞的混合物中再生出的转化植物细胞数量的方法。进一步还涉及用于提高自延迟的异养培养条件下转化的和非转化的植物细胞的混合物中再生出的转化植物细胞数量的方法。进一步本发明还涉及其基因组含有可鉴定的异源、外源供应的DNA片段的转化植物，所述DNA片段最少含有一个表达盒。也涉及用于转化植物细胞的试剂盒。
因此，在一个实施方案中，涉及转化植物细胞的选择方法。根据该方法，
(a)在一种培养基中，在异养培养条件下，培养转化的和非转化的植物细胞的混合物，所述培养基含有那些植物细胞增殖和生长需要的基本营养，其中不含用来支持所述生长和增殖的碳源。该碳源被一种加密或潜在的(有限生长)碳源替代，该加密碳源不支持非转化植物细胞的生长和增殖。该混合物中的转化细胞含有包含最少两个表达盒的基因组异源DNA片段。
第一表达盒含有异源DNA可选择标记片段，该片段包括(i)编码一种异源酶的第一异源基因，所述异源酶的表达将加密碳源转化为在异养培养条件下支持转化植物细胞生长和增殖的一种碳源。该第一异源基因可操作地与(ii)控制该异源基因表达的第一启动子DNA片段和(iii)终止子DNA片段相连。第二表达盒含有(i)在转化植物中表达的第二基因，该基因可操作地与(ii)控制该第二基因表达的第二启动子DNA片段和(iii)终止子DNA片段相连。
(b)使异养培养条件保持足以使转化植物细胞表达异源酶、增殖和生长的一段时间。由于非转化的植物细胞不能利用加密或潜在的碳源，因此这些细胞不生长和增殖。从而从非转化植物细胞中选出生长和增殖的转化细胞。
特别优选的第一基因编码磷酸甘露糖异构酶(pmi；EC5.3.1.8)，该酶将不可利用的甘露糖-6-磷酸转化为可以被植物细胞用作碳源支持细胞生长和增殖的果糖-6-磷酸。pmi基因也称为manA基因，本文经常将该基因称作为pmi/manA。与第一基因一起使用的加密碳源(生长限制碳源)是甘露糖。另一个优选的有用基因编码甘露醇-1-氧化还原酶，该酶将甘露醇转化为甘露糖，而此处甘露醇是加密(有限生长)碳源。对已经用pmi/manA基因转化的植物细胞使用第二基因和其加密碳源。另一个优选的第一基因编码人L-艾杜糖醇脱氢酶(EC1.1.1.14)，该酶将山梨醇转化为果糖，因此山梨醇被用作加密(有限生长)碳源。也可以利用类似的醛还原酶基因。
此后，可收集如此产生和选出的增殖细胞或借助于分生组织或胚胎，通过在合适的培养基上培养使之再生为成熟植物，或借助于愈伤组织转化为分生组织或胚胎。因此，优选的是收集选出的增殖细胞，之后再生为自养生长的成熟植物。更优选的是上述方法利用附加步骤：
(c)回收选出的增殖细胞；和/或
(d)自这些增殖细胞再生植物。
第一表达盒的启动子被转基因植物的正常自养代谢的产物阻抑，该产物在非转基因植物中也存在。优选启动子的例子包括黄瓜异柠檬酸裂合酶启动子和水稻α-淀粉酶Amy3A启动子。
第二基因和随后的表达盒中的基因可以是期望在植物中表达的任何基因，其启动子和终止子DNA片段可以是在植物中操作所期望的启动子和终止子。
在第二个实施方案中，涉及用于提高在异养培养条件下培养的转化的和非转化的植物细胞的混合物中的转化植物细胞数量的选择方法。根据该方法，
(a)在一种培养基中，在异养培养条件下，培养转化的和非转化的植物细胞混合物，所述培养基含有非转化植物细胞增殖和生长需要的基本营养和约1.5-3倍标准量的磷，但其中不含支持生长和增殖的碳源。所用的碳源由加密碳源替代，所述加密碳源不支持所述的非转化植物细胞的生长和增殖。混合物中的转化细胞具有插入到其基因组中的异源DNA片段，其基因组含有至少一个表达盒。
所述的至少一个表达盒含有异源DNA可选择标记片段，该片段包括(i)编码异源酶的第一异源基因，所述异源酶的表达使加密碳源转化为在异养培养条件下支持转化植物细胞生长和增殖的一种碳源。该第一基因可操作地与(ii)控制该异源基因表达的第一启动子DNA片段和(iii)终止子DNA片段相连。
(b)使异养培养条件保持足以使转化植物细胞表达异源酶、增殖和生长的一段时间。
在第三个实施方案中，涉及用于在延迟的选择性培养条件下培养的转化的和非转化的植物细胞的混合物中提高转化植物细胞数量的选择方法。根据该方法，
(a)在第一种培养基中，培养转化的和非转化的植物细胞混合物长达2星期，所述培养基含有转化和非转化的植物细胞增殖和生长需要的基本营养，其中包括支持转化的和非转化的植物细胞生长和增殖的碳源。转化的植物细胞具有含有至少一个表达盒的异源基因组DNA片段。
所述的至少一个表达盒含有异源DNA可选择标记片段，该片段包括(i)编码异源酶的第一异源基因，所述异源酶的表达使加密碳源转化为在异养培养条件下支持所述的转化的植物细胞生长和增殖的一种碳源。该第一基因可操作地与(ii)控制该异源基因表达的第一启动子DNA片段和(iii)终止子DNA片段相连。
(b)在第一培养基中培养足够时间之后，从第一培养基中取出转化和非转化的植物细胞。
(c)然后将转化和非转化的植物细胞置于第二培养基的异养培养条件下，所述培养基含有非转化植物细胞增殖和生长需要的基本营养和约1.5-3倍标准量的磷，其中不含不支持所述的非转化植物细胞生长和增殖的加密碳源。
(d)使异养培养条件保持足以使转化的植物细胞表达异源酶、增殖和生长的一段时间。
本发明进一步涉及了其基因组包括异源DNA片段的转基因植物，所述异源DNA片段至少含有两个表达盒。
第一表达盒含有异源DNA可选择标记片段，该片段包括(i)编码一种异源酶的第一异源基因，在细胞异养培养期间转化植物表达的异源酶将加密碳源转化为支持转化的植物细胞生长和增殖的一种碳源，所述加密碳源不支持相同类型的非转化植物细胞的生长和增殖。该第一基因可操作地与(ii)控制该异源基因表达的第一启动子DNA片段和(iii)终止子DNA片段相连。第二表达盒含有(i)在转化植物中表达的第二基因，该基因可操作地与(ii)控制该第二基因表达的第二启动子DNA片段和(iii)终止子DNA片段相连。
前面所述的优选方案也适用于有关转基因植物中的第一基因和其启动子，第二基因和其启动子也如前面讨论的。
本发明还涉及用于形成转化植物细胞的试剂盒。该试剂盒包括：
(a)含有转化植物细胞的DNA片段的第一包裹，所述DNA片段含有可操作地与含有至少一个限制性内切酶位点的接头片段相连的表达盒。该表达盒含有异源DNA可选择标记片段，该片段包括(i)编码异源酶的第一异源基因，在转化的植物细胞的异源培养期间，该异源酶的表达将不支持非转化植物细胞生长和增殖的加密碳源转化为支持转化植物细胞生长和增殖的一种碳源。第一异源基因可操作地与(ii)控制该异源基因表达的启动子DNA片段和(iii)终止子DNA片段相连。
(b)以及第二包裹，它含有在异源培养期间植物细胞增殖和生长需要的除碳源外的基本营养和约1.5-3倍标准量的磷。由加密碳源替代所述的碳源，所述加密碳源不支持所述的非转化植物细胞的生长和增殖，但支持转化植物细胞的生长和增殖，转化植物细胞的基因组中含有第一包裹中的DNA片段。还优选提供使用该盒成份的说明书。
本发明具有几个益处和优点。
本发明的一个益处是其选择性的生长方法不依赖于潜在有害的抗菌素、除草剂或其它可能的有毒物质。
本发明的一个优点是其加密(有限生长)碳源可以是和优选是碳水化合物。
本发明另一个益处是在自养生长条件下，在再生的植物中可选择标记的表达可被抑制。
本发明的另一个优点是可选择标记基因可以与任何第二表达基因一起利用。
本发明的又一益处是本发明的试剂盒提供了用于将第二表达盒插入到植物转化载体中的简便装置和用于加强转化和选择转化植物细胞生长的合适的选择性培养基。
又有一个优点是可以进行连续的转化，其中由第二可选择标记基因将加密(有限生长)碳源转化为另一加密(有限生长)碳水化合物，该碳水化合物再由也存在于转化细胞中的第一可选择标记基因转化为有用的碳源。
根据下面公开的内容，本领域内技术人员对本发明的其它益处和优点是显而易见的。
序列表简述
SEQ ID NO：1是ClaI片段的1650碱基对的序列表，该片段含有鼠伤寒沙门氏菌磷酸甘露糖异构酶(pmi)基因。
SEQ ID NO：2是pmi的氨基酸序列。
SEQ ID NO：3是用于帮助pmi基因克隆到植物转化载体的引物之一的序列。该引物对应于SEQ ID NO：1的391-410碱基，其中在碱基403位由腺嘌呤替代胸腺嘧啶。
SEQ ID NO：4是用于帮助pmi基因克隆到植物转化载体的另一引物的序列。该引物对应于SEQ ID NO：1的1617-1641碱基，其中在碱基1628位由胞嘧啶替代鸟嘌呤，在碱基1630位由胞嘧啶替代胸腺嘧啶。
附图简述
附图1显示植物中甘露醇和蔗糖生物合成之间的关系。圆圈内的号码用于标识催化反应的酶，显示如下：(1)甘露醇-1-磷酸磷酸酯酶，(2)甘露糖激酶，(3)甘露醇-6-磷酸还原酶，(4)甘露糖-6-磷酸异构酶，和(5)蔗糖磷酸合成酶。
附图2描述质粒载体pETO148的构建。在该附图的圆圈中说明了该构建过程操作和产生的重组DNA。该构建过程是由该附图中与圆圈相连接的箭头指明的和如本文详述的一系列步骤进行的。在圆圈中由插入圆圈的标记线指明界标和所利用的限制性内切酶位点。由圆圈内的标记箭头指明单独的遗传元件的相对位置和其定向。
附图3显示未经选择的再生植物和用卡那霉素和甘露醇选择的植物群体中NPTII的相对表达。由ELISA测定NPTII的表达，表达单位是405nm处的吸收值。实心圆圈显示非转化植物(阴性对照)的资料。实心三角形显示利用卡那霉素(阳性对照)选择转化植物的资料。实心正方形显示用甘露糖选择转化植物的资料。
发明详述
A.术语的定义
氨基酸：本文中鉴别的所有氨基酸残基是天然的L构型。
自体的：通常存在于非转化细胞中的DNA片段或蛋白质。
外植体：一片植物组织
表达：由编码蛋白质的基因从事的以便产生多肽的细胞内过程(包括转录和转译的组合)。
表达盒：DNA片段构建体，包括可操作地与启动子DNA和DNA终止子片段相连的能表达的基因、以及转译必要的序列、实现表达产物正确加工必需的其它调节信号。
表达载体：当可操作地将基因连接到载体内时，形成调节所需的基因表达的控制元件的DNA序列。特定的所需的表达载体也含有便于整合到植物基因组中的DNA片段。
基因：有机体基因组中的核苷酸序列，在所述有机体中发挥特定的功能。
异源的：在非转化细胞中不存在的DNA片段或蛋白质。
整合的：将掺入到宿主染色体的异源DNA序列整合。
可操作地相连或插入：第一DNA序列例如启动子DNA序列可操作地与第二DNA序列例如异源基因DNA序列相连，如果两者的定位便于启动子DNA序列影响异源基因DNA序列的转录和转译。
启动子：提供基因表达控制元件的DNA序列或DNA序列组上的识别位点，RNA聚合酶特异性结合到该位点上并且驱动该基因的RNA合成(转录)。
编码蛋白质的基因：借助于RNA中间体编码多肽也就是氨基酸残基序列的DNA序列。
重组DNA分子：包括至少两个核苷酸序列的杂合DNA序列，在体外不会形成。
相同类型或相同植物株：相同杂交的植物或非转化植物的克隆。
转基因植物：含有整合在染色体上的异源或外源DNA的植物，其表达是组成型或可调节的。
载体：能够在细胞中复制的DNA分子和/或另一个DNA片段可操作连接到其上以便使插入的片段复制的DNA分子。质粒是载体的例子。
B.导入
成年(成熟)形式的高等植物(植物)是自养生物体。因此，成熟植物利用二氧化碳满足其大多数碳的需求。当从种子生长时，萌发的幼苗起初利用富氧种子的一部分供应其碳需求，直到能够固定碳。类似地，当植物细胞在培养基如细胞悬浮液、微球体、原生质体或外植体(统称为植物细胞，因为它们均来自植物并且具有膜包围的核和细胞质)中生长时，培养的植物细胞是异养的，需要外源的碳和其它营养提供。通常该碳源是蔗糖、葡萄糖或另一种碳水化合物，所述碳水化合物易于被生长的细胞代谢，以便它们生长、繁殖和分化，然后再生为成熟植物。
但是，不是所有的碳源(包括一些碳水化合物)都可以被培养的植物细胞代谢。培养的植物在组织培养条件下不具备将许多简单的有机分子转化为能够支持生长和增殖所必需的所有的酶。
例如，在许多哺乳动物糖蛋白中存在的多糖甘露糖不能被用作许多培养植物细胞的碳源。因此，如下文中描述的，甘露糖被培养的西红柿细胞吸收，例如甘露糖被转化为甘露糖-6-磷酸，但是甘露糖-6-磷酸不能被西红柿植物细胞用作细胞生长和增殖的一种碳源。
本发明利用植物细胞不能在异养培养期间利用许多小的含碳化合物作为碳源而生长和繁殖的事实，作为选择性生长转化(遗传工程改造)的植物细胞的一种方法。通过利用细胞转化的标记基因达到这一目的，所述标记基因将不支持细胞生长和增殖的碳源(非可用碳源)转化为支持细胞生长和增殖的碳源(可用碳源)。
因此，当在一种培养基中，在异养培养条件下培养转化的和非转化的植物细胞混合物时，所述培养基含有不支持非转化植物细胞增殖和生长的非可用碳源，本文称为加密、潜在的或生长限制碳源，只有被可选择标记基因转化了的那些植物细胞生长和增殖，所述标记基因的表达产物将加密碳源转化为可用碳源。该碳源是加密(有密码)的，因为植物细胞不能利用其而生长和增殖，只有在转化愈伤组织中存在的可选择标记基因的产物对它解码(解密)或对它作用之后，它才可以用作支持转化植物细胞的生长和增殖的碳源。
C.发明过程
在一个实施方案中，涉及转化植物细胞的选择方法。根据该方法，
(a)在一种培养基中，在异养培养条件下培养转化的和非转化的植物细胞混合物，所述培养基含有那些植物细胞增殖和分化需要的除可用碳源外的基本营养。通常存在的可用碳源被一种加密、潜在的或生长限制的碳源所替代，所述加密碳源不支持所述的非转化植物细胞的生长和增殖。混合物中的转化细胞含有基因组(染色体整合的)异源DNA片段，该片段含有两个表达盒。
第一表达盒含有异源DNA可选择标记片段，该片段包括(i)编码一种异源酶的第一异源基因，所述异源酶的表达将加密碳源转化为在异养培养条件下支持转化植物细胞生长和增殖的一种碳源。该第一异源基因可操作地与(ii)控制该异源基因的表达的第一启动子DNA片段和(iii)终止子DNA片段相连。第二表达盒含有(i)在转化植物中表达的第二异源基因，该异源基因可操作地与(ii)控制该第二异源基因表达的第二启动子DNA片段和(iii)终止子DNA片段相连。
(b)使异养培养条件保持足以使转化植物细胞表达异源酶、增殖和生长的一段时间。由于非转化的植物细胞不能利用加密或潜在的碳源，该植物细胞也不生长和增殖。从而从非转化植物细胞中选出生长和增殖的转化细胞，优选的是收集该选择出的转化细胞以用于再生为植物。
因此第一表达盒DNA含有三个可操作连接的元件：(1)编码将加密碳源转化为可用碳源的异源酶的第一异源基因，(2)控制异源基因表达的第一启动子DNA片段和(3)导致转录终止和转译RNA的3′末端腺苷酸化作用的第一终止DNA片段。
在某些情况下，功能类似于第一表达盒的第一基因的基因存在于非转化植物的基因组中。但是，内源基因的功能不存在于异养培养的植物细胞中，因为非转化植物细胞不能利用相同的被第一基因的异源基因产物转化为可用碳源的加密碳源而生长和增殖。该概念由下列事实加以说明：当利用乳糖或水杨苷作为碳源进行异养培养时，番茄植物不生长和增殖。乳糖易于被β-半乳糖苷酶裂解为葡萄糖和半乳糖，而水杨苷能够被β-葡萄糖苷酶裂解产生葡萄糖。然而，商品β-半乳糖苷酶从jack豆回收，而商品β-半乳糖苷酶是从甜扁桃(Sigma化学公司)回收的，表明植物基因组含有编码各种酶的基因，所述酶一直不足量表达。
第一基因的选择取决于其编码的酶和该酶的功能，在该发明中该酶的功能将加密、非可用碳源转化为可用碳源，所述可用碳源支持异养培养的转基因植物细胞的生长和增殖。继续将第一基因向后选择，可以检测待转化植物细胞不能利用生长和增殖的碳源。
通过在培养基中培养所需的非转化植物细胞易于实施所述的检测，所述培养基含有细胞生长和增殖需要的基本营养，但其中不含碳源。所述培养基是本领域内技术人员熟知的，所述培养基的例子是熟知的Murashigi和Skoog，Physiol.Plant，15：437-498(1962)培养基；MS盐。通常存在于该培养基中的葡萄糖或蔗糖被待检测的碳源替代，待检测的碳源以相同于葡萄糖或蔗糖的浓度存在。
然后按常规程序在获得的培养基中培养植物细胞。测定不支持异养培养细胞生长和增殖的被检测的碳源。不支持本文使用的用于说明的番茄细胞生长和增殖的碳源的例子包括甘露糖、甘露醇、山梨醇、乳糖、海藻糖和水杨苷。另外，证明利用甘露糖作为唯一碳源，燕麦、玉米、甜瓜和南瓜细胞不生长和增殖。
选择将非可用碳源转化为可被植物利用的碳源的酶。可被植物细胞利用以支持生长和增殖的碳源的例子是卡尔文氏循环的化合物，包括葡萄糖、果糖、核糖和甘油酸以及Hatch-Slack途径的化合物包括草酸乙酯、苹果酸和丙酮酸。因此，将前面提及的碳源之一和所述培养基的其它所需的基本营养供应给异养培养的植物细胞，由于植物细胞含有利用所述的化合物进行生长和增殖的内源酶，导致植物细胞的生长和增殖。
由于所有活的生物体利用碳源进行生长和增殖，许多这样的酶是可用的。将非可用碳源转化为可用的6-碳源例如葡萄糖或果糖的酶是优选的，本文举例利用了这些酶。
本文举例使用的优选的酶是磷酸甘露糖异构酶(pmi/manA；E.C.5.3.1.8)，该酶将甘露糖-6-磷酸转化为果糖-6-磷酸；后一化合物支持植物细胞的生长和增殖。当甘露糖用作为加密碳源，由于内源激酶的作用在细胞中形成甘露糖-6-磷酸。在苜蓿根瘤菌(基因，122：35-43)、铜绿假单胞菌(基因，42：293-302)、啤酒酵母(分子和细胞生物学，12：2924-2930)和鼠伤寒沙门氏菌(基因，103：135-136)中磷酸甘露糖异构酶基因称作为pmi基因。在大肠杆菌中磷酸甘露糖异构酶被称作为manA(基因，32：41-48)。
另一种可用的酶是L-艾杜糖醇脱氢酶(EC1.1.1.14)，该酶将山梨醇转化为果糖。已知几种醛脱氢酶可用于将作为加密碳源的山梨醇转化为可用碳源葡萄糖。一种酶的例子是D-山梨醇1-氧化还原酶(EC1.1.00.24)。将加密碳源乳糖转化为葡萄糖和半乳糖的乳糖酶(EC3.2.1.108)、其它几种β-半乳糖苷酶和将加密碳源α，α-海藻糖转化为葡萄糖的α，α-海藻糖酶(EC3.2.1.28)是其它可用酶。
根据对所用的异源标记酶测定的结果，获得了编码所述酶的基因。在文献中报道了编码许多异源标记酶的基因，从作者处可获得这些酶，本文使用的pmi基因是一个例子。许多有用的基因序列也在Gen Bank数据库中有报道，例如人L-艾杜糖醇脱氢酶(Gen Bank登记号为L29008)或大鼠醛还原酶基因(Gen Bank登记号为X74673和D10484)或人醛还原酶基因(Gen Bank登记号为J04794)。在Gen Bank数据库中还可获得几种有用的β-半乳糖苷酶的序列。例如，来自Brassica oleracea的酶的登记号为X84684，来自Granny Smith苹果(Malus domestica)的酶的登记号为L29451，来自大肠杆菌的三种基因的登记号为X03228、M13700和M13797。本文使用的鼠伤寒沙门氏菌的pmi基因在Gen Bank中的登记号为X57117。
当所需的基因不能得到，但其序列是已知的，可以使用从已经报道的或其它已知含有所需基因的来源制备的DNA或RNA，使用PCR技术获得所述基因的有用的拷贝。
当所需的基因的序列不能获得时，按照常规程序获得酶本身，对其末端进行完全的序列分析，以便可以制备大量的DNA探针组，并且与PCR技术一起使用以便从生物体(酶自其中分离出来)的DNA或RNA文库获得该基因的DNA拷贝。
从寄主生物体制备和使用DNA和RNA文库以获得所需的基因是本领域内技术人员熟知的，并且本文不再进一步详述。
通常分离和纯化在5′-和3′末端含有合适的限制性核酸内切酶位点的编码异源可选择标记酶的DNA片段(第一基因)，以便该基因可操作地与启动子和末端DNA片段连接。如果没有获得这样的DNA片段，通过体外连接或通过熟知的技术，可加上这样的合适的限制性位点。
将上述第一基因可操作地与启动子DNA片段连接。该启动子DNA片段是在植物细胞中起作用的片段。有用的启动子的例子包括花椰菜花叶病毒的组成型CaMV 35S启动子、组成型的章鱼碱合成酶启动子(P-Ocs)和胭脂碱合成酶启动子(P-Nos)。
在一个实施方案中，使用的启动子被在自养生长条件下培养的转基因(非转基因)植物细胞的正常代谢的产物抑制。因此，一旦已经再生出成熟植物，选择则不再必要，控制标记酶表达的启动子被关闭或被抑制，以致于选择酶不表达或表达量降低。
其活性被植物代谢的正常产物抑制的启动子的一个例子是水稻α-淀粉酶Amy3A启动子(Thomas等人，植物生理学，106：1235-1239(1994))。水稻中α-淀粉酶启动子的表达被存在的蔗糖(转化和非转化水稻细胞的正常、自养、代谢产物)所抑制。
可被植物代谢的正常产物阻抑的其它两种启动子是Graham等人，在植物细胞，6：761-772(1994)报道的黄瓜苹果酸合成酶和异柠檬酸裂解酶启动子。培养基中的葡萄糖、果糖、棉子糖阻抑这两种启动子。由于当植物细胞生存在有甘露糖存在的环境中时苹果酸合成酶启动子被阻抑，该启动子不能与pmi/manA基因和作为第一加密碳源的甘露糖一起利用。
第一表达盒的最后元件是可操作地连接到第一基因的3末端的第一终止DNA片段。在植物中有用的几种终止片段是熟知的，在本文中利用。一种列举的片段是本文中使用的胭脂碱合成酶基因的3’非转译区域(Nos-T；Fraley等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：4803-4807(1983))。另一种是pearbcS-E9基因的3’非转译区域(E9；Coruzzi等人，Embo J.，3：1671-1679(1984))。
优选启动子和终止子DNA片段以合适的限制性核酸内切酶位点作为末端，以便连接到和可操作键合到第一基因的末端和作为基因组异源DNA片段的一部分连接到第二表达盒，以及连接到适当的载体上。与第一基因和/或载体的可操作连接还可以使用平齐末端连接。
第二表达盒含有在转化植物中表达的第二基因。该第二或靶基因在转化植物中编码蛋白质的表达。
第二基因可以是所需的任何基因。可列举的基因包括列于下面表I中的基因，在该表显示的专利文献中公开了该基因对植物的转化。
                    表I
第二基因产品                     文献
抗体                         U.S.5,202,422
哺乳动物肽                   WO 87/00865
HMG-CoA还原酶                U.S.5,306,862
磷酸果糖激酶                 U.S.5,387,756
小麦的蜡质位点(反义)         U.S.5,365,016
ADP-葡萄糖焦磷酸化酶，       EP 0 368 506 A2
(反义)                       EP 0 455 316 A2
                             WO 92/11382
马铃薯L-淀粉酶               EP 0 470 145 B1
蔗糖磷酸合成酶               EP 0 466 995 A2
                             EP 0 530 978
大肠杆菌非生物体的焦磷酸化酶 EP 0 485 044 A2
玉米1，4-α-葡萄糖           WO 92/11375
支链淀粉酶，(反义)
颗粒结合的淀粉合成酶(反义)   WO 92/11376
番茄液泡蔗糖酶，反义         WO 92/14831
类胡萝卜素合成途径中的       WO 91/13078
草生欧文氏杆菌基因
将第二基因可操作连接到控制第二基因表达的第二启动子DNA片段上。该启动子不受正常植物代谢的产物阻抑，可以是组成型启动子例如前面讨论的CaMV 35S、P-Ocs和P-Nos启动子或器官增强型启动子，后者在转化植物的一种或多种有限器官中引起表达。
本文将在一种或多种预选定的器官中表达而在其它器官不或几乎不表达(例如根相对叶或茎)称作加强或优选表达。
在第二表达盒中的最后元件是终止DNA片段。可以利用任何终止子片段，如上文中有关第一表达盒所讨论的。
虽然如前所述可利用平齐末端连接，通常还是借助于连接的核酸内切酶位点将第二表达盒的元件可操作连接在一起。
还注意到由第一基因编码的任一种或两种异源酶和第二基因的产物实际上是含有两种或多种由肽键连接在一起的蛋白质(例如酶)的多蛋白质的一部分，正如在几种病毒基因中所发现的。参见例如，Vardi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：7413-7417(1993)和Maiti等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6110-6114(1993)。
在异源基因组DNA片段中将第一和第二表达盒连接在一起，以便该两个表达盒组成紧密相连的一个位点，其被转化到植物的染色体DNA中。因此，如同使用其它可选择标记系统的情况一样，用表达盒之一转化植物细胞与用另一个转化有密切关系。在这种情况下，假设转化的细胞的生长和增殖表示用第二表达盒的转化是成功的。
在下文中将详细讨论含有两个相连的表达盒的DNA片段用于转化植物细胞。
在某些情况下，在两个不同的时刻转化植物细胞是令人满意的。这样的双重转化需要顺序使用两种可选择标记和两种靶基因。在本文中使用的术语中，这样的双重转化使用了四个表达盒和两种用于异源生长的加密(有限生长)碳源。两种异源基因组DNA片段存在于两次转化的植物中。
为便于就该实施例进行讨论，第一和第二表达盒是在前面讨论的那些，这些表达盒存在于第一基因组异源DNA片段中。第二基因组异源DNA片段也存在于两次转化的植物中并且含有第三和第四表达盒。
第三表达盒含有第二异源DNA可选择标记片段，该片段包括：(i)编码第二异源酶的第二异源基因，(ii)控制第二异源基因表达的第三启动子DNA序列和(iii)终止DNA片段，其中的(i)和(ii)、(iii)可操作地连接。
第三启动子DNA可以是与编码异源酶的第一基因一起使用的启动子相同的DNA。终止DNA片段也是用于植物中的任何终止片段，如在前面讨论的。如前所述将第三启动子和该终止DNA片段连接。
编码第二异源酶的第二基因不同于前面讨论的基因。该第二异源酶将第二种加密碳源转化为第一加密碳源，该第一加密碳源支持转化植物的生长和增殖。第二种加密碳源也不支持相同类型的非转化植物细胞的生长和增殖。
因此，可将该第二种加密碳源看作为第一加密碳源的前体，所述第一加密碳源被第一异源基因转化为支持细胞生长和增殖的有用碳源。更具体地说，当以甘露糖作为第一加密碳源而磷酸甘露糖异构酶是第一异源基因时，可将甘露醇用作为第二种加密碳源，而甘露醇-1-氧化还原酶用作为第二异源基因。
因此，用第三和第四表达盒转化已用第一和第二表达盒转化了的植物细胞，所述第一和第二表达盒含有pmi/manA基因作为第一基因可选择标记，第三表达盒含有编码甘露醇1-氧化还原酶的基因，第四表达盒含有另一个所需的基因。将两次转化和一次转化获得的植物细胞混合物异养培养于含有甘露醇作为碳源的基本营养培养基中。由于只有两次转化的细胞含有编码甘露醇1-氧化还原酶和磷酸甘露糖异构酶的基因，只有这些细胞生长和增殖，因为它们将甘露醇转化为甘露糖并将甘露糖转化为果糖-6-磷酸。
优选的是回收那些增殖的两次转化细胞并且如前所述再生为成熟植物。
注意到本文使用的术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”仅是为了方便。因此，第二表达盒可以在第一表达盒的上游，第四表达盒可以在第三表达盒的上游。
在第二实施方案中，涉及用于选择性地提高从在异养培养条件下培养的转化和非转化植物细胞混合物中再生的转化植物细胞数量的方法。根据该方法，
(a)在一种培养基中，在异养培养条件下培养转化的和非转化的植物细胞混合物，所述培养基含有转化植物细胞增殖和分化需要的除有用碳源外的标准营养和约1.5-3倍标准量的磷。由加密、潜在的或有限生长碳源替代通常存在的有用碳源，所述加密碳源不支持所述的非转化植物细胞的生长和增殖。混合物中的转化的植物细胞含有基因组(染色体整合)的异源DNA片段，该片段至少含有一个表达盒。
至少一个表达盒含有异源DNA可选择标记片段，该片段包括(i)编码一种异源酶的一个异源基因，所述异源酶的表达将加密碳源转化为在异养培养条件下支持转化植物细胞生长和增殖的一种碳源。该基因可操作地与(ii)控制该异源基因表达的第一启动子DNA片段和(iii)终止子DNA片段相连。该表达盒可以相同于在本发明的第一实施例中描述的第一表达盒。因此，前面有关第一表达盒的描述适用于在本发明的第二实施例中使用的表达盒。
该异源DNA片段必需至少含有上述的表达盒。该异源DNA片段也可任意地含有其它的表达盒，后者含有在转化植物中表达的任何基因。这些表达盒相同于在本发明的第一实施例中描述的第二到第四表达盒。因此，前面所述的有关这些表达盒的描述适用于在本发明的第二实施例中使用的表达盒。
(b)使异养培养条件保持足以使转化植物细胞表达异源酶、增殖和生长的一段时间。
本发明的第二实施方案利用了下面所述的发现：当向培养基中加入额外的磷(除了不支持非转化植物细胞生长和增殖的加密或潜在的碳源外，该培养基含有非转化植物细胞增殖和生长需要的基本营养)，再生的转化植物细胞的量和质均提高。
本文使用的“标准量的磷”是指在本领域常规使用的Murashigi和Skoog，培养基中含有的磷的量或水平。通常Murashigi和Skoog培养基含有170.00mg/l的磷例如磷酸二氢钾。此外，本领域内技术人员熟知可对Murashigi和Skoog培养基加以改变以满足一定的要求。通常，当修饰Murashigi和Skoog培养基时，这些改变在于微量元素、维生素的组成或包含其它添加剂。其中维生素被改变的修饰的Murashigi和Skoog培养基的例子是Linsmaier和Skoog培养基(在Physiologia Plantarum 18：100-127(1965))。该培养基含有170.00mg/l的磷。
在本发明中，发明人已经发现当含有加密或潜在的碳源的培养基也含有1.5倍到3倍的所述培养基通常所含的标准量的磷，再生转化植物细胞的量就能得到增强。另外，在再生的植物中，如前所述回收更高百分数的正常苗。
不希望被任何理论束缚，本发明人相信在补充了磷酸盐的含有加密或潜在碳源的生长培养基上的转化实验比在仅含有加密碳源的生长培养基上的更成功的理由是：因为当生长培养基含有额外水平的磷酸盐时，转化植物细胞比非转化植物细胞至少有两种生长优势。第一优势是转化植物细胞能够从培养基中接受额外的碳。第二优势是磷授予转化植物细胞额外的生长优势，使之能够在有限的碳源中生长，而非转化植物细胞在这样的有限碳源中不能生长。
向培养基中加入的磷可以是任何水溶性的磷酸盐。例如，可以使用磷酸钾(一碱价的、二碱价的和三碱价的)、磷酸钠(一碱价的、二碱价的)、磷酸钙(一碱价的、二碱价的和三碱价的)、六偏磷酸钠、磷酸铵(一碱价的、二碱价的)、正磷酸、磷酸高铁、甘油磷酸钠、甘油磷酸高铁和有机磷(例如ATP、ADP等等)。
在第三个实施方案中，涉及在延迟的异养培养条件下培养的转化的和非转化的植物细胞混合物中选择性提高转化植物细胞数量的方法。根据该方法，
(a)在含有非转化植物细胞增殖和生长需要的基本营养的第一培养基中，将转化的和非转化的植物细胞混合物培养到2星期，所述培养基包括支持生长和增殖的碳源。含有基因组异源DNA片段的转化植物细胞至少含有一个表达盒。
至少一个表达盒含有异源DNA可选择标记片段，该片段包括(i)编码一种异源酶的第一异源基因，所述异源酶的表达将加密碳源转化为在异养培养条件下支持所述转化植物细胞生长和增殖的一种碳源，所述第一基因可操作地与(ii)控制所述异源基因表达的第一启动子DNA片段和(iii)终止子DNA片段相连。该表达盒可以相同于在本发明的第一实施例中描述的第一表达盒。因此，前面所述的有关第一表达盒的描述适用于在本发明的第三实施例中使用的表达盒。
该异源DNA片段必需至少含有上述的表达盒。该异源DNA片段也可任意地含有其它的表达盒，后者含有在转化植物中表达的任何基因。因此，前面所述的有关这些表达盒的描述适用于在本发明的第三实施例中使用的表达盒。
(b)在第一培养基中培养足够的时间后，从第一培养基中收集转化和非转化植物细胞。
(c)在自第一培养基上移出后，将转化和非转化植物细胞置于第二培养基的异源培养条件下，除了不支持非转化植物细胞生长和增殖的加密碳源外，所述第二培养基含有非转化植物细胞生长和增殖所需的基本营养和1.5-3倍标准量的磷。
(d)使异养培养条件保持足以使转化植物细胞表达异源酶、增殖和生长的一段时间。
正如第二实施方案讨论的，加入1.5-3倍标准量的磷可以提高再生转化植物细胞的数量和质量。也正如在第二实施方案讨论的，向培养基中加入的磷可以是任何水溶性的磷酸盐。
重组DNA分子
本文使用的重组DNA分子可通过将载体与分离的异源DNA片段可操作连接形成质粒而制备，所述异源DNA片段含有两个表达盒。特别优选的重组DNA分子在下文的实施例中详细讨论。能够指导基因表达的载体本文称作为“表达载体”。
在一个优选的实施方案中，载体包括原核复制子；即具有能够指导染色体外的重组DNA分子在转化的原核寄主细胞中自主复制和维持的DNA序列。所述复制子是本领域内技术人员熟知的。
包括原核复制子的那些载体也包括能够指导在转化的寄主细胞例如大肠杆菌中表达的原核启动子。通常含有一个或多个便于本发明的DNA片段插入的限制位点的质粒载体中提供了与细菌寄主相容的启动子序列。典型的这样的载体质粒是可从GibcoBRL，Gaithersburg，MD购买的pUC18、pUC19、pBR322。这些载体可用于合成存在于整合表达载体中的DNA片段。
用于在高等植物中表达基因的典型载体是本领域内技术人员熟知的，并且包括含有由Rogers等人(Meth.in Enzymol.，153：253-277(1987))描述的根癌土壤杆菌的根瘤诱导(Ti)质粒的一部分的载体。这些载体是植物整合载体，其中通过转化将载体DNA的一部分整合到寄主植物的基因组中。对于含有Ti质粒的一部分的整合载体，整合到寄主植物染色体的区域是位于Ti质粒的右和左边界之间或TDNA的区域。
本文中使用的优选的植物转化载体是BIN19载体(Bevan，Nucleic Acids Res.，12：8711-8712(1984))。本文中使用的其它典型的根癌土壤杆菌载体是由Schardl等人(基因，61：1-11(1987))和Berger等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：9802-8406(1989))描述的质粒pKYLX6和pKYLX7。本文中另一个有用的载体是从Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto，CA购买的pBI101。质粒BIN19、pKYLX7和pKYLX71和pBI101是用于根癌土壤杆菌的双元载体。
另一个植物转化系统是以发根病土壤杆菌为基础的，通过转化，它诱导毛状的根而不是根瘤。PCT/US87/02512(WO88/02405，1988年4月7日公开)描述了发根土壤杆菌菌株A4和其Ri质粒与根癌土壤杆菌载体pARC8或pARC16一起用于转化黄瓜(Cucumissativas，cv，Straight Eight)，并且形成再生的黄瓜植物。
由Dong等人(生物/技术，9：858-863(1991))报道了用于甜瓜的基于土壤杆菌的转化系统，它是葫芦科黄瓜家属的另一个成员。这些研究人员使用了利用组成型CaMV 35启动子的双元载体，并且借助于报告基因基本上在所有检测的组织中发现了转化证据。这些工作阐明了借助于根癌土壤杆菌甜瓜易于转化。
已经开发出了各种各样的方法，借助于互补的粘性末端和平齐末端将DNA片段可操作连接到载体上。另外，含有各种各样限制性核酸内切酶位点的合成接头可通过许多种来源购买，包括New EnglandBioLabs，Beverly，MA。这些方法和合成接头的应用是本领域内技术人员已知的，并且在此不再讨论。参见Sambrook等人，Molecular Cloning，2ed；Cold Spring HarborLaboratory Press(1989)。
基因导入到高等植物中
转化高等的多细胞开花植物的方法包括土壤杆菌介导的植物细胞转化、原生质体转化、将基因转移进花粉、注射进生殖器官、转化小孢子和注射进成熟的胚。这些方法的每一种都有明显的优点和缺点。所以，将基因导入特定植物种类的特定方法对另一种植物种类不一定是最有效的，但众所周知，这些方法可用于特定的植物种类。
土壤杆菌介导的转移是广泛使用的将基因导入植物细胞的系统。使用以土壤杆菌介导的表达载体将DNA导入植物细胞是本领域熟知的。参见，例如，Fraley等人(生物技术，3：629(1985))和Rogers等人(酶学方法，153：253-277(1987))所述的方法。另外，T-DNA的整合是产生极少重排现象的相对精确的方法。待转移的DNA区域位于边缘序列内，并且常常将介入的DNA如Spielmann等人(Mol.Gen.Genet..205：34(1986))和Jorgensen等人(Mol.Gen.Genet..207：471(1987))所述插入植物基因组中。
如上讨论的土壤杆菌转化载体能在大肠杆菌以及土壤杆菌中复制，从而允许进行如Klee等人(植物DNA感染试剂，T.Hohn和J.Schell，eds.，Springer-Verlag，New York(1985)pp.179-203)所述的方便的操作。
此外，为了简化能够表达各种多肽编码基因的载体的构建，用于土壤杆菌介导的基因转移载体的技术进步改进了载体中基因和限制位点的排列。Rogers等人(酶学方法，153：253(1987))叙述的载体具有以启动子和多聚腺苷酸位点为侧翼的方便的多接头区，可指导插入的多肽编码基因的表达，因此符合本发明的目的。
在那些以土壤杆菌介导的转化是有效的的植物种类(即，在双子叶植物)中，由于基因转移具有容易完成和明确的特性，这是可选的方法。特别优选的双子叶植物包括高等植物的芸苔科(甘蓝和花茎甘蓝)、菊科(生菜)、伞形科(胡萝卜)、茄科(胡椒和蕃茄)和胡芦科(西瓜和南瓜)植物。
单子叶植物如谷类和草类似乎不是土壤杆菌的天然寄主，尽管如Bytebier等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，84：5345(1987))所述利用土壤杆菌载体已在天门冬属中产生了转基因植物。通常，用其它可替代的方法转化重要的经济谷类如水稻、玉米、燕麦和小麦。
为了转化不能用土壤杆菌成功转化的植物种类，可以利用“粒子枪”或高速微射弹技术。如 Klein et al.，自然，327：70(1987)；Klein et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85：8502(1988)；和McCabe et al，生物技术，6：923(1988)；和Vasiletal.，生物/技术，9：667-674(1992)所述，利用这样的技术，可以使在小金属颗粒表面的DNA穿过细胞壁运入细胞质。金属颗粒穿过几层细胞从而允许在组织外植体内转化细胞。
以微射弹介导的转化是来自单子叶植物的转基因细胞的优选来源。特别优选的单子叶植物包括玉米、小麦、燕麦、大麦、水稻、高粱和饲料草类。用DNA包被的金属颗粒已经成功地用于转化玉米和小麦细胞。用这种方法也已经转化了可育的、稳定转化的烟草和大豆植物。如Vasil(生物技术，6：397(1988))所述，从成熟的胚或外植体再生谷类植物是有效的。
利用基于磷酸钙沉淀、聚乙烯乙二醇处理、电穿孔和这些处理组合的方法可以完成植物原生质体的转化。参见，例如，Potrykus etal.，Mol.Gen.Genet.，199：183(1985)；Lorz et al.，Mol.Gen.Genet.，199：178(1985)；Fromm et al.，自然，319：791(1986)；Uchimiya et al.，Mol.Gen.Genet.，204：204(1986)；Callis et al.，基因和发展，1：1183(1987)；Marcotte et al.，自然，335：454(1988)；Wanget al.，生物/技术，10：691-696(1992)；和Fennell et al.，植物细胞报告，11：567-570(1992)。
对不同植物种类应用这些系统依赖于从原生质体再生特定植物种类的能力。在Fujimura et al.，植物组织培养通讯，2：74(1985)；Toriyama et al.，Theor Appl.Genet.，73：16(1986)；Yamada et al.，植物细胞报告，4：85(1986)；Abdullah etal.，生物技术，4：1087(1986)中叙述了可作为例证的从原生质体再生谷类的方法。美国专利No.4,634,674叙述了从原生质体再生蕃茄植物。
如Zhou et al.，酶学方法，101：433(1983)：D.Hess，Intern Rev.Cytol.，107：367(1987)：Luo et al.，PlantMol.Biol.Reporter，6：165(1988)所述，通过直接将DNA转移到花粉也可以将DNA导入植物。如Pena et al.，自然，325：274(1987)所述，在将DNA注射进植物的繁殖器官后，可以获得转化基因的表达。美国专利No.5,302,523叙述了利用Whisker体穿透细胞转化玉米细胞。如Neuhaus et al..Theor.Apl.Genet.,75：30(1987)；和Bedbrook et al.在Proceedings BioExpo 1986，Butterworth，Stoneham.M A，pp.27-54(1986)中所述，可以将DNA直接注射进成熟的胚和失水的胚的再水化过程中的细胞中，以及通过聚(乙烯乙二醇)或电穿孔将DNA注射进玉米小孢子，从而再生双单倍体纯合植物(Fennell et al.，植物细胞报告，11：567-570(1992))。
从被转化的植物细胞如单个植物原生质体或各种外植体再生植物是本领域熟知的。参见例如，植物分子生物学方法，A.Weissbach和H.Weissbach编辑，学术出版公司出版，San Diego，CA(1988)。再生和生长过程包括步骤：选择转化体细胞和幼芽，使转化体幼芽长根和在土壤上生长小植株。
本文关注的植物细胞的生长培养基是这些领域的熟练技术人员所熟悉的，不同的是加密碳源代替了通常使用的碳源如匍萄糖或蔗糖。示例的培养基含有Murashige和Skoog(MS)盐和RO维生素。再生培养基同样是熟知的，也含有植物激素如苯甲基腺嘌呤、赤霉素、吲哚乙酸、萘基乙酸、玉米素、盐酸硫胺素等，并利用了加密碳源。
如前面所讨论的，优选的再生营养培养基的一个特定的特征是存在约1.5-约3倍标准量的以水溶性磷酸盐存在的磷。这一优先选择的根据是，发现利用提高量的磷酸盐可以得到较大数目的健康再生幼芽以及在这些再生物中正常幼芽的百分数较高。
如Horsch et al.，科学，227：1229-1231(1985)所述，可以完成从叶外植体再生含有由土壤杆菌导入的外源基因的植物。在这一过程中，如Fraley et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，80：4830(1983)所述，在培养基中存在适当的加密碳源时使转化体生长，以便在转化的植物种类中诱导幼芽的再生。通常这一方法在2-4个月内产生幼芽，然后将这些转化体幼芽转移到适当的诱导生根的培养基和防止细菌生长的抗生素上。
然后将在存在加密碳源时开始长根并形成小植株的转化体幼芽转移种植到土壤或其它培养基上使它长根。根据所用的特定植物种类，这些方法可以有所改变，这些变化是本领域熟知的。
遗传学
用土壤杆菌转化方法形成的转基因植物可以在一个染色体上含有单个转化基因。将这样的转基因植物称为加入基因杂合的。但是，由于所用的词“杂合的”通常指在一对染色体的第二个染色体的相同位置上存在互补基因，而在含有一个本文所说的加入基因的植物中没有这样的基因，所以这样的植物的更精确的名称是半合子。将用土壤杆菌形成的起始转基因植物称为半合子。
更优选加入的表达盒是纯合的转基因植物，例如，转基因植物含有两套加入的表达盒，在染色体对的每个染色体的相同位置上各有一套。与天然的非转基因植物和独立分离的转基因植物相比，纯合的转基因植物至少显示了增强的可选择标记的表达。如前面注意到的，从转化的小孢子也可以制备纯合的转基因植物。更优选的是由不同的近亲交配系杂交产生的植物。将这样杂交产生的植物种子称为杂交种子。生长杂交种子有许多优点，包括更一致的产品、高产量和植物更健壮。总之，在农业上这些优点是众所周知的，通常称为杂交优势。如果近亲交配的亲本中的一个携带了纯合的转基因盒，那么杂交子代将都含有单个拷贝的转基因盒(即，对于转化基因它们是半合子的)。在这样的杂交方案中，杂交子代将具有杂交优势的优点和转基因赋予的效果的优点。
有待理解的是可以将两种不同的转基因植物交配从而产生含有两套分别加入的分离盒的子代。适当的子代的自交可以产生两种加入的盒均纯合的植物。也可进行与亲本植物的回交和与非转基因植物的异型杂交。
所以本发明的转基因植物具有含有两个表达盒(一套)的异源DNA。优选的转基因植物对加入的那套表达盒是独立的分离体并能将这些盒和它们的活性传送给子代。更优选的转基因植物是那些异源的盒套是纯合的，并在两性交配的基础上将这些基因传送给它所有的子代。
植物转化试剂盒
本发明的另一个方面是用于转化植物细胞的试剂盒。这一试剂盒本身通常包含在一个包装盒内，它含有两个包装盒并优选地还含有一套指导使用该试剂盒的说明。
第一个包装盒含有与待转化的植物相异源的DNA片段。该DNA片段含有与接头片段可操作连接的表达盒，该接头片段包括至少一个限制性内切酶位点，并优选地包括许多这样的位点。所述的表达盒是前面讨论的第一个(或第三个)表达盒，含有异源DNA可选择标记片段，该表达盒包括(i)编码异源酶的第一异源基因，在转化植物细胞的异养培养过程中，该基因的表达将不支持非转化植物细胞生长和繁殖的加密碳源转化成支持转化细胞生长和繁殖的碳源。这一基因与(ii)控制该异源基因表达的启动子DNA片段和(iii)终止DNA片段可操作地连接。
第一基因可以编码前面讨论的任何异源基因，pmi是一个优选的基因。另一个优选的基因是甘露醇1-氧化还原酶基因，它将甘露醇转化成甘露糖并可用于打算进行双转化的情况。
启动子和终止DNA片段是前面的有关第一表达盒讨论的那些。可阻遏的启动子DNA片段是特别优选的。
如通常在载体中发现的，该DNA的接头片段优选地含有许多内切酶限制位点。该接头和它的一个或更多的限制位点便于在异源DNA片段中掺入使用者选择的第二个表达盒。可以将接头片段定位于第一表达盒的上游或下游。
适用于以土壤杆菌介导植物转化的载体中，第一个包装盒的DNA本身优选地是在根癌土壤杆菌的Ti质粒的TDNA边界内。所以，构想用于以土壤杆菌介导的植物转化的表达载体除了第二表达盒外，应含有转化所必需的所有元件，所述的第二表达盒含有由使用者提供的第二个靶基因和它的启动子和终止子片段。
本发明的这一方面的另一个实施方案包括带有可操作地连接的接头的5′-启动子或3′-终止DNA片段中的一个或另一个或二者兼有，所述的接头中至少含有一个限制酶位点，以致使用者所有需要做的是插入(连接)所需要的第二个靶基因。这些片段可以一起定位于所述表达盒的上游或下游。
试剂盒的第二个包装盒含有在异养培养过程中非转化植物细胞生长和繁殖所必需的基本营养，除了碳源。用不支持非转化植物细胞生长和繁殖而支持转化植物细胞生长和繁殖的加密碳源替代通常存在于这样的营养培养基中的碳源，该转化植物细胞的基因组含有前面叙述的含有第一个表达盒的DNA片段。
如存在于第二个包装盒的本文涉及的营养培养基可以是任何有用的培养基，如本文讨论的任何培养基象含有MS盐和RO维生素但不含有用碳源的MS培养基。加密碳源也是前面讨论的加密碳源如甘露糖、半乳糖、山梨醇或如第二个加密碳源甘露醇。
也可以包括第三个包装盒，它含有再生培养基成份和同样的加密碳源。所以，营养物质如MS盐和RO维生素和众所周知的植物激素如苯甲基腺嘌呤和赤霉素等等一起包括在内。消除土壤细菌的抗生素如羧苄青霉素和替卡西林钠-克拉维酸钾或铁卡霉素也可以包括在内。每种成份以它的通常用量存在，除了磷，作为水溶性磷酸盐它优选地以约1.5-约3倍的通常量存在于这样的培养基中。
结果
异养补充选择系统的第一步是鉴定出碳源如不被植物细胞代谢的碳水化合物以便支持生长和繁殖。这样的碳水化合物的例子有甘露糖、甘露醇、山梨醇、半乳糖、茧蜜糖和柳醇。
基于碳源的选择系统的第二步是选择基因，该基因编码允许转化的组织利用加密碳源的酶，而所述碳源通常不被非转化植物组织代谢。一个具体的例证的基因编码磷酸甘露糖异构酶(pmi；EC 5.3.1.8)。该酶可逆地催化果糖6-磷酸到甘露糖6-磷酸的转化。在苜蓿根瘤菌(基因，122：35-43)、绿脓假单胞菌(基因，42：293-302)、酿酒酵母菌(分子和细胞生物学，12：2924-2930)和鼠伤寒沙门氏菌(基因，103：135-136)中，该基因被命名为pmi基因。在大肠杆菌中，该磷酸甘露糖异构酶基因被称为manA(基因，32：41-48)。
选择限制生长的碳水化合物
本文所用的所有培养基是调节到pH＝5.7并用9g/L的Noble琼脂(Gibco)固体化的MS培养基(Murashige和Skoog，植物生理，15：437-498(1962))，含MS盐和RO维生素(成份列于下面)。培养基R1F是补充了1mg/L吲哚乙酸(IAA)、0.65mg/L玉米素和16g/L匍萄糖的MS。培养基MR1是补充了1mg/LIAA、0.65mg/L玉米素和16g/L甘露糖的MS。培养基MR1/2是补充了0.5mg/LIAA、0.325mg/L玉米素和16g/L甘露糖的MS。培养基RO是补充了16g/L葡萄糖的MS。培养基MRO是补充了16g/L甘露糖的MS。
          表1
用于蕃茄再生的培养基的成份培养基MS盐                mg/L硝酸铵                  1650.000硼酸                       6.200氯化钙                   440.000氯化钴                     0.025五水硫酸铜                 0.025七水硫酸铁                27.800硫酸镁                   370.000七水合物一水硫酸镁                15.600碘化钾                     0.083硝酸钾                  1900.000一碱价磷酸钾             170.000乙二胺四乙酸钠二水钼酸钠                 0.250七水硫酸锌                 8.600RO维生素                   mg/L尼克酸                     5.000盐酸硫胺素                 0.500吡哆醇                     0.500肌醇                     100.000甘氨酸
在含有20％市售的含5.25％次氯酸钠的家用漂白剂的溶液中将蕃茄种子灭菌20分钟，在无菌蒸馏水中漂洗3次并在135mm的PhytaconTM组织培养容器(Sigma，St.Louis，MO)中种植于用10g/L Noble琼脂(Gibco)固体化的RO培养基上。在暗中，在25℃让种子萌发72小时，然后移到24-26℃下的、光合光子流密度(PPFD)约为80μmolm-2s-1的有光照的架子上。通过从生长7天的幼苗上切下子叶并将它们切成3部分(距生长点近处、中间处和远处)来制备用于再生的植物组织。将中间处和近处部分用于估计在潜在的非利用碳水化合物上的生长。
下面的碳水化合物被认为可用作植物再生培养基中的碳源的加密替代物：甘露糖、甘露醇、山梨醇、半乳糖、α，α-茧蜜糖和柳醇。制备不同的RIF培养基，每种含有这些碳水化合物中的一种，它们作为唯一碳源以0.09M的浓度加入。对照R1F培养基含有0.09M(16g/L)葡萄糖作为碳源。将蕃茄组织的远轴侧朝下置于培养基上并在24-26℃，在30μmolm-2s-1PPFD和16小时光期下，在封闭的培养皿中温育。每周观察蕃茄组织的再生信号。
通过持续4周的碳水化合物的评估，含有上面列出的碳水化合物的修改培养基没有一个支持蕃茄幼芽的再生，而置于补充有葡萄糖的对照R1F培养基上的蕃茄组织产生丰富的幼芽。
选择转化加密碳水化合物的基因
已知植物能从培养基中吸收甘露糖，随后将甘露糖磷酸化成甘露糖-6-磷酸。Sheu-Hwa et al.New Phyto.，74：383-392(1975)。已经认定甘露糖-6-磷酸不支持植物细胞的生长和繁殖，因为利用甘露糖作为唯一碳源培养的植物细胞不生长和繁殖。因此选择了一个编码将甘露糖-6-磷酸转换成果糖-6-磷酸的酶的基因。已知果糖-6-磷酸是被植物代谢的化合物。所以，表达这一基因的植物细胞能利用甘露糖生长和繁殖，并当置于含有甘露糖作为唯一碳源的培养基上时具有选择生长优势。
构建转移载体
选择来自原核种类的pmi基因，用于生产含有本发明的可选择标记的植物转化载体。利用本领域技术人员熟知的分子生物学技术来生产含有可选择标记基因的植物转化载体。图2展示了用于将pmi基因转移到植物转化载体中的步骤。可以从新英格兰生物实验室或BoehringerMannhein购买用于操作DNA的酶。
简要地说，由Adelaide大学的Dr.James Hackett惠赠含有鼠伤寒沙门氏菌pmi基因(基因库登记号X57117)的质粒pADE253。质粒pADE253是通常使用的含有1650碱基对(bp)ClaI片段的大肠杆菌克隆载体pBR322的衍生物，该ClaI片段含有pmi基因(图2)。SEQ ID NO：1显示了1650bp的ClaI片段的序列，它含有到pmi编码区的5′开头的432个碱基、具有编码pmi基因产物(推测分子量为42.6kDa的蛋白质)能力的391个密码子和到TAG终止密码子3′端的43个碱基。
SEQ ID NO：3和4是制备的两个低聚核苷酸以便于将pmi基因从pADE253克隆进植物转化载体。SEQ ID NO：3的低聚核苷酸有20个碱基长，并且与ClaI片段(编码链)的391-410碱基相同，除了在403位置是一个错配。SEQ ID NO：4的低聚核苷酸有25个碱基长并且是ClaI片段的1641-1617碱基的互补序列，除了位置1628和1630是错配。
将这两个低聚核苷酸和来自质粒pADE253的DNA用于聚合酶链式反应(PCR)，以扩增含有pmi编码区和小部分上游和下游区的约1250bp的DNA片段群。作为低聚核苷酸和ClaI片段之间错配碱基的结果和由于在PCR反应中大部分合成的DNA利用新合成的DNA而不是pADE253的DNA作模板，大多数约1250bp的合成片段含有两个新限制性内切酶识别位点，这两个位点便于pmi基因克隆到植物转化载体上。
加入的新限制性内切酶识别位点是位于pmi基因的起始甲硫氨酸密码子的5′端的24和29碱基之间的BglII识别位点(AGATCT)，和位于pmi基因的TAG终止密码子的3′端的21和26碱基之间的SacI识别位点(GAGCTC)。在37℃用BglII和SacI消化来自PCR的DNA几小时，然后在1％的低熔点琼脂糖凝胶上电泳。从凝胶上切下约1225bp的带，分离和纯化DNA。
将这一含有pmi基因的片段克隆到质粒pGEM3Zf(-)中(图2)。质粒pGEM3Zf(-)是市售的载体(Promega公司)，长度为3199bp。更具体地说，用BamHI和SacI消化pGEM3Zf(-)的DNA，凝胶纯化载体片段。用SacI消化留下了四个碱基序列AGCT的3′突出。虽然BamHI和BglII的识别位点是不同的，两种酶产生相同的四个碱基序列GATC的5′突出。这些突出区大大地促进了定向克隆。
在16℃过夜(约18小时)，将含有pmi基因的约1.2kbp的BglII-SacI片段和BamHI和SacI消化的pGEM3Zf(-)的DNA连接到一起。接着，利用连接反应产物转化大肠杆菌菌株MV190。将转化的各种等分试样铺在补充有羧苄青霉素(100mg/L)、异丙基-1-硫-β-D-半乳糖苷(IPTG)(0.1mM)和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)溶解于N，N二甲基甲酰胺的20mg/mL的储液，1ml/L)的LB琼脂平板上。
质粒pGEM3Zf(-)类似于分子生物学中通常使用的许多质粒，具有颜色标记选择系统以使DNA已插入载体的多接头处时有显示。当将含有通常包含于F′质粒的β半乳糖苷酶ω片段并含有pGEM3Zf(-)质粒的大肠杆菌铺在用IPTG和X-gal补充的平板上时，由该质粒编码的β-半乳糖苷酶的α片段能与ω片段互补并产生功能性β半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶能切开培养基中的X-gal产生蓝色。通常，当将DNA插入pGEM3Zf(-)的多接头区时，就破坏了α互补，并且菌落显示白色而不是蓝色。转化后的第1天，从生长在LB-羧苄青霉素-IPTG-X-Gal平板上的几个白色菌落纯化质粒DNA。为了证明pmi基因的存在，在用各种限制性内切酶消化后，通过凝胶电泳图谱检测这些质粒的DNA。从这一群体中选择一个含有pmi基因的菌落并且将该质粒命名为pETO147(图2)。
从质粒pETO147上切下pmi基因并将其插入便于转化的双元载体。pETO107的长度约为13kbp，是通常使用的双元植物转化载体BIN19(Bevan，核酸研究，12：8711-8721(1984))的衍生物。象BIN19一样，质粒pETO107有右边和左边TDNA边界区。这些25个碱基对的TDNA区指明了根癌土壤杆菌识别的位点，该细菌介导从质粒到植物染色体的DNA的转移；根癌土壤杆菌将这些边界区之间的DNA插入植物染色体。用含有双元载体的根癌土壤杆菌感染许多不同的植物组织类型如叶片或子叶是转化许多植物种类的优选方法。在TDNA边界以外，质粒pETO107含有细菌nptIII基因，该基因赋予含有这一质粒的大肠杆菌以卡那霉素抗性。
质粒pETO107在TDNA边界之间具有所需要的两个表达盒。从右边的TDNA边界开始，沿着顺时针方向前进(图2)，第一个盒由可操作连接的三个元件组成。第一个元件是蓝曙红合酶启动子(P-Nos)，当将它插入植物染色体中时，在大多数植物细胞中指导定位于这一DNA下游(在图2中顺时针)的基因的组成型表达。下一个元件是II型新霉素磷酸转移酶基因(NPTII)的编码区。如果NPTII在大多数植物细胞中以充足量表达，它赋予这些细胞对抗生素卡那霉素的抗性。第一个盒的第三个也是最后一个元件是蓝曙红合酶编码区(NOS-T)的3′终止末端，它含有聚腺苷酸化识别位点。通常在植物转化载体中将第一个盒用作鉴定转化组织的可选择标记；赋予转化细胞卡那霉素抗性导致在补充有卡那霉素的培养基上选择生长的优势。该nptII表达盒是原始质粒的一部分，不是本发明必需的，但是是讨论第二个表达盒之前的实施例。
沿着图2的顺时针方向，质粒pETO107的第二个表达盒也含有三个元件。第一个元件是来自花椰菜花叶病毒的35S启动子(CaMV35S)。象P-Nos启动子一样，CaMV35S在植物细胞中指导组成型的表达。通常在植物细胞中，有CaMV35S的表达水平高于有P-Nos的。下一个元件是多接头，包括下面的限制性内切酶：XbaI、BamHI、SmaI、KpnI和SacI的识别位点。这一盒的第三个和最后一个元素是蓝曙红合酶编码区(Nos-T)的3′终止末端。这第二个元件的多接头区用于将来自pETO147的含有pmi基因的XbaI-SacI片段插入位于CaMV35S和Nos-T元件之间的XbaI和SacI位点。
用XbaI和SacI消化来自质粒pETO147和pETO107的DNA。凝胶纯化来自质粒pETO147的约1.2kbp的XbaI-SacI片段和来自质粒pETO107的13kbp的XbaI-SacI片段。在含有pmi基因的来自pETO147的1.2kbp的XbaI-SacI片段和质粒pETO107的13kbp的XbaI和SacI片段的连接反应中，4个碱基的突出简化了pmi基因在CaMV35S动子和Nos-T之间的定向插入。连接反应在16℃过夜(约18小时)进行。
接着，将连接反应产物用于转化大肠杆菌菌株XL1-BlueMRF′。将转化的各种等分试样铺在补充了卡那霉素(50mg/L)的LB琼脂平板上。第二天，从几个菌落中纯化质粒DNA，利用限制性内切酶消化得到的凝胶电泳图谱鉴定含有插入在CaMV 35S和Nos-T元件之间的pmi基因的质粒。将一个这样的质粒命名为pETO148(图2)。
将质粒pETO148于1995年3月6日保藏于美国典型培养物保藏中心(12301 Parklawn Drive，Rockville，MD)并得到ATCC登记号为97107。该保藏是根据布达佩斯条约的要求进行的即，保藏的持续时间为自保藏日起30年或自最后需要保藏处的保藏物后5年或为本中请成为美国专利后的可实施时期，按期限较长的进行本保藏。如果载体在保藏处变得不能存活，应该重新提供该载体。
利用三亲本接合系统将含有质粒pETO148的大肠杆菌移入去除保护的根癌土壤杆菌菌株LBA4404，形成根癌土壤杆菌pETO148：LBA4404。利用反式接合体(transconjugates)转化蕃茄(Lycopersicon esculentum)。
为了检测几种作物在甘露糖上的转化和再生的动力学，在质粒pETO148转化载体中加入可评估的标记。具体地说，将含有CaMV35S启动子、β匍糖苷酸酶编码区和Nos-T的附加表达盒插入质粒pETO148。将得到的载体命名为质粒pETO156，利用三亲本方法匹配进根癌土壤杆菌。
实施例1：转化蕃茄植物
将蕃茄种子在含有20％的市场购买的含有5.25％次氯酸钠的家用漂白剂的溶液中灭菌，在无菌蒸馏水中漂洗3次，并在135mmPhytaconTM组织培养容器(Sigma，St.Louis，MO)中，将种子种植于用10g Noble琼脂(Gibco)固体化的Murashige和Skoog(MS)培养基(Gibco)上。在暗中，在25℃使种子萌发72小时，然后移到24-26℃、约80μmolm-2s-1PPFD光照下的架子上。通过从生长7天的幼苗上取下子叶，并将它们切成三部分(距生长点近处、中间处和远处)制备用于转化的植物组织。
将中间处和近处部分用于和土壤杆菌共同培养。将这些部分远轴侧朝下置于覆盖在补加有0.09M(16g/L)葡萄糖的共同培养基R1F上的无菌滤纸上，并在暗中温育24小时。然后，使它们与含有5×108CFU/ml的根癌土壤杆菌、pETO148∷LBA4404的细菌接种物温育20分钟，吸干水分，并在24℃、在暗中培养48小时。
在28℃、在180rpm的摇床上，在25ml用50mg/L卡那霉素(K)和25mg/L链霉素(St)补充的AB培养基(ABK50St25)[Chilton et al.，1974，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，71：3672-3676(1974)]中，通过让根癌土壤杆菌、pETO148∷LBA4404生长24小时来制备细菌接种物。将1ml该培养物转移到25ml新鲜ABk50s125培养基中，在28℃、在180rpm的摇床上生长24小时。然后用JA-20转头在BeckmanJ2-21上以8000rpm离心10分钟沉淀细菌。将细菌沉淀重悬浮于无菌MS培养基中，利用在550nm处的分光光度计光密度读数(0.1OD550 2×108CFU/ml)，将它们的浓度调节到5×108CFU/ml。在共同培养之前，用aceto syringone(3′，5′-二甲氧基-4′羟基-乙酰苯，Sigma，St.Louis，MO)补充接种物到最后浓度为600毫摩尔。
选择转化的蕃茄植物
在与土壤杆菌(pETO148∷LBA4404)在R1F培养基上共同培养48小时之后，将蕃茄组织移到含有0.09M甘露糖作为唯一碳源的MR1再生培养基上。用100mg/L的抗生素铁卡霉素(Duchefa公司)补充MR1培养基，以除去土壤杆菌。在培养2星期后，将蕃茄组织移到新鲜的MR1培养基上。这次，在共同培养组织的切开末端可见到小的愈伤组织，而没有与细菌共同培养但也在MR1培养基上培养的对照组织显示黄化并且不产生愈伤组织。再培养2个星期后，将所有组织移到还是含有0.09M甘露糖作为唯一碳源的MR1/2再生培养基上。这次，共同培养组织产生具有小的芽原基的愈伤组织的厚脊，而对照组织颜色发黄，不增大也不产生愈伤组织。在MR1/2培养基上2星期后，将共同培养组织上形成的愈伤组织和芽原基从原始组织上分离下来并移到补加有0.09M甘露糖的MRO培养基上。在此培养基上，芽伸长并长出根。将长根的植株种在盆中，移到温室中。
再生植株的生化和分子分析
对在甘露糖上再生的植株进行生化的和分子的测定以确定它们是否被转化。以在含有甘露糖作为加密碳源的培养基上的生长能力筛选这些植株，但由于pETO148转化载体含有pmi和nptII基因，可以用与市售(5Prime→3Prime，Inc.)的NPTII酶相关的免疫吸收测定方法(ELISA)评估第二个基因(nptII)的表达来，间接地测定植株的转化。
图3显示了三个排列成序的群体的相对的N PTII的表达。一个群体包括五个非转化的蕃茄植株(阴性对照)。五个植株的第二个群体来自用卡那霉素作为选择剂的转化研究。在这些阳性对照植株中，NPTIIELISA直接测定了去除选择剂毒性的选择标记基因的表达。在这些植株中NPTII的表达覆盖了很大的范围。第三个群体是在甘露糖上筛选的16个植株。在甘露糖上筛选出的植株中，NPTII的表达也覆盖了很大的范围。在甘露糖上筛选的植株中的NPTll的表达表明与pmi表达盒合并的nptll表达盒在植物中有功能，这提供了这些植株被转化的间接证据。另外，这些数据表明pmi基因的表达赋予在甘露糖上生长的能力，并且不影响植物染色体中的邻接基因的表达。
为了直接地测定转化，对几个推断的转化体进行Southern印迹分析。Southern印迹是分子生物学中通常采用的测定方法，能显示出有多少需要的转化基因的拷贝掺入了基因组。收集5克幼叶组织，用于分离基因组DNA。用HoeferTK100型荧光光度计对DNA产量进行定量。
对每个样品，将10毫克DNA用HindIII消化。在1％的琼脂糖凝胶上电泳，并转移到尼龙膜上。用Stratagene CL-100紫外交联器将DNA固定在膜上。用GeniusTM非放射性检测系统(Boehringer Mannheim)探测膜并用荧光照相术记录印迹结果。利用特异于pmi基因的引物，用PCR扩增788bp的片段。在扩增过程中，将异羟基毛地黄毒苷-11-dUTP掺入PCR片段。利用该pmi特异的、异羟基毛地黄毒苷标记的片段探测基因组印迹。由制造商提供杂交，印迹洗涤和观察的方案。
利用来自HindIII消化的λ噬菌体DNA的分子量标记并将非转化的蕃茄植物的DNA作为阴性对照，制备了11个推测转基因样品的印迹图。荧光图显示pmi探针与来自非转化亲本对照的DNA不杂交，但确实给出了11个推测转化体中的9个的特异条带。插入蕃茄基因组的拷贝的数目不一(数据未显示)。
实施例2：单子叶植物细胞在甘露糖上生长
为了测试是否可以利用甘露糖选择单子叶植物细胞中的转基因细胞，评估了在补加有蔗糖的培养基(标准方案)和用甘露糖以同样的摩尔浓度替代蔗糖的培养基中燕麦和玉米的细胞悬浮液的生长。
燕麦
将约500mg放干的燕麦悬浮细胞接种到40ml含有0.06M蔗糖(20g/L)或0.06M甘露糖(10.6g/L)的液体MS2-D培养基(4.4g/LMS盐，Sigma#M5524；0.5mg/L盐酸硫胺素；2mg/L2，4-D；150 mg/L-精氨酸；pH＝5.8)中。每种处理重复3次。将烧瓶置于160rpm的摇床上，24-26℃，采用16小时的光期。25天后，允许悬浮细胞沉淀在试管的底部，吸去液体培养基并将细胞称重。细胞的净重列于下面的表2。
表2
在补加有蔗糖或甘露糖作为碳源的培养基中培养后的燕麦悬浮细胞的净重(g)
重复过程        蔗糖       甘露糖
1               3.03        0.79
2               3.33        0.66
3               3.41        0.92
平均值±SE  3.26±0.12  0.79±0.08
玉米
用补充有甘露糖(10.6g/L)的MS-F培养基(4.4g/LMS盐，Sigma#M5524；1.3mg/L尼克酸；0.25mg/l盐酸吡哆醇；0.25mg/l盐酸硫胺素；0.25mg/L泛酸钙；2mg/L2，4-D；0.1g/L肌醇；150mg/LL-精氨酸；pH＝5.8)洗涤快速生长的黑墨西哥甜玉米(BMS)的悬浮培养物几次。将5ml从洗涤过的细胞制备的稠细胞浆(细胞对液体的比例为1∶1)的等分试样接种到含有35ml补充有甘露糖(0.06M)或蔗糖(0.06M)的培养基的烧瓶中。每种处理重复4次。将烧瓶置于160rpm、24-26℃、暗中的摇床上。在培养32天后，通过测量聚集的细胞体积评估悬浮细胞的生长。结果表示在下面的表3中。
表3
在补加有蔗糖或甘露糖的培养基中培养后的玉米悬浮细胞的体积(立方厘米)
重复过程      蔗糖      甘露糖
  1            8.4        1.8
  2            7.6        2.0
  3            8.0        2.4
  4           10.4        2.0
平均值±SE 8.60±0.62 2.05±0.13
与标准的含蔗糖的培养基相比，当在补充有甘露糖的培养基中培养时，燕麦和玉米细胞悬浮液都显示出生长严重抑制。这表明用甘露糖替代蔗糖，提供了有效地筛选在异养生长条件下能利用甘露糖作为碳源的来自单子叶植物的遗传工程细胞的方法。
实施例3：再生转基因蕃茄
如实施例1所述，制备蕃茄组织并与含有pmi基因的土壤杆菌共同培养。在共同培养后，将蕃茄组织培养在标准MR1培养基上或培养在补充有170.00mg/L一碱价磷酸钾的MR1培养基(MR1/P培养基)上。用额外的磷补充含有甘露糖的培养基导致再生的转化植物的数目明显增加。表4比较了在MR1培养基和MR1/P培养基上的再生。
表4
在MR1和MR1/P培养基上转化植物的再生的比较培养基    再生频率  再生幼芽数目  正常幼芽百分数  不正常幼芽
         (％)                                     百分数MR1        66.4          83            48.2            51.8MR1/P      82.4          103           80.6            19.4
这些观察结果表明附加的基础培养基组成的修改导致转化植物的再生增加。将再生培养基的基本成份磷的浓度加倍，得到含有pmi基因的蕃茄细胞的进一步的生长优势，导致用甘露糖筛选的基因工程植株的更有效的再生。
实施例4：转基因西瓜
在含有10％的市售的含有5.25％次氯酸钠的家用漂白剂的溶液中将去壳的西瓜种子表面灭菌10分钟，在无菌蒸馏水中漂洗6次，并在暗中在用无菌水浸湿的吸水纸上使种子萌发24小时。萌发后，从种子的轴上取下子叶，并在20μmolm-2s-1PPFD下，在B0培养基上培养2天。用1号软木钻具将用于转化的组织切下，并用根癌上壤杆菌pETO156∷EHA105通过将组织首先简单地在细菌接种物中涡旋，然后将该组织浸在细菌接种物20分钟来接种。将接种的组织在用无菌滤纸覆盖的新鲜B0培养基上培养3天。在含有1000mg/L抗生素羧苄青霉素和200mg/L抗生素铁卡霉素(Duchefa公司)的液体B0培养基中，将共同培养的外植体洗涤3次以便去除上壤杆菌，接着在24-26℃，在60-80μmolm-2s-1的PPFD光下，以16小时的光期在补加有16mg/L甘露糖的诱导芽的培养基B300上培养2星期。
在B0300培养基上2星期后，将西瓜组织转移到也含有16mg/L甘露糖的芽延长培养基E500上，再培养2星期。在转移到E500培养基上的时期，共同培养组织显示了快速的细胞繁殖，而非转化对照组织不增大并且不产生任何愈伤组织。把从共同培养的组织上长出的幼芽种植于含有16mg/l甘露糖的培养基N500上使之长根。非共同培养的对照组织没有长出任何幼芽。将长根的植株种在盆中。通过在化学试剂X-Gluc中对植物组织染色，该试剂由于转基因细胞产生靛蓝染料而引起转基因组织变蓝，从而证实转化西瓜植物的有效筛选。
用8.0mg/L的Noble琼脂将含有4.3mg/LMS盐(Gibco#11117-074)和1ml/L的MS维生素(Sigma#7150)的用于西瓜再生的所有培养基固体化并将pH调节到5.8。培养基B300、E500和N500含有1000mg/L的羧苄青霉素和200mg/L的铁卡霉素(Duchcfa公司)以去除土壤杆菌。用于预培养和共同培养的B0培养基中补加有30mg/L的蔗糖，而培养基B300、E500和N500含有16mg/L甘露糖作为唯一碳源。培养基B300含有1.0mg/L苯甲基腺嘌呤；培养基E500含有0.15mg/L苯甲基腺嘌呤和3mg/L赤霉素；培养基N500含有50mg/L1-萘基乙酸和16mg/L盐酸硫胺素。
利用甘露糖作为选择剂再生转基因西瓜植物的优选方法是使用用另外的170mg/L或340mg/L的一碱价磷酸钾补充的B300、E500和N500培养基。
实施例5：转基因南瓜
在含有10％的市售的含有5.25％次氯酸钠的家用漂白剂的溶液中将去壳的南瓜种子表面灭菌10分钟，在无菌蒸馏水中漂洗5次，并在暗中，于27℃在用无菌水浸湿的滤纸上使种子萌发24小时。通过去除芽轴子叶结节组织和子叶组织远端的一半来制备用于转化的植物组织。将留下的近端的一半切成4个外植体薄片。
在补充有0.2mM acetosyringone的液体MS培养基中，将所有的外植体用2.5×108CFU/ml的根癌土壤杆菌、pETO156：EHA105接种10分钟。将外植体用无菌滤纸上吸干水分，将近轴侧朝下放在用2mg/L2，4，5-T和0.5mg/L激动素补充的MS培养基上共同培养。在暗中，在未封口的培养皿中将外植体共同培养3天。
在3天共同培养期后，在补充了10mg/L2，4-D、0.5mg/L激动素、400mg/L头孢氨噻和750mg/L羧苄青霉素的MS液体培养基中，将外植体洗涤3小时。在此过程中更换漂洗培养基3次。将外植体用无菌滤纸上吸干水分，将远轴侧朝下放在含有MS盐和维生素、10mg/L2，4-D、0.5mg/L激动素、16.2g/L甘露糖、1000mg/L羧苄青霉素和170mg/L一碱价磷酸钾的选择培养基上培养。在未封口的培养皿中培养外植体并使之保持于漫射光中。每2星期将外植体继代培养到新鲜培养基上。
在8星期的筛选后，在甘露糖上培养的外植体的边缘形成胚群，而对照外植体不产生任何胚。通过在引起转基因组织变蓝的化学试剂X-Gluc中染色，证实了再生胚的转基因特征。通过在无激素的培养基上继代培养，生根和进一步发育实现了胚再生为转基因植株。在Xgluc中的染色证实了在含有甘露糖的培养基上再生的植株的转基因特征。
实施例6：转基因南瓜
用基于甘露糖的筛选对南瓜进行两个实验。在两个实验中，外植体的制备和它们的接种如下：
在含有20％的市售的含有5.25％次氯酸钠(CloroxTM)的家用漂白剂的溶液中，将去壳的南瓜种子表面灭菌10分钟，在无菌蒸馏水中简单地漂洗5次，并在暗中，在27℃，在用无菌水浸湿的滤纸上使种子萌发24小时。通过除去芽轴、子叶结节组织和子叶远端的一半制备用于转化的植物组织。将留下的近端的一半切成4个薄片，称为外植体。
以每32个外植体10ml的MS培养基量，将外植体在补充有0.2mM acetosyringone和2.5×108CFU/ml的去除保护的根癌土壤杆菌菌株EHA105的MS培养基中接种10分钟，所述的EHA105菌株含有双元质粒pET0156。在用土壤杆菌接种后，将外植体用无菌滤纸吸干水分，并将远轴侧朝下放置于用2mg/L2，4，5-T和0.5mg/L激动素补充的MS培养基上。将外植体在暗中、在未封口的培养皿中培养3天。
在培养3天后，将外植体在20-30ml补充有10mg/L2，4-D、0.5mg/L激动素、400mg/L头孢氨噻和750mg/L羧苄青霉素的MS液体培养基中洗涤3小时。每小时更换漂洗培养基，总共洗涤3次。在洗后，将外植体用无菌滤纸吸干水分，并将远轴侧朝下放置于含有筛选培养基的培养皿中，该筛选培养基包括MS盐和维生素、10mg/L2，4-D、0.5mg/L激动素、1000mg/L羧苄青霉素。
在第一个实验中，培养基含有16.2g/L甘露糖和各种浓度的KH2PO4(170mg/l，340mg/l或510mgl)。将外植体培养在未封口的培养皿中，并使之保持于光合光子流密度(PPFD)约为10μmolm-2s-1的漫射光中。每隔两星期将外植体在新鲜培养基上继代培养。
在第二个实验中，将外植体培养在用下面物质补充的MS培养基上一星期：
16.2g/l甘露糖，
16.2g/l甘露糖加170mg/LKH2PO4，
30g/L蔗糖，培养一星期，然后在16.2g/l甘露糖加170mg/lKH2PO4上筛选，
30g/l蔗糖，培养两星期，然后在16.2g/l甘露糖加170mg/lKH2PO4上筛选。
在两个实验中，在培养8星期后，在与上壤杆菌共同培养的外植体的边缘形成胚群，而非共同培养的对照外植体不形成胚。通过测定GUS基因的表达证实了再生胚的转化，该基因在化合物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖醛酸环己基铵盐(X-Gluc)存在时引起转基因组织变蓝。由于GUS基因含有内含子，该基因可以在真核细胞中表达，而不能在原核土壤杆菌细胞中表达。如果在胚中观察到蓝色信号则鉴定外植体为转基因植物。表5显示了第一个实验中产生转基因胚的外植体的百分数，表6显示了第二个实验中产生转基因胚的外植体的百分数。表5.磷酸盐浓度对用pmi基因转化的南瓜胚的筛选的影响。
    处    理 具有转化胚的外植体的百分数
MS培养基+16.2g/l甘露糖      2.8
MS暗养基+16.2g/l甘露糖+170mg/lKH2PO4     13.9
MS培养基+16.2g/l甘露糖+340mg/lKH2PO4     16.7
MS培养基+16.2g/l甘露糖+510mg/lKH2PO4      5.6
表6.碳和磷酸盐对用pmi基因转化的南瓜胚的筛选的影响。
                  处理 具有转化胚的外植体的百分数
MS培养基+16.2g/l甘露糖      4.3
MS培养基+16.2g/l甘露糖+170mg/lKH2PO4      8.3
MS培养基+30g/l蔗糖，一星期，然后用16.2g/l甘露糖+170mg/1KH2PO4筛选      8.5
MS培养基+30g/l蔗糖，两星期，然后用16.2g/l甘露糖+170mg/lKH2PO4筛选     15.5
在第一个实验中，与对照(MS培养基)磷酸盐的浓度相比，如果筛选培养基中磷酸盐的浓度加倍，用甘露糖筛选的转基因胚的产生频率增加5倍，如果磷酸盐浓度是三倍，转基因胚的产生频率增加6倍。MS培养基是从组织培养再生许多植物时广泛使用的配方。
在第二个实验中，利用甘露糖加磷酸盐的筛选导致转化频率增加了将近两倍。外植体首先在含有30g/l蔗糖的MS培养基上生长一星期后转移到含有16.2g/l甘露糖和170.00mg/lKH2PO4的MS培养基上，没有观察到它的转化频率明显的比保持在MS+甘露糖+KH2PO4培养基上的外植体的转化频率增加。相反，在用蔗糖补充的MS培养基上生长两星期接着在MS+甘露糖+KH2PO4的培养基上生长，导致比生长在MS+甘露糖+KH2PO4的培养基上的外植体增加了将近两倍的转化频率。另外，两星期的蔗糖处理接着在甘露糖+KH2PO4的培养基筛选展示了比仅用甘露糖处理增加3.5倍的转化效率。
两个实验表明在MS-甘露糖培养基中增加磷酸盐使转基因胚的再生频率增加了3.5到6倍。第二个实验还表明推迟筛选到两星期导致增加转基因胚的再生。这两个实验中的转化频率的差异是在组织培养中经常观察到的实验到实验的高度变化的特征。
实施例7：转基因蕃茄
在20％CloroxTM中，将用pmi基因转化的两个转基因蕃茄系X11-28和X11-40的种子灭菌20分钟，在无菌蒸馏水中漂洗3次，并种植于在135mm的PhytaconTM组织培养容器(Sigma，St.Louis，MO)中的用7g/L的商品级的植物琼脂固体化的Murashigi和Skoog培养基(Gibco)上。在暗中，在25℃让种子萌发72小时，然后移到在24-26℃、在约80μmolm-2s-1PPFD下的光照架子上。通过从生长了7天的幼苗上切去子叶并将它们切成3部分(距生长点近处、中间处和远处)来制备用于实验的植物组织。将中间处和近处的部分置于补加有16g/l葡萄糖的对照R1培养基或含有16g/L甘露糖的MR1再生培养基上。将R1和MR1培养基分成3种处理，这3种处理的区别在于一碱价磷酸钾的量：1×MS(170mg/LKH2PO4的标准浓度)、2×MS(340mg/L的总浓度)和3×MS(510mg/L的总浓度)。每种处理重复3次，每个重复实验包括9个外植体。将外植体在24-26℃，在16小时光期和30μmolm-2s-1下培养3星期，然后移到PPFD约为80μmolm-2s-1的光照架子上。在培养6星期后，通过对每个外植体称重评估磷酸盐浓度和碳源对外植体的生长的影响。结果表示在表7和8中。
表7.在两种碳源和三个磷酸盐水平上培养的来自用pmi基因转化的转基因蕃茄系X11-28的蕃茄外植体的湿重(mg)。
  KH2PO4水平 碳源 重复实验1 重复实验2 重复实验3 平均值±标准误差 百分数差异
    1×(标准) 葡萄糖 276.6  335.4  450.3  354.1±
甘露糖 251.3  362.9  346.5  320.3± -9.5
    2× 葡萄糖 221.3  296.0  392.2  303.1±
甘露糖 433.9  391.8  380.8  402.2± +32.7
    3× 葡萄糖 258.5  323.5  240.7  274.3±
甘露糖 370.4  340.3  420.0  376.9± +37.4
表8.在两种碳源和三个磷酸盐水平上培养的来自用pmi基因转化的转基因蕃茄系X11-40的蕃茄外植体的湿重(mg)。
KH2PO4水平   碳源 重复实验1 重复实验2 重复实验3 平均值±标准误差 百分数差异
    1  ×(标准)   葡萄糖   312.7   515.1   404.8   410.9±
  甘露糖   441.1   550.1   382.3   457.8±   +11.1
    2  × 葡萄糖   265.2   307.3   332.9   301.8±
甘露糖   412.8   384.1   388.4   395.1±   +30.9
    3  × 葡萄糖   271.8   390.2    nt   331.0±
甘露糖   457.7   404.9    nt   431.3±   +30.3
与培养在含有葡萄糖作为碳源的培养基的外植体的湿重相比，培养在补充有两或三倍高的磷酸盐水平的甘露糖培养基上的用pmi基因转化的蕃茄外植体的湿重平均高30％。这一结果表明增加磷酸盐提供了用甘露糖异构酶基因转化的转基因细胞在甘露糖培养基上的生长优势。
在转化实验中，存在许多非转基因细胞和少数转基因细胞。筛选的目的是鉴定和赋予具有全能性的再生植株的转基因细胞以生长优势。来源于光合活性组织如叶子或储存器官如萌发种子的子叶的细胞通常有丰富的可代谢碳。在利用甘露糖异构酶基因和利用甘露糖培养基的转化实验中，通过利用细胞内的残留碳源，大量存在的非转基因细胞和相对稀少的转基因细胞都具有生长的潜能。转基因细胞具有可获得的另外的碳源，因为它们能利用以甘露糖形式存在于培养基中的碳。如果由于细胞内残留的碳源导致的生长量是明显的，那么鉴定少数转基因细胞将更加困难。
表7和8显示的数据证明加入磷酸盐使在甘露糖上生长的转基因细胞比在葡萄糖上生长的转基因细胞更具生长优势。另外，这些实验表明了为什么在用增高的磷酸盐水平补充的甘露糖培养基上的转化实验比只用甘露糖的实验更成功。在甘露糖加磷酸盐的环境中，转基因细胞比利用葡萄糖(即，非转基因)细胞具有两个生长优势：(1)它们能利用来自培养基的其它碳源，和(2)磷酸盐使能在甘露糖上生长的细胞具有超过利用葡萄糖的细胞的额外的生长优势。这双重生长优势导致有效地筛选具有再生健康转基因植株的全能性的转基因细胞。
前面只试图对本发明加以说明但不加以限制。不离开本发明的新概念的真正精神和范围，可以进行大量的变化和修改。
                 序列表(1)总的资料：(i)申请人：Trulson.Anna J.Green.Charles EBraun III.Carl J(ii)发明的题目：筛选转基因植物细胞的方法(iii)序列数目：4(iv)通信地址：(A)收信人：Greer，Burns和Crain有限公司(B)街道：Wacker南大街233号，8660房间(C)城市：芝加哥(D)州：伊利诺斯(E)国家：美国(F)邮政编码：60606-4002(v)计算机可读形式：(A)工具类型：软盘(B)计算机：IBMPC兼容机(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS(D)软件：Patent In Release#1.0，#1.30版(vi)当前申请资料：(A)申请号：美国08/417.618(B)申请日：1995年3月6日(C)分类：(viii)代理人/代理机构资料：(A)姓名：Mueller，LisaV(B)登记号：38,978(C)档案号：1605.61148(ix)电讯资料：(A)电话：(312)993-0080(B)电传：(312)993-0633(2)SEQIDNO：1的资料：(i)序列特征：(A)长度：1650个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(ix)特征：
(A)名称/关键词：CDS
(B)位置：432...1607(xi)序列描述：SEQ ID NO：1ATCGATAACT  TTCCACGCGA TGTCGCAGAG  CTGGTGGACT  GGTTCGACGC  TCGCGACCCT60AACCGCATGT  GCGCCCGGTG  CCCGCTACGC  GAGCAGATCC  CGGTCTGGCT  GTTGGGATCT120CTTGTCCTTC GAATTCGGCG ACGGAAACAT GTTCGCTGGT CAACAAGTAG TACTCGGTAT180CGTCCTTTTT  GAGGGGAAAA GGGTCTTGAT  AAAAGAAGGG  TTTGTTTGAC ATTGTGCTCT240CACTTACCGC TCGGTATGGT TATTCTGG GCAGGTGTTC CATTGCCCGA CTCAAAGCGA300GTAACACTAT CCTACACAAT TTTTTAACAA AAACTGAGAC AAGTACGACT TTTTACGCCC360GGAGGTTACT  TCATGCGGGT  TTCTTGGTTT  AATACCTCCC  ATTGATCTCC  ACATTGAAAC420AGGGCTTGAT A ATG CAA AAA CTC ATT AAC TCA GTG CAA AAC TAT GCC TGG470
         Met Gln Lys Leu Ile Asn Ser Val Gln Asn Tyr Ala Trp
          1               5                  10GGA AGT AAA ACT GCG TTA ACG GAA CTT TAT GGC ATC GCC AAT CCG CAG518Gly Ser Lys Thr Ala Leu Thr Glu Leu Tyr Gly Ile Ala Asn Pro Gln
15                  20                   25CAG CAG CCA ATG GCT GAA CTC TGG ATG GGC GCG CAT CCC AAA AGC AGC566Gln Gln Pro Met Ala Glu Leu Trp Met Gly Ala His Pro Lys Ser Ser30                   35                 40                  45TCG CGA ATC ACC ACC GCC AAC GGC GAA ACC GTC TCC CTG CGT GAC GCC614Ser Arg Ile Thr Thr Ala Asn Gly Glu Thr Val Ser Leu Arg Asp Ala
             50                  55                   60ATC GAA AAG AAT AAA ACC GCC ATG CTG GGC GAA GCG GTA GCC AAC CGT662Ile Glu Lys Asn Lys Thr Ala Met Leu Gly Glu Ala Val Ala Asn Arg
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     80                  85                  90CTC TCT ATT CAG GTG CAC CCG AAT AAA CGC AAC TCC GAA ATC GGT TTC758Leu Ser Ile Gln Val His Pro Asn Lys Arg Asn Ser Glu Ile Gly Phe
95                  100                  105GCG AAA GAA AAT GCG GCG GGT ATC CCC ATG GAT GCC GCA GAG CGG AAC806Ala Lys Glu Asn Ala Ala Gly Ile Pro Met Asp Ala Ala Glu Arg Asn110                 115                 120                 125TAT AAA GAT CCT AAC CAT AAA CCA GAG CTG GTT TTT GCC CTG ACG CCT854Tyr Lys Asp Pro Asn His Lyg Pro Glu Leu Val Phe Ala Leu Thr Pro
            130                 135                  140TTC CTG GCG ATG AAC GCG TTC CGC GAA TTT TCT GAC ATT GTC TCT TTA902Phe Leu Ala Met Asn Ala Phe Arg Glu Phe Ser Asp Ile Val Ser Leu
        145                 150                         155CTG CAA CCT GTC GCC GGC GCG CAT TCC GCT ATC GCC CAC TTT TTG CAG950Leu Gln Pro Val Ala Gly Ala His Ser Ala Ile Ala His Phe Leu Gln
    160                 165                 170GTG CCG AAT GCT GAA CGT CTG AGC CAG CTT TTC GCC AGC CTG TTG AAT998Val Pro Asn Ala Glu Arg Leu Ser Gln Leu Phe Ala Ser Leu Leu Asn
175                 180                 185ATG CAA GGC GAA GAA AAA TCC CGC GCG TTA GCC GTA CTC AAA GCG GCG1046Met Gln Gly Glu Glu Lys Ser Arg Ala Leu Ala Val Leu Lys Ala Ala190                 195                  200                 205CTT AAC AGC CAG CAA GGC GAA CCG TGG CAA ACG ATC CGC GTG ATT TCA1094Leu Asn Ser Gln Gln Gly Glu Pro Trp Gln Thr Ile Arg Val Ile Ser
            210                  215                  220GAG TAT TAT CCT GAC GAC AGC GGG CTT TTC TCT CCT TTG TTG CTG AAT1142Glu Tyr Tyr Pro Asp Asp Ser Gly Leu Phe Ser Pro Leu Leu Leu Asn
        225                  230                     235GTG GTC AAA CTG AAT CCC GGC GAG GCG ATG TTC CTG TTT GCT GAA ACG1190Val Val Lys Leu Asn Pro Gly Glu Ala Met Phe Leu Phe Ala Glu Thr
    240                 245                  250CCT CAT GCT TAT CTG CAG GGC GTT GCG CTG GAA GTC ATG GCG AAC TCC1238Pro His Ala Tyr Leu Gln Gly Val Ala Leu Glu Val Met Ala Asn Ser
255                 260                  265GAT AAC GTT CTG CGC GCT GGC CTT ACG CCA AAA TAT ATC GAC ATC CCT1286Asp Asn Val Leu Arg Ala Gly Leu Thr Pro Lys Tyr Ile Asp Ile Pro270                 275                 280                 285GAG CTG GTC GCG AAC GTG AAG TTC GAA CCT AAG CCT GCC GGC GAG TTG1334Glu Leu Val Ala Asn Val Lys Phe Glu Pro Lys Pro Ala Gly Glu Leu
            290                 295                 300CTG ACT GCC CCG GTG AAA AGC GGC GCG GAG CTG GAC TTC CCA ATT CCG1382Leu Thr Ala Pro Val Lys Ser Gly Ala Glu Leu Asp Phe Pro Ile Pro
        305                 310                  315GTT GAC GAT TTT GCT TTT TCA CTG CAC GAC CTG GCG CTT CAG GAG ACG1430Val Asp Asp Phe Ala Phe Ser Leu His Asp Leu Ala Leu Gln Glu Thr
    320                  325                 330AGC ATC GGC CAA CAC AGC GCC GCG ATT CTG TTC TGC GTT GAG GGT GAG1478Ser Ile Gly Gln His Ser Ala Ala Ile Leu Phe Cys Val Glu Gly Glu
335                 340                 345GCG GTG TTA CGT AAA GAT GAA C AG CGT CTG GTA CTG AAG CCG GGT GAA1526Ala Val Leu Arg Lys Asp Glu Gln Arg Leu Val Leu Lys Pro Gly Glu350                 355                 360                 365TCT GCC TTT ATC GGC GCG GAT GAG TCT CCG GTT AAC GCC AGC GGC ACG1574SerAla Phe Ile Gly Ala Asp Glu Ser Pro Val Asn Ala Ser Gly Thr
           370                  375                 380GGC CGT TTA GCG CGT GTT TAT AAC AAG CTG TAGCAACGTA CTGAATTTTT1624GlyArg Leu Ala Arg Val Tyr Asn Lys Leu
       385                  390TAACAACTCT TGCTAAGCTT ATCGAT1650(2)SEQ ID NO：2的资料：(i)序列特征(A)长度：391个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：2Met Gln Lys Leu Ile Asn Ser Val Gln Ash Tyr Ala Trp Gly Ser Lys1                 5                  10                  15Thr Ala Leu Thr Glu Leu Tyr Gly Ile Ala Asn Pro Gln Gln Gln Pro
        20                   25                   30Met Ala Glu Leu Trp Met Gly Ala His Pro Lys Ser Ser Ser Arg Ile
    35                    40                  45Thr Thr Ala Asn Gly Glu Thr Val Ser Leu Arg Asp Ala Ile Glu Lys
50                   55                  60Asn Lys Thr Ala Met Leu Gly Glu Ala Val Ala Asn Arg Phe Gly Glu65                   70                  75                  80Leu Pro Phe Leu Phe Lys Val Leu Cys Ala Ala Lys Pro Leu Ser Ile
             85                   90                   95Gln Val His Pro Asn Lys Arg Asn Ser Glu Ile Gly Phe Ala Lys Glu
       100                  105                 110Asn Ala Ala Gly Ile Pro Met Asp Ala Ala Glu Arg Asn Tyr Lys Asp
    115                  120                 125Pro Asn His Lys Pro Glu Leu Val Phe Ala Leu Thr Pro Phe Leu Ala
130                  135                 140Met Asn Ala Phe Arg Glu Phe Ser Asp Ile Val Ser Leu Leu Gln Pro145                 150                  155                 160Val Ala Gly Ala His Ser Ala Ile Ala His Phe Leu Gln Val Pro Asn
            165                 170                   175Ala Glu Arg Leu Ser Gln Leu Phe Ala Ser Leu Leu Asn Met Gln Gly
        180                  185                  190Glu Glu Lys Ser Arg Ala Leu Ala Val Leu Lys Ala Ala Leu Asn Ser
    195                   200                 205Gln Gln Gly Glu Pro Trp Gln Thr Ile Arg Val Ile Ser Glu Tyr Tyr
210                 215                  220Pro Asp Asp Ser Gly Leu Phe Ser Pro Leu Leu Leu Asn Val Val Lys225               230                  235                 240Leu Asn Pro Gly Glu Ala Met Phe Leu Phe Ala Glu Thr Pro His Ala
           245                   250                  255Tyr Leu Gln Gly Val Ala Leu Glu Val Met Ala Asn Ser Asp Asn Val
        260                 265                 270Leu Arg Ala Gly Leu Thr Pro Lys Tyr Ile Asp Ile Pro Glu Leu Val
    275                 280                  285Ala Asn Val Lys Phe Glu Pro Lys Pro Ala Gly Glu Leu Leu Thr Ala
290                 295                  300Pro Val Lys Ser Gly Ala Glu Leu Asp Phe Pro Ile Pro Val Asp Asp305                 310                 315                  320Phe Ala Phe Ser Leu His Asp Leu Ala Leu Gln Glu Thr Ser Ile Gly
            325                  330                 335Gln His Ser Ala Ala Ile Leu Phe Cys Val Glu Gly Glu Ala Val Leu
        340                 345                 350Arg Lys Asp Glu Gln Arg Leu Val Leu Lys Pro Gly Glu Ser Ala Phe
   355                  360                  365Ile Gly Ala Asp Glu Ser Pro Val Asn Ala Ser Gly Thr Gly Arg Leu
370                 375                  380Ala Arg Val Tyr Asn Lys Leu385                  390(2)SEQ ID NO：3的资料：(i)序列特征：(A)长度：20个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(xi)序列描述：SEQ ID NO：3
AATACCTCCC ATAGATCTCC
20(2)SEQ ID NO：4的资料：(i)序列特征：(A)长度：25个碱基对(B )类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(xi)序列描述：SEQ ID NO：4
CTTAGCAAGA GCTCTTAAAA AATTC
25

Claims (38)

1.用于选择性增加在异养培养条件下培养的转化的和非转化的植物细胞混合物中再生的转化植物细胞数量的方法，所说方法包括下列步骤：
(a)在一种培养基中在异养培养条件下培养转化的和非转化的植物细胞的混合物，除了支持生长和增殖的碳源外，所述培养基含有非转化植物细胞增殖和生长需要的基本营养和约1.5倍-3倍标准量的磷，所述碳源被一种加密碳源替代，该加密碳源不支持所说的非转化细胞的生长和增殖，所说的转化细胞含有最少含有一个表达盒的异源基因组DNA片段，
所说的表达盒含有异源DNA可选择标记片段，该片段包括(i)编码异源酶的异源基因，所述异源酶的表达将加密碳源转化为在异养培养条件下支持所说转化植物细胞生长和增殖的碳源，该第一基因可操作地与(ii)控制该异源基因表达的启动子DNA片段和(iii)终止子DNA片段连接；
(b)使异养培养条件保持足以使所述的转化植物细胞表达所述的异源酶、生长和增殖的一段时间；和
(c)回收所说的转基因增殖细胞。
2.根据权利要求1的方法，其中所说的异源基因是磷酸甘露糖异构酶，所说的加密碳源是甘露糖。
3.根据权利要求1的方法，其中所说的磷是水溶性的磷酸盐。
4.根据权利要求3的方法，其中所说磷酸盐选自于：磷酸钾、磷酸钠、磷酸钙、六偏磷酸钠、磷酸铵、正磷酸、磷酸高铁、甘油磷酸钠、甘油磷酸高铁和有机磷组成的组。
5.根据权利要求1的方法，其中从所说启动子DNA序列的表达受所说的转基因植物在自养条件下的正常代谢产物的抑制。
6.根据权利要求5的方法，其中所说的可抑制性启动子DNA序列是黄瓜异柠檬酸裂解酶启动子序列。
7.根据权利要求5的方法，其中所说的可抑制性启动子DNA序列是水稻α-淀粉酶Amy3A启动子序列。
8.根据权利要求1的方法，其中所说的启动子是组成型启动子。
9.根据权利要求8的方法，其中所说的组成型启动子选自于：花椰菜花叶病毒的35S启动子、章鱼碱合成酶启动子和胭脂碱合成酶启动子组成的组。
10.用于选择性增加在异养培养条件下培养的转化的和非转化的植物细胞混合物中再生的转化植物细胞数量的方法，所说方法包括下列步骤：
(a)在一种培养基中在异养培养条件下培养转化的和非转化的植物细胞的混合物，除了支持生长和增殖的碳源外，所述培养基含有非转化植物细胞增殖和生长需要的基本营养和约1.5倍-3倍标准量的磷，所说碳源被一种加密碳源替代，该加密碳源不支持所说非转化细胞的生长和增殖，所说的转化细胞含有最少含有一个表达盒的异源基因组DNA片段；
所说的表达盒含有异源DNA可选择标记片段，该片段包括(i)编码异源酶的第一异源基因，所述异源酶的表达将加密碳源转化为在异养培养条件下支持所说转化植物细胞生长和增殖的碳源，该第一基因可操作地与(ii)控制该异源基因表达的第一启动子DNA片段和(iii)终止子DNA片段连接；
(b)使异养培养条件保持足以使所述的转化植物细胞表达所述的异源酶、生长和增殖的一段时间；
(c)回收所述的增殖细胞；和
(d)从所述的增殖细胞再生植物分生组织或植物胚胎。
11.根据权利要求10的方法，其中所说的异源基因是磷酸甘露糖异构酶，所说的加密碳源是甘露糖。
12.根据权利要求10的方法，其中所说的磷是水溶性的磷酸盐。
13.根据权利要求12的方法，其中所说的磷酸盐选自于：磷酸钾、磷酸钠、磷酸钙、六偏磷酸钠、磷酸铵、正磷酸、磷酸高铁、甘油磷酸钠、甘油磷酸高铁和有机磷组成的组。
14.根据权利要求10的方法，其中从所说启动子DNA序列的表达受所说转基因植物在自养条件下的正常代谢产物的抑制。
15.根据权利要求14的方法，其中所说的可抑制性启动子DNA序列是黄瓜异柠檬酸裂解酶启动子序列。
16.根据权利要求14的方法，其中所说的可抑制性启动子DNA序列是水稻α-淀粉酶Amy3A启动子序列。
17.根据权利要求10的方法，其中所说的启动子是组成型启动子。
18.根据权利要求17的方法，其中所说的组成型启动子选自于：花椰菜花叶病毒的35S启动子、章鱼碱合成酶启动子和胭脂碱合成酶启动子组成的组。
19.选择性提高在选择性异养培养条件下培养的转化的和非转化的植物细胞混合物中再生的转化植物细胞数量的方法，该方法包括下列步骤：
(a)在含有非转化的植物细胞增殖和生长需要的基本营养的第一培养基中，将转化的和非转化的植物细胞混合物培养到2星期，所述培养基包括支持生长和增殖的碳源，所说的转化植物细胞含有至少含有一个表达盒的基因组异源DNA片段，
所说的至少一个表达盒含有异源DNA可选择标记片段，该片段包括(i)编码异源酶的异源基因，所述异源酶的表达将加密碳源转化为在异养培养条件下支持所述转化植物细胞生长和增殖的碳源，所述第一基因可操作地与(ii)控制所述异源基因表达的第一启动子DNA片段和(iii)终止子DNA片段连接；
(b)将转化和非转化的植物细胞混合物从第一培养基中移出；
(c)将转化和非转化植物细胞置于第二培养基的异养培养条件下，除了不支持非转化植物细胞生长和增殖的加密碳源外，所述的第二培养基含有非转化植物细胞生长和增殖所需的基本营养和1.5-3倍标准量的磷；
(d)使异养培养条件保持足以使所述的转化植物细胞表达所述的异源酶、生长和增殖的一段时间；和
(e)回收所说的增殖细胞。
20.根据权利要求19的方法，其中所说的异源基因是磷酸甘露糖异构酶，所说的加密碳源是甘露糖。
21.根据权利要求19的方法，其中所说的磷是水溶性的磷酸盐。
22.根据权利要求21的方法，其中所说的磷酸盐选自于：磷酸钾、磷酸钠、磷酸钙、六偏磷酸钠、磷酸铵、正磷酸、磷酸高铁、甘油磷酸钠、甘油磷酸高铁和有机磷组成的组。
23.根据权利要求19的方法，其中从所说启动子DNA序列的表达受所说转基因植物在自养条件下的正常代谢产物的抑制。
24.根据权利要求23的方法，其中所说的可抑制性启动子DNA序列是黄瓜异柠檬酸裂解酶启动子序列。
25.根据权利要求23的方法，其中所说的可抑制性启动子DNA序列是水稻α-淀粉酶Amy3A启动子序列。
26.根据权利要求19的方法，其中所说的启动子是组成型启动子。
27.根据权利要求26的方法，其中所说的组成型启动子选自于：花椰菜花叶病毒的35S启动子、章鱼碱合成酶启动子和胭脂碱合成酶启动子组成的组。
28.从两次和一次转化的植物细胞的混合物中选择性地生长两次转化的植物的方法，该方法包括下列步骤：
(a)在一种培养基中在异养培养条件下培养两次和一次转化的植物细胞的混合物，所述培养基含有一次转化植物细胞增殖和生长需要的除了碳源外的基本营养和约1.5倍-3倍标准量的磷，所说的碳源支持一次转化细胞的生长和增殖，所说碳源被第二加密碳源替代，该第二加密碳源不支持所说的一次转化细胞的生长和增殖，所说的两次转化细胞含有最少含有两个表达盒的第一和第二异源DNA片段，其中至少一个表达盒是在第一异源DNA片段内和至少一个表达盒是在第二异源DNA片段内；
第一异源DNA片段内的表达盒含有异源DNA可选择标记片段，该片段包括(i)编码异源酶的第一异源基因，所述异源酶的表达将第一加密碳源转化为在异养培养条件下支持所说的一次和两次转化植物细胞生长和增殖但不支持非转化植物细胞生长和增殖的一种碳源，该第一基因可操作地与(ii)控制所述的异源基因表达的第一启动子DNA片段和(iii)终止子DNA片段连接；
第二异源DNA片段内的表达盒含有第二异源DNA可选择标记片段，该片段包括(i)编码第二异源酶的第二异源基因，在所说的两次转化细胞的异源培养期间，所述第二异源酶的表达将第二加密碳源转化为支持所说的一次和两次转化植物细胞生长和增殖的第一加密碳源，所说的第二加密碳源不支持相同类型的一次转化和非转化植物细胞的生长和增殖，该第二基因可操作地与(ii)控制所说第二异源基因表达的第二启动子DNA片段和(iii)终止子DNA片段连接；
(b)使异养培养条件保持足以使所说的两次转化植物细胞表达所说的第一和第二异源酶、生长和增殖的一段时间；和
(c)回收所说的增殖细胞。
29.根据权利要求28的方法，其中所说的第二异源DNA可选择标记片段编码甘露醇-1-氧还原酶，所说的第二加密碳源是甘露醇，所说的编码异源基因的第一基因编码磷酸甘露糖异构酶和所说的第一加密碳源是甘露糖。
30.从两次和一次转化的植物细胞的混合物中选择性地生长两次转化植物的方法，该方法包括下列步骤：
(a)在一种培养基中在异养培养条件下培养两次和一次转化的植物细胞的混合物，所述培养基含有一次转化植物细胞增殖和生长需要的除了支持所说一次转化细胞生长和增殖的碳源外的基本营养和约1.5倍-3倍标准量的磷，所说碳源被第二加密碳源替代，该第二加密碳源不支持所说一次转化细胞的生长和增殖；所说的两次转化细胞含有最少含有两个表达盒的第一和第二异源DNA片段，其中至少一个表达盒是在第一异源DNA片段内和至少一个表达盒是在第二异源DNA片段内；
第一异源DNA片段内的表达盒含有异源DNA可选择标记片段，该片段包括(i)编码异源酶的第一异源基因，所述异源酶的表达将第一加密碳源转化为在异养培养条件下支持所说的一次和两次转化植物细胞生长和增殖但不支持非转化植物细胞生长和增殖的一种碳源，该第一异源基因可操作地与(ii)控制该异源基因表达的第一启动子DNA片段和(iii)终止子DNA片段连接；
第二异源DNA片段内的表达盒含有第二异源DNA可选择标记片段，该片段包括(i)编码第二异源酶的第二异源基因，在所说的两次转化细胞的异源培养期间，所述第二异源酶的表达将第二加密碳源转化为支持所说的一次和两次转化植物细胞生长和增殖的第一加密碳源，所说的第二加密碳源不支持相同类型的一次转化和非转化植物细胞的生长和增殖，该第二异源基因可操作地与(ii)控制该第二异源基因表达的第二启动子DNA片段和(iii)终止子DNA片段连接；
(b)使异养培养条件保持足以使所说的两次转化植物细胞表达所说的第一和第二异源酶、生长和增殖的一段时间；
(c)回收所说的增殖细胞；和
(d)从所说的增殖细胞再生植物分生组织或植物胚胎。
31.根据权利要求30的方法，其中所说的第二异源DNA可选择标记片段编码甘露醇-1-氧还原酶，所说的第二加密碳源是甘露醇，所说的第一基因编码磷酸甘露糖异构酶的表达和所说的第一加密碳源是甘露糖。
32.用于形成转化植物细胞的试剂盒，包括：
(a)含有用于转化植物细胞的DNA片段的第一包裹，所述DNA片段含有可操作地与含有至少一个限制性内切酶位点的接头片段连接的表达盒，该表达盒含有异源DNA可选择标记片段，该标记片段包括(i)编码异源酶的第一异源基因，在转化植物细胞的异养培养期间该异源酶的表达将不支持非转化植物细胞生长和增殖的加密碳源转化为支持转化植物细胞生长和增殖的碳源，该第一基因可操作地与(ii)控制该第一异源基因表达的启动子DNA片段和(iii)终止子DNA片段连接；和
(b)第二包裹，该包裹含有异养培养期间非转化植物细胞增殖和生长需要的除碳源外的基本营养和约1.5-3倍标准量的磷，所述的碳源由加密碳源替代，所述加密碳源不支持非转化植物细胞的生长和增殖但支持转化植物细胞的生长和增殖，所述转化植物细胞的基因组含有第一包裹中的DNA片段。
33.根据权利要求32的试剂盒，其中所说的异源基因是磷酸甘露糖异构酶和所说的加密碳源是甘露糖。
34.根据权利要求32的试剂盒，其中所说的控制所说异源基因表达的第一启动子DNA片段受所说转基因植物在自养条件下的正常代谢产物的抑制。
35.根据权利要求32的试剂盒，其中所说接头片段含有多个选择性核酸内切酶位点。
36.根据权利要求32的试剂盒，其中所说(a)的DNA片段位于根瘤土壤杆菌的Ti质粒的TDNA边界内。
37.根据权利要求32的试剂盒，其中所说的磷是水溶性的磷酸盐。
38.根据权利要求37的试剂盒，其中所说的磷酸盐选自于：磷酸钾、磷酸钠、磷酸钙、六偏磷酸钠、磷酸铵、正磷酸、磷酸高铁、甘油磷酸钠、甘油磷酸高铁和有机磷组成的组。
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