CN102229949A - 组成型干扰棉花细胞分裂素代谢相关基因及其在制备转基因植物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明将组成型启动子与干扰棉花细胞分裂素氧化酶基因表达的核苷酸可操作地连接，构建含RNA干扰的棉花细胞分裂素氧化酶基因的植物表达载体，将该植物表达载体整合到棉花基因组中，获得转基因的棉花。该方法通过在棉花中组成型干扰细胞分裂素代谢酶相关基因，进而调控细胞分裂素氧化酶基因的表达，控制棉花株型、延缓衰老、增加干旱抗性，达到提高棉花产量和改良棉花纤维品质的目的。

Description

组成型干扰棉花细胞分裂素代谢相关基因及其在制备转基因植物中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及干扰棉花细胞分裂素代谢相关基因的载体及应用以及含有上述表达载体的转基因棉花的制备方法。

背景技术

棉花是世界上最重要的天然纤维作物，也是最重要的经济作物。我国是世界上最大的纺织品生产国和消费国，棉花产业在我国的国民经济中具有举足轻重的地位。随着全球经济在经历衰退之后的逐步复苏，中国纺织行业将恢复增长，棉花需求量将相应增加(王莉，杜珉，农业展望，2009，5)。食品与农业政策研究会(Food and A gricultural Policy Research Institute，FAPRI)预测，未来10年内，中国棉花单位面积产量和栽培面积没有明显变化，但由于需求的持续增加，导致每年进口大量棉花才能满足国内需求，到2020年甚至需要进口30％的棉花。对棉花生产育种来说，这既是机遇，更是挑战。因为经济的进步、人口的增加使得可用耕地面积日渐减少，与此同时人民群众对纯棉产品的需要却不断增加。如何在不占用有限耕地资源的前提下增加棉花的产量就成为摆在广大棉花科研工作者面前的一个重要课题。能否迅速提高我国棉花产量，直接关系到我国棉花产业的兴衰和纺织品生产加工业的生存与发展。

棉花的产量和品质性状为多基因控制的数量性状，且产量与品质性状之间存在遗传上的负相关。棉花栽培品种主要是陆地棉，而优良纤维品质基因主要源于二倍体的瑟伯氏棉(纤维强度)、异常棉(纤维强度与细度)以及四倍体的海岛棉(纤维强度与细度)等。这些优良性状基因的利用，却在常规育种中受到诸多限制，单靠现有的棉花遗传种质资源和常规育种手段已经难以大幅度提高棉花产量，难以满足快速发展的纺织工艺革命对纤维品质的要求。利用基因工程技术育种可以打破物种间的遗传障碍，实现优良目的基因的定向转移，同时具有后代易于稳定，育种周期短等优点，这为棉花纤维产量和品质的改良提供了新的途径。但是目前人们还未得到与棉花产量和品质(强度、细度和长度等)直接相关的基因，使得利用基因工程提高棉花纤维缺乏有效的目的基因。人们对棉花产量和品质形成的分子机理也知之甚少。这些都极大的阻碍了对棉花纤维进行产量和品质改良的进程。

细胞分裂素是一类N⁶取代的腺嘌呤同系物，参与调节细胞分裂、芽的发育、根的分枝、叶绿体的发育、叶片的发育及衰老(Mok et al，1994，Cytokinins：chemistry，activity，and function，CRC Press Boca Raton，pp 155-156)。细胞分裂素氧化酶CKX，不可逆降解侧链含不饱和双键的细胞分裂素，在调节细胞分裂素含量上起十分重要的作用(Armstrong et al，1994，Cytokinins：chemistry，activity，and function，CRC Press Boca Raton，pp 139-154)。Namken(Namken，1984，Proceedings Beltwide Cotton Production Research Conferences)发现在1/3花蕾期和初花期叶面喷施细胞分裂素明显提高了棉花纤维的产量。叶面喷施细胞分裂素复合物Burst能促进芽的起始和发育，增加棉花花蕾发育因此引起丰产(Mayeux et al，1985，Proceedings Beltwide Cotton Production ResearchConferences)。细胞分裂素复合物能明显增加棉铃的数目和第一果枝位棉铃的座果率(Mayeux et al，1987，Proceedings Beltwide Cotton Production ResearchConferences)。美国九个州九年共83个实验点外施细胞分裂素复合物增加了棉花产量，平均达到49lint/ha(Parker and Salk，1990，Proceedings Beltwide CottonProduction Research Conferences)。Hedin(Hedin，1991，Journal of Agricultural andFood Chemistry 39：549-553；Hedin and McCarty，1994，Journal of Agricultural andFood Chemistry 42：1355-1357)发现在田间施用激动素能使棉花增产26％。叶面喷施细胞分裂素4PU-30和矮壮素DPC混合物能使棉花纤维产量增加17％，而只喷施DPC仅增产7％(Deng，1996，China Cotton 23：13-14)。Sawan(Sawan et al，2000，Environmental and Experimental Botany 44：59-68)发现，海岛棉Giza75种子在播种前用5mg L-1的激动素处理，在播种后60天和70天用相同浓度的激动素叶面喷施棉花能提高棉花的萌发率，棉花的种子和纤维产量。现蕾期和早花期喷施Cytokin(主要成分是细胞分裂素)和Cytokin与Pix(Mepiquat Chloride，赤霉素拮抗剂)的混合物都能增加棉花的产量(Albers and Schnakenberg，1994，Agriculture publication G：4258)。中棉所30的苗期和蕾期叶施0.00001％异戊烯基腺嘌呤水剂能增加株高、单株果枝数，提高单株成铃数、增加铃重、提高单产(郭宗培等，2001，江西棉花23：9-10)。棉花种子浸泡时、棉花幼苗的子叶期和六叶期施用低浓度的细胞分裂素能减少顶端优势、增加果枝数、增加花蕾数目，下胚轴增厚、延缓叶片衰老，增强根系发育(Burke，2009，United States Patent：7634870)。

外源施用细胞分裂素虽然有很好的效果，但所用劳动力成本高，且细胞分裂素的大量使用，不但增加了生产成本，而且会带来环境污染。相比之下，通过控制细胞分裂素代谢酶基因，从内源的角度来调节植株中的细胞分裂素含量，改变株型，提高棉花产量、干旱抗性，延缓衰老，是个十分有效的策略。这一策略至少具有下述几方面的优点：1)效率高、成本低，因为一旦将细胞分裂素氧化酶基因干扰序列导入植物，就无需外加施用细胞分裂素或其它处理。而且，外源施用细胞分裂素是通过扩散进入细胞，而内源激素则产生自细胞内。因此，用转基因内源控制细胞分裂素的效果往往比外源施用更好；2)对作物负面影响小，由于细胞分裂素的作用浓度很低，通过调节细胞分裂素氧化酶基因的表达，可实现细胞分裂素含量的适当增加，不会产生浓度过高对植物的发育带来的不良影响；3)与外源施用细胞分裂素和人工合成生产调节物质相比，内源调控细胞分裂素氧化酶基因对环境污染小，对人类健康造成的危害也小(Li Y et al，2004，Transgenics of plant hormones and their potential application in horticultural crops.In：Geneticallt Modified Crops：their development，uses，and risks.New York：FoodProducts Press，101-112)。

外源施用细胞分裂素能增加棉花产量，因此，研究者们试图利用内源增加细胞分裂素来提高产量。1999年John ME将涉及细胞分裂素生物合成的IPT基因置于纤维特异性启动子E6下，通过农杆菌介导转入陆地棉DP50中，转基因植株的纤维品质与野生型相比并没有改变(Basra AS et al，1999，Cotton Fiber，New York：Food Products Press，271-292)。Yu等(Yu et al，2000，Acta BotanicaSinica 42：59-63)将IPT基因置于菜豆种子Phaseolin基因启动子后，通过花粉管通道法导入中棉19、苏棉12、泗棉3号等品种中，转Phaseolin::IPT基因棉花小苗普遍粗壮，根系很发达，侧根数目约为对照的3-4倍，然而大田生长的转基因棉花外形与对照没有差异，有些转基因品系的纤维长度明显变短。上述实验不成功的原因可能在于细胞分裂素的过度积累是有害的，能导致生长矮化、产生欠发达的维管组织、失顶端优势；同时过量或低量合成细胞分裂素的突变体、信号传导缺陷的突变体都难以获得衰老延缓的功能(段留生，2008，植物激素：全成、信号转导和作用，中国农业大学出版社，第3版)。蕃茄果实发育早期pZ130诱导IPT基因的表达使每株铃数增加，纤维长度增加，强度增加，马克隆值降低(Martineau and Davis，2001，United States Patent：6329570B1)。可见，通过适当增加内源细胞分裂素提高棉花纤维产量和品质是可行的。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种植物表达载体，其包含干扰棉花细胞分裂素代谢相关基因表达的核苷酸和启动子，通过在棉花中组成型干扰细胞分裂素代谢相关基因表达，调控细胞分裂素氧化酶的水平，从而改良植物性状。将所述植物表达载体应用于棉花纤维性状的改良，增加棉花产量，解决现有的单位面积产量难以提高同时可用耕地有限的问题。

本发明进一步提供所述植物表达载体在棉花纤维性状改良上的应用。

本发明进一步提供基于所述植物表达载体制备转基因植物的方法。

根据本发明的一个方面，所述植物表达载体至少含有由干扰棉花细胞分裂素代谢相关基因表达的核苷酸和组成型启动子。所述植物表达载体通过将干扰细胞分裂素代谢相关基因表达的核苷酸与编码组成型启动子的核苷酸可操作地连接而构建。优选地，所述细胞分裂素代谢相关基因为细胞分裂素氧化酶CKX(cytokinin dehydrogenase)基因。更优选地，所述细胞分裂素代谢相关基因为棉花细胞分裂素氧化酶基因(简称GhCKX基因)。在一种实施方式中，所述干扰棉花细胞分裂素代谢基因表达的核苷酸为RNA干扰的棉花细胞分裂素氧化酶(RNA Interference Gossypium hirsutum.L cytokinin dehydrogenase)基因(简称RNAiGhCKX基因)，该基因能够干扰细胞分裂素氧化酶基因的mRNA表达，内源调控细胞分裂素含量。优选的组成型启动子为花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子。优选的植物表达载体具有如图2所示的结构。进一步地，通过所述植物表达载体转染宿主而获得的转化体也属于本发明的范围。

根据本发明的另一方面，提供所述植物表达载体在棉花纤维性状改良上的应用。通过RNA干扰，下调细胞分裂素氧化酶基因在棉花中的表达，在棉花中适度提高内源细胞分裂素的含量，从而增加棉花蕾数，延缓棉花的衰老，提高干旱抗性，降低株高，提高棉花的产量，改善棉花的品质。

根据本发明的另一方面，提供转基因植物的制备方法，包括以下步骤：1)获得组成型启动子核苷酸；2)获得干扰细胞分裂素代谢相关基因表达的核苷酸；3)将步骤1)中分离克隆到的组成型启动子核苷酸与步骤2)中分离克隆到的干扰细胞分裂素代谢相关基因的核苷酸进行融合，构建表达组成型干扰细胞分裂素代谢相关基因的植物表达载体；4)将步骤3)得到的表达组成型干扰细胞分裂素代谢相关基因的植物表达载体整合到棉花基因组中；5)将通过步骤4)获得的棉花进行进一步的培养、栽培，并获得转基因的棉花植株。

在更详细的实施方式中，所述方法包括步骤：1)获得组成型启动子核苷酸；2)获得干扰细胞分裂素代谢相关基因表达的核苷酸；3)将步骤1)中分离克隆到的组成型启动子核苷酸与步骤2)中分离克隆到的干扰细胞分裂素代谢相关基因的核苷酸进行融合，构建表达组成型干扰细胞分裂素代谢相关基因的植物表达载体；4)将步骤3)得到的表达组成型干扰细胞分裂素代谢相关基因的植物表达载体整合到棉花基因组中；5)将通过步骤4)获得的棉花进行进一步的培养、栽培，并获得转基因的棉花植株。

优选地，本发明中所述细胞分裂素代谢相关基因为细胞分裂素氧化酶CKX(cytokinin dehydrogenase)基因。更优选地，所述细胞分裂素代谢相关基因为棉花细胞分裂素氧化酶基因(简称GhCKX基因)。

本发明中所指的“棉花纤维性状”是指棉花纤维品质性状，包括纤维长度、细度、强度、整齐度等。

本发明中所指的“转基因棉花”是指通过分子生物学、生物技术手段，将目标基因转移到棉花中，从而使被改造棉花的遗传物质得到改造的棉花。用于改造的基因可以来源于植物、动物以及微生物或者人工合成改造。

本发明中所指“衣分”是指籽棉上纤维重量对籽棉重量之比，以百分率表示。也就是纤维重量占整个种子及纤维总重量的比例。

本发明通过大量研究和分析以及前期实验，认为John和于晓红等未能成功并不意味着调节内源细胞分裂素含量来提高棉花产量的策略是不可行的。因为，既然外施低浓度的细胞分裂素能增加棉花纤维产量，那么，通过控制植物激素合成酶基因、或者代谢酶基因，从内源角度来调节激素含量，增加棉花纤维产量，应该是可行的。而现有研究的结果未能取得预期效果的原因关键在于：未能找到内源细胞分裂素含量适当增加的转基因植株。因此选择适当增加内源细胞分裂素含量的方法，才可以有效的影响棉花的生长发育，获得预期的效果。但是，通过激素合成酶基因获得的转基因植株，内源细胞分裂素含量往往增加较剧烈，难以获得细胞分裂素含量适当增加的植株；然而采用pZ130组织特异性启动子获得了细胞分裂素含量增加的株系，转基因棉花的铃数、纤维长度、强度增加。本发明根据细胞分裂素合成酶和代谢酶的特点，创造性地采用了棉花细胞分裂素氧化酶(GhCKX)基因来调节内源细胞分裂素含量，并通过RNA干扰GhCKX基因的表达，上调细胞分裂素含量，从中筛选出细胞分裂素含量适当增加的转基因株系。

本发明方法在选定了启动子和目的基因的情况下，本发明的启动子和目的基因融合成新的基因的方式可以采用本领域常用的方式，并可以将融合成的新的基因转入本领域常用的载体中构建成表达载体再转入棉花中。显然，上述表达载体可以构建成含单个基因的单价载体，也可以构建含多基因的双价或三价等类型的载体。在使用本发明方法改良棉花的过程中，在整个生长发育过程中都可以表达形成双链RNA，干扰目标基因的mRNA，本发明方法已经提供了技术方案。

本发明降低植株高度、延缓棉花衰老、增加干旱抗性进而提高产量的方法，是通过在棉花中组成型干扰细胞分裂素代谢酶相关基因，进而调控细胞分裂素氧化酶基因的表达，通过内源调控棉花相应激素含量的方式，控制棉花株型、延缓衰老、增加干旱抗性，达到提高棉花产量的目的。试验结果证明，经本发明提高棉花产量的方法所改良的棉花植株变矮，衰老明显延缓，干旱抗性明显提高，铃重和纤维产量明显提高，棉花纤维品质没有明显变化。本发明方法简便易行，效果显著，能在不占用有限耕地的情况下，为纺织工业带来更多的纤维原料，产生巨大的经济效益。

附图说明

图1：干扰棉花细胞分裂素氧化酶基因表达载体的构建流程图

Km，卡那霉素抗性基因；Amp，氨苄青霉素抗性基因；NPTII，新霉素磷酸转移酶基因；GUS，β-葡萄糖酸苷酶基因；35S，来源于花椰菜花叶病毒的植物组成性启动子；Pnos，冠瘿碱合成酶基因启动子；nos，冠瘿碱合成酶基因终止子；LB，T-DNA左边界；RB，T-DNA右边界。用于构建植物表达载体的骨架载体为pBI121基础上改造的p5载体，具有CaMV 35S启动子调控下的GUS基因，便于在植物遗传转化的过程中对转化子进行GUS染色的筛选。

图2：干扰棉花细胞分裂素氧化酶基因表达载体的结构示意图

图3：35S：RNAiGhCKX转基因棉花茎中GhCKX基因的Real-time PCR分析

GhCKX基因在11个转基因株系中表达程度不同，株系13-1、16-8的表达量最低，株系16-5、16-7、5-6、11-1、P中的表达水平依次升高。WT，未转化的冀棉14号棉花作为对照。

图4：35S：RNAiGhCKX转基因棉花与对照幼嫩茎反玉素(ZT)和反玉素核苷(ZR)比较

通过测定盛花期茎(茎尖下2cm处，取3cm左右茎段)细胞分裂素含量，结果发现，转基因株系P、5-6、16-5和16-7的ZT和ZR含量之和高于野生型，特别是ZT含量，野生型植株含量很低或检测不到。WT，未转化的冀棉14号棉花作为对照；N/A，指没有检测到或者含量很低。所有株系重复取材测定3次，取平均值进行作图分析。

图5：35S：RNAiGhCKX转基因棉花与对照开花后一天每铃胚珠数目的比较

统计开花后一天棉铃胚珠数目发现，株系16-5、16-7、16-8的每铃胚珠数目显著降低。WT，未转化的冀棉14号棉花作为对照。所有株系统计30个棉铃，取平均值进行作图分析。

图6：35S：RNAiGhCKX转基因棉花与对照植株形态和现蕾数考察

通过调查盛花期植株高度、果枝数、果枝间距和现蕾数，结果发现，转基因植株的株高、果枝间距显著降低(A)；现蕾数目增加(A、B)，果枝数目没有变化。P，35S：RNAiGhCKX转基因棉花株系P；WT，未转化的冀棉14号棉花作为对照。随机选择30株植株调查，取其平均值进行作图分析。

图7：35S：RNAiGhCKX转基因棉花与对照子叶脱落率统计

统计种子萌发后37d和42d田间中试植株的子叶脱落情况，结果表明，转基因植株的子叶脱落显著低于野生型。P，35S：RNAiGhCKX转基因棉花株系P；WT，未转化的冀棉14号棉花作为对照。共统计120株棉花植株调查，以40株为一个重复，取其平均值进行作图分析。

图8：35S：RNAiGhCKX转基因棉花与对照子叶可溶性蛋白质含量的比较

检测种子萌发后43d和64d田间中试植株的子叶可溶性蛋白质含量，结果表明转基因植株子叶可溶性蛋白质含量显著高于野生型；萌发后43d(A)的可溶性蛋白质含量显著高于64d含量(B)。P，35S：RNAiGhCKX转基因棉花株系P；WT，未转化的冀棉14号棉花作为对照。随机选取3片子叶进行检测，取其平均值进行作图分析。

图9：35S：RNAiGhCKX转基因棉花与对照主茎叶脱落率统计

统计种子育种移栽138d后田间中试植株的主茎第一叶到第十三片叶脱落情况，结果表明，除第一、二和第十三片叶以外，转基因植株的主茎叶脱落显著低于野生型。P，35S：RNAiGhCKX转基因棉花株系P；WT，未转化的冀棉14号棉花作为对照。共统计120株棉花植株调查，以40株主茎叶脱落率为一个重复，取其平均值进行作图分析。

图10：35S：RNAiGhCKX转基因棉花与对照主茎第十片叶表型的比较

观察种子育种移栽135d后田间中试植株主茎第十片叶表型，结果表明，转基因植株叶片没有明显黄化衰老，而野生型叶片已呈现出显著的黄化、衰老情况。P，35S：RNAiGhCKX转基因棉花株系P；WT，未转化的冀棉14号棉花作为对照。标尺表示1cm。

图11：35S：RNAiGhCKX转基因棉花与对照主茎第十片叶可溶性蛋白质含量的比较

测定育种移栽135d后田间中试植株主茎第十片叶可溶性蛋白质含量，结果表明转基因植株叶片可溶性蛋白质含量显著高于野生型。P，35S：RNAiGhCKX转基因棉花株系P；WT，未转化的冀棉14号棉花作为对照。随机选取3片主茎叶进行检测，取其平均值进行作图分析。

图12：35S：RNAiGhCKX转基因棉花与对照主茎叶的叶绿素、类胡萝卜素含量的比较

检测育种移栽135d后田间中试植株主茎第十片叶的叶绿素、类胡萝卜素含量，结果表明转基因植株的叶绿素含量(A)和类胡萝卜素含量(B)显著高于野生型。P，35S：RNAiGhCKX转基因棉花株系P；WT，未转化的冀棉14号棉花作为对照。随机选取3片主茎叶进行检测，取其平均值进行作图分析。

图13：35S：RNAiGhCKX转基因棉花与对照主茎叶光合速率的比较

用LI-6400便携式光合作用测定仪检测第六和第十片主茎叶的光合速率，结果表明，转基因植株的光合速率高于野生型，特别是第六片叶光合速率明显比野生型高。P，35S：RNAiGhCKX转基因棉花株系P；WT，未转化的冀棉14号棉花作为对照。选取10片主茎叶进行检测，取其平均值进行作图分析。

具体实施方式

以下结合附图对本发明进行进一步的详细说明，但以下说明并不对本发明进行限定，任何对本发明的变形和改变，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求所定义的范围。

本发明实施例中的试剂药品未做具体说明的均为普通市售，材料方法未做具体说明的均参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell，2001)。所用的棉花实验材料为冀棉14，来自陆地棉(Gossypium hirsutum)。

【实施例一】棉花基因组的制备

1、DNA的提取

选取棉花幼叶0.5-1g，在液氮中快速研磨至精细粉末，加入3mL 65℃预热的CTAB提取液(100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，20mmol/L EDTA(pH8.0)，1.5mol/LNaCl，2％CTAB(W/V)，4％PVP40(W/V)和2％巯基乙醇(V/V)，PVP和巯基乙醇使用前加入)，快速颠倒振荡混匀。65℃水浴40min，然后加入1mL 5mol/LKAc，冰浴20min后，用等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提1次(10,000r/min，4℃离心5min)，取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇，混匀静置约30min，用玻棒挑出絮状沉淀，用75％的乙醇漂洗三次，再用无水乙醇漂洗1次，自然风干，重悬于500μL TE中。加入1μL RNaseA(10mg/ml)，37℃处理1h。再用酚(pH8.0)∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)和氯仿∶异戊醇(24∶1)各抽提1次(10,000r/min，4℃离心5min)，取上清，乙醇沉淀。沉淀用75％的乙醇漂洗，自然风干，溶于200μL TE中，-20℃保存备用。

2.RNA的提取

选取约3g新鲜棉花材料，在液氮中快速磨成至精细粉末，装入50mL离心管，加入15mL 65℃预热的RNA提取液(2％CTAB(W/V)，2％PVP(W/V)，100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，0.5g/L Spermidine，2.0mol/L NaCl，2％巯基乙醇(V/V，使用前加入))，颠倒混匀。65℃水浴3～10min，期间混匀2～3次。氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提2次(10,000r/min，室温，5min)。取上清，加入1/4体积10mol/L LiCl溶液，4℃放置6h，以氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)各抽提1次(10,000r/min，室温，5min)。加2倍体积的无水乙醇，在-70℃冰箱沉淀30min以上。12,000r/min，4℃离心20min，弃上清。沉淀用200μL的DEPC处理水溶解。酚(pH4.5)∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)、氯仿∶异戊醇(24∶1)各抽提1次(10,000r/min，室温，5min)。加1/10体积3mol/L NaAc溶液和2.5倍体积的无水乙醇，在-70℃冰箱沉淀30min以上。12,000r/min，4℃离心20min，弃上清。沉淀用70％的酒精漂洗一次，风干。加200μL的DEPC处理水溶解。用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量。

3、基因组序列的PCR扩增

扩增程序为：94℃，5min；94℃，30sec，56℃，30sec，72℃，1.5min，35个循环；72℃延伸10min。

4、DNA片段回收，连接，转化大肠杆菌DH5α

长度在2.0kb以下的片段采用离心法回收。紫外灯下，用洁净的刀片切下含目的片段的琼脂糖凝胶块。用5号缝衣针在0.5mL的离心管底部钻一小孔并填入大小合适的玻璃棉。将含目的片段的琼脂糖块放入填有玻璃棉的0.5mL离心管中，液N2速冻，将速冻的0.5mL离心管套入到一1.5mL的离心管中，13,000r/min离心3min。向流出液(含DNA)中加入1/10倍体积的3mol/LNaAc(pH5.2)，3倍体积的无水乙醇，混匀后于-70℃放置30min。13,000r/min、4℃离心15min收集DNA沉淀，用预冷的75％的乙醇洗涤沉淀。室温干燥，用适量的TE溶解沉淀即得到目的片段。回收片段在琼脂糖凝胶上电泳定量。长度大于2.0kb以上的片段用试剂盒(Roche公司)回收。

回收的片段与pUCm-T(上海生工)载体建立如下连接体系：

载体DNA片段与外源连接产物DNA片段摩尔比为1∶3，16℃连接12h。之后将连接产物转化大肠杆菌DH5α。

本实施例中提供了棉花基因组的提取、基因组序列PCR扩增、DNA片段回收、连接、转化的通用方法。在本发明的具体实施方式中，可以采用上述方法，也可以采用本发明其他地方所述的方法。

【实施例二】表达细胞分裂素氧化酶基因的核苷酸的制备与表达载体的构建

1、RNAiGhCKX核苷酸序列的获得

采用从基因组中直接扩增获得带内含子的RNA发夹结构的方法(Xiao等，2006，BioTechniques 41：548-552)，设计引物1和2(分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)，从陆地棉基因组中直接扩增克隆、测序分析后得到RNAiGhCKX的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3所示。

2、干扰棉花细胞分裂素氧化酶基因的载体的构建

载体构建流程见图1。所有限制性内切酶购自Roche公司，按照使用说明书操作。构建的植物表达载体结构如图2所示，其包括表达干扰细胞分裂素氧化酶基因的核苷酸(SEQ ID NO.3)以及表达筛选所需的各元件。

【实施例三】转化体和转基因植物的制备

1、用电激法将构建的植物表达载体质粒导入农杆菌LBA4404。

参考Bio-RAD MicroPulser用户说明书，将上述载体通过电激转化法导入农杆菌LBA4404。

2、干扰棉花细胞分裂素氧化酶基因的载体整合到棉花基因组

通过根癌农杆菌介导的方法进行棉花的遗传转化

表1：根癌农杆菌介导的棉花遗传转化用培养基

MS：Murashige & Skoog，1962；B5：Gamborg，1986；

Gelrite：Sigma，货号：G1910；SH：Schenk & Hildebrandt，1972

上述的表达载体通过农杆菌介导下胚轴的方法导入棉花。具体方法如下：

(1)转化农杆菌的培养：挑取含上述表达载体的农杆菌菌株，在含50mg/L卡那霉素和125mg/L链霉素的YEB固体培养基(0.5％蔗糖(W/V)，0.1％细菌用酵母提取物(W/V)，1％细菌用胰化蛋白胨(W/V)，0.05％MgSO4·7H2O(W/V)，1.5％的琼脂粉(W/V)pH7.0)上划线培养。挑农杆菌单菌落，接种于5mL含相同抗生素的YEB液体培养基中，28℃、200r/min振荡培养过夜。培养后的农杆菌菌液按1∶20的比例转接到50mL含相同抗生素的YEB液体培养基中，继续在28℃、200r/min振荡培养3-5h。6,000r/min离心10min后，菌体用液体MSB(含100μmol/L乙酰丁香酮)培养基重悬，调整OD600值为0.6-0.8备用。

(2)棉花下胚轴的获得：棉花种子(冀棉14号)剥壳，用0.1％升汞(HgCl₂)消毒10min，无菌水漂洗6次，在125mL三角瓶中加入约35mL无菌水振荡过夜，次日换一次无菌水。当种子长出下胚轴根后，播种于种子萌发培养基(培养基成分见表1)上，28℃、黑暗条件下萌发3-5d(天)，以获得无菌棉花下胚轴材料。选取生长健壮的无菌苗下胚轴，快速斜切为长约1.0cm的小段保湿备用。

(3)浸染和共培养：将10mL转化用农杆菌液放入下胚轴受体材料中手动晃动瓶子以使其充分接触菌液，20-25min后，弃去转化用农杆菌液，然后用1.0mL无菌枪头吸取残液。将浸染过的下胚轴材料转移到已经加入无菌滤纸片的共培养培养基中，于24℃黑暗条件下共培养2d。

(4)转化子的筛选：共培养2d后将转化后的下胚轴材料转移到筛选培养基上进行脱菌和抗性选择培养，20d左右继代一次，继代时去掉切口明显褐化死亡的下胚轴材料，约需继代2次，共计40d左右。当下胚轴材料切口长出肉眼明显可见的抗性愈伤组织时，将其继代至愈伤诱导培养基中，以诱导大量的愈伤组织形成，每14d左右继代一次。继代至愈伤组织长至小指头大小，将这些愈伤组织连同下胚轴一起转移至胚性愈伤诱导培养基中，以诱导胚性愈伤组织的产生。诱导胚性愈伤组织的形成平均12-14d继代一次，约需继代2-3次。当形成肉眼可见的松散的颗粒状淡黄色胚性愈伤组织后，可以将这些明显的单个颗粒状胚转移至胚成熟培养基中进行胚成熟培养。同时可把松散的淡黄色胚性愈伤组织转移至液体悬浮培养基中，在摇床上120r/min振荡悬浮培养以促进形成更多的单个颗粒状胚，培养一周到二周后用30目筛网过滤悬浮培养组织，去掉大颗粒组织。然后将滤过的淡黄色胚性愈伤组织用1.0mL无菌枪头转移至体胚成熟培养基中，确保胚性愈伤组织松散铺开，以利于单个胚的成熟生长。

将在胚成熟培养基中形成的绿色胚，转移至体胚伸长培养基中，当绿色胚伸长至约0.5cm时，将其转移至成苗培养基中进行成苗培养。当从伸长的体胚中长出3-4片真叶后，将其嫁接到有3-4片真叶的棉花幼苗上。

3、获得整合组成型表达植物激素代谢相关基因的棉花

嫁接时，先取其新生幼嫩根进行GUS组织化学染色，GUS阳性的小苗表明组成型表达植物激素代谢相关基因的载体已经整合到棉花基因组中。嫁接的棉花培养在温室中常规管理。成熟后收集棉铃、种子和纤维进行产量和品质性状分析。

【实施例四】用Real-time PCR的方法检测细胞分裂素氧化酶基因GhCKX在棉花茎中的表达

提取对照和转基因棉花幼嫩茎的总RNA，通过逆转录合成cDNA一链。以此为模板进行quantitative real-time PCR扩增。具体操作步骤为：用DNA一链合成试剂盒(MBI公司)合成各种RNA的一链cDNA，操作均按试剂盒说明书进行。PCR在quantitative real-time PCR仪上进行，在20μL的反应体系中包括10μL MIX buffer(Bio-Rad公司，包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs和MgCl₂)，上下游引物各0.2μmol/L和1μL一链产物。温度循环参数为98℃预变性2mins；94℃，20sec，56℃，20sec，72℃，20sec，预设循环数为40。用棉花Histone3基因作内标，上、下游引物分别为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5。扩增GhCKX基因的上、下游引物分别为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7。在运行quantitativereal-time PCR之后，通过融解曲线分析，检查并确保扩增产物是单带。

转基因和野生型植株茎中GhCKX基因表达比较

采用上述方法，检测了转基因和野生型植株盛花期茎(茎尖下2cm处，取3cm左右茎段)中GhCKX基因的表达水平，结果见图3。转基因株系中幼嫩茎GhCKX基因表达水平最低的是16-8，其次是13-1、16-5、16-7，表达水平下调中等的是株系P和5-6。

【实施例五】35S：RNAiGhCKX转基因棉花幼嫩茎中细胞分裂素的考察

以[²H₅]Trans-Zeatin(ZT)和[²H₅]Trans-Zeatin Riboside(ZR)为内标，采用高压液相色谱-质谱联用分析法。

1、内标的配制：同位素标记的细胞分裂素标准样品[²H₅]Trans-Zeatin(ZT)、[²H₅]Trans-Zeatin Riboside(ZR)溶解于适量体积的80％甲醇，配制成终浓度为10p mol/μL的母液备用。

2、激素提取和纯化：从盛花期主茎尖下2cm处，取3cm左右茎段用液氮精细研磨后装入预先称量的10mL离心管，然后再精确称量10mL离心管的重量从而得出样品的重量。采用Dobrev等(2002)的方法提取茎细胞分裂素。具体方法如下：每个样品中加入7mL-20℃预冷的提取液，涡旋振荡1min后于-20℃提取过夜，然后13000g 20min 4℃离心，将上清液转移到15mL离心管中，下部固体重新加入3mL提取液，涡旋30Sec后-20℃静置1h，再次13000g 20min4℃离心，将所有上清液合并。接着把合并的上清液缓缓通过预先用5mL 100％甲醇和5mL 80％提取液活化的Sep-Pak PlusC₁₈反相小柱，样品中的色素与脂质保留在小柱中。将过柱上清液置于100mL蒸馏瓶中40℃真空旋转蒸发接近干，用5mL 1M甲酸复溶蒸馏瓶中残余物质。1mol/L甲酸复液缓缓通过预先用5mL100％甲醇和5mL 1mol/L甲酸活化的阳离子反相SPE小柱Oasis MCXcolumn，接着依次用5mL 1mol/L甲酸、5mL 100％甲醇、2mL 0.35mol/L氨水漂洗Oasis MCX column小柱，最后用5mL 60％的0.35mol/L氨水的甲醇(V/V)溶液洗脱出Cytokinin bases，ribosides和glucosides，洗脱液置于50mL蒸馏瓶中40℃真空蒸发接近干，残余物质用1.5mL 100％甲醇复溶，复溶液转移到1.5mL离心管中室温真空干燥。将此干燥的样品重新用100μL 10％的HPLC级甲醇复溶，涡旋振荡1min，静置20min后过0.2μm有机滤膜除去固体和水溶性杂质。将得到的样品置于-20℃中备用。

3、激素的检测：使用的检测仪器为岛津公司(shimazu)高压液相色谱-质谱联用仪(LCMS-2010A)。将干燥的样品以10％色谱纯甲醇复溶，通过自动进样器上样，分析条件为：Zorbax Eclipse XDB-C18分离柱(2.1*130mm，5um粒径，Agilent)，用0.01％乙酸∶甲醇以流速0.140mL/min分离Trans-Zeatin、Trans-Zeatin Riboside，洗脱梯度：90∶10％到60∶40％15分钟，60∶40％到45∶55％15分钟。分离流出物引入ESI离子源温度200℃，去溶剂温度为250℃。雾化气和干燥气的流速分别为1.5L/min和10L/min。Trans-Zeatin、Trans-ZeatinRiboside以SIM方式对正离子进行检测，特征离子如下：220(Trans-Zeatin)，225([2H5]Trans-Zeatin)；350(Trans-Zeatin Riboside)，356([2H5]Trans-ZeatinRiboside)，检测电压1.2KV。

记录内标[²H₅]Trans-Zeatin(ZT)和[²H₅]Trans-Zeatin Riboside(ZR)的色谱峰保留时间、峰面积和质谱图。根据保留时间和质谱图鉴定各样品中ZT和ZR，并计算内标和内源ZT、ZR的色谱峰面积。重复三次，取峰面积的平均值。通过内标法计算样品中的ZT和ZR含量。

转基因和野生型植株茎中细胞分裂素含量比较

采用上述方法，检测了转基因和野生型植株盛花期茎(茎尖下2cm处，取3cm左右茎段)细胞分裂素含量，结果见图4。转基因株系P、5-6、16-5和16-7的ZT和ZR含量之和高于野生型，特别是ZT含量，野生型植株含量很低或检测不到；其中，株系P的ZT和ZR含量处于中等水平。

【实施例六】35S：RNAiGhCKX转基因棉花每铃胚珠数目调查

转基因棉花和对照的每铃胚珠数目对比分析

常规管理温室中的嫁接的棉花，于盛花期统计30个开花后一天棉铃的每铃胚珠数目，结果见图5。转基因株系16-5、16-7和16-8的每铃胚珠数目显著低于野生型材料。结合转基因材料茎中细胞分裂素含量分析可以看出，更高细胞分裂素水平更高的株系，胚珠数目明显减少。

【实施例七】选择适当增加细胞分裂素的35S：RNAiGhCKX转基因棉花株系

选择细胞分裂素含量增加，生长发育正常的植株

细胞分裂素含量高于P的株系16-5、16-7其每铃胚珠数目显著减少，这表明细胞分裂素含量的超过株系P导致植株生长不正常。这与前人研究结果，过量增加细胞分裂素对正常生长不利而难以达到预期的目的相一致。同时株系P的每铃胚珠数目与野生型没有明显差异，因此，选择株系P进一步分析其表型。

【实施例八】35S：RNAiGhCKX转基因棉花的植株形态和现蕾数考察

转基因棉花和对照的植株高度、果枝数、果枝间距和现蕾数对比分析

转基因T2代棉花植株种植于西南大学转基因基地，每个株系种植120株，常规田间管理。于盛花期随机选择30株植株检测其植株高度、果枝数、果枝间距和现蕾数。从实验结果(图6)可见：非转基因对照的植株高度、现蕾数、果枝数和果枝间距分别为110.8cm、76个、16.4cm、6.8cm，而转基因为100.2cm、81个、16.0cm和6.3cm，其中转基因棉花植株高度降低约10cm、果枝间距减少0.5cm，差异达到极显著(P＜0.01，T-Test测试)，果枝数没有明显变化，现蕾数增加5个，差异达到显著(P＜0.05，T-Test测试)。

【实施例九】35S：RNAiGhCKX转基因棉花衰老分析

转基因棉花和对照的子叶和主茎叶衰老分析

转基因棉花的子叶衰老减慢

转基因T2代棉花植株种植于西南大学转基因基地，每个株系种植120株，常规田间管理。统计了播种后37d和42d的子叶衰老脱落情况，结果表明：37

d后转基因植株子叶脱落率为3.28％，野生型为9.48％；42d后转基因植株子叶脱落率为7.47％，野生型为24.49％(图7)。检测了播种后43d和64d子叶中可溶性蛋白质含量(图8)，结果表明：43d(A)后转基因植株子叶可溶性蛋白质含量为8.40mg/g，野生型为7.24mg/g，差异达到极显著(P＜0.01，T-Test测试)；64d(B)后转基因植株子叶可溶性蛋白质含量为0.43mg/g，野生型为0.13mg/g，差异达到极显著(P＜0.01，T-Test测试)。

转基因棉花的主茎叶衰老减慢

统计了转基因T2代棉花植株播种后138d天，且近一月干旱缺水情况下，主茎第一片叶到第十三片叶衰老脱落情况。结果(图9)表明：转基因主茎第一到第十三片叶脱落率依次为97.59％、96.24％、80.35％、73.88％、64.19％、52.45％、33.99％、25.35％、15.42％、7.66％、2.04％、0.65％、0，野生型依次为99.31％、98.55％、94.90％、94.90％、92.66％、85.48％、78.30％、65.66％、50.47％、32.59％、25.64％、10.04％、4.18％，除第主茎第一、第二和第十三片叶没有脱落率没有明显差异外，其它叶片脱落率具有极显著差异(P＜0.01，T-Test测试)。

观察播种后135d后主茎第十片叶表型。结果(图10)表明，转基因植株叶片没有明显黄化衰老，而野生型叶片已呈现出显著的黄化、衰老情况。

检测了播种135d后主茎第十片叶的可溶性蛋白质含量和叶绿素含量。结果表明，转基因植株主茎叶的可溶性蛋白质(图11)含量为0.65mg/g(650μg/g)，野生型为0.39mg/g(390μg/g)，差异达显著水平(P＜0.05，T-Test测试)；转基因植株主茎叶的叶绿素含量和类胡萝卜素含量(图12)分别为0.63(mg/g)、0.28(mg/g)和77.32(mg/g)，野生型含量分别为0.28(mg/g)、0.15(mg/g)和58.66(mg/g)，差异都达到极显著水平(P＜0.01，T-Test测试)。

【实施例十】35S：RNAiGhCKX转基因棉花光合速率

转基因棉花和对照主茎第六片和第十片叶光合速率分析

采用LI-6400便携式光合作用测定仪测定了主茎第六片、第十片叶的光合速率，结果(图13)表明：转基因第六片叶为14.275μmol/(m².s)，野生型为9.905μmol/(m².s)，差异达显著水平(P＜0.05，T-Test测试)；转基因第十片叶为19.54μmol/(m².s)，野生型为17.23μmol/(m².s)。

【实施例十一】35S：RNAiGhCKX转基因棉花的棉铃及纤维品质性状考察

转基因材料纤维产量增加

棉铃成熟裂开后，40个棉铃铃一组收获，晒至恒重后，称量籽棉总重，棉花种子经脱绒机脱绒，称量纤维总重和棉籽总重，计算得到纤维衣分以百分数表示和铃重。结果如表1所示，转基因棉花平均衣分为39.87％，野生型为37.47％，差异达极显著水平(P＜0.01，T-Test测试)；转基因棉花铃重为3.93g，比野生型3.53g增加11.38％，增加达极显著水平(P＜0.01，T-Test测试)。转基因材料纤维重62.7g，比野生型53.07g增加18.15％达到极显著水平(P＜0.01，T-Test测试)。同时240个棉铃转基因材料纤维重比野生型增加14.54％。

表2：转基因棉花和对照的衣分、铃重比较

转基因棉花纤维的品质检测

将各棉纤维样品送农业部棉花品质监督检测测试中心(安阳)，依据ASTMD5867-95《HVI900大容量纤维测试仪试验方法》，采用HFT9000在温度20℃相对湿度65％的环境条件下，对上半部平均长度、整齐度指标、断裂比强度、伸长率、马克隆值5指标进行测试。对照材料选用未转化的冀棉14号植株。结果见表3。

转基因材料纤维上半部平均长度、整齐度指标、断裂比强度、伸长率四个检测样本的平均值分别依次为30.59、86.05、32.23、6.95，野生型依次为29.88、85.60、31.25、6.88，t测验结果表明转基因材料与野生型没有显著。与纤维细度和成熟度相关的马克隆值指标检测的结果显示转基因棉花的马克隆值为5.31比野生型5.03显著增加。根据国家棉花分级标准，按照马克隆值差异将棉花分为A、B、C三级，B为标准级。A级取值范围在3.7-4.2，品质最好；B级取值范围为3.5-3.6和4.3-4.9；C级取值范围为3.4及以下和5.0及以上，品质最差。转基因棉和野生型棉纤维的马克隆值都大于5.0，属于C级品质较差。转基因棉马克隆值高于野生型，可能是细胞分裂素增加纤维沉积导致细度增加。

表3：转基因棉花和对照的纤维品质比较

上述实例表明，本发明提高棉花产量的方法，能够实现在棉花中组成型下调棉花细胞分裂素氧化酶基因的表达，进而适当提高内源细胞分裂素含量，达到降低株高、延缓植株衰老、抗干旱逆境、增加纤维产量的目的。试验结果证明，经本发明提高棉花产量的方法所改良的棉花株高降低，棉蕾数量增加，铃重增加，纤维衣分明显提高，纤维产量显著增加，同时棉花品质没有明显改变。本发明方法简便易行，效果显著，具有很好的市场前景。

以上对本发明的详细描述并不限制本发明，本领域的技术人员可以根据本发明做出各种变形和改变，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求所定义的范围。

Claims (7)

1.一种植物表达载体，含有干扰棉花细胞分裂素代谢相关基因表达的核苷酸和组成型启动子。

2.根据权利要求1所述的植物表达载体，其特征在于，所述植物表达载体至少包含RNA干扰的棉花细胞分裂素氧化酶基因RNAiGhCKX和花椰菜花叶病毒35S启动子。

3.根据权利要求2所述的植物表达载体，其特征在于，所述植物表达载体具有如图2所示的结构。

4.一种含有权利要求1所述的植物表达载体的转基因植物的制备方法，包括下述步骤：

1)将干扰棉花细胞分裂素代谢相关基因表达的核苷酸与植物组成型启动子可操作地连接；

2)构建含有干扰棉花细胞分裂素代谢相关基因表达的核苷酸和组成型启动子的植物表达载体；

3)用所述植物表达载体转化宿主，获得转化体；

4)用所述转化体转化植物，获得转基因植物。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其中所述干扰棉花细胞分裂素代谢相关基因表达的核苷酸为RNA干扰的棉花细胞分裂素氧化酶基因RNAiGhCKX，具有如SEQ ID No.3所示的序列，所述植物组成型启动子为花椰菜花叶病毒35S启动子。

6.权利要求1所述的植物表达载体在棉花纤维性状改良中的应用。

7.权利要求1所述的植物表达载体在培育植物新品种中的应用。

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