CN113588850A - 一种细胞分裂素氧化酶活性检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种细胞分裂素氧化酶活性检测试剂盒及检测方法，属于试剂盒技术领域，试剂盒中包括试剂一：20mmol/LpH 6.0磷酸缓冲溶液；试剂二：1mmol/L氯化锰溶液；试剂三：1mmol/L反式玉米素(tZ)溶液；试剂四：乙酸；利用反式玉米素(tZ)在细胞分裂素氧化酶的作用下，降解为腺嘌呤的原理，可通过检测tZ含量，利用反应前后tZ含量的变化量，计算得出细胞分裂素氧化酶的活性。该发明中可以检测的tZ含量可达到ng/mL，检测时间短，可对植物体各个部位的细胞分裂素氧化酶活性进行检测，适用性广。

Description

一种细胞分裂素氧化酶活性检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于试剂盒技术领域，具体涉及一种细胞分裂素氧化酶活性检测试剂盒及检测方法。
背景技术
随着农业的快速发展，对农业学科领域的研究也随之快速发展。在植物学科领域内，植物激素一直都是研究的重点，细胞分裂素(cytokinin，CTK)是五大植物激素之一，是直接调控作物产量的一种植物激素，是植物自身合成的微量有机物质，在植物体内含量极微，但对植物生长发育具有显著影响，参与植物的发育、形态建成、抗病、抗逆等生物学进程，其主要作用是促进细胞分裂和扩大，促进芽分化和侧芽发育，延缓衰老和打破休眠等。
细胞分裂素氧化酶(cytokinin oxidase/dehydrogenase，CKX)是合成细胞分裂素的关键酶，细胞分裂素的含量在植物体内的动态平衡需要细胞分裂素氧化酶(cytokininoxidase/dehydrogenase，CKX)的维持，细胞分裂素氧化酶能断裂细胞分裂素侧链使其失活，可防止细胞分裂素积累过多而产生毒害。因此细胞分裂素氧化酶对于植物体自身合成细胞分裂素起着关键作用，间接控制着植物的生长发育。
而现有技术中还没有合适的检测方法能够检测细胞分裂素氧化酶的活性，因此植物农学领域的科研工作者不能更加深入地研究植物激素的生成过程，研究进展停滞不前。
发明内容
本发明的目的在于提供一种细胞分裂素氧化酶活性检测试剂盒及检测方法，以解决背景技术中提出的技术问题。
为了实现上述目的，本发明公开了一种细胞分裂素氧化酶活性检测试剂盒，包括以下试剂：
试剂一：20mmol/L pH 6.0磷酸缓冲溶液，4℃保存；
试剂二：1mmol/L氯化锰溶液，4℃保存；
试剂三：1mmol/L反式玉米素溶液，4℃保存；
试剂四：乙酸，4℃保存。
本发明同时要求保护一种细胞分裂素氧化酶活性的检测方法，使用上述的细胞分裂素氧化酶活性检测试剂盒进行，包括如下步骤：(1)细胞分裂素氧化酶的提取和降解反应； (2)仪器检测；(3)进行细胞分裂素氧化酶活性的计算。
进一步地，步骤(1)中，采用试剂一对植物样本进行细胞分裂素氧化酶的提取。
进一步地，步骤(1)中，采用提取出的细胞分裂素氧化酶对反式玉米素进行降解反应，得到细胞分裂素氧化酶样本溶液。
进一步地，步骤(2)中，准备已知浓度的反式玉米素标准品溶液，采用高效液相色谱仪分别对步骤(2)中得到的细胞分裂素氧化酶样本溶液，以及反式玉米素标准品溶液进行测试。
进一步地，采用高效液相色谱仪检测时，流动相为甲醇和水的混合液，并加入试剂四，混匀；其中甲醇和水的体积比为40:60。
进一步地，步骤(3)中，细胞分裂素氧化酶活性按样本鲜重计算：
细胞分裂素氧化酶活性＝[(S对照+0.2924)/28.1091-(S测定+0.2924)/28.1091]·V提取/ (T·W·M)；
该公式中，细胞分裂素氧化酶活性代表每质量单位植物样本组织每单位时间消耗每摩尔单位的反式玉米素，即为一个酶活力单位；
其中，S测定：细胞分裂素氧化酶样本溶液中反式玉米素的峰面积，S对照：反式玉米素标准品溶液中反式玉米素的峰面积；V提取：提取的总体积；T：步骤(1)中降解反应的时间，W：步骤(1)中植物样本的质量；M：反式玉米素的相对分子质量。
上述公式中，可根据具体的测试实际进行计量单位之间的换算，例如，常用的细胞分裂素氧化酶活性的单位为nmol/(min·g鲜重)，实际中nmol可换算为μmol、mmol、mol 等；min可换算为h、s等；g可换算为kg、mg、μg、ng等，需要注意的是进行换算是需要乘以或除以相应的换算系数。
在植物细胞分裂素的生物代谢途径中，反式玉米素(tZ)在细胞分裂素氧化酶的作用下，降解为腺嘌呤。细胞分裂素氧化酶有高效性，温和性，专一性，只会对反式玉米素进行氧化降解，因此可通过检测tZ含量，利用反应前后tZ含量的变化量，计算得出细胞分裂素氧化酶的活性。
与现有技术相比，本发明的细胞分裂素氧化酶活性检测试剂盒及检测方法具有如下优点：
(1)本发明基于高效液相色谱法，该仪器检测灵敏度极高，可以检测的tZ含量达到ng/mL，检测时间短，完成一个样本的测定时间在5min，同时还可配备自动检测器，可以 24小时自动进样检测。
(2)本发明的检测试剂盒及检测方法适用性很广，对于植物叶片、果实、根系等植物体的各个部位的细胞分裂素氧化酶活性均可进行检测，无杂质干扰，无假阳性。
附图说明
图1：拟合后的tZ浓度标准曲线；
图2：测试组中棉花叶片的细胞分裂素氧化酶活性检测色谱图；
图3：对照组中棉花叶片的细胞分裂素氧化酶活性检测色谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施例进行详细阐述，说明本发明的技术方案。
实施例1
一种细胞分裂素氧化酶活性检测试剂盒，包括以下试剂：
试剂一：20mmol/L pH 6.0磷酸缓冲溶液，4℃保存；
试剂二：1mmol/L氯化锰溶液，4℃保存；
试剂三：1mmol/L反式玉米素(tZ)溶液，4℃保存；
试剂四：乙酸，4℃保存。
一种细胞分裂素氧化酶活性的检测方法，使用上述细胞分裂素氧化酶活性检测试剂盒进行，包括如下步骤：
(一)准备试验用品：高效液相色谱仪、低速离心机、氮吹仪、溶剂抽滤装置、针头式过滤器(有机系，50个，0.22μm)、滤膜(水系和有机系各1个，0.45μm)、C18柱 (4.6×250mm)、可调式移液器、样品瓶(50个，2mL)、甲醇(色谱级，500mL)、和超纯水。
(二)试验前准备工作，包括如下步骤：
(1)将超纯水500mL和甲醇500mL分别用0.45μm的滤膜抽滤，以除去溶剂中的杂质，防止堵塞色谱柱。(注：蒸馏水用水系滤膜抽滤，甲醇用有机系滤膜抽滤)。
(2)流动相的配制：将甲醇和超纯水按照40:60的体积比配成流动相，该实施例1中取200mL甲醇和300mL超纯水混合，加入3mL乙酸(试剂四)，混匀。
(3)将配好的流动相超声20分钟，以脱去溶剂中的气泡，防止堵塞色谱柱，超声后备用。
(三)进行提取和试验操作，包括如下步骤：
(1)取新鲜的植物样本0.5g，置研钵中，加入5mL预冷(放入4℃冰箱，预冷6h) 的试剂一(试剂一为提取液)，置冰浴中研磨成浆。将研磨形成的浆液加入离心机中，在10000rpm条件下，4℃离心10min，取上清液，置于冰上冷却备用。
(2)取2支试管，于一试管中加入氯化锰(试剂二)0.5mL，tZ(试剂三)2mL，步骤(1)中的上清液1mL，磷酸缓冲液(试剂一)1mL，混合均匀，作为测试组；
另一个试管中除了步骤(1)中的1mL上清液用等体积的磷酸缓冲液代替之外，其他成分相同，作为对照组；
两支试管一起置于25℃恒温水浴中，保温条件下反应60min。
(3)反应结束后，加入2mL甲醇终止反应，测试组得到细胞分裂素氧化酶样本溶液；对照组得到tZ标准品溶液。
将测试组和对照组试管中的液体过0.22μm滤膜，取上清液送入高效液相色谱仪中进行检测。
其中，高效液相色谱仪的仪器设置条件：流动相为甲醇与水体积比＝40:60，以及试剂四的混合溶剂，设置紫外波长254nm，流速1mL/min，柱温30℃，进样体积10μL，测试时间5min。
(四)进行细胞分裂素氧化酶活性的计算：
用高效液相色谱仪测试tZ浓度与对应的峰面积的数值，如表1所示。
表1 高效液相色谱仪测试得到的tZ浓度与对应的峰面积的数值
x(浓度μg/mL) 0.1 1 4 10 40 100
y(峰面积) 8.905 33.893 109.787 265.800 1129.684 2809.905
对表1中的数据进行曲线拟合，如图1所示，得到tZ标准曲线：y＝28.1091x-0.2924， R2＝0.9999。
其中，x：tZ浓度，y：峰面积，R2≈1，说明tZ标准曲线的可靠性较高。
细胞分裂素氧化酶活性按照样本鲜重进行计算：
按样本鲜重计算：
CKX[nmol/(min·g鲜重)]＝[(S对照+0.2924)/28.1091-(S测定+0.2924)/28.1091]·V 提取·1000/(T·W·M)＝0.176·ΔS。
其中，CKX[nmol/(min·g鲜重)]为每g植物样本组织鲜重每分钟消耗1nmol的tZ定义为一个酶活力单位，单位为：nmol/(min·g鲜重)。
其中，S测定：测试组中tZ的峰面积(仪器上显示的值)，S对照：对照组中tZ的峰面积(仪器上显示的值)；ΔS＝S对照-S测定；
V提取：提取的总体积为32.5mL，计算过程为：首先是0.5g植物样本加入5mL提取液，研磨后从中取1mL参加反应，其中1mL参加反应时，最后体积是6.5mL(包括1mL 提取后的上清液、0.5mL试剂二、2mL试剂三、1mL试剂一、2mL甲醇，共计6.5mL)，所以对于5mL提取液而言，提取的总体积V提取＝5·6.5＝32.5mL；
T：反应时间，即60min，W：步骤1中称取的植物样本质量W＝0.5g，1000表示的是μg转变为ng的数量级；M：tZ的相对分子质量，即219.243g/mol。
如图2所示，为测试组中棉花叶片的细胞分裂素氧化酶活性检测色谱图，图3为对照组中棉花叶片的细胞分裂素氧化酶活性检测色谱图。
在图2中，tZ的色谱信号峰对应的时间为4.3931min，图3中色谱信号峰对应的时间为4.3871min，将图2和图3中tZ的色谱信号峰面积的数值代入上述公式中，可得：
按样本鲜重计算：
CKX[nmol/(min·g鲜重)]＝0.176·ΔS＝0.4224nmol/(min·g鲜重)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的设计构思之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种细胞分裂素氧化酶活性检测试剂盒，其特征在于：包括以下试剂：
试剂一：20mmol/LpH 6.0磷酸缓冲溶液，4℃保存；
试剂二：1mmol/L氯化锰溶液，4℃保存；
试剂三：1mmol/L反式玉米素溶液，4℃保存；
试剂四：乙酸，4℃保存。
2.一种细胞分裂素氧化酶活性的检测方法，使用如权利要求1所述的细胞分裂素氧化酶活性检测试剂盒进行，其特征在于：包括如下步骤：(1)细胞分裂素氧化酶的提取和降解反应；(2)仪器检测；(3)进行细胞分裂素氧化酶活性的计算。
3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于：步骤(1)中，采用试剂一对植物样本进行细胞分裂素氧化酶的提取。
4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于：步骤(1)中，采用提取出的细胞分裂素氧化酶对反式玉米素进行降解反应，得到细胞分裂素氧化酶样本溶液。
5.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于：步骤(2)中，准备已知浓度的反式玉米素标准品溶液，采用高效液相色谱仪分别对步骤(2)中得到的细胞分裂素氧化酶样本溶液，以及反式玉米素标准品溶液进行测试。
6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于：采用高效液相色谱仪检测时，流动相为甲醇和水的混合液，并加入试剂四，混匀；其中甲醇和水的体积比为40:60。
7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于：步骤(3)中，细胞分裂素氧化酶活性按样本鲜重计算：
细胞分裂素氧化酶活性＝[(S对照+0.2924)/28.1091-(S测定+0.2924)/28.1091]·V提取/(T·W·M)；
其中，细胞分裂素氧化酶活性代表每质量单位植物样本组织每单位时间消耗每摩尔单位的反式玉米素，即为一个酶活力单位；
其中，S测定：细胞分裂素氧化酶样本溶液中反式玉米素的峰面积，S对照：反式玉米素标准品溶液中反式玉米素的峰面积；V提取：提取的总体积；T：步骤(1)中降解反应的时间，W：步骤(1)中植物样本的质量；M：反式玉米素的相对分子质量。
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