CN112126653B - 0scpy及其编码蛋白在水稻播种中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了水稻孤儿基因Oscpy及其编码蛋白的新应用。本发明发现Oscpy表达下调可促进水淹条件下水稻种子的萌发，以及正常条件下水稻幼苗的快速生长。利用该基因的功能特点，可以创建高效率直播的水稻材料，该基因在水稻育种上有巨大的应用潜力。Oscpy表达下调水稻幼苗的快速生长，可提高水稻直播效率，也有利于提高长江流域地区遇到“倒春寒”的育秧效率。

Description

0scpy及其编码蛋白在水稻播种中的应用
技术领域
本发明属于生物基因工程领域，具体涉及水稻中一个孤儿基因Oscpy及其编码蛋白在水稻播种中的应用。
背景技术
水稻是我国主要的粮食作物之一，如何提高其抗逆能力一直是生物学家普遍关注的问题之一。水稻种植的方式主要有直播和育秧移栽两种，直播方式是我国祖先留下来的最古老和最原始的种植方式。在温饱问题为主要矛盾的阶段，要提高单位面积产量，只能充分利用当地气候资源进行精细耕作，因此育秧移栽一直处于主导地位。但随着我国经济的发展，农业生产领域也从传统的追求产量单一目标向追求效益、生态、环保等综合目标转变，导致了对水稻的生产方式进行了新的思考。从节约水资源，降低人力投入等角度出发，水稻的直播技术逐步兴起。水稻直播技术是指不育苗，不插秧，将种子直接播到大田，没有育苗及移植过程的一项种植技术。在直播过程中，需要保持一定的水层，确保水稻种子在淹水的条件下进行播种出苗的一种直播方式。水直播能够有效的控制杂草的萌发和生长，同时对鸟类危害种子也起到了极好的防控作用。但是水稻种子在淹水条件下进行生长发育，出苗率低，这也是直播方式存在的弊端，若能通过分子操作来改善此性状，将会降低直播引起的产量降低的风险。
“孤儿基因”是指根据已有的知识，还未了解其功能和生物学意义的基因。“孤儿基因”在Gene中没有同源蛋白，不属于任何基因家族和基因超家族。在酵母、人类、小鼠中发现部分孤儿基因是物种必需基因，在调节物种的生命活动中起到了重要的作用，并且很多孤儿基因行使特殊的生理功能。我们在水稻根的cDNA文库中发现了一个新基因(LOC_Os09g30350)，该基因cDNA全长1722bp,编码573个氨基酸。在InterPro和PROSITE数据库中对其蛋白序列进行分析，鉴定不到已知的功能结构域，也不属于任何一个基因家族或超基因家族，为一典型的孤儿基因，我们将其命名为OsCPY，并对其进行了逆境胁迫(低温)下的表达分析。
鉴于基因遗传的复杂性，目前，水稻孤儿基因OsCPY及其编码蛋白及其基因的作用还有待进一步开发。
发明内容
基于此，本发明的目的之一是提供水稻孤儿基因Oscpy及其编码蛋白的新应用。
实现上述目的技术方案如下。
水稻孤儿基因Oscpy和/或其编码蛋白在促进水淹条件下农作物种子的萌发中的应用。
水稻孤儿基因Oscpy和/或其编码蛋白在高效率直播农作物育种中的应用。
水稻孤儿基因Oscpy和/或其编码蛋白在促进农作物幼苗的快速生长中的应用。
水稻孤儿基因Oscpy和/或其编码蛋白在提高农作物幼苗的快速生长的育种中的应用。
在其中一些实施例中，在促进正常条件下农作物幼苗的快速生长。
在其中一个实施例中，所述Oscpy基因的cDNA阅读框为如SEQ ID NO.2所示，或为与SEQ ID NO.2互补配对的核苷酸序列，或为编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的序列；或为上述序列且具有一个多个核苷酸突变，但生物活性不变的核苷酸序列。进一步地，所述生物活性为Oscpy表达量下调时，稻米的垩白度和/或垩白粒率降低。
在其中一个实施例中，所述农作物是粮食作物，更优选的是，所述粮食作物是谷类作物，最优选地，所述谷类作物是水稻。
一种促进农作物幼苗的快速生长的方法，包括调控Oscpy基因表达下调。
在其中一些实施例中，包括构建Oscpy基因RNAi干扰载体；将Oscpy基因RNAi干扰载体转化至水稻内后，调控Oscpy基因的表达下调。
在其中一些实施例中，Oscpy基因RNAi干扰载体构建包括：以水稻的幼苗为材料，提取RNA，并将RNA逆转录成cDNA，利用引物序列(优选为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4CPY-SIF22：5’-CGCGGATCCTCCATCGTGGAGCCGGAGAA-3’；CPY-SIR22：5’–GCCTAAGCTTCCCTGTAGAAACCTCCTGCTCCAG-3’)，扩增出包含Oscpy的正向干涉片段(SEQ ID NO.5)，通过酶切与干涉载体pYL进行连接，构建中间载体PYL-Oscpy，利用引物序列(优选为SEQ NO.6和SEQ NO.7)对PYL-Oscpy进行PCR扩增，获得反向干涉片段(SEQ NO.8)，通过酶切，连接将反向干涉片段与PYL-Oscpy连接后，转化DH5a感受态细胞，挑选阳性菌落，提取质粒后，利用测序引物(优选为SEQ NO.9和SEQ NO.10)进行PCR扩增，扩增产物经测序验证后获得干扰载体pYL-RNNAiOscpy。
在其中一些实施例中，将干涉载体pYL-RNAi Oscpy,利用农杆菌介导的方法转化水稻愈伤组织，再培育成转基因植株，优选为利用荧光定量PCR方法检测Oscpy基因表达下调，获得Oscpy基因表达量下了RNAi干扰植株和T-DNA插入植株。
本发明的另一目的是公开Oscpy基因RNAi干扰载体，将上述载体转化至农作物(水稻)内后，调控Oscpy基因的表达。
一种Oscpy基因RNAi干扰载体，将包含如SEQ ID NO.5所示的Oscpy的正向干涉片段和包含如SEQ ID NO.8所示的反向干涉片段连接到载体上制备而成。
本发明提供了水稻孤儿基因Oscpy及其编码蛋白的新应用。发明人在进一步对该基因的功能研究表明，Oscpy表达下调时，可促进水淹条件下水稻种子的萌发，以及正常条件下水稻幼苗的快速生长。利用该基因的功能特点，可以创建高效率直播的水稻材料，该基因在水稻育种上有巨大的应用潜力。发明人还发现，Oscpy表达下调水稻幼苗的快速生长，可提高水稻直播效率和育秧，也有利于提高长江流域地区遇到“倒春寒”的育秧效率。
附图说明
图1干涉载体pYL质粒图谱。
图2干涉载体pYL-RNNAi Oscpy构建成功，M，Maker；1，质粒抽提结果；2，质粒BamHI单酶切结果。
图3 Oscpy在RNAi干扰植株中表达量检测。
图4水淹条件下野生型及转基因株胚芽鞘的生长的观察。
图5正常条件下野生型及转基因株苗期生长的观察。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明公开了Oscpy表达量表达下调的转基因水稻植株(包括RNAi干扰植株和T-DNA插入植株)，与野生型对照相比，Oscpy表达量表达下调的转基因植株的在水淹条件下，转基因植株种子萌发速率更高，幼苗期的生长加速。
对水淹条件下的Oscpy表达量下调的转基因植株的种子的萌发率及生长进行了检测，发现与野生型相比，Oscpy表达量下调的转基因植株的种子的萌发率及生长显著提高。
对正常温度下，Oscpy表达量下调的转基因植株和野生型的植株的生长进行观察和检测，发现，Oscpy表达量下调的转基因植株均显著高于野生型植株。
Oscpy表达下调还可促进水淹条件下水稻种子的萌发，正常条件下水稻幼苗的快速生长。该基因可应用于水稻品质育种，可提高水稻直播效率和应用水稻的育秧。
以下用到的培养基包括：
YEB液体培养基:10.0g/L胰蛋白胨；1.0g/L酵母提取物；5.0g/L蔗糖，1.03g/LMgSO4·7H2O；8.0g/L琼脂(固体培养基)pH7.0-7.4农杆菌悬浮培养基:1/2N6大量元素和微量元素，N6铁盐和复合维生素，3.0mg/L 2,4-D；0.6g/L水解酪蛋白；20g/L蔗糖；10g/L葡萄糖；100μmol/L乙酰丁酰酮(AS)，pH5.2。
共培养基:1/2N6大量元素和微量元素、铁盐及复合维生素；3.0mg/L 2,4-D；0.8g/L水解酪蛋白；2％的蔗糖；0.8％琼脂；pH 5.6，另外，灭菌后冷却至50℃左右，按照每升培养基加入20mL 50％的葡萄糖(预先115度灭菌30min)和乙酰丁酰酮AS(100mmol/L)1mL。
筛选培养基:N6大量元素和微量元素、铁盐及维生素；2.0mg/L 2,4-D；0.6g/L水解酪蛋白；3％的蔗糖；0.8％琼脂；pH 5.9，灭菌后冷却至50℃左右，每升培养基加潮霉素(50mg/mL)；头孢噻肟钠(250mg/mL)和羧苄青霉素(250mg/mL)各1mL。
分化培养基:MS大量元素和微量元素；MS铁盐和复合维生素；3.5mg/L 6-BA；1mg/LKT；0.4mg/L NAA；0.60g/L水解酪蛋白；15.0g/L山梨醇；30.0g/L蔗糖；3.0g/L Phytagel，pH6.0。灭菌后冷却至50℃左右，每升培养基加潮霉素(50mg/mL)；头孢噻肟钠(250mg/mL)和羧苄青霉素(250mg/mL)各1mL。生根培养基:1/2MS大量元素和微量元素；MS铁盐和复合维生素；20g/L蔗糖；3.0g/L Phytagel；pH5.9，灭菌后冷却至50℃左右，每升培养基加潮霉素(50mg/mL)1mL。
SEQ ID NO.1
>LOC_Os09g30350.1
MDSGGNSVNSAVESVAESPAPASPASNPTAPAAVTKGRGLRRWRRIPREHHEEGSPGSGGGGGGGGSVAAAAADEDLAQLHKRRHPLGADAPKGKEEAAAAAAAAAVEEVGSESPVASVESSFAPQEAPPSPPVQTKLDPDLGFLIASAGFSVGAGGADSDNSDDRASKSSTNAAAPRHDFSFGGGFGRERDRPRSRAPGAAAHAKGIRTARTRGAHGARAATPTPSIVEPENSRSSVESNLRSSAAAHARQSSAGISSNGVHKVLYDDDDDDDDDAEQSDGEPPSEEAARSGAGGFYRENGSVVGRLVKGSSDSDADDHGYDERSIGKGENGEIHSGLDPYVQSIAMLRSAEEAIENEIQKFIEMRNETCENSANNHSETEWSSSCHFDESTEELSEKLKLLESRLNEASTLINDKDSEILELDVLNHKQPKQHVLCNTELLSLQSDMDQLFLEKMEAETQCFILTRASQAWNPLTEDQAAIFDIQKSLPEDHKQLEAKLRHTENRALMLEEMVEKLEAQCKDLARTSEILKLQARASRASLFCSVQFVLLFIAVGTFLVRLWPSSSEFVPT*
SEQ ID NO.2
>LOC_Os09g30350.1
ATGGATTCCGGCGGCAACAGCGTGAATTCTGCGGTGGAGTCGGTGGCGGAGTCGCCGGCGCCGGCTTCACCGGCGAGCAATCCCACCGCACCCGCCGCGGTCACCAAGGGGCGTGGGCTACGGCGGTGGCGGCGTATCCCCCGGGAACACCACGAGGAGGGCTCACCTGGCTCCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCAGCGTTGCGGCCGCTGCCGCGGATGAGGACTTGGCGCAGCTTCACAAGCGCCGGCACCCTCTCGGCGCCGACGCGCCTAAGGGGAAGGAGGAGGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCTGCCGTGGAGGAGGTGGGGAGCGAGAGCCCCGTCGCCTCCGTGGAGTCCAGCTTCGCGCCGCAGGAGGCGCCACCGTCGCCGCCGGTCCAGACCAAGCTGGACCCGGATCTCGGCTTCCTGATCGCCTCGGCGGGGTTCTCGGTGGGCGCCGGCGGCGCCGACTCGGACAACAGCGACGACCGGGCCAGCAAGTCCTCCACCAACGCCGCCGCGCCGCGCCACGACTTCTCGTTCGGCGGCGGCTTCGGCCGCGAGCGCGACAGGCCGCGATCCCGCGCCCCAGGCGCCGCCGCGCACGCCAAGGGCATCCGCACGGCGCGCACGCGCGGAGCCCACGGCGCGCGCGCCGCCACACCGACCCCCTCCATCGTGGAGCCGGAGAACTCGCGCTCCAGCGTTGAATCCAACCTCCGGAGCTCTGCCGCTGCTCATGCGCGCCAATCCAGTGCTGGCATAAGCAGCAATGGCGTTCACAAGGTTCTCTATGATGATGATGACGATGATGATGATGATGCCGAGCAGAGTGACGGCGAGCCTCCGAGCGAGGAGGCGGCGCGCTCTGGAGCAGGAGGTTTCTACAGGGAGAATGGAAGTGTAGTAGGGAGATTGGTAAAGGGCAGCAGTGATTCCGATGCCGATGATCATGGATACGATGAGAGGAGTATAGGCAAGGGTGAGAATGGGGAAATTCATTCGGGTCTCGATCCGTATGTGCAGTCGATCGCGATGCTCCGGTCAGCCGAAGAAGCAATTGAGAATGAGATCCAGAAGTTTATTGAAATGAGAAATGAAACGTGTGAAAATTCTGCAAACAACCACAGTGAAACTGAATGGAGTAGTTCATGCCATTTTGACGAATCCACAGAAGAACTGAGTGAGAAGTTGAAGCTTCTCGAGTCTAGGCTAAACGAAGCTTCTACCCTCATCAATGATAAGGATTCAGAAATACTTGAACTCGATGTGCTCAACCACAAACAACCAAAGCAGCATGTTCTATGCAATACCGAGCTGCTGTCTCTGCAATCTGATATGGATCAACTGTTCCTGGAGAAGATGGAAGCAGAGACTCAATGCTTCATCCTGACAAGAGCATCGCAAGCTTGGAATCCCCTGACTGAGGATCAAGCTGCTATTTTTGACATTCAGAAATCTCTACCTGAGGATCACAAACAGCTTGAAGCTAAGCTACGGCACACCGAGAACAGGGCACTGATGCTAGAGGAGATGGTGGAGAAGCTAGAGGCACAGTGCAAAGATCTTGCTAGGACTTCAGAAATCCTGAAGCTGCAGGCAAGAGCAAGCAGAGCTTCGCTGTTTTGCTCCGTCCAGTTTGTTCTGCTGTTCATCGCCGTCGGAACCTTCCTCGTCCGGCTATGGCCCTCTTCCTCTGAATTTGTACCTACCTGA
SEQ ID NO.3 Oscpy的正向干涉片段上游引物序列
CPY-SIF22：5’-CGCGGATCCTCCATCGTGGAGCCGGAGAA-3’；
SEQ ID NO.4 Oscpy的正向干涉片段下游引物序列
CPY-SIR22:5’–GCCTAAGCTTCCCTGTAGAAACCTCCTGCTCCAG-3’
SEQ ID NO.5 Oscpy的正向干涉片段序列
CCTCCATCGTGGAGCCGGAGAACTCGCGCTCCAGCGTTGAATCCAACCTCCGGAGCTCTGCCGCTGCTCATGCGCGCCAATCCAGTGCTGGCATAAGCAGCAATGGCGTTCACAAGGTTCTCTATGATGATGATGACGATGATGATGATGATGCCGAGCAGAGTGACGGCGAGCCTCCGAGCGAGGAGGCGGCGCGCTCTGGAGCAGGAGGTTTCTACAGGGA。
SEQ ID NO.6:Oscpy的反向干涉片段上游引物序列
RNAi-M：5’—CACCCTGACGCGTGGTGTTACTTCTGAAGAGG—3’
SEQ ID NO.7 Oscpy的反向干涉片段下游引物序列
RNAi-P：5’—ACTAGAACTGCAGCCTCAGATCTACATGGTGG—3
SEQ ID NO.8 Oscpy的反向干涉片段序列
TCCCTGTAGAAACCTCCTGCTCCAGAGCGCGCCGCCTCCTCGCTCGGAGGCTCGCCGTCACTCTGCTCGGCATCATCATCATCATCGTCATCATCATCATAGAGAACCTTGTGAACGCCATTGCTGCTTATGCCAGCACTGGATTGGCGCGCATGAGCAGCGGCAGAGCTCCGGAGGTTGGATTCAACGCTGGAGCGCGAGTTCTCCGGCTCCACGATGGAGG
SEQ ID NO.9测序引物上游序列
5’-CTGAACTCACCGCGACGTCTGTC-3’；
SEQ ID NO.10:测序引物下游序列
5’-TAGCGCGTCTGCT GCTCCATACA-3’
SEQ ID NO.11:Oscpy基因定量特异引物上游序列
5’-AGGGCACTGATGCTAGAGGA-3’；
SEQ ID NO.12:Oscpy基因定量特异引物下游序列
5’-CTCATTGGCGCCGGATTTTC-3’，
SEQ ID NO.13:内参基因OsActin上游序列
5’-ACCTTCAACACCCCTGCTAT-3’
SEQ ID NO.14：内参基因OsActin下游序列
5’-CACCATCACCAGAGTCCAAC-3’。
以下通过具体实施例对本发明做进一步的阐述，但不用于限制本发明的保护范围。
实施例1:RNA干涉载体的构建和遗传转化
(1)正向干涉片段的获得：提取中花11号幼穗总RNA，反转成cDNA，根据Oscpy基因序列，利用设计引物对3：SEQ ID NO.3CPY-SIF22：5’-CGCGGATCCTCCATCGTGGAGCCGGAGAA-3’(下划线为BamHI酶切位点)和SEQ ID NO.4CPY-SIR22：5’–GCCTAAGCTTCCCTGTAGAAACCTCCTGCTCCAG-3’(下划线为HindIII酶切位点)。采用RT-PCR扩增出Oscpy的正向干涉片段(SEQID NO.5)，经测序验证后用于干涉载体构建。
(2)RNA干涉载体构建:正向干涉片段(SEQ ID NO.5)和pYL载体(见图1)均经过BamH I和Hind III两种酶进行双酶切、纯化、回收后，再用T4 DNA酶进行连接反应，连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，挑选阳性单菌落，经摇菌后提取质粒获得中间干涉载体PYL-Oscpy，采用引物对二:SEQ ID NO.6:RNAi-M：5’—CACCCTGACGCGTGGTGTTACTTCTGA AGAGG—3’SEQ ID NO.7RNAi-P：5’—ACTAGAACTGCAGCCTCAGATCTACATGGTGG—3对PYL-Oscpy进行PCR扩增，PCR扩增体系和条件为：10XbufferI 2.5ul,10mMdNTP 0.5ul,RNAi-M 0.5ul,RNAi-P 0.5ul,cDNA 1ul,HIFI taq 0.5ul,ddH2O 19.5ul。94℃，5min,94℃,30sec,60℃30sec,72℃,30sec,30cycles；72℃,7min。
获得反向干涉片段，随后再用Mlu I和Pst I酶对反向干涉片段和PYL-Oscpy进行双酶切，经纯化回收后，再用T4 DNA连接酶进行连接后，转化DH5a感受态细胞，挑选阳性单菌落，摇菌提取质粒获得干涉载体pYL-RNNAi Oscpy，对pYL-RNNAiOscpyp载体分别用BamHI进行单酶切和BamHI和HindIII进行双酶切验证成功后(见图2)
(3)将构建成功的RNAi干涉载体pYL-RNNAiOscpy转化根癌农杆菌EHA105中，通过农杆菌介导法转化水稻愈伤组织。
a.愈伤组织诱导和继代。
将水稻中花11号种子剥去颖壳后，放入灭菌100mL三角瓶中，先用30mL75％的酒精消毒1min，然后用0.1％升汞消毒6min，无菌水冲洗5次，灭菌处理的种子接于愈伤组织诱导培养基中，放入人工气候室中在26℃下暗培养一个月左右进行愈伤组织诱导。将从胚长出的淡黄色愈伤组织接种到继代培养基中进行扩大培养，培养条件为26℃，暗培养15-20天。
愈伤组织诱导培养基:N6大量元素和微量元素、铁盐及维生素；3.0mg/L 2,4-D；0.3g/L L-proline；0.6g/L水解酪蛋白；3％的蔗糖；0.3％phytagel；pH 5.9。
愈伤组织继代培养基:N6大量元素和微量元素、铁盐及维生素；2.0mg/L 2,4-D；0.5g/L L-proline；0.6g/L水解酪蛋白；3％的蔗糖；0.8％琼脂；pH 5.9。
b.预培养
将继代培养一次后大小为1-3mm的愈伤组织(淡黄色，致密，颗粒状)接种预培26℃暗培养4天。
预培养培养基:1/2N6大量元素和微量元素、铁盐及维生素3.0mg/L 2,4-D；1.2g/LL-proline；0.6g/L水解酪蛋白；2％的蔗糖；0.8％琼脂；pH 5.6，另外，灭菌后按照每升培养基加入20mL 50％的葡萄糖(预先115度灭菌30min)和乙酰丁酰酮AS(100mmol/L)1mL。
c.遗传转化
将携带Oscpy基因干涉载体pYL-RNNAi Oscpy的农杆菌EHA105接种到YEB液体培养基中(添加100mg/L卡那霉素霉素和25mg/L利福平)，28℃下摇床振荡培养48后，离心收集菌种，用含有100μmol/L乙酰丁香酮(AS)的农杆菌悬浮培养基重新悬浮农杆菌，使菌液的OD600为0.1，并用上述浓度的农杆菌菌液浸染经过预培养的愈伤组织，浸染时间30min，随后愈伤组织放在灭菌滤纸上吸去多余菌液，接入到共培养基(含100μmol/L的AS)中，在19℃暗环境下共培养3天，随后用无菌水快速清洗愈伤组织10次，最后用含有400mg/L的头孢霉素和250mg/L羧苄青霉素的无菌水浸泡愈伤10min，然后将愈伤放置于灭菌滤纸上晾干，再接种到筛选培养基中进行筛选培养，在26℃暗环境下培养一个月后，新长出的愈伤接种到分化培养基中进行分化，将分化出幼苗接种到生根培养基中进行培养，幼苗株高长至10cm左右时移栽到大田进行种植。
实施例2转基因阳性水稻植株检测和Oscpy表达下调植株获得
采用CTAB法提取转基因水稻叶片的DNA后，采用潮霉素磷酸转移酶基因特异性引物(SEQ ID NO.9:5’-CTGAACTCACCGCGACGTCTGTC-3’；SEQ ID NO.10:5’-TAGCGCGTCTGCTGCTCCATACA-3’)经PCR扩增为阳性的水稻，确定为T0代转基因阳性植株；采用荧光定量PCR方法，以Oscpy基因特异引物SEQ ID NO.11:5’-AGGGCACTGATGCTAGAGGA-3’；SEQ ID NO.12:5’-CTCATTGGCGCCGGATTTTC-3’，以水稻的OsActin作为内参基因，其引物序列为SEQ IDNO.13:5’-ACCTTCAACACCCCTGCTAT-3’和SEQ ID NO.14:5’-CACCATCACCAGAGTCC AAC-3’检测Oscpy下调表达，而获得Oscpy基因下调表达的RNAi水稻植株和T-DNA插入突变体植株，如图3所示，与野生型中花11相比，我们分别获得了Oscpy表达量显著下调的RNAi转基因株系12，14，36，48，74。
实施例3水淹条件下野生型及转基因株胚芽鞘的生长的观察
挑选成熟饱满的野生型中花11(ZH11)，突变体(cpy)，RNA干扰(RNAi)，材料各200粒，先用足量的蒸馏水湿润水稻种子，使种子表面能够亲水。将这些湿润的种子放入标记好实验日期和种子名称的玻璃瓶中，加入等体积、足量的蒸馏水，使种子处于完全淹水条件下萌发，放入白昼/黑夜12h、温度为白天32℃/黑夜28℃，相对湿度60％，3000Lx光强的培养箱中萌发培养，每隔8h更换一次水稻该条件下相同温度的蒸馏水，并清理玻璃瓶中的种子代谢物，免受代谢物毒害，影响种子正常生长(在更换蒸馏水时速度一定要快，减少种子的完全有氧呼吸)。每隔24h拍照和记录以上材料种子的胚芽鞘长度，实验周期为7天，重复三次。并利用Image J软件测量以上材料的胚芽鞘长度，用Prism 2.0软件对所测量的数据进行分析，并制作相应的表格，比较淹水条件下各种材料的萌发速度。结果表明，与野生型中花11相比，水淹条件下，突变体(cpy)和RNAi材料的胚芽鞘的长度明显增长(图4)，表明Oscpy表达下调能够促进水淹条件下胚芽鞘的生长。其中,图中的RNAi12-5是RNAi转基因株系12的自交结实纯合体。
实施例4正常条件下野生型及转基因株苗期生长的观察
挑选成熟饱满的野生型中花11(ZH11)，突变体(cpy)，RNA干扰(RNAi,株系12，14)，100粒种子放置垫两层滤纸的培养皿中，先加入过量的蒸馏水浸湿种子，使种子表面的微绒毛湿润，使种子表面能够亲水，将湿润的种子平铺在含滤纸的培养皿中，再加适量的蒸馏水，使种子面积一半沉在水中，一半与空气接触，有利于种子进行萌发。培养皿上做好标记，写好实验日期和种子名称，放置在白昼/黑夜各12h，温度为白天32℃/黑夜28℃，相对湿度为60％，3000Lx光强的培养箱中培养，每隔8h更换一次水稻该条件下相同温度的蒸馏水，清理培养皿中的种子代谢物，并更换滤纸，使得种子免受代谢物毒害。在所有种子开始露白时，从每皿中挑选20粒长势相似的种子，整齐平铺在2.0升的水培盒中，其中每个水培盒中必须有ZH11、cpy、RNAi，每隔24h拍照并记录材料生长情况，实验周期为7天，重复三次。并利用Image J软件测量以上材料的地上部分稻苗的株高和地下部分稻苗的根长，用Prism2.0软件对所测量的数据进行分析，并制作相应的表格，比较各材料在水培条件下的苗期生长速度。结果与野生型中花11相比，突变体(cpy)和RNAi材料在铺种后的第2天和第3天，无论是地上部分还是地下部分，均显著性增加(图5,表2，表3)，表明Oscpy表达下调能够促进正常条件水稻苗期的快速生长。
表2铺种2天后幼苗株高及根长统计
Figure BDA0002706747280000141
表3铺种3天后幼苗株高及根长统计
Figure BDA0002706747280000142
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
序列表
<110> 南昌大学
<120> 0scpy及其编码蛋白在水稻播种中的应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 573
<212> PRT
<213> Oscpy蛋白(Oscpy)
<400> 1
Met Asp Ser Gly Gly Asn Ser Val Asn Ser Ala Val Glu Ser Val Ala
1 5 10 15
Glu Ser Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ser Asn Pro Thr Ala Pro Ala
20 25 30
Ala Val Thr Lys Gly Arg Gly Leu Arg Arg Trp Arg Arg Ile Pro Arg
35 40 45
Glu His His Glu Glu Gly Ser Pro Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Val Ala Ala Ala Ala Ala Asp Glu Asp Leu Ala Gln Leu
65 70 75 80
His Lys Arg Arg His Pro Leu Gly Ala Asp Ala Pro Lys Gly Lys Glu
85 90 95
Glu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Glu Glu Val Gly Ser
100 105 110
Glu Ser Pro Val Ala Ser Val Glu Ser Ser Phe Ala Pro Gln Glu Ala
115 120 125
Pro Pro Ser Pro Pro Val Gln Thr Lys Leu Asp Pro Asp Leu Gly Phe
130 135 140
Leu Ile Ala Ser Ala Gly Phe Ser Val Gly Ala Gly Gly Ala Asp Ser
145 150 155 160
Asp Asn Ser Asp Asp Arg Ala Ser Lys Ser Ser Thr Asn Ala Ala Ala
165 170 175
Pro Arg His Asp Phe Ser Phe Gly Gly Gly Phe Gly Arg Glu Arg Asp
180 185 190
Arg Pro Arg Ser Arg Ala Pro Gly Ala Ala Ala His Ala Lys Gly Ile
195 200 205
Arg Thr Ala Arg Thr Arg Gly Ala His Gly Ala Arg Ala Ala Thr Pro
210 215 220
Thr Pro Ser Ile Val Glu Pro Glu Asn Ser Arg Ser Ser Val Glu Ser
225 230 235 240
Asn Leu Arg Ser Ser Ala Ala Ala His Ala Arg Gln Ser Ser Ala Gly
245 250 255
Ile Ser Ser Asn Gly Val His Lys Val Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Asp
260 265 270
Asp Asp Asp Asp Ala Glu Gln Ser Asp Gly Glu Pro Pro Ser Glu Glu
275 280 285
Ala Ala Arg Ser Gly Ala Gly Gly Phe Tyr Arg Glu Asn Gly Ser Val
290 295 300
Val Gly Arg Leu Val Lys Gly Ser Ser Asp Ser Asp Ala Asp Asp His
305 310 315 320
Gly Tyr Asp Glu Arg Ser Ile Gly Lys Gly Glu Asn Gly Glu Ile His
325 330 335
Ser Gly Leu Asp Pro Tyr Val Gln Ser Ile Ala Met Leu Arg Ser Ala
340 345 350
Glu Glu Ala Ile Glu Asn Glu Ile Gln Lys Phe Ile Glu Met Arg Asn
355 360 365
Glu Thr Cys Glu Asn Ser Ala Asn Asn His Ser Glu Thr Glu Trp Ser
370 375 380
Ser Ser Cys His Phe Asp Glu Ser Thr Glu Glu Leu Ser Glu Lys Leu
385 390 395 400
Lys Leu Leu Glu Ser Arg Leu Asn Glu Ala Ser Thr Leu Ile Asn Asp
405 410 415
Lys Asp Ser Glu Ile Leu Glu Leu Asp Val Leu Asn His Lys Gln Pro
420 425 430
Lys Gln His Val Leu Cys Asn Thr Glu Leu Leu Ser Leu Gln Ser Asp
435 440 445
Met Asp Gln Leu Phe Leu Glu Lys Met Glu Ala Glu Thr Gln Cys Phe
450 455 460
Ile Leu Thr Arg Ala Ser Gln Ala Trp Asn Pro Leu Thr Glu Asp Gln
465 470 475 480
Ala Ala Ile Phe Asp Ile Gln Lys Ser Leu Pro Glu Asp His Lys Gln
485 490 495
Leu Glu Ala Lys Leu Arg His Thr Glu Asn Arg Ala Leu Met Leu Glu
500 505 510
Glu Met Val Glu Lys Leu Glu Ala Gln Cys Lys Asp Leu Ala Arg Thr
515 520 525
Ser Glu Ile Leu Lys Leu Gln Ala Arg Ala Ser Arg Ala Ser Leu Phe
530 535 540
Cys Ser Val Gln Phe Val Leu Leu Phe Ile Ala Val Gly Thr Phe Leu
545 550 555 560
Val Arg Leu Trp Pro Ser Ser Ser Glu Phe Val Pro Thr
565 570
<210> 2
<211> 1722
<212> DNA
<213> Oscpy基因(Oscpy)
<400> 2
atggattccg gcggcaacag cgtgaattct gcggtggagt cggtggcgga gtcgccggcg 60
ccggcttcac cggcgagcaa tcccaccgca cccgccgcgg tcaccaaggg gcgtgggcta 120
cggcggtggc ggcgtatccc ccgggaacac cacgaggagg gctcacctgg ctccggcggc 180
ggcggcggcg gcggcggcag cgttgcggcc gctgccgcgg atgaggactt ggcgcagctt 240
cacaagcgcc ggcaccctct cggcgccgac gcgcctaagg ggaaggagga ggccgccgcc 300
gccgccgccg ccgctgccgt ggaggaggtg gggagcgaga gccccgtcgc ctccgtggag 360
tccagcttcg cgccgcagga ggcgccaccg tcgccgccgg tccagaccaa gctggacccg 420
gatctcggct tcctgatcgc ctcggcgggg ttctcggtgg gcgccggcgg cgccgactcg 480
gacaacagcg acgaccgggc cagcaagtcc tccaccaacg ccgccgcgcc gcgccacgac 540
ttctcgttcg gcggcggctt cggccgcgag cgcgacaggc cgcgatcccg cgccccaggc 600
gccgccgcgc acgccaaggg catccgcacg gcgcgcacgc gcggagccca cggcgcgcgc 660
gccgccacac cgaccccctc catcgtggag ccggagaact cgcgctccag cgttgaatcc 720
aacctccgga gctctgccgc tgctcatgcg cgccaatcca gtgctggcat aagcagcaat 780
ggcgttcaca aggttctcta tgatgatgat gacgatgatg atgatgatgc cgagcagagt 840
gacggcgagc ctccgagcga ggaggcggcg cgctctggag caggaggttt ctacagggag 900
aatggaagtg tagtagggag attggtaaag ggcagcagtg attccgatgc cgatgatcat 960
ggatacgatg agaggagtat aggcaagggt gagaatgggg aaattcattc gggtctcgat 1020
ccgtatgtgc agtcgatcgc gatgctccgg tcagccgaag aagcaattga gaatgagatc 1080
cagaagttta ttgaaatgag aaatgaaacg tgtgaaaatt ctgcaaacaa ccacagtgaa 1140
actgaatgga gtagttcatg ccattttgac gaatccacag aagaactgag tgagaagttg 1200
aagcttctcg agtctaggct aaacgaagct tctaccctca tcaatgataa ggattcagaa 1260
atacttgaac tcgatgtgct caaccacaaa caaccaaagc agcatgttct atgcaatacc 1320
gagctgctgt ctctgcaatc tgatatggat caactgttcc tggagaagat ggaagcagag 1380
actcaatgct tcatcctgac aagagcatcg caagcttgga atcccctgac tgaggatcaa 1440
gctgctattt ttgacattca gaaatctcta cctgaggatc acaaacagct tgaagctaag 1500
ctacggcaca ccgagaacag ggcactgatg ctagaggaga tggtggagaa gctagaggca 1560
cagtgcaaag atcttgctag gacttcagaa atcctgaagc tgcaggcaag agcaagcaga 1620
gcttcgctgt tttgctccgt ccagtttgtt ctgctgttca tcgccgtcgg aaccttcctc 1680
gtccggctat ggccctcttc ctctgaattt gtacctacct ga 1722
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgcggatcct ccatcgtgga gccggagaa 29
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcctaagctt ccctgtagaa acctcctgct ccag 34
<210> 5
<211> 223
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cctccatcgt ggagccggag aactcgcgct ccagcgttga atccaacctc cggagctctg 60
ccgctgctca tgcgcgccaa tccagtgctg gcataagcag caatggcgtt cacaaggttc 120
tctatgatga tgatgacgat gatgatgatg atgccgagca gagtgacggc gagcctccga 180
gcgaggaggc ggcgcgctct ggagcaggag gtttctacag gga 223
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caccctgacg cgtggtgtta cttctgaaga gg 32
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
actagaactg cagcctcaga tctacatggt gg 32
<210> 8
<211> 223
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tccctgtaga aacctcctgc tccagagcgc gccgcctcct cgctcggagg ctcgccgtca 60
ctctgctcgg catcatcatc atcatcgtca tcatcatcat agagaacctt gtgaacgcca 120
ttgctgctta tgccagcact ggattggcgc gcatgagcag cggcagagct ccggaggttg 180
gattcaacgc tggagcgcga gttctccggc tccacgatgg agg 223
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctgaactcac cgcgacgtct gtc 23
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tagcgcgtct gctgctccat aca 23
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
agggcactga tgctagagga 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ctcattggcg ccggattttc 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
accttcaaca cccctgctat 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
caccatcacc agagtccaac 20

Claims (8)

1.水稻孤儿基因Oscpy和/或其编码蛋白在促进水淹条件下水稻种子的萌发中的应用，所述Oscpy基因的cDNA阅读框为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或为编码如SEQ IDNO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。
2.水稻孤儿基因Oscpy和/或其编码蛋白在水稻直播育种中的应用，所述Oscpy基因的cDNA阅读框为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或为编码如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。
3.水稻孤儿基因Oscpy和/或其编码蛋白在促进水稻幼苗快速生长中的应用，所述Oscpy基因的cDNA阅读框为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或为编码如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。
4.水稻孤儿基因Oscpy和/或其编码蛋白在提高水稻幼苗快速生长的育种中的应用，所述Oscpy基因的cDNA阅读框为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或为编码如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述应用为在正常条件下促进水稻幼苗的快速生长。
6.一种促进水稻幼苗的快速生长的方法，其特征在于，包括调控水稻Oscpy基因表达下调，所述Oscpy基因的cDNA阅读框为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或为编码如SEQ IDNO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。
7.根据权利要求6所述的促进水稻幼苗的快速生长的方法，其特征在于，包括构建Oscpy基因RNAi干扰载体；将Oscpy基因RNAi干扰载体转化至水稻内后，调控Oscpy基因的表达。
8.根据权利要求7所述的促进水稻幼苗的快速生长的方法，其特征在于，所述Oscpy基因RNAi干扰载体构建包括：以水稻的幼苗为材料，提取RNA，并将RNA逆转录成cDNA，扩增出包括如SEQ ID NO.5所示序列的Oscpy的正向干涉片段，通过酶切与干涉载体进行连接，构建中间载体，利用引物序列对中间载体进行PCR扩增，获得包括如SEQ ID NO.8所示序列的反向干涉片段，通过酶切，将反向干涉片段与中间载体连接后，转化DH5a感受态细胞，挑选阳性菌落，提取质粒后，进行PCR扩增，获得Oscpy基因RNAi干扰载体；将Oscpy基因RNAi干扰载体,利用农杆菌介导的方法转化水稻愈伤组织，再培育成转基因植株。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20060035199A (ko) * 2004-10-21 2006-04-26 조영손 이랑파종과 물관리에 따른 무제초제 벼건답직파재배법
CN111303259A (zh) * 2019-12-27 2020-06-19 中国农业科学院生物技术研究所 水稻转录因子基因OsBEAR1在培育胚芽鞘增长或适于田间直播的水稻品种中的应用

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