WO2001001762A1

WO2001001762A1 - Production de riz resistant aux carences en fer

Info

Publication number: WO2001001762A1
Application number: PCT/JP2000/004425
Authority: WO
Inventors: Satoshi Mori; Hiromi Nakanishi; Michiko Takahashi; Naoko Nishizawa
Original assignee: Japan Science And Technology Corporation
Priority date: 1999-07-05
Filing date: 2000-07-04
Publication date: 2001-01-11
Also published as: EP1197139B1; CN1360466A; EP1197139A1; JP4084502B2; EP1197139A4; AU5572800A; US7259292B1; KR20020009604A; AU772529C; AU772529B2; KR100454083B1; CN1298853C; JP2001017012A

Description

明細書鉄欠乏耐性ィネの創製技術分野

本発明は、鉄欠乏耐性を有するイネ科植物を製造する方法、その方法により得られたイネ科植物並びに当該イネ科植物を育成する方法及びその方法で得られた作物に関する。

より詳細には、本発明は、イネ科植物にムギネ酸類生合成経路中の酵素をコードする遺伝子、好ましくは当該酵素がニコチアナミン · アミノ基転移酵素である遺伝子を導入して鉄欠乏耐性を有するイネ科植物の創製に関する。背景技術

地球上の 9 0 %近くの土壌は、何らかの問題を抱える不良土壌であると言われている。不良土壌では一般的に、植物の生育に必須な元素を質的または量的に欠いているために植物の生育が阻害されたり、あるいは重金属等を多く含む土壌による生育障害などが起こる。不良土壌の代表として、乾燥地塩類集積土壌がある。これは、人為的な過剰灌漑や、長年にわたる乾燥気候により、土壌上層に N a C 1や N a ₂ C O ₃が集積したものと、 C a C Osや C a S 0₄が集積したものとがある。ナトリウムの集積した土壌では、塩類濃度障害を引き起こし、石灰質の土壌では、鉄欠乏障害を引き起こす。

地球上の耕地土壌の約 3 0 %は、潜在的な鉄欠乏地帯と言われている（Wallenc e et al. 1960)。半乾燥地域の石灰質土壌では、毛管現象により母材から溶出した石灰質成分が地表に集積する。このような土壌では、 p Hが上昇しアルカリ性を示すため土壌中の鉄が F e (OH) の形で存在し、溶解度が極めて低くなる。このような土壌に生育した植物は、可溶性の鉄が少ないことにより、鉄欠乏クロロシスとなり、生育が阻害されるか、または枯死する。

高等植物の鉄獲得機構は、ストラテジー I (Strategy- 1) とストラテジー I I (Strategy- II) という 2つに区分される。ストラテジ一 I は、イネ科を除く高等植物の鉄獲得機構である。土壌中の三価の不溶態鉄を根の細胞表面に存在する三価鉄還元酵素により還元し、二価鉄のトランスポーターで吸収する機構である。この機構を有する植物の中には、根圏にプロトンを放出し、根圏の pHを下げることで三価鉄還元酵素の活性を増加させる機構を有しているものや、フエノール系化合物を根圏に放出し、形成された F e ( I I I ) 一フエノール系化合物キレ一卜が細胞膜表面に存在する三価鉄還元酵素に F e ( I I I ) を供給する機構を持っているものが存在する。最近の研究で、シロイヌナズナの根に特異的に発現する二価鉄のトランスポー夕一 I RT l (Eide et al. 1996)や、シロイヌナズナの三価鉄還元酵素の遺伝子が単離された（Robinson et al. 1997)。

ストラテジー I I は、単子葉植物の中のイネ科植物にのみ見られる鉄獲得機構である。イネ科植物は鉄欠乏条件下で、三価鉄キレート活性を有するムギネ酸類を根圏に放出し、「F e ( I I I ) 一ムギネ酸」錯体として根から鉄を吸収する (Takagi et al. 1984 )。ムギネ酸類（MA s ) は、ムギネ酸（MA) 、 2 ' —デォキシムギネ酸（DMA) 、 3—ヒドロキシムギネ酸（HMA) 、 3—ェピヒド口キシムギネ酸（ e p i HMA) 、アベニン酸（AVA) 、ディステイコン酸、ェピヒドロキシデォキシムギネ酸（ e p i HDMA) の 7つが知られており、ムギネ酸類（MA s ) は全て第 1図に示すようにメチォニンを前駆体として合成される（Shojima et al. 1990， Ma et al. l 998)。

ムギネ酸の分泌には概日リズムが存在し（Takagi et al. 1984)、日の出後にその分泌量が最大となり、夜には分泌されなくなる。また、鉄欠乏のォォムギ根で分泌前に膨らんでいた顆粒が、分泌後にしぼむ現象が観察され（Nishizawa et al.

1987)、この顆粒内でムギネ酸が合成されていると考えられている。これらのことから、イネ科植物の鉄欠乏応答は、ムギネ酸合成のみならず、鉄欠乏シグナルの伝達、根の形態変化など複雑な制御系により成立していることが示唆される。ムギネ酸合成経路に関わる酵素として、ニコチアナミン合成酵素の遺伝子が単離され、鉄欠乏により誘導されていることが報告された（Higuchi et al. 1999)。また、ニコチアナミンァミノ基転移酵素（NAAT) の遺伝子が単離され、鉄欠乏により誘導されていた（Takahashi et al. 1997)。

また、鉄欠乏ォォムギ根、コントロールのォォムギ根から抽出した mRNAを用いたディファレンシャルスクリーニングにより、鉄欠乏条件下で特異的に誘導される遺伝子 / d s l 、 I d s 2 , / d s 3が単離された。 / d s 1 は、メタ口チォネイン様タンパク質をコードする遺伝子である（Okumura et al. 1991)。 I d s 2は、その遺伝子配列から予測されるアミノ酸配列が、水酸化酵素に相同性をもつ遺伝子であり（Okumura et al. 1994)、 J d s 3 もまた、その遺伝子配列から予測されるアミノ酸配列が、水酸化酵素に相同性をもつ遺伝子であった（Nakanis hi et al. 1993)。ェピヒドロキシムギネ酸合成経路には、水酸化反応が 2力所存在し、この遺伝子がこの反応を触媒する酵素をコ一ドしているものと考えられている。

また、ォォムギ根において鉄欠乏により誘導されるタンパク質として、 I D S 3タンパク質、アデニンリボースリン酸転移酵素（板井， 1999)、ギ酸脱水素酵素 (Suzuki et al. 1998)、そして 3 6 k D aタンパク質（入船， 1991)などが挙げられる。イネ科植物は、鉄欠乏条件で、ムギネ酸を生合成するが、このとき根に含まれるメチォニンが減少するためにメチォニンサイクルでメチォニンを合成すると共に、生じたアデニンを AM Pに変換するためにアデニンリボースリン酸転移酵素が誘導されていると考えられている（板井， 1999)。

ギ酸脱水素酵素は、メチォニンサイクルで生じたギ酸を分解する。また鉄欠乏のイネの根では、ミトコンドリァの形態変化と電子伝達系のエネルギーチャージの減少（Mori et al. 1991)が報告されており、ギ酸脱水素酵素は、鉄欠乏により生じた嫌気条件により誘導され、エネルギー源としての NADHの供給をしているものと考えられている。

一方、人口の増加に伴って食糧の増産が今後の人類の生存の条件として大きな問題となってきている。イネは人類の古来からの重要な食糧のひとつであるが、鉄欠乏地帯でのイネの生育は難しいのが現状である。鉄欠乏地帯でィネの生育が可能となれば食糧の増産も可能となり、食糧増産の問題の解決策のひとつとして注目されている。発明の開示

本発明は、鉄欠乏地帯での生育が可能な鉄欠乏耐性を有するイネ科植物を提供することを目的としている。

より詳細には、本発明は、イネ科植物のムギネ酸類の生合成経路上の酵素の遺伝子をイネ科植物に導入することにより、石灰質アルカリ土壌などでも旺盛に生育する鉄欠乏耐性を有するイネ科植物を提供することを目的としている。本発明は、イネ科植物にムギネ酸類生合成経路中の酵素をコードする遺伝子を導入して、鉄吸収性が改善されたイネ科植物を製造する方法、より詳細には、当該酵素がニコチアナミンァミノ基転移酵素（NAAT) であり、それをコードする遺伝子 n a a ίを導入する鉄吸収性が改善されたイネ科植物を製造する方法に関する。

また、本発明は前記した方法により製造され得るイネ科植物に関する。より詳細には本発明は、イネ科植物にムギネ酸類生合成経路中の酵素をコードする遺伝子を導入してなる鉄吸収性が改善されたイネ科植物、さらに詳細には、当該酵素がニコチアナミンァミノ基転移酵素（ΝΑΑΤ) であり、それをコードする遺伝子 a a ίが導入されてなる鉄吸収性が改善されたイネ科植物に関する。

さらに、本発明は、前記鉄吸収性が改善されたイネ科植物を育成する方法及び当該育成により得られる作物に関する。図面の簡単な説明

第 1図は、鉄欠乏ォォムギ根のムギネ酸類生合成経路と根圏環境を図示したものである。

第 2図は、 n a a ί — Aの c DNAを挿入したイネ科形質転換用のバイナリ一ベクター p I G 1 2 l Hmの遺伝子の配列を示したものである。

第 3図は、導入された遺伝子の検出をサザンハイプリダイゼ一ション法により行った結果を示す図面に代わる写真である。第 3図の WTは野生種のイネの場合を示し、コントロールはべク夕一のみを導入した対照のイネの場合を示し、 1一 5、 1— 6、 1 — 7、 8— 1及び 1 5— 2は 3 5 Sプロモー夕一を有する形質転換体を示す。

第 4図は、鉄存在（+ F e ) 及び鉄欠乏（一 F e ) の水耕液で栽培した根における N A A Tの活性を測定した結果を示すものである。第 4図の白抜き部分は + F eの場合を示し、斜線部分は一 F eの場合を示す。 W Tは野生種のものを示し、 1 一 5、 1 — 6及び 1 — 7 は形質転換体のものを示す。

第 5図は、アルカリ土壌に移植後 8週目の各イネの生育状況を示す図面に代わる写真である。第 5図のコントロール（control) は、ベクタ一のみを移植した対照のイネを示し、その右側のイネは形質転換したものである。

第 6図は、アルカリ土壌移植後の各ィネの草丈の変化をグラフにして示したものである。黒丸印は形質転換体 1 5 — 2 を示し、黒四角印は形質転換体 8 — 1 を示し、白丸印はコントロールとして用いたベクターのみを移植した対照のイネを示す。

第 7図は、単離されたゲノム _n a a ίを含むファージ D NAのひとつの制限酵素地図を示すものである。第 7図中の 5は£じ 0尺 1 を、 Hは iJ i' d l I I を、 Bは B amH I を、 Nは JVo t I をそれぞれ示す。両端の W o t I サイトは A F I X I I のアームにある N o t I である。

第 8図は、 NAATゲノム断片を挿入したイネ科形質転換用のバイナリーべク夕一 p B I G R Z 1 の遺伝子の配列を示したものである。第 8図の N P T I I はカナマイシン耐性遺伝子を、 H P Tはハイグロマイシン耐性遺伝子を、 GU Sはイントロン入り /3 ダルクロニダーゼ遺伝子を、 L a c Zは /3ガラクトシダ一ゼ遺伝子を、 3 5 Pは 3 5 Sプロモータ一を、 N Pは NO Sプロモータ一を、 N Tは NO S夕一ミネ一ターを、 MC Sはマルチクローニングサイトを、 R i o r i は R i プラスミド複製起点をそれぞれ示している。

第 9図は、得られたゲノム n a a ίの塩基配列を示した図である。

第 1 0図は、得られたゲノム / a a tの塩基配列と c D NAと比較して決定した n a a 2: — Aと n a a t — βの 5 ' 上流、ェキソン、イントロン、 3 ' 下流を示した図である。第 1 0図において大文字が c D NAに転写されていたェキソン部分を示し、小文字がそれ以外の部分を示している。

第 1 1図は、得られたゲノム断片の模式図を示す。第 1 1図中の Eは£ c o R I を、 Hは H i n d i I I を、 Bは B a mH I を示す。

第 1 2図は、 n 3 a A及び n a a ί — Bの c D NAにおけるイントロンの挿入位置とイントロンのサイズを示したものである。

第 1 3図は、 c D N Aから予想される N A A T— Aのアミノ酸配列をアミノ酸の 1文字表記で示したものである。

第 1 4図は、 c D N Aから予想される N AA T— Bのアミノ酸配列をアミノ酸の 1文字表記で示したものである。

第 1 5図は、ゲノム n a a tを導入したイネのアル力リ土壌に移植後 1 0週間目の生育の状況を示した図面に代わる写真である。第 1 5図のコントロールは、ベクターのみを移植した対照のイネを示す。右側のィネはゲノム n & & tで形質転換したものである。

第 1 6図は、ゲノム ίΐ a a ίを導入したイネのアルカリ土壌移植後の草丈の変化をグラフにして示したものである。第 1 6図の左側はゲノム / a a ίで形質転換したイネであり、右側はベクターのみを移植した対照のイネである。発明を実施するための最良の形態

単子葉植物の中のイネ科植物にのみ見られる鉄獲得機構である前記したストラテジー I I は、ムギネ酸類を生合成し、これを放出することにより鉄を獲得する方法であることから、ムギネ酸類の生合成経路（第 1 図参照）における酵素の強化方法について検討した。

本発明者らは、ムギネ酸合成経路上の酵素としてニコチアナミンァミノ基転移酵素（N AA T) にまず着目し、その遺伝子 n a a ί を導入してみたところ、驚くべきことに、遺伝子が導入されたイネは石灰質アル力リ土壌でも旺盛に生育することを見出した。

ニコチアナミンァミノ基転移酵素（N AA T) の遺伝子 n a a Aの c D N Aを、 p I G 1 2 l Hmに X b a I 及び c I 部位を使って組み込んで、第 2 図に示すバイナリ一ベクターを作成した。得られたベクターをァグロバクテリウムに導入し形質転換に用いた。

イネの形質転換はヒエイら（Hieiら（ 1994) ) の方法に従い、材料に「ッキノヒカリ」を用い、胚盤から誘導したカルスを前記した形質転換したァグロバクテリウム懸濁液に浸し感染させて、再生体（T 1植物）を得、この種子から最終的に 34系統の形質転換ィネを得た。

導入された遺伝子の検出をサザンハイプリダイゼーション法により行った。結果を第 3図に示す。第 3図の WTは野生種のイネの場合を示し、 c o n t r o 1 はべク夕一のみを導入した対照のイネの場合を示し、 1 — 5、 1 — 6、 1一 7、 8— 1及び 1 5— 2は 3 5 Sプロモータ一を有する形質転換体を示す。第 3図に示されるように形質転換体はいずれも n a a t — Aを過剰発現していることがわかる。また、 3 5 S形質転換イネのうち、 8— 1、 1 5— 2には少なくともそれぞれ 5コピー、 2コピーの /7 a a ίが導入されたことが分かった。

遺伝子 n a a ίを導入することにより、野生種やべクタ一のみを導入したものに比べてニコチアナミンァミノ基転移酵素（ΝΑΑΤ) が過剰に発現され、その結果としてムギネ酸合成経路が活性化され、鉄の取り込みに必要とされるムギネ酸類が多量に産生されていることが推察される。

そこで、まずこれらの種の ΝΑΑΤ活性を検討した。発芽後 3週間の幼植物 (Τ 2 ) を鉄存在（+ F e ) 及び鉄欠乏（一 F e ) の水耕液でそれぞれ 2週間栽培し、それぞれの根における NAATの活性を測定した結果を第 4図に示す。第 4図の白抜き部分は + F eの場合を示し、斜線部分は一 F eの場合を示す。 WT は野生種のものを示し、 1 — 5、 1 一 6及び 1— 7は形質転換体のものを示す。この結果、 + F e、一 F eのいずれにおいても形質転換していない野生種（W T) よりも形質転換したもののほうが比活性が高く、 — F eの時さらに比活性が高くなることがわかった。このことは遺伝子の導入により、 NAATの活性が高くなることを示しているのみならず、形質転換体は鉄欠乏状態又は鉄の不溶態化した状態において NAAT活性が非常に亢進されることを示している。即ち、鉄欠乏状態又は鉄の不溶態化した状態において強い耐性を有する種となっていることが推察された。

以上のことにより、遺伝子 n 3 a ίを導入することにより NAAT活性が亢進されることがわかったが、これらの形質転換体が実際の鉄欠乏土壌で生育できるかどうかを検討した。 3 5 S— n a a t — A形質転換イネを鉄の不溶態化したァルカリ土壌に移植すると、移植後 2週間目までは葉が黄化してくるが、その後の 4〜 5週間目に新葉が濃い緑になり回復し始めた。第 5図のアルカリ土壌に移植後 8週目の生育状況の写真を挙げる。第 5図のコントロール（c on t ro l ) は、べクターのみを移植した対照のイネを示し、その右側のイネは形質転換したものである。コントロールのものに比べて形質転換体のものの発育が格段に優れていることがわかる。また、アルカリ土壌移植後の草丈の変化を第 6図に示す。第 6図のグラフの縦軸は草丈（ c m ) であり、横軸はアルカリ土壌移植後の日数（日）を示す。黒丸印は形質転換体 1 5— 2を示し、黒四角印は形質転換体 8— 1 を示し、白丸印はコントロールとして用いたベクタ一のみを移植した対照のイネを示す。前述したように、 3 5 S形質転換ィネ 8 — 1 には少なくとも 5 コピーの _n a a t遺伝子が、また、 3 5 S形質転換ィネ 1 5 _ 2 には少なくとも 2 コピーの a ί遺伝子が導入されており、第 6図の草丈からみれば遺伝子のコピー数には余り関係無く、遺伝子が導入されていればィネに鉄欠乏耐性が付与できることが示されたことになる。

このように、イネのムギネ酸合成経路のなかの酵素の活性を、その遺伝子の導入により高めることができ、さらにそれにより鉄欠乏耐性が与えられることがわ力、つ 7こ。

本発明のイネのムギネ酸合成経路のなかの酵素としては、第 1図に示すムギネ酸類の生合成経路の中の酵素であって、当該酵素をコードする遺伝子を導入することによりその活性が高められるものであればよいが、前記したようにその中のニコチアナミンァミノ基転移酵素（Ν Α Α Τ ) やニコチアナミン合成酵素が好ましい。本発明のイネのムギネ酸合成経路のなかの酵素をコードする遺伝子としては、 c D N Aであってもゲノム由来のものであってもよい。後述するようにゲノムの使用も本発明の好ましい例である。

したがって、本発明のイネ科植物としては、ストラテジー I I の機構により鉄を吸収することが可能な植物であればよく、学術上のイネ科植物に限定されるものではない。本発明の好ましいイネ科植物の例としては、イネ、トウモロコシ、ソルガム、小麦，大麦、ェンバクなどが挙げられる。これらのイネ科植物はその品種に関係なく、広く本発明の方法を適用することができ、目的とする遺伝子が導入されたイネ科植物を作出することができる。

本発明のプロモーターとしては、目的の酵素を発現させることができるものであれば特に制限はなく、 3 5 Sプロモーター、より具体的には C a M V 3 5 S プ口モーターなどを用いることができる。

本発明のベクタ一としては、形質転換において好適に使用することができるものであれば、特に制限はない。本発明の形質転換法としては、前記したァグロバクテリゥムを用いる方法に限定されるものではなく、パ一ティクルガンなどを用いた各種の形質転換法を採用することもできる。また、形質転換されるイネ科植物の細胞としては、前記したカルスからの細胞に限定されるものではなく、各種の細胞を使用することもできるが、通常はカルス由来のものが好ましい。

本発明の鉄欠乏とは、鉄分が欠乏している状態であってもよいが、好ましくは植物が吸収することができる状態の鉄分が欠乏している状態であり、植物の種類に応じて鉄欠乏状態であるか否かを決めることもできる。したがって、本発明における鉄欠乏耐性とは、目的とする植物がその土壌においては鉄分を吸収するのが困難な状態に対する耐性であるということもできる。

次に本発明者らは、 n a a の c D NAに代えてォォムギのゲノム n a a tの導入を試みた。

ゲノム _n a a ίは、ォォムギ（Horudeum vulgare L. var. Igri)より抽出したゲノム D N Aを用いて作成されたライブラリ一（SRTRATAGENE社製）を用いた。このライブラリ一は、制限酵素 S a u 3 A I で部分的に切断され、 A F I X I I べク夕一の o Iサイトに導入されたものである。プロ一ブとしては、先に単離した n a a t -A c D NAの全長を用いた。ホストとしては、大腸菌 X L 1 — B 1 u e MRA (E. col i XLl-Blue MRA (P2)) を使用した。

スクリーニングの結果、 5つのファージが得られ、これらについてそれぞれファ一ジ D N Aの単離を行い、それぞれについて制限酵素地図を作製したところ、すべて同じ断片を含むことが解った。すなわち、得られた 5つのファージは同じゲノムの部分から由来するものであることが解った。また、これらはプローブに使用した n a a ίを含むことが予想された。そこで、第 7図に示すこのうちの 1 つについて塩基配列の決定を行った。

第 7図に示したファージ DNAを、 1 0 k b以上の断片を挿入でき、かつァグロバクテリウムを用いたイネの形質転換を行うことのできるプラスミドベクタ一 p B I G R Z l の JV o i l サイトに挿入した（第 8図参照）。

さらに、第 7 図に示した断片について 1 1 . O k bまでを、 A〜Dまでの 4つに分け、これらをプラスミドベクタ一 p B l u e s c r i p t S K (― ) の E c o R I サイト（B、 C ) 、または V o i I 、 E c o R I サイト（A、 D ) に導入した。

A〜Dの各断片についてプラスミド上の配列を元にしたプライマ一（M l 3 フォワードプライマー， M 1 3 リバースプライマー）にて断片の両端から塩基配列を決定した。塩基配列の決定には島津製作所社製 D N Aシーケンサー D S Q - 2 0 0 0 Lを使用した。

配列決定の詳細は後述する実施例に記載されている。

決定した 1 0 ， 9 6 6 b pの塩基配列を配列表の配列番号 1示す。また、全配列を第 9図（塩基番号なし）に示した。

得られた塩基配列から、この 1 0 ， 9 6 6 b pの遺伝子は、これまで得られていた n a a ί — Aと n a a ί — βをコードするォォムギゲノムの断片であることがわかった。順序は n a a i — β、 n a a t — Αの順であった。

第 1 0図に c D N Aと比較して決定した n a a ί — Aと n a a t — Bの 5 ' 上流、ェキソン、イントロン、 3 ' 下流を示した。第 1 0図において大文字が c D N Aに転写されていたェキソン部分を示し、小文字がそれ以外の部分を示している。ェキソン部分の塩基番号はそれぞれ以下のようになる。

この模式図を、第 1 1 図に示した。ェキソン部分を斜線で塗った部分で示してある。両遺伝子ともに 6つのイントロン、 7つのェキソンで形成されている。また、イントロンの挿入位置は、各遺伝子ともに相同の位置であった。 c D N Aのどの位置にどの大きさのイントロンが挿入されているかを第 1 2図に示した。 c D N Aから予想される n a a t 一 A及び n a a t 一 βのアミノ酸配列を第 1 3図及び第 1 4図にそれぞれ示した。

得られたォォムギのゲノム n a a ίを導入したイネの形質転換法は、前述した 3 5 Sの形質転換イネの形質転換法に準じて行った。

次に得られたゲノム n a a ίを導入したイネの鉄欠乏耐性の検定を行った。得られた再生体（T 1 ) のうち 3 9個体とベクタ一のみを導入したコントロール (control) 1 5個体を用いて 3 5 Sの形質転換植物と同様に検定を行った。移植後 5週目から、 1週間または 2週間ごとに草丈の測定を行った。 4 — 5週間ごとに 2回土壌サイズを増やしたポッ卜に移し変えた。

ゲノム n a a tで形質転換されたイネは、アル力リ土壌に移植後 2週間目までに葉が黄化し 4〜 5週間目に新葉が濃い緑になり回復し始め、俄然旺盛な生育を示すようになった。これに対してべクタ一のみを入れた対照区は永く黄化葉が続き、 8週目あたりから新葉の緑化が始まった。

第 1 5図は、アルカリ土壌に移植後 1 0週間目の生育の状況を移した写真である。

第 1 5図の c o n t r o 1 は、ベクターのみを移植した対照のイネを示す。右側のイネはゲノム n a a ίで形質転換したものである。

アルカリ土壌移植後の草丈の変化を第 1 6図に示す。第 1 6図のグラフの縦軸は草丈（ c m) であり、横軸はアルカリ土壌移植後の日数（日）を示す。第 1 6 図の左側はゲノム n a a tで形質転換したイネであり、右側はベクターのみを移植した対照のイネである。

これにより、ゲノム n a a ίの導入によりィネに鉄欠乏耐性が付与できたことがわかった。実施例

次に、具体例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの具体例に限定されるものではない。実施例 1 ： C a MV 3 5 Sプロモータ一で；i a a を過剰発現するイネの形質転換法

第 2図に示すバイナリーべクタ一を、遺伝子 n a a iの c D NAを p I G 1 2 l Hmに X b a l 及び S a c I 部位を使って組み込んで作成した。これをァグロパクテリゥムに導入し形質転換に用いた。

イネの形質転換はヒエイら（Hiei, et aし， ( 1994) ) の方法に従い、材料には「ツキノヒカリ」を用いた。まず、籾を取り除いた種子を滅菌して、 N 6無機塩 N 6ビタミン 3 0 gZL、スクロース（sucrose) 2 m g / L > 2， 4—D 2 g/Lゲルライト（gelrite) からなるカルス誘導培地（ p H 5. 8 ) に播種し、 6 0 mo l /m² s T、 1 6時間明期ノ 8時間暗期の条件で 2 5 °C、 3週間培養して胚盤からカルスを誘導した。

新しい培地に移し、 2 5で明所で 3 日間培養した後、ァグロパクテリゥム懸濁培地（P H 5. 8 ) (AA無機塩アミノ酸 B 5ビタミン 2 0 gZL、スクロース（sucrose) 2 m g / L , 2， 4—D 0. 2 m g / L , 力イネチン（k

1 net in) 1 0 m gノ Lァセトシリンゴン（ ace t osyr i ngone) ) でァグロバクテリウム懸濁液に浸し、ペーパー夕オルで水を切った後、共存培養培地（p H 5.

2 ) (N 6無機塩 N 6ビタミン 3 0 g/L、スクロース（sucrose) 1 0 g し、グルコース（glucose) 2 m g / L , 2， 4—D 1 O mg L ァセトシリンゴン（acetosyringone) 2 g/Lゲルライト（gelrite) ) で 2 8 °C暗黒下で 3 日間感染させた。

その後、 5 0 O mg/Lでクラフォランを入れた滅菌水洗浄液でカルスを洗つてァグロバクテリゥムを除去し、 5 OmgZLのハイグロマイシンを含む選抜培地（pH 5. 8 ) (N 6無機塩 N 6ビタミン 3 0 g L、スクロース（sucr ose) 2 m g / L , 2 , 4—D 2 g/L、ゲルライト（gelrite) 5 0 0 m g / L , クラフォラン 5 0 mg/L、ハイグロマイシン（hygromycin) ) 上に置床して 2 5で明所で 3週間培養した。

培養後、再分化培地（ P H 5 · 8 ) (M S無機塩 M Sビタミン 3 0 gZL、スクロース（sucrose) 3 0 g / L , ソルビトール（sorbitol) 2 g/L、力ザミノ酸類（casamino acids) 1 m g / L , N A A 2 m g / L , BA P 5 0 Omg/L, クラフォラン 5 0mg/L、ハイグロマイシン（hygromycin)

4 g/L , ゲルライト（ge ite) ) に移し 3〜 5週間で再分化してきた再生体 (T 1植物）を検定培地に移した。検定培地（p H 5. 8 ) は、 MS無機塩 M Sビタミン 3 0 gZL、スクロース（sucrose) 5 0 m g L、ハイグロマイシン（hygromycin) 8 g / L , 寒天（agar) からなつている。

シャーレ一杯に大きくなつた植物体を 4〜 5 日間馴化させた後、合成培土（ボンソル 1号、住友化学）とバーミキユライトを 1 ： 1にまぜた土に移植して種子をとつた。最終的に 3 4系統の形質転換イネを得た。実施例 2 ：導入された遺伝子のサザンハイプリダイゼ一ション法による検出実施例 1で得られた T 1植物の葉を磨砕し、 C — T A B法の改変によりゲノムを抽出した。抽出したゲノムを i j' n d l I I で処理し、 0. 8 %ァガロースゲルを用いた電気泳動で分離した。これをナイ口ンメンブレンにプロッティングした。プローブに /7 a a ίの内部配列で作成したプライマーを用いて P C Rによつて³² Pでラベルしたものを用いてハイブリダィゼ一シヨンを行った後、 B A S 2 0 0 0 (フジフィルム）によってバンドを検出した。

このサザンハイブリダィゼ一ションの結果を第 3図に示す。第 3図の WTは野生型のイネの場合を示し、 c o n t r o 1 はベクターのみを導入した対照のイネの場合を示し、 1 — 5 、 1 — 6 、 1 — 7 、 8 — 1及び 1 5 — 2 は 3 5 Sプロモ一夕一で； 7 a a t 一 Aを過剰発現するイネの場合を示す。

第 3図に示す結果より、 3 5 S形質転換イネのうち、 8 — 1 、 1 5 — 2 には少なくともそれぞれ 5コピー、 2 コピーの n a a iが導入されたことが分かった。実施例 3 ：アルカリ土壌を用いた鉄欠乏耐性の検定

供試土壌として、次の構成成分からなる貝化石土壌を用いた。構成成分（％) ；水分 0.48

リン酸全量 0.12

力リ全量 0.12

ケィ酸全量 22.79

石灰全量 37.82

苦土全量 0.91

マンガン全量 0.018

ホウ素全量 0.003

アルカリ分 38.80

塩酸不溶解物 28.88 酸化鉄 0.99

酸化アルミニウム 5.59

亜鉛 0.002 この土壌の可溶性の鉄濃度は 2. 2 p p mであり、 p Hは 8 . 7 8であり、電気抵抗は 0. 0 3 ιη Ωであった。

3 5 Sの形質転換植物の検定には、最初に得られた形質転換植物の再生体（Τ 1 ) の種子を 5 0 m g / Lのハイグロマイシンを含む M S固形培地上に播種して選抜、馴化後、 2 0〜 2 5 c mになった幼植物（T 2 ) を用いた。

3 4系統のうちの 1 6系統 2 7種について耐性の検定を行った。検定法はプラスチックの黒ポット（ 0. 5 L ) の底にペーパータオルとろ紙を円形に切ってしき、アルカリ土壌を入れたものに植物を移植し、水耕液（春日井氏液； 7 X 1 0 — ⁴M K P O 1 X 1 0 _⁴M K C 1 , 1 X 1 0 — ⁴M KH ₂ P〇₄， 2 X 1 0 - ³M C a (N O ₃) 5 X 1 0 -⁴ M M g S O _{4 >} 1 X 1 0 - ⁵M H B O 5 X 1 0 _⁷M M n S O 5 X 1 0 _⁷M Z n S O 2 X 1 0 " M C u S O ₄, 1 X 1 0— ⁸M ( N H ₃M o O 1 . 5 X 1 0 — ⁴M F e — E D T A) をポッ卜の底から 2〜 3 c m浸し、昼 3 0で、夜 2 5での温室で栽培した。アルカリ土壌は 3〜 4週間後にポッ卜のサイズを 1 Lにし、 8〜 9週間後に 2 Lと一回りづっ大きくして植え替えた。移植後 2週目から、 1週間または 2週間ごとに草丈の測定を行った。

+ F e (鉄存在）又は— F e (鉄欠乏）の水耕液で育てた形質転換イネ（ 3 5 S - n a a t イネ）の N A A T比活性の測定を次のようにして行った。発芽後 3週間の幼植物（Τ 2 ) を + F e、 — F eの水耕液で 2週間栽培しそれぞれの根における N AA T活性を測定した。その結果を第 4図に示す。第 4図の白抜き部分は + F eの場合を示し、斜線部分は一 F eの場合を示す。 WTは野生種のものを示し、 1 — 5、 1 一 6及び 1 — 7 は形質転換体のものを示す。

+ F e、 — F eのいずれにおいても形質転換していない野生種（WT) よりも形質転換したもののほうが比活性が高く、一 F eの時さらに比活性が上乗せされた（第 4図参照）。実施例 4 ：アルカリ土壌による鉄欠乏耐性の検定

3 5 S ~ n a a 一 A形質転換イネをアルカリ土壌に移植して、その生育を観察した。

3 5 S - n a a ί — A形質転換イネは、移植後 2週間目までに葉が黄化し 4〜 5週間目に新葉が濃い緑になり回復し始め、 n _a a ίの導入によりイネに鉄欠乏耐性が付与できたことがわかった。

移植後 8週目の生育状況の写真を第 5図に示す。第 5図の c o n t r o 1 は、ベクタ一のみを移植した対照のイネを示す。右側のイネは形質転換したものである。

アルカリ土壌移植後の草丈の変化を第 6図に示す。第 6図のグラフの縦軸は草丈（ c m) であり、横軸はアルカリ土壌移植後の日数（日）を示す。黒丸印は形質転換体 1 5 — 2 を示し、黒四角印は形質転換体 8 — 1 を示し、白丸印は c o n t r o 1 として用いたベクターのみを移植した対照のイネを示す。

遺伝子 n _{a a} tの導入によりイネに鉄欠乏耐性が付与できたことがわかった (第 5図、第 6図）。実施例 5 ： n a a ί 一 A及び βゲノミッククローンの単離

スクリーニングの手順は主に「クロ一エングとシーケンス」（農村文化社）によった。

ライブラリ一として、ストラタジーン（SRTRATAGENE) 社より購入した I X I I ライブラリ一を用いた。これはォォムギ（Horudeum vulgare L. var. Igri) より抽出したゲノム D N Aを用いて作成されたものである。ゲノム D N Aは、制限酵素 S a u 3 A I で部分的に切断され、 A F I X I I ベクターの ΧΛ ο Ι サイ卜に導入されたものである。ライブラリ一のインサートサイズは 9〜 2 3 k bである。

( 1 ) N Z C YM液体培地（N Zァミン 1 0 g、 N a C l 5 g、カザミノ酸 l g、バクトイ一スト抽出物（Bac to - yeas t extract) 5 g、 M g S O ₄ · 7 H2O 2 g、及び、 I N N a O H 約 6 m Lを蒸留水で 1 Lにし（ p H 7 5) オートクレープで殺菌したもの。）で一晩培養した大腸菌（E. c o 1 i

XL 1— B l u e M R A ( P 2 ) ) を遠心した後、 l O mM M g S〇₄溶液 2 0 mLに懸濁した。

( 2 ) この大腸菌懸濁液 1 0 0 mLとファージ希釈液（スクリーニング用プレ — ト（ 9 c mx l 3 c m) に 2 5， 0 0 0プラークを形成する量） l O O mLとを混ぜ、 3 7 °C 2 0分静置後、 8 mLの 5 0°C 0. 7 % トツプアガー（ 1 0 0 mLあたり 0. 7 gのァガロースを加えたもの）と混ぜ、スクリーニング用プレート（ 9 c mx l 3 c m) にまいた。プレートは 3 7でに静置し、プラークのサィズが 0. 5 mmになるまで培養した。

( 3 ) ナイロンメンブレン H y b o n d— N (Ame r s h am社）をプレー卜のサイズに切り取り、トップァガロースの上に 3 0秒間おいた。これを変性液

( 0. 5 M N a OH、 1. 5 M N a C l ) を含ませた濾紙の上にプラークと接触した面を上にして置いた。 2枚目のメンブレンをトップァガロース上に置き、 1分間放置した。同様に変性液をしみこませた濾紙上においた。 5分間放置した後、 2枚のメンブレンを中和液（ 0. 5 M T r i s — HC 1 p H 8. 0、 1. 5 M N a C l ) をしみこませた濾紙上に移した。 5分間放置後、 2 x S S P E ( 0. 0 2 M N a H ₂ P O p H 7. 4、 0. 3 M N a C l , 2 m M EDTA) 液で 2回よく洗い、乾燥させた。

(4) 先に単離した n a a ί — Aの c D N A全長をプローブとして使用するために、プラスミドベクタ一 p YH 2 3の ff j' n d l I I及び JVo i lサイトに入つているものを同サイトで切り出し、精製した。これをランダムプライマー D N Aラベリングキット第 2版（Random Primer DNA Labeling Kit Ver.2 (宝酒造））を用いて [ α— ³²P] d AT Pでラベル化した。

一方、メンブレンを予め 6 5 に加温しておいた 3 0 m Lのハイブリダィゼーシヨンバッファ一（ 6 x S S P E、 5 Xデンハルト溶液、 0. 1 % S D S、 1 0 0 m g /m L変性サケ精巣 D N A) でプレハイブリダィゼ一シヨンを 6 5 X：で 1時間行い、ハイブリダィゼ一シヨンバッファーを交換した（ 2 5mL) 。

これに、前記で調製したプローブを加え、 6 5でで 1 2時間ハイブリダィゼ一シヨンを行った。メンブレンの洗浄は予め 6 5 T:に加温しておいた洗浄液（ 5 x S S P E) で 6 5でで 1 0分間を 2回、ハイストリ一ジェント（ h i gh s t r i ngen t ) 洗浄液（ 2 x S S P E、 0. 1 % S D S ) 6 5 °Cで 1 回を行った。メンブレンをサランラップで包み、イメージングプレート（フジフィルム）にー晚感光させ、イメージングアナライザ一（フジフィルム）で結果を得た。

試薬は、 2 0 x S S P E ( 0. 2 M N a H ₂ P O . p H 7. 4、 3 M N a C l 、 2 0 mM E D TA) 、 5 O xデンハルト溶液、 5 g フイコール 4 0 0、 5 g ポリピニルピロリドン（ M W 3 6 0 , 0 0 0 ) 、 5 g 仔ゥシ血清アルブミンを 5 0 0 mLの蒸留水に溶解し、 0. 4 5 mmのフィルタ一で濾過したものを使用した。

( 5 ) 二枚のメンブレンに共通して現れたものをポジティブとして、この場所に対応するプラークを元のシャーレから打ち抜いた。打ち抜いたものは S M液

( 5 0 mM T r i s - H C 1 H 7 . 5、 0. 1 M N a C l 、 7 mM M g S O 0. 0 1 % ゼラチン）にとり、 4 t:で保存した。その後、このファージ液を使って同様に 2次、 3次スクリーニングを行った。最終的に 5つのファージが得られた。

上記で得られた 5つのファージについてそれぞれファージ D NAの単離を行つた。それぞれについて制限酵素地図を作製したところ、すべて同じ断片を含むことが解った。すなわち、得られた 5つのファージは同じゲノムの部分から由来するものであることが解った。また、これらはプローブに使用した _n a a ίを含むことが予想された。そこで、このうちの 1つ（第 7図参照）について塩基配列の決定を行うこととした。第 7図中の Eは£ c o R I を、 Ηは H i n d i I I を、 Bは B a mH I を、 Nは ΛΓο t I をそれぞれ示す。両端の N o t I サイトは I X I I のアームにある ΛΓο t I である。実施例 6 ：サブクロ一ニングと塩基配列の決定

( 1 ) 第 7図に示したファージ D N Aを、 1 0 k b以上の断片を挿入でき、力、っァグロバクテリゥムを用いたイネの形質転換を行うことのできるプラスミドべクタ一 p B I G R Z 1 に挿入した。第 7図で示したファージ D NAのはじめの V o i lサイトから 1 1. 0 k bにある Wo ί Iサイトまでの断片 1 1. O k b pを切り出し、 p B I G R Z l の JV o i l サイトに挿入した（第 8図参照）。第 8図の N P T I I はカナマイシン耐性遺伝子を、 H P Tはハイグロマイシン耐性遺伝子を、 G U Sはイントロン入り j3ダルク口ニダ一ゼ遺伝子を、 L a c Zは /3 ガラクトシダーゼ遺伝子を、 3 5 Pは 3 5 Sプロモータ一を、 N Pは N O S プロモーターを、 N Tは N O S夕一ミネ一夕一を、 M C Sはマルチクローニングサイトを、 R i o r i は R i プラスミド複製起点をそれぞれ示している。

すなわち、塩基配列の決定を行ったのは、この 1 1 . O k bについてである。後のイネの形質転換にはこの作成したコンストラクトを使用した。

( 2 ) p B I G R Z l は大腸菌（E . c o l i X L 1 — b l u e ) 内で安定に保持される。このコンストラクトを持った大腸菌を培養し、ここからプラスミドをプラスミド調整器 P I — 5 0 α (倉敷紡績株式会社）により抽出した。

( 3 ) 第 7図に示した断片について 1 1 . O k bまでを、 A〜 Dまでの 4つに分け、これらをプラスミドベクタ一 p B l u e s c r i p t S K (- ) の Ε c o R Iサイト（B、 C ) 、または JV o t I 、 E c o R I サイト（A、 D) 〖こ導入した。

( 4 ) A〜Dの各断片についてプラスミド上の配列を元にしたプライマー（M 1 3フォワードプライマ一， M 1 3 リバースプライマ一）にて断片の両端から塩基配列を決定した。塩基配列の決定には島津製作所社製 D N Aシーケンサ一 D S Q— 2 0 0 0 Lを使用した。

( 5 ) 各断片について塩基配列の決定された部分からさらに先を読むためのプライマーとそこまで読めた配列を逆方向から確認するためのプライマーを作成し、順次塩基配列を決定した。最終的には全ての断片について、 5 ' 方向からと 3 ' 方向から両方向について配列決定を行った。各断片の塩基配列を決定するのに使用したプライマーの配列を以下に示す。

これらのプライマ一は、 D S Q— 2 0 0 0 Lでの使用のため 5 ' 末端にフルォレセィンィソチオシァネ一ト（f luorescein isot iocyanate, F I T C ) でラベルした。断片 A用のプライマー名称：配歹 'J F-A1F: FITC-5' -get act agt agt at t cct ggt gta g 名称：配列 F - AIR: FITC-5' -gga gta c ta c t a gac tac acc agg a 名称：酉己列 F-A2F： FITC-5' -aca tgc gca tgc atg aat tgc eg

名称：酉己歹 |J F-A2R: FITC-5' -caa t tc alg cat gcg cat gtg cc 断片 B用のプライマ一

名称：酉己列 F-B1F： FITC-5' -ggt caa gta tgc agt atg t tg gaa c 名称：配歹 'J F-B1R: FITC-5' -gt t cca aca tac tgc ata ctt gac c 名称：配列 F- B2F: FITC-5' -cta gaa gcc tat gga tgt t tc 111 t g 名称：酉己列 F-B2R: FITC-5' -cca aaa gaa aca tec ata ggc t tc tag 名称：配歹 |J F-B3F: FITC-5' -agt tct tat caa t t t ccg aga tga c 名称：己歹 |J F-B3R: FITC-5' -ata gtc ate tcg gaa at t gat aag a 名称：酉己歹¹ J F-B4F： FITC-5' -agt ggt cac cat gcg gac caa cac c 名称：配歹 'J F-B4R: FITC-5' -ggt gt t ggt ccg cat ggt gac cac t 断片 C用のプライマ一

名称：配列 F-C1F: FITC-5' -cac egg cca gt t caa c tg cta cgc

名称：配列 F- C1R: FITC-5' -gcg tag cag t tg aac tgg ccg gtg

名称：酉己列 F-C2F: FITC-5' -t t t gga gga gat cca tga cga cat a 名称：配列 F- C2R: FITC-5' -tat gtc gtc atg gat etc etc caa a 名称：配列 F-C3F: FITC-5' -tct tct cat atg cta ctg tgg gga t 名称：配列 F-C3R: FITC-5' -tga cat gca aca cag gga cat gag c 断片 D用のプライマー

名称：配列 F-D1F: FITC-5' -cat get gac gaa gag cga ggt cat a 名称：配列 F-D1R: FITC-5' -ccc agg ata tga cct tag t g ttg g

( 6 ) 上で完全に配列決定ができなかった部分について新たに下に示すプライマ一を合成し、パーキンエルマ一ジャパン社製自動 DN Aシーケンサ一 ABI PRIS MTM 310 genetic Analyzerを使用して、完全に塩基配列を決定した。断片 B用のプライマ一

名称：酉己歹¹ J B5F： 5' -gaa tgg caa act ggg tec gca 11 a c

名称：酉己歹!] B5R: 5' -gt a atg egg acc cag 111 gcc a 11 c

名称：配歹 |J B6F： 5' - ctg gt t gt t gtg gcc tgg acg aaa c

名称：配歹¹ J B6R: 5' -gt t tcg tec agg cca caa caa cca g

名称：配歹¹ J B7F: 5' -age aca aac cc t acc t a t gt t agg c

名称：配列 B7R: 5' -gcc taa cat agg tag ggt t tg tgc t 断片 C用のプライマ一

名称：酉己歹 |J C4F: 5' -tgg aat t tc gcc egg ggc aag gac

名称：酉己歹¹ J C4R: 5' -ccc tgt gac aag tgc tct get acg

名称：配歹リ C5F： 5' -tc t ggg ate tea gtg cat cca aca

名称：配歹¹ J C5R: 5' -gaa gca tat ate agt caa aca taa cc また、断片 Aと断片 B、断片 Bと断片 Cのつなぎ目部分を確定するために以下のプライマ一を作成して、（ 1 ) で作成したコンストラクトをパーキンエルマ一ジャパン社製自動 D N Aシーケンサ一 ABI PRISMTM 310 genetic Analyzerを使用して、塩基配列を決定した。断片 Aと断片 Bの境目

名称：配歹リ A-eF: 5' -cac ate c 11 tgc c 11 gc t gaa tat gg

名称：配歹リ B-tR: 5' -cag tag tac taa tta ate acc tta gta gc 断片 Bと断片 Cの境目

名称：配歹リ B-eF： 5' -cac gat caa cca aag aat gtc etc c

名称：配歹 'J C-tR: 5' -tac t tg tat atg cag etc cag cac ( 7 ) 決定した 1 0 ， 9 6 6 b pの塩基配列を配列表の配列番号 1示す。また全配列を第 9図（塩基番号なし）に示した。

得られた塩基配列から、この 1 0 ， 9 6 6 b pの遺伝子は、これまで得られていた n a a _ と /1 ョ 3 ί — βをコードするォォムギゲノムの断片であることがわかった。順序は n a a i — β、 n a a t — Αの順であった。

第 1 0図に c D N Aと比較して決定した n a a /: — と /1 3 3 t — Bの 5 , 上流、ェキソン、イントロン、 3 ' 下流を示した。第 1 0図において大文字が c D N Aに転写されていたェキソン部分を示し、小文字がそれ以外の部分を示している。ェキソン部分の塩基番号はそれぞれ以下のようになる。 n a a t — B 第 1 ェキソン 5 7 9 - 1 2 9 9 (開始コドン 6 5 1 8 ) 第 2ェキソン 1 4 8 3 - 1 8 2 5

第 3ェキソン 1 9 2 2 - 2 1 4 0

第 4ェキソン 2 2 4 4 - 2 3 0 3

第 5ェキソン 2 7 6 1 - 2 9 1 6

第 6ェキソン 3 2 6 3 - 3 3 5 6

第 7ェキソン 3 7 3 5 - 4 0 3 3 (終始コドン 3 8 6 8 ) n a a t - A 第 1ェキソン 6 4 5 7 6 8 9 7 (·開始コドン 6 5 1 8 ) 第 2ェキソン 7 0 2 9 7 3 7 1

第 3ェキソン 7 4 7 9 7 6 9 7

第 4ェキソン 7 7 8 4 7 8 4 3

第 5ェキソン 8 2 8 5 8 4 4 0

第 6ェキソン 8 7 3 8 8 8 3 1

第 7ェキソン 9 4 1 4 9 7 3 2 (終始コドン 9 5 4 7 ) この模式図を、第 1 1図に示した。ェキソン部分を斜線で塗った部分で示してある。両遺伝子ともに 6つのイントロン、 7つのェキソンで形成されている。また、イントロンの挿入位置は、各遺伝子ともに相同の位置であった。 c D N Aのどの位置にどの大きさのィントロンが揷入されているかを第 1 2図に示した。 c D N Aから予想される n a a t — A及び n a a ί 一 βのアミノ酸配列を第 1 3図及び第 1 4図にそれぞれ示した。実施例 7 ：ォォムギのゲノム n a a ίを導入したイネの形質転換法

前記した実施例 6で得られたォォムギのゲノム /7 a a ίを導入したイネの形質転換法は、以下に示す（ 1 ) 〜（ 3 ) の点を除いては 3 5 Sの形質転換イネのときと同様に形質転換を行った。

( 1 ) カルス誘導を 2 8で暗所で行い、カルス誘導培地を、

Ν 6無機塩 Ν 6 ビタミン 0 . 3 g L、カザミノ酸（casamino acid) 3 0 g / L、スクロース（sucrose) 2 m g / L、 2 ， 4 - D 2 . 8 g / L、プロリン 4 g Z L、ゲルライト（gel ri te) ( p H 5 . 8 ) とした。

( 2 ) ァグロパクテリゥムによる感染を 2 5 °Cで行い、共存培養培地を、

N 6無機塩 N 6 ビタミン 3 0 g / L、スクロース（sucrose) 1 0 g L、グルコース（glucose) 1 g / L , カザミノ酸 (casamino acid) 2 m g / L、 2 , 4 一 D 2 0 m g / L ァセトシリンゴン（ ace t osy r i ngone) 2 g _ L、ゲルライト（gelri te) ( p H 5. 2 ) とし、ろ紙を敷いて行った。

( 3 ) 選抜は、はじめの 1週間を 1 0 m g Z L、次の 1週間を 3 0 g / L、最後の 2週間を 5 O m g / Lのハイグロマイシンを含む選抜培地を使い、暗所 2 8 でで培養した。

選抜培地として、 N 6無機塩 N 6 ビタミン 1 、カザミノ酸 353 no acid) 、 3 0 g / L スクロース（sucrose) 、 2 m g / L 2 , 4 一 D、 2 5 O m g /L クラフォラン、 1 0 — 5 0 m g / L ハイグロマイシン（hygrom ycin) 、 2 g / L ゲルライト（gelri te) ( p H 5. 8 ) を用い、

再分化培地として、 M S無機塩 M S ビタミン 3 0 g ZL スクロース（sucr ose) 、 3 0 g / L ソルビトール（sorbitol) 、 2 g / L カザミノ酸（casam i no acid) 、 1 . 1 g / L M E S、 2 m g / L N AA、 l m g / L 力イネチン（kinetin) 、 2 5 O m g / L クラフォラン、 S O m g Z L ハイグロマイシン（hygromycin) 、 4 g / L ゲルライト（gelri te) ( p H 5. 8 ) を用い、 2 8 °Cで培養を行った。実施例 8 ：ゲノム n a a tを導入したイネの鉄欠乏耐性の検定

ゲノム ·η a a tを導入したイネの鉄欠乏耐性の検定は、得られた再生体（T 1 ) のうち 3 9個体とベクタ一のみを導入したコントロール（c on t r o l ) 1 5個体を用いて 3 5 Sの形質転換植物と同様に検定を行った。移植後 5週目から、 1週間または 2週間ごとに草丈の測定を行った。 4 一 5週間ごとに 2回土壌サイズを増やしたポットに移し変えた。

ゲノム n a a tで形質転換されたイネは、アル力リ土壌に移植後 2週間目までに葉が黄化し 4〜 5週間目に新葉が濃い緑になり回復し始め、俄然旺盛な生育を示すようになった。これに対してベクターのみを入れた対照区は永く黄化葉が続き、 8週目あたりから新葉の緑化が始まった。これにより； i a a ίの導入によりイネに鉄欠乏耐性が付与できたことがわかった（第 1 5図及び第 1 6図参照）。第 1 5図は、アル力リ土壌に移植後 1 0週間目の生育の状況を移した写真である。

第 1 5図の c o n t r o 1 は、ベクタ一のみを移植した対照のイネを示す。右側のイネはゲノム n & 3 tで形質転換したものである。

アルカリ土壌移植後の草丈の変化を第 1 6図に示す。第 1 6図のグラフの縦軸は草丈（ c m ) であり、横軸はアルカリ土壌移植後の日数（日）を示す。第 1 6 図の左側はゲノム n a a tで形質転換したィネであり、右側はベクターのみを移植した対照のイネである。

これにより、ゲノム； 1 a a ίの導入によりイネに鉄欠乏耐性が付与できたことがわかった。産業上の利用可能性

本発明は、鉄欠乏耐性を有する新規なイネ科植物を提供するものであり、鉄欠乏耕地においても生育可能な新規なイネ科植物を提供するものである。

また、本発明は、イネ科植物に、ムギネ酸類生合成経路中の酵素をコードする遺伝子を導入することにより、鉄吸収性が改善されたイネ科植物をえることができるという新規な知見を提供するものである。

Claims

請求の範囲

1 . イネ科植物にムギネ酸類生合成経路中の酵素をコードする遺伝子を導入して鉄吸収性が改善されたイネ科植物を作出する方法。

2. 酵素がニコチアナミンァミノ基転移酵素（N A A T) であり、それをコードする遺伝子が n a a である請求の範囲第 1項に記載の方法。

3. プロモ一夕一が C a Μ V 3 5 Sである請求の範囲第 1項又は第 2項に記載の方法。

4. 導入される遺伝子がゲノム遺伝子である請求の範囲第 1項〜第 3項のいずれかに記載の方法。

5. ゲノムがォォムギのゲノム n a a ίである請求の範囲第 4項に記載の方法。

6. 遺伝子の塩基配列が、配列表の配列番号 1 で示される塩基配列、若しくは当該塩基配列にストリ一ジェン卜な条件でハイブリダイズ可能でかつニコチアナミンァミノ基転移酵素（Ν ΑΑ Τ) 活性を有する蛋白質を発現し得る塩基配列、又はそれらに相補的な塩基配列である請求の範囲第 5項に記載の方法。

7. 請求の範囲第 1項〜第 6項のいずれかの方法で製造され得る鉄欠乏耐性を有するイネ科植物。

8. 請求の範囲第 7項に記載のイネ科植物の種子。

9. 請求の範囲第 7項に記載のイネ科植物の細胞。

1 0. 請求の範囲第 7項に記載のイネ科植物を鉄欠乏耕地で育成する方法。

1 1 . 請求の範囲第 1 0項に記載の方法により得られたイネ科植物の作物。