CN100547072C

CN100547072C - 一种培育耐低重金属元素植物的方法

Info

Publication number: CN100547072C
Application number: CNB2005100072513A
Authority: CN
Inventors: 凌宏清; 李丽华
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2005-02-06
Filing date: 2005-02-06
Publication date: 2009-10-07
Anticipated expiration: 2025-02-06
Also published as: CN1814759A

Abstract

本发明公开了一种培育耐低重金属元素植物的方法，该方法是将调控植物对重金属吸收的相关基因导入植物细胞或组织，得到耐低重金属元素的植物；所述调控植物对重金属吸收的相关基因，其核苷酸序列是编码序列表中SEQ ID №：2多肽序列的核苷酸序列。用本发明的方法可提高植物在低重金属胁迫下对重金属元素的吸收能力，可在农业生产中发挥巨大作用，具有重要的实际意义。

Description

一种培育耐低重金属元素植物的方法

技术领域

本发明涉及一种培育耐低重金属元素植物的方法。

背景技术

铁是所有生物生长所必需的一种营养元素。缺铁会严重影响植物的生长发育和光合作用，最终导致产量和质量的下降。土壤中，铁的总含量一般较高，但绝大多数都以三价氧化铁的形式存在，在中性和碱性土壤中，三价铁的可溶性非常低，不能被植物吸收利用。在长期进化过程中，植物为了满足其生长发育的需要，进化出两条活化和吸收铁的高效途径，分别称为strategy I和strategy II(Ion uptake mechanismsof individual cells and roots：in Mineral nutrition of higher plants Marschner(second edition)ed by Marschner，Academic Press，New York，1995，6-78)。禾本科植物属于strategy II植物，除禾本科以外的植物都属于strategy I植物。

发明内容

本发明的目的是提供一种培育耐低重金属元素植物的方法。

本发明所提供的培育耐低重金属元素植物的方法，是将调控植物对重金属吸收的相关基因导入植物细胞或组织，得到耐低重金属元素的植物；所述调控植物对重金属吸收的相关基因，具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的多核苷酸；

2)编码序列表中SEQ ID №：2多肽序列；

3)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

其中，高严谨条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在65℃下杂交并洗膜。

所述调控植物对重金属吸收相关基因的编码蛋白是具有下述氨基酸残基序列之一的多肽：

1)序列表中的SEQ ID №：2；

2)将序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有调控植物对重金属吸收作用的蛋白质。

具体的说，所述培育耐低重金属元素植物的方法，是利用植物表达载体，将序列表中SEQ ID №：1的基因序列导入植物细胞或组织，得到耐低重金属元素的植物。

所述序列表中SEQ ID №：1的基因序列是以序列表中SEQ ID №：3和SEQ ID №：4为引物经PCR扩增获得。

所述在构建植物表达载体时，在序列表中SEQ ID №：1的基因的转录起始核苷酸前还添加有增强型启动子或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、根部特异表达启动子等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述构建植物表达载体的出发载体为pBI121、pBin19或pBIN35S-mGFP4。

所述植物表达载体为pBI121-FER。

所述将调控植物对重金属吸收的相关基因导入植物细胞或组织的方法为借助Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化法、显微注射法、电击法或农杆菌介导法。

所述得到的耐低重金属元素的植物为番茄、大豆、油菜、水稻或小麦。

序列表中SEQ ID №：1的基因，名称为FER，编码一个bHLH类转录调控因子FER，参与控制strategyI植物的缺铁反应(iron deficiency responses)和对铁元素的吸收。通过增强该基因的转录量，能提升FER所调控的下游基因的表达水平，如在低铁条件下，FER转基因植株对铁、锰和锌的吸收能力明显增强，与未转基因植株相比更耐低铁胁迫。用本发明的方法可提高植物在低重金属胁迫下对重金属元素的吸收能力，将在农业生产中发挥巨大作用，具有重要的实际意义。

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1为FER的过量表达载体pBI121-FER的构建示意图

图2为FER的过表达对其下游功能基因LeFRO1、LeIRT1和LeNRAMP1转录的影响的琼脂糖凝胶电泳检测结果

图3为在低铁胁迫下FER基因过量表达植株和野生型植株生长情况的比较

图4为在低铁胁迫下FER基因过量表达植株对Fe、Mn、Zn和Cu吸收的影响

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物均由北京奥克生物技术有限责任公司合成。

实施例1、FER基因的获得

采用图位克隆法从番茄基因组中分离出FER基因，具体步骤为：通过FER基因突变体T3238fer(Brown JC，Chaney RL，Ambler JE，1971，A new tomato mutantinefficient in the transport of iron.Physiol Plant 25：48-53)和一野生番茄Lycopericum pennellii(LA716)杂交构建作图群体，对FER进行遗传精确定位，用与FER基因紧密连锁的DNA分子标记筛选番茄DNA的BAC基因组文库，进行BAC测序后获得FER基因的基因组序列，再用FER基因的基因组序列筛选cDNA文库，经测序获得FER基因的cDNA序列，其cDNA序列由1088个碱基组成，具有序列表中SEQ ID №：1的DNA序列，其编码序列为自5’端第41-第934位碱基，自5’端第384-第531位碱基编码bHLH类转录调控因子的bHLH保守结构，编码具有序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列的蛋白质。

实施例2、FER转基因植株的获得及该基因的功能验证

1、FER的过量表达载体的构建

提取番茄品种Moneymaker中的RNA，用逆转录法合成其cDNA，然后以此cDNA为模板，在引物1：5′-tctagaaaatggagagtggtaatgcatc-3′(序列表中SEQ ID №：3)和引物2：5′-gagctcattaagtaaaagtcccgtttagtttg-3′(序列表中SEQ ID №：4)的引导下，PCR扩增FER，PCR反应条件为：先95℃ 2分钟；然后95℃ 1分钟，50℃ 1分钟，72℃ 1分钟，共35个循环；最后72℃ 5分钟。反应结束后，对PCR产物用DNA纯化试剂盒(Phamacia公司)纯化后将其克隆入载体pGEM T-easy(Promega公司)中，将该重组载体命名为pGEM T-easy/FER，然后将pGEM T-easy/FER用CaCl₂法转化大肠杆菌DH5a菌株，经筛选后挑选阳性单克隆提质粒进行测序。验证序列无误后，用限制性内切酶Xba I和SST I将FER从实施例1中的重组载体pGEM T-easy/FER中分离出来，再将其克隆入含有35S增强型启动子的载体pBI121的Xba I和SacI酶切位点之间得到FER的过量表达载体，如图1所示，将该载体命名为pBI121-FER。

2、FER转基因植株的获得及FER基因的过表达对其下游功能基因LeFRO1、LeIRT1和LeNRAMP1转录的影响

1)将重组载体pBI121-FER用电击法导入农杆菌LBA4404中，经鉴定后将其转化番茄品种Ailsa Craig的子叶，获得FER的转基因植株。用FER基因序列为探针，Southern杂交分析T2代转基因植株，结果表明外缘FER基因稳定地整合到了番茄基因组中，在不同转基因株系中所引入的外缘FER基因拷贝数为1-2个。

2)转基因株系的种子在正常的生长条件下(MS培养基)发芽长出幼苗后，将转基因植株幼苗分别在含有10μM和100μM的铁浓度的MS固体培养基上生长2周，再分别提取上述转基因植株根和叶的总RNA(以未转任何基因并在相同条件下处理的番茄Ailsa Craig植株为对照)，并以所提取的不同的总RNA为模板，进行RT-PCR分析FER基因及其下游功能基因的表达丰度。在引物1和引物2的引导下，PCR扩增FER基因；在引物3；5’-ggagccagagaaaatcagtg-3’和引物4：5’-cgaagccataggagttgc-3’的引导下，PCR扩增三价铁还原酶LeFRO1基因(GenBank号AY224079)；在引物5：5’-tggctgtggctggaaatcatgttc-3’和引物6：5’-agaatttttttgcaactcccaataggt-3’的引导下，PCR扩增二价铁离子转运蛋白LeIRT1基因(GenBank号AF246266)；在引物7：5’-gctttgtcctgaggctaataatg-3’和引物8：5’-gtttcgcgttgtttgtgtcc-3’的引导下，PCR扩增、二价铁离子转运蛋白LeNRAMP1基因(GenBank号AY196091)；在引物9：5’-cctcttgggctcgttaatctggct-3’和引物10：5’-ctggtggttttgaagctggtatct-3’的引导下，PCR扩增LeEF-1a基因(Pokalsky et al.，1989，Nucleic Acids Res.17，4661-4673)。将上述PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2所示，CK为未转任何基因并在相同条件下处理的番茄Ailsa Craig的对照植株，T1和T2表示两个转基因株系，结果表明在10μM的缺铁条件下，通过增加FER基因的转录量，可增强植物根中FER下游功能基因LeFRO1基因、LeIRT1基因和LeNRAMP1基因的转录。

3、FER基因过量表达植株的耐低铁实验

将FER基因过量表达植株，在10μM Fe-EDTA低铁条件下处理，结果如图3所示，图中Ailisa为番茄品种Ailsa Craig的野生型对照植株，D12和B15-6表示两个FER基因过量表达植株，表明在低铁胁迫时，FER基因过量表达植株比对照植株更耐低铁，生长茂盛。同时测定上述三个植株根、茎、叶中Fe、Mn、Zn和Cu四种种金属的含量，结果如图4所示，表明在低铁胁迫下，和野生型对照植株相比，FER基因过量表达植株对金属元素铁、锰和锌的吸收能力明显增强。

序列表

<160>4

<210>1

<211>1088

<212>DNA

<213>番茄属番茄(Lycoper.esculentum Miller)

<400>1

ggggaaaaat aaaaaaaaaa tggagagtgg taatgcatca atggaaaata ataatgttaa 60

tgatattggg cttattaatt tcttggatga ggataatttt gaacaattca ttgagcttat 120

taggggtgaa actgctgatc ctattgtaaa tttttgccca aactatgatt gtgaacatat 180

gacaggttgt ttttccgcag ccaatgccca atttgagcca atattatcgt cgatggattt 240

ctatgataca acattgccag atcctatttc gctatataac tgcgaaatca agctggataa 300

taatgatgat gaagacgatg atgaatcttc tggcacaacg gctaccacca aaatgactcc 360

aacaagcaaa ggcacgagga ctgaccggtc cagaactttg atttcggagc gcaaaaggag 420

aggaagaatg aaggaaaagc tttacgcttt gcgatcctta gttcctaata tcacaaagat 480

ggataaagcc tccatcattg gagatgcaat attatacgta caaggactac aaaccaaagc 540

aaagaaactt aaagttgaaa tagcagagtt tgagtcatca agtggaatat ttcaaaatgc 600

aaagaaaatg aatttcacaa cctattatcc agcaatcaag aggataacaa agatggacat 660

taatcaagta gaagaaaaag gattttacgt gagattaatt tgcaacaaag ggcgacacat 720

tgcagcttct cttttcaaag ctcttgagtc tctcaatgga ttcaatgttc aaacttccaa 780

cttggctact tctaccaatg attacatttt caccttcact ctttatgtga gagaatgtca 840

tgaggtggac ataaactttg gcaatttgaa gctatggata gctagtgctt ttcttaatca 900

agggtttgac ttcgagacat ctccgttggt ctaatatcat gttattattg taactttcta 960

aaatactgaa ctatatttaa tttgtattat catttagtac attatccaaa ctaaacggga 1020

cttttactta atgaagagaa aacttgtttt gattttaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1080

aaaaaaaa 1088

<210>2

<211>297

<212>PRT

<213>番茄属番茄(esculentum Miller)

<400>2

Met Glu Asn Asn Asn Val Asn Asp Ile Gly Leu Ile Asn Phe Leu Asp

1 5 10 15

Glu Asp Asn Phe Glu Gln Phe Ile Glu Leu Ile Arg Gly Glu Thr Ala

20 25 30

Asp Pro Ile Val Asn Phe Cys Pro Asn Tyr Asp Cys Glu His Met Thr

35 40 45

Gly Cys Phe Ser Ala Ala Asn Ala Gln Phe Glu Pro Ile Leu Ser Ser

50 55 60

Met Asp Phe Tyr Asp Thr Thr Leu Pro Asp Pro Ile Ser Leu Tyr Asn

65 70 75 80

Cys Glu Ile Lys Leu Asp Asn Asn Asp Asp Glu Asp Asp Asp Glu Ser

85 90 95

Ser Gly Thr Thr Ala Thr Thr Lys Met Thr Pro Thr Ser Lys Gly Thr

100 105 110

Arg Thr Asp Arg Ser Arg Thr Leu Ile Ser Glu Arg Lys Arg Arg Gly

115 120 125

Arg Met Lys Glu Lys Leu Tyr Ala Leu Arg Ser Leu Val Pro Asn Ile

130 135 140

Thr Lys Met Asp Lys Ala Ser Ile Ile Gly Asp Ala Ile Leu Tyr Val

145 150 155 160

Gln Gly Leu Gln Thr Lys Ala Lys Lys Leu Lys Val Glu Ile Ala Glu

165 170 175

Phe Glu Ser Ser Ser Gly Ile Phe Gln Asn Ala Lys Lys Met Asn Phe

180 185 190

Thr Thr Tyr Tyr Pro Ala Ile Lys Arg Ile Thr Lys Met Asp Ile Asn

195 200 205

Gln Val Glu Glu Lys Gly Phe Tyr Val Arg Leu Ile Cys Asn Lys Gly

210 215 220

Arg His Ile Ala Ala Ser Leu Phe Lys Ala Leu Glu Ser Leu Asn Gly

225 230 235 240

Phe Asn Val Gln Thr Ser Asn Leu Ala Thr Ser Thr Asn Asp Tyr Ile

245 250 255

Phe Thr Phe Thr Leu Tyr Val Arg Glu Cys His Glu Val Asp Ile Asn

260 265 270

Phe Gly Asn Leu Lys Leu Trp Ile Ala Ser Ala Phe Leu Asn Gln Gly

275 280 285

Phe Asp Phe Glu Thr Ser Pro Leu Val

290 295

<210>3

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>

<400>3

tctagaaaat ggagagtggt aatgcatc 28

<210>4

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>

<400>4

gagctcatta agtaaaagtc ccgtttagtt t 31

Claims

1、一种培育耐低铁番茄的方法，是将调控植物对重金属吸收的相关基因导入植物细胞或组织，得到耐低铁的番茄；所述调控植物对重金属吸收的相关基因，其核苷酸序列是编码序列表中SEQ ID №：2多肽序列的核苷酸序列。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述调控植物对重金属吸收的相关基因的碱基序列如SEQ ID №：1所示。

3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述序列表中SEQ ID №：1的序列是以序列表中SEQ ID №：3和SEQ ID №：4为引物，以番茄品种Moneymaker的cDNA为模板，经PCR扩增获得。

4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于：在构建植物表达载体时，在序列表中SEQ ID №：1的基因的转录起始核苷酸前还添加有增强型启动子或诱导型启动子。

5、根据权利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于：所述将调控植物对重金属吸收的相关基因导入植物细胞或组织的方法为借助Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化法、显微注射法、电击法或农杆菌介导法。