CN113736781A - 一种水稻内含子及其活性鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种水稻内含子及其活性鉴定方法，水稻内含子的序列如SEQ ID NO.1，通过构建Pro::GFP、Pro+Intron+UTR::GFP、Pro+UTR::GFP三个载体来鉴定内含子的活性，结果显示，本发明的内含子DNA分子，104bp，对转录具有较好的增强效果。

Description

一种水稻内含子及其活性鉴定方法
技术领域
本发明涉及内含子及鉴定方法，特别涉及一种水稻内含子及其活性鉴定方法。
背景技术
真核生物基因通常由若干个外显子和内含子互相间隔连接而成。外显子是真核生物基因的一部分，它在剪切后仍会被保存下来，其中可以被翻译的部分称为编码区，不能被翻译的部分称为UTR。内含子是位于基因中外显子之间的间隔序列，为非编码序列，在剪切过程中被除去。基因转录时，外显子和内含子都被转录成前体RNA分子，进一步剪切删除内含子序列，将外显子连接起来，产生有功能的成熟RNA分子。
随着研究的不断深入，科学家发现内含子不再是无义序列，它们作为真核生物基因组的重要组分，参与基因表达、染色质结构的维持、细胞骨架的构建及动态变化等信号途径。越来越多的研究证实内含子作为调控元件扮演着重要角色，可增强目的基因的表达。因此，内含子是基因工程中重要的研究对象。
发明内容
发明目的：本发明目的是提供对转录具有增强效果的内含子。
技术方案：本发明提供一种水稻内含子，序列如SEQ ID NO.1。
进一步地，所述水稻为禾本科稻属粳稻日本晴(Oryza sativa L.spp.Japonicavar.Nipponbare)。
进一步地，以水稻为禾本科稻属粳稻日本晴基因组DNA为模板，扩增得到104bp的扩增产物。
进一步地，所述扩增用的引物为序列如下：
正向F：5’-gtcggtacgcgtctctaggc-3’；
反向R：5’-ccacaaaacaagaaaaaaa-3’。
所述的水稻内含子的活性鉴定方法，包括如下步骤：
(1)先验证LOC_Os04g57220自身的启动子的活性，构建LOC_Os04g57220启动子驱动GFP的表达载体，命名为Pro：：GFP，LOC_Os04g57220自身的启动子序列为SEQ ID NO.2，
扩增引物为：
promoter-F：5’-gagtgtcgtgctccaccatgcgctaagttaaaaatagatat-3’
promoter-R：5’-ctcttcttcttaggagccatctttcggtgctcttcgctttc-3’；
(2)分析发现LOC_Os04g57220基因5’UTR区被104bp的内含子分隔，为检测内含子是否对基因表达的影响，构建启动子及包括内含子的5’UTR区序列(SEQ ID NO.3)调控GFP表达的载体，命名为Pro+Intron+UTR：：GFP，
扩增引物为：
intron-F：5’-gagtgtcgtgctccaccatgcgctaagttaaaaatagatat-3’；
intron-R：5’-ctcttcttcttaggagccatcgatcaaaccctaatcaccc-3’；
(3)为检测单独5’UTR序列对基因表达的影响，构建启动子和5’UTR序列(SEQ IDNO.4)调控GFP表达载体，命名为Pro+UTR：：GFP，
扩增引物为：
UTR-F：5’-gagtgtcgtgctccaccatgcgctaagttaaaaatagatat-3’；
UTR-R：5’-ctcttcttcttaggagccatcggcgacggggcgctccggc-3’；
(4)水稻原生质体的制备与转化；
(5)转化后根据荧光信号强弱对LOC_Os04g57220基因5’UTR区的104bp内含子活性进行验证。
鉴定原理：
基因的启动子在转录水平上对基因的表达调控起着非常重要的作用。启动子像是“开关”决定转录的起始。本发明中发现LOC_Os04g57220基因的启动子只能启动GFP基因以本底水平表达，而内含子的存在极大增强GFP表达。本发明组合启动子与内含子序列驱动GFP表达的系统，在瞬时转化体系中，验证了该内含子增强基因表达的功能。
有益效果：本发明的内含子DNA分子，104bp，对转录具有较好的增强效果。
附图说明
图1是LOC_Os04g57220基因结构示意图；
图2是原生质体中内含子检测载体示意图和活性检测结果。
具体实施方式
实本实施例的内含子获取及鉴定方法如下：
1、内含子
在水稻基因组公共数据库(RGAP，http：//rice.plantbiology.msu.edu/)中获取日本晴基因组序列和注释信息，从植物开放染色质数据库PlamDHS(http：//plantdhs.org/)中获得开放染色质数据(DNase-seq)。分析LOC_Os04g57220基因，该基因编码泛素结合酶，在茎、叶、花序、胚、胚乳和种子中表达较强。研究该基因结构，发现其5’UTR存在一段长度为104bp的内含子序列。
设计序列特异性引物，制备如下引物：
正向F：5’-gtcggtacgcgtctctaggc-3’
反向R：5’-ccacaaaacaagaaaaaaa-3’。
用以上引物以粳稻日本晴的基因组DNA为模板，扩增得到104bp的扩增产物。经测序，扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的自5’端第一位至104位所示，如图1所示。
SEQ ID NO.1：
gtcggtacgcgtctctaggcccccctctctctctcgatttgatcggtttgatctgtggtgccctaggtttgatctgtggatttattttttttcttgttttgtgg。
2、检测
为检测104bp内含子序列对基因表达的影响，构建如下三个载体：
1)为了检测LOC_Os04g57220自身的启动子的活性，首先克隆其启动子序列，用于驱动报告GFP基因的表达。使用的GFP载体由电子科技大学张勇课题组提供。LOC_Os04g57220基因自身的启动子序列(SEQ ID NO.2)，长度为144bp，使用所述引物扩增：
promoter-F：5’-gagtgtcgtgctccaccatgcgctaagttaaaaatagatat-3’
promoter-R：5’-ctcttcttcttaggagccatctttcggtgctcttcgctttc-3’
SEQ ID NO.2：
cgctaagttaaaaatagatataaactctgtaaagatgcaggtgtccaggctaaacttccaagatcatccaataaaaggaacacttccttttacttttctccttaggaaaaaaaagaaaaaaaagaaagcgaagagcaccgaaag，
构建好的载体命名为Pro：：GFP(如图2所示)。
2)分析发现LOC_Os04g57220基因5’UTR区被104bp的内含子分隔，为检测包括内含子是否对基因表达的影响，扩增启动子及包括内含子的5’UTR区(SEQ ID NO.3)，使用所述引物：
intron-F：5’-gagtgtcgtgctccaccatgcgctaagttaaaaatagatat-3’
intron-R：5’-ctcttcttcttaggagccatcgatcaaaccctaatcaccc-3’
SEQ ID NO.3：
cgctaagttaaaaatagatataaactctgtaaagatgcaggtgtccaggctaaacttccaagatcatccaataaaaggaacacttccttttacttttctccttaggaaaaaaaagaaaaaaaagaaagcgaagagcaccgaaaggcgaatctaagcgcgtccagcgtaagcatcacgcgagtcgtcggcgcgcgcggatccccgatcggacggtccacgttgccccgtcgccctataaattggtccccccgtctcccccacccaaatcctccccgactcctcgcagcttcctcttgtttttcttggccgaaccccccctcgacacgccgtcgccgccgaggggagagagagagaggccgccggccgccgctaccactgaccccccccctcgccggagcgccccgtcgccggtcggtacgcgtctctaggcccccctctctctctcgatttgatcggtttgatctgtggtgccctaggtttgatctgtggatttattttttttcttgttttgtgggggtgattagggtttgatcg
构建好的载体命名为Pro+Intron+UTR：：GFP(如图2所示)。
3)为检测单独5’UTR序列对基因表达的影响，扩增启动子和5’UTR序列(SEQ IDNO.4)，
UTR-F：5’-gagtgtcgtgctccaccatgcgctaagttaaaaatagatat-3’
UTR-R：5’-ctcttcttcttaggagccatcggcgacggggcgctccggc-3’
SEQ ID NO.4：
cgctaagttaaaaatagatataaactctgtaaagatgcaggtgtccaggctaaacttccaagatcatccaataaaaggaacacttccttttacttttctccttaggaaaaaaaagaaaaaaaagaaagcgaagagcaccgaaaggcgaatctaagcgcgtccagcgtaagcatcacgcgagtcgtcggcgcgcgcggatccccgatcggacggtccacgttgccccgtcgccctataaattggtccccccgtctcccccacccaaatcctccccgactcctcgcagcttcctcttgtttttcttggccgaaccccccctcgacacgccgtcgccgccgaggggagagagagagaggccgccggccgccgctaccactgaccccccccctcgccggagcgccccgtcgccg，
构建好的载体命名为Pro+UTR：：GFP(如图2所示)。
3、水稻原生质体制备与转化
3.1水稻原生质体制备：
(1)叶片准备。取无菌培养14天左右生长良好的新鲜水稻植株40-60株，去掉根部，备用。
(2)酶解。将水稻叶片和茎段用锋利刀片切成宽度为0.5mm的条状，速度要快，防止叶片脱水，将切好的叶片放入盛有10mL酶解液的培养皿中，置于密闭容器中用真空泵抽真空30min，用封口膜封口，置于60rpm转速的摇床上25℃黑暗条件下过夜酶解。
(3)过滤。将过夜酶解的粗酶液通过预先用2mL W5 washing Buffer润洗过的孔径40,μm的细胞筛进行过滤，去除酶解不充分的杂质。
(4)提纯。将过滤过的细胞酶解液转移到两个15mL离心管中，每管6mL细胞酶解液，用装有长针头的注射器吸取16mL 0.55M蔗糖，每管细胞酶解液底部加入8mL 0.55M蔗糖，注意：加蔗糖时，针头伸入底部，推动注射器，随着液面升高，缓慢上移注射器，动作要轻柔，防止对原生质体细胞造成破坏。1000g离心5min。
(5)清洗。取50mL离心管一个，加入10mL Washing buffer，置于试管架上。用装有长针头的注射器吸取8mL Washing buffer，再将针头伸到上步离心后的中间细胞层，慢慢吸取该层的所有原生质体，然后小心转移至盛有10mL Washing buffer的50mL离心管中。轻弹混匀，100g室温离心5min。
(6)重复清洗一次。移除上清，沿壁慢慢加入10mL Washing buffer，轻弹混匀，100g离心2min。
(7)重悬。去掉上清，加入5mL Washing buffer，注意沿壁缓慢加入，轻弹混匀，使细胞保持悬浮。
(8)计数。吸取100μL细胞用于计数，取6-7μL细胞置于细胞计数板进行计数，如果细胞数目太多可采用MGG稀释后再进行计数。
(9)细胞稀释。根据计数结果取适量细胞悬浮液进行离心，然后用MGG Buffer重悬细胞，最终将细胞稀释至1×106个/mL，用于原生质体转化。
3.2水稻原生质体的转化：
(1)质粒的准备。采用质粒小提试剂盒(TIANGEN，Cat#DP-106)提取以下质粒：Pro：：GFP，Pro+Intron+UTR：：GFP和Pro+UTR：：GFP。确保其浓度尽量在500ng/μL以上，整个过程最好为无菌操作。质粒置于-20℃冰箱冻存。使用前以离心机最高转速进行离心10min处理，使杂质沉淀于离心管底部，避免因杂质影响原生质体转化的效率。处理好的质粒用MGG Buffer稀释到实验所需质粒浓度，稀释后充分混匀备用。
(2)PEG介导的转化。将上述准备好的质粒(Pro：：GFP，Pro+Intron+UTR：：GFP和Pro+UTR：：GFP)中加入200μL按照2.2.6制备过程制备的原生质体细胞，轻弹混匀。然后，每管加入210-230μL 40％PEG(PEG加入量与质粒体积相关，确保等体积加入)，轻弹混匀，直至细胞均匀悬浮于PEG当中，从第一管加入PEG开始计时，计时20min。从第一管加入到最后一管加入的时间尽量控制在5min以内。
(3)清洗。加入PEG反应20min后，每管加入1mL W5 Washing Buffer，终止反应，轻轻颠倒混匀，250g离心5min。
(4)重复清洗一次。用枪轻轻吸掉上清，重新加入800μL Washing Buffer，轻轻颠倒混匀，150g离心5min，轻轻吸掉上清。
(5)细胞重悬与培养。取40mm培养皿加入2mL W5 Buffer，再取培养皿中的W5Buffer重悬离心管中的细胞，并全部转移至培养皿中，25℃黑暗培养，两天后在显微镜下观察荧光。
4、荧光显微镜观察
使用高内涵细胞成像系统进行观察。GFP使用的激发波长为488nm，吸收波长为490-540nm。所有的荧光实验至少重复三次。Pro：：GFP，Pro+Intron+UTR：：GFP和Pro+UTR：：GFP质粒分别转化原生质体后，在转化子中观察，结果如图2所示。LOC_Os04g57220基因转录起始位点上游序列且位于开放染色质区域的定义为启动子，当启动子调控GFP表达时，观察到微弱荧光信号；当包括内含子的5’UTR区和启动子一同调控GFP表达时，在原生质体中观察到明显的荧光信号；当仅有5’UTR区和启动子调控GFP表达时，依然是微弱的荧光信号。实验结果表明，LOC_Os04g57220基因启动子启动GFP本底水平的表达，呈现微弱荧光。5’UTR区对GFP的表达没有影响。在内含子存在的情况下，GFP表达明显增强，故观察到强荧光信号。说明该内含子能够增强基因的表达。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种水稻内含子及其活性鉴定方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 104
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtcggtacgc gtctctaggc ccccctctct ctctcgattt gatcggtttg atctgtggtg 60
ccctaggttt gatctgtgga tttatttttt ttcttgtttt gtgg 104
<210> 2
<211> 144
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgctaagtta aaaatagata taaactctgt aaagatgcag gtgtccaggc taaacttcca 60
agatcatcca ataaaaggaa cacttccttt tacttttctc cttaggaaaa aaaagaaaaa 120
aaagaaagcg aagagcaccg aaag 144
<210> 3
<211> 534
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgctaagtta aaaatagata taaactctgt aaagatgcag gtgtccaggc taaacttcca 60
agatcatcca ataaaaggaa cacttccttt tacttttctc cttaggaaaa aaaagaaaaa 120
aaagaaagcg aagagcaccg aaaggcgaat ctaagcgcgt ccagcgtaag catcacgcga 180
gtcgtcggcg cgcgcggatc cccgatcgga cggtccacgt tgccccgtcg ccctataaat 240
tggtcccccc gtctccccca cccaaatcct ccccgactcc tcgcagcttc ctcttgtttt 300
tcttggccga accccccctc gacacgccgt cgccgccgag gggagagaga gagaggccgc 360
cggccgccgc taccactgac cccccccctc gccggagcgc cccgtcgccg gtcggtacgc 420
gtctctaggc ccccctctct ctctcgattt gatcggtttg atctgtggtg ccctaggttt 480
gatctgtgga tttatttttt ttcttgtttt gtgggggtga ttagggtttg atcg 534
<210> 4
<211> 410
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgctaagtta aaaatagata taaactctgt aaagatgcag gtgtccaggc taaacttcca 60
agatcatcca ataaaaggaa cacttccttt tacttttctc cttaggaaaa aaaagaaaaa 120
aaagaaagcg aagagcaccg aaaggcgaat ctaagcgcgt ccagcgtaag catcacgcga 180
gtcgtcggcg cgcgcggatc cccgatcgga cggtccacgt tgccccgtcg ccctataaat 240
tggtcccccc gtctccccca cccaaatcct ccccgactcc tcgcagcttc ctcttgtttt 300
tcttggccga accccccctc gacacgccgt cgccgccgag gggagagaga gagaggccgc 360
cggccgccgc taccactgac cccccccctc gccggagcgc cccgtcgccg 410

Claims (6)

1.一种水稻内含子，序列如SEQ ID NO.1。
2.根据权利要求1所述的水稻内含子，其特征在于：所述水稻为禾本科稻属粳稻日本晴(Oryza sativa L.spp.Japonica var.Nipponbare)。
3.根据权利要求2所述的水稻内含子，其特征在于：以水稻为禾本科稻属粳稻日本晴基因组DNA为模板，扩增得到104bp的扩增产物。
4.根据权利要求3所述的水稻内含子，其特征在于：所述扩增用的引物为序列如下：
正向F：5’-gtcggtacgcgtctctaggc-3’；
反向R：5’-ccacaaaacaagaaaaaaa-3’。
5.权利要求1所述的水稻内含子的活性鉴定方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)构建LOC_Os04g57220启动子驱动GFP的表达载体，命名为Pro：：GFP，LOC_Os04g57220自身的启动子序列为SEQ ID NO.2，
扩增引物为：
promoter-F：5’-gagtgtcgtgctccaccatgcgctaagttaaaaatagatat-3’
promoter-R：5’-ctcttcttcttaggagccatctttcggtgctcttcgctttc-3’；
(2)构建启动子及包括内含子的5’UTR区序列(SEQ ID NO.3)调控GFP表达的载体，命名为Pro+Intron+UTR：：GFP，
扩增引物为：
intron-F：5’-gagtgtcgtgctccaccatgcgctaagttaaaaatagatat-3’；
intron-R：5’-ctcttcttcttaggagccatcgatcaaaccctaatcaccc-3’；
(3)构建启动子和5’UTR序列(SEQ ID NO.4)调控GFP表达载体，命名为Pro+UTR：：GFP，
扩增引物为：
UTR-F：5’-gagtgtcgtgctccaccatgcgctaagttaaaaatagatat-3’；
UTR-R：5’-ctcttcttcttaggagccatcggcgacggggcgctccggc-3’；
(4)水稻原生质体的制备与转化；
(5)转化后根据荧光信号强弱对LOC_Os04g57220基因5’UTR区的104bp内含子活性进行验证。
6.根据利要求5所述的水稻内含子的活性鉴定方法，其特征在于：使用高内涵细胞成像系统进行荧光信号强弱观察。
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