CN114292845B - 一种强活性的水稻启动子序列及验证方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种强活性的水稻启动子序列及验证方法，基因序列如SEQ ID NO.1。方法包括：(1)OsUBQ启动子序列扩增，构建OsUBQ驱动GFP的表达载体；(2)Ubi1启动子序列扩增，构建由Ubi1驱动的GFP表达载体；(3)使用CaMV35S启动子为正对照；(4)水稻原生质体制备与转化；(5)在瞬时表达系统通过荧光强度评估三个启动子CaMV35S、OsUBQ和Ubi1活性。本发明的水稻启动子序列，本质是DNA分子，1405bp，能够启动基因的表达并且活性更强。
Description
技术领域
本发明涉及启动子及验证方法，特别涉及一种强活性的水稻启动子序列及验证方法。
背景技术
植物启动子在转录水平上对基因的表达调控起着非常重要的作用。大多数启动子位于基因5’端转录起始位点上游。启动子序列包含基因转录所需的RNA聚合酶复合物的结合位点及转录因子结合位点，当基因被调控表达时，这些位点能够被转录因子特异性识别和结合，进而招募RNA聚合酶组装成复合体，启动子决定起始位置和转录的方向。研究表明，大多数启动子位于染色体上的开放染色质区域。在基因工程研究中，启动子是影响外源转基因表达效率的重要因素之一。实践上需要高效的启动子用于驱动外源基因表达，以便在转基因植株中获得较好的农艺性状。因此，组成型表达的强启动子具有较广的应用前景。
发明内容
发明目的：本发明目的是提供一种强活性的水稻启动子序列。
本发明另一目是提供所述强活性的水稻启动子序列的验证方法。
技术方案：本发明提供一种强活性的水稻启动子序列，基因序列如SEQ ID NO.1。
进一步地，用引物以粳稻日本晴(Oryza sativa L.spp.Japonicavar.Nipponbare)的基因组DNA为模板，扩增得到1405bp的扩增产物，即SEQ ID NO.1。
进一步地，所述引物序列如下：
正向F：5’-CTGCAAATACTGCAAAGAAT-3’；
反向R：5’-AAGAGGCGAGGAGGGGGTGG-3’。
进一步地，
所述的水稻启动子活性检测的具体方法，如下：
1)LOC_Os06g46770基因在各个组织中表达量较高，为组成型表达。在它的转录起始位点上游的1405bp序列，定义为启动子序列OsUBQ(SEQ ID NO.1)。
2)为验证OsUBQ启动子活性，构建OsUBQ驱动GFP的表达载体。
3)已发表的该基因Ubil启动子序列与本实验中预测的启动子之间的序列分析。
4)Ubi1启动子序列扩增，构建由Ubi1驱动的GFP表达载体。
5)使用CaMV35S启动子为正对照。
6)水稻原生质体制备与转化。
7)在瞬时表达系统评估三个启动子CaMV35S、OsUBQ和Ubi1活性。
鉴定原理：
研究发现大多数启动子位于染色体上的开放染色质区域。通常启动子位于基因转录起始位点上游。利用启动子的位置特征和开放染色质图谱可以有效预测基因的启动子区。本发明中发现LOC_Os06g46770基因的启动子OsUBQ，在瞬时表达体系中其活性较强，强于与已发表的Ubi1启动子。
有益效果：本发明的水稻启动子序列，本质是DNA分子，1405bp，能够启动基因的表达并且活性更强。
附图说明
图1 LOC_Os06g46770基因结构示意图；
图2瞬时表达系统检测三个启动子CaMV35S、OsUBQ和Ubil活性。
具体实施方式
本实施例的启动子获取及鉴定方法如下：
1.LOC_Os06g46770启动子介绍
LOC_Os06g46770基因编码泛素蛋白，该基因在茎、叶、花序、根等组织中表达较强，呈现组成型表达特点。从植物PlantDHS(http：//plantdhs.org/)数据库中获得水稻开放染色质(DNase-seq)数据，依据开放染色质特征预测该基因的启动子序列。在该基因的转录起始位点上游，约1.4kb的区间内存在2个开放染色质位点，图1所示。因此克隆这段DNA序列(1405bp，SEQ ID NO.1)并命名为OsUBQ启动子作为后续实验分析。
设计序列特异性引物，制备如下引物：
正向F：5’-CTGCAAATACTGCAAAGAAT-3’；
反向R：5’-AAGAGGCGAGGAGGGGGTGG-3’。
用以上引物以粳稻日本晴的基因组DNA为模板，扩增得到1405bp的扩增产物。经测序，扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的自5’端第一位至1045位所示。
2.载体构建
查阅文献得知，已有研究报道过LOC_Os06g46770基因的启动子并命名为Ubi1启动子，文献如下：Bhattacharyya，J.，Chowdhury，A.H.，Ray，S.et al.Native polyubiquitinpromoter of rice provides increased constitutive expression in stabletransgenic rice plants.Plant Cell Rep 31，271-279(2012).
经过生物信息学分析，发现本实验中使用的OsUBQ启动子与已发表的Ubi1启动子在序列上不同，OsUBQ启动子序列为基因转录起始位点上游1405bp，包含两个开放染色质位点。Ubi1启动子长度为1537bp，包括基因转录起始位点上游683bp序列(此区域仅有一个开放染色质位点)和转录起始位点下游的854bp序列(这段序列有5’UTR和内含子)。在本实验中分别构建上述两个启动子的检测载体，具体操作如下：
2.1骨架载体的准备
GFP报告基因载体由电子科技大学张勇课题组提供。用Xba I和Asc I限制性内切酶切除掉原有的启动子序列得到线性化的骨架载体。
2.2启动子序列的扩增
本实验中预测的OsUBQ启动子序列用如下引物扩增：
正向F：5’-CTGCAAATACTGCAAAGAAT-3’；
反向R：5’-AAGAGGCGAGGAGGGGGTGG-3’。
Ubi1启动子序列用如下引物扩增：
正向F：5’-CACATCAGTCTCTGCACAAA-3’；
反向R：5’-CTGCACACACAATTACCGAA-3’。
本实验用CaMV35S启动子为正对照，其序列为公开发表序列。
2.3载体构建
使用无缝克隆重组酶(诺维赞，C112)将载体与片段连接起来，即将目标启动子序列放置于GFP基因序列的5’端，将连接产物转化感受态细胞DH5α，选取阳性克隆，测序验证并保菌待用。
3.水稻原生质体制备与转化
3.1水稻原生质体制备：
(1)叶片准备。取无菌培养14天左右生长良好的新鲜水稻植株40-60株，去掉根部，备用。
(2)酶解。将水稻叶片和茎段用锋利刀片切成宽度为0.5mm的条状，速度要快，防止叶片脱水，将切好的叶片放入盛有10ml酶解液的培养皿中，置于密闭容器中用真空泵抽真空30min，用封口膜封口，置于60rpm转速的摇床上25℃黑暗条件下过夜酶解。
(3)过滤。将过夜酶解的粗酶液通过预先用2ml W5 washing Buffer润洗过的孔径40μm的细胞筛进行过滤，去除酶解不充分的杂质。
(4)提纯。将过滤过的细胞酶解液转移到两个15ml离心管中，每管6ml细胞酶解液，用装有长针头的注射器吸取16ml 0.55M蔗糖，每管细胞酶解液底部加入8ml 0.55M蔗糖，注意：加蔗糖时，针头伸入底部，推动注射器，随着液面升高，缓慢上移注射器，动作要轻柔，防止对原生质体细胞造成破坏。1000g离心5min。
(5)清洗。取50ml离心管一个，加入10ml Washing buffer，置于试管架上。用装有长针头的注射器吸取8ml Washing buffer，再将针头伸到上步离心后的中间细胞层，慢慢吸取该层的所有原生质体，然后小心转移至盛有10ml Washing buffer的50ml离心管中。轻弹混匀，100g室温离心5min。
(6)重复清洗一次。移除上清，沿壁慢慢加入10ml Washing buffer，轻弹混匀，100g离心2min。
(7)重悬。去掉上清，加入5ml Washing buffer，注意沿壁缓慢加入，轻弹混匀，使细胞保持悬浮。
(8)计数。吸取100μl细胞用于计数，取6-7μl细胞置于细胞计数板进行计数，如果细胞数目太多可采用MGG稀释后再进行计数。
(9)细胞稀释。根据计数结果取适量细胞悬浮液进行离心，然后用MGG Buffer重悬细胞，最终将细胞稀释至1×106个/ml，用于原生质体转化。
3.2水稻原生质体的转化：
(1)质粒的准备。采用质粒小提试剂盒(TIANGEN，Cat#DP-106)提取以下质粒：CaMV35S：：GFP，OsUBQ：：GFP和Ubi1：：GFP。确保其浓度尽量在500ng/μl以上，整个过程最好为无菌操作。质粒置于-20℃冰箱冻存。使用前以离心机最高转速进行离心10min处理，使杂质沉淀于离心管底部，避免因杂质影响原生质体转化的效率。处理好的质粒用MGG Buffer稀释到实验所需质粒浓度，稀释后充分混匀备用。
(2)PEG介导的转化。将上述准备好的等量的10ug质粒(CaMV35S：：GFP，OsUBQ：：GFP和Ubi1：：GFP)中加入200μl按照2.2.6制备过程制备的原生质体细胞，轻弹混匀。然后，每管加入210-230μl 40％PEG(PEG加入量与质粒体积相关，确保等体积加入)，轻弹混匀，直至细胞均匀悬浮于PEG当中，从第一管加入PEG开始计时，计时20min。从第一管加入到最后一管加入的时间尽量控制在5min以内。
(3)清洗。加入PEG反应20min后，每管加入1ml W5 Washing Buffer，终止反应，轻轻颠倒混匀，250g离心5min。
(4)重复清洗一次。用枪轻轻吸掉上清，重新加入800μl Washing Buffer，轻轻颠倒混匀，150g离心5min，轻轻吸掉上清。
(5)细胞重悬与培养。取40mm培养皿加入2ml W5 Buffer，再取培养皿中的W5Buffer重悬离心管中的细胞，并全部转移至培养皿中，25℃黑暗培养，两天后在显微镜下观察荧光。
4.荧光显微镜观察
使用高内涵细胞成像系统进行观察。GFP使用的激发波长为488nm，吸收波长为490-540nm。所有的荧光实验至少重复三次。在转化后的细胞中观察，三个启动子CaMV35S、OsUBQ和Ubi1均能启动GFP的表达，但是荧光强度存在差异。本实验预测的OsUBQ启动子调控的GFP表达，其荧光信号最强，强于Ubi1启动子活性。由于OsUBQ启动子序列中存在两个开放染色质位点，而Ubi1启动子序列只包含一个开放染色质位点，推测开放染色质位点对基因表达有增强的作用。
序列表
<110> 扬州大学
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1.一种水稻启动子，其特征在于：所述水稻启动子的基因序列如SEQ ID NO.1所示。
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| CN112522291A (zh) * | 2020-12-23 | 2021-03-19 | 福建省农业科学院水稻研究所 | 水稻OsSH3P2基因及其应用 |
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