CN117511943A - 一种内含子dna及在增强基因表达能力中应用 - Google Patents
一种内含子dna及在增强基因表达能力中应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117511943A CN117511943A CN202311478667.8A CN202311478667A CN117511943A CN 117511943 A CN117511943 A CN 117511943A CN 202311478667 A CN202311478667 A CN 202311478667A CN 117511943 A CN117511943 A CN 117511943A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- intron
- sui1
- seq
- gene
- gfp
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 42
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 title claims abstract description 14
- 101001012787 Homo sapiens Eukaryotic translation initiation factor 1 Proteins 0.000 claims abstract description 51
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 102100029775 Eukaryotic translation initiation factor 1 Human genes 0.000 claims abstract description 24
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 8
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 39
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 27
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 21
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 claims description 16
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 15
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 14
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 4
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 claims description 4
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 4
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 4
- 240000008467 Oryza sativa Japonica Group Species 0.000 claims description 3
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 claims description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 3
- 244000184734 Pyrus japonica Species 0.000 claims description 2
- 125000000174 L-prolyl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(*)=O 0.000 claims 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 abstract description 9
- 101100311444 Oryza sativa subsp. japonica GOS2 gene Proteins 0.000 abstract description 4
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 42
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 108010044843 Peptide Initiation Factors Proteins 0.000 description 2
- 102000005877 Peptide Initiation Factors Human genes 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 20-hydroxyecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@](C)(O)[C@H](O)CCC(C)(O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 108091027974 Mature messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 1
- 241000209504 Poaceae Species 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000010377 protein imaging Methods 0.000 description 1
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000037425 regulation of transcription Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种内含子DNA及其在增强基因表达能力中的应用。内含子DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。SUI1(LOC_Os07g34589)基因的启动子能启动报告GFP基因表达，当启动子和5’UTR区的内含子共同存在时，GFP表达上升，荧光信号显著增强，说明1049bp内含子能显著促进基因表达。本发明确定了SUI1基因5’UTR区的1049bp内含子序列，并在瞬时转化体系中，验证了该内含子增强基因表达的功能。
Description
技术领域
本发明涉及一种内含子DNA及其增强基因表达能力中的应用，属于基因领域。
背景技术
真核生物基因通常由若干个外显子和内含子互相间隔连接而成。外显子是基因的编码区。内含子是非编码序列，位于基因中外显子之间。基因转录时，外显子和内含子同时被转录成前体RNA分子，内含子序列被剪切删除，而外显子保留产生有功能的成熟RNA。
由于内含子是非编码序列，因此曾被认为是“Junk”序列。随着分子生物学技术的发展，1983年，研究发现，内含子使转基因小鼠的转录效率提高了约十倍以上，指出内含子对增强基因表达有着非常重要的作用。近年来对不同物种的研究发现，即使不包含转录因子的结合位点，内含子也会增强基因的表达。这种现象被称为“内含子介导的增强”。在基因工程领域，大量实验表明通过加入内含子序列，外源基因的表达可明显改善。例如，玉米Adhl基因内含子使转基因玉米中报告基因的表达水平提高100倍。因此，内含子应用在植物基因工程领域存在巨大潜力。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种新的内含子及其在增强基因表达中的应用。
技术方案：为解决上述技术问题，本发明提供的内含子DNA的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
本发明还提供了一种表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌株，其含有所述内含子DNA。
本发明还提供了一种定性或定量鉴定内含子DNA能否增强基因表达的方法，包括以下步骤：
(1)将p1300LV载体中的CaMV35S启动子酶切去除后保留骨架载体后，与SUI1基因启动子连接，构建得到SUI1 pro:GFP质粒；
(2)PCR扩增含有SUI1基因启动子及带内含子的SUI1基因5’UTR区域的序列，利用同源重组法将其与步骤(1)得到的骨架载体连接，构建得到SUI1 pro+intron:GFP质粒；
(3)PCR扩增含有SUI1基因启动子及不带内含子的SUI1基因5’UTR区域的序列，将其与步骤(1)得到的骨架载体连接，构建得到SUI1 pro+utr:GFP质粒；
(4)将步骤(1)所述的SUI1 pro:GFP质粒、步骤(2)所述的SUI1 pro+intron:GFP质粒和步骤(3)所述的SUI1 pro+utr:GFP质粒分别转化至水稻原生质体中，观察三种质粒的相对荧光强度；
(5)当所述SUI1 pro:GFP质粒有相对荧光强度，且所述SUI1 pro+intron:GFP质粒的相对荧光强度高于SUI1 pro+utr:GFP质粒的相对荧光强度时，权利要求1所述内含子DNA增强了GFP基因的表达；当所述SUI1 pro:GFP质粒没有相对荧光强度，或所述SUI1 pro+intron:GFP质粒的相对荧光强度不高于SUI1 pro+utr:GFP质粒的相对荧光强度时，权利要求1所述内含子DNA没有增强GFP基因的表达。
其中，步骤(1)中所述SUI1基因启动子由引物对扩增得到，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
其中，步骤(2)中扩增所述序列的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10所示。
其中，步骤(2)中所述序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
其中，步骤(3)中扩增所述序列的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.12所示。
其中，步骤(3)中所述序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
其中，步骤(4)中的水稻包括禾本科稻属粳稻日本晴(Oryza sativaL.spp.Japonica var.Nipponbare)。
本发明还提供了所述内含子DNA或所述表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌株在增强基因表达能力中的应用。
鉴定原理：
转录水平的调控是影响基因表达调控的重要层次之一。基因的启动子如同“开关”决定转录的起始。启动子与其它调控元件(如增强子和内含子)联合作用，决定基因表达的强弱。本发明中发现SUI1基因5’UTR区的1049bp内含子能够增强基因表达。SUI1(LOC_Os07g34589)基因的启动子能启动报告GFP基因表达，当启动子和5’UTR区的内含子共同存在时，GFP表达上升，荧光信号显著增强，说明1049bp内含子能显著促进基因表达。本发明确定了SUI1基因5’UTR区的1049bp内含子序列，并在瞬时转化体系中，验证了该内含子增强基因表达的功能。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：本发明的内含子DNA分子为1049bp，对转录具有较好的增强效果。
附图说明
图1为SUI1(LOC_Os07g34589)基因结构示意图；
图2为SUI1 pro:GFP、SUI1 pro+utr:GFP和SUI1 pro+intron:GFP载体组成示意图和原生质体中内含子活性检测结果；
图3为原生质体中相对荧光强度的统计图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
本实施例的内含子获取及鉴定方法如下：
1、内含子
LOC_Os07g34589基因编码翻译起始因子(translation initiation factor，SUI1)。在水稻基因组公共数据库(RGAP，http://rice.plantbiology.msu.edu/)中检索该基因信息。
在不同组织转录组数据中发现，该基因在茎、叶、花序、胚、胚乳和种子中均有较高表达。分析SUI1基因结构，发现其转录本中，5'UTR包含一段长1049bp的内含子序列(图1)。利用植物开放染色质数据PlantDHS(http://plantdhs.org/)进一步分析，发现SUI1基因转录起始位点处存在开放染色质位点，据此预测SUI1基因启动子区为转录起始位点上游290bp的序列。同时，SUI1基因转录起始位点处的开放染色质区域也覆盖5'UTR区域。此外，在5'UTR和第一个内含子处富集较高水平的H3K27Ac活性组蛋白修饰。扩增得到1049bp内含子序列。
设计序列特异性引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司制备如下引物：
正向F:SEQ ID NO.5:5’-GTCGAGTTCTTGGTCGATCT-3’；
反向R:SEQ ID NO.6:5’-CTGCACAAAGGAAATGAATC-3’。
用以上引物以粳稻日本晴的基因组DNA为模板，使用PCR体系及步骤扩增得到1049bp的目标DNA片段。
其中，PCR扩增体系如下(使用诺维赞公司高保真酶Phanta Max Super-FidelityDNAPolymerase，货号P505)：
50μL反应体系：2×PhantaMax Buffer 25μL；dNTPmix(10mmol/L)1μL；Phanta MaxSuper-Fidelity DNAPolymerase(100U)1μL；上游和下游引物(10μmol/L)各2μL；模板(30ng)1μL；ddH2O补足至50μL。
PCR反应条件：95℃预变性3min；95℃变性15s，根据引物Tm值设置退火温度，根据基因长度设置72℃延伸时间，30个循环；最后72℃延伸5min。
经测序，扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的自5’端第一位至1049位所示，
如图1所示。
SEQ ID NO.1：
GTCGAGTTCTTGGTCGATCTCTTCCCTCCTCCACCTCCTCCTCACAGGGTATGTGCCTCCCTTCGGTTGTTCTTGAATTTATTGTTCTAGGTTGTGTAGTACGGGCCTTGATGTTAGGAAAGGGGATCTGTATCTGTGATGATTCCTGTTCTTGGATTTGGGATAGAGGGGTTCTTGATGTTGCATGTTATCGGTTCGGTTTGATTAGTAGTATGGTTTTCAATCGTCTGGAGAGCTCTATGGAAATGAAATGGTTTAGGGATCGGAATCTTGCGATTTTGTGAGTACCTTTTGTTTGAGGTAAAATCAGAGCACCGGTGATTTTGCTTGGTGTAATAAAGTACATTTGTTTGGTCCTCGATTCTGGTAGTGATGCTTCTCGATTTGACGAAGCTATCCTTTGTTTATTCCCTATTGAACAAAAATAATCCAACTTTGAAGACGGTCCCGTTGATGAGATTGAATGATTGATTCTTAAGCCTGTCCAAAATTTCGCAGCTGGCTTGTTTAGATACAGTAGTCCCCATCACGAAATTCATGAAAACAGTTATAATCCTCAGGAACAGGGGATTCCCTGTTCTTCCGATTTGCTTTAGTCCCAGAATTTTTTTTCCCAAATATCTTAAAAAGTCACTTTCTGGTTCAGTTCAATGAATTGATTGCTACAAATAATGCTTTTATAGCGTTATCCTAGCTGTAGTTCAGTTTATAGGTAATACCCCTATAGTTTAGTCAGGAGAAGAACTTATCCGATTTCTGATCTCCATTTTTAATTATATGAAATGAACTGTAGCATAAGCAGTATTCATTTGGATTATTTTTTTTATTAGCTTTCACCCCTTCATTATTCTGAGCTGAAAGTCTGGCATGAACTGTCCTCAATTTTGTTTTCAAATTCACATCGATTATCTATCGATTATCCTCTTGTATCTACCTGTAGAAGTTTCTTTTTGGTTATTCCTTGACTGCTTGATTACAGAAAGAAATTTATGAAGCTGTAATCGGGATAGTTATACTGCTTGTTCTTATGATTCATTTCCTTTGTGCAG
2、活性检测
由于内含子能增强基因表达，为检测内含子序列(SEQ ID NO.1)对报告基因GFP表达的影响，构建如下三个质粒：
1)首先检测SUI1基因启动子的活性，评估其活性强弱。使用p1300LV载体(专利ZL202010234221.0中使用过该载体)该载体中含有CaMV35S启动子和GFP基因。使用限制性内切酶SacⅠ和NcoⅠ(NEB公司)依照标准酶切体系在37℃条件下酶切p1300LV载体，以去除CaMV35S启动子，仅保留骨架载体。其中，酶切体系如下：50μL酶切体系：10×NEB buffer 5μL；SacⅠ1μL；NcoⅠ1μL；质粒1μg；ddH2O补足至50μL。
使用如下引物(SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8)进行PCR扩增得到SUI1基因启动子序列，利用同源重组法和骨架载体片段连接，构建得到SUI1 pro:GFP质粒(如图2所示，其中BF指明场成像；GFP指GFP绿色荧光蛋白成像；Merged指将明场和GFP通道成像合并)，该质粒包括SUI1 pro，GFP和TER(转录终止序列)。
SUI1基因启动子序列(SEQ ID NO.2)，长度为290bp,使用所述引物按照上述PCR体系及步骤进行扩增：
SUI1 pro-F:SEQ ID NO.7:5’-CTATTTAGGTTTTTCACATAC-3’
SUI1 pro-R:SEQ ID NO.8:5’-CCCTCTTCTTGGCTTGGATG-3’
SEQ ID NO.2:
CTATTTAGGTTTTTCACATACAAAAAAAAAAAGAATTTTGCTCGTGCGCGAGCGCCAATCTCCCATATTGGGCACACAGGCAACAACAGAGTGGCTGCCCACAGAACAACCCACAAAAAACGATGATCTAACGGAGGACAGCAAGTCCGCAACAACCTTTTAACAGCAGGCTTTGCGGCCAGGAGAGAGGAGGAGAGGCAAAGAAAACCAAGCATCCTCCTCCTCCCGTCTATAAATTCCTCCCCCCTTTTCCCCTCTCTATATAGGAGGCATCCAAGCCAAGAAGAGGG
2)检测SUI1基因启动子和带内含子的5’UTR共同调控报告GFP表达，用于评估内含子是否增强报告基因表达。扩增序列SEQ ID NO.3包括290bp启动子及1150bp带内含子的5’UTR，使用如下引物(SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10)按照上述PCR体系及步骤进行扩增。扩增片段利用同源重组法和步骤1)中得到的骨架载体连接，构建得到SUI1 pro+intron:GFP质粒(如图2所示)。
使用所述引物：
SUI1 intron-F：SEQ ID NO.9:5’-CTATTTAGGTTTTTCACATAC-3’
SUI1 intron-R：SEQ ID NO.10:5’-GAAACTTTGCTGGTGAAAGT-3’
SEQ ID NO.3：
CTATTTAGGTTTTTCACATACAAAAAAAAAAAGAATTTTGCTCGTGCGCGAGCGCCAATCTCCCATATTGGGCACACAGGCAACAACAGAGTGGCTGCCCACAGAACAACCCACAAAAAACGATGATCTAACGGAGGACAGCAAGTCCGCAACAACCTTTTAACAGCAGGCTTTGCGGCCAGGAGAGAGGAGGAGAGGCAAAGAAAACCAAGCATCCTCCTCCTCCCGTCTATAAATTCCTCCCCCCTTTTCCCCTCTCTATATAGGAGGCATCC AAGCCAAGAAGAGGGAGAGCACCAAGGACACGCGACTAGCAGAAGCCGAGCGACCGCCTCCTCGATCCATATCTTCCGGTCGAGTTCTTGGTCGATCTCTTCCCTCCTCCACCTCCTCCTCACAGGGTATGTGCCTCCCTTCGGTTGTTCTTGAATTTATTGTTCTAGGTTGTGTAGTACGGGCCTTGATGTTAGGAAAGGGGATCTGTATCTGTGATGATTCCTGTTCTTGGATTTGGGATAGAGGGGTTCTTGATGTTGCATGTTATCGGTTCGGTTTGATTAGTAGTATGGTTTTCAATCGTCTGGAGAGCTCTATGGAAATGAAATGGTTTAGGGATCGGAATCTTGCGATTTTGTGAGTACCTTTTGTTTGAGGTAAAATCAGAGCACCGGTGATTTTGCTTGGTGTAATAAAGTACATTTGTTTGGTCCTCGATTCTGGTAGTGATGCTTCTCGATTTGACGAAGCTATCCTTTGTTTATTCCCTATTGAACAAAAATAATCCAACTTTGAAGACGGTCCCGTTGATGAGATTGAATGATTGATTCTTAAGCCTGTCCAAAATTTCGCAGCTGGCTTGTTTAGATACAGTAGTCCCCATCACGAAATTCATGAAAACAGTTATAATCCTCAGGAACAGGGGATTCCCTGTTCTTCCGATTTGCTTTAGTCCCAGAATTTTTTTTCCCAAATATCTTAAAAAGTCACTTTCTGGTTCAGTTCAATGAATTGATTGCTACAAATAATGCTTTTATAGCGTTATCCTAGCTGTAGTTCAGTTTATAGGTAATACCCCTATAGTTTAGTCAGGAGAAGAACTTATCCGATTTCTGATCTCCATTTTTAATTATATGAAATGAACTGTAGCATAAGCAGTATTCATTTGGATTATTTTTTTTATTAGCTTTCACCCCTTCATTATTCTGAGCTGAAAGTCTGGCATGAACTGTCCTCAATTTTGTTTTCAAATTCACATCGATTATCTATCGATTATCCTCTTGTATCTACCTGTAGAAGTTTCTTTTTGGTTATTCCTTGACTGCTTGATTACAGAAAGAAATTTATGAAGCTGTAATCGGGATAGTTATACTGCTTGTTCTTATGATTCATTTCCTTTGTGCAGTTCTTGGTGTAGCTTGCCACTTTCACCAGCAAAGTTTC
3)检测SUI1基因启动子和不含内含子的5’UTR组合的调控活性，为评估单独5’UTR对报告基因表达的影响。扩增序列SEQ ID NO.4包括启动子序列及不带内含子的5’UTR序列，长度为353bp。依照步骤2)的载体构建方法，得到SUI1 pro+utr:GFP质粒(如图2所示)。
使用所述引物：
SUI1 utr-F：SEQ ID NO.11:5’-CTATTTAGGTTTTTCACATAC-3’
SUI1 utr-R：SEQ ID NO.12:5’-CGGAAGATATGGATCGAGGA-3’
SEQ ID NO.4：
CTATTTAGGTTTTTCACATACAAAAAAAAAAAGAATTTTGCTCGTGCGCGAGCGCCAATCTCCCATATTGGGCACACAGGCAACAACAGAGTGGCTGCCCACAGAACAACCCACAAAAAACGATGATCTAACGGAGGACAGCAAGTCCGCAACAACCTTTTAA CAGCAGGCTTTGCGGCCAGGAGAGAGGAGGAGAGGCAAAGAAAACCAAGCATCCTCCTCCTCCCGTCTATAAATTCCTCCCCCCTTTTCCCCTCTCTATATAGGAGGCATCCAAGCCAAGAAGAGGGAGAGCACCAAGGACACGCGACTAGCAGAAGCCGAGCGACCGCCTCCTCGATCCATATCTTCCG
3、水稻原生质体制备与转化
3.1水稻原生质体制备：
依据已发表的文献进行制备：江云鹤,程珂,赵晓波,欧阳亦聃.(2018).水稻原生质体的分离及转化.Bio-101:e1010125.DOI:10.21769/BioProtoc.1010125.其中试剂的具体配方参见该参考文献。
(1)叶片准备。取无菌培养14天左右生长良好的新鲜水稻植株40-60株，去掉根部，备用。
(2)酶解。将水稻叶片用锋利刀片切成宽度为0.5mm的条状，速度要快，防止叶片脱水，将切好的叶片放入盛有10mL酶解液的培养皿中，置于密闭容器中用真空泵抽真空30min，用封口膜封口，置于60rpm转速的摇床上25℃黑暗条件下过夜酶解。
(3)过滤。将过夜酶解的粗酶液通过预先用2mLW5 washing Buffer润洗过的孔径40μm的细胞筛进行过滤，去除酶解不充分的杂质。
(4)提纯。将过滤过的细胞酶解液转移到两个15mL离心管中，每管6mL细胞酶解液，用装有长针头的注射器吸取16mL 0.55M蔗糖，每管细胞酶解液底部加入8mL 0.55M蔗糖，注意：加蔗糖时，针头伸入底部，推动注射器，随着液面升高，缓慢上移注射器，动作要轻柔，防止对原生质体细胞造成破坏。1000g离心5min。
(5)清洗。取50mL离心管一个，加入10mLWashingbuffer，置于试管架上。用装有长针头的注射器吸取8mLWashing buffer，再将针头伸到上步离心后的中间细胞层，慢慢吸取该层的所有原生质体，然后小心转移至盛有10mLWashingbuffer的50mL离心管中。轻弹混匀，100g室温离心5min。
(6)重复清洗一次。移除上清，沿壁慢慢加入10mLWashing buffer，轻弹混匀，100g离心2min。
(7)重悬。去掉上清，加入5mLWashingbuffer，注意沿壁缓慢加入，轻弹混匀，使细胞保持悬浮。
(8)计数。吸取100μL细胞用于计数，取6-7μL细胞置于细胞计数板进行计数，如果细胞数目太多可采用MGG稀释后再进行计数。
(9)细胞稀释。根据计数结果取适量细胞悬浮液进行离心，然后用MGG Buffer重悬细胞，最终将细胞稀释至1×106个/mL，用于原生质体转化。
3.2水稻原生质体的转化：
(1)质粒的准备。采用质粒小提试剂盒(TIANGEN，Cat#DP-106)提取以下质粒：SUI1pro:GFP，SUI1 pro+intron:GFP和SUI1 pro+utr:GFP。确保20μL质粒总量为10μg，整个过程最好为无菌操作。质粒置于-20℃冰箱冻存。使用前以离心机最高转速进行离心10min处理，使杂质沉淀于离心管底部，避免因杂质影响原生质体转化的效率。
(2)PEG介导的转化。在上述准备好的质粒(SUI1 pro:GFP，SUI1 pro+intron:GFP和SUI1 pro+utr:GFP)中加入200μL按照3.1制备过程制备的原生质体细胞，轻弹混匀。然后，每管加入220μL40％PEG，轻弹混匀，直至细胞均匀悬浮于PEG当中，从第一管加入PEG开始计时，计时20min。从第一管加入到最后一管加入的时间尽量控制在5min以内。
(3)清洗。加入PEG反应20min后，每管加入1mLW5 Washing Buffer，终止反应，轻轻颠倒混匀，250g离心5min。
(4)重复清洗一次。用枪轻轻吸掉上清，重新加入800μLWashing Buffer，轻轻颠倒混匀，150g离心5min，轻轻吸掉上清。
(5)细胞重悬与培养。取40mm培养皿加入2mLW5 Washing Buffer，再取培养皿中的W5 Washing Buffer重悬离心管中的细胞，并全部转移至培养皿中，25℃黑暗培养，两天后在显微镜下观察荧光。
4、荧光显微镜观察
使用高内涵细胞成像系统(Operetta CLS)进行观察。依照仪器说明书，选取观察绿色荧光蛋白GFP的参数设定进行观察。所有的荧光实验至少重复三次。SUI1 pro:GFP，SUI1 pro+intron:GFP和SUI1 pro+utr:GFP质粒分别转化水稻原生质体，观察转化后的原生质体细胞中荧光信号强弱，结果如图2所示。本实验依据开放染色质信息确定的SUI1基因启动子序列，当SUI1启动子调控GFP表达时，显微镜下观察到一定的荧光信号。当启动子序列连入包括1049bp内含子的5’UTR序列后，即二者共同调控GFP表达时，在原生质体细胞中观察到明显增强的荧光信号。为确定5’UTR序列是否影响转录，用仅有5’UTR序列和启动子组合调控GFP表达，观察发现其荧光信号强度与单独启动子调控的水平一致，说明仅5’UTR区对GFP的表达没有影响。实验结果证实，SUI1基因5’UTR区的1049bp内含子能够增强基因表达。根据高内涵内置软件计算相对荧光强度，定量分析后比较上述三个质粒转化后的相对荧光强度数值(图3)，发现SUI1pro+intron:GFP中相对荧光强度数值最高，约是SUI1pro:GFP的1.5倍。其中，高内涵定量分析参数设置的具体步骤为(参见Operetta CLS Usermanual)：图像输入，图像中选择全部细胞，定义感兴趣的细胞，量化细胞的荧光强度，计算不同荧光强度的细胞，鉴定出荧光强度高的细胞，将结果输出。图3的结果进一步证实SUI1基因5’UTR区的1049bp内含子能够增强基因表达。
Claims (10)
1.一种内含子DNA，其特征在于，所述DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌株，其特征在于，其含有权利要求1所述内含子DNA。
3.一种定性或定量鉴定权利要求1所述内含子DNA是否能够增强基因表达能力的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将p1300LV载体中的CaMV35S启动子酶切去除后保留骨架载体后，与SUI1基因启动子连接，构建得到SUI1 pro:GFP质粒；
(2)PCR扩增含有SUI1基因启动子及带内含子的SUI1基因5’UTR区域的序列，利用同源重组法将其与步骤(1)得到的骨架载体连接，构建得到SUI1 pro+intron:GFP质粒；
(3)PCR扩增含有SUI1基因启动子及不带内含子的SUI1基因5’UTR区域的序列，将其与步骤(1)得到的骨架载体连接，构建得到SUI1 pro+utr:GFP质粒；
(4)将步骤(1)所述的SUI1 pro:GFP质粒、步骤(2)所述的SUI1 pro+intron:GFP质粒和步骤(3)所述的SUI1 pro+utr:GFP质粒分别转化至水稻原生质体中，观察三种质粒的相对荧光强度；
(5)根据高内涵内置软件计算相对荧光强度，定量分析后比较上述三个质粒转化后的相对荧光强度数值，当所述SUI1 pro:GFP质粒有相对荧光强度，且所述SUI1pro+intron:GFP质粒的相对荧光强度高于SUI1 pro+utr:GFP质粒的相对荧光强度时，权利要求1所述内含子DNA增强了GFP基因的表达；当所述SUI1 pro:GFP质粒没有相对荧光强度，或所述SUI1pro+intron:GFP质粒的相对荧光强度不高于SUI1 pro+utr:GFP质粒的相对荧光强度时，权利要求1所述内含子DNA没有增强GFP基因的表达。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述SUI1基因启动子由引物对扩增得到，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中扩增所述序列的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述序列的核苷酸序列如SEQID NO.3所示。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)中扩增所述序列的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述序列的核苷酸序列如SEQID NO.4所示。
9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(4)中的水稻包括禾本科稻属粳稻日本晴(Oryza sativa L.spp.Japonica var.Nipponbare)。
10.权利要求1所述内含子DNA或权利要求2所述表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌株在增强基因表达能力中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311478667.8A CN117511943A (zh) | 2023-11-08 | 2023-11-08 | 一种内含子dna及在增强基因表达能力中应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311478667.8A CN117511943A (zh) | 2023-11-08 | 2023-11-08 | 一种内含子dna及在增强基因表达能力中应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117511943A true CN117511943A (zh) | 2024-02-06 |
Family
ID=89750654
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311478667.8A Pending CN117511943A (zh) | 2023-11-08 | 2023-11-08 | 一种内含子dna及在增强基因表达能力中应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117511943A (zh) |
-
2023
- 2023-11-08 CN CN202311478667.8A patent/CN117511943A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103993018B (zh) | 控制水稻株高、提高抗倒伏能力、增加有效分蘖数和产量的基因及其应用 | |
| CN115058449B (zh) | 一种利用CsWRKY43干扰以提高柑橘溃疡病抗性的方法 | |
| CN110331145B (zh) | miR156及其相关生物材料在调控植物抗病性中的应用 | |
| CN114106130B (zh) | 一种紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbJOX4及其应用 | |
| CN103772495B (zh) | 一个棉花长纤维高表达基因（GhLFHE1）及其应用 | |
| CN111690660A (zh) | 水稻转录因子基因OsMYBS1及其编码蛋白与应用 | |
| CN115820686B (zh) | 一种柑橘CsGSTU18基因及其应用 | |
| CN101519662A (zh) | 棉花油菜素内酯合成酶基因的用途及含有其的表达载体 | |
| CN117511943A (zh) | 一种内含子dna及在增强基因表达能力中应用 | |
| CN116656679A (zh) | 一种橡胶草乳管特异性表达启动子pTkREF及其表达载体和应用 | |
| CN113444738B (zh) | 棉花GhGOLS2基因在控制棉花种子萌发中的应用 | |
| CN115772212A (zh) | 紫花苜蓿叶绿体MsSAP22基因及在提高植物抗旱性中的应用 | |
| CN114480486A (zh) | 一种植物抗病毒rna沉默相关转录因子筛选方法及应用 | |
| CN114292845B (zh) | 一种强活性的水稻启动子序列及验证方法 | |
| CN110734917A (zh) | 一种长筒石蒜LlDFRc基因及其表达的蛋白和应用 | |
| CN117363628B (zh) | 一种柑橘CsMYB149基因及其增强柑橘溃疡病抗性的方法 | |
| CN108715854A (zh) | 棉花AINTEGUMENTA基因GhANT在棉花育种中的应用 | |
| CN117363629B (zh) | 一种柑橘CsGATA12基因及其增强柑橘溃疡病抗性的方法 | |
| CN117025834B (zh) | 一种转基因玉米vb15外源插入片段的旁侧序列及其应用 | |
| CN111961122B (zh) | 一种棉花tbl34基因的优势等位基因及其编码蛋白和应用 | |
| CN103255149B (zh) | BGIos040基因、构建体及其应用 | |
| CN106893723B (zh) | 植物双向启动子及其应用 | |
| CN113736781A (zh) | 一种水稻内含子及其活性鉴定方法 | |
| CN118028355A (zh) | 大豆GmFNSⅡ-2基因在调控大豆抗旱性中的应用 | |
| CN117363626A (zh) | 一种柑橘CsGATA17基因及其提高柑橘溃疡病抗性的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |