CN109182337B - 大豆盐诱导型人工合成启动子ap2及其应用 - Google Patents

大豆盐诱导型人工合成启动子ap2及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种大豆盐诱导型人工合成启动子AP2，是以大豆圣豆9号中的GmST1基因启动子区300bp(P4)和具有受盐胁迫响应的6个串联重复的GT1GMSCAM4顺式元件连接构建而成，该启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。利用启动子LUC质粒转化的原生质体相对荧光素酶活性实验证实，本发明的启动子AP2可快速高效的响应高盐诱导，预示该启动子对盐胁迫表现敏感，可应用于培育耐盐转基因植物及农作物转基因抗逆育种。

Description

大豆盐诱导型人工合成启动子AP2及其应用
技术领域
本发明涉及一种启动子，尤其涉及一种大豆盐诱导型人工合成启动子AP2及其应用。
背景技术
要实现对基因表达的精细调控，包括组织特异性表达和诱导性表达，就是如何使用分子开关启动子来调控单一基因或者多个基因针对特定的环境、生理和化学诱导来表达。近年来随着生物合成学的发展，人工合成功能元件在代谢工程领域发挥着巨大的作用，而启动子是转录水平的重要调控元件，因此，人工合成启动子对基因的精细调控在植物生长发育、组织特性、生物及非生物抗性方面将会发挥重要作用。
顺式作用元件是位于启动子上游的一段核酸序列，它通过与转录因子结合来调控基因转录效率。通过对启动子上游的顺式作用元件的改造进而可以调节启动子的活性，驱动目的基因按照所需进行特异性表达，例如能够在特定是时间和位点调控基因的表达水平。植物中通过对某些顺式作用元件的组合连接一个核心启动子来构建诱导型启动子，能够使报告基因在特定的外界刺激下进行表达。利用逆境诱导型启动子及其顺式作用元件驱动抗逆基因在转基因植物中表达是培育抗逆作物新品种的有效方法。
干旱、盐碱、低温等逆境胁迫已经严重影响了植物的生长及产量。通过胁迫诱导型启动子驱动转录因子，进而激活多个逆境诱导基因的表达，目前已经成为提高作物抗逆性的一种有效手段。但是，目前分离和鉴定的天然启动子的活性受到一定的限制，比如低表达活性和低特异性等，因此，开发利用高活性的人工合成启动子，实现对目的基因的精确调控，具有重要的科学和现实意义。将功能明确的抗逆启动子功能元件成功应用到转基因植物中调控抗逆基因的表达是植物抗逆基因工程的研究方向。
发明内容
本发明的目的是提供一种大豆盐诱导型人工合成启动子AP2及其应用。
本发明所述大豆盐诱导型人工合成启动子，其特征在于：该启动子命名为大豆盐诱导型人工合成启动子AP2，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
上述大豆盐诱导型人工合成启动子是以大豆圣豆9号中的GmST1基因启动子区300bp(P4)和受盐胁迫响应的6个串联重复的GT1GMSCAM4顺式元件连接构建而成，属于一种人工合成启动子的构建，命名为大豆盐诱导型人工合成启动子AP2。
本发明还提供了一种含有上述大豆盐诱导型人工合成启动子AP2的报告基因LUC表达载体pGmST1::BM2::P4::pGreenII-0800LUC。
本发明所述大豆盐诱导型人工合成启动子AP2在受盐诱导高效启动目标基因表达中的应用，以及在培育耐盐转基因植物中的应用。
构建上述大豆盐诱导型人工合成启动子AP2，并将其构建的人工合成载体转入拟南芥叶片原生质体中，通过拟南芥叶肉细胞原生质体瞬时转染体系，检测盐、非盐条件下启动子LUC质粒转化的原生质体相对荧光素酶活性，结果表明本发明所述大豆盐诱导型人工合成启动子AP2可快速高效的响应高盐诱导。
本发明提供了一种大豆盐诱导型人工合成启动子AP2，实验证实该启动子在盐诱导下，AP2能上调驱动报告基因在转基因拟南芥原生质体中的表达，AP2启动子具有盐诱导功能，预示本发明构建的大豆人工合成启动子AP2对盐胁迫表现敏感，能够用于今后转基因耐盐调控机制研究，并广泛地应用于培育耐盐转基因植物及农作物转基因抗逆育种。
附图说明
图1为pGmST1::BM2::P4::pGreenII-0800LUC载体示意图。
图2为启动子盐诱导功能元件在盐和非盐条件下相对荧光素酶测定结果
其中：mock：为转化原生质体正常培养6h的相对荧光素酶活性；NaCl：为转化原生质体150mM NaCl处理6h的相对荧光素酶活性；-：阴性对照，为无启动子驱动的pGreenII空载对照相对荧光素酶活性；+：阳性对照，为35S::pGreenII，35S启动子驱动的相对荧光素酶活性。
具体实施方式
实施例1大豆盐诱导型人工合成启动子的设计
申请人前期研究发现：圣豆9号GmST1基因启动子区300bp(P4)为基本启动子，利用CTAB法提取圣豆9号基因组DNA，将提取的基因组DNA稀释到100ug/ul，用作扩增启动子模板。利用高保真酶HIFI(Takara)扩增目的片段并测序，同时合成具有受盐胁迫响应的6个串联重复的GT1GMSCAM4顺式元件核酸序列，并将这两段序列连接构建成人工合成启动子，命名为大豆盐诱导型人工合成启动子AP2，该启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
实施例2利用拟南芥原生质体瞬时转化技术验证大豆盐诱导型人工合成启动子AP2受盐诱导。
2.1 pGmST1::BM2::P4::pGreenII-0800LUC载体的构建
2.1.1克隆含有酶切位点的AP2启动子片段
利用双酶切-连接法构建大豆盐诱导型人工合成启动子AP2的双荧光报告载体pGmST1::BM2::P4::pGreenII-0800LUC。利用Primer5 AP2上的限制性酶切位点分析，与pGreen II-0800LUC上的多克隆位点进行比较，筛选出可用酶切位点为kpnI和Spe I。
利用AP2含有酶切位点的引物PCR扩增。
高保真酶HIFI扩增的反应体系如下(20μl体系)：
Figure BDA0001797151910000021
Figure BDA0001797151910000031
扩增条件如下：
Figure BDA0001797151910000032
反应结束后，反应液于0.8％TAE琼脂糖凝胶电泳检测。
2.1.2胶回收PCR产物
1)取500μl平衡液(BL)，添加到回收柱(CB2)中，12，000rpm，离心1min；
2)将切下带有目的片段的凝胶放入1.5ml离心管中，加入3倍体积的溶胶液，50℃溶胶10min，期间不时地翻转；
3)凝胶完全融化后，转移至平衡过的回收柱(CB2)中，12，000rpm，离心1min；
4)向吸附柱(CB2)中加600μl的漂洗液(PW)，室温2-5min，12,000rpm，离心1min；
5)重复步骤4；
6)空柱，12000rpm，离心2min；
7)将回收柱子开盖，在超净台中吹数分钟干燥后，放入灭菌的1.5ml离心管，加入40μl预热到60℃的EB缓冲液，放置1min；
8)12000rpm离心1min，所得溶液即含有回收片段。
2.1.3kpnI和Spe I分别双酶切PCR产物和pGreen II-0800LUC载体过夜。
反应体系如下：
Figure BDA0001797151910000033
37℃过夜充分酶切。
2.1.4第二天胶回收酶切产物及pGreen II-0800LUC载体
1)取500μl平衡液(BL)，添加到回收柱(CB2)中，12，000rpm，离心1min；
2)将切下带有目的片段的凝胶放入1.5ml离心管中，加入3倍体积的溶胶液，50℃溶胶10min，期间不时地翻转；
3)凝胶完全融化后，转移至平衡过的回收柱(CB2)中，12，000rpm，离心1min；
4)向吸附柱(CB2)中加600μl的漂洗液(PW)，室温2-5min，12,000rpm，离心1min；
5)重复步骤4；
6)空柱，12000rpm，离心2min；
7)将回收柱子开盖，在超净台中吹数分钟干燥后，放入灭菌的1.5ml离心管，加入40μl预热到60℃的EB缓冲液，放置1min；
8)12000rpm离心1min，所得溶液即含有回收片段。
2.1.5将回收的酶切产物和载体进行连接反应过夜。
2.1.6大肠杆菌感受态质粒转化
(1)将1-5μl连接产物加入50μl的大肠杆菌感受态细胞中，轻轻混匀，在冰上放置30min；
(2)42℃水浴热激90sec，立即放置冰上2-3min；
(3)在超净台中加入1ml LB培养基，37℃摇床上培养40-50min；
(4)室温，5000rpm，离心3min；
(5)倒掉LB培养基，将菌涂布于含有相应抗生素的培养平皿上，37℃倒置培养过夜。
2.1.7大肠杆菌PCR验证
反应体系如下(20μl体系)：
Figure BDA0001797151910000041
扩增条件如下：
Figure BDA0001797151910000042
Figure BDA0001797151910000051
PCR结束后，反应液于0.8％TAE琼脂糖凝胶电泳检测。
2.1.8DNA测序
挑取含有重组质粒的阳性单菌落用含有Amp(50mg/L)的液体LB摇过夜，然后送上海铂尚生物技术有限公司测序，得到测序结果，启动子DNA序列如序列表SEQ ID No.1所示。
2.1.9大肠杆菌质粒DNA的提取得到pGmST1::BM2::P4::pGreenII-0800LUC质粒：无内毒素质粒纯化DNA纯化体系(NucleoBond Xtra Midi EF)(MACHEREY-NAGEL)
(1).菌体培养收集：4500×g,15min,4℃
(2).菌体裂解：8ml Buffer RES-EF彻底重悬菌体，加入8ml Buffer LYS-EF裂解菌体，轻柔混匀，常温裂解5min；
(3).平衡柱子和滤头：15ml Buffer EQU-EF
(4).中和:8ml NEU-EF,轻柔混合10-15次，冰上放置5min
(5).净化和装柱裂解液：颠倒试管3次，将裂解液倒入柱子中
(6).1st洗：5ml Buffer FIL-EF
(7).去除过滤柱：去除Nucleobond Xtra Column Filter
(8).2ed洗：35ml Buffer ENDO-EF
(9).溶解：5ml ELU-EF
(14)沉淀：3.5ml异丙醇,15000g，4℃，30min
(15)清洗和干燥DNA沉淀：2ml 70％乙醇常温，5min,15000g,常温，5min
(16).溶解DNA：加入适量体积的H2O-EF，使DNA浓度达到1000ug/ml,-20℃保存。
2.2AP2启动子拟南芥叶肉细胞原生质体瞬时转化
(1)准备在土里生长的3～4周拟南芥幼苗(拟南芥未受胁迫，未抽苔，生长良好)，取5-8片展开的真叶；
(2)用新的单面刀片将叶片的中部切成0.5-1mm的小条，保证切片没有组织的挤压；
(3)将叶片条迅速且轻柔的转移到备好的酶液中，用平头镊子将叶条两边的切面都浸入酶液；
(4)将叶条在黑暗中抽真空30min黑暗中酶解3小时，轻摇后酶液呈绿色，说明原生质体解离下来；
(5)用显微镜检查原生质体，正常拟南芥叶肉细胞原生质体应约为30-50μm；
(6)用W5溶液将酶/原生质体等体积稀释；
(7)用水将75μm尼龙网上的乙醇洗净并吸去多余水分，并用W5浸湿，然后过滤上述混合物；
(8)将上清转入30ml圆底离心管，200g离心2min,尽可能去除上清，并轻柔转动重悬原生质体；
(9)用血球计数板在100倍显微镜下对原生质体计数，按2×105个/ml的比例用W5重悬原生质体，冰上静止30min；
(10)用移液器尽量吸去W5,不要碰到沉淀。按照2×105个/ml的比例用MMG重悬原生质体，并放置室温；
(11)在2ml离心管中加入10ul pGmST1::BM2::P4::pGreenII-0800LUC质粒；
(12)加入100ul原生质体(2×104个),轻柔混合；
(13)加入110ulPEG溶液，轻敲离心管充分混合，室温放置10min；
(14)在6孔板的每个孔中加入1ml 5％的牛血清溶液，晃动几下，使溶液覆盖好孔的内壁(防止原生质体贴壁)，将牛血清移去，加入1mlW5溶液清洗六孔板，移去W5溶液；
(16)在转化体系中加入440ul W5稀释，轻柔混合以终止转化反应；
(17)100g离心2min，去除上清，加入200ul W5溶液悬浮原生质体；
(18)在六孔板中加入1ml W5溶液，将转化后的原生质体转入刘孔板中，黑暗中过夜培养；
(19)重悬原生质体，100g离心2min收集，去上清，留100ul左右的液体，直接进行LUC测定，或放入-80℃保存。
2.3pGmST1::BM2::P4::pGreenII-0800LUC相对荧光素酶活性测定
利用Promega
Figure BDA0001797151910000061
Luciferase Assay System检测启动子LUC质粒转化的原生质体相对荧光素酶活性，操作参照说明书。将-80℃的原生质体拿出放在冰上融化，取20ul原生质体溶液+20ul
Figure BDA0001797151910000062
Luciferase Reagent,25℃反应10min后测定萤火虫发光值，加入20ul
Figure BDA0001797151910000063
Stop&
Figure BDA0001797151910000064
Reagent测定，25℃反应10min，测定海肾发光值。计算相对荧光素酶活性值，相对活性值＝萤火虫发光值/海肾发光值。
pGmST1::BM2::P4::pGreenII-0800LUC的相对活性值和受盐诱导情况如图2所示，结果证明，在盐诱导下，AP2能上调驱动报告基因在转基因拟南芥原生质体中的表达，AP2启动子具有盐诱导功能，能够用于今后转基因耐盐调控机制研究，并广泛地应用于培育耐盐转基因植物。
序列表
<110>山东大学
<120>大豆盐诱导型人工合成启动子AP2及其应用
<141> 2018-8-21
<160> 1
<210> 1
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 大豆盐诱导型人工合成启动子AP2
<222>（1）…（336）
<400>
gaaaaagaaa aagaaaaaga aaaagaaaaa gaaaaatcga gtgtctgcat gctttttttt 60
tttgttgagg acacgtggtg aactctaaga ggagagtaac tcaagtgggt cccacccgtc 120
caacagtaag acaaagataa ccgtacttat ctcagcccat gtgttggcta taaataacga 180
cccatgtcta ccgttttctg agaaagaaaa aaaaaaagaa aacaaaaaca tttccctgct 240
acttcatctt cttcttcttc ttcttcatca ccggtggttc tgttcattct tccttgcacc 300
ttcttctttg aagatcgaaa ttgtgttttt gaaaaa 336

Claims (4)

1.一种大豆盐诱导型人工合成启动子，其特征在于：所述启动子命名为大豆盐诱导型人工合成启动子AP2，该启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.含有权利要求1所述大豆盐诱导型人工合成启动子AP2的报告基因LUC表达载体pGmST1::BM2::P4::pGreenII-0800LUC；其中所述大豆盐诱导型人工合成启动子AP2以pGmST1::BM2::P4表示。
3.权利要求1所述大豆盐诱导型人工合成启动子AP2在受盐诱导启动目标基因表达中的应用。
4.权利要求1所述大豆盐诱导型人工合成启动子AP2在培育耐盐转基因拟南芥中的应用。
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