CN112481260B - 一种具有启动子功能的落叶松dna分子、获取及鉴定方法 - Google Patents
一种具有启动子功能的落叶松dna分子、获取及鉴定方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112481260B CN112481260B CN202011332979.4A CN202011332979A CN112481260B CN 112481260 B CN112481260 B CN 112481260B CN 202011332979 A CN202011332979 A CN 202011332979A CN 112481260 B CN112481260 B CN 112481260B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- larch
- promoter
- dna molecule
- seq
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Botany (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种具有启动子功能的落叶松DNA分子、获取及鉴定方法。启动子DNA序列如SEQ ID NO.1。用特异引物以日本落叶松(Larix kaempferi)的基因组DNA为模板，扩增得到1179bp的扩增产物，即得。将该段DNA分子启动GFP荧光蛋白基因表达，在荧光显微镜下可观察到荧光，证实该序列有功能，反之，则不能。本发明提供的落叶松启动子序列，本质是DNA分子，1179bp，能够启动转录。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术，特别涉及一种具有启动子功能的落叶松DNA分子、获取及鉴定方法。
背景技术
落叶松具有众多优良特征，如适应性广，易于栽培，成林快，材质优良等。落叶松已经成为北方地区退耕还林和荒山绿化的主要造林树种之一。因此落叶松的育苗造林具有很大发展前景。启动子是能够促使转录开始的一段DNA序列，启动子本身不被转录，通常位于基因5‘端转录起始位点上游。启动子就像“开关”，调控基因的表达。因此，对启动子的研究尤为重要。落叶松中启动子的分析与鉴定，对于深入了解其基因组信息提供重要的支撑。
发明内容
发明目的：本发明目的是提供具有启动子功能的落叶松DNA分子。
本发明另一目的是提供所述具有启动子功能的落叶松DNA分子的获取方法及鉴定方法。
技术方案：本发明提供一种具有启动子功能的落叶松DNA分子，DNA序列如SEQ IDNO.1。
所述的具有启动子功能的落叶松DNA分子的获取方法，包括如下步骤：用特异引物以日本落叶松(Larix kaempferi)的基因组DNA为模板，扩增得到1179bp的扩增产物，即得。
进一步地，所述特异引物序列如下：
正向：5’-gagtgtcgtgctccaccatgcaatgagacttcaaaccggc-3’；
反向：5’-ctcttcttcttaggagccatgtaccaaaatttgaagggcgg-3’。
进一步地，落叶松RNA-seq：将落叶松针叶和落叶松愈伤组织分别进行转录组测序，对转录本进行注释；ATAC-seq：将诱导培养的落叶松愈伤组织进行ATAC-seq测序，确定开放染色质信息；组蛋白ChIP-seq：将诱导培养的落叶松愈伤组织进行H3K27ac ChIP-seq测序，明确H3K27ac的分布特征，整合组学分析结果，预测潜在调控元件，综合测序数据，通过拼装获得落叶松序列SEQ ID NO.2，该序列中包括一个转录本，启动子位于基因的转录起始位点(TSS)上游，并且位于开放染色质区，能调控下游基因的表达，将其转录本TSS上游1.5kb具有开放染色质的序列扩增(引物同上)，最终获得SEQ ID NO.1。
所述的具有启动子功能的落叶松DNA分子的鉴定方法，包括如下步骤：
(1)将启动子DNA序列SEQ ID NO.1插入P1300LV载体中替换原有的CaMV35S启动子，构建LkPro2启动报告基因的载体；
(2)正对照载体采用P1300LV：
(3)落叶松原生质体的制备与转化；
(4)转化后对启动子活性进行荧光验证。
进一步地，所述LkPro2启动报告基因的载体的构建方法：使用限制性内切酶NcoI和BamHI将P1300LV载体线性化，后用无缝连接试剂盒将其与启动子序列片段连接，转化至大肠杆菌DH5α中，筛选阳性转化子，即得。
鉴定原理：将一段有启动子活性的DNA分子驱动GFP荧光蛋白基因表达，在荧光显微镜下可观察到荧光，证实该序列有功能。反之，则不能。
有益效果：本发明提供了落叶松启动子序列，本质是DNA分子，1179bp，能够启动转录，同时提供了快捷的鉴定方法。
附图说明
图1是正对照载体P1300LV结构示意图，是CaMV35S启动GFP表达；落叶松启动子LkPro2载体示意图和瞬时表达的检测结果。
具体实施方式
本实施例的启动子获取及鉴定方法如下：
1.LkPro2介绍
落叶松RNA-seq：将落叶松针叶和落叶松愈伤组织分别进行转录组测序，对转录本进行注释；ATAC-seq：将诱导培养的落叶松愈伤组织进行ATAC-seq测序，确定开放染色质信息；组蛋白ChIP-seq：将诱导培养的落叶松愈伤组织进行H3K27ac ChIP-seq测序，明确H3K27ac的分布特征，整合组学分析结果，预测落叶松中启动子。本研究综合测序数据，通过拼装获得一段长片段(4895bp，SEQ ID NO.2)的落叶松序列。在这段序列中包括一个转录本，其表达量较高，FPKM值为20.7499。因为启动子位于基因的转录起始位点(TSS)上游，并且位于开放染色质区，能调控下游基因的表达。因此将其转录本TSS上游1.5kb具有开放染色质的序列扩增(引物同下)，最终获得LkPro2(SEQ ID NO.1)。
设计序列特异性引物，制备如下引物：
正向：5’-gagtgtcgtgctccaccatgcaatgagacttcaaaccggc-3’；
反向：5’-ctcttcttcttaggagccatgtaccaaaatttgaagggcgg-3’。
用以上引物以日本落叶松的基因组DNA为模板，扩增得到1179bp的扩增产物。经测序，扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的自5’端第一位-1179位所示。
2.检测
将SEQ ID NO.1所示的片段插入P1300LV载体中的NcoI和BamHI酶切位点中，构建LkPro2驱动GFP蛋白的载体(如图1所示)。
3.落叶松原生质体制备
(1)愈伤准备。取无菌培养14天左右生长良好的落叶松愈伤组织。
(2)酶解。将愈伤组织用锋利刀片切成细小的块状，并转入盛有10ml酶解液的培养皿中，置于60rpm转速的摇床上25℃黑暗条件下酶解。
(3)过滤。将粗酶液通过预先用2ml W5 washing Buffer润洗过的孔径40μm的细胞筛进行过滤，去除酶解不充分的杂质。
(4)提纯。将过滤过的细胞酶解液转移到两个15ml离心管中，每管6ml细胞酶解液，用装有长针头的注射器吸取16ml0.55M蔗糖，每管细胞酶解液底部加入8ml0.55M蔗糖，注意：加蔗糖时，针头伸入底部，推动注射器，随着液面升高，缓慢上移注射器，动作要轻柔，防止对原生质体细胞造成破坏。1000g离心5min。
(5)清洗。取50ml离心管一个，加入10ml Washing buffer，置于试管架上。用装有长针头的注射器吸取8ml Washing buffer，再将针头伸到上步离心后的中间细胞层，慢慢吸取该层的所有原生质体，然后小心转移至盛有10ml Washing buffer的50ml离心管中。轻弹混匀，100g室温离心5min。
(6)重复清洗一次。移除上清，沿壁慢慢加入10ml Washing buffer，轻弹混匀，100g离心2min。
(7)重悬。去掉上清，加入5ml Washing buffer，注意沿壁缓慢加入，轻弹混匀，使细胞保持悬浮。
(8)计数。吸取100μl细胞用于计数，取10μl细胞置于细胞计数板进行计数，如果细胞数目太多可采用MGG稀释后再进行计数。
(9)细胞稀释。根据计数结果取适量细胞悬浮液进行离心，然后用MGG Buffer重悬细胞，最终将细胞稀释至1×106个/ml，用于原生质体转化。
4.落叶松原生质体的转化：
(1)质粒的准备。采用质粒小提试剂盒(TIANGEN，Cat#DP-106)提取以下质粒：CaMV35S-GFP和LkPro2-GFP质粒。确保其浓度尽量在500ng/μl以上，整个过程最好为无菌操作。质粒置于-20℃冰箱冻存。使用前以离心机最高转速进行离心10min处理，使杂质沉淀于离心管底部，避免因杂质影响原生质体转化的效率。处理好的质粒用MGG Buffer稀释到实验所需质粒浓度，稀释后充分混匀备用。
(2)PEG介导的转化。将上述准备好的质粒(CaMV35S-GFP和LkPro2-GFP)中加入200μl制备好的原生质体细胞，轻弹混匀。然后，每管加入210-230μl40％PEG(PEG加入量与质粒体积相关，确保等体积加入)，轻弹混匀，直至细胞均匀悬浮于PEG当中，从第一管加入PEG开始计时，计时20min。从第一管加入到最后一管加入的时间尽量控制在5min以内。
(3)清洗。加入PEG反应20min后，每管加入1ml W5 Washing Buffer，终止反应，轻轻颠倒混匀，250g离心5min。
(4)重复清洗一次。用枪轻轻吸掉上清，重新加入800μl Washing Buffer，轻轻颠倒混匀，150g离心5min，轻轻吸掉上清。
(5)细胞重悬与培养。取40mm培养皿加入2ml W5 Buffer，再取培养皿中的W5Buffer重悬离心管中的细胞，并全部转移至培养皿中，25℃黑暗培养，两天后在显微镜下观察荧光。
5.荧光显微镜观察
使用荧光显微镜进行观察。所有的荧光实验至少重复三次。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种具有启动子功能的落叶松DNA分子、获取及鉴定方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1179
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
caatgagact tcaaaccggc ggaaagcaac agctgcagat atcgtccaaa ccgagtagac 60
aacaacagaa ctgaaaatga tagagaacgc tgaaccgata atgccgataa aatcacaaac 120
aatccaccat aaaacagaac tgaatatgat agaggaggct gaagcgagaa cgctgataaa 180
accaccaaaa atccgccata aattacagcc ggccatgccg aaataaatgc taaacataaa 240
ttcgccatcg catccaagga ttttttttgc tcacccattt tctgggctgc caacacagtg 300
caaacactat tcactctttt tggaccaaag aaactccgcc attgccgccg aatttgcaac 360
agacagtaca tctgaacttc gagaactacg acctcacagc tggcaaaacc acaacgacac 420
gaaaccccca tacctcgcat taaacacaac aaaaaaccac gtcgaaattg gaccaaagga 480
actcagccat tgccgccgaa tttgccatct gaactacgag aacgacaggt gaaggacctc 540
aggagcggaa ggacgaccca caggcaacct ctttccacac cggagcggaa ggacgaccca 600
caaaaaaacc cgcagctgct agaacaataa caacgacgaa acctcgaaaa atctgcgaac 660
aacccagcca acatcgcatt aaacacctcg aacgatgcac acgaaaacca cctcgaaaac 720
gaaaaaccac ctcggtcaca gcatccgagg acaacccaca ccacgcggcg tgacgccatc 780
gcgccgccgc ctcctgggcc acagcatccg aggcaggcgt catcgcggac ggccccaatc 840
aaaagctaac aaaataaccc attaacaatt taaaaaaaaa caaatttttt aagttaaaca 900
ttgcgtccac cctatattca tcaacagcaa cccaaactaa tgcccttgac cgaaaaatag 960
atgtcgggga cataataaat agaaaaaatt agttaccatt cactttcaac aaatgcacct 1020
tggggtgtga atgcagtaaa ggccttgcga gtctgggact gacttttatt aatgggaaga 1080
aaccaaaggc agggtcacat gtagccgccc taagcacaga agtcatggtc acacggccca 1140
gcacgttgaa ttcgaggccc gcccttcaaa ttttggtac 1179
<210> 2
<211> 4895
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agcgaaccag caatgagact tcaaaccggc ggaaagcaac agctgcagat atcgtccaaa 60
ccgagtagac aacaacagaa ctgaaaatga tagagaacgc tgaaccgata atgccgataa 120
aatcacaaac aatccaccat aaaacagaac tgaatatgat agaggaggct gaagcgagaa 180
cgctgataaa accaccaaaa atccgccata aattacagcc ggccatgccg aaataaatgc 240
taaacataaa ttcgccatcg catccaagga ttttttttgc tcacccattt tctgggctgc 300
caacacagtg caaacactat tcactctttt tggaccaaag aaactccgcc attgccgccg 360
aatttgcaac agacagtaca tctgaacttc gagaactacg acctcacagc tggcaaaacc 420
acaacgacac gaaaccccca tacctcgcat taaacacaac aaaaaaccac gtcgaaattg 480
gaccaaagga actcagccat tgccgccgaa tttgccatct gaactacgag aacgacaggt 540
gaaggacctc aggagcggaa ggacgaccca caggcaacct ctttccacac cggagcggaa 600
ggacgaccca caaaaaaacc cgcagctgct agaacaataa caacgacgaa acctcgaaaa 660
atctgcgaac aacccagcca acatcgcatt aaacacctcg aacgatgcac acgaaaacca 720
cctcgaaaac gaaaaaccac ctcggtcaca gcatccgagg acaacccaca ccacgcggcg 780
tgacgccatc gcgccgccgc ctcctgggcc acagcatccg aggcaggcgt catcgcggac 840
ggccccaatc aaaagctaac aaaataaccc attaacaatt taaaaaaaaa caaatttttt 900
aagttaaaca ttgcgtccac cctatattca tcaacagcaa cccaaactaa tgcccttgac 960
cgaaaaatag atgtcgggga cataataaat agaaaaaatt agttaccatt cactttcaac 1020
aaatgcacct tggggtgtga atgcagtaaa ggccttgcga gtctgggact gacttttatt 1080
aatgggaaga aaccaaaggc agggtcacat gtagccgccc taagcacaga agtcatggtc 1140
acacggccca gcacgttgaa ttcgaggccc gcccttcaaa ttttggtact gttaaattaa 1200
ttaatgcata cagacttgtt ctctctgttg cctttgtatc gatcgtatac gcagcgaaga 1260
agaaattttg agctctgttg tcttgaagtt gttgacagct gctgccacgg cgttgcctct 1320
ggcccgggtc gtgtgctttg cgagtttcga tttctcgtct gccatgccca cccgcgacct 1380
tatttttctc tctctcacgc caactgggat ttccagaaca ctgaaatccc aatgcccgcc 1440
aacgcccgag gttcgaaccc ttgacctgcc tgacattcca aggctctagg gtttagaacg 1500
gaattctcga aatccgtaac agggtgctgc tggccgtgtg agattttgga tttgcggtgt 1560
gtgcgcattt ttttcatgct gattgcgagg gccggcaccc acgatttcat tgaatatctt 1620
cttaacgaag ctcgcggcag gtttcaatcc catggcatgt ccgtggatgg tgaaaatcaa 1680
aacagaaaca gactgccctg ctcgggcatc gtgaatgaca cagacgtgaa ccggtgagct 1740
tcgacctcgt gacctgcatc cggtgaaata agagcagaag cgcgtctcgg catccatggg 1800
gaactgctgc ggatctgcac aggggaaaaa gaaaagggtt aaatccagcc ccgcaggtcc 1860
aaatggccgc aagagggata atgtaggagg agatgttgcc aagattcctg tactcaaagg 1920
gtgccttgag cagagcgtcg agcagagata tttgttggac agagagctcg gaagagggga 1980
gtttggaatt acttacttgt gtactgatag agagtctcgg gaattgctgg cttgtaagtc 2040
tatttctaaa cggaagctca aaactgcgat cgacatcgaa gatgtgcggc gggaagtggc 2100
tattatgaag catttgccca aaaataataa catcgtgagc ctgaaggcca cctgtgaaga 2160
cgacaatgcc gttcatttgt tgatggaact ctgcgagggt ggggagcttt tcgatcgaat 2220
cgttgcccgg ggccattata ccgaacgtgc tgctgctgct gttacacgga caattgtgga 2280
agtcgttcag gtgagtgaca atatttacga tataatttat agtcgtagaa gtaaatccat 2340
atccacacaa caatattttc atgtatagag aaaggtaaag caagcaagca taatcacctc 2400
ccaaccgtcg tttttttatt tatatattga cacctcacga ggatcgaaga cgattcctat 2460
gtttgtccaa ttctccacat tgcaaagata gcccccaagc tcatgtttaa gaaatcagcc 2520
tctgaagatc tgtctgtcat ttttgataac tgtcagcagt tttgaagttt gtagtgtgat 2580
gaaatacggt gtcatgtaag tttctcacca aaagtttttg cgaaattggt cgaattcatg 2640
ttttcttgag gtgcactaga aatcgaatag gtttacttga gcatgaatga aatcgcagag 2700
atcctcacgt ctctgcatat taggaattat tcagtgttgc acatatctct tatttctccc 2760
aatttttact tttttatttt taaggttgtt tgagtttttc agatgtaagt ttattcttgc 2820
cgacatgttt cctcattttt gataggtttc tttctgcaca cttggtgata tattacctga 2880
aacgatatct ggaacattaa tagagagttc tcatacgtgt tctccatttt tgggacagta 2940
atggcgattt tactttgtcc gttggccgtc tttgtcgata ttgcttcaga aatcatttcc 3000
agagatcatg tctgtttatg ttatgttatc atttggtagt aattctgttc ttttgatgca 3060
gctctgccac aaacatgggg tgatccacag ggaccttaag ccagagaatt tcctgtttgc 3120
gaacaaaaag gagaattcac ctcttaaggc tattgatttt ggattatctg tattcttcaa 3180
acctggttag tcgagattca gcattcttgt atacagcatt tctgttaaaa ttttgagcag 3240
atacctactg tagctcgctc tggctgtgag gcataattat gcagggattt ttataaattc 3300
tctctgttga aggttctggc agagtgattt cctatttagt taagttgtaa aattttcagg 3360
accatcattt ttttaatatt ttaaacattg acaatacttg ccatttctac ttatgcaagg 3420
aaataattaa atcattttct ggcttcaaac cattggtgct tctcagttct aacaatataa 3480
tttgatcctt ttttttccgt attgcagggg atcgcttttc tgaaattgtt gggagtccat 3540
actatatggc accggaggtt ctgaagcgta attacggacc tgagattgac gtgtggagtg 3600
ctggtgttat cctgtatatt ttattgtgtg gcgtgccacc attttgggcc ggtaagtacc 3660
ctaggcacaa tgtcagagct agcttgtggt gcaataactg aatcctgttt gcagaagctt 3720
aaggtttctt tcctctccat attctatcat ttcaattgag gcatatgtca aggatcaaaa 3780
tatgccttta ttcttggttg ttctgcctta gaatgtatac agctcaaccg tactcaattt 3840
gtttacgttt tgtcttccaa aatatttatc agtagtggga aattgaagtg gaggatttct 3900
ataatggtga tatgcagaat cagagcaagg agttgctcag gcgattcttc gtggttttgt 3960
agacttcaaa agagagccat ggccaaaaat atccgaaact gcaaaaagtc ttgtacgcca 4020
gatgctggag cctgatccca agctacgatt aacagctcag caagtacttg gtatgttgtg 4080
ttttgtttta tgaaaaattt ctgcaggttt tgttttaaac catgacctga ttgcactgca 4140
aggcttccaa acttatgtta tgaaaggatt ttgtttctgt tgggggtagt ttttgattgt 4200
atataagcat tgattcatgt agaatatcaa aataggtaaa gaggaggaag aacacgagaa 4260
ggaagagtga aaatgtgtct cttctgtgtt aacttttgga atagggaaaa acaacgtgct 4320
tgatttaatg caggcaagac tgaatgtatg ctttcatgtt gacattaatt aatatttcca 4380
agactttgtc ttataacgag ggcgccaaag tggacttggg tgtatggaaa gatagtagca 4440
tcccaatcat tatgaagtga tcaagtggga tataagcaca tttttttttg caagagatat 4500
tttcaatatt tgaaaaaaaa atccagctcc agtagattgc aagtttttac attttcaggt 4560
ttttctcata ccattggatc ctaagtcttc tattttccct ttctgttttg aacaatatag 4620
gacatgttac atgcaattgt taatgttgcg aaaagtgaca aaaaaggcca tgtttttggc 4680
tcttaaaact aatctgattt tttttgccct tcatttaggc cttatctgaa aatttccttg 4740
attaatcaga gtctaaagta tccaagctat cctcatcact gttatccttt gtatgtaata 4800
aaatgacgca catcaccatc aaagttggag ggatccaagc tctggtcgtg atgtctacac 4860
tcaactccca tcagtctgct tctgtattga gctgg 4895
Claims (6)
1.一种具有启动子功能的落叶松DNA分子，DNA序列如SEQ ID NO.1。
2.权利要求1所述的具有启动子功能的落叶松DNA分子的获取方法，其特征在于：包括如下步骤：用特异引物以日本落叶松(Larix kaempferi)的基因组DNA为模板，扩增得到1179bp的扩增产物，即得具有启动子功能的落叶松DNA分子。
3.根据权利要求2所述的具有启动子功能的落叶松DNA分子的获取方法，其特征在于：所述特异引物序列如下：
正向：5’-gagtgtcgtgctccaccatgcaatgagacttcaaaccggc-3’；
反向：5’-ctcttcttcttaggagccatgtaccaaaatttgaagggcgg-3’。
4.权利要求1所述的具有启动子功能的落叶松DNA分子的获取方法，其特征在于：落叶松RNA-seq：将落叶松针叶和落叶松愈伤组织分别进行转录组测序，对转录本进行注释；ATAC-seq：将诱导培养的落叶松愈伤组织进行ATAC-seq测序，确定开放染色质信息；组蛋白ChIP-seq：将诱导培养的落叶松愈伤组织进行H3K27ac ChIP-seq测序，明确H3K27ac的分布特征，整合组学分析结果，预测潜在调控元件，综合测序数据，通过拼装获得落叶松序列SEQID NO.2，该序列中包括一个转录本，启动子位于基因的转录起始位点(TSS)上游，并且位于开放染色质区，能调控下游基因的表达，将其转录本TSS上游1.5kb具有开放染色质的序列扩增，最终获得SEQ ID NO.1。
5.权利要求1所述的具有启动子功能的落叶松DNA分子的鉴定方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)将启动子DNA序列SEQ ID NO.1插入P1300LV载体中替换原有的CaMV35S启动子，构建LkPro2启动报告基因的载体；
(2)正对照载体采用P1300LV；
(3)落叶松原生质体的制备与转化；
(4)转化后对启动子活性进行荧光验证。
6.根据权利要求5所述的具有启动子功能的落叶松DNA分子的鉴定方法，其特征在于：所述LkPro2启动报告基因的载体的构建方法：使用限制性内切酶NcoI和BamHI将P1300LV载体线性化，后用无缝连接试剂盒将其与启动子序列片段连接，转化至大肠杆菌DH5α中，筛选阳性转化子，即得。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011332979.4A CN112481260B (zh) | 2020-11-24 | 2020-11-24 | 一种具有启动子功能的落叶松dna分子、获取及鉴定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011332979.4A CN112481260B (zh) | 2020-11-24 | 2020-11-24 | 一种具有启动子功能的落叶松dna分子、获取及鉴定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112481260A CN112481260A (zh) | 2021-03-12 |
| CN112481260B true CN112481260B (zh) | 2022-06-14 |
Family
ID=74934052
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011332979.4A Active CN112481260B (zh) | 2020-11-24 | 2020-11-24 | 一种具有启动子功能的落叶松dna分子、获取及鉴定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112481260B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113943733A (zh) * | 2020-06-30 | 2022-01-18 | 电子科技大学 | 落叶松内源高效启动子及应用 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116376909B (zh) * | 2022-12-30 | 2023-10-13 | 南通大学 | 一种具有增强子和启动子活性的甘蔗复合型顺式转录调控元件及筛选方法 |
-
2020
- 2020-11-24 CN CN202011332979.4A patent/CN112481260B/zh active Active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 落叶松启动子元件挖掘及基因组编辑实现;刘炳麟;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库（硕士）农业科技辑》;20200715(第7期);第1-72页 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113943733A (zh) * | 2020-06-30 | 2022-01-18 | 电子科技大学 | 落叶松内源高效启动子及应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN112481260A (zh) | 2021-03-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN112481260B (zh) | 一种具有启动子功能的落叶松dna分子、获取及鉴定方法 | |
| CN113564164B (zh) | 一种提高先导编辑效率的载体和方法 | |
| CN111254160B (zh) | 一种高效鉴定水稻增强子的原生质体验证方法 | |
| CN116716298A (zh) | 一种引导编辑系统和目的基因序列的定点修饰方法 | |
| CN112553197B (zh) | 一种有活性的落叶松启动子、获取及鉴定方法 | |
| CN112553198B (zh) | 一种有活性的落叶松增强子、获取及鉴定方法 | |
| CN111893118B (zh) | 一种来源于甘蓝型油菜的双向启动子及其应用 | |
| CN107338262B (zh) | 用于表达红色荧光蛋白的无乳链球菌质粒及其构建方法和应用 | |
| US11913002B2 (en) | Modified plant endosperm specific promoter and use thereof | |
| CN112522265B (zh) | 一种具有增强子功能的落叶松dna分子、获取及鉴定方法 | |
| CN104830860A (zh) | 一种可以提高植物基因表达活性的间隔重复序列及应用 | |
| CN106520766B (zh) | 一种海藻内源组成型启动子及其应用 | |
| Uozumi et al. | Light activation of expression associated with the tomato rbcS promoter in transformed tobacco cell line BY-2 | |
| CN112877332A (zh) | 一种由双荧光素酶报告基因检测鸡ripk2启动子活性的方法 | |
| CN116063429B (zh) | 一种紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbUR5GT及其应用 | |
| CN113736781A (zh) | 一种水稻内含子及其活性鉴定方法 | |
| CN116063430B (zh) | 一种紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbPGP19及其应用 | |
| CN116102630B (zh) | 一种紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbPDC及其应用 | |
| CN110029108B (zh) | 一种海藻内源全生活史组成型启动子及其应用 | |
| CN116041459B (zh) | 一种紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbPPA及其应用 | |
| JP7576362B2 (ja) | 修飾植物胚乳特異的プロモータとその使用 | |
| CN113832151B (zh) | 黄瓜内源启动子及其应用 | |
| CN114292845A (zh) | 一种强活性的水稻启动子序列及验证方法 | |
| EP4022055A1 (en) | Gene editing using a messenger ribonucleic acid construct | |
| US20130347144A1 (en) | Promoters and methods for transforming tubers and transformed tubers |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |