JP2018516984A - 細胞を標的にしたｈｐｖ処置のための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＨＰＶゲノムを選択的に標的とするために、またはＨＰＶに感染した細胞内に、標的に向かうことが可能なヌクレアーゼを選択的に発現させるために使用することができる、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染を標的に向かうことが可能なヌクレアーゼを使用して処置するための組成物および方法を提供する。ＨＰＶに感染した細胞、感染細胞内のＨＰＶゲノム、またはその両方を選択的に標的とすることにより、ヌクレアーゼはＨＰＶゲノムを切断することができ、そのことにより、それを不活性化し、作動不能にし、ウイルスが感染の潜伏段階である場合においてさえも、ウイルスが繁殖する能力を妨害する。潜伏性ＨＰＶを切断し、宿主細胞から根絶することができるので、本発明の組成物および方法は、ＨＰＶ感染を処置するために、パピローマウイルスに関連する多くの有害な健康事象を強力に予防するために使用され得る。

Description

（関連出願への相互参照）
本出願は、２０１５年５月２９日に出願された米国仮特許出願番号第６２／１６８，１８８号の利益および優先権を主張しており、その内容は参考として援用される。

（発明の分野）
本発明は、一般に、ガイドされるヌクレアーゼ系を使用してウイルス感染を選択的に処置するための組成物および方法に関する。

（背景）
ヒトパピローマウイルス、すなわちＨＰＶは、多くの人々に感染するウイルスである。実際、７５％を超える女性および男性が人生のある時点で感染する。ほとんどのＨＰＶ感染は無症候性であり、身体的症状を引き起こさないが、一部の人々では感染によって乳頭腫として公知の増殖を引き起こすことがあり、子宮頸部、外陰部、膣、陰茎、中咽頭および肛門のがんを引き起こすことさえある。特に、ＨＰＶ １６およびＨＰＶ １８は、子宮頸がんのケースのおよそ７０％の原因となることが知られている。

高リスク発癌性ＨＰＶ型は、宿主ＤＮＡに組み込まれ、ＨＰＶ Ｅ６およびＥ７等の遺伝子を発現することができる。Ｅ６およびＥ７発癌性タンパク質はｐ５３およびｐＲＢ腫瘍抑制因子を不活性化し、ＨＰＶをがんの発症に関与させると考えられている。ＨＰＶはまた、細胞内に無期限に休眠する能力を有し、処置後でさえ完全には根絶することができない潜伏段階を経る。その結果、ウイルスは感染の長期間の後に再び活性化し、その遺伝子の複製および発現を開始することができる。

（要旨）
本発明は、ＨＰＶに感染した細胞またはある特定のタイプの細胞内の、ＨＰＶゲノムを選択的に標的とするため、または標的に向かうことが可能なヌクレアーゼを選択的に発現させるために使用することができる、標的に向かうことが可能なヌクレアーゼを使用したウイルス感染を処置する組成物および方法を提供する。ＨＰＶに感染したある特定のタイプの細胞を選択的に標的とすること、感染した細胞内のＨＰＶゲノムを標的とすること、またはそれらの組合せにより、ヌクレアーゼはＨＰＶゲノムを切断することができ、そのことにより、それを不活性化して作動不能とし、ウイルスが感染の潜伏段階にある場合でさえも増殖するウイルスの能力を妨害する。感染細胞を選択的に標的とすることは、例えば、ケラチノサイトに対する、細胞型特異的プロモーターを使用して行うことができ、そのような細胞は感染細胞である。ヌクレアーゼの標的に向かうことが可能な性質により、それは宿主ヒトゲノムの正常な機能を妨害することなくＨＰＶゲノムを切断することに使用することができる。ウイルス核酸を標的とすることは、ヌクレアーゼで破壊しようとするウイルスゲノム物質を標的とし、宿主細胞ゲノムを標的としないガイドＲＮＡなどの配列特異的部分を使用して行うことができる。一部の実施形態では、ウイルスゲノム物質を共に標的とし、それを選択的に編集または破壊するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が使用される。ｇＲＮＡは、ＨＰＶゲノムの特定部分へとＣａｓ９を標的に向かわせる。潜伏性ＨＰＶは、宿主細胞から切断され、根絶され得るので、本発明の組成物および方法は、ＨＰＶ感染を処置するために、および強力にパピローマウイルスに関連する多くの有害な健康事象を未然に予防するために使用され得る。

本発明の態様は、ＲＮＡでガイドされるヌクレアーゼ（RNA-guided nuclease）を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）およびウイルスのウイルス核酸内の標的部位に相補的な部分を有するＲＮＡを含む組成物を提供する。ＲＮＰは、任意の細胞の外の溶液中で、活性形態で存在するということにおいて、好ましくは細胞外ＲＮＰである。

ある特定の実施形態では、ＲＮＡでガイドされるヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質およびＣｐｆ１からなる群から選択される。組成物は、ＲＮＰを包み込むリポソームを含んでもよい。ウイルスは、例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）であり得る。実施形態では、標的部位は、ＨＰＶのゲノムのＥ６またはＥ７遺伝子内に存在し得る。任意選択で、ＲＮＡでガイドされるヌクレアーゼは、核局在化シグナルを含むことができる。この組成物は、それ自体が第２のＲＮＡでガイドされるヌクレアーゼおよび第２のＲＮＡを含む、少なくとも第２のＲＮＰを含み得る。第２のＲＮＡは、ウイルス核酸内の第２の標的部位に相補的な第２の部分を含み、第２の標的部位は、Ｅ６またはＥ７遺伝子内に存在し、上記の標的部位と同じではない。組成物は、ＲＮＰを包み込むリポソームおよび第２のＲＮＰを包み込む第２のリポソームを含んでもよい。ある特定の実施形態の１つでは、ＲＮＡでガイドされるヌクレアーゼはＣａｓ９である。

一部の実施形態では、組成物は、ウイルスに感染した細胞に送達するとウイルス核酸を複数の場所で切断する複数のＲＮＰを含む。組成物は、複数のＲＮＰを包み込む複数のリポソームをさらに含んでもよい。

実施形態のいずれかでは、標的部位に相補的な部分が、ヒトゲノム内において、６０％超の一致を有さないことが好ましくあり得る。

本発明の態様は、細胞から外来核酸を除去する方法を提供する。この方法は、上に記載の実施形態のいずれかに従った細胞外ＲＮＰを含む組成物をｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞または組織に送達するステップと、ウイルス核酸をＲＮＰで切断するステップとを含む。

ある特定の態様では、本発明は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染を処置するための組成物を提供する。この組成物は、標的に向かうことが可能なヌクレアーゼをコードするベクターと、ヌクレアーゼをＨＰＶゲノムへと標的に向かわせる１つまたは複数の標的指向性配列とを含む。このベクターは、ケラチノサイト内の標的に向かうことが可能なヌクレアーゼおよび標的指向性配列の発現を促進する誘導可能プロモーターを含んでもよい。例えば、誘導可能プロモーターは、他のタイプの宿主細胞よりも、ケラチノサイト内の標的に向かうことが可能なヌクレアーゼおよび標的指向性配列の発現を選択的に好むプロモーターエンハンサーカセットであり得る。標的に向かうことが可能なヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、または他の任意の好適な標的に向かうことが可能なヌクレアーゼであり得る。

好ましい実施形態では、ヌクレアーゼはＣａｓ９エンドヌクレアーゼであり、標的指向性配列（単数または複数）は、ガイドＲＮＡを含む。標的指向性配列（単数または複数）は、Ｅ６遺伝子、Ｅ７遺伝子、その他、またはそれらの組合せ等の、ＨＰＶゲノム内の特定の遺伝子を切断するためにヌクレアーゼを標的に向かわせ得る。好ましくは、標的指向性配列は、ガイドＲＮＡであり、ヒトゲノム内で６０％超の一致を有していない。

組成物は、例えば、皮下送達系または静脈内送達系における、またはそれらを用いた、ヒト患者への送達のために、パッケージされてもよい。ベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、プラスミド、ナノ粒子、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、金属ナノ粒子、ナノロッド、リポソーム、マイクロバブル、細胞浸透性ペプチド、またはリポスフェア（ｌｉｐｏｓｐｈｅｒｅ）を使用することを含み得る。

本発明の態様は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染を処置するための方法を提供する。この方法は、標的に向かうことが可能なヌクレアーゼおよびこのヌクレアーゼをＨＰＶゲノムへと標的に向かわせる標的指向性配列を宿主細胞に導入するステップを含む。ＨＰＶゲノムは、宿主ゲノム上の遺伝子に干渉することなく、宿主細胞内のヌクレアーゼで切断される。一部の実施形態では、標的に向かうことが可能なヌクレアーゼおよび標的指向性配列は、例えばタンパク質および１つまたは複数のガイドＲＮＡとして、患者に（例えば、注射によってまたは静脈内に）直接導入される。ある特定の実施形態では、標的に向かうことが可能なヌクレアーゼおよび標的指向性配列は、標的に向かうことが可能なヌクレアーゼおよび標的指向性配列をコードするベクターを使用して導入される。本発明の方法はまた、例えば、細胞アッセイのために、ｉｎ ｖｉｔｒｏでヌクレアーゼおよび標的指向性配列を導入するステップを含む。

好ましい実施形態では、宿主細胞はケラチノサイトであり、ベクターは、ケラチノサイト内の標的に向かうことが可能なヌクレアーゼおよび標的指向性配列の発現を促進する特徴を含む。発現を促進する特徴は、他のタイプの宿主細胞よりも、ケラチノサイト内の標的に向かうことが可能なヌクレアーゼおよび標的指向性配列の発現を選択的に好むプロモーター−エンハンサーカセットであり得る。ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、またはメガヌクレアーゼ等の任意の好適なヌクレアーゼを使用することができる。本方法の好ましい態様では、ヌクレアーゼはＣａｓ９エンドヌクレアーゼであり、標的指向性配列はガイドＲＮＡを含む。標的指向性配列は、Ｅ６遺伝子、Ｅ７遺伝子、その他、またはそれらの組合せ等の、ＨＰＶゲノム内の特定の遺伝子を切断するためにヌクレアーゼを標的に向かわせてもよく、標的指向性配列は、ヒトゲノム内で７０％超の一致を有していないガイドＲＮＡである。

図１は、ＨＰＶ感染を処置する方法を図示する。 図２は、標的に向かうことが可能なヌクレアーゼに対する標的を示す。 図３は、標的に向かうことが可能なヌクレアーゼを使用したＨＰＶゲノムを標的にしたことの結果を与える。 図４は、ＨＰＶゲノムを標的とするための組成物（composition）を示す。 図５は、Ｃａｓ９陽性細胞の選択を可能にするＥＧＦＰマーカーがＣａｓ９タンパク質の後に融合されていることを示す。 図６は、プラスミドがｏｒｉ−Ｐを含むことにより、細胞内部の活性プラスミド複製が促進され、トランスフェクション効率が６０％超増加したことを示す。 図７は、候補となる構造関連標的、形質転換関連標的、および潜伏関連標的が示されているＥＢＶゲノムの概略図である。 図８は、ガイドＲＮＡ ｓｇＥＢＶ２およびＰＣＲプライマー位置の周辺のゲノム構成を示す。 図９は、ｓｇＥＢＶ２により誘導された大きな欠失を示す（レーン１〜３は、それぞれ、ｓｇＥＢＶ２処置の前、５日後、および７日後である）。 図１０は、ガイドＲＮＡ ｓｇＥＢＶ３／４／５およびＰＣＲプライマー位置の周辺のゲノム構成を示す。 図１１は、ｓｇＥＢＶ３／５およびｓｇＥＢＶ４／５により誘導された大きな欠失を示す。レーン１および２は、ｓｇＥＢＶ３／５処置の前および８日後の３Ｆ／５Ｒ ＰＣＲ増幅産物である。レーン３および４は、ｓｇＥＢＶ４／５処置の前および８日後の４Ｆ／５Ｒ ＰＣＲ増幅産物である。 図１２は、サンガー配列決定法により、ｓｇＥＢＶ３／５の８日後にゲノム切断および修復ライゲーションが確認されたことを示す。 図１３は、サンガー配列決定法により、ｓｇＥＢＶ４／５の８日後にゲノム切断および修復ライゲーションが確認されたことを示す。 図１４は、ＥＢＶゲノム領域において種々の組合せのガイドＲＮＡで標的とした後の相対的細胞増殖を示す。 図１５は、ｓｇＥＢＶ１〜７で処置する前のフローサイトメトリー散乱シグナルを示す。 図１６は、ｓｇＥＢＶ１〜７で処置した５日後のフローサイトメトリー散乱シグナルを示す。 図１７は、ｓｇＥＢＶ１〜７で処置した８日後のフローサイトメトリー散乱シグナルを示す。 図１８は、ｓｇＥＢＶ１〜７で処置する前のアネキシンＶ Ａｌｅｘａ６４７およびＤＡＰＩ染色結果を示す。 図１９は、ｓｇＥＢＶ１〜７で処置した５日後のアネキシンＶ Ａｌｅｘａ６４７およびＤＡＰＩ染色結果を示す。 図２０は、ｓｇＥＢＶ１〜７で処置した８日後のアネキシンＶ Ａｌｅｘａ６４７およびＤＡＰＩ染色結果を示す。 図２１および図２２は、顕微鏡観察により、ｓｇＥＢＶ１〜７での処置後にアポトーシス細胞形態が明らかになったことを示す。 図２１および図２２は、顕微鏡観察により、ｓｇＥＢＶ１〜７での処置後にアポトーシス細胞形態が明らかになったことを示す。 図２３は、ｓｇＥＢＶ１〜７で処置する前の核形態を示す。 図２４〜図２６は、ｓｇＥＢＶ１〜７で処置した後の核形態を示す。 図２４〜図２６は、ｓｇＥＢＶ１〜７で処置した後の核形態を示す。 図２４〜図２６は、ｓｇＥＢＶ１〜７で処置した後の核形態を示す。 図２７は、デジタルＰＣＲによる様々なＣＲＩＳＰＲ処置後のＥＢＶ負荷を示す。Ｃａｓ９およびＣａｓ９−ｏｒｉＰは２つの複製物を有し、ｓｇＥＢＶ１〜７は５つの複製物を有していた。 図２８は、マイクロ流体チップに捕捉されている単一のＲａｊｉ細胞を示す。 図２９は、チップに捕捉されている単一のｓｇＥＢＶ１〜７処置細胞を示す。 図３０は、処置前の単一細胞のＥＢＶ定量ＰＣＲ Ｃｔ値のヒストグラムである。 図３１は、ｓｇＥＢＶ１〜７で処置した７日後の単一生存細胞のＥＢＶ定量ＰＣＲ Ｃｔ値のヒストグラムである。 図３２は、ＥＢＶ ＣＲＩＳＰＲのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイを示す（レーンは左から右へと付番されている：レーン１：ＮＥＢ １００ｂｐラダー；レーン２：ｓｇＥＢＶ１対照；レーン３：ｓｇＥＢＶ１；レーン４：ｓｇＥＢＶ５対照；レーン５：ｓｇＥＢＶ５；レーン６：ｓｇＥＢＶ７対照；レーン７：ｓｇＥＢＶ７；レーン８：ｓｇＥＢＶ４）。 図３３は、ＣＲＩＳＰＲ処置が、ＥＢＶ陰性バーキットリンパ腫細胞株ＤＧ−７５に対して細胞毒性ではなかったことを示す。 図３４は、ＣＲＩＳＰＲ処置が初代ヒト肺線維芽細胞ＩＭＲ９０に対して細胞毒性ではなかったことを示す。 図３５は、ウイルス核酸を切断するために使用されるＺＦＮを示す。 図３６は、外来核酸を除去するために細胞３２３７を処理するための方法３２０１を図示する。 図３７は、ＥＢＶ特異的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰがＥＢＶ＋Ｂリンパ腫がん細胞を特異的に死滅させることを示すための実験設計を図示する。 図３８は、処置後６日間についてのＥＢＶ＋がん細胞生存率を示す。 図３９は、処置後６日目における各々の細胞集団の百分率を示す。 図４０は、処置後３日間についての細胞生存の百分率を示す。 図４１は、選択されたガイドＲＮＡがゲノムにマッピングされる場所を示す。 図４２は、Ｃａｓ９での処置後の生存百分率を示す。 図４３は、ＨＰＶ特異的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ用量応答を示す。 図４４は、ＨＰＶ特異的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ経時変化を与える。 図４５は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰがＤＮＡ切断を増強することを示すゲルである。 図４６は、ＲＮＰがｐＤＮＡと比較して細胞毒性が減少していることを示す。 図４７は、ＲＮＰについてのＨＰＶ＋がん細胞の生存率が、ｐＤＮＡに対してより低いことを示す。 図４８は、ＨＰＶ特異的ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰの組合せがＨＰＶ＋がん細胞死滅を改善することを示す。 図４９は、ＨＰＶ＋がん細胞を死滅させるためのプライマー設計を示す。 図５０は、細胞の生存をモニターするためのプロセスを示す。 図５１は、ＨＰＶ−１６特異的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｐＤＮＡがＨＰＶ−１６陽性がん細胞を死滅させることを示す。 図５２は、リポソームを介したＣａｓ９ ＲＮＰの送達を説明した。 図５３は、リポソームに処方されたＨＰＶ特異的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰがＨＰＶ＋がん細胞を阻害することを示す。

（詳細な説明）
本発明は、一般に、ケラチノサイトにおけるＨＰＶ感染への特定の適用でガイドされるヌクレアーゼ系を使用して、ウイルス感染を選択的に処置するための組成物および方法に関する。本発明の方法は、一本鎖または二本鎖切断、切断、消化または編集等のヌクレアーゼ活性を介して細胞内のウイルス核酸を無力化または損壊するために使用される。本発明の方法は、全ゲノムを再構築する確率を減少させて、ゲノム中に大きな欠失または繰り返しの欠失を体系的に引き起こすために使用され得る。

本発明の組成物および方法は、ＨＰＶ感染、ならびにＨＰＶ感染の症状および帰結を処置するために提供される。ＨＰＶは、皮膚または粘膜のケラチノサイトにおいてのみ生産的感染を確立する。本発明は、潜伏性ＨＰＶ感染に対する適用性を有するＨＰＶ感染に対するヌクレアーゼベースの抗ウイルス療法のための組成物および方法を提供する。

図１は、ＨＰＶ感染を標的とする方法を図示する。好ましくは、本発明の組成物はケラチノサイトに送達される。臨床的に有意なＨＰＶ感染がケラチノサイトに影響を及ぼすことが理解される。ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＨＰＶ感染ケラチノサイトは、本発明の方法に従って処置することができる。この方法は、標的に向かうことが可能なヌクレアーゼ（例えば、タンパク質またはヌクレアーゼの遺伝子として）を得るステップを含む。ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮまたはメガヌクレアーゼ等の、任意の好適なヌクレアーゼを使用することができる。好ましい実施形態では、ヌクレアーゼはＣａｓ９である。ＨＰＶゲノム上の特定の標的へとヌクレアーゼを標的に向かわせる配列が提供される。この配列は、ケラチノサイト内で転写されて最終的なｇＲＮＡを提供する、ガイドＲＮＡに相補的なＤＮＡの形態であってもよい。ヌクレアーゼ遺伝子およびコードされたｇＲＮＡは、プラスミドまたはアデノウイルスベースのベクター等のＤＮＡベクター中に提供されてもよく、ベクターは、任意選択で、ケラチノサイト特異的誘導可能プロモーターをさらに含み得る。その後、組成物は、ＨＰＶ感染細胞に導入される。任意の好適なトランスフェクションまたは送達方法を使用してもよい。細胞内に入ると、遺伝子が発現され、Ｃａｓ９酵素はｇＲＮＡを使用してＨＰＶゲノムを標的とし、そしてそれを切断する。ｇＲＮＡは、本明細書に記載される方法および基準に従ってヒトゲノムと一致することなくＨＰＶゲノムに特異的であるため、この方法は宿主ゲノムを無傷に保ち、正常なヒト遺伝子機能を妨害しない。ＨＰＶの考察は、Mungerら、２００４年、Mechanisms of human papillomavirus-induced oncogenesis、J Virol ７８巻（２１号）： １１４５１〜１１４６０頁およびMadkanら、２００７年、The oncogenic potential of human papillomaviruses: a review on the role of host genetics and environmental cofactors、Brit J Dermatology １５７巻（２号）：２２８〜２４１頁に見出され、これらの各々の内容は、あらゆる目的のためにその全体が引用により取り込まれる。

組成物および方法を使用して、ＨＰＶゲノムを選択的に標的とするか、またはＨＰＶに感染した細胞内で標的に向かうことが可能なヌクレアーゼを選択的に発現させることができる。ある特定の実施形態では、本発明の方法および組成物は、ＨＰＶ Ｅ６およびＥ７遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ配列を使用する。ｃａｓ９をコードするＤＮＡベクター等の本発明の組成物は、ＨＢＶゲノム内の特定の標的に相補的なｇＲＮＡをコードしてもよい。

図２は、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡによって標的にされるＨＰＶゲノムおよびＨＰＶ Ｅ６およびＥ７遺伝子を示す。Ｅ６およびＥ７タンパク質は発癌性であり得るため、それらのそれぞれの遺伝子をヌクレアーゼによる破壊の標的とすることは有用であり得る。好ましい実施形態では、各々の遺伝子は、ヌクレアーゼのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンされる（例えば、Ｃａｓ９について５’−ＮＧＧ−３’）。遺伝子内に見出される各々の候補ＰＡＭについて、ＰＡＭに隣接する２０ｎｔが読み取られ、ヒトゲノムと比較される。２０ｎｔ＋ＰＡＭがヒトゲノム内で一定の基準で一致しない場合には、その２０ｎｔ＋ＰＡＭを標的指向性配列として使用することができる。この一致基準は、完璧ではない一致の必要条件であってもよい。好ましい実施形態では、標的指向性配列は、７０％以上一致するヒトゲノム内の２３ｎｔ文字列がない２０ｎｔ＋ＰＡＭ（例えば、Ｃａｓ９については２３ｎｔ）である。より好ましい実施形態では、標的指向性配列は、ＰＡＭが続く２０ｎｔ文字列（ヒトゲノムのこの２０ｎｔは７０％以上で２０ｎｔの標的指向性配列と一致する）がヒトゲノム内にない２０ｎｔ＋ＰＡＭである（例えば、Ｃａｓ９がヌクレアーゼである場合、１４塩基またはそれを超える塩基が一致するＰＡＭが続く、ヒトゲノムの２０ｎｔ文字列があると、与えられた標的指向性配列の使用が除外されるだろう）。

ＨＰＶゲノムを切断するために標的に向かうことが可能なヌクレアーゼの使用が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼアッセイによって本明細書に示される。Ｔ７ファージポリメラーゼによる転写のために、遺伝子にコードされたｇＲＮＡスキャフォールドが提供された。Ｔ７ ｉｎ ｖｉｔｒｏ 転写は、スキャフォールドを有する完全なガイドＲＮＡを産生した。ゲノム標的の隣接領域を、ＨＰＶ １８ゲノムＤＮＡ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡのＡＴＣＣにより商標４５１５２Ｄのもと販売されている）からＰＣＲ増幅した。ｉｎ ｖｉｔｒｏエンドヌクレアーゼアッセイのために、Ｃａｓ９タンパク質（Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ、ＣＡのＰＮＡ Ｂｉｏから）、ガイドＲＮＡおよび標的ＤＮＡを混合し、インキュベートした。消化されたＤＮＡのＤＮＡゲル電気泳動によって、高エンドヌクレアーゼ活性が明らかになった。

図３は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼアッセイの結果を与える。４つのレーンは、Ｅ６−Ｅ７領域のＰＣＲ増幅産物（アンプリコン）およびｉｎ ｖｉｔｒｏ ＣＲＩＳＰＲ処理された増幅産物の生成物の結果を示す。レーン２〜４は、各々、対照に対する差を示す。レーン３は、ＨＰＶゲノムＤＮＡの異なる質量の３つの断片への切断を示す。ｇＲＮＡはＥ６またはＥ７遺伝子内で一致するように設計されているため、対応するタンパク質の発現を、ヌクレアーゼ切断によって停止させることができる。

組成物および方法を使用して、ＨＰＶに感染した細胞内で標的に向かうことが可能なヌクレアーゼを選択的に発現させることができる。ＨＰＶがケラチノサイトに感染することが理解される。例えば、引用により組み込まれる、Bossens、１９９２年、J Gen Virol ７３巻：３２６９頁を参照されたい。ある特定の実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでヌクレアーゼの発現を調節し、ケラチノサイト内のヌクレアーゼの発現を引き起こすプロモーター−エンハンサーカセットとともに、ヌクレアーゼが提供される。

図４は、本発明のある特定の実施形態による組成物の図を示す。この組成物は、好ましくは、少なくともヌクレアーゼ遺伝子および少なくとも１つの標的指向性配列（図４においてｇＲＮＡと標識される）を含むＤＮＡ鎖（環状または直線状、ここでは環状化されたものとして示される）を含む。この組成物は、ＨＰＶ開始点等の複製の開始点を含み得る。好ましくは、この組成物は、いずれかまたは全てがケラチノサイトに特異的であってもよい、１つまたは複数のプロモーターを含む。ケラチノサイト内での発現をもたらす任意の好適なプロモーターまたはエンハンサーを使用してもよい。例えば、それぞれ、メタロチオネイン（metallothionein；ＭＴ）および誘導剤に応答する１，２４−ビタミンＤ（３）（ＯＨ）（２）デヒドロキシラーゼ（ＶＤＨ）プロモーター、カドミウムおよび１，２５−ビタミンＤ（３）（ＯＨ）（２）（ＶｉｔＤ（３））等の１つまたは複数の誘導可能プロモーターを含むベクター（例えば、プラスミド）内に、ヌクレアーゼが提供され得る。ケラチノサイト誘導可能プロモーターは、Mengら、２００２年、 Keratinocyte gene therapy: cytokine gene expression in local keratinocytes and in circulation by introducing cytokine genes into skin、 Exp Dermatol １１巻（５号）：４５６〜６１頁に考察されており、さらなる考察は、Westergaardら、２００１年、Modulation of keratinocyte gene expression and differentiation by PPAR-selective ligands and tetradecyltheioacetic acid、 J Invest Dermatol １１６巻（５号）：７０２〜１２頁に見出すことができ、これらの各々の内容は引用により組み込まれる。誘導可能プロモーターはケラチノサイトに特異的であり、１つまたは好ましくは複数のｇＲＮＡは各々ＨＰＶゲノムの一部に特異的であるため、組成物を患者に投与すると、コードされた遺伝子はケラチノサイト内でのみ発現される。ヌクレアーゼは、ＨＰＶゲノムを切断するために１つまたは複数のｇＲＮＡによってガイドされる。ｇＲＮＡは、特定の基準（例えば、７０％以上一致しない）に従ってヒト内で一致を有さないので、宿主ゲノム機能は影響を受けない。したがって、本発明の組成物および方法は、ＨＰＶ感染を処置するために使用され得る。さらに、本発明の組成物は、ＨＰＶプロモーターまたは複製開始点を含んでもよい。ＨＰＶゲノムの特徴は、ZhengおよびBaker、２００６年、Papillomavirus genome structure, expression, and post-transcriptional regulation、 Front Biosci １１巻：２２８６〜２３０２頁に記載され、引用により取り込まれる。

（ｉ．感染細胞の標的化）
図１は、ウイルスに感染した細胞を処置する方法を図示する。本発明の方法は、患者のｉｎ ｖｉｖｏ処置に適用可能であり、潜伏ウイルス感染に関連するウイルスの遺伝子等の任意のウイルス遺伝物質を除去するために使用され得る。方法は、例えば、細胞培養物または細胞試料を調製または処理するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏで使用され得る。ｉｎ ｖｉｖｏで使用される場合、細胞は、任意の好適な生殖系列細胞または体細胞であってもよく、本発明の組成物は、患者の身体の特定の部分に送達されてもよいか、または全身に送達されてもよい。全身的に送達される場合、本発明の組成物内に組織特異的プロモーターを含めることが好ましくあり得る。例えば、患者が肝臓に局在する潜伏性ウイルス感染を有する場合、標的ヌクレアーゼをコードするプラスミドまたはウイルスベクターに、肝臓組織特異的プロモーターが含まれてもよい。

図４には、ある特定の実施形態によるウイルス感染を処置するための組成物が示されている。組成物は、好ましくは、ヌクレアーゼと、ウイルス核酸へとヌクレアーゼを標的に向かわせる標的指向性部分（例えばｇＲＮＡ）とをコードするベクター（プラスミド、直鎖状ＤＮＡ、またはウイルスベクターであってもよい）を含む。組成物は、任意選択で、本明細書にさらに記載されているような、プロモーター、複製開始点、他のエレメント、またはそれらの組合せの１つまたは複数を含んでいてもよい。

（ｉｉ．ヌクレアーゼ）
本発明の方法は、プログラム可能であるか、または標的に向かわせることが可能なヌクレアーゼを使用して、ウイルス核酸を特異的に標的として破壊することを含む。例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、クラスターを形成し規則正しい間隔を持つ短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、他のエンドヌクレアーゼもしくはエキソヌクレアーゼ、またはそれらの組合せを含む、任意の好適な標的指向性ヌクレアーゼを使用することができる。Schiffer、２０１２年、Targeted DNA mutagenesis for the cure of chronic viral infections、J Virol、８８巻（１７号）：８９２０〜８９３６頁を参照されたい。この文献は、参照により組み込まれる。

ＣＲＩＳＰＲ方法論では、ガイドとしての小型ＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と複合体を形成して、任意のゲノム位置のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の上流にあるＤＮＡを配列特異的な様式で切断するＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）が使用される。ＣＲＩＳＰＲは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡとして公知の別々のガイドＲＮＡを使用することができる。このような２つの別々のＲＮＡを組み合わせて単一のＲＮＡにすることにより、短鎖ガイドＲＮＡ設計による部位特異的な哺乳類ゲノム切断が可能になる。Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、公知の方法により合成することができる。Ｃａｓ９／ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、非特異的ＤＮＡ切断タンパク質Ｃａｓ９、およびハイブリダイズしてＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を標的に向かわせ、そして動員するＲＮＡオリゴを使用する。Changら、２０１３年、Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease in zebrafish embryos、Cell Res、２３巻：４６５〜４７２頁；Hwangら、２０１３年、Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system、Nat. Biotechnol、３１巻：２２７〜２２９頁；Xiaoら、２０１３年、Chromosomal deletions and inversions mediated by TALENS and CRISPR/Cas in zebrafish、Nucl Acids Res、１〜１１頁を参照されたい。

ＣＲＩＳＰＲ（クラスターを形成し規則正しい間隔を持つ短いパリンドロームリピート）は、細菌に見出され、ファージ感染から細菌を保護すると考えられている。ＣＲＩＳＰＲは、近年では真核生物ＤＮＡの遺伝子発現を変更するための手段として使用されているが、抗ウイルス療法またはより幅広くゲノム物質を損壊する方法としては提案されていない。むしろ、ＣＲＩＳＰＲは、標的とした細胞または細胞集団のＤＮＡの転写を増加または減少させる手段としての挿入または欠失を導入するために使用されている。例えば、Horvathら、Science（２０１０年）３２７巻：１６７〜１７０頁；Ternsら、Current Opinion in Microbiology（２０１１年）１４巻：３２１〜３２７頁；Bhayaら、Annu Rev Genet（２０１１年）４５巻：２７３〜２９７頁；Wiedenheftら、Nature（２０１２年）４８２巻：３３１〜３３８頁;Jinek Mら、Science（２０１２年）３３７巻：８１６〜８２１頁；Cong Lら、Science（２０１３年）３３９巻：８１９〜８２３頁；Jinek Mら、（２０１３年）、eLife 2:ｅ００４７１；Mali Pら、（２０１３年）Science、３３９巻：８２３〜８２６頁；Qi LSら、（２０１３年）Cell、１５２巻：１１７３〜１１８３頁；Gilbert LAら、（２０１３年）Cell、１５４巻：４４２〜４５１頁；Yang Hら、（２０１３年）Cell、１５４巻：１３７０〜１３７９頁；およびWang Hら、（２０１３年）Cell、１５３巻：９１０〜９１８頁）を参照されたい。

本発明の態様では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ゲノムの少なくとも２つの位置で二本鎖切断を引き起こす。こうした２つの二本鎖切断は、ゲノム断片の欠失を引き起こす。ウイルス修復経路により２つの末端がアニーリングされたとしても、ゲノムは依然として欠失したままであり得る。この機序を使用した１つまたは複数の欠失は、ウイルスゲノムを無力化することになる。その結果、宿主細胞からウイルス感染がなくなることになる。

本発明の実施形態では、ヌクレアーゼは、標的ウイルスのゲノムを切断する。ヌクレアーゼは、核酸のヌクレオチドサブユニット間のリン酸ジエステル結合を切断することが可能な酵素である。エンドヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド鎖内のリン酸ジエステル結合を切断する酵素である。デオキシリボヌクレアーゼＩ等、幾つかのものは、ＤＮＡを比較的非特異的に（配列に関わらず）切断するが、多くものは、典型的には制限エンドヌクレアーゼまたは制限酵素と呼ばれ、ヌクレオチド配列を非常に特異的にのみ切断する。本発明の好ましい実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、本発明の組成物および方法に組み込まれるが、任意のヌクレアーゼを使用することができることが理解されるべきである。

本発明の好ましい実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを使用して、ゲノムを切断する。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ゲノムに二本鎖切断を生成することが可能である。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、２つの機能性ドメインＲｕｖＣおよびＨＮＨを有しており、各々が異なる鎖を切断する。これらドメインが両方とも活性であると、Ｃａｓ９はゲノム中に二本鎖切断を引き起こす。

本発明の一部の実施形態では、ゲノムへの挿入は、無力化を引き起こすかまたはゲノム発現を変更するように設計することができる。加えて、挿入／欠失は、二本鎖切断に中途終止コードンを生成するか、またはリーディングフレームをシフトさせて二本鎖切断の下流に中途終止コードンを生成するかのいずれかにより、中途終止コードンを導入するためにも使用される。ＮＨＥＪ修復経路のこうした結果はいずれも、標的遺伝子を損壊するために活用することができる。ＣＲＩＳＰＲ／ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９系の使用により導入される変更は、ゲノムに恒久的に存続する。

本発明の一部の実施形態では、少なくとも１つの挿入は、ＣＲＩＳＰＲ／ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体により引き起こされる。好ましい実施形態では、ゲノム中に多数の挿入を引き起こすことにより、ウイルスが無力化される。本発明の態様では、挿入の数は、ゲノムが修復され得る確率を低下させる。

本発明の一部の実施形態では、少なくとも１つの欠失が、ＣＲＩＳＰＲ／ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体により引き起こされる。好ましい実施形態では、ゲノムに多数の欠失を引き起こすことにより、ウイルスが無力化される。本発明の態様では、欠失の数は、ゲノムが修復され得る確率を低下させる。非常に好ましい実施形態では、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ系は、宿主ゲノムを無傷に保ったまま、著しいゲノム損壊を引き起こし、ウイルスゲノムの効果的な破壊をもたらす。

ＴＡＬＥＮは、本質的にあらゆる配列を標的とすることができるＤＮＡ結合ドメインに融合された非特異的ＤＮＡ切断ヌクレアーゼを使用する。ＴＡＬＥＮ技術の場合、標的部位を識別し、発現ベクターを製作する。線状にされた発現ベクター（例えば、Ｎｏｔ１により）を、ｍＲＮＡ合成の鋳型として使用することができる。Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カールズバッド、米国カリフォルニア州）製のｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ ＳＰ６転写キット等の市販のキットを使用してもよい。JoungおよびSander、２０１３年、TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing、Nat Rev Mol Cell Bio、１４巻：４９〜５５頁を参照されたい。

ＴＡＬＥＮおよびＣＲＩＳＰＲ法は、標的部位との１対１関係を提供する。つまり、ＴＡＬＥドメインの１単位のタンデムリピートが、標的部位の１つのヌクレオチドを認識し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のｃｒＲＮＡ、ｇＲＮＡ、またはｓｇＲＮＡは、ＤＮＡ標的の相補配列にハイブリダイズする。これらの方法は、１対のＴＡＬＥＮまたは１つのｇＲＮＡを有するＣａｓ９タンパク質を使用して、標的に二本鎖切断を生成することを含み得る。その後、切断箇所は、非相同末端結合または相同組換え（ＨＲ）により修復される。

図３５は、ウイルス核酸を切断するために使用されているＺＦＮが示されている。手短に述べれば、ＺＦＮ法は、標的にされたＺＦＮ３０５および任意選択で少なくとも１つのアクセサリーポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのベクター（例えば、ＲＮＡ分子）を、感染宿主細胞に導入することを含む。例えば、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎの米国特許出願公開第２０１１／００２３１４４号を参照されたい。この文献は、参照により組み込まれる。細胞は、標的配列３１１を含む。細胞をインキュベートしてＺＦＮ３０５を発現させ、ＺＦＮ３０５により、標的とされた染色体配列３１１に二本鎖切断３１７を導入する。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドまたは交換ポリヌクレオチド３２１が導入される。ウイルス核酸の部分を無関連配列と交換することにより、ウイルス核酸の転写または複製を完全に妨害することができる。標的ＤＮＡ３１１は交換ポリヌクレオチド３２１と共に、誤りがちな非相同末端結合ＤＮＡ修復プロセスまたは相同性により導かれたＤＮＡ修復プロセスにより修復され得る。

典型的には、ＺＦＮは、ＤＮＡ結合ドメイン（つまり、ジンクフィンガー）および切断ドメイン（つまり、ヌクレアーゼ）を含み、この遺伝子は、ｍＲＮＡ（例えば、５’キャッピングされているか、ポリアデニル化されているか、またはその両方）として導入することができる。ジンクフィンガー結合ドメインは、選択した任意の核酸配列を認識および結合するように操作することができる。例えば、Quら、２０１３年、Zinc-finger-nucleases mediate specific and efficient excision of HIV-1 proviral DAN from infected and latently infected human T cells、Nucl Ac Res、４１巻（１６号）：７７７１〜７７８２頁を参照されたい。この文献は参照により組み込まれる。操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較して、新規な結合特異性を有する場合がある。操作方法としては、これらに限定されないが、合理的設計および種々のタイプの選択が挙げられる。ジンクフィンガー結合ドメインは、ジンクフィンガー認識領域（つまり、ジンクフィンガー）を介して標的ＤＮＡ配列を認識するように設計することができる。例えば、米国特許第６，６０７，８８２号；第６，５３４，２６１号；および第６，４５３，２４２号を参照されたい。これら文献は、参照により組み込まれる。ジンクフィンガー認識領域を選択するための例示的な方法としては、ファージディスプレイおよびツーハイブリッド系を挙げることができ、米国特許第５，７８９，５３８号；米国特許第５，９２５，５２３号；米国特許第６，００７，９８８号；米国特許第６，０１３，４５３号；米国特許第６，４１０，２４８号；米国特許第６，１４０，４６６号；米国特許第６，２００，７５９号；および米国特許第６，２４２，５６８号に開示されている。これら文献の各々は、参照により組み込まれる。

また、ＺＦＮは切断ドメインを含む。ＺＦＮの切断ドメイン部分は、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼ等の任意の好適なエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。例えば、BelfortおよびRoberts、１９９７年、Homing endonucleases: keeping the house in order、Nucleic Acids Res、２５巻（１７号）：３３７９〜３３８８頁を参照されたい。切断ドメインは、切断活性に二量体化を必要とする酵素に由来していてもよい。各ヌクレアーゼが活性酵素二量体の単量体を含む場合、切断に２つのＺＦＮが必要とされる場合がある。あるいは、単一のＺＦＮが、活性酵素二量体を生成するための単量体を両方とも含んでいてもよい。存在する制限エンドヌクレアーゼは、配列特異的結合、および結合部位でのまたはその近傍でのＤＮＡ切断が可能であってもよい。ある特定の制限酵素（例えば、タイプＩＩＳ）は、認識部位から除去された部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを有する。例えば、タイプＩＩＳ酵素ＦｏｋＩは、二量体として活性であり、一方の鎖のその認識部位から９個のヌクレオチドで、および他方の鎖のその認識部位から１３個のヌクレオチドで、ＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。ＺＦＮに使用されるＦｏｋＩ酵素は、切断単量体とみなすことができる。したがって、ＦｏｋＩ切断ドメインを使用する標的とされる二本鎖切断の場合、各々がＦｏｋＩ切断単量体を含む２つのＺＦＮを使用して、活性酵素二量体を再構成することができる。Wahら、１９９８年、Structure of FokI has implications for DNA cleavage、PNAS、９５巻：１０５６４〜１０５６９頁；米国特許第５，３５６，８０２号；米国特許第５，４３６，１５０号；米国特許第５，４８７，９９４号；米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号；米国特許出願公開第２００６／０１８８９８７号；米国特許出願公開第２００８／０１３１９６２号を参照されたい。これら文献の各々は、参照により組み込まれる。

ＺＦＮを使用したウイルス標的化は、ある配列を含む少なくとも１つのドナーポリヌクレオチドを細胞内に導入することを含んでいてもよい。ドナーポリヌクレオチドは、好ましくは、染色体への組込み部位のいずれかの側と配列類似性を共有する上流配列および下流配列に隣接されている導入されるべき配列を含む。ドナーポリヌクレオチドの上流配列および下流配列は、目的の染色体配列とドナーポリヌクレオチドとの組換えを促進するように選択される。典型的には、ドナーポリヌクレオチドはＤＮＡであり得る。ドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡプラスミド、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、ウイルスベクター、ＤＮＡの線状小片、ＰＣＲ断片、ネイキッド核酸であってもよく、リポソーム等の送達媒体を使用してもよい。ドナーポリヌクレオチドの配列は、エキソン、イントロン、調節配列、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。二本鎖切断は、ドナーポリヌクレオチドとの相同組換えにより修復され、所望の配列が染色体内に組み込まれる。ＺＦＮ媒介性プロセスの場合、ＺＦＮにより標的配列内に導入された二本鎖切断は、交換ポリヌクレオチドとの相同組換えにより修復され、交換ポリヌクレオチドの配列を標的配列の部分と交換することができる。二本鎖切断の存在は、切断の相同組換えおよび修復を促進する。交換ポリヌクレオチドは、物理的に組み込まれてもよく、あるいは切断を修復するための鋳型として交換ポリヌクレオチドを使用して、交換ポリヌクレオチドの配列情報が、標的配列のその部分の配列情報と交換されるという結果をもたらすことができる。したがって、ウイルス核酸の部分を、交換ポリヌクレオチドの配列に変換することができる。ＺＦＮ法は、ベクターを使用して、ＺＦＮおよび任意選択で少なくとも１つの交換ポリヌクレオチドまたは少なくとも１つのドナーポリヌクレオチドをコードする核酸分子を感染細胞に送達することを含むことができる。

メガヌクレアーゼは、大型認識部位（１２〜４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列）により特徴付けられるエンドデオキシリボヌクレアーゼであり、そのため、一般的にこの部位は任意の所与のゲノムに１つしか存在しない。例えば、Ｉ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼにより認識される１８塩基対配列は、偶然に１つ見出すだけでも、平均でヒトゲノムの２０倍のサイズのゲノムを必要とするだろう（単一のミスマッチを有する配列は、ヒトサイズのゲノム１つ当たり約３倍見出されるが）。したがって、メガヌクレアーゼは、最も特異的な天然に存在する制限酵素であると考えられる。メガヌクレアーゼは、配列および構造モチーフに基づいて、５つのファミリーに分類することができる：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ、ＧＩＹ−ＹＩＧ、ＨＮＨ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックス、およびＰＤ−（Ｄ／Ｅ）ＸＫである。最もよく研究されているファミリーは、生命界の全てに見出されているＬＡＧＬＩＤＡＤＧタンパク質のファミリーであり、一般的にイントロンまたはインテイン内にコードされているが、独立したメンバーも存在する。配列モチーフＬＡＧＬＩＤＡＤＧは、酵素活性の必須エレメントである。幾つかのタンパク質は、そのようなモチーフを１つだけ含むが、他のタンパク質はそのようなモチーフを２つ含む。いずれの場合でも、このモチーフの後には、他のファミリーメンバーとの配列類似性がほとんどないかまたは全くない約７５〜２００個のアミノ酸残基が続いていた。結晶構造は、以下のＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーの配列特異性の様式および切断機序を示す：（ｉ）伸長β鎖がＤＮＡの主溝内に埋没することにより特異的接触が生じ、ＤＮＡ結合サドルが、ＤＮＡのヘリックスのねじれを模倣するピッチおよび輪郭を有する；（ｉｉ）タンパク質とＤＮＡとの間の完全な水素結合能力は、決して完全に実現されることはない；（ｉｉｉ）特徴的な４−ｎｔの３’−ＯＨ突出を生成する切断が副溝を横切って生じ、中央「４塩基」領域のＤＮＡの歪みにより、切断を受けるリン酸結合がタンパク質触媒コアにより接近する；（ｉｖ）固有の「金属共有」パラダイムが関与することがある、提唱されている２金属機序により切断が生じる；および（ｖ）最後に、コアα／βフォールディングの外側領域の「適応させられた（ａｄａｐｔｅｄ）」スキャフォールドから、さらなる親和性および／または特異的接触が生じ得る。Silvaら、２０１１年、Meganucleases and other tools for targeted genome engineering、Curr Gene Ther、１１巻（１号）：１１〜２７頁を参照されたい。この文献は、参照により組み込まれる。

本発明の一部の実施形態では、鋳型配列がゲノム内に挿入される。ゲノムＤＮＡにヌクレオチド改変を導入するためには、相同性により導かれた修復（ＨＤＲ）の間に、所望の配列を含むＤＮＡ修複鋳型が存在しなければならない。ＤＮＡ鋳型は、通常、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９と共に細胞内にトランスフェクトされる。各相同性アームの長さおよび結合位置は、導入される変化のサイズに依存する。好適な鋳型が存在すると、ＨＤＲは、Ｃａｓ９誘導性二本鎖切断に著しい変化を導入することができる。

本発明の一部の実施形態では、修飾型のヌクレアーゼを使用してもよい。ＲｕｖＣ−またはＨＮＨ−のいずれかの単一不活性触媒ドメインを含む修飾型のＣａｓ９酵素は、「ニッカーゼ」と呼ばれる。活性ヌクレアーゼドメインが１つのみで、Ｃａｓ９ニッカーゼは、標的ＤＮＡの一方の鎖のみを切断し、一本鎖切断または「ニック」を生成する。不活性ｄＣａｓ９（ＲｕｖＣ−およびＨＮＨ−）と同様に、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ｇＲＮＡ特異性に基づいてＤＮＡに依然として結合することができるが、ニッカーゼは、ＤＮＡ鎖の一方のみを切断することになる。ＣＲＩＳＰＲプラスミドの大部分は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来し、ＲｕｖＣドメインは、Ｄ１０Ａ突然変異により不活化することができ、ＨＮＨドメインは、Ｈ８４０Ａ突然変異により不活化することができる。

一本鎖切断またはニックは、通常、インタクトな相補的ＤＮＡ鎖を鋳型として使用して、ＨＤＲ経路により迅速に修復される。しかしながら、Ｃａｓ９ニッカーゼにより導入された２つの近接した反対側の鎖のニックは、二本鎖切断として扱われ、この場合、「ダブルニック」または「二重ニッカーゼ」ＣＲＩＳＰＲ系と呼ばれることが多い。ダブルニック誘導性二本鎖切断は、遺伝子標的に対する所望の効果に応じて、ＮＨＥＪまたはＨＤＲのいずれかにより修復することができる。こうした二本鎖切断にて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体により挿入および欠失が引き起こされる。本発明の態様では、欠失は、２つの二本鎖切断を互いに近接して配置することにより引き起こされ、それによりゲノムの断片の欠失が引き起こされる。

（ｉｉｉ．標的指向性配列）
ヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の標的特異性を使用することができる。以下で考察されるように、ガイドＲＮＡまたは単一ガイドＲＮＡは、ウイルスゲノムを標的とするように特異的に設計される。本明細書で使用さえる場合、標的指向性配列は、ｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｓｇＲＮＡなどの任意の組合せを意味し得る。本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集複合体は、ウイルスゲノムを標的とするガイドＲＮＡと共に最適に作用する。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）（単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、ｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、トランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、任意の他の標的指向性オリゴ、またはそれらの任意の組合せを含む）は、ウイルスゲノムの損壊を引き起こすために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体をウイルスゲノムへと導く。本発明の態様では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体は、細胞内の特定のウイルスを標的とするように設計される。本発明の組成物を使用して任意のウイルスを標的とすることができることが理解されるべきである。ウイルスゲノムの特異的領域を識別することにより、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の開発および設計が支援される。

本発明の態様では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体は、細胞内の潜伏ウイルスを標的とするように設計される。細胞内にトランスフェクトされると、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体は、反復挿入または欠失によりゲノムの無力化を引き起こすか、または挿入または欠失の数に起因して、修復の可能性を著しく低減させる。

一例として、本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を用いて、ヒトヘルペスウイルス４（ＨＨＶ−４）とも呼ばれるエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）を細胞内で不活化した。ＥＢＶは、ヘルペスファミリーのウイルスであり、ヒトにおいて最も一般的なウイルスの１つである。ウイルスは、直径がおよそ１２２ｎｍ〜１８０ｎｍであり、タンパク質カプシドに包まれた二重らせんのＤＮＡで構成されている。この例では、適切なｉｎ ｖｉｔｒｏモデルとして役割を果たすのは、Ｒａｊｉ細胞株である。Ｒａｊｉ細胞株は、造血起源からの最初の連続継代性ヒト細胞株であり、細胞株は、非通常株のエプスタインバーウイルスを産生するが、最も広範に研究されているＥＢＶモデルの１つである。Ｒａｊｉ細胞内のＥＢＶゲノムを標的とするためには、ＥＢＶに対して特異性を有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体が必要とされる。

図５は、Ｃａｓ９タンパク質の後に融合されたＥＧＦＰマーカーを含む組成物を示す。

ＥＢＶを標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミドの設計は、Ａｄｄｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．から得たＵ６プロモーター駆動性キメラガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）およびユビキタスプロモーター駆動性Ｃａｓ９で構成される。本発明では、市販のガイドＲＮＡおよびＣａｓ９ヌクレアーゼを使用することができる。Ｃａｓ９タンパク質の後に融合されているＥＧＦＰマーカーにより、Ｃａｓ９陽性細胞の選択を可能にした。

好ましくは、ガイドＲＮＡは、商業的に購入したか否かに関わらず、ＨＰＶゲノムの特定の部分を標的とするように設計されている。ＨＰＶ中の標的領域が識別され、ＨＰＶゲノムの選択部分を標的とするガイドＲＮＡが開発され、本発明の組成物に組み込まれる。本発明の態様では、ガイドＲＮＡ設計には、特定のウイルス株の基準ゲノムが選択される。

ＥＢＶに関しては、例えば、Ｂ９５−８株に由来する基準ゲノムを、設計指針として使用した。ＥＢＶ等の、目的のゲノム内の選択領域または遺伝子が標的とされる。例えば、６つの領域を、ゲノム編集の目的が異なる７つのガイドＲＮＡ設計で標的とすることができる。

図７は、候補となる構造関連標的、形質転換関連標的、および潜伏関連標的が示されているＥＢＶゲノムの概略図である。さらに、図７には、ｓｇＥＢＶ１、ｓｇＥＢＶ２、ｓｇＥＢＶ３、ｓｇＥＢＶ４／５、ｓｇＥＢＶ６、およびｓｇＥＢＶ７が、ＥＢＶゲノムを標的とする箇所が示されている。

図７は、ｇＲＮＡが参照ゲノムに沿って標的することを示しており、＃は構造標的を意味しており、＊は形質転換関連標的を意味しており、＋は潜伏関連標的を意味している。

ＥＢＶに関して、感染の潜在モードおよび溶菌モードの両方で発現される唯一の核エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）タンパク質は、ＥＢＮＡ１である。ＥＢＮＡ１は、潜伏感染に幾つかの重要な役割を果たすことが公知であるが、ＥＢＮＡ１は、遺伝子調節および潜伏ゲノム複製を含む多数のＥＢＶ機能にとって重要である。したがって、ガイドＲＮＡ ｓｇＥＢＶ４およびｓｇＥＢＶ５を選択して、ゲノムのこの全領域を切除するためにＥＢＮＡ１コード領域の両端を標的とした。こうした「構造」標的により、ＥＢＶゲノムを系統的により小さな小片に消化することが可能になる。ＥＢＮＡ３ＣおよびＬＭＰ１は、宿主細胞形質転換に不可欠であり、これら２つのタンパク質の５’エキソンをそれぞれ標的とするようにガイドＲＮＡ ｓｇＥＢＶ３およびｓｇＥＢＶ７を設計した。

（ｉｖ．細胞への導入）
本発明の方法は、ヌクレアーゼおよび配列特異的標的指向性部分をＨＰＶ感染ケラチノサイト内に導入することを含む。ヌクレアーゼは、配列特異的標的指向性部分によりウイルス核酸を標的とし、その後、宿主ゲノムを妨害することなくウイルス核酸を切断する。任意の好適な方法を使用して、ヌクレアーゼを感染細胞または組織に送達することができる。例えば、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする遺伝子を、注射により、経口で、または流体力学的送達により送達することができる。ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする遺伝子は、全身循環に送達してもよく、または特定の組織タイプに送達してもよく、もしくはそうでなければ局在化させてもよい。ヌクレアーゼまたヌクレアーゼをコードする遺伝子を修飾またはプログラムして、コードされているヌクレアーゼが、ある特定の組織タイプで優先的にまたはある特定の組織タイプでのみ転写されるように組織特異的プロモーターを使用することによる等の、ある特定の条件下でのみ活性化させてもよい。

一部の実施形態では、特異的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体が細胞内に導入される。ガイドＲＮＡは、ウイルスゲノムの少なくとも１つのカテゴリーの配列を標的とするように設計される。潜伏感染に加えて、本発明は、パッケージングにされる前に、または放出された後にウイルスゲノムを標的とすることにより、ウイルス複製を能動的に制御するために使用することもできる。

一部の実施形態では、ガイドＲＮＡのカクテルを細胞内に導入してもよい。ガイドＲＮＡは、ウイルスゲノムの多数のカテゴリーの配列を標的とするように設計される。ゲノムに沿って幾つかの領域を標的とすることにより、複数位置での二本鎖切断は、ゲノムを断片化し、修復の可能性を低下させる。修復機構が働いたとしても、こうした大きな欠失は、ウイルスを無力化する。

一部の実施形態では、幾つかのガイドＲＮＡを添加して、異なるカテゴリーの配列を標的とするカクテルが生成される。例えば、２、５、７、または１１個のガイドＲＮＡが、３つの異なるカテゴリーの配列を標的とするＣＲＩＳＰＲカクテル中に存在してもよい。しかしながら、任意の数のｇＲＮＡをカクテルに導入して、配列のカテゴリーを標的とすることができる。好ましい実施形態では、配列のカテゴリーは、それぞれ、ゲノム構造、宿主細胞形質転換、および潜伏感染性にとって重要である。

本発明の一部の態様では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験により、ウイルスゲノム内の最も必須な標的を決定することが可能である。例えば、ゲノムを効果的に無力化するために最も必須な標的を理解するために、ガイドＲＮＡのサブセットをモデル細胞内にトランスフェクトする。アッセイにより、どのガイドＲＮＡまたはどのカクテルが、必須なカテゴリーの配列を標的とするのに最も効果的であるかを決定することができる。

例えば、ＥＢＶゲノムを標的とする場合、ＣＲＩＳＰＲカクテル中の７個のガイドＲＮＡが、それぞれＥＢＶゲノム構造、宿主細胞形質転換、および潜伏感染性にとって重要であると識別されている３つの異なるカテゴリーの配列を標的とした。効果的なＥＢＶ処置に最も必須な標的を理解するために、ガイドＲＮＡのサブセットをＲａｊｉ細胞にトランスフェクトした。ｓｇＥＢＶ４／５は、ＥＢＶゲノムを８５％低減したが、完全カクテルほど効果的には細胞増殖を抑制することができなかった（図１４）。構造配列を標的とするガイドＲＮＡ（ｓｇＥＢＶ１／２／６）は、ＥＢＶ負荷を完全には除去しなかったが（２６％の減少）、細胞増殖を完全に中止させることができた。ゲノム編集の効率が高いことおよび増殖が停止したことを考慮すると、ｓｇＥＢＶ１／２／６の残留ＥＢＶゲノム痕跡は、インタクトなゲノムに起因するのではなく、ＥＢＶゲノムから消化された遊離の浮遊ＤＮＡ、つまり偽陽性であると疑われた。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を構築したら、複合体を細胞内に導入する。複合体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルまたはｉｎ ｖｉｖｏモデルの細胞内に導入することができることが理解されるべきである。本発明の態様では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体は、トランスフェクション後にウイルスのインタクトなゲノムを残さないように設計され、複合体は、効率的なトランスフェクションのために設計される。

本発明の態様では、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターを含む種々の方法によりＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡを細胞内にトランスフェクトすることが可能である。ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスを挙げることができる。任意のウイルスベクターを本発明に組み込んで、細胞内へのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の送達を達成することができることが理解されるべきである。消化または無力化のために設計されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体によっては、幾つかのウイルスベクターは、他のものよりも効果的であり得る。本発明の態様では、ベクターは、宿主細胞でベクターを複製および維持するのに必要な複製開始点等の必須成分を含む。

本発明の態様では、ウイルスベクターを送達ベクターとして使用して、複合体を細胞内に送達する。送達ベクターとしてのウイルスベクターの使用は、当技術分野で公知である。例えば、Wilkesらの米国特許出願公開第２００９／００１７５４３号を参照されたい。この文献の内容は、参照により組み込まれる。

レトロウイルスは、その核酸をｍＲＮＡゲノムの形態（５’キャップおよび３’ＰｏｌｙＡ尾部を含む）で格納し、偏性寄生体として宿主細胞を標的とする一本鎖ＲＮＡウイルスである。当技術分野の一部の方法では、核酸を細胞内に導入するためにレトロウイルスが使用されてきた。ウイルスは、宿主細胞の細胞質内部に入ると、それ自体の逆転写酵素を使用してそのＲＮＡゲノムからＤＮＡを産生する。これは、通常のパターンの逆であり、したがってレトロ（逆方向）である。その後、この新しいＤＮＡは、インテグラーゼ酵素により宿主細胞ゲノムに組み込まれ、その時点で、このレトロウイルスＤＮＡは、プロウイルスと呼ばれる。例えば、モロニーマウス白血病ウイルス等の組換えレトロウイルスは、安定的した様式の宿主ゲノム内への組込み能力を有する。それらは、宿主ゲノム内への組込みを可能にする逆転写酵素を含む。レトロウイルスベクターは、複製可能または複製欠損のいずれであってもよい。本発明の一部の実施形態では、細胞内へのトランスフェクションを達成にするためにレトロウイルスが組み込まれるが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体は、ウイルスゲノムを標的とするように設計される。

本発明の一部の実施形態では、レトロウイルスのサブクラスであるレンチウイルスが、ウイルスベクターとして使用される。レンチウイルスは、非分裂細胞のゲノム内への組込み能力を考慮すると、送達媒体（ベクター）として適合することができる。これは、他のレトロウイルスは分裂する細胞にしか感染することができないため、レンチウイルスに固有な特徴である。ＲＮＡの形態のウイルスゲノムは、ウイルスが細胞に進入してＤＮＡを産生する際に逆転写され、その後ウイルスのインテグラーゼ酵素により無作為位置でゲノム内に挿入される。この時点ではプロウイルスと呼ばれるベクターは、ゲノムに残留し、細胞が分裂するときに細胞の子孫に受け継がれる。

レンチウイルスとは対照的に、アデノウイルスＤＮＡは、ゲノムに組み込まれず、細胞分裂の間には複製されない。アデノウイルスおよび関連ＡＡＶは、宿主のゲノム内に組み込まれないため、送達ベクターとして使用され得る。本発明の一部の態様では、標的とされるウイルスゲノムだけが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体により影響を受け、宿主の細胞は影響を受けない。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ヒトおよび幾つかの他の霊長類種に感染する小型ウイルスである。ＡＡＶは、分裂する細胞および分裂しない細胞の両方に感染することができ、そのゲノムを宿主細胞のゲノム内に組み込むことができる。例えば、遺伝子治療ベクターとしての使用に有望であるため、自己相補性アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）と呼ばれる改変型ＡＡＶが研究者により生成されている。ＡＡＶは、ＤＮＡの一本鎖をパッケージングしており、第２鎖の合成プロセスを必要とするが、ｓｃＡＡＶは、両鎖をパッケージングしており、それらは共にアニーリングして二本鎖ＤＮＡを形成する。第２鎖の合成を省くことにより、ｓｃＡＡＶは、細胞内での迅速な発現が可能になる。それ以外については、ｓｃＡＡＶは、その対応するＡＡＶの多くの特徴を有している。さらに、またはあるいは、本発明の方法および組成物は、送達ベクターの手段として、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、またはワクシニアウイルスを使用することができる。

本発明のある特定の実施形態では、非ウイルスベクターを使用して、トランスフェクションを達成することができる。核酸の非ウイルス送達法としては、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン、または脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、およびＤＮＡの作用剤増強性取り込みが挙げられる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、第４，９４６，７８７号、および第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、ＴｒａｎｓｆｅｃｔａｍおよびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン性および中性脂質としては、Jesseeの米国特許第７，１６６，２９８号またはJesseの米国特許第６，８９０，５５４号に記載されているものが挙げられ、これら文献の各々の内容は、参照により組み込まれる。送達は、細胞に対してであってもよく（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ投与）、または標的組織に対してでもよい（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ投与）。

合成ベクターは、典型的には、負荷電の核酸と複合体を形成して１００ｎｍ程度の直径を有する粒子を形成することができるカチオン性脂質またはポリマーに基づく。複合体は、ヌクレアーゼによる分解から核酸を保護する。さらに、細胞および局所送達戦略は、内部移行、放出、および適切な細胞内コンパートメント中の分配の必要性に対処しなければならない。全身送達戦略は、さらなるハードル、例えば、カチオン性送達媒体と血液成分との強力な相互作用、細網内皮系による取り込み、腎臓ろ過、目的の細胞に対する担体の毒性および標的指向能力に遭遇する。カチオン性非ウイルスの表面を修飾することにより、血液成分とのそれらの相互作用を最小限に抑え、細網内皮系取り込みを低減し、それらの毒性を低減し、標的細胞とのそれらの結合親和性を増加させることができる。血漿タンパク質との結合（オプソニン化とも称される）は、ＲＥＳが循環ナノ粒子を認識する主要機序である。例えば、肝臓のクッパー細胞等のマクロファージは、スカベンジャー受容体を介してオプソニン化されたナノ粒子を認識する。

本発明の一部の実施形態では、非ウイルスベクターは、標的送達およびトランスフェクションを達成するように修飾される。ペグ化（つまり、表面をポリエチレングリコールで修飾すること）は、非ウイルスベクターのオプソニン化および凝集を低減し、細網内皮系によるクリアランスを最小限に抑えて、静脈内（ｉ．ｖ．）投与後の循環寿命延長をもたらすために使用される主要な方法である。したがって、ペグ化ナノ粒子は、「ステルス」ナノ粒子と呼ばれることが多い。循環から迅速にクリアランスされないナノ粒子は、感染細胞に遭遇する機会を得ることになる。

しかしながら、表面のＰＥＧは、標的細胞による取り込みを減少させ、生物学的活動を低減させる場合がある。したがって、ペグ化成分の遠位端部に標的指向性リガンドを付加することが必要であり、標的細胞表面の受容体との結合が可能になるように、ＰＥＧ「シールド」を越えてリガンドを突出させる。カチオン性リポソームを遺伝子担体として使用する場合、核酸の放出には、六方相形成を促進してエンドソーム脱出を可能にすること以外に、中性ヘルパー脂質の応用が有用である。本発明の一部の実施形態では、核酸を全身送達するための、および実験動物モデルにおいて治療効果を得るための、中性またはアニオン性リポソームが開発される。また、新規のカチオン性脂質およびポリマー、およびペプチドと共有結合または非共有結合で結合する遺伝子、標的指向性リガンド、ポリマー、または環境感受性部分の設計および合成も、非ウイルスベクターが遭遇する問題の解決のために注目されている。無機ナノ粒子（例えば、金属ナノ粒子、酸化鉄、リン酸カルシウム、リン酸マグネシウム、リン酸マンガン、複水酸化物、カーボンナノチューブ、および量子ドット）を送達ベクターに施したものを調製し、多くの異なる様式で表面官能化することができる。

一部の実施形態では、複合体は、中でもリポソーム、アルブミンに基づく粒子、ペグ化タンパク質、生分解性ポリマー薬物複合材料、ポリマーミセル、デンドリマー等の全身療法用のナノ系にコンジュゲートされる。Davisら、２００８年、Nanotherapeutic particles: an emerging treatment modality for cancer、Nat Rev Drug Discov.、７巻（９号）：７７１〜７８２頁を参照されたい。この文献は、参照により組み込まれる。リポソーム等の長期循環巨大分子担体では、増強された透過性、および腫瘍血管からの優先的血管外漏出に対する保持効果を活用することができる。ある特定の実施形態では、本発明の複合体は、細胞への送達用のリポソームまたはポリマーソーム（polymerosome）にコンジュゲートされているか、または封入されている。例えば、リポソームアントラサイクリンは、非常に効率的な封入化を達成しており、リポソームダウノルビシンおよびペグ化リポソームドキソルビシン等の超長期循環性を有する型が挙げられる。Krishnaら、Carboxymethylcellulose-sodium based transdermal drug delivery system for propranolol、J Pharm Pharmacol.、１９９６年４月；４８巻（４号）：３６７〜７０頁を参照されたい。

リポソーム送達系は、安定製剤を提供し、薬物動態の向上、および組織に対するある程度の「受動的」または「生理学的」標的指向性を提供する。有望な化学治療剤等の親水性および疎水性物質の封入化は公知である。例えば、以下の文献を参照されたい：Schneiderの米国特許第５，４６６，４６８号、合成脂質を含む非経口投与可能なリポソーム製剤が開示されている；Hostetlerらの米国特許第５，５８０，５７１号、リン脂質にコンジュゲートされているヌクレオシド類似体が開示されている；Nyqvistの米国特許第５，６２６，８６９号、薬学的活性化合物が、少なくとも１つの両親媒性成分および極性脂質成分および少なくとも１つの無極性脂質成分を含む限定脂質系に含まれているヘパリンまたはその断片である医薬組成物が開示されている。

リポソームおよびポリマーソームは、複数の溶液および化合物を含んでいてもよい。ある特定の実施形態では、本発明の複合体は、ポリマーソームとカップリングされているか、またはポリマーソームに封入されている。人工小胞の一種としてのポリマーソームは、溶液を取り囲む極小中空球体であり、両親媒性合成ブロックコポリマーを使用して小胞膜を形成することにより製作される。一般的なポリマーソームは、それらのコアに水溶液を含有し、薬物、酵素、他のタンパク質およびペプチド、ならびにＤＮＡおよびＲＮＡ断片等の感受性分子を封入し、保護するのに有用である。ポリマーソーム膜は、生物学的系に見出されるもの等の、外部物質から封入した物質を隔離する物理的障壁を提供する。ポリマーソームは、公知の技法により複乳剤から生成することができる。Lorenceauら、２００５年、Generation of Polymerosomes from Double-Emulsions、Langmuir、２１巻（２０号）：９１８３〜６頁を参照されたい。この文献は、参照により組み込まれる。

本発明の態様は、送達ベクターの使用を数多く提供する。送達ベクターの選択は、標的とされている細胞または組織、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡの特定の組成に基づく。例えば、上記で考察されているＥＢＶの例では、リンパ球は、リポフェクションに抵抗性であることが公知であるため、Ｒａｊｉ細胞内へのＤＮＡ送達には、ヌクレオフェクション（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒと呼ばれるデバイスにより生成される電気的パラメータと、細胞核内および細胞質内に基質を直接移行させる細胞タイプ特異的試薬との組合せ）が必要であった。Ｌｏｎｚａ ｐｍａｘプロモーターは、Ｃａｓ９発現を駆動する。それは、このプロモーターがＲａｊｉ細胞内での強力な発現をもたらしていたためである。ヌクレオフェクションの２４時間後、蛍光顕微鏡で、少数の細胞から明白なＥＧＦＰシグナルが観察された。しかしながら、ＥＧＦＰ陽性細胞集団は劇的に減少し、ヌクレオフェクションの４８時間後に１０％未満のトランスフェクション効率が測定された。

図６は、Ｒａｊｉ細胞におけるトランスフェクション効率に対するｏｒｉＰの影響を示す。ＥＢＶ複製開始点配列ｏｒｉＰを含んでいたＣＲＩＳＰＲプラスミドは、６０％超のトランスフェクション効率をもたらした。

本発明の態様は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体および標的指向性送達を使用する。一般的で公知の経路としては、経皮経路、経粘膜（transmucal）経路、経鼻経路、経眼経路、経肺経路が挙げられる。薬物送達系はとしては、リポソーム、プロリポソーム、ミクロスフェア、ゲル、プロドラッグ、シクロデキストリン等を挙げることができる。本発明の態様では、肺の特定部位または細胞集団を標的とするためのエアロゾルに移行されることになる、生分解性ポリマーで構成されているナノ粒子が使用され、所定の様式での薬物放出および許容される期間内での分解が提供される。経皮的および径粘膜的制御放出送達系、鼻およびバッカルエアゾルスプレー、薬物含浸ロゼンジ、封入細胞、経口柔質ゲル、皮膚を介して薬物を投与するイオントフォレーシスデバイス、ならびに様々なプログラム可能な移植薬物送達デバイス等の制御放出技術（ＣＲＴ）を、本発明の複合体と共に使用して、標的指向性制御送達が達成される。

（ｖ．ウイルス核酸切断）
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体は、細胞内部に入ると、ウイルスゲノムを標的とする。本発明の態様では、複合体は、ウイルスゲノムへと標的化されている。潜伏感染に加えて、本発明を使用して、パッケージングにされる前にまたは放出された後にウイルスゲノムを標的とすることにより、ウイルス複製を能動的に制御することもできる。一部の実施形態では、本発明の方法および組成物は、Ｃａｓ９等のヌクレアーゼを使用して潜伏ウイルスゲノムを標的とし、それにより増殖の機会を低減させる。

図３は、Ｅ６についてはｇＲＮＡでありＥ７についてはｇＲＮＡであるＣａｓ９エンドヌクレアーゼを用いたＨＰＶゲノムの成功裏の切断の結果を示す。ヌクレアーゼは、ｇＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）と複合体を形成する。複合体は、ウイルス核酸を標的化様式で切断して、ウイルスゲノムを無力化する。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ウイルスゲノムの二本鎖切断を引き起こす。ウイルスゲノムに沿った幾つかの位置を標的とし、一本鎖切断ではなく二本鎖切断を引き起こすことにより、ゲノムに沿った幾つかの位置でゲノムが効果的に切断される。好ましい実施形態では、二本鎖切断は、天然の修復機構がゲノムを共に接合した場合であってもゲノムが無力化されるように、小型の欠失が引き起こされるか、または小さな断片がゲノムから除去されるように設計されている。

ケラチノサイト内への導入後、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体は、ＨＰＶゲノム、遺伝子、転写物、または他のウイルス核酸に作用する。ＣＲＩＳＰＲにより生成された二本鎖ＤＮＡ切断は、修復されて小型の欠失がもたらされる。こうした欠失は、タンパク質コードを中断し、したがってノックアウト効果を発揮することになる。

ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする遺伝子は、トランスフェクションにより感染細胞内に送達することができる。例えば、感染ケラチノサイトに、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡをコードするＤＮＡをトランスフェクトすることができる（単一の小片または別々の小片で）。ｇＲＮＡは、ウイルスゲノムに沿って１つまたは幾つかの位置にＣａｓ９エンドヌクレアーゼを局在化させるように設計される。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ゲノム中に二本鎖切断を引き起こし、ウイルスゲノムから小断片を欠失させる。欠失は、修復機構が働いたとしても、ウイルスゲノムを無力化する。

（ｖｉ．宿主ゲノム）
本発明の方法および組成物は、宿主遺伝物質を妨害せずにウイルス核酸を標的とするために使用することができることが理解される。本発明の方法および組成物は、ウイルス配列内の標的にハイブリダイズする配列を有するガイドＲＮＡ等の標的指向性部分を使用する。本発明の方法および組成物は、ｇＲＮＡを使用して、排他的にウイルスゲノムと結合し、二本鎖を切断することによりウイルス配列を宿主から除去するｃａｓ９酵素等の標的に向かうヌクレアーゼまたはそのようなヌクレアーゼをコードするベクターをさらに使用してもよい。

標的指向性部分がガイドＲＮＡを含む場合、ｇＲＮＡの配列またはガイド配列は、ウイルス配列を調査して、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接し、しかもプロトスペーサーモチーフに隣接する宿主ゲノムには出現しない約２０個のヌクレオチドの領域を見出すことにより決定することができる。

好ましくは、ガイド配列は、ガイド配列に従って製作されるｇＲＮＡ／ｃａｓ９複合体が、宿主ゲノムを妨害することなく、ウイルス配列の指定の特徴または標的と結合しそれらを消化することになるように、ある特定の類似性基準（例えば、ＰＡＭにより近い領域に向かってバイアスのかかった同一性と少なくとも６０％同一であること）を満たす。好ましくは、ガイドＲＮＡは、ウイルス配列中のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）（例えば、ＮＧＧ、この場合Ｎは任意のヌクレオチドである）の次のヌクレオチド文字列に対応する。好ましくは、宿主ゲノムは、（１）所定の類似性基準によるヌクレオチド文字列が一致し、（２）またＰＡＭに隣接するあらゆる領域を欠如する。所定の類似性基準は、例えば、ＰＡＭの５’側にある２０個ヌクレオチド内に少なくとも１２個の一致ヌクレオチドがあるという要件を含んでいてもよく、また、ＰＡＭの５’側にある１０個ヌクレオチド内に少なくとも７個の一致ヌクレオチドがあるという要件を含んでいてもよい。注釈付きウイルスゲノム（例えば、ＧｅｎＢａｎｋからの）を使用して、ウイルス配列の特徴を識別し、ウイルス配列の選択特徴（例えば、ウイルス複製開始点、末端反復、複製因子結合部位、プロモーター、コード配列、または反復領域）内のウイルス配列のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の次のヌクレオチド文字を見出してもよい。ウイルス配列および注釈は、ゲノムデータベースから得ることができる。

複数の候補ｇＲＮＡ標的がウイルスゲノムに見出される場合、ガイドＲＮＡの鋳型である配列の選択は、ガイド配列としての標的特徴に最も近いかまたは最も５’端にある候補標的を優先してもよい。選択は、好ましくは、中間的な（例えば、４０％〜６０％の）ＧＣ含量を有する配列を優先的に選んでもよい。エンドヌクレアーゼによるＲＮＡ指向性標的化に関するさらなる背景は、以下の文献で考察されている：米国特許出願公開第２０１５／００５０６９９号；米国特許出願公開第２０１４０３５６９５８号；米国特許出願公開第２０１４／０３４９４００号；米国特許出願公開第２０１４／０３４２４５７号；米国特許出願公開第２０１４／０２９５５５６号；および米国特許出願公開第２０１４／０２７３０３７号。これら文献の各々の内容は、参照によりあらゆる目的のために組み込まれる。感染細胞にヒトゲノムのバックグラウンドが存在するため、ウイルスゲノムに対する効率が高く、ヒトゲノムに対するオフターゲット効果が低いことを保証するための１組のステップが提供される。こうしたステップは、（１）ウイルスゲノム内の標的を選択すること、（２）宿主ゲノムのＰＡＭ＋標的配列を回避すること、（３）株間で保存されているウイルス標的を方法論的に選択すること、（４）適切なＧＣ含量を有する標的を選択すること、（５）細胞でのヌクレアーゼ発現を制御すること、（６）ベクターを設計すること、（７）アッセイで検証すること等、およびそれらの種々の組合せを含んでいてもよい。標的指向性部分（ガイドＲＮＡ等）は、好ましくは、（ｉ）潜伏関連標的、（ｉｉ）感染および症状関連標的、および（ｉｉｉ）構造関連標的等の、ある特定のカテゴリー内の標的と結合する。

ｇＲＮＡの第１のカテゴリーの標的は、潜伏関連標的を含む。ウイルスゲノムは、潜伏を維持するためにある特定の特徴を必要とする。こうした特徴としては、これらに限定されないが、マスター転写制御因子、潜伏特異的プロモーター、宿主細胞と情報交換するシグナル伝達タンパク質等が挙げられる。宿主細胞が潜伏中に分裂している場合、ウイルスゲノムは、複製系がゲノムのコピーレベルを維持することが必要である。ウイルス複製開始点、末端反復、および複製開始点に結合する複製因子は、良好な標的である。こうした特徴の機能が妨害されると、ウイルスが再活性化し、それは、従来の抗ウイルス療法で処置することができる。

ｇＲＮＡの第２のカテゴリーの標的は、感染関連および症状関連の標的を含む。ウイルスは、感染を促進するための種々の分子を産生する。ウイルスは、宿主細胞に進入すると、溶菌サイクルを開始し、それにより細胞死および組織損傷（ＨＢＶ）を引き起こし得る。ＨＰＶ１６等のある特定の場合では、細胞産物（Ｅ６およびＥ７タンパク質）は、宿主細胞を形質転換し、がんを引き起こし得る。こうした分子を産生する重要なゲノム配列（プロモーター、コード配列等）を妨害すると、さらなる感染を予防することができ、および／またはその疾患の症状を治癒しないとしても、緩和することができる。

ｇＲＮＡの第３のカテゴリーの標的は、構造関連標的を含む。ウイルスゲノムは、ゲノム統合、複製、または他の機能を支援する反復領域を含む場合がある。反復領域を標的とすると、ウイルスゲノムを切断して複数の小片にすることができ、それによりゲノムは物理的に破壊される。

ヌクレアーゼがｃａｓタンパク質である場合、標的指向性部分は、ガイドＲＮＡである。各ｃａｓタンパク質は、標的とされた配列の次の特定のＰＡＭ（ガイドＲＮＡのではない）を必要とする。これは、ヒトゲノム編集の場合と同じある。現在の理解では、ガイドＲＮＡ／ヌクレアーゼ複合体は、まずＰＡＭに結合し、その後ガイドＲＮＡと標的ゲノムとの間の相同性を探索する。Sternbergら、２０１４年、DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9、Nature、５０７巻（７４９０号）：６２〜６７頁。ＤＮＡは、認識されると、ＰＡＭの３−ｎｔ上流で消化される。こうした結果は、オフターゲット消化が起こるためには、宿主ＤＮＡにＰＡＭが存在し、かつガイドＲＮＡとＰＡＭ直前の宿主ゲノムとの間の親和性が高いことが必要であることを示唆している。

高度に保存されているウイルスゲノムの部分を標的とする標的指向性部分を使用することが好ましい場合がある。ウイルスゲノムは、ヒトゲノムよりもはるかに変異性が高い。異なる株を標的とするために、ガイドＲＮＡは、好ましくは、保存された領域を標的とすることになる。ＰＡＭは、最初の配列認識にとって重要であるため、保存された領域にＰＡＭを有することも不可欠である。

好ましい実施形態では、本発明の方法を使用して、核酸を細胞に送達する。細胞に送達される核酸は、決定されたガイド配列を有するｇＲＮＡを含んでいてもよく、または核酸は、標的遺伝物質に対して作用することになる酵素をコードするプラスミド等のベクターを含んでいてもよい。その酵素が発現されることにより、標的遺伝物質の分解またはそうでなければ妨害が可能になる。酵素は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ等のヌクレアーゼであってもよく、また、核酸は、決定されたガイド配列を有する１つまたは複数のｇＲＮＡをコードしていてもよい。

ｇＲＮＡにより、ヌクレアーゼは、標的遺伝物質を標的とする。標的遺伝物質がウイルスゲノムを含む場合、そのゲノムの一部分に相補的なｇＲＮＡは、ヌクレアーゼによるそのゲノムの分解（degredation）を誘導することができ、それにより、インタクトなウイルスゲノムのさらなる複製が一切防止されるか、またはさらに細胞から完全に除去される。こうした手段により、潜伏ウイルス感染を標的として根絶することができる。

宿主細胞は、特定の細胞タイプによっては、異なる速度で増殖する場合がある。迅速な細胞複製にはヌクレアーゼの発現が高いことが必要であるが、未感染細胞のオフターゲット切断を回避するには、発現は低い方が役に立つ。ヌクレアーゼ発現の制御は、幾つかの態様により達成することができる。ヌクレアーゼがベクターから発現される場合、ベクターがウイルス複製開始点を有することにより、ベクターのコピー数を感染細胞でのみ劇的に増加させることができる。各プロモーターは、異なる組織では異なる活性を有する。遺伝子転写は、異なるプロモーターを選択することにより調整することができる。また、転写物およびタンパク質安定性は、安定化または不安定化モチーフ（ユビキチン標的指向性配列等）を配列に組み込むことにより調整することができる。

ｇＲＮＡ配列、ヌクレアーゼ（例えば、ｃａｓ９）、他のエレメント、またはそれらの組合せに対する特異的プロモーターを使用してもよい。例えば、一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｕ６プロモーターにより駆動される。タンパク質発現用のプロモーターを含むベクターを設計してもよい（例えば、Ｌｏｎｚａ Ｇｒｏｕｐ Ｌｔｄ（バーゼル、スイス）によりＰＭＡＸＣＬＯＮＩＮＧという商標名で販売されているベクターに記載されているプロモーターを使用して）。ベクターは、プラスミドであってもよい（例えば、合成機器２５５および組換えＤＮＡ実験装置で生成される）。ある特定の実施形態では、プラスミドは、Ｕ６プロモーター駆動性ｇＲＮＡまたはキメラガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）およびユビキタスプロモーター駆動性ｃａｓ９を含む。任意選択で、ベクターは、後にｃａｓ９＋細胞を選択することを可能にするために、ｃａｓ９タンパク質の後に融合されているＥＧＦＰ等のマーカーを含んでいてもよい。ｃａｓ９は、ｇＲＮＡ（元の細菌系のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と類似している）を、相補的なｔｒａｎｓ活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と共に使用して、ｇＲＮＡに相補的なウイルス配列を標的とすることができることが理解される。ｃａｓ９は、単一のＲＮＡ分子、ｇＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡのキメラでプログラムすることができることも示されている。単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、プラスミドにコードすることができ、ｓｇＲＮＡの転写は、ｃａｓ９のプログラミングおよびｔｒａｃｒＲＮＡの機能を提供することができる。背景については、Jinek、２０１２年、A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity、Science、３３７巻：８１６〜８２１頁、および特にこの文献の図５Ａを参照されたい。

上記の原理を使用すると、本発明の方法および組成物を使用して、宿主ゲノムに悪影響を及ぼさずに、感染宿主のウイルス核酸を標的とすることができる。

さらなる背景は、Hsu、２０１３年、DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases、Nature Biotechnology、３１巻（９号）：８２７〜８３２頁；およびJinek、２０１２年、A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity、Science、３３７巻：８１６〜８２１頁を参照されたい。これら文献の各々の内容は、参照により組み込まれる。標的位置は、（ｉ）潜伏関連標的（ｉｉ）感染および症状関連標的、または、（ｉｉｉ）構造関連標的等の、ある特定のカテゴリー内にあるものが選択されるため、これら配列を切断することにより、ウイルスが不活化され、宿主からウイルスが除去される。標的指向性ＲＮＡ（ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）は、ウイルス遺伝子配列の標的と一致するが、宿主ゲノムと一致する一切のオフターゲットを起こさないという類似性基準を満たすように設計されているため、潜伏ウイルス遺伝物質は、宿主ゲノムを一切妨害せずに宿主から除去される。

（ｖｉｉ．組成物）
図３６は、ＲＮＡでガイドされるヌクレアーゼ３２０５およびウイルスのウイルス核酸内の標的部位に相補的な部分を有するＲＮＡ ３２１３を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）３２３１を含む組成物３２３０を示す。ＲＮＰは、任意の細胞の外の溶液中で、活性形態で存在するという点において、好ましくは細胞外ＲＮＰである。ＲＮＡでガイドされるヌクレアーゼ３２０５は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１等のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質であってもよい。図５２は、ＲＮＰ ３２３１を包み込むリポソーム５２１５を示す。図５３は、リポソーム５２１５内に包み込まれたＲＮＰ ３２３１が、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に感染した細胞に送達されると、初期遺伝子、特にＥ６およびＥ７内のＨＰＶのウイルス核酸を切断する組成物の実施形態を提供することを示す。図５３および図５１に示されるように、初期遺伝子（Ｅ６およびＥ７）内の複数の部位を標的とするガイドＲＮＡと共に複数のＲＮＰが送達されると、組成物はＨＰＶ＋がん細胞を死滅させることについて、有効である。図３６は、細胞内の外来核酸を切断する（切断産物が代謝経路に入る可能性があるため、外来核酸を効果的に除去する）方法３２０１を示す。この方法は、上に記載の任意の実施形態に従った細胞外ＲＮＰ ３２３１を含む組成物３２３０を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞３２５９または組織に、または患者に送達するステップ、およびウイルス核酸をＲＮＰで切断するステップを含む。

一部の実施形態では、本発明は、局所適用（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ、人の皮膚に直接）のための組成物３２３０を提供する。組成物は、表面に（例えば、局所的に）適用されてもよい。この組成物はヌクレアーゼ３２０５またはその遺伝子を提供し、医薬的に許容される希釈剤、アジュバントまたは担体を含む。好ましくは、主題の発明に従って使用される担体は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）などの管轄権を有する政府機関によって、動物またはヒトの使用のために認可されている。例としては、リン酸緩衝食塩水、生理食塩水、水、および油／水エマルジョン等のエマルジョンが挙げられるが、これらに限定される訳ではない。担体は、例えば、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒体であってよい。これらの製剤には、約０．０１％〜約１００％、好ましくは約０．０１％〜約９０％のＭＦＢ抽出物、残りの約０％〜約９９．９９％、好ましくは約１０％〜約９９．９９％の許容可能な担体または他の賦形剤が含まれる。より好ましい製剤には、約１０％までのＭＦＢ抽出物および約９０％またはそれ超の担体または賦形剤が含まれる一方で、典型的で最も好ましい組成物には、約５％のＭＦＢ抽出物および約９５％の担体または他の賦形剤が含まれる。製剤は、当業者に周知であり、そして容易に利用可能な多くの情報源に記載されている。

（参照による組込み）
本開示の全体にわたって、特許、特許出願、特許公報、ジャーナル、本、論文、ウェブコンテンツ等の他の文献が参照および引用されている。そのような文献は全て、それらの全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

（均等物）
本明細書に図示および記載されているものに加えて、本発明およびその多数のさらなる実施形態に対する種々の改変は、当業者であれば、本明細書に引用されている科学文献および特許文献への参照を含む本書類の完全な内容から明白になる。本明細書の主題は、種々の実施形態およびその均等物にて本発明を実施するために応用することができる重要な情報、例示、および指針を含む。

（実施例１）
標的ＥＢＶ
バーキットリンパ腫細胞株Ｒａｊｉ、Ｎａｍａｌｗａ、およびＤＧ−７５を、ＡＴＣＣから取得し、ＡＴＣＣの推奨に従って１０％ＦＢＳおよびＰＳＡで補完されたＲＰＭＩ１６４０で培養した。ヒト原発性肺線維芽細胞ＩＭＲ−９０を、Ｃｏｒｉｅｌｌから取得し、１０％ＦＢＳおよびＰＳＡで補完されたアドバンストＤＭＥＭ／Ｆ−１２で培養した。

Cong Lら、（２０１３年）、Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.、Science、３３９巻：８１９〜８２３頁に記載されているような、Ｕ６プロモーター駆動性キメラガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）およびユビキタスプロモーター駆動性Ｃａｓ９からなるプラスミドは、ａｄｄｇｅｎｅから得た。Ｃａｓ９タンパク質の後に融合されているＥＧＦＰマーカーで、Ｃａｓ９陽性細胞の選択を可能にした（図５）。本発明者らは、より効率的なＰｏｌ−ＩＩＩ転写およびより安定的なステム−ループ構造のために修飾型キメラガイドＲＮＡ設計を採用した（Chen Bら、（２０１３年）、Dynamic Imaging of Genomic Loci in Living Human Cells by an Optimized CRISPR/Cas System.、Cell、１５５巻：１４７９〜１４９１頁）。

本発明者らは、ｐＸ４５８をＡｄｄｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．から得た。合成イントロン（ｐｍａｘ）を有する修飾ＣＭＶプロモーターを、Ｌｏｎｚａ対照プラスミドｐｍａｘ−ＧＦＰからＰＣＲで増幅した。修飾ガイドＲＮＡ ｓｇＲＮＡ（Ｆ＋Ｅ）をＩＤＴに注文した。ＥＢＶ複製開始点ｏｒｉＰを、Ｂ９５−８形質転換リンパ芽球様細胞株ＧＭ１２８９１からＰＣＲで増幅した。本発明者らは、標準的なクローニングプロトコールを使用して、ｐｍａｘ、ｓｇＲＮＡ（Ｆ＋Ｅ）、およびｏｒｉＰをｐＸ４５８にクローニングし、元のＣＡＧプロモーター、ｓｇＲＮＡ、およびｆ１開始点を置換した。本発明者らは、Ｂ９５−８基準に基づいてＥＢＶ ｓｇＲＮＡを設計し、ＩＤＴにＤＮＡオリゴを注文した。ｐＸ４５８の元々のｓｇＲＮＡプレースホールダーは、陰性対照として役目を果たす。

リンパ球は、リポフェクションに抵抗性であることが公知であり、したがって、本発明者らは、Ｒａｊｉ細胞内へのＤＮＡ送達にヌクレオフェクションを使用した。本発明者らは、Ｌｏｎｚａ ｐｍａｘプロモーターを選択して、Ｃａｓ９発現を駆動する。それは、このプロモーターがＲａｊｉ細胞内での強力な発現をもたらしていたためである。本発明者らは、ＤＮＡ送達にＬｏｎｚａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩを使用した。５００万個のＲａｊｉ細胞またはＤＧ−７５細胞に、各々１００ｕｌ反応で５ｕｇプラスミドをトランスフェクトした。細胞株キットＶおよびプログラムＭ−０１３を、Ｌｏｎｚａの推奨に従って使用した。ＩＭＲ−９０の場合、１００ｕｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｖ中で５ｕｇプラスミドを用いて、１００万個の細胞にプログラムＴ−０３０またはＸ−００５をトランスフェクトした。本発明者らは、ヌクレオフェクションの２４時間後に、蛍光顕微鏡で少数の細胞からの明白なＥＧＦＰシグナルを観察した。しかしながら、その後ＥＧＦＰ陽性細胞集団は劇的に減少し、本発明者らは、ヌクレオフェクションの４８時間後には１０％未満のトランスフェクション効率を測定した（図６）。本発明者らは、このトランスフェクション効率の減少は、細胞分裂によるプラスミド希釈に起因すると考えた。宿主細胞内のプラスミドレベルを活性に維持するために、本発明者らは、ＥＢＶ複製開始点配列、ｏｒｉＰを含むようにＣＲＩＳＰＲプラスミドの再設計した。細胞内部での活性プラスミド複製により、トランスフェクション効率は、６０％超に上昇した（図６）。

ＥＢＶゲノムを標的とするガイドＲＮＡを設計するために、本発明者らはＢ９５−８株に由来するＥＢＶ参照ゲノムに依存した。異なるゲノムの編集の目的のために７つのガイドＲＮＡ設計で６つの領域を標的とした。ガイドＲＮＡは、WangおよびQuake、２０１４年、RNA-guided endonuclease provides a therapeutic strategy to cure latent herpesviridae infection、PNAS １１１巻（３６号）：１３１５７〜１３１６２頁およびＰＮＡＳウェブサイトにオンラインで公開されている文献の補足情報の表Ｓ１に列挙されており、これらの両方の文献の内容はあらゆる目的のために引用により取り込まれる。

ＥＢＮＡ１は、遺伝子調節および潜伏ゲノム複製を含む、多くのＥＢＶ機能にとって重要である。本発明者らは、ゲノムのこの領域全体を切除するために、ＥＢＮＡ１コード領域の両端に対するガイドＲＮＡ ｓｇＥＢＶ４およびｓｇＥＢＶ５を標的とした。ガイドＲＮＡ ｓｇＥＢＶ１、２、および６は、反復領域内にあるため、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ切断の成功率が倍増する。こうした「構造」標的により、ＥＢＶゲノムを系統的により小さな小片に消化することが可能になる。ＥＢＮＡ３ＣおよびＬＭＰ１は、宿主細胞形質転換に不可欠であり、本発明者らは、これら２つのタンパク質の５’エキソンを標的とするように、それぞれガイドＲＮＡ ｓｇＥＢＶ３およびｓｇＥＢＶ７を設計した。

ＥＢＶゲノム編集。

ＣＲＩＳＰＲにより生成される二本鎖ＤＮＡ切断は、修復されて小型の欠失がもたらされる。こうした欠失は、タンパク質コードを中断し、したがってノックアウト効果を発揮することになる。ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイにより、個々の部位の効率的な編集を確認した。

図３２には、ＥＢＶ ＣＲＩＳＰＲのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイが示されている（レーンは左から右へと付番されている：レーン１：ＮＥＢ １００ｂｐラダー；レーン２：ｓｇＥＢＶ１対照；レーン３：ｓｇＥＢＶ１；レーン４：ｓｇＥＢＶ５対照；レーン５：ｓｇＥＢＶ５；レーン６：ｓｇＥＢＶ７対照；レーン７：ｓｇＥＢＶ７；レーン８：ｓｇＥＢＶ４）。

各ガイドＲＮＡにより誘導された独立した小型欠失を越えた標的部位間の大きな欠失は、ＥＢＶゲノムを系統的に破壊することができる。

図８は、ガイドＲＮＡ ｓｇＥＢＶ２およびＰＣＲプライマー位置の周辺のゲノム構成を示す。

図９は、ｓｇＥＢＶ２によって誘導される大きな欠失を示し、レーン１〜３は、それぞれ、ｓｇＥＢＶ２処理の前、５日後、および７日後である。ガイドＲＮＡ ｓｇＥＢＶ２は、１２個の１２５ｂｐ繰り返し単位を有する領域を標的とする（図８）。全反復領域のＰＣＲ増幅産物は約１．８ｋｂのバンドを与えた（図９）。ｓｇＥＢＶ２トランスフェクションの５日後または７日後に、同じＰＣＲ増幅から約０．４ｋｂのバンドを得た（図９）。約１．４ｋｂの欠失は、最初および最後の反復単位における切断間の修復ライゲーションの期待された産物である（図８）。

ｓｇＲＮＡ標的に隣接するＤＮＡ配列を、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲ増幅した。ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイを、製造業者の説明書に従って実施した。大きな欠失を有するＤＮＡ増幅産物を、ＴＯＰＯクローニングし、単一のコロニーを使用してサンガー配列決定を行った。ＥＢＶ負荷を、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ ＢｉｏＭａｒｋでのＴａｑｍａｎデジタルＰＣＲで測定した。保存されているヒト遺伝子座を標的とするＴａｑｍａｎアッセイを、ヒトＤＮＡ正規化に使用した。Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ｃ１に由来する単一細胞全ゲノム増幅産物の１ｎｇを、ＥＢＶ定量ＰＣＲに使用した。

本発明者らは、固有標的間の領域を欠失させることが可能であるこちょを実証した（図１０）。ｓｇＥＢＶ４〜５トランスフェクションの６日後、隣接領域全体をＰＣＲ増幅したところ（プライマーＥＢＶ４Ｆおよび５Ｒを用いて）、より短い増幅産物が得られ、同時に、予想される２ｋｂのバンドは非常によりかすかであった（図１１）。増幅産物クローンをサンガー配列決定したところ、２つの予期される切断部位が直接接続されていることが確認された（図１３）。ｓｇＥＢＶ３〜５を用いた同様の実験でも、ＥＢＮＡ３ＣからＥＢＮＡ１までのさらに大きな欠失が判明した（図１１〜１２）。

プライマー設計等のさらなる情報は、WangおよびQuake、２０１４年、RNA-guided endonuclease provides a therapeutic strategy to cure latent herpesviridae infection、PNAS、１１１巻（３６号）：１３１５７〜１３１６２頁、およびＰＮＡＳのウェブサイトにオンラインで公開されているこの論文の補足情報に示されている。これら書類の内容は両方とも、参照によりあらゆる目的のために組み込まれる。

ＥＢＶゲノム破壊による細胞増殖停止。

ＣＲＩＳＰＲトランスフェクションの２日後、さらなる培養のためにＥＧＦＰ陽性細胞をフロー選別し、毎日生存細胞を数えた。図１０は、ガイドＲＮＡ ｓｇＥＢＶ３／４／５およびＰＣＲプライマーの位置の周辺のゲノム構成を与える。

図１１は、ｓｇＥＢＶ３／５およびｓｇＥＢＶ４／５によって誘導される大きな欠失を示し、レーン１および２は、ｓｇＥＢＶ３／５処理の前および８日後の３Ｆ／５Ｒ ＰＣＲ増幅産物であり；レーン３および４は、ｓｇＥＢＶ４／５処理の前および８日後の４Ｆ／５Ｒ ＰＣＲ増幅産物である。

図１２は、サンガー配列決定により、ｓｇＥＢＶ３／５処理のゲノム切断および８日後に修復ライゲーションが確認されたことを示す。

図１３は、サンガー配列決定により、ｓｇＥＢＶ４／５処理のゲノム切断および８日後に修復ライゲーションが確認されたことを示す。

図１４は、異なるＣＲＩＳＰＲ処置後のいくつかの細胞増殖曲線を示す。

図１５〜１７は、ｓｇＥＢＶ１〜７処置前（図１５）、５日後（図１６）および８日後（図１７）のフローサイトメトリー散乱シグナルを与える。

図１８〜２０は、ｓｇＥＢＶ１〜７処置の前（図１８）、５日後（図１９）および８日後（図２０）のアネキシンＶ Ａｌｅｘａ６４７およびＤＡＰＩ染色結果を示す。青色および赤色は、（図１５〜１７）における部分母集団Ｐ３およびＰ４に対応する。

図２１は、顕微鏡観察により、ｓｇＥＢＶ１〜７処理後にアポトーシス細胞形態が明らかになったことを示す。

図２２は、顕微鏡観察により、ｓｇＥＢＶ１〜７処理後にアポトーシス細胞形態が明らかになったことを示す。

図２３は、ｓｇＥＢＶ１〜７処理前の核形態を示す。

図２４は、ｓｇＥＢＶ１〜７処理後の核形態を示す。

図２５は、ｓｇＥＢＶ１〜７処理後の核形態を示す。

図２６は、ｓｇＥＢＶ１〜７処理後の核形態を示す。

予想したように、ｏｒｉＰまたはｓｇＥＢＶを欠損したＣａｓ９プラスミドで処理した細胞は、数日以内にＥＧＦＰ発現を失い、非処置対照群と同様の速度で増殖した（図１４）。Ｃａｓ９−ｏｒｉＰおよびスクランブルしたガイドＲＮＡを有するプラスミドは、８日後にＥＧＦＰ発現を維持したが、細胞増殖速度は低下しなかった。混合カクテルｓｇＥＢＶ１〜７での処理は、測定可能な細胞増殖をもたらさず、全細胞数は一定のままであったか、または減少した（図１４）。フローサイトメトリー散乱シグナルは、細胞の大部分は肉芽形成の増加とともにサイズが縮小し、ｓｇＥＢＶ１〜７処理後の細胞形態における変化をはっきりと明らかにした（図１５〜１７、集団Ｐ４からＰ３へシフト）。集団Ｐ３中の細胞はまた、ＤＡＰＩ染色により、易感染性の膜透過性を実証した（図１８〜２０）。

特に複数のガイドＲＮＡによる、ＣＲＩＳＰＲ細胞毒性の可能性を除外するために、本発明者らは２つの他の試料について、同じ処置を行った：ＥＢＶ陰性バーキットリンパ腫細胞株ＤＧ−７５（図３３）および初代ヒト肺線維芽細胞ＩＭＲ９０（図３４）。図３３は、ＥＢＶ陰性バーキットリンパ腫ＤＧ−７５を用いたＣＲＩＳＰＲ細胞毒性試験を示す。

図３３は、ＣＲＩＳＰＲ処置が、ＥＢＶ陰性バーキットリンパ腫細胞株ＤＧ−７５に対して細胞毒性ではなかったことを示す。

図３４は、ＣＲＩＳＰＲ処置が初代ヒト肺線維芽細胞ＩＭＲ９０に対して細胞毒性でないことを示す。

図３４は、初代ヒト肺線維芽細胞ＩＭＲ９０を用いたＣＲＩＳＰＲ細胞毒性試験を表す。トランスフェクションの８日後および９日後に、細胞増殖率は、非処置対照群から変化せず、これは細胞毒性が無視できたことを示唆している。

以前の研究によると、ＥＢＶ腫瘍形成能力は、宿主細胞アポトーシスを妨害するためであると考えられている（Ruf IKら、（１９９９年）、Epstein-Barr Virus Regulates c-MYC, Apoptosis, and Tumorigenicity in Burkitt Lymphoma. ,Molecular and Cellular Biology、１９巻：１６５１〜１６６０頁）。したがって、ＥＢＶ活性の抑制は、アポトーシスプロセスを回復させることができる。そう考えれば、本発明者らの実験で細胞死が観察されたことを説明することができる。アネキシンＶ染色は、インタクトな細胞膜を有するが、ホスファチジルセリンが露出している細胞の特徴的な部分集団を明らかにした。これは、アポトーシスによる細胞死を示唆している（図１８〜２０）。明視野顕微鏡では、明白なアポトーシス細胞形態が示され（図２１〜２２）、蛍光染色は、劇的なＤＮＡ断片化を示した（図２３〜２６）。まとめると、こうした証拠は、ＥＢＶゲノム破壊後に正常な宿主細胞アポトーシス経路が回復したことを示唆している。

（部分集団中のＥＢＶの完全クリアランス）

細胞増殖停止とＥＢＶゲノム編集との間の関連の可能性を研究するために、本発明者らは、ＥＢＮＡ１を標的としたデジタルＰＣＲを用いて、ＥＢＶ負荷を異なる試料で定量した。保存されているヒト体細胞遺伝子座を標的とする別のＴａｑｍａｎアッセイは、ヒトＤＮＡ正規化の内部対照としての役目を果たした。

図２７は、デジタルＰＣＲによる、様々なＣＲＩＳＰＲ処理後のＥＢＶ負荷を示し、ここで、Ｃａｓ９およびＣａｓ９−ｏｒｉＰは２つの複製物を有し、ｓｇＥＢＶ１〜７が５つの複製物を有していた。

図２８は、全ゲノム増幅についての捕捉された単一細胞の顕微鏡観察を示す。

図２９は、全ゲノム増幅についての捕捉された単一細胞の顕微鏡観察を示す。

図３０は、処置前の単一細胞のＥＢＶ定量ＰＣＲ Ｃｔ値のヒストグラムを与える。

図３１は、ｓｇＥＢＶ１〜７処置の７日後の単一生存細胞のＥＢＶ定量ＰＣＲ Ｃｔ値のヒストグラムを示し、ここで図３０および３１の点線は、細胞あたりの１つのＥＢＶゲノムのＣｔ値を表す。

各非処置Ｒａｊｉ細胞は、平均で、４２コピーのＥＢＶゲノムを有する（図２７）。ｏｒｉＰまたはｓｇＥＢＶを欠如したＣａｓ９プラスミドで処置した細胞は、非処置対照と明白に異なるＥＢＶ負荷差を示さなかった。ｏｒｉＰを有するがｓｇＥＢＶを有していないＣａｓ９プラスミドで処置した細胞は、約５０％低減されたＥＢＶ負荷を示した。この実験の細胞では増殖速度差が一切示されなかったという上記の観察と合わせて考えると、本発明者らは、これは、プラスミド複製中のＥＢＮＡ１結合の競合によるものである可能性が高いと解釈する。ガイドＲＮＡカクテルｓｇＥＢＶ１〜７をトランスフェクションに付加することにより、ＥＢＶ負荷が劇的に低減された。生存細胞および死細胞は両方とも、非処置対照と比較して６０％超のＥＢＶ減少を示している。

本発明者らは、７つのガイドＲＮＡを同じモル比で提供したが、プラスミドトランスフェクションおよび複製プロセスは、非常に確率論的である可能性が高い。幾つかの細胞は、必然的にガイドＲＮＡカクテルの異なるサブセットまたは混合物を受け取ることになり、これは処置効率に影響及ぼす場合がある。そのような効果を制御するため、本発明者らは、ＥＢＶ負荷を、自動マイクロ流体システムによる単一細胞全ゲノム増幅を使用することにより単一細胞レベルで測定した。本発明者らは、新たに培養したＲａｊｉ細胞を、マイクロ流体チップに搭載し、８１個の単一細胞を捕捉した（図２８）。ｓｇＥＢＶ１〜７処置細胞の場合、本発明者らは、トランスフェクションの８日後に生存細胞をフロー選別して、９１個の単一細胞を捕捉した（図２９）。製造業者の説明書に従って、本発明者らは、約１５０ｎｇの増幅ＤＮＡを、各単一細胞反応チャンバから得た。品質管理目的のため、本発明者らは、各単一細胞増幅産物に対して４遺伝子座のヒト体細胞ＤＮＡ定量ＰＣＲを実施し（Wang J, Fan HC, Behr B, Quake SR、（２０１２年）Genome-wide single-cell analysis of recombination activity and de novo mutation rates in human sperm.、Cell、１５０巻：４０２〜４１２頁）、少なくとも１つの遺伝子座から陽性増幅産物を得ることを条件とした。６９個の非処置単一細胞産物は、品質管理に合格し、そしてほとんど全ての細胞が著しい量のＥＢＶゲノムＤＮＡを示す、ＥＢＶ負荷の対数正規分布を示した（図３０）。本発明者らは、単一の統合ＥＢＶゲノムを含むＮａｍａｌｗａバーキットリンパ腫細胞のサブクローンを用いて、定量ＰＣＲアッセイを較正した。単一コピーＥＢＶ測定によると、Ｃｔは２９．８であった。これにより、本発明者らは、６９個のＲａｊｉ単一細胞試料の平均Ｃｔが、バルクデジタルＰＣＲ測定による細胞当たり４２コピーのＥＢＶに対応していたと決定することが可能になった。ｓｇＥＢＶ１〜７処置試料の場合、７１個の単一細胞産物が品質管理に合格し、ＥＢＶ負荷分布は劇的により広範であった（図３１）。２２個の細胞は、非処置細胞と同じＥＢＶ負荷を有していたが、１９個の細胞は、検出可能なＥＢＶを有しておらず、残りの３０個の細胞は、非処置試料と比べて劇的なＥＢＶ負荷減少を示した。

ＥＢＶ処置に必須の標的。本発明者らのＣＲＩＳＰＲカクテルの７つのガイドＲＮＡは、それぞれＥＢＶゲノム構造、宿主細胞形質転換、および潜伏感染性にとって重要な３つの異なるカテゴリーの配列を標的とする。効果的なＥＢＶ処置に最も必須な標的を理解するために、本発明者らは、ガイドＲＮＡのサブセットをＲａｊｉ細胞にトランスフェクトした。ｓｇＥＢＶ４／５は、ＥＢＶゲノムを８５％低減したが、完全カクテルほど効果的には細胞増殖を抑制することができなかった（図１４）。構造配列を標的とするガイドＲＮＡ（ｓｇＥＢＶ１／２／６）は、ＥＢＶ負荷を完全には除去しなかったが（２６％の減少）、細胞増殖を完全に停止させることができた。本発明者らは、ゲノム編集の効率が高いことおよび増殖が停止したことを考慮して、ｓｇＥＢＶ１／２／６の残存ＥＢＶゲノム痕跡は、インタクトなゲノムによるものではなく、ＥＢＶゲノムから消化された遊離浮遊ＤＮＡ、つまり偽陽性であると推測する。本発明者らは、ＥＢＶ処置には、特定の重要なタンパク質を標的とするよりも、ＥＢＶゲノム構造を系統的に破壊する方がより効果的であると結論付ける。

（実施例２）
ＨＰＶゲノムおよび標的
ＨＰＶゲノムは、概して３つの主要領域（初期領域、後期領域、および長い制御領域（long control region；ＬＣＲ））に分けることができる、およそ８ｋｂのサイズの二本鎖環状ＤＮＡゲノムであり、これらの領域は２つのポリアデニル化部位により隔てられている。初期領域は、その５’半分からＨＰＶゲノムの５０％を超えるものであり、タンパク質に翻訳される６つの共通のオープンリーディングフレーム（Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６およびＥ７）をコードする。後期領域は、初期領域の下流であり、メジャー（Ｌ１）およびマイナー（Ｌ２）キャプシドタンパク質の翻訳のためのＬ１ ＯＲＦおよびＬ２ ＯＲＦをコードする。ｇＲＮＡ等の標的指向性配列は、ウイルス機能を妨げるためにキャプシドタンパク質を標的とすることができる。約８５０ｂｐのＬＣＲ領域は、タンパク質コード機能を有さないが、複製の開始点ならびにウイルス初期プロモーターおよび後期プロモーターからの転写調節のための転写因子結合部位を有する。引用により取り込まれる、Bernard、２００７年、Gene expression of genital human papillomaviruses and considerations on potential antiviral approaches、Antivir Ther. ７巻：２１９〜２３７頁を参照されたい。ＨＰＶ−１６ゲノムは、２つの主要なプロモーターを含む。Ｐ９７プロモーターは、Ｅ６ ＯＲＦの上流に位置し、ほとんど全ての初期遺伝子発現に関与する。Ｐ６７０プロモーターは、Ｅ７ ＯＲＦ領域内に位置し、後期遺伝子発現に関与する。ＨＰＶ−３１のＰ９９およびＨＰＶ−１８のＰ１０５に匹敵するＨＰＶ−１６ Ｐ９７プロモーターは、非常に強力で、主に、細胞転写因子およびウイルストランス活性化因子／リプレッサーＥ２と相互作用し、未分化の基底細胞から高度に分化したケラチノサイトへＰ９７の転写を調節するＬＣＲの上流のシスエレメントによって、厳密に制御されている。Ｅ２は、ＴＢＰまたはＴＦＩＩＤ結合後、Ｐ９７転写のためのリプレッサーとして機能し、その転写抑制は、組込まれたＨＰＶ−１６ ＤＮＡを有する細胞でのみ起こるがエピソーム性ＨＰＶ−１６ ＤＮＡを有する細胞では起こらないと考えられている。ＨＰＶ−１６ Ｐ６７０プロモーターは後期プロモーターであり、その活性は分化したケラチノサイトにおいてのみ誘導することができる。Ｅ６およびＥ７コード領域におけるエレメントは後期プロモーターを調節することができ、ＨＰＶ−１６における後期Ｐ６７０プロモーターおよびＨＰＶ−３１におけるＰ７４２は両方ともＥ７コード領域に位置し、後期プロモーターからの転写は初期ｐＡ部位を迂回して後期領域を発現させなければならない。引用により取り込まれる、ZhengおよびBaker、２００６年、Papillomavirus genome structure, expression, and post-transcriptional regulation、Front Biosci １１巻：２２８６〜２３０２頁を参照されたい。

プロモーターは、抗ウイルスまたは標的に向かうことが可能なエンドヌクレアーゼの遺伝子を含むベクターにおいて使用されてもよい。

（実施例３）
図３６は、ウイルス核酸３２５１等の外来核酸を除去するための細胞３２３７を処理する方法３２０１を示す。方法３２０１は、ＨＰＶ感染を処置するために臨床的に使用されてもよく、または方法３２０１は、例えば、ヒトに由来する細胞等の対象の細胞から外来核酸を除去するための研究および開発のために、ｉｎ ｖｉｔｒｏで使用されてもよい。

方法３２０１は：ヌクレアーゼ３２０５およびＲＮＡ ３２１３を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）３２３１を形成するステップ３２２５；感染細胞３２３７にＲＮＰ ３２３１を送達するステップ３２４５；およびＲＮＰ ３２３１で細胞３２３７内のウイルス核酸３２５１を切断するステップを含む。

送達するステップ３２４５は、エレクトロポレーションを含んでもよいか、またはＲＮＰは、送達するステップ３２４５のためにリポソーム内にパッケージされてもよい。一部の実施形態では、ウイルス核酸３２５１は、ウイルスのエピソーム性ウイルスゲノム、すなわちエピソームまたはエピソーム性ベクターとして存在する。ＲＮＡ ３２１３は、ウイルス核酸３２５１内の標的に実質的に相補的であり、好ましくはヒトゲノム上の任意の位置に実質的に相補的でない部分を有する。好ましい実施形態では、ウイルスはＨＰＶ−１６等のヒトパピローマウイルス（Human Papilloma Virus；ＨＰＶ）である。

好ましい実施形態では、ヌクレアーゼ３２０５は、好ましくはＣａｓ９等のＣｒｉｓｐｅｒ関連タンパク質である。ＲＮＡ ３２１３は、単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの機能性を提供する）であってもよい。この好ましい実施形態では、ヌクレアーゼ３２０５およびＲＮＡ ３２１３は、ＲＮＰ ３２３１として細胞に送達される。

一部の実施形態では、ＲＮＰは、感染しているか、または感染が疑われる組織に送達される。例えば、ＲＮＰは、リポソームに充填され、臨床応用のために局所的または経皮的に送達されることができる。エレクトロポレーションまたはヌクレオポレーションを使用してもよく、このストラテジーは、ｅｘ ｖｉｖｏでの応用において特定の価値を有し得る。

一部の実施形態では、臨床応用、特に非経口送達のためには（例えば、プラスミドＤＮＡに対して）ＲＮＰが好ましいことを見出すことができる。ＲＮＰは、ＤＮＡ（ＡＡＶ）またはｍＲＮＡに長所をもたらす活性の前もって形成された薬物である。細胞内の薬物成分を転写、翻訳、またはアセンブルする必要はない。ＲＮＰ ３２３１の送達は、例えば、より初期の開始活性および制御されたクリアランス（毒性）のような、薬物特性の改善をもたらし得る。

（実施例４）
Ｃａｓ９ ＲＮＰがＨＰＶ＋がん細胞を死滅させる
Ｃａｓ９等のヌクレアーゼは、選択されたガイドＲＮＡを介してＨＰＶゲノムにガイドされ得る。図４１は、ある特定の実施形態に従って、選択されたガイドＲＮＡがＨＰＶゲノムにマッピングされる場所を示す。２つはＥ６遺伝子にマッピングし、２つはＥ７遺伝子にマッピングする。

図４２は、Ｃａｓ９ならびに各々のｓｇＨＰＶ Ｅ６−１、ｓｇＨＰＶ Ｅ６−２、ｓｇＨＰＶ Ｅ７−１、およびｓｇＨＰＶ Ｅ７−２を用いて処理した後の生存百分率を示す。ＨＰＶ特異的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）による処理は、ＨＰＶ＋がん細胞を死滅させる。

図４３は、ＨＰＶ＋がん細胞における、ＨＰＶ特異的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ用量応答を示す。

図４４は、ＨＰＶ＋がん細胞におけるＨＰＶ特異的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ経時変化を与える。図４２〜４４は、Ｃａｓ９、および初期遺伝子にマッピングされる１つまたは複数のガイドＲＮＡを含むＲＮＰを、ＨＰＶ＋がん細胞に送達することにより、がん細胞を死滅させることができることを実証する。

（実施例５）
Ｃａｓ９ ＲＮＰは、Ｃａｓ９ ｐＤＮＡよりも良く切断する
図４５は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰがＤＮＡ切断を増強することを示すゲルである。

図４６は、ｐＤＮＡと比較して、ＲＮＰは細胞毒性が減少していることを示す。これらの結果は、ＲＮＰ形態のＣａｓ９がウイルス処置剤として有効である見込みがあることを示している。

（実施例６）
Ｃａｓ９ ＲＮＰはＨＰＶ＋がん細胞をｐＤＮＡよりも効果的に死滅させる
図４７は、ＨＰＶ＋がん細胞の生存率が、ＨＰＶ特異的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰを使用して、ＨＰＶ＋がん細胞を処理した場合に、Ｃａｓ９をコードするｐＤＮＡでこれらの細胞を処理した場合よりも、より低いことを示す。

（実施例７）
複数のガイドＲＮＡは、個々のものよりも良好である
図４８は、ＨＰＶ特異的ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰの組合せがＨＰＶ＋がん細胞死滅を改善することを示す。Ｅ６−１およびＥ６−２ガイドＲＮＡでＲＮＰを送達することにより、それらのどちらか一方のみでＲＮＰを送達するよりも低い生存数がもたらされる。

（実施例８）
Ｅ６、Ｅ７を標的とすることによるＨＰＶ＋がん細胞の死滅
図４９は、ＨＰＶ＋がん細胞を死滅させるためのプライマー設計を示す。プライマーＥ６−１、Ｅ６−２、Ｅ７−１、Ｅ７−３およびＥ７−４は、示されるように、Ｅ６およびＥ７遺伝子内に位置するように設計された。

図５０は、細胞生存をモニターするプロセスを示す。ＧＦＰレポーターを有するＣａｓ９プラスミドを細胞内にエレクトロポレーションする。ＧＦＰ＋細胞を選択し、培養し、フローサイトメトリーにより測定する。

図５１は、ＨＰＶ−１６特異的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｐＤＮＡがＨＰＶ−１６陽性がん細胞を死滅させることを示す。標準化された生存数により、対照細胞が高い生存率を有することが示された。生存していない細胞は、Ｃａｓ９ならびにＥ６−１、Ｅ７−２、およびＥ７−３プライマーの１つで処理されたものであった。

（実施例９）
ＲＮＰのリポソーム送達により、がん細胞が阻害される
図５２は、リポソームを介するＣａｓ９ ＲＮＰの送達を示した。

図５３は、リポソーム内に処方されたＨＰＶ特異的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰが、ＨＰＶ＋がん細胞を阻害することを示す。これらの結果は、Ｃａｓ９ ＲＮＰのリポソーム送達が、抗ウイルス／抗がん治療薬として、特に発癌性ウイルスがん細胞に対して、有望であることを示している。

（実施例１０）
ＥＢＶ特異的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰは、ＥＢＶ＋Ｂリンパ腫がん細胞を特異的に死滅させる。
図３７は、ＥＢＶ特異的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰがＥＢＶ＋Ｂリンパ腫がん細胞を特異的に死滅させることを示すための実験設計を図示している。Ｒａｊｉ細胞はＥＢＶ陽性である。Ｒａｊｉ細胞は、造血起源の継続ヒト細胞株である。ＤＧ−７５細胞は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手可能なＥＢＶ陰性Ｂリンパ球細胞株である。ＤＧ−７５は、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光マーカーを示す。ＥＢＶ陰性細胞は蛍光マーカーを含むので、成功した切断事象を識別することができる。

図３８は、処置後６日間のＥＢＶ＋がん細胞の生存を示す。エプスタイン−バール（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウイルス核酸３２５１に実質的に相補的なガイドＲＮＡを有するＲＮＰ ３２３１を与えたＥＢＶ＋細胞は、対照における約６０〜７０％と比較して、１０％未満の生存率を示した。

図３９は、Ｃａｓ９、ｓｇＨＰＶ３、ｓｇＥＢＶ２＋６およびｓｇＥＢＶ１＋２＋６についての処置後６日目の各々の細胞集団の百分率を示す。エプスタイン−バールウイルス核酸３２５１に実質的に相補的なガイドＲＮＡを有するＲＮＰ ３２３１で処理したＤＧ−７５が、Ｒａｊｉ細胞に対する培養物を卓越していることが、６日目のこのスナップショットにより示される。

図４０は、Ｃａｓ９（０．０３および０．１ｎｇ／細胞での）ならびにｓｇＥＢＶ２／６とのＣａｓ９（同じ用量での）についての、処置後３日間の（陰性対照に対して正規化した）細胞生存百分率を示す。

Claims (35)

1. 標的に向かうことが可能なヌクレアーゼおよび前記ヌクレアーゼをＨＰＶゲノムへと標的に向かわせる標的指向性配列をコードするベクターを含む、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染を処置するための組成物。
2. ベクターが、ケラチノサイト内での前記標的に向かうことが可能なヌクレアーゼおよび前記標的指向性配列の発現を促進する特徴を含む、請求項１に記載の組成物。
3. 発現を促進する前記特徴が、他の型の宿主細胞よりも前記ケラチノサイト内での前記標的に向かうことが可能なヌクレアーゼおよび前記標的指向性配列の発現を選択的に好むプロモーター−エンハンサーカセットを含む、請求項２に記載の組成物。
4. 前記ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、およびメガヌクレアーゼからなる群から選択されるヌクレアーゼである、請求項２に記載の組成物。
5. 前記ヌクレアーゼがＣａｓ９エンドヌクレアーゼを含み、前記標的指向性配列がガイドＲＮＡを含む、請求項２に記載の組成物。
6. 前記標的指向性配列が、前記ＨＰＶゲノム内のＥ６遺伝子を切断するために前記ヌクレアーゼを標的に向かわせる、請求項２に記載の組成物。
7. 前記ベクターが、前記ＨＰＶゲノム内のＥ７遺伝子を切断するために前記ヌクレアーゼを標的に向かわせる第２の標的指向性配列をさらに含む、請求項６に記載の組成物。
8. ヒト患者への送達のためにさらにパッケージされる、請求項１に記載の組成物。
9. 前記標的指向性配列がガイドＲＮＡであり、ヒトゲノム内で６０％超の一致を有さない、請求項１に記載の組成物。
10. 前記ベクターが、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、プラスミド、ナノ粒子、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、金属ナノ粒子、ナノロッド、リポソーム、マイクロバブル、細胞透過性ペプチド、およびリポスフェアからなる群から選択されるベクターを含む、請求項１に記載の組成物。
11. ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染を処置するための方法であって、
    宿主細胞に、標的に向かうことが可能なヌクレアーゼおよびＨＰＶゲノムへと前記ヌクレアーゼを標的に向かわせる標的指向性配列を導入するステップ；ならびに
    宿主ゲノム上の遺伝子に干渉することなく、前記宿主細胞内において前記ヌクレアーゼで前記ＨＰＶゲノムを切断するステップ
    を含む方法。
12. 前記標的に向かうことが可能なヌクレアーゼおよび前記標的指向性配列が、前記標的に向かうことが可能なヌクレアーゼおよび前記標的指向性配列をコードするベクターを使用して導入される、請求項１１に記載の方法。
13. 前記宿主細胞がケラチノサイトであり、前記ベクターが、前記ケラチノサイト内での前記標的に向かうことが可能なヌクレアーゼおよび前記標的指向性配列の発現を促進する特徴を含む、請求項１２に記載の方法。
14. 発現を促進する前記特徴が、他の型の宿主細胞よりも前記ケラチノサイト内での前記標的に向かうことが可能なヌクレアーゼおよび前記標的指向性配列の発現を選択的に好むプロモーター−エンハンサーカセットを含む、請求項１３に記載の方法。
15. 前記ベクターが、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、プラスミド、ナノ粒子、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、金属ナノ粒子、ナノロッド、リポソーム、マイクロバブル、細胞透過性ペプチド、およびリポスフェアからなる群から選択されるベクターを含む、請求項１２に記載の方法。
16. 前記ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、およびメガヌクレアーゼからなる群から選択されるヌクレアーゼである、請求項１１に記載の方法。
17. 前記ヌクレアーゼがＣａｓ９エンドヌクレアーゼを含み、前記標的指向性配列がガイドＲＮＡを含む、請求項１１に記載の方法。
18. 前記標的指向性配列が、前記ＨＰＶゲノム内のＥ６遺伝子を切断するために前記ヌクレアーゼを標的に向かわせる、請求項１７に記載の方法。
19. 前記ベクターが、前記ＨＰＶゲノム内のＥ７遺伝子を切断するために前記ヌクレアーゼを標的に向かわせる第２の標的指向性配列をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
20. 前記標的指向性配列がガイドＲＮＡであり、ヒトゲノム内で６０％超の一致を有さない、請求項１９に記載の方法。
21. 前記宿主が生体ヒト患者であり、前記ステップがｉｎ ｖｉｖｏで行われる、請求項２０に記載の方法。
22. ＲＮＡでガイドされるヌクレアーゼ；および
    ウイルスのウイルス核酸内の標的部位に相補的な部分を有するＲＮＡ
    を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を含む組成物。
23. 前記ＲＮＡでガイドされるヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質およびＣｐｆ１からなる群より選択される、請求項２２に記載の組成物。
24. 前記ＲＮＰを包み込むリポソームをさらに含む、請求項２３に記載の組成物。
25. 前記ウイルスがヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）である、請求項２３に記載の組成物。
26. 前記標的部位が、前記ＨＰＶのゲノムのＥ６またはＥ７遺伝子内に存在する、請求項２５に記載の組成物。
27. 前記ＲＮＡでガイドされるヌクレアーゼが、核局在化シグナルをさらに含む、請求項２６に記載の組成物。
28. 少なくとも第２のＲＮＰをさらに含み、前記第２のＲＮＰは、第２のＲＮＡでガイドされるヌクレアーゼおよび第２のＲＮＡを含む、請求項２６に記載の組成物。
29. 前記第２のＲＮＡが、前記ウイルス核酸内の第２の標的部位に相補的な第２の部分を含み、前記第２の標的部位が、前記Ｅ６またはＥ７遺伝子内に存在し、前記標的部位と同じでない、請求項２８に記載の組成物。
30. 前記ＲＮＰを包み込むリポソームおよび前記第２のＲＮＰを包み込む第２のリポソームをさらに含む、請求項２８に記載の組成物。
31. 前記ＲＮＡでガイドされるヌクレアーゼがＣａｓ９である、請求項２８に記載の組成物。
32. 前記ウイルスに感染した細胞に送達されたときに前記ウイルス核酸を複数の位置で切断する複数のＲＮＰをさらに含む、請求項２３に記載の組成物。
33. 前記複数のＲＮＰを包み込む複数のリポソームをさらに含む、請求項３１に記載の組成物。
34. 前記標的部位に相補的な前記部分が、ヒトゲノム内で６０％超の一致を有さない、請求項２２〜３３のいずれか一項に記載の組成物。
35. 請求項２２〜３３のいずれか一項に記載の組成物をｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞または組織に送達するステップ、およびウイルス核酸を前記ＲＮＰで切断するステップを含む、細胞から外来核酸を除去する方法。