JP2015510401A - ヒト疾患のインビトロモデル化および細胞に基づく治療のための間葉系幹細胞ならびにそのバンク - Google Patents
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Abstract
間葉系幹細胞(MSC)集団を認定する方法が開示される。前記方法は、(a)対象に起源を有する間葉系幹細胞の集団を第1の系譜特異的細胞に向かってエクスビボ分化させること、ただし、前記第1の系譜特異的細胞は脳疾患に関連する;(b)健常者対象に起源を有する間葉系幹細胞の集団を前記第1の系譜特異的細胞に向かってエクスビボ分化させること;(c)前記脳疾患に関連する第2の系譜特異的細胞に対して、前記対象に由来する前記第1の系譜特異的細胞の影響を、前記健常者対象に由来する前記第1の系譜特異的細胞の影響と比較することを含み、所定のレベルを超えるか、または所定のレベルに達しない前記影響における違いにより、間葉系幹細胞集団が認定されることが示される。【選択図】なし
Description
本願は、2012年2月22日に出願した米国特許仮出願第61/601619号、2012年2月22日に出願した米国特許仮出願第61/601596号、及び2012年2月22日に出願した米国特許仮出願第61/601624号(参照として本明細書中にそれらの全体が援用される)の優先権の利益を主張する。
本発明は、そのいくつかの実施形態において、ヒト疾患のインビトロモデル化のための間葉系幹細胞集団、およびそのような疾患を処置するための好適な間葉系幹細胞集団を選択する方法に関連する。
標的主導の薬物発見に対する現在の取り組みは典型的には、大きい化合物ライブラリーを単一の酵素または受容体に対してスクリーニングすること、その後、ヒットしたものを化学的取り扱いやすさに基づいて優先順位づけし、効力および選択性を達成するために医薬品化学により最適化することを伴う。典型的には、前臨床開発での後期段階において、候補化合物が、関連性のある初代細胞系または動物モデルにおいて試験されるが、これらは期待はずれの結果であることが多い。標的指向の生化学的スクリーニングとは対照的に、細胞に基づく表現型アッセイの使用が、ハイコンテント画像処理における進歩、ならびに、細胞に基づくスクリーニングがハイスループットスクリーニングおよびリード物質最適化のためのより生理学的な系を表すという認識によって押し進められるので増大している。
細胞に基づくアッセイは、細胞透過性および許容可能な毒性が同時に確認されるため、単一標的の生化学的アッセイを上回る様々な利点を有しているが、付随した制限が多くある。細胞に基づくスクリーニングでは既知の標的を欠くために、生物学的活性に関わる化学的群を構造活性相関研究により求めることができず、また、純粋に経験的な試みが、薬物様の性質を試行錯誤により最適化するために要求される。薬物スクリーニング、リード物質発見およびリード物質最適化のためにヒト初代細胞(好ましくは、疾患を有する細胞)を使用するための理論的根拠は説得力があるにもかかわらず、ほとんどの初代細胞は利用困難であり、かつ、有限の寿命を培養において有する。培養において不死成長するようにヒト初代細胞を適合化することは、細胞に基づくスクリーニングにおけるその使用のためには必要不可欠なことであり、典型的には、薬物に対する細胞の応答に影響を及ぼし得る、したがって、薬物スクリーニングおよび対比スクリーニングの忠実度を損ない得る遺伝子変化についての選択を必然的に伴う。
疾患患者由来のiPSを首尾よく作製し、様々な系譜特異的細胞に分化させることが可能となっている(例えば、ALS患者由来のiPS細胞が運動ニューロンに分化させられている)にもかかわらず、iPS細胞を使用するための様々な制限には、誤った遺伝子型特徴および表現型特徴を持ち込み得る胚性遺伝子の発現、ならびに、分化させたiPSは未だに臨床使用することができないので、これらの研究の結果を臨床にそのまま適用することができないことが含まれる。
間葉系幹細胞(MSC)は、骨髄、脂肪、臍帯、胎盤、羊水および血管周囲の組織を含むほとんどの結合組織に存在する、多数の種から単離される間質細胞の不均一な集団である。MSCは間葉系譜の細胞(例えば、骨、軟骨および脂肪など)に分化することができ、しかし、ある種の環境のもとでは、内胚葉系譜および神経外胚葉系譜の細胞の表現型を獲得することが報告されており、このことは「分化転換」のための何らかの潜在的能力を示唆している。骨髄内において、これらの細胞がしっかりと混じり合い、造血および造血幹細胞の生存を黙従的状態において支援する(Meuleman N他、Stem Cells Dev、18(9):1247〜52、2009)。
近年の報告では、MSCはまた、ニューロン、星状膠細胞および乏突起膠細胞を含む中枢神経系の機能的細胞に分化する潜在的能力を有することが明らかにされている。MSCは、様々な神経学的な疾患および機能不全における治療効果を実験的動物モデルにおいて、また、より近年には試験的な臨床試験において発揮することが示されている。それらの効果は主として、免疫抑制機能および神経保護機能に起因すると考えられている。しかしながら、いくつかの研究は、これらの細胞の分化がそれらの治療効果を様々な場合において増大させたことを明らかにした。したがって、MSC由来細胞は、疾患活性の細胞媒介抑制と、同様にまた、損傷した機能または失われた機能の再生との両方を目指す、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、アルツハイマー病、レット症候群、多発性硬化症およびパーキンソン病を含む炎症性障害および神経変性障害の処置のための細胞の容易に利用可能な供給源としての大きい潜在的能力を有する。
本発明のいくつかの実施形態の1つの局面によれば、間葉系幹細胞(MSC)集団を認定する(qualifying)方法であって、
(a)対象に起源を有する間葉系幹細胞の集団を第1の系譜特異的細胞に向かってエクスビボ分化させること(ただし、第1の系譜特異的細胞は脳疾患に関連する);
(b)健常者対象に起源を有する間葉系幹細胞の集団を前記第1の系譜特異的細胞に向かってエクスビボ分化させること;
(c)前記脳疾患に関連する第2の系譜特異的細胞に対して、前記対象に由来する前記第1の系譜特異的細胞の影響を、前記健常者対象に由来する前記第1の系譜特異的細胞の影響と比較すること(ただし、所定のレベルを超えるか、または所定のレベルに達しない前記影響における違いにより、間葉系幹細胞集団が認定されることが示される)
を含む方法が提供される。
(a)対象に起源を有する間葉系幹細胞の集団を第1の系譜特異的細胞に向かってエクスビボ分化させること(ただし、第1の系譜特異的細胞は脳疾患に関連する);
(b)健常者対象に起源を有する間葉系幹細胞の集団を前記第1の系譜特異的細胞に向かってエクスビボ分化させること;
(c)前記脳疾患に関連する第2の系譜特異的細胞に対して、前記対象に由来する前記第1の系譜特異的細胞の影響を、前記健常者対象に由来する前記第1の系譜特異的細胞の影響と比較すること(ただし、所定のレベルを超えるか、または所定のレベルに達しない前記影響における違いにより、間葉系幹細胞集団が認定されることが示される)
を含む方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の1つの局面によれば、間葉系幹細胞(MSC)集団を認定する方法であって、前記MSCの前記集団から分化させられる系譜特異的細胞の機能および/または形態学を分析することを含み、ただし、対照の系譜特異的細胞と比較される前記系譜特異的細胞の前記機能または形態学における変化により、前記MSCが認定されることが示される、方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の1つの局面によれば、脳疾患を処置するための作用因を選択する方法であって、脳障害の患者から単離されるMSCの集団が、前記脳障害に関連する系譜特異的細胞に向かって分化する能力を前記作用因の存在下および非存在下において分析することを含み、ただし、前記作用因の存在下におけるMSCの対照集団に由来する同一の系譜特異的細胞と比較して、前記系譜特異的細胞の機能または形態学の改善により、前記作用因が前記脳疾患の処置のために使用され得ることが示される、方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の1つの局面によれば、間葉系幹細胞(MSC)バンクを製造する方法であって、未分化間葉系幹細胞を、脳障害を有する複数の対象から採取して、複数の別個の細胞集団を得ること;前記間葉系幹細胞を系譜特異的細胞に向かって分化させること;前記未分化間葉系幹細胞および前記系譜特異的細胞を貯蔵し、それにより、間葉系幹細胞バンクを製造すること、を含む方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の1つの局面によれば、脳障害の患者から単離される多数のMSC集団を含む幹細胞バンクであって、それぞれが個々に、別個の容器に配置される幹細胞バンクが提供される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記認定することは、上記MSC集団が、対象の上記脳疾患を処置するための自己細胞置換療法のために好適であるかどうかを確認することである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、上記第1および/または上記第2の系譜特異的細胞に対する、上記対象に由来する第3の系譜特異的細胞の影響と上記健常者対象に由来する前記第3の系譜特異的細胞の影響とを比較することを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記第2の系譜特異的細胞は間葉系幹細胞の集団からエクスビボ分化させられている。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記脳疾患は、神経変性障害、神経炎症障害およびプリオン媒介障害からなる群から選択される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病およびレット症候群からなる群から選択される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記脳疾患は、多発性硬化症、ALS、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、レット症候群、自閉症スペクトラム障害、アスペルガー症候群、認知症および大脳萎縮、多系統萎縮症、クロイツフェルト・ヤコブ病、橋小脳形成不全、皮質基底核変性、進行性核上性麻痺、脊髄小脳萎縮症、脊髄&延髄性筋萎縮、シャルコー・マリー・トゥース病、巨大軸索ニューロパチー、カナバン病、フリードライヒ運動失調および他の運動失調、てんかん、早期乳児脳症、遺伝性痙性対麻痺、中枢神経系のアミロイドーシス、トゥレット症候群、シャイ・ドレーガー症候群、メニエール症候群、アルパース病、家族性自律神経異常症、失読症、ウェルドニッヒ・ホフマン病、結節性硬化症ならびに神経線維腫症である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記脳疾患は精神医学的疾患である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、上記対象に起源を有する上記MSCの遺伝子異常について分析することを含み、ただし、前記遺伝子異常は脳疾患に関連する。
本発明のいくつかの実施形態によれば、MSCの上記集団は、脳疾患を有する対象に由来する。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記認定することは、上記MSCが、対象の脳疾患を自己処置するために好適であるかどうかを確認することである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、上記MSCの遺伝子異常について分析することを含み、ただし、前記遺伝子異常は脳疾患に関連する。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記系譜特異的細胞の上記機能は、ミクログリア細胞に対する応答を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記脳疾患は神経変性障害である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病およびレット症候群からなる群から選択される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記脳疾患は精神医学的疾患である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記脳疾患が筋萎縮性側索硬化症(ALS)であり、上記系譜特異的細胞が、運動ニューロン、骨格筋および星状膠細胞からなる群から選択される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記脳疾患がパーキンソン病であるとき、上記系譜特異的細胞が、星状膠細胞およびドーパミン作動性ニューロンからなる群から選択される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記脳疾患がレット症候群であるとき、上記系譜特異的細胞が、星状膠細胞およびニューロンからなる群から選択される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、上記未分化細胞集団を、少なくとも1つの所定の特徴を上記未分化細胞集団のそれぞれについて得るために特徴づけること、および上記未分化細胞集団のカタログを前記少なくとも1つの所定の特徴に従って作成することを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、上記分化細胞集団を、少なくとも1つの所定の特徴をそれぞれの分化細胞集団について得るために特徴づけること、および上記分化細胞集団のカタログを前記少なくとも1つの所定の特徴に従って作成することを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記特徴づけることは、上記疾患に関連する系譜特異的細胞に向かって分化する上記MSCの能力を分析することを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記特徴づけることは、上記MSCの遺伝子異常について分析することを含み、ただし、前記遺伝子異常は上記疾患に関連する。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記貯蔵することは、上記細胞集団を凍結条件のもとで別個の容器に配置することを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記カタログを作成することは、所与の細胞集団の上記所定の特徴に関する情報をデータベースコンピューターに入力することを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記所定の特徴は上記対象の疾患状態情報を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記バンクは、上記MSC集団から分化させられる系譜特異的細胞であって、上記脳障害に関連する系譜特異的細胞を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記バンクはさらに、上記MSC集団の所定の特徴に関する情報を含むカタログを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記所定の特徴は上記MSC集団の分化能を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記所定の特徴は遺伝的特徴を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記カタログは、少なくとも1つの処理モジュールと、多数の細胞集団の所定の特徴情報が入力される少なくとも1つのメモリデバイスと、所定の特徴情報を、当該データベースコンピューターに通信接続されるディスプレーに要求時に表示させるための少なくとも1つのプログラムコードモジュールとを含む少なくとも1つのデータベースコンピューターユニットである。
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および/または科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および/または材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
本明細書では本発明のいくつかの実施形態を単に例示し添付の図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の実施形態を例示考察することだけを目的としていることを強調するものである。この点について、図面について行う説明によって、本発明の実施形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
本発明は、そのいくつかの実施形態において、ヒト疾患のインビトロモデル化のための間葉系幹細胞集団、およびそのような疾患を処置するための好適な間葉系幹細胞集団を選択する方法に関連する。
本発明の少なくとも1つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示される細部、または、実施例によって例示される細部に必ずしも限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、あるいは、様々な方法で実施、または、実行される。
ヒトでの神経発達疾患および神経変性疾患における細胞の表現型に関する我々の現在の知識のほとんどが、死後の脳組織における研究から推測されている。これらのサンプルは疾患の末期段階を表していることが多く、したがって、その疾患がどのように発達したかを必ずしも正しく表すものではない。そのうえ、これらの状況のもとでは、認められた病理は、真の疾患の細胞の表現型というよりは、むしろ、二次的な影響であり得る。同様に、利用可能な齧歯類モデルはヒト疾患からの病理を必ずしも再現していない。
したがって、ヒト疾患の病態生理学的機構の研究と、標的療法の開発との両方が、インビトロにおいて実験的に操作することができる予測的疾患モデルがないことによって妨げられている。
例えば、筋萎縮性側索硬化症(ALS)を研究するための実験的モデルとして使用されるSODマウスは、家族性ALS(fALS)に対するSODマウスの関連性がたとえ、疑わしいままであるとしても、ALSを処置するための新規な取り組みを研究するための受け入れられ得る実験的モデルを表す。そのうえ、実験的動物モデルが、ALSの症例の大多数を表す散発性ALS(sALS)を研究するためには何ら存在していない。
同様に、遺伝型形態のヒトPDによく似る遺伝的病変(例えば、パーキンにおけるホモ接合性欠失またはα−シヌクレインの過剰発現など)を有する動物モデルは、ドーパミン作動性ニューロンの喪失を再現することができていない。
最適な取り組みは、細胞変性の機構を、神経変性疾患の患者に由来する細胞を使用して調べることであると考えられる。しかしながら、関連性のある細胞タイプのすべてをこれらの患者から単離することは事実上不可能である。
疾患患者由来のiPSを首尾よく作製し、様々な系譜特異的細胞に分化させることが可能となっている(例えば、ALS患者由来のiPS細胞が運動ニューロンに分化させられている)にもかかわらず、iPS細胞の使用のための様々な制限には、誤った遺伝子型特徴および表現型特徴を持ち込み得る胚性遺伝子の発現、ならびに、分化させたiPSは未だに臨床使用することができないので、これらの研究の結果を実施にそのまま適用することができないことが含まれる。
間葉系幹細胞(MSC)を、例えば、運動ニューロン、乏突起膠細胞および星状膠細胞を含めて、神経変性疾患に関連する様々な細胞に分化させることができることにより、本発明者らは、疾患を有する対象に由来する間葉系幹細胞を、神経変性疾患をモデル化するために使用することを提案する。そのようなモデルは疾患の基本的理解を高め、特定の疾患を処置するための間葉系幹細胞集団の選択を可能にし、ならびに薬物スクリーニングおよび最適化におけるそれらの適用のための道を開くであろう。病的MSCに由来するモデルから集められる知識は、健常者MSCに由来するモデルの作製を可能にするであろう。例えば、特定の遺伝子が、病的MSCから作製されるニューロンタイプの細胞においてダウンレギュレーションされることが見出されたならば、その同じ遺伝子は、健常者MSCにおいて(遺伝子ノックアウト、siRNA、miRNAなどによって)ダウンレギュレーションされ得るかもしれず、また、ニューロン細胞タイプに分化させた後で、当該疾患のためのモデルとして役立つであろう。
加えて、既知の遺伝子型に由来するMSCは、薬物に対する応答における変動性を評価するために、または遺伝性疾患の根底にある分子的機構を調べるために使用することができる。
本発明の第1局面によれば、間葉系幹細胞集団を認定する方法であって、
(a)対象に起源を有する間葉系幹細胞の集団を第1の系譜特異的細胞に向かってエクスビボ分化させること(ただし、第1の系譜特異的細胞は脳疾患に関連する);
(b)健常者対象に起源を有する間葉系幹細胞の集団を前記第1の系譜特異的細胞に向かってエクスビボ分化させること;
(c)前記脳疾患に関連する第2の系譜特異的細胞に対して、前記対象に由来する前記第1の系譜特異的細胞の影響を、前記健常者対象に由来する前記第1の系譜特異的細胞の影響と比較すること(ただし、所定のレベルを超えるか、または所定のレベルに達しない前記影響における違いにより、間葉系幹細胞集団が認定されることが示される)
を含む方法が提供される。
(a)対象に起源を有する間葉系幹細胞の集団を第1の系譜特異的細胞に向かってエクスビボ分化させること(ただし、第1の系譜特異的細胞は脳疾患に関連する);
(b)健常者対象に起源を有する間葉系幹細胞の集団を前記第1の系譜特異的細胞に向かってエクスビボ分化させること;
(c)前記脳疾患に関連する第2の系譜特異的細胞に対して、前記対象に由来する前記第1の系譜特異的細胞の影響を、前記健常者対象に由来する前記第1の系譜特異的細胞の影響と比較すること(ただし、所定のレベルを超えるか、または所定のレベルに達しない前記影響における違いにより、間葉系幹細胞集団が認定されることが示される)
を含む方法が提供される。
用語「間葉系幹細胞」または用語「MSC」は、最終分化していない、いずれかの幹細胞である細胞をもたらすために分裂することができる、または生物活性因子(例えば、サイトカインなど)からの様々な影響に依存して不可逆的に分化して間葉細胞系譜の細胞(例えば、脂肪組織、骨組織、軟骨組織、弾性結合組織および繊維性結合組織、筋芽細胞)および胚の中胚葉に起源を有する組織とは異なる組織(例えば、神経系細胞)を生じさせる、成体細胞に対して交換可能に使用される。
間葉系幹細胞(MSC)を単離し、精製し、拡大する様々な方法が当技術分野では知られており、これらには、例えば、CaplanおよびHaynesworthによって米国特許第5486359号に開示される方法、ならびに、Jones E.A.他、2002、Isolation and characterization of bone marrow multipotential mesenchymal progenitor cells、Arthritis Rheum、46(12):3349〜60に開示される方法が含まれる。
間葉系幹細胞は、骨髄、末梢血、血液、胎盤(絨毛膜および/または羊膜の両方)、臍帯血、臍帯、羊水(これらに限定されない)を含む様々な組織、および脂肪組織から単離される場合がある。
間葉系幹細胞を末梢血から単離する方法が、Kassis他[Bone Marrow Transplant、2006 May;37(10):967〜76]によって記載される。間葉系幹細胞を胎盤組織から単離する方法が、Zhang他[Chinese Medical Journal、2004、117(6):882〜887]によって記載される。脂肪組織、胎盤および臍帯血の間葉系幹細胞を単離し、培養する方法が、Kern他[Stem Cells、2006;24:1294〜1301]によって記載される。
本発明のこの局面の好ましい実施形態によれば、間葉系幹細胞はヒト由来である。
本発明のこの局面の別の実施形態によれば、間葉系幹細胞はヒトの新生児から単離される。
骨髄を吸引によって個体の腸骨稜から単離することができる。低密度BM単核細胞(BMMNC)が、FICOL−PAQUE密度勾配によって、またはHetastarch(ヒドロキシエチルデンプン)を使用する赤血球の除去によって分離される場合がある。好ましくは、間葉系幹細胞の培養物が、BM吸引物(通常的には20ml)を等体積のハンクス平衡塩類溶液(HBSS;GIBCO Laboratories、Grand Islanad、NY、米国)により希釈し、希釈された細胞を約10mlのFicollカラム(Ficoll−Paque;Pharmacia、Piscataway、NJ、米国)の上に重層することによって作製される。2500×gでの遠心分離を30分間行った後、単核細胞層が境界から取り出され、HBSSに懸濁される。その後、細胞が1500×gで15分間遠心分離され、完全培地(MEM、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含まないα培地;GIBCO)、MSCの迅速成長のために選択されたロットに由来する20%のウシ胎児血清(FCS)(Atlanta Biologicals、Norcross、GA)、100ユニット/mlのペニシリン(GIBCO)、100μg/mlのストレプトマイシン(GIBCO)、および2mMのL−グルタミン(GIBCO)に再懸濁される。再懸濁された細胞が10cmの培養ディッシュ(Corning Glass Works、Corning、NY)において約25mlの培地に置床され、5%の加湿CO2とともに37℃でインキュベーションされる。培養で24時間の後、非接着性細胞が捨てられ、接着性細胞がリン酸塩緩衝化生理的食塩水(PBS)により2回徹底的に洗浄される。培地が、3日毎または4日毎に約14日間、新鮮な完全培地により取り換えられる。その後、接着性細胞が、0.25%のトリプシンおよび1mMのEDTA(トリプシン/EDTA、GIBCO)を37℃で5分間用いて集められ、6cmのプレートに再置床され、さらに14日間培養される。その後、細胞がトリプシン処理され、細胞計数デバイス、例えば、血球計(Hausser Scientific、Horsham、PA)などを使用して計数される。培養細胞が遠心分離によって回収され、5%DMSOおよび30%FCSとともに、1mlあたり1〜2×106細胞の濃度で再懸濁される。それぞれが約1mlのアリコートが緩速凍結され、液体窒素において貯蔵される。
脂肪組織由来のMSCを脂肪吸引によって得ることができ、また、単核細胞を、脂肪および脂肪細胞を除くことによって手作業で、またはCelution System(Cytori Therapeutics)をMSCの調製のために上記で記載されるのと同じ手順に従って使用して単離することができる。
1つの実施形態によれば、集団が(例えば、フラスコにおいて)ポリスチレンプラスチック表面に置床され、間葉系幹細胞が、非接着性細胞を除くことによって単離される。代替では、間葉系幹細胞が、間葉系幹細胞のマーカーを使用してFACSによって単離される場合がある。
好ましくは、MSCは少なくとも50%精製され、より好ましくは少なくとも75%精製され、一層より好ましくは少なくとも90%精製される。
間葉系幹細胞画分を拡大するために、凍結された細胞が37℃で解凍され、完全培地により希釈され、DMSOを除くために遠心分離によって回収される。細胞が完全培地に再懸濁され、約5000細胞/cm2の濃度で置床される。培養で24時間の後、非接着性細胞が除かれ、接着性細胞が、トリプシン/EDTAを使用して集められ、狭くしたパスツールピペットに通すことによって解離させられ、好ましくは、約1.5〜約3.0細胞/cm2の密度で再置床される。これらの条件のもとで、MSC培養物は約50回の集団倍加にわたって成長することができ、約2000倍にわたって拡大させることができる[Colter DC他、Rapid expansion of recycling stem cells in cultures of plastic−adherent cells from human bone marrow、Proc Natl Acad Sci USA、97:3213〜3218、2000]。
本発明のいくつかの実施形態によって利用されるMSC培養物には好ましくは、それらの形態学的特徴によって定義される3つの群の細胞、すなわち、小さい無顆粒細胞(これらは本明細書中下記ではRS−1として示される)、小さい顆粒細胞(これらは本明細書中下記ではRS−2として示される)、および大きい適度な顆粒細胞(これらは本明細書中下記では成熟MSCとして示される)が含まれる。培養におけるそのような細胞の存在および濃度を、例えば、免疫蛍光、インサイチューハイブリダイゼーションおよび活性アッセイを使用することにより、様々な細胞表面マーカーの存在の有無を特定することによってアッセイすることができる。
MSCが本発明のいくつかの実施形態の培養条件のもとで培養されるとき、MSCは、造血幹細胞マーカーであるCD34、CD11B、CD43およびCD45については陰性の染色を示す。小さい割合の細胞(10%未満)がCD31および/またはCD38のマーカーについてかすかに陽性である。加えて、成熟MSCは、造血幹細胞マーカーであるCD117(c−Kit)についてかすかに陽性であり、骨形成MSCのマーカーであるStro−1について中程度に陽性であり[Simmons,P.J.&Torok−Storb,B.(1991)、Blood、78、5562]、かつ、胸腺細胞および末梢Tリンパ球のマーカーであるCD90(Thy−1)について陽性である。他方で、RS−1細胞はCD117およびStro1のマーカーについて陰性であり、かつ、CD90のマーカーについてかすかに陽性であり、RS−2細胞はこれらのマーカーのすべてについて陰性である。
本明細書中で使用される場合、表現「脳疾患」は、神経変性障害および精神医学的障害を含む、中枢神経系の任意の障害、疾患または状態をも示す。
脳疾患または脳障害のさらなる代表的な例には、疼痛性障害、運動障害、解離性障害、気分障害、情動障害、神経変性疾患または神経変性障害および痙攣性障害が含まれるが、これらに限定されない。
そのような状態のより具体的な例には、パーキンソン病、ALS、多発性硬化症、ハンチントン病、自己免疫性脳脊髄炎、糖尿病性神経障害、緑内障性(glaucatomus)神経障害、黄斑変性、動作時振戦および遅発性ジスキネジー、パニック、不安、うつ病、アルコール依存症、不眠症、躁病的行動、アルツハイマー病、てんかん、レット症候群ならびに自閉症が含まれるが、これらに限定されない。
特定の実施形態によれば、疾患は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病またはレット症候群である。
1つの実施形態によれば、認定することは、MSC集団が、対象の脳疾患を処置するための自己細胞置換療法のために好適であるかどうかを確認するためである。
別の実施形態によれば、認定することは、MSC集団を特定の様式で遺伝的に改変することまたは分化させることが有益であるかどうかを確認するためである。
「細胞置換療法」は、本明細書中で使用される場合、未分化のまたは分化させた間葉系幹細胞を疾患の処置のために患者に移植することを示す。脳疾患を処置するために、細胞は典型的には、当該対象の脳に移植される。
細胞置換療法が、埋め込み部位に性質が依存する様々な移植取り組みを使用して行われる場合がある。
特定の実施形態によれば、細胞が鼻腔内投与される。
「移植」、「細胞置換」または「移植する」の用語または表現は本明細書中では交換可能に使用され、本発明の細胞を標的組織に導入することを示す。上述のように、細胞はレシピエントに、あるいは、同種ドナー、半同種ドナーまたは異種ドナーに由来することができる。
細胞は全身的には循環に注入するか、クモ膜下腔内に投与するかまたは中枢神経系、脊髄もしくは脳室腔の中に移植するか、あるいは、硬膜下において宿主の脳の表面に移植することができる。成功する移植のための条件には、(i)埋め込み物の生存性、(ii)移植部位における移植片の保持、および(iii)移植部位における最少量の病理学的反応が含まれる。様々な神経組織(例えば、胚性脳組織)を宿主の脳に移植するための様々な方法が、“Neural grafting in the mammalian CNS”、BjorklundおよびStenevi編(1985);Freed他(2001);Olanow他(2003)に記載されている。これらの手順には、実質内移植、すなわち、組織を移植時に脳の実質に注入するか、または置くことによって達成される、(脳外または実質外移植と比較されるような)宿主の脳の内部における実質内移植が含まれる。
実質内移植を、2つの取り組みを使用して行うことができる:(i)細胞を宿主の脳の実質に注入すること、または(ii)宿主の脳の実質を露出させるために外科的手段によって腔を準備し、その後、移植片をこの腔の中に置くこと。両方の方法が、移植片と宿主脳組織との間における実質での設置を移植時にもたらし、また、ともに、移植片と宿主脳組織との間における解剖学的一体化を容易にする。移植片が宿主の脳の不可欠な部分となり、かつ、宿主の生涯にわたって生存することが要求されるならば、このことは重要である。
代替では、移植片が、室(例えば、脳室)に、あるいは、硬膜下に、すなわち、介在する軟膜またはクモ膜および軟膜によって宿主の脳の実質から隔てられる宿主の脳の表面に置かれる場合がある。脳室に移植することが、ドナー細胞の注入によって、または細胞を基体(例えば、3%コラーゲンなど)において成長させて、その後、移植片のずれを防止するために脳室内に埋め込まれることがある充実組織のプラグを形成することによって達成される場合がある。硬膜下移植のために、細胞が、隙間を硬膜に作製した後で脳の表面の周りに注入される場合がある。宿主の脳の選択された領域への注入が、ドリルで穴を開け、硬膜を突き通して、マイクロシリンジの針が挿入されることを可能にすることによって行われる場合がある。マイクロシリンジは好ましくは、定位フレームに取り付けられ、三次元定位座標が、針を脳または脊髄の所望される場所に設置するために選択される。細胞はまた、脳の被殻、基底核、海馬皮質、線条体、黒質または尾状領域に、同様にまた、脊髄に導入される場合がある。
細胞はまた、組織の健康な領域に移植される場合がある。場合により、損傷した組織区域の正確な場所が不明である場合があり、細胞が、健康な領域に気付かずに移植される場合がある。他の場合には、細胞を健康な領域に投与して、それにより、その領域に対する何らかのさらなる損傷を回避することが好ましい場合がある。どのような場合であれ、移植後、細胞は好ましくは、損傷区域に遊走する。
移植のために、細胞懸濁物がシリンジに引き入れられ、麻酔された移植レシピエントに投与される。複数の注入が、この手順を使用して行われる場合がある。
細胞を、脳または脊髄における任意の所定の部位に移植することをこのように可能にする細胞懸濁物手順は、比較的非外傷性であり、複数の移植を、同じ細胞懸濁物を使用していくつかの異なる部位または同じ部位において同時に可能にし、また、異なる解剖学的領域から得られる細胞の混合物を可能にする。複数の移植片が、細胞タイプの混合物、および/または細胞に挿入される導入遺伝子の混合物からなる場合がある。好ましくは、およそ104〜およそ109個の細胞が移植片あたり導入される。細胞は、冒された区域への標的化の機会を最大にするために、異なる場所に同時に投与することができる(例えば、クモ膜下腔内および静脈内の組み合わされた投与など)。
脊髄移植に好ましい場合がある腔内への移植のために、組織が中枢神経系(CNS)の外側表面に近い領域から取り出され、例えば、Stenevi他(Brain Res、114:1〜20、1976)によって記載されるように、脳の上にある骨を除き、出血をゲルフォームなどの材料により止めることによって移植腔を形成する。吸引が、腔を作り出すために使用される場合がある。その後、移植片が腔に置かれる。2つ以上の移植片が、細胞または充実組織埋め込み物の注入を使用して同じ腔に置かれる場合がある。好ましくは、埋め込み部位が、処置されるCNS障害によって決定される。脱髄したMS病変が、MSの効果的な処置が適切な標的部位への細胞の遊走能により依拠し得るように、CNSの至るところ、多数の場所にわたって分布する。
上述のように、本発明のこの局面の方法は、対象に起源を有する間葉系幹細胞の集団を第1の系譜特異的細胞に向かってエクスビボ分化させること(ただし、第1の系譜特異的細胞は脳疾患に関連する)を含む。
用語「系譜特異的細胞」は、もはや多能性ではなく、特定の細胞タイプに向かって拘束される細胞を示す。系譜特異的細胞は始原体細胞(例えば、神経幹細胞)または完全に分化した細胞(例えば、運動ニューロン)である場合がある。
本発明によって意図される系譜特異的細胞には、運動ニューロン、神経幹細胞、骨格筋細胞、ドーパミン分泌ニューロン、コリン作動性ニューロン、星状膠細胞、乏突起膠細胞およびそれらの始原体が含まれる。
MSCが分化させられる特定の系譜特異的細胞の選択は、要求される認定に依存している。
したがって、例えば、MSCが、脳疾患の自己処置のために好適であるとして認定されるならば、系譜特異的細胞は、MSCが処置のために意図される脳疾患に従って選択される。
したがって、例えば、疾患がALSである場合、意図される系譜特異的細胞には、星状膠細胞、骨格筋細胞、および運動ニューロンの始原体または完全に分化した細胞が含まれる。
したがって、例えば、疾患がパーキンソン病である場合、意図される系譜特異的細胞には、ドーパミン作動性ニューロン、星状膠細胞、および乏突起膠細胞の始原体または完全に分化した細胞が含まれる。
したがって、例えば、疾患がアルツハイマー病である場合、意図される系譜特異的細胞には、ニューロン、および星状膠細胞の始原体または完全に分化した細胞が含まれる。
したがって、例えば、疾患がレット症候群である場合、意図される系譜特異的細胞には、ニューロン、および星状膠細胞の始原体または完全に分化した細胞が含まれる。
MSCを上述の系譜特異的細胞に向かって分化させる様々な方法が当技術分野では知られており、これらの方法は遺伝子改変および/または分化培地における培養を含む。
遺伝子改変
MSCが、その分化を誘導するタンパク質を発現するように遺伝子改変される場合がある。代替では、MSCが、分化を誘導するために特定のタンパク質作用因またはポリヌクレオチド作用因の発現をダウンレギュレーションするポリヌクレオチド作用因(例えば、siRNAまたはmiRNAなど)を発現するように遺伝子改変される場合がある。
MSCが、その分化を誘導するタンパク質を発現するように遺伝子改変される場合がある。代替では、MSCが、分化を誘導するために特定のタンパク質作用因またはポリヌクレオチド作用因の発現をダウンレギュレーションするポリヌクレオチド作用因(例えば、siRNAまたはmiRNAなど)を発現するように遺伝子改変される場合がある。
そのような作用因を間葉系幹細胞において発現させるために、この作用因をコードするポリヌクレオチド配列が好ましくは、間葉系幹細胞での発現のために好適である核酸構築物に連結される。そのような核酸構築物は、細胞におけるポリヌクレオチド配列の転写を構成的様式または誘導可能な様式で行わせるためのプロモーター配列を含む。
本発明のいくつかの実施形態との使用のために好適である構成的プロモーターが、ほとんどの環境条件およびほとんどのタイプの細胞のもとで活性であるプロモーター配列であり、例えば、サイトメガロウイルス(CMV)およびラウス肉腫ウイルス(RSV)などである。本発明のいくつかの実施形態との使用のために好適である誘導可能なプロモーターには、例えば、テトラサイクリン誘導プロモーター(Zabala M他、Cancer Res、2004、64(8):2799〜804)が含まれる。
真核生物プロモーターは典型的には、2つのタイプの認識配列、すなわち、TATAボックスおよび上流プロモーターエレメントを含有する。TATAボックスは、転写開始部位から25塩基対〜30塩基対上流に位置しており、RNAポリメラーゼにRNA合成を開始させることに関与すると考えられている。もう一方の上流プロモーターエレメントにより、転写が開始される速度が決定される。
好ましくは、本発明のいくつかの実施形態の核酸構築物によって利用されるプロモーターは、形質転換された特定の細胞集団において、すなわち、間葉系幹細胞において活性である。
エンハンサーエレメントは、連結されている同種または異種プロモーターから転写を1000倍にまで刺激することができる。エンハンサーは、転写開始部位の下流側または上流側に置かれたときに活性である。ウイルスに由来する多くのエンハンサーエレメントは幅広い宿主範囲を有しており、様々な組織において活性である。例えば、SV40の初期遺伝子エンハンサーが多くの細胞タイプのために好適である。本発明のいくつかの実施形態のために好適である他のエンハンサー/プロモーター組合せには、ポリオーマウイルス、ヒトまたはマウスのサイトメガロウイルス(CMV)、様々なレトロウイルス(例えば、マウス白血病ウイルス、マウス肉腫ウイルスまたはラウス肉腫ウイルス、およびHIVなど)から得られる長末端反復に由来する組合せが含まれる。Enhancers and Eukaryotic Expression(Cold Spring Harbor Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、1983)を参照のこと(これは参照によって本明細書中に組み込まれる)。
発現ベクターの構築において、プロモーターは好ましくは、異種の転写開始部位からの距離がその天然の環境における転写開始部位からの距離とおよそ同じで配置される。しかしながら、当技術分野では公知のように、この距離におけるいくらかの変動が、プロモーター機能を失うことなく受け入れられ得る。
既に記載されたエレメントに加えて、本発明のいくつかの実施形態の発現ベクターは典型的には、クローン化された核酸の発現レベルを増大させるために、または組換えDNAを有する細胞の特定を容易にするために意図される他の特化したエレメントを含有する場合がある。例えば、いくつかの動物ウイルスは、許容細胞タイプにおけるウイルスゲノムの染色体外での複製を促進させるDNA配列を含有する。これらのウイルスレプリコンを有するプラスミドは、適切な因子が、プラスミドで運ばれる遺伝子または宿主細胞のゲノムとともに運ばれる遺伝子のどちらかによって提供される限り、エピソームとして複製される。
ベクターは真核生物レプリコンを含む場合があり、または含まない場合がある。真核生物レプリコンが存在するならば、ベクターは、適切な選択マーカーを使用して真核生物細胞において増幅可能である。ベクターが真核生物レプリコンを含まないならば、エピソーム増幅を行うことができない。代わりに、組換えDNAが、操作された細胞のゲノムに一体化し、この場合、その細胞において、プロモーターにより、所望される核酸の発現が導かれる。
哺乳動物発現ベクターの例には、pcDNA3、pcDNA3.1(+/−)、pGL3、pZeoSV2(+/−)、pSecTag2、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto、pCR3.1、pSinRep5、DH26S、DHBB、pNMT1、pNMT41、pNMT81(これらはInvitrogenから入手可能である)、pCI(これはPromegaから入手可能である)、pMbac、pPbac、pBK−RSVおよびpBK−CMV(これらはStrategeneから入手可能である)、pTRES(これはClontechから入手可能である)、ならびに、それらの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
真核生物ウイルス(例えば、レトロウイルスなど)から得られる調節エレメントを含有する発現ベクターもまた使用することができる。SV40系ベクターには、pSVT7およびpMT2が含まれる。ウシパピローマウイルスに由来するベクターには、pBV−1MTHAが含まれ、エプスタイン・バールウイルスに由来するベクターには、pHEBOおよびp2O5が含まれる。他の例示的なベクターには、pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo−5、バキュロウイルスpDSVE、および任意の、真核生物細胞における発現のために効果的であることが示されるSV−40初期プロモーター、SV−40後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳ガンウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーターまたは他のプロモーターの指示のもとでのタンパク質の発現を可能にする他のベクターが含まれる。
上記で記載されるように、ウイルスは、多くの場合には宿主の防御機構を逃れるために進化してきた非常に特殊化された感染性作用因である。典型的には、ウイルスは特定の細胞タイプにおいて感染し、伝播する。ウイルスベクターの標的化特異性では、その天然の特異性が、所定の細胞タイプを特異的に標的とし、かつ、それにより、組換え遺伝子を感染細胞に導入するために利用される。したがって、本発明のいくつかの実施形態によって使用されるベクターのタイプは、形質転換された細胞タイプに依存するであろう。好適なベクターを形質転換された細胞タイプに従って選択できることは、十分に当業者の能力の範囲内であり、そのようなものとして、選択での考慮の一般的記載は本明細書中には提供されない。例えば、骨髄細胞を、ヒトT細胞白血病ウイルスI型(HTLV−I)を使用して標的化することができ、また、腎臓細胞が、Liang CY他(2004)(Arch Virol、149:51〜60)に記載されるようなバキュロウイルスのオートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)核多角体病ウイルス(AcMNPV)に存在する異種プロモーターを使用して標的化される場合がある。
1つの実施形態によれば、レンチウイルスベクターが、間葉系幹細胞をトランスフェクションするために使用される。
様々な方法を、本発明のいくつかの実施形態の発現ベクターを間葉系幹細胞に導入するために使用することができる。そのような方法が、Sambrook他、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Springs Harbor Laboratory、New York(1989、1992)、Ausubel他、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley and Sons、Baltimore、Md.(1989)、Chang他、Somatic Gene Therapy、CRC Press、Ann Arbor、Mich.(1995)、Vega他、Gene Targeting、CRC Press、Ann Arbor、Mich.(1995)、Vectors:A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses、Butterworths、Boston Mass.(1988)、およびGilboa他[Biotechniques、4(6):504〜512、1986]において一般的に記載されており、また、そのような方法には、例えば、組換えウイルスベクターを用いた安定的または一過性のトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーションおよび感染が含まれる。加えて、陽性−陰性の選抜方法については米国特許第5464764号および同第5487992号を参照のこと。
ウイルス感染による核酸の導入は、より大きいトランスフェクション効率をウイルスの感染性のために得ることができるので、他の方法(例えば、リポフェクションおよびエレクトロポレーションなど)を上回るいくつかの利点を提供する。
非ウイルス性である他のベクター、例えば、カチオン性脂質、ポリリシンおよびデンドリマーなどを使用することができる。ナノ粒子もまた意図される。
組込みを伴わないトランスフェクションの他の様式には、小環状DNAベクターの使用、またはゲノムから後で除くことができる遺伝子のトランスフェクションを可能にするPiggyBacトランスポゾンの使用が含まれる。
特定の実施形態によれば、間葉系幹細胞は、分化を誘導するために、miRNA(または一群のmiRNA)を発現するように遺伝子改変される。代替において、または加えて、間葉系幹細胞は、分化を誘導するために、miRNA(または一群のmiRNA)をダウンレギュレーションするポリヌクレオチド作用因を発現するように遺伝子改変される。
用語「ミクロRNA」、用語「miRNA」および用語「miR」は同義的であり、遺伝子発現を調節する、長さが約19〜28ヌクレオチドである非コードの一本鎖RNA分子の集まりを示す。様々なmiRNAが広範囲の生物において見出され、発達、恒常性および疾患原因において役割を果たすことが示されている。
下記はmiRNA活性の機構の簡単な記載である。
miRNAをコードする遺伝子が転写され、これにより、プリ−miRNAとして公知のmiRNA前駆体の産生がもたらされる。プリ−miRNAは典型的には、多数のプリ−miRNAを含む多シストロン性RNAの一部である。プリ−miRNAは、ステム/ループを有するヘアピンを形成する場合がある。ステムはミスマッチの塩基を含む場合がある。
プリ−miRNAのヘアピン構造が、RNaseIIIエンドヌクレアーゼであるDroshaによって認識される。Droshaは典型的には、プリ−miRNAにおける末端のループを認識し、およそ2回のらせん状ターンをステムに切断して、プレ−miRNAとして公知の60〜70ntの前駆体を生じさせる。Droshaは、RNaseIIIエンドヌクレアーゼに典型的な互い違いの切れ目を伴ってプリ−miRNAを切断し、これにより、5’ホスファートおよび約2ヌクレオチドの3’突出を有するプレ−miRNAのステム・ループをもたらす。ステムのおよそ1回のらせん状ターン(約10ヌクレオチド)がDrosha切断部位を越えて伸びることが、効率的なプロセシングのために必須であることが推定されている。その後、プレ−miRNAが、Ran−GTPおよび輸出受容体エクスポーチン−5によって核から細胞質に能動輸送される。
その後、プレ−miRNAの二本鎖ステムがDicerによって認識される(Dicerもまた、RNaseIIIエンドヌクレアーゼである)。Dicerはまた、ステム・ループの塩基において5’ホスファートおよび3’突出を認識する場合がある。その場合、Dicerは末端ループをステム・ループの塩基から2回のらせん状ターン離れて切断し、これにより、さらなる5’ホスファートおよび約2ヌクレオチドの3’突出を残す。生じたsiRNA様二重鎖はミスマッチを含む場合があり、成熟miRNAと、miRNA*として公知の類似サイズの断片とを含む。miRNAおよびmiRNA*が、プリ−miRNAおよびプレ−miRNAの相対するアームに由来する場合がある。miRNA*配列が、典型的にはmiRNAよりも低い頻度ではあるが、クローン化されたmiRNAのライブラリーにおいて見出される場合がある。
最初はmiRNA*との二本鎖の種として存在するにもかかわらず、miRNAは最終的には、RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)として公知のリボ核タンパク質複合体の中に一本鎖RNAとして取り込まれる。様々なタンパク質がRISCを形成することができ、このことは、miRNA/miRNA*二重鎖に対する特異性、標的遺伝子の結合部位、miRNAの活性(抑制するか、または活性化する)、およびmiRNA/miRNA*二重鎖のどの鎖がRISCに入るかにおける変動性をもたらすことができる。
miRNA:miRNA*二重鎖のmiRNA鎖がRISCに入るとき、miRNA*は除かれ、分解される。RISCに入るmiRNA:miRNA*二重鎖の鎖は、5’末端がそれほど強固に対形成しない方の鎖である。miRNA:miRNA*の両末端がほぼ同等な5’対形成を有する場合には、miRNAおよびmiRNA*の両方が遺伝子サイレンシング活性を有する場合がある。
RISCは、標的核酸を、miRNAとmRNAとの間における大きいレベルの相補性に基づいて、とりわけ、miRNAの2〜7番目のヌクレオチドによる相補性に基づいて特定する。
数多くの研究が、翻訳の効率的な阻害を達成するための、miRNAとそのmRNA標的との間における塩基対形成要件を調べている(これらがBartel(2004、Cell、116−281)によって総説される)。哺乳動物細胞では、miRNAの最初の8ヌクレオチドが重要であり得る(Doench&Sharp、2004、GenesDev、2004−504)。しかしながら、ミクロRNAの他の部分もまた、mRNA結合に関与する場合がある。そのうえ、3’における十分な塩基対形成は5’における不十分な対形成を補うことができる(Brennecke他、2005、PLoS、3−e85)。コンピューター計算研究では、ゲノム全体に対するmiRNA結合が分析された場合、標的結合におけるmiRNAの5’での2〜7番目の塩基に特異的な役割が示唆されており、しかし、通常では「A」であることが見出される最初のヌクレオチドの役割もまた認められた(Lewis他、2005、Cell、120−15)。同様に、1〜7番目のヌクレオチドまたは2〜8番目のヌクレオチドが、Krek他(2005、Nat Genet、37−495)によって、標的を特定し、検証するために使用された。
mRNAにおける標的部位が、5’UTR、3’UTRまたはコード領域に存在する場合がある。興味深いことに、多数のmiRNAが、同じ部位または多数の部位を認識することによって同じmRNA標的を調節する場合がある。多数のmiRNA結合部位がほとんどの遺伝子的に特定された標的に存在することは、多数のRISCの協同作用により、最も効率的な翻訳阻害がもたらされることを示し得る。
miRNAが、RISCに、遺伝子発現を2つの機構、すなわち、mRNA切断または翻訳抑制のどちらかによってダウンレギュレーションさせる場合がある。mRNAが、ある特定の程度の相補性をmiRNAに対して有するならば、miRNAにより、mRNAの切断が規定される場合がある。miRNAが切断を導くとき、切れ目は典型的には、miRNAの10番目および11番目の残基に対するヌクレオチド対形成の間である。代替では、miRNAが、必要な程度の相補性をmiRNAに対して有していないならば、miRNAにより、翻訳が抑制される場合がある。翻訳抑制が動物においてより多く見られる場合がある。これは、動物は、より低い程度の相補性をmiRNAと結合部位との間に有する場合があるからである。
どのmiRNAおよびmiRNA*の対の5’末端および3’末端にも、変動性が存在し得ることに留意しなければならない。この変動性は、切断部位に関するDroshaおよびDicerの酵素プロセシングにおける変動性に起因する場合がある。miRNAおよびmiRNA*の5’末端および3’末端における変動性はまた、プリ−miRNAおよびプレ−miRNAのステム構造におけるミスマッチに起因する場合がある。ステム鎖のミスマッチにより、異なるヘアピン構造の集団がもたらされる場合がある。ステム構造における変動性はまた、DroshaおよびDicerによる切断の生成物における変動性をもたらす場合がある。
用語「ミクロRNA模倣体」は、RNAi経路に入り、遺伝子発現を調節することができる合成された非コードRNAを示す。miRNA模倣体は内因性ミクロRNA(miRNA)の機能を模倣しており、成熟型二本鎖分子または模倣体前駆体(例えば、またはプレ−miRNA)として設計することができる。miRNA模倣体は、修飾された、または修飾されていないRNA、DNA、RNA−DNAハイブリッドまたは代替となり得る核酸化学(例えば、LNAまたは2’−O,4’−C−エチレン架橋核酸(ENA))から構成され得る。他の修飾体が本明細書中下記に記載される。成熟型二本鎖miRNA模倣体については、二重鎖領域の長さが、13〜33ヌクレオチドの間、1824ヌクレオチドの間、または21〜23ヌクレオチドの間で変化し得る。miRNAはまた、合計で少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39または40個のヌクレオチドを含む場合がある。miRNAの配列はプレ−miRNAの最初の13〜33ヌクレオチドである場合がある。miRNAの配列はまた、プレ−miRNAの最後の13ヌクレオチド〜33ヌクレオチドである場合がある。
miRNAを発現させるために間葉系幹細胞を遺伝子改変することが下記のいくつかの方法で実行される場合があることが、本明細書中に提供される説明から理解されるであろう:
1.間葉系幹細胞を成熟型miRNA(または本明細書中下記で記載されるように改変形態)により一過性にトランスフェクションすること。本発明の教示に従って設計されるmiRNAは、酵素的合成および固相合成の両方を含めて、当技術分野で公知の任意のオリゴヌクレオチド合成法に従って作製することができる。固相合成を実行するための様々な設備および試薬が、例えば、Applied Biosystemsから市販されている。そのような合成のための任意の他の手段もまた用いることができる;オリゴヌクレオチドの実際の合成は十分に当業者の能力の範囲内であり、固相化学(例えば、シアノエチルホスホルアミダイト)、その後、脱保護、脱塩および精製(例えば、自動トリチル・オン法またはHPLCによる精製)を利用して、例えば、下記において詳しく記載されるような確立された方法論により達成することができる:Sambrook,J.およびRussell,D.W.(2001)、“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”;Ausubel,R.M.他編(1994、1989)、“Current Protocols in Molecular Biology”、第I巻〜第III巻、John Wiley&Sons、Baltimore、Maryland;Perbal,B.(1988)、“A Practical Guide to Molecular Cloning”、John Wiley&Sons、New York;およびGait,M.J.編(1984)、“Oligonucleotide Synthesis”。
2.間葉系幹細胞を、成熟型miRNAをコードする発現ベクターにより安定的または一過性にトランスフェクションすること。
3.間葉系幹細胞を、プレ−miRNAをコードする発現ベクターにより安定的または一過性にトランスフェクションすること。プレ−miRNA配列は、45〜90ヌクレオチド、60〜80ヌクレオチド、または60〜70ヌクレオチドを含む場合がある。プレ−miRNAの配列は、本明細書中に示されるようなmiRNAおよびmiRNA*を含む場合がある。プレ−miRNAの配列はまた、プリ−miRNAの5’末端および3’末端から0〜160個のヌクレオチドを除外するプリ−miRNAの配列である場合がある。
4.間葉系幹細胞を、プリ−miRNAをコードする発現ベクターにより安定的または一過性にトランスフェクションすること。プリ−miRNA配列は、45〜30000ヌクレオチド、50〜25000ヌクレオチド、100〜20000ヌクレオチド、1000〜1500ヌクレオチド、または80〜100ヌクレオチドを含む場合がある。プリ−miRNAの配列は、本明細書中に示されるようにプレ−miRNA、miRNAおよびmiRNA*、ならびに、それらの変化体を含む場合がある。miRNA模倣体の調製を化学的合成法によって、または、組換え法によって行うことができる。
1.間葉系幹細胞を成熟型miRNA(または本明細書中下記で記載されるように改変形態)により一過性にトランスフェクションすること。本発明の教示に従って設計されるmiRNAは、酵素的合成および固相合成の両方を含めて、当技術分野で公知の任意のオリゴヌクレオチド合成法に従って作製することができる。固相合成を実行するための様々な設備および試薬が、例えば、Applied Biosystemsから市販されている。そのような合成のための任意の他の手段もまた用いることができる;オリゴヌクレオチドの実際の合成は十分に当業者の能力の範囲内であり、固相化学(例えば、シアノエチルホスホルアミダイト)、その後、脱保護、脱塩および精製(例えば、自動トリチル・オン法またはHPLCによる精製)を利用して、例えば、下記において詳しく記載されるような確立された方法論により達成することができる:Sambrook,J.およびRussell,D.W.(2001)、“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”;Ausubel,R.M.他編(1994、1989)、“Current Protocols in Molecular Biology”、第I巻〜第III巻、John Wiley&Sons、Baltimore、Maryland;Perbal,B.(1988)、“A Practical Guide to Molecular Cloning”、John Wiley&Sons、New York;およびGait,M.J.編(1984)、“Oligonucleotide Synthesis”。
2.間葉系幹細胞を、成熟型miRNAをコードする発現ベクターにより安定的または一過性にトランスフェクションすること。
3.間葉系幹細胞を、プレ−miRNAをコードする発現ベクターにより安定的または一過性にトランスフェクションすること。プレ−miRNA配列は、45〜90ヌクレオチド、60〜80ヌクレオチド、または60〜70ヌクレオチドを含む場合がある。プレ−miRNAの配列は、本明細書中に示されるようなmiRNAおよびmiRNA*を含む場合がある。プレ−miRNAの配列はまた、プリ−miRNAの5’末端および3’末端から0〜160個のヌクレオチドを除外するプリ−miRNAの配列である場合がある。
4.間葉系幹細胞を、プリ−miRNAをコードする発現ベクターにより安定的または一過性にトランスフェクションすること。プリ−miRNA配列は、45〜30000ヌクレオチド、50〜25000ヌクレオチド、100〜20000ヌクレオチド、1000〜1500ヌクレオチド、または80〜100ヌクレオチドを含む場合がある。プリ−miRNAの配列は、本明細書中に示されるようにプレ−miRNA、miRNAおよびmiRNA*、ならびに、それらの変化体を含む場合がある。miRNA模倣体の調製を化学的合成法によって、または、組換え法によって行うことができる。
分化培地における培養:
MSCを分化作用因と接触させることを、例えば、分化作用因を、当該作用因が細胞と直接に接触しているように対象由来の細胞に加えることを含む任意のインビトロ条件のもとで行うことができる。本発明のいくつかの実施形態によれば、対象の細胞が分化作用因とともにインキュベーションされる。細胞をインキュベーションするために使用される条件は、作用因が、分化を促進させる細胞変化(例えば、特異的な遺伝子の転写速度および/または翻訳速度における変化など)を誘導することを可能にする期間/細胞の濃度/作用因の濃度/細胞と作用因との比率などについて選択される。
MSCを分化作用因と接触させることを、例えば、分化作用因を、当該作用因が細胞と直接に接触しているように対象由来の細胞に加えることを含む任意のインビトロ条件のもとで行うことができる。本発明のいくつかの実施形態によれば、対象の細胞が分化作用因とともにインキュベーションされる。細胞をインキュベーションするために使用される条件は、作用因が、分化を促進させる細胞変化(例えば、特異的な遺伝子の転写速度および/または翻訳速度における変化など)を誘導することを可能にする期間/細胞の濃度/作用因の濃度/細胞と作用因との比率などについて選択される。
典型的には、培地は、特定の系譜特異的細胞の分化を促進させる増殖因子および/またはサイトカインを含む。
分化用培地の例には、G5、神経基礎培地、DMEMまたはDMEM/F12、OptiMEM(商標)、あるいは、系譜特異的細胞の成長を支援する他の任意の培地が含まれる。
分化作用因の例には、ヒトニューレグリン1−β1、N2補充物、IBMX、cAMP、神経栄養因子(例えば、BDNF、CNTF、GDNF、NTN、NT3またはLIF)、ホルモン、増殖因子(例えば、GGF2、TGF−β3、TGF−α、FGF(FGF−8、FGF4およびbFGFを含む)、EGF、血小板由来増殖因子(PDGF))、ビタミン、ホルモン(例えば、インスリン、プロゲステロン)および他の因子(例えば、ソニックヘッジホッグ、骨形態形成タンパク質、フォルスコリン、レチノイン酸、アスコルビン酸、プトレシン、セレンおよびトランスフェリンなど)が含まれるが、これらに限定されない。
下記は、系譜特異的細胞を作製するために使用され得る例示的な分化プロトコルのまとめである。MSC分化のためのさらにより多くのプロトコルが当技術分野では公知であり、本発明はすべてのそのようなプロトコルを意図することが理解されるであろう。
星状膠細胞様細胞:
本発明者らは、その星状膠細胞分化を特定の一組のmiRNAのアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションによって誘導するためにMSCの遺伝子改変を意図する。
本発明者らは、その星状膠細胞分化を特定の一組のmiRNAのアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションによって誘導するためにMSCの遺伝子改変を意図する。
したがって、1つの実施形態によれば、星状膠細胞表現型に向かう分化は、間葉系幹細胞(MSC)において、miR−18,miR−17−5p,miR−141,miR−302b,miR−20b,miR−101,miR−126,miR−146a,miR−146b,miR−3a,miR−26,miR−29,miR−132,miR−92ap,miR−21,miR−26a,miR−18a,miR−124,miR−99a,miR−30c,miR−301a,miR−145−50,miR−143−3p,miR−373,miR−20b,miR−29c,miR−29b,miR−143,let−7g,let−7a,let−7b,miR−98,miR−30a*,miR−17,miR−1,miR−192,miR−155,miR−516−ap,miR−31,miR−181a,miR−181b,miR−181c,miR−34−c,miR−34b*,miR−103a,miR−210,miR−16,miR−30a,miR−31,miR−222,miR−17,miR−17*,miR−200b,miR−200c,miR−128,miR−503,miR−424,miR−195,miR−1256,miR−203a,miR−199,miR−93,miR−98,miR−125−a,miR−133a,miR−133b,miR−126,miR−194,miR−346,miR−15b,miR−338−3p,miR−373,miR−205,miR−210,miR−125,miR−1226,miR−708,miR−449,miR−422,miR−340,miR−605,miR−522,miR−663,miR−130a,miR−130b,miR−942,miR−572,miR−520,miR−639,miR−654,miR−519,mir−202,mir−767−5p,mir−29a,mir−29b,mir−29c,let−7a,let−7b,let−7c,let−7d,let−7e,let−7f,let−7g,let−7i,mir−4458,mir−4500,mir−98,mir−148a,mir−148b,mir−152,mir−4658,mir−3662,mir−25,mir−32,mir−363,mir−367,mir−92a,mir−92b,mir−520d−5p,mir−524−5p,mir−4724−3p,mir−1294,mir−143,mir−4770,mir−3659,mir−145,mir−3163,mir−181a,mir−181b,mir−181c,mir−181d,mir−4262,mir−4279,mir−144,mir−642b,mir−4742−3p,mir−3177−5p,mir−656,mir−3121−3p,mir−106a,mir−106b,mir−17,mir−20a,mir−20b,mir−519d,mir−93,mir−1297,mir−26a,mir−26b,mir−4465,mir−326,mir−330−5p,mir−3927,mir−2113,mir−372,mir−373,mir−520a−3p,mir−520b,mir−520c−3p,mir−520d−3p,mir−520e,mir−199a−3p,mir−199b−3pおよびmir−3129−5pからなる群から選択される少なくとも1種の外因性miRNAのレベルをアップレギュレーションすることによって行われることができる。
別の実施形態によれば、星状膠細胞表現型に向かう分化は、mi−R−193b,mi−R−221,mi−R−135a,mi−R−149,mi−R−222,mi−R−199a,mi−R−302a,mi−R−302c,mi−R−302d,mi−R−369−3p,mi−R−370,mi−R−let7a,mi−R−let7b,mi−R−10b,mi−R−23a,mi−R−23b and mi−R−32,miR−204,miR−224,miR−616,miR−122,miR−299,miR−100,miR−138,miR−140,miR−375,miR−217,miR−302,miR−372,miR−96,miR−127−3p,miR−449,miR−135b,miR−101,miR−326,miR−324,miR−335,miR−14,miR−16,mir−410,mir−3163,mir−148a,mir−148b,mir−152,mir−3121−3p,mir−495,mir−203およびmir−4680−3pからなる群から選択される少なくとも1種のmiRNAの発現をダウンレギュレーションすることによって行われることができ、ダウンレギュレーションすることは、少なくとも1種のmiRNAにハイブリダイズしてその機能を阻害する少なくとも1種のポリヌクレオチド作用因のレベルをアップレギュレーションすることによって行われる。
特定の組合せもまた本発明者らによって意図され、これらには、MSCにおいて、miR−20b、miR−101およびmiR−146aのそれぞれをアップレギュレーションすること、ならびに、miR−9および外因性miR−20bのそれぞれをアップレギュレーションすること(これらに限定されない)が含まれる。
外因性miR−9、外因性miR−146および外因性miR−101のレベルをMSCの集団においてアップレギュレーションし、かつ、miR−10bおよびmiR−302の発現をMSCの当該集団においてダウンレギュレーションすることが、本発明者らによって意図される別の組合せである。
MSCを星状膠細胞の系譜に向かって分化させる方法が下記において開示される:Kopen,G.C.,et al.,Proc Natl Acad USA.96(19):10711−6,1999;Sanchez−Ramos,et al.Exp Neurol.164(2):247−56.2000;Woodbury,D.,J Neurosci Res.61(4):364−70,2000;Woodbury,D.,et al.,J Neurosci Res.69(6):908−17,2002;Black,I.B.,Woodbury,D.Blood Cells Mol Dis.27(3):632−6,2001;Kohyama,J.,et al.Differentiation.68(4−5):235−44,2001;Levy,Y.S.J Mol Neurosci.21(2):121−32,2003;US Patent Application No.20090010895;US Patent Application No.20120009673,U.S.Pat.No.6,528,24;Reyes and Verfatile(Ann.N.Y.Acad. Sci.938:231−235,2001)and Jiang et al.(Nature 418:47−49,2002)。これらの内容は本明細書中に参照として援用される。
神経幹細胞:
本発明者らは、その神経幹細胞分化を特定の一組のmiRNAのアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションによって誘導するためにMSCの遺伝子改変を意図する。
本発明者らは、その神経幹細胞分化を特定の一組のmiRNAのアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションによって誘導するためにMSCの遺伝子改変を意図する。
したがって、1つの実施形態によれば、神経幹細胞表現型に向かう分化は、間葉系幹細胞(MSC)において、miR302b,miR−371,miR−134,miR−219,miR−154,miR−155,miR−32,miR−33,miR−126,miR−127,miR−132,miR−137,miR−572,miR−935a,miR−891a,miR−1202,miR−1275,let−7c,miR−665,miR−4258,miR−361−3p,miR−374a−star,miR−892b miR−361−5p,miR−181a,miR−16,miR−636,miR−4284,miR−1208,miR−1274b,miR−30c−2−star,miR−501−3p,hsa−miR−92a,miR−378b,miR−1287,miR−425−star,miR−324−5p,miR−3178,miR−219−1−3p,miR−197,miR−181b,miR−500−star,miR−106b,miR−502−3p,miR−30c,miR−1275,miR−422a,miR−93,miR−181d,miR−1307,miR−1301,miR−99a,miR−505−star,miR−1202,miR−12,miR−532−5p,miR−195,miR−532−3p,miR−106a,miR−17,miR−1271,miR−769−3p,miR−15b,miR−324−3p,miR−20a,miR−501−5p,miR−330−3p,miR−874,miR−500,miR−25,miR−769−5p,miR−125b−2−star,miR−130b,miR−504,miR−181a−2−star,miR−885−3p,miR−1246,miR−92b,miR−362−5p,miR−572,miR−4270,miR−378c,miR−93−star,miR−149,miR−363,miR−18a,miR−891a,miR−346,miR−497,miR−378,miR−1231,miR−139−5p,miR−3180−3p,miR−935およびmiR−20bからなる群から選択される少なくとも1種の外因性miRNAのレベルをアップレギュレーションすることによって行われることができる。
したがって、別の実施形態によれば、神経幹細胞表現型に向かう分化は、間葉系幹細胞(MSC)において、miR−10b,miR−142−3p,miR−131a,miR−125b,miR−153,miR−181a,miR−409−5p,miR−193a−5p,miR−4317,miR−4288,miR−145,miR−143,miR−214,miR−199a−3p,miR−199a−5p,miR−199b−3p,miR−138,miR−31,miR−21,miR−193a−5p,miR−224−star,miR−196a,miR−487b,miR−409−5p,miR−193b−star,miR−379,miR−21−star,miR−27a−star,miR−27a,miR−4317,miR−193b,miR−27b,miR−22,574−3p,miR−4288,miR−23a,miR−221−star,miR−2113,let−7i,miR−24,miR−23b,miR−299−3p,miR−518c−star,miR−221,miR−431−star,miR−523,miR−4313,miR−559,miR−614,miR−653,miR−2278,miR−768−5p,miR−154−star,miR−302a−star,miR−3199およびmiR−3137からなる群から選択される少なくとも1種のmiRNAの発現をダウンレギュレーションすることによって行われることができ、ダウンレギュレーションすることは、少なくとも1種のmiRNAにハイブリダイズしてその機能を阻害する少なくとも1種のポリヌクレオチド作用因のレベルをアップレギュレーションすることによって行われる。
さらに別の実施形態によれば、神経幹細胞表現型に向かう分化が、外因性miR−124のレベルを間葉系幹細胞(MSC)においてアップレギュレーションし、かつ、miR−let−7のレベルを当該MSCにおいてダウンレギュレーションすることによって達成される場合がある。
神経幹細胞をMSCから作製する別の方法が、Related to testis−specific,vespid and pathogenesisタンパク質1(RTVP−1)の量および/または活性をダウンレギュレーションすることによるものである。
神経幹細胞を作製するさらなる方法が当技術分野では知られており、本発明はすべてのそのような方法を意図する。
運動ニューロン:
本発明者らは、その運動ニューロン分化を特定の一組のmiRNAのアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションによって誘導するために神経幹細胞の作製を介するMSCの遺伝子改変を意図する。
本発明者らは、その運動ニューロン分化を特定の一組のmiRNAのアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションによって誘導するために神経幹細胞の作製を介するMSCの遺伝子改変を意図する。
したがって、1つの実施形態によれば、運動ニューロン表現型に向かう分化は、神経幹細胞(NSC)において、miR−368,miR−302b,miR−365−3p,miR−365−5p,miR−Let−7a,miR−Let−7b,miR−218,miR−134,miR−124,miR−125a,miR−9,miR−154,miR−20aおよびmiR−130aからなる群から選択される少なくとも1種の外因性miRNAのレベルをアップレギュレーションすることによって行われることができる。
なお別の実施形態によれば、運動ニューロン表現型に向かう分化は、NSCにおいて、miR−372,miR−373,miR−141,miR−199a,miR−32,miR−33,miR−221およびmiR−223からなる群から選択される少なくとも1種のmiRNAの発現をダウンレギュレーションすることによって行われることができ、ダウンレギュレーションすることは、少なくとも1種のmiRNAにハイブリダイズしてその機能を阻害する少なくとも1種のポリヌクレオチド作用因のレベルをアップレギュレーションすることによって行われる。
miRNAの特定の組合せもまた本発明者らによって意図され、これらには、例えば、神経幹細胞において、miR Let−7a、miR−124、miR−368およびmiR−154のそれぞれをアップレギュレーションすること、またはmiR−125a、miR−9、miR−130aのそれぞれをアップレギュレーションすること、またはmiR−218、miR−134およびmiR−20aのそれぞれをアップレギュレーションすることが含まれる。
加えて、または代替において、本発明者らはさらに、miR−141、miR−32、miR−33、miR−221、miR−223およびmiR−373のそれぞれを神経幹細胞においてダウンレギュレーションすることを意図する。
加えて、運動ニューロンの作製が、下記の外因性miRNAのレベルを間葉系幹細胞においてアップレギュレーションすることによって達成される場合がある:miR−368,miR−365,miR−500,miR−648,miR−491,miR−218,miR−155,miR−192,let−7b,miR−16,miR−210,miR−197,miR−21,miR−373,miR−27a,miR−122,miR−17,miR−494,miR−449,miR−503,miR−30a,miR−196a,miR−122,miR−7,miR−151−5p,miR−16,miR−22,miR−31,miR−424,miR−1,miR−29c,miR−942,miR−100,miR−520,miR−663a,miR−562,miR−449a,miR−449b−5p,miR−520b,miR−451,miR−532−59,miR−605,miR−504,miR−503,miR−155,miR−34a,miR−16,miR−7b,miR−103,miR−124,miR−1385p,miR−16,miR−330,miR−520,miR−608,miR−708,miR−107,miR−137,miR−132,miR−145,miR−204,miR−125b,miR−224,miR−30a,miR−375,miR−101,miR−106b,miR−128,miR−129−5p,miR−153,miR−203,miR−214,miR−338−3p,miR−346,miR−98,miR−107,miR−141,miR−217,miR−424,miR−449,miR−7,miR−9,miR−93,miR−99a,miR−100,miR−1228,miR−183,miR−185,miR−190,miR−522,miR−650,miR−675,miR−342−3p,miR−31。
加えて、運動ニューロンの作製が、下記miRNAの少なくとも1つとハイブリダイゼーションし、かつ、その活性を阻害する少なくとも1つのポリヌクレオチド作用因のレベルをMSCにおいてアップレギュレーションすることによって達成される場合がある:miR−199a,miR−372,miR−373,miR−942,miR−2113,miR−301a−3p,miR−302c,miR−30b−5p,miR−30c,miR−326,miR−328,miR−331−3p,miR−340,miR−345,miR−361−5p,miR−363,miR−365a−3p,miR−371a−3p,miR−373−3p,miR−374a,miR−423−3p,miR−449b−5p,miR−451a,miR−494,miR−504,miR−515−3p,miR−516a−3p,miR−519e,miR−520a−3p,miR−520c−3p,miR−520g,miR−532−5p,miR−559,miR−562,miR−572,miR−590−5p,miR−605,miR−608,miR−626,miR−639,miR−654−3p,miR−657,miR−661,miR−708−5p,miR−942,miR−96,miR−99arno and miR−194。
Roy et al.,2005[Exp Neurol.2005;196:224−234];Zhang et al.,2006[Stem Cells.2006;24:434−442];Bohl et al.,2008[Stem Cells.2008;26:2564−2575];and Dimos et al.,2008[Science.2008;321:1218−1221]。参照によって本明細書中に組み入れられるこれらの内容は、運動ニューロンへの分化を誘導するための様々な異なる幹細胞の遺伝的改変を教示する。当業者は、かかるプロトコールを間葉系幹細胞治療のためにどのようにして適合するかを知っているだろう。
Renoncourt et al.,1998[Mech Dev.1998;79:185−197];Wichterle et al.,2002 Cell.2002;110:385−397;Barberi et al.,2003[Nat Biotechnol.2003;21:1200−1207];Li et al.,2005[Nat Biotechnol.2005;23:215−221];Shin et al.,2005[Stem Cells Dev.2005;14:266−269],Soundararajan et al.,2006[J Neurosci.2006;26:3256−3268],Lim et al.,2006[Curr Neurovasc Res.2006;3:281−288];Deshpande et al.,2006[Ann Neurol.2006;60:32−44];Lee et al.,2007[Stem Cells.2007;25:1931−1939];Li et al.,2008[Stem Cells.2008;26:886−893];Wu et al.,2002[Nat Neurosci.2002;5:1271−1278];Gao et al.,2005[Neuroscience.2005;131:257−262];MacDonald et al.,2003[J Neurosurg.2003;98:1094−1103];Goncalves et al.,2005 [Dev Biol.2005;278:60−70];Corti et al.,2006[Hum Mol Genet.2006;15:167−187];Corti et al.,2007[Brain.2007;130:1289−1305]。参照によって本明細書中に組み入れられるこれらの内容は、運動ニューロンへの分化を誘導するための様々な異なる幹細胞の分化培地における培養を教示する。当業者は、かかるプロトコールを間葉系幹細胞治療のためにどのようにして適合するかを知っているだろう。
骨格筋細胞
MSCを骨格筋に向かって分化させるための意図されるプロトコルには、下記によって開示されるプロトコルが含まれる:Taylor SM、Jones PA、J Cell Physiol、1982、111:187〜94;Lee JH、Kosinski PA、Kemp DM、Exp Cell Res、2005、307:174〜82(それらの内容は参照によって組み込まれる)。
MSCを骨格筋に向かって分化させるための意図されるプロトコルには、下記によって開示されるプロトコルが含まれる:Taylor SM、Jones PA、J Cell Physiol、1982、111:187〜94;Lee JH、Kosinski PA、Kemp DM、Exp Cell Res、2005、307:174〜82(それらの内容は参照によって組み込まれる)。
ニューロン
本発明者らの国際出願公開番号WO2010/144698(これは参照によって本明細書中に組み込まれる)は、そのニューロン分化を誘導するためにMSCの遺伝子改変を教示する。この特許出願は、分化を促進させるために特定の一組のmiRNAのアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを教示する。
本発明者らの国際出願公開番号WO2010/144698(これは参照によって本明細書中に組み込まれる)は、そのニューロン分化を誘導するためにMSCの遺伝子改変を教示する。この特許出願は、分化を促進させるために特定の一組のmiRNAのアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを教示する。
米国特許出願公開20050265983は、ドーパミン分泌細胞に向かうMSCの分化を教示する。
MSCは、ニューロン様細胞へと分化することも示されている。かかるニューロン様細胞は、ニューロンマーカーを示し(Azizi et al.,1998,Proc Natl Acad Sci USA 95:3908−3913;Deng et al.,2001,Biochem Biophys Res Commun 282:148−152;Kopen et al.,Proc Natl Acad USA 96:10711−10716 1999;Levy et al.,2003 J Mol.Neurosci.21:127−138;Sanchez−Ramos et al.,2000 Exp Neurol 164:247−256.;Schwarz et al.,1999 Hum Gene Ther 10:2539−2549;Woodbury et al.,2000,J Neurosci Res 61:364−370)、いくつかの電気生理学的機能を示す(Kohyama et al.,2001,Differentiation 68:235−244)。MSCは、ドーパミン作動性マーカーを発現して、脱分極後にドーパミンを分泌することも示されている(Levy et al.,2004,J Mol.Neurosci.24:353−386)。
乏突起膠細胞:
意図されるプロトコルには、Liu他[Dev Biol、302:683〜693、2007]によって開示されるプロトコルが含まれ、また、米国特許出願公開第20100021434号は、N2補充物および線維芽細胞増殖因子(FGF)におけるインキュベーションによる骨髄由来間葉細胞の乏突起膠細胞分化を教示する(両者の内容は参照によって本明細書中に組み込まれる)。
意図されるプロトコルには、Liu他[Dev Biol、302:683〜693、2007]によって開示されるプロトコルが含まれ、また、米国特許出願公開第20100021434号は、N2補充物および線維芽細胞増殖因子(FGF)におけるインキュベーションによる骨髄由来間葉細胞の乏突起膠細胞分化を教示する(両者の内容は参照によって本明細書中に組み込まれる)。
本発明者らのIL2011/000660(これは参照によって本明細書中に組み込まれる)は、そのニューロン分化を誘導するためのMSCの遺伝子改変を教示する。この特許出願は、分化を促進させるための特定の一組のmiRNAのアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを教示する。
間葉系幹細胞集団が自己移植に好適であるかどうかを立証するために、(患者のMSCから分化させられる)系譜特異的細胞が、当該疾患に関連する別の系譜特異的細胞と接触させられ、当該疾患に対する影響が分析される。
筋萎縮性側索硬化症(ALS)−図2を参照のこと:
筋萎縮性側索硬化症(ALS)は、患者の上位および下位運動ニューロンを冒す原因不明の致死的な神経変性疾患である。合衆国ではおよそ5600人が毎年、ALSと診断される。ALSの発生率は100000人あたり2人であり、30000人もの多くのアメリカ人がある時点でこの疾患に罹り得ると推定されている。80%の患者が診断後5年以内に死亡し、この場合、通常、死亡は呼吸不全のためである。今日に至るまで、ALSのための効果的な治療法は何もなく、FDAによって現在承認されている唯一の薬物が、生存率を6ヶ月増大させるNMDA受容体アンタゴニスト(リルゾール)である。
筋萎縮性側索硬化症(ALS)は、患者の上位および下位運動ニューロンを冒す原因不明の致死的な神経変性疾患である。合衆国ではおよそ5600人が毎年、ALSと診断される。ALSの発生率は100000人あたり2人であり、30000人もの多くのアメリカ人がある時点でこの疾患に罹り得ると推定されている。80%の患者が診断後5年以内に死亡し、この場合、通常、死亡は呼吸不全のためである。今日に至るまで、ALSのための効果的な治療法は何もなく、FDAによって現在承認されている唯一の薬物が、生存率を6ヶ月増大させるNMDA受容体アンタゴニスト(リルゾール)である。
間葉系幹細胞集団が、ALSを処置するための自己移植のために好適であるかどうかを立証するために、患者から分化させられた星状膠細胞および/または骨格筋細胞が運動ニューロンと接触させられる(例えば、共培養される)場合がある。運動ニューロンは初代運動ニューロンまたは運動ニューロンの細胞株である場合がある。特定の実施形態によれば、運動ニューロンが、星状膠細胞が分化させられた間葉系幹細胞集団から分化させられる。
好ましくは、運動ニューロンに対する系譜特異的細胞の細胞毒性影響が分析される。
薬物によって誘導される細胞変化をモニターする様々な方法が当技術分野では公知であり、これらには、例えば、黄色塩のMTT(3−(4,5−ジメチルチアゾリル−2)−2,5−ジフェニルテトラゾリウム臭化物)(Sigma,Aldrich、St Louis、MO、米国)を青紫色の不溶性ホルマザン沈殿物に還元する生細胞の選択的能力に基づくMTT試験;BrDuアッセイ[Cell Proliferation ELISA BrdU比色キット(Roche、Mannheim、ドイツ)];TUNELアッセイ[Roche、Mannheim、ドイツ];アネキシンVアッセイ[ApoAlert(登録商標)アネキシンVアポトーシスキット(Clontech Laboratories,Inc.、CA、米国];細胞老化関連β−ガラクトシダーゼアッセイ、同様にまた、(発現および/または活性のレベルを検出する)様々なRNAおよびタンパク質の検出方法が含まれる。
ALS患者に由来する系譜特異的細胞が、対照の対象に由来する同一の系譜特異的細胞よりも大きい細胞毒性を運動ニューロンに対して有するならば、当該系譜特異的細胞が由来するMSC集団は、ALSを処置するための自己細胞移植のために適していないと見なされる場合がある。
1つの実施形態によれば、自己MSC集団が、対照のMSC集団よりも10%を超えて細胞毒性であるならば、患者細胞集団は、ALSを処置するための自己細胞移植のために適していないと見なされる。
1つの実施形態によれば、自己MSC集団が、対照のMSC集団よりも20%を超えて細胞毒性であるならば、患者細胞集団は、ALSを処置するための自己細胞移植のために適していないと見なされる。
1つの実施形態によれば、自己MSC集団が、対照のMSC集団よりも30%を超えて細胞毒性であるならば、患者細胞集団は、ALSを処置するための自己細胞移植のために適していないと見なされる。
1つの実施形態によれば、自己MSC集団が、対照のMSC集団よりも40%を超えて細胞毒性であるならば、患者細胞集団は、ALSを処置するための自己細胞移植のために適していないと見なされる。
1つの実施形態によれば、自己MSC集団が、対照のMSC集団よりも50%を超えて細胞毒性であるならば、患者細胞集団は、ALSを処置するための自己細胞移植のために適していないと見なされる。
対照のMSC集団は典型的には、ALSを有しない対象に由来し、好ましくは健常者対象に由来する。MSC集団の年齢一致および性別一致もまた意図される。
好ましくは、対照のMSC集団は、患者のMSC集団の分化と同時に系譜特異的細胞に向かって分化させられ、その結果、これら2つの細胞集団が同一の実験条件(例えば、温度および時間など)を受けることを保証するようにされる。
細胞死に加えて、運動ニューロンは、患者のMSC集団から分化させられる系譜特異的細胞との共培養の後で、酸化ストレスに対する感受性、プロテアソーム阻害、ミトコンドリアの機能およびERのストレス応答について調べられる場合がある。
本明細書中上記で記載される共培養アッセイと同様に、本発明ではさらに、対象に起源を有するMSCの遺伝子異常について分析することが意図される。遺伝子異常が検出されるならば、そのMSC集団は細胞治療のための供給源として選択されない。したがって、例えば、本発明では、スーパーオキシドジスムターゼ(SOD−1)遺伝子における変異の存在について分析することが意図される。
SOD−1遺伝子は染色体21q22.1に局在する。SOD−1の配列はPCT公開WO94/19493に開示されている。ヒトSOD−1遺伝子の核酸配列をGenbankアクセション番号NM.000454において見出すことができる。
ALSに伴う他の遺伝子異常には、アルシン(Alsin)、すなわち、ALSの若年性劣性型に関わる潜在的なグアニンヌクレオチド交換因子(GEF)に存在する遺伝子異常が含まれる。別のものが、若年性ALSの常染色体優性型に連鎖することが確認されるセナタキシン(Senataxin)と呼ばれるDNA/RNAヘリカーゼドメイン含有タンパク質をコードするALS4である。最も近年には、ALS8と呼ばれる新しい遺伝子座での小胞結合膜タンパク質/シナプトブレビン結合膜タンパク質B(VAPB)における変異が、ALSの非定型形態に関連すると報告された。
別の実施形態によれば、遺伝子異常はTARDBP遺伝子においてである。
遺伝子異常について分析する様々な方法が当技術分野では知られており、これらはタンパク質レベルまたはポリヌクレオチドレベルで行われる場合がある。
遺伝子異常について分析するための例示的な方法には、染色体染色法およびDNA染色法(例えば、FISH分析、PRINS分析、間期染色体に対する高分解能多色バンディング(MCB)、および定量的FISH(Q−FISH))が含まれる。
本発明のいくつかの実施形態の配列変化(またはSNP)を、様々なさらなる方法を使用して特定することができる。1つの選択肢が、PCR反応産物の完全な遺伝子配列を決定することである。代替では、核酸の所与部分がいくつかの他のレベルで特徴づけられる場合がある。最も低い分解能では、分子のサイズを同じゲルでの既知標準物の泳動との比較により電気泳動によって求めることができる。分子のより詳細な写真が、整然としたマップの構築を可能にするための、電気泳動に先立つ制限酵素の組合せによる切断によって達成される場合がある。断片内における特異的配列の存在を標識されたプローブのハイブリダイゼーションによって検出することができ、あるいは、正確なヌクレオチド配列を部分的な化学的分解によって、または鎖停止ヌクレオチドアナログの存在下におけるプライマー伸張によって求めることができる。
さらなる例示的な技術には、制限断片長多型(RFLP)、配列決定分析、ミクロ配列決定、ポリメラーゼおよびリガーゼに基づくミスマッチ検出アッセイ、リガーゼ/ポリメラーゼにより媒介されるGenetic Bit Analysis(商標)ハイブリダイゼーションアッセイ法(オリゴヌクレオチドアレイに対するハイブリダイゼーションを含む)、Integrated Systems、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド(ASO)、変性勾配ゲル電気泳動/温度勾配ゲル電気泳動(DGGE/TGGE)、一本鎖高次構造多型(SSCP)、ジデオキシフィンガープリンティング(ddF)、ピロシークエンシング(商標)分析(Pyrosequencing,Inc.、Westborough、MA、米国)、Acycloprime(商標)分析(Perkin Elmer、Boston、Massachusetts、米国)ならびにリバースドットブロットが含まれる。
配列変化はまた、タンパク質レベルで求めることができる。クロマトグラフィーおよび電気泳動法が好ましくは、SOD−1の分子量における大きい変動を検出するために使用されるが、SOD−1の配列変化に対して特異的である抗体を使用して行われる場合がある免疫検出アッセイ(例えば、ELISAおよびウエスタンブロット分析ならびに免疫組織化学など)が好ましくは、点変異および分子量におけるかすかな変化を検出するために使用される。
したがって、本発明では、そのいくつかの実施形態によれば、血清免疫グロブリン、ポリクローナル抗体またはそのフラグメント(すなわち、その免疫反応性誘導体)、あるいは、モノクローナル抗体またはそのフラグメントの使用もまた、遺伝子異常を検出するために想定される。モノクローナル抗体、または抗原結合領域の少なくとも一部分を有する当該モノクローナル抗体の精製断片(本明細書中下記で記載される断片を含む)、キメラ抗体またはヒト化抗体、および相補性決定領域(CDR)。
パーキンソン病−図3を参照のこと:
パーキンソン病(PD)は、強直、動作緩慢および静止時振戦によって特徴づけられる進行性の神経変性疾患である。この疾患の病理学的な際立った特徴が、中脳における黒質緻密部(SNc)でのドーパミン作動性ニューロンの選択的喪失である。PDの症例のほとんどが、未だに不明な原因および病理発生により散発的に発生する。可能性のある機構には、ミトコンドリア機能不全、酸化ストレス、小胞体ストレス、ユビキチン−プロテアソーム系の不全、いくつかの環境的要因、および遺伝的素因が含まれる。
パーキンソン病(PD)は、強直、動作緩慢および静止時振戦によって特徴づけられる進行性の神経変性疾患である。この疾患の病理学的な際立った特徴が、中脳における黒質緻密部(SNc)でのドーパミン作動性ニューロンの選択的喪失である。PDの症例のほとんどが、未だに不明な原因および病理発生により散発的に発生する。可能性のある機構には、ミトコンドリア機能不全、酸化ストレス、小胞体ストレス、ユビキチン−プロテアソーム系の不全、いくつかの環境的要因、および遺伝的素因が含まれる。
星状膠細胞が、その進行において、また、星状膠細胞における早期のニューロン機能不全およびα−シヌクレイン蓄積を開始し、これにより、PDの臨床的症状の原因となる限られた脳領域における特異的ニューロン集団の細胞死を引き起こすことにおいて役割を果たすことが近年には報告されている。最近の研究では、軸索を鞘で覆う乏突起膠細胞におけるa−シヌクレインの蓄積もまた、関連したニューロンの神経変性を誘導し得ることが示される。最後に、ミクログリア細胞がPDの早期段階において星状膠細胞による活性化を受け、その後、この活性化がドーパミン作動性ニューロンに対する毒性影響を及ぼすことが示されている。したがって、他の神経変性障害と類似して、PDの病理発生が病理学的な細胞・細胞相互作用によって媒介される。
間葉系幹細胞集団が、パーキンソン病を処置するための自己移植のために好適であるかどうかを立証するために、患者から分化させられた星状膠細胞がドーパミン作動性ニューロンと接触させられる(例えば、共培養される)場合がある。ドーパミン作動性ニューロンは初代ドーパミン作動性ニューロンまたはドーパミン作動性ニューロンの細胞株である場合がある。特定の実施形態によれば、ドーパミン作動性ニューロンが、星状膠細胞が分化させられた間葉系幹細胞集団から分化させられる。
好ましくは、ドーパミン作動性ニューロンに対する系譜特異的細胞の細胞毒性影響が分析される。
特定の実施形態によれば、CD34+細胞(すなわち、患者に由来する骨髄または全血から得られる造血始原体)から分化させられるミクログリア細胞が、間葉細胞由来の星状膠細胞性細胞の存在下または非存在下のどちらかでドーパミン作動性ニューロンと共培養される。細胞は、CD34+細胞の富化集団を含むように事前に選別される場合がある。
CD34+細胞または全骨髄をミクログリア表現型に分化させる様々な方法が当技術分野では知られており、これらには、例えば、培養培地(例えば、DMEM/10%FCS)において10〜15日間(例えば、11日間)にわたって培養することが含まれる。非接着性細胞がさらに、5〜10日(例えば、6日)の期間にわたって培養される。その後、細胞が吸引され、新しい培養ディッシュに移され、50%の星状膠細胞馴化培地(これは、培地(例えば、DMEM、約24時間)および20ng/mlのGM−CSFにおいて培養される初代ヒト星状膠細胞から調製される)が補充される培地(例えば、DMEM/10%FSC)において培養される。細胞はその後、ミクログリアマーカーおよびミクログリア細胞と類似する機能を発現する。
細胞毒性を分析する様々な方法が本明細書中上記で記載されている。
患者に由来する系譜特異的細胞が、対照の対象に由来する同一の系譜特異的細胞よりも大きい細胞毒性をドーパミン作動性ニューロンに対して有するならば、当該系譜特異的細胞が由来するMSC集団は、PDを処置するための自己細胞移植のために適していないと見なされる場合がある。
1つの実施形態によれば、自己MSC集団が、対照のMSC集団よりも10%を超えて細胞毒性であるならば、患者細胞集団は、PDを処置するための自己細胞移植のために適していないと見なされる。
1つの実施形態によれば、自己MSC集団が、対照のMSC集団よりも20%を超えて細胞毒性であるならば、患者細胞集団は、PDを処置するための自己細胞移植のために適していないと見なされる。
1つの実施形態によれば、自己MSC集団が、対照のMSC集団よりも30%を超えて細胞毒性であるならば、患者細胞集団は、PDを処置するための自己細胞移植のために適していないと見なされる。
1つの実施形態によれば、自己MSC集団が、対照のMSC集団よりも40%を超えて細胞毒性であるならば、患者細胞集団は、PDを処置するための自己細胞移植のために適していないと見なされる。
1つの実施形態によれば、自己MSC集団が、対照のMSC集団よりも50%を超えて細胞毒性であるならば、患者細胞集団は、PDを処置するための自己細胞移植のために適していないと見なされる。
対照のMSC集団は典型的には、パーキンソン病を有しない対象に由来し、好ましくは健常者対象に由来する。MSC集団の年齢一致および性別一致もまた意図される。
細胞死に加えて、ドーパミン作動性ニューロンは、患者のMSC集団から分化させられる系譜特異的細胞との共培養の後で、酸化ストレスに対する感受性、プロテアソーム阻害、不溶解性アルファ−シヌクレインタンパク質の外観、ミトコンドリアの機能およびERのストレス応答について調べられる場合がある。
本明細書中上記で記載される共培養アッセイと同様に、本発明ではさらに、対象に起源を有するMSCの遺伝子異常について分析することが意図される。遺伝子異常が検出されるならば、そのMSC集団は細胞治療のための供給源として選択されない。したがって、例えば、本発明では、アルファ−シヌクレイン遺伝子における変異(例えば、アラニン30からプロリンへの変異(A30P)、およびアラニン53からトレオニンへの変異(A53T))の存在、または正常なa−シヌクレインの増大した合成について分析することが意図される。家族性PDについての以下のさらなる遺伝子が今日までに特定されている:常染色体劣性パーキンソン症候群の家族性型でのパーキン(PARK2)、DJ−1(PARK7)またはPINK1(PARK6)における変異、ならびに、常染色体優性パーキンソン症候群の家族性型でのUCH−L1(PARK5)およびLRRK2/ダルダリン(dardarin)(PARK8)における変異またはα−シヌクレイン(PARK4)のゲノム三重化。
遺伝子異常を分析するための方法が本明細書中上記で記載されている。
アルツハイマー病:
アルツハイマー病(AD)は一般的な慢性神経変性疾患であり、認知症の最も一般的な原因である。この疾患の2つの際立った特徴が、老人斑(これは主に、アミロイドβの細胞外沈着から構成される)および神経原線維変化(これは、異常にリン酸化されたタウタンパク質の細胞間凝集物からなる)である。老人斑の存在はまた、ADにおける顕著な初期の役割を果たすと考えられる炎症性応答に関連する。
アルツハイマー病(AD)は一般的な慢性神経変性疾患であり、認知症の最も一般的な原因である。この疾患の2つの際立った特徴が、老人斑(これは主に、アミロイドβの細胞外沈着から構成される)および神経原線維変化(これは、異常にリン酸化されたタウタンパク質の細胞間凝集物からなる)である。老人斑の存在はまた、ADにおける顕著な初期の役割を果たすと考えられる炎症性応答に関連する。
ADの両方のタイプにおいて、様々な細胞タイプ(例えば、星状膠細胞、ニューロンおよびミクログリアなど)がこの疾患の病理発生に関係づけられている。
間葉系幹細胞集団が、ADを処置するための自己移植のために好適であるかどうかを立証するために、患者から分化させられた星状膠細胞がニューロン細胞と接触させられる(例えば、共培養される)場合がある。ニューロンは初代ニューロンまたはニューロンの細胞株である場合がある。特定の実施形態によれば、ニューロンが、星状膠細胞が分化させられた間葉系幹細胞集団から分化させられる。
好ましくは、ニューロンに対する系譜特異的細胞の細胞毒性影響が分析される。
特定の実施形態によれば、患者に由来するCD34+細胞から分化させられるミクログリア細胞が、間葉細胞由来の星状膠細胞性細胞の存在下または非存在下のどちらかでニューロンと共培養される。
CD34+細胞を分化する方法が本明細書中上記で記載されている。
細胞毒性を分析する様々な方法が本明細書中上記で記載されている。
細胞死に加えて、ニューロンは、患者のMSC集団から分化させられる系譜特異的細胞との共培養の後で、酸化ストレスに対する感受性、プロテアソーム阻害、ミトコンドリアの機能およびERのストレス応答について調べられる場合がある。
患者に由来する系譜特異的細胞が、対照の対象に由来する同一の系譜特異的細胞よりも大きい細胞毒性をニューロンに対して有するならば、当該系譜特異的細胞が由来するMSC集団は、ADを処置するための自己細胞移植のために適していないと見なされる場合がある。
1つの実施形態によれば、自己MSC集団が、対照のMSC集団よりも10%を超えて細胞毒性であるならば、患者細胞集団は、ADを処置するための自己細胞移植のために適していないと見なされる。
1つの実施形態によれば、自己MSC集団が、対照のMSC集団よりも20%を超えて細胞毒性であるならば、患者細胞集団は、ADを処置するための自己細胞移植のために適していないと見なされる。
1つの実施形態によれば、自己MSC集団が、対照のMSC集団よりも30%を超えて細胞毒性であるならば、患者細胞集団は、ADを処置するための自己細胞移植のために適していないと見なされる。
1つの実施形態によれば、自己MSC集団が、対照のMSC集団よりも40%を超えて細胞毒性であるならば、患者細胞集団は、ADを処置するための自己細胞移植のために適していないと見なされる。
1つの実施形態によれば、自己MSC集団が、対照のMSC集団よりも50%を超えて細胞毒性であるならば、患者細胞集団は、ADを処置するための自己細胞移植のために適していないと見なされる。
対照のMSC集団は典型的には、アルツハイマー病を有しない対象に由来し、好ましくは健常者対象に由来する。MSC集団の年齢一致および性別一致もまた意図される。
本明細書中上記で記載される共培養アッセイと同様に、本発明ではさらに、対象に起源を有するMSCの遺伝子異常について分析することが意図される。遺伝子異常が検出されるならば、そのMSC集団は細胞治療のための供給源として選択されない。したがって、例えば、本発明では、変異の存在について分析することが意図される。
アルツハイマー病の症例の大多数が散発性であり、しかしながら、APP(これはアミロイド−β前駆体タンパク質をコードする)の変異または重複化、あるいは、プレセニリン遺伝子(これは、APPをアミロイド−βに切断するタンパク質分解酵素をコードする)における変異を有するアルツハイマー病の優性遺伝性家族性型の希な症例が存在する。
遺伝子異常を分析するための方法が本明細書中上記で記載されている。
レット症候群−図4を参照のこと
レット症候群(RTT)は、メチルcpG結合タンパク質2(MsCP2)の機能の喪失によって引き起こされるX染色体連鎖の自閉症スペクトラム障害である。より初期の研究では、この疾患はニューロンにおけるMeCP2機能の喪失に起因すると結論されたにもかかわらず、近年の研究では、グリア細胞におけるMeCP2の喪失が負の影響を細胞非自律的様式でニューロンに及ぼすことが明瞭に明らかにされた。そのうえ、MeCP2完全欠損マウスでの星状膠細胞におけるMeCP2の再発現は、ヌルマウスと比較して、運動レベルおよび不安レベルを著しく改善し、呼吸の異常を正常なパターンにまで回復させ、かつ、寿命を大きく延ばした。加えて、変異型星状膠細胞に対するMeCP2の修復は、インビボにおける変異型ニューロンに対する細胞非自律的な陽性の影響を及ぼし、これにより、正常な樹状突起形態学を回復させ、また、興奮性グルタミン酸輸送体のレベルを増大させた。したがって、グリア細胞が、ニューロンと類似して、RTTの神経病理学の不可欠な構成要素であり、また、この疾患の随伴症状を改善するための1つの方策としての、正常なMeCP2レベルを有するグリア細胞を投与するという考えを裏づけているようである。
レット症候群(RTT)は、メチルcpG結合タンパク質2(MsCP2)の機能の喪失によって引き起こされるX染色体連鎖の自閉症スペクトラム障害である。より初期の研究では、この疾患はニューロンにおけるMeCP2機能の喪失に起因すると結論されたにもかかわらず、近年の研究では、グリア細胞におけるMeCP2の喪失が負の影響を細胞非自律的様式でニューロンに及ぼすことが明瞭に明らかにされた。そのうえ、MeCP2完全欠損マウスでの星状膠細胞におけるMeCP2の再発現は、ヌルマウスと比較して、運動レベルおよび不安レベルを著しく改善し、呼吸の異常を正常なパターンにまで回復させ、かつ、寿命を大きく延ばした。加えて、変異型星状膠細胞に対するMeCP2の修復は、インビボにおける変異型ニューロンに対する細胞非自律的な陽性の影響を及ぼし、これにより、正常な樹状突起形態学を回復させ、また、興奮性グルタミン酸輸送体のレベルを増大させた。したがって、グリア細胞が、ニューロンと類似して、RTTの神経病理学の不可欠な構成要素であり、また、この疾患の随伴症状を改善するための1つの方策としての、正常なMeCP2レベルを有するグリア細胞を投与するという考えを裏づけているようである。
星状膠細胞に加えて、ミクログリア細胞もまた、神経毒性である高レベルのグルタミン酸を分泌することによってこの疾患の病理発生に関係づけられている。
間葉系幹細胞集団が、レット症候群を処置するための自己移植のために好適であるかどうかを立証するために、患者から分化させられた星状膠細胞がニューロンと接触させられる(例えば、共培養される)場合がある。ニューロンは初代ニューロンまたはニューロンの細胞株である場合がある。特定の実施形態によれば、ニューロンが、星状膠細胞が分化させられた間葉系幹細胞集団から分化させられる。
好ましくは、ニューロンに対する系譜特異的細胞の細胞毒性影響が分析される。
特定の実施形態によれば、患者に由来するCD34+細胞から分化させられるミクログリア細胞が、間葉細胞由来の星状膠細胞性細胞の存在下または非存在下のどちらかでニューロンと共培養される。
CD34+細胞をミクログリア表現型に分化させる様々な方法が当技術分野では知られており、本明細書中上記で記載されている。
細胞毒性を分析する方法が本明細書中上記で記載されている。
細胞死に加えて、ニューロンは、患者のMSC集団から分化させられる系譜特異的細胞との共培養の後で、酸化ストレスに対する感受性、プロテアソーム阻害、ミトコンドリアの機能およびERのストレス応答について調べられる場合がある。
患者に由来する系譜特異的細胞が、対照の対象に由来する同一の系譜特異的細胞よりも大きい細胞毒性をニューロンに対して有するならば、当該系譜特異的細胞が由来するMSC集団は、レット症候群を処置するための自己細胞移植のために適していないと見なされる場合がある。
1つの実施形態によれば、自己MSC集団が、対照のMSC集団よりも10%を超えて細胞毒性であるならば、患者細胞集団は、レット症候群を処置するための自己細胞移植のために適していないと見なされる。
1つの実施形態によれば、自己MSC集団が、対照のMSC集団よりも20%を超えて細胞毒性であるならば、患者細胞集団は、レット症候群を処置するための自己細胞移植のために適していないと見なされる。
1つの実施形態によれば、自己MSC集団が、対照のMSC集団よりも30%を超えて細胞毒性であるならば、患者細胞集団は、レット症候群を処置するための自己細胞移植のために適していないと見なされる。
1つの実施形態によれば、自己MSC集団が、対照のMSC集団よりも40%を超えて細胞毒性であるならば、患者細胞集団は、レット症候群を処置するための自己細胞移植のために適していないと見なされる。
1つの実施形態によれば、自己MSC集団が、対照のMSC集団よりも50%を超えて細胞毒性であるならば、患者細胞集団は、レット症候群を処置するための自己細胞移植のために適していないと見なされる。
対照のMSC集団は典型的には、レット症候群を有しない対象に由来し、好ましくは健常者対象に由来する。MSC集団の年齢一致および性別一致もまた意図される。
本発明ではさらに、遺伝子改変されたMSC集団を分化させることが、そのような細胞集団が自己細胞治療のために有益であるかどうかを明らかにするために意図される。したがって、例えば、ALSについては、細胞が、IGF−1、VEGF、GDNFおよび/またはSOD1のsiRNAを発現するように遺伝子改変される場合がある。パーキンソン病については、細胞が、VEGFおよびGDNFを発現するように遺伝子改変される場合がある。レット症候群については、細胞が、IGF−1および/またはBDNFを発現するように遺伝子改変される場合がある。MSCを遺伝子改変する様々な方法が本明細書中上記に提供される。
患者のMSCから作製される系譜特異的細胞の、別の細胞タイプに対する影響を分析することと同様に、他のパラメーターもまた、MSC集団を分類および/または認定するために分析される場合があることが理解されるであろう。
本発明の別の局面によれば、間葉系幹細胞(MSC)集団を認定する方法であって、前記MSCの前記集団から分化させられる系譜特異的細胞の機能および/または形態学を分析することを含み、ただし、対照の系譜特異的細胞と比較される前記系譜特異的細胞の前記機能または形態学における変化により、前記MSCが認定されることが示される、方法が提供される。
分化した細胞タイプが比較されることがある対照の系譜特異的細胞には、星状膠細胞、運動ニューロン、乏突起膠細胞およびドーパミン作動性ニューロンが含まれるが、これらに限定されない。対照細胞は、細胞株または初代細胞から得られる培養細胞または非培養細胞である場合がある。対照細胞は、本明細書中上記で記載されるように、健常者対象のMSC集団からエクスビボで分化させられる場合がある。そのような対照系譜特異的細胞の機能および/または形態学の知識が実際の測定から集められる場合があり、あるいは、これらの細胞に関連する文献から得られる場合がある。
1つの実施形態によれば、細胞は、対象における脳疾患の自己細胞治療のために好適であるかを調べるために認定される。
機能または形態学の変化の程度が典型的には、好ましくは量的レベルで実施者によって求められ、ただし、この場合、対照の系譜特異的細胞と比較して、測定されているパラメーターのどちらかの方向で10%を超える変化、どちらかの方向で20%を超える変化、どちらかの方向で30%を超える変化、どちらかの方向で40%を超える変化、どちらかの方向で50%を超える変化は、当該MSC細胞集団が自己細胞移植のために推奨されないことを示すものである。
細胞形態学が、顕微鏡技術(例えば、走査型電子顕微鏡法)を使用して分析される場合がある。抗体または色素が、分析を助けるための識別特徴を強調するために使用される場合がある。
分析され得る例示的な細胞機能には、例えば、特定のタンパク質または特定の一組のタンパク質の発現(発現の相対的量を含む)、特定のmiRNAまたは特定の一組のmiRNAの発現、特定の因子(例えば、神経栄養因子)の分泌、特定の因子(例えば、神経栄養因子)に応答する能力、および(本明細書中上記で記載されるように)別の細胞タイプに影響を与える能力が含まれる。
特定の実施形態によれば、細胞機能がRNAレベルまたはタンパク質レベルで分析される。
RNAの発現レベルを検出する方法
本発明のいくつかの実施形態の細胞におけるRNAの発現レベルを、当技術分野において公知の方法を使用して求めることができる。
本発明のいくつかの実施形態の細胞におけるRNAの発現レベルを、当技術分野において公知の方法を使用して求めることができる。
ノーザンブロット分析:この方法は、RNAの混合物における特定のRNAの検出を伴う。塩基対の間の水素結合を妨げてRNA分子のすべてが折り畳まれていない線状の立体配座を有することを保証する薬剤(例えば、ホルムアルデヒド)による処理によって、RNAサンプルを変性させる。個々のRNA分子をその後、ゲル電気泳動によってサイズに従って分離し、変性したRNAが付着するニトロセルロース膜またはナイロン系膜に移す。その後、膜を標識されたDNAプローブにさらす。プローブを、放射性同位体または酵素連結ヌクレオチドを使用して標識される場合がある。検出では、オートラジオグラフィー、比色反応または化学発光を使用される場合がある。この方法は、特定のRNA分子の量の定量化と、電気泳動期間中のゲルにおける移動距離を示す膜上の相対的位置によるその正体の決定との両方を可能にする。
RT−PCR分析:この方法では、相対的に希なRNA分子のPCR増幅を使用する。最初に、RNA分子を細胞から精製し、逆転写酵素(例えば、MMLV−RTなど)およびプライマー(例えば、オリゴdT、ランダムヘキサマーまたは遺伝子特異的プライマーなど)を使用して相補的DNA(cDNA)に変換する。その後、遺伝子特異的プライマーおよびTaq DNAポリメラーゼを加えることによって、PCR増幅反応をPCR装置において行う。当業者は、特異的なRNA分子を検出するために好適である遺伝子特異的プライマーの長さおよび配列ならびにPCR条件(すなわち、アニーリング温度およびサイクル回数など)を選択することができる。半定量的RT−PCR反応を、PCRサイクルの回数を調節し、増幅産物を既知対照に対して比較することによって用い得ることが理解されるであろう。
RNAインサイチューハイブリダイゼーション染色:この方法では、DNAプローブまたはRNAプローブをが、細胞内に存在するRNA分子に結合させる。一般に、細胞を最初に、細胞構造を保つために、また、RNA分子が分解されないようにするために顕微鏡用スライドに固定処理し、その後、標識されたプローブを含有するハイブリダイゼーション緩衝液に供する。ハイブリダイゼーション緩衝液は、DNAプローブまたはRNAプローブを原位置においてそれらの標的mRNA分子と特異的にハイブリダイゼーションすることを可能にし、一方で、プローブが非特異的に結合することを回避する、ホルムアミドおよび各種塩(例えば、塩化ナトリウムおよびクエン酸ナトリウム)などの試薬を含む。当業者は、ハイブリダイゼーション条件(すなわち、温度、塩およびホルムアミドの濃度など)を特異的プローブおよび特異的タイプの細胞に対して調節することができる。ハイブリダイゼーション後、結合していないプローブをすべて洗い流し、結合したプローブを公知の方法を使用して検出する。例えば、放射能標識したプローブを使用するならば、スライドを、放射能標識されたプローブを使用して生じるシグナルを明らかにする写真乳剤に供する;プローブを酵素により標識した場合は、酵素特異的基質を比色反応の形成のために加える;プローブを、蛍光標識を使用して標識した場合は、結合したプローブを、蛍光顕微鏡を使用して明らかにする;プローブをタグ(例えば、ジゴキシゲニンおよびビオチンなど)を使用して標識した場合は、結合したプローブを公知の方法を使用して検出できるタグ特異的抗体との反応に従って検出することができる。
インサイチューRT−PCR染色:この方法が、Nuovo GJ他[Intracellular localization of polymerase chain reaction(PCR)−amplified hepatitis C cDNA、Am J Surg Pathol、1993、17:683〜90]およびKomminoth P他[Evaluation of methods for hepatitis C virus detection in archival liver biopsies.Comparison of histology,immunohistochemistry,in situ hybridization,reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT−PCR) and in situ RT−PCR、Pathol Res Pract、1994、190:1017〜25]に記載される。簡単に記載すると、RT−PCR反応が、標識されたヌクレオチドをPCR反応に取り込むことによって、固定処理された細胞に対して行われる。反応は、特異的なインサイチューRT−PCR装置を使用して行い、例えば、Arcturus Engineering(Mountainview、CA)から入手可能なレーザー・キャプチャー・マイクロダイセクションPixCell I LCMシステムなどを使用して行う。
DNAマイクロアレイ/DNAチップ:
数千個の遺伝子の発現が、DNAマイクロアレイを使用して同時に分析される場合があり、これにより、特異的な発達プロセスまたは生理学的応答の期間における生物の完全な転写プログラムの分析が可能になる。DNAマイクロアレイは、支持体(例えば、ガラス製の顕微鏡スライドなど)の表面の密に詰められた領域に結合する数千の個々の遺伝子配列からなる。様々な方法が、DNAマイクロアレイを調製するために開発されている。1つの方法では、分析のための各遺伝子のコード領域のおよそ1キロベースの部分を個々にPCR増幅する。ロボット装置を使用して、それぞれの増幅されたDNAサンプルを、ガラス製顕微鏡用スライドの表面の密に一定間隔で配置された区域に適用し、続いてサンプルを、DNA配列を支持体の表面に結合させ、変性させるために熱的および化学的な処理によって処理する。典型的には、そのようなアレイは約2×2cmであり、個々の核酸の約6000個のスポットを含有する。この技術の変形において、多数のDNAオリゴヌクレオチド(通常、長さにおいて20ヌクレオチド)を、支持体の表面に共有結合される最初のヌクレオチドから合成し、その結果、数万の同一オリゴヌクレオチドを支持体の表面の小さい正方形区域において合成する。単一の遺伝子からの多数のオリゴヌクレオチド配列を、その遺伝子の発現を分析するためにスライドの近接領域において合成する。したがって、数千の遺伝子を1枚のガラス製スライドの上に表すことができる。合成オリゴヌクレオチドのそのようなアレイは、上記で記載されるような「DNAマイクロアレイ」とは対照的に、当技術分野では「DNAチップ」と呼ばれることがある[Lodish他(編)、第7.8章:DNA Microarrays:Analyzing Genome−Wide Expression、Molecular Cell Biology、第4版、W.H.Freeman、New York(2000)]。
数千個の遺伝子の発現が、DNAマイクロアレイを使用して同時に分析される場合があり、これにより、特異的な発達プロセスまたは生理学的応答の期間における生物の完全な転写プログラムの分析が可能になる。DNAマイクロアレイは、支持体(例えば、ガラス製の顕微鏡スライドなど)の表面の密に詰められた領域に結合する数千の個々の遺伝子配列からなる。様々な方法が、DNAマイクロアレイを調製するために開発されている。1つの方法では、分析のための各遺伝子のコード領域のおよそ1キロベースの部分を個々にPCR増幅する。ロボット装置を使用して、それぞれの増幅されたDNAサンプルを、ガラス製顕微鏡用スライドの表面の密に一定間隔で配置された区域に適用し、続いてサンプルを、DNA配列を支持体の表面に結合させ、変性させるために熱的および化学的な処理によって処理する。典型的には、そのようなアレイは約2×2cmであり、個々の核酸の約6000個のスポットを含有する。この技術の変形において、多数のDNAオリゴヌクレオチド(通常、長さにおいて20ヌクレオチド)を、支持体の表面に共有結合される最初のヌクレオチドから合成し、その結果、数万の同一オリゴヌクレオチドを支持体の表面の小さい正方形区域において合成する。単一の遺伝子からの多数のオリゴヌクレオチド配列を、その遺伝子の発現を分析するためにスライドの近接領域において合成する。したがって、数千の遺伝子を1枚のガラス製スライドの上に表すことができる。合成オリゴヌクレオチドのそのようなアレイは、上記で記載されるような「DNAマイクロアレイ」とは対照的に、当技術分野では「DNAチップ」と呼ばれることがある[Lodish他(編)、第7.8章:DNA Microarrays:Analyzing Genome−Wide Expression、Molecular Cell Biology、第4版、W.H.Freeman、New York(2000)]。
オリゴヌクレオチドマイクロアレイ−この方法では、本発明のいくつかの実施形態のポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイゼーションすることができるオリゴヌクレオチドプローブを固体表面(例えば、ガラス製ウエハー)に結合させる。それぞれのオリゴヌクレオチドプローブが長さにおいておよそ20〜25個の核酸からなる。特定の細胞サンプル(例えば、血液細胞)における本発明のいくつかの実施形態のポリヌクレオチドの発現パターンを検出するために、RNAを、当技術分野で公知の方法(例えば、TRIZOL溶液(Gibco BRL、米国))を使用して細胞サンプルから抽出する。ハイブリダイゼーションを、標識されたオリゴヌクレオチドプローブ(例えば、5’−ビオチン化プローブ)または相補的なDNA(cDNA)もしくはRNA(cRNA)の標識された断片のどちらかを使用して行うことができる。簡単に記載すると、二本鎖cDNAを、逆転写酵素(RT)(例えば、SuperscriptII RT)、DNAリガーゼおよびDNAポリメラーゼIをすべて製造者の説明書(Invitrogen Life Technologies、Frederick、MD、米国)に従って使用してRNAから調製する。標識されたcRNAを調製するために、二本鎖cDNAを、例えば、BioArray High Yield RNA Transcript Labelling Kit(Enzo,Diagnostics、Affymetrix、Santa Clara、CA)を使用するビオチン化ヌクレオチドの存在下でのインビトロ転写反応に供する。効率的なハイブリダイゼーションのために、標識されたcRNAは、RNAを94℃で35分間、40mMのTris酢酸塩(pH8.1)、100mM酢酸カリウムおよび30mM酢酸マグネシウムにおいてインキュベーションすることによって断片化することができる。ハイブリダイゼーション後、マイクロアレイを洗浄し、ハイブリダイゼーションシグナルを、プローブアレイに結合する標識されたcRNAによって放射される蛍光強度を測定する共焦点レーザー蛍光スキャナーを使用して走査する。
例えば、Affymetrixマイクロアレイ(Affymetrix(登録商標)、Santa Clara、CA)では、アレイ上のそれぞれの遺伝子が一連の異なるオリゴヌクレオチドプローブによって表され、ただし、この場合、これらのオリゴヌクレオチドプローブの各プローブ対が、完全一致のオリゴヌクレオチドと、ミスマッチのオリゴヌクレオチドとからなる。完全一致のプローブは、特定の遺伝子に対して正確に相補的である配列を有しており、したがって、当該特定の遺伝子の発現レベルの測定を可能にするが、ミスマッチのプローブは中央塩基位置における一塩基置換によって完全一致のプローブと異なる。ハイブリダイゼーションシグナルを、Agilentスキャナーを使用して走査し、Microarray Suiteソフトウエアにより、ミスマッチのプローブから生じる非特異的シグナルを、完全一致のプローブから生じるシグナルから引く。
タンパク質の発現および/または活性を検出する方法
本発明のいくつかの実施形態の培養物の細胞において発現されるタンパク質の発現レベルおよび/または活性レベルを、当技術分野において公知の方法を使用して求めることができる。
本発明のいくつかの実施形態の培養物の細胞において発現されるタンパク質の発現レベルおよび/または活性レベルを、当技術分野において公知の方法を使用して求めることができる。
酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA):この方法は、タンパク質基質を含有するサンプル(例えば、固定処理された細胞またはタンパク質性溶液)を表面(例えば、マイクロタイタープレートのウエルなど)に固定処理することを伴う。酵素にカップリングされた基質特異的抗体を適用し、基質に結合させる。抗体の存在をその後、抗体にカップリングされた酵素を用いる比色反応によって検出し、定量する。この方法において一般に用いられる酵素には、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼが含まれる。十分に校正され、かつ、応答の直線範囲の範囲内であるならば、サンプルに存在する基質の量は、生じる色の量に比例する。基質標準物が、定量精度を改善するために一般に用いられる。
ウエスタンブロット:この方法は、基質をアクリルアミドゲルによって他のタンパク質から分離し、続いて、基質を膜(例えば、ナイロンまたはPVDF)に転写することを伴う。その後、基質の存在を、基質に特異的な抗体によって検出し、今度は、この抗体を抗体結合試薬によって検出する。抗体結合試薬は、例えば、プロテインAまたは他の抗体である場合がある。抗体結合試薬は、本明細書中上記で記載されるように、放射能標識されるかまたは酵素に連結される場合がある。検出が、オートラジオグラフィー、比色反応または化学発光によって行われる場合がある。この方法は、基質の量の定量化と、電気泳動期間中のアクリルアミドゲルにおける移動距離を示す膜上の相対的位置によるその正体の決定との両方を可能にする。
放射免疫アッセイ(RIA):1つの形式において、この方法は、所望されるタンパク質(すなわち、基質)を、特異的な抗体と、沈殿可能な担体(例えば、アガロースビーズなど)に固定化される放射能標識された抗体結合タンパク質(例えば、I125により標識されるプロテインA)とともに沈殿させることを伴う。沈殿したペレットにおけるカウント数は基質の量に比例する。
RIAの代替形式において、標識された基質と、標識されていない抗体結合タンパク質とが用いられる。未知量の基質を含有するサンプルを様々な量で加える。標識された基質から得られる沈殿したカウント数における低下は添加サンプルにおける基質の量に比例する。
蛍光活性化細胞分取(FACS):この方法は、基質を基質特異的抗体によって細胞における原位置において検出することを伴う。基質特異的抗体を蛍光団に連結させる。検出は、細胞が光ビームを通過する際にそれぞれの細胞から放射される光の波長を読み取る細胞分取装置によって行う。この方法では、2つ以上の抗体が同時に用いてもよい。
免疫組織化学的分析:この方法は、基質を基質特異的抗体によって固定処理細胞における原位置において検出することを伴う。基質特異的抗体が酵素に連結される場合があり、または蛍光団に連結される場合がある。検出は、顕微鏡法および主観的評価または自動的評価によって行う。酵素連結された抗体を用いるならば、比色反応が要求される場合がある。免疫組織化学は多くの場合、続いて、細胞の核を、例えば、ヘマトキシリンまたはギムザ染色液を使用して対比染色することが理解されるであろう。
インサイチュー活性アッセイ:この方法によれば、発色性基質が、活性な酵素を含有する細胞に加えられ、当該酵素により、基質が分解されて、光学顕微鏡または蛍光顕微鏡によって視認される発色性生成物をもたらす反応が触媒される。
各種のインビトロ活性アッセイ:これらの方法では、特定の酵素の活性が、細胞から抽出されるタンパク質混合物において測定する。活性を、比色法を使用して分光光度計ウエルにおいて測定することができ、または非変性アクリルアミドゲル(すなわち、活性ゲル)において測定することができる。電気泳動後、ゲルを、基質および比色試薬を含有する溶液に浸す。生じた染色バンドが、目的とするタンパク質の酵素活性に対応する。十分に校正され、かつ、応答の直線範囲の範囲内であるならば、サンプルに存在する酵素の量は、生じる色の量に比例する。酵素標準物が、定量精度を改善するために一般に用いられる。
星状膠細胞性細胞に分化させた後で、下記の例示的パラメーターが分析される場合がある:
1.神経栄養因子の発現および/または分泌。
本明細書中で使用される場合、表現「神経栄養因子」は、ニューロンに対する成長、分化、機能維持および/または生存の影響を含む脳神経系に作用する細胞因子を示す。神経栄養因子の例には、下記のものが含まれるが、それらに限定されない:グリア由来神経栄養因子(GDNF)、GenBankアクセション番号L19063、同L15306;神経成長因子(NGF)、GenBankアクセション番号CAA37703;ニューロトロフィン−3(NT−3)、GenBankアクセション番号M37763;ニューロトロフィン−4/5;ニュールツリン(NTN)、GenBankアクセション番号NP_004549;ニューロトロフィン−4、GenBankアクセション番号M86528;パーセフィン、GenBankアクセション番号AAC39640;脳由来神経栄養因子(BDNF)、GenBankアクセション番号CAA42761;アルテミン(ART)、GenBankアクセション番号AAD13110;毛様体神経栄養因子(CNTF)、GenBankアクセション番号NP_000605;インスリン様増殖因子−I(IGF−1)、GenBankアクセション番号NP_000609;およびニューブラスチン(Neublastin)、GenBankアクセション番号AAD21075。
2.IL−1betaおよびカベルゴリンを加えた後における神経栄養因子の発現および/または分泌の増強。
3.グルタミン酸輸送体の活性。そのようなグルタミン酸輸送体の活性が、細胞の培養培地からの標識アスパラギン酸(例えば、[3H]−d−アスパラギン酸)の取り込みを測定することによって分析される場合がある。
4.星状膠細胞の構造的表現型、これには、丸い核、「星型形状」体、およびCNSの小さい血管における脈管足板として終わる多くの長い突起の存在が含まれる。構造的な星状膠細胞表現型のさらなる例が下記の資料に見出される場合がある:ReynoldsおよびWeiss、Science(1992)、255:1707〜1710;Reynolds,TetzlaffおよびWeiss、J.Neurosci(1992)、12:4565〜4574;ならびに、Kandel他、Principles of Neuroscience、第3版(1991)、Appleton&Lange、Norwalk、Conn。
5.星状膠細胞マーカーの発現。
1.神経栄養因子の発現および/または分泌。
本明細書中で使用される場合、表現「神経栄養因子」は、ニューロンに対する成長、分化、機能維持および/または生存の影響を含む脳神経系に作用する細胞因子を示す。神経栄養因子の例には、下記のものが含まれるが、それらに限定されない:グリア由来神経栄養因子(GDNF)、GenBankアクセション番号L19063、同L15306;神経成長因子(NGF)、GenBankアクセション番号CAA37703;ニューロトロフィン−3(NT−3)、GenBankアクセション番号M37763;ニューロトロフィン−4/5;ニュールツリン(NTN)、GenBankアクセション番号NP_004549;ニューロトロフィン−4、GenBankアクセション番号M86528;パーセフィン、GenBankアクセション番号AAC39640;脳由来神経栄養因子(BDNF)、GenBankアクセション番号CAA42761;アルテミン(ART)、GenBankアクセション番号AAD13110;毛様体神経栄養因子(CNTF)、GenBankアクセション番号NP_000605;インスリン様増殖因子−I(IGF−1)、GenBankアクセション番号NP_000609;およびニューブラスチン(Neublastin)、GenBankアクセション番号AAD21075。
2.IL−1betaおよびカベルゴリンを加えた後における神経栄養因子の発現および/または分泌の増強。
3.グルタミン酸輸送体の活性。そのようなグルタミン酸輸送体の活性が、細胞の培養培地からの標識アスパラギン酸(例えば、[3H]−d−アスパラギン酸)の取り込みを測定することによって分析される場合がある。
4.星状膠細胞の構造的表現型、これには、丸い核、「星型形状」体、およびCNSの小さい血管における脈管足板として終わる多くの長い突起の存在が含まれる。構造的な星状膠細胞表現型のさらなる例が下記の資料に見出される場合がある:ReynoldsおよびWeiss、Science(1992)、255:1707〜1710;Reynolds,TetzlaffおよびWeiss、J.Neurosci(1992)、12:4565〜4574;ならびに、Kandel他、Principles of Neuroscience、第3版(1991)、Appleton&Lange、Norwalk、Conn。
5.星状膠細胞マーカーの発現。
本明細書中で使用される場合、表現「星状膠細胞マーカー」は、星状膠細胞において選択的または非選択的のどちらでも発現されるポリペプチドを示す。星状膠細胞マーカーが細胞表面または内部で発現される場合がある。星状膠細胞マーカーの例には、S100beta、グリア線維酸性タンパク質(GFAP)、グルタミンシンセターゼ、GLASTおよびGLT1が含まれる。
ニューロン細胞に分化させた後で、下記のパラメーターが分析される場合がある:
1.神経伝達物質の放出;
本発明の教示による神経伝達物質は、中枢神経系または末梢神経系のシナプス前ニューロンの軸索終末から興奮時に放出され、かつ、シナプス間隙を越えて伝わり、標的細胞の興奮または阻害のどちらかを生じさせる任意の物質であり得る。神経伝達物質は、例えば、ドーパミン、ノルエピネフリン、エピネフリン、ガンマアミノ酪酸、セロトニン、アセチルコリン、グリシン、ヒスタミン、バソプレシン、オキシトシン、タキキニン、コレシストキニン(CCK)、ニューロペプチドY(NPY)、ニューロテンシン、ソマトスタチン、オピオイドペプチド、プリン系化合物またはグルタミン酸であり得る。
2.ニューロンマーカーの発現
ニューロンマーカー、例えば、神経タンパク質(例えば、グリピカン−4(GPC4)、ネクジン(Necdin)、ネスチン、神経突起成長促進因子2(NEGF−2)、ニューロフィラメント−heavy、ニューロフィラメント−light、ニューロフィラメント−medium、ニューロン特異的エノラーゼ(NSE)、神経栄養性チロシンキナーゼ受容体2型(TRK−2)、ニューロン核(NeuN)、RETチロシンキナーゼまたはレチノイン酸受容体アルファ型(RARA)など)、および乏突起膠細胞タンパク質(例えば、2’,3’−環状ヌクレオチド3’−ホスホジエステラーゼ(CNPアーゼ)など)など。代替として、ニューロンマーカーは、ニューロン活性な転写因子、例えば、アリール炭化水素受容体/アリール炭化水素受容体核トランスロケーター結合エレメント(AhR/Amt)、エコトロピックウイルス組み込み部位1(EVI−1)、フォークヘッドボックスO1Aヒト(FKHRhu)、グリコサミノグリカン(GAG)、肝細胞核因子3.beta.(HNF−3.beta.)、ミエリン遺伝子発現因子2 MEF2(2)、核Yボックス因子(NF−Y)、神経ジンクフィンガー3(NZF−3)、ペアードボックス遺伝子3(Pax−3)、ペアードボックス遺伝子6(Pax−6)または生体異物応答エレメント(XRE)などであり得る。好ましくは、細胞が、パーキンソン病を処置するために要求されるならば、細胞はまた、ドーパミン作動性マーカー、例えば、ドーパミン作動性転写因子(例えば、アルデヒドデヒドロゲナーゼ1(Aldh1)、Engrailed1(En−1)、Nurr−1またはPaired様ホメオドメイン転写因子3(PITX−3)など)またはドーパミン作動性タンパク質(例えば、芳香族L−アミノ酸デカルボキシラーゼ(AADC)、カテコール−o−メチルトランスフェラーゼ(COMT)、ドーパミン輸送体(DAT)、ドーパミン受容体D2(DRD2)、GTPシクロヒドロラーゼ−1(GCH)、モノアミンオキシダーゼB(MAO−B)、トリプトファンヒドロキシラーゼ(TPH)、小胞モノアミン輸送体2(VMAT2)、Patchedホモログ(PTCH)、Smoothened(SMO)またはチロシンヒドロキシラーゼ(TH)など)を発現しなければならない。
2.細胞形態学(例えば、樹状突起を有すること)。
1.神経伝達物質の放出;
本発明の教示による神経伝達物質は、中枢神経系または末梢神経系のシナプス前ニューロンの軸索終末から興奮時に放出され、かつ、シナプス間隙を越えて伝わり、標的細胞の興奮または阻害のどちらかを生じさせる任意の物質であり得る。神経伝達物質は、例えば、ドーパミン、ノルエピネフリン、エピネフリン、ガンマアミノ酪酸、セロトニン、アセチルコリン、グリシン、ヒスタミン、バソプレシン、オキシトシン、タキキニン、コレシストキニン(CCK)、ニューロペプチドY(NPY)、ニューロテンシン、ソマトスタチン、オピオイドペプチド、プリン系化合物またはグルタミン酸であり得る。
2.ニューロンマーカーの発現
ニューロンマーカー、例えば、神経タンパク質(例えば、グリピカン−4(GPC4)、ネクジン(Necdin)、ネスチン、神経突起成長促進因子2(NEGF−2)、ニューロフィラメント−heavy、ニューロフィラメント−light、ニューロフィラメント−medium、ニューロン特異的エノラーゼ(NSE)、神経栄養性チロシンキナーゼ受容体2型(TRK−2)、ニューロン核(NeuN)、RETチロシンキナーゼまたはレチノイン酸受容体アルファ型(RARA)など)、および乏突起膠細胞タンパク質(例えば、2’,3’−環状ヌクレオチド3’−ホスホジエステラーゼ(CNPアーゼ)など)など。代替として、ニューロンマーカーは、ニューロン活性な転写因子、例えば、アリール炭化水素受容体/アリール炭化水素受容体核トランスロケーター結合エレメント(AhR/Amt)、エコトロピックウイルス組み込み部位1(EVI−1)、フォークヘッドボックスO1Aヒト(FKHRhu)、グリコサミノグリカン(GAG)、肝細胞核因子3.beta.(HNF−3.beta.)、ミエリン遺伝子発現因子2 MEF2(2)、核Yボックス因子(NF−Y)、神経ジンクフィンガー3(NZF−3)、ペアードボックス遺伝子3(Pax−3)、ペアードボックス遺伝子6(Pax−6)または生体異物応答エレメント(XRE)などであり得る。好ましくは、細胞が、パーキンソン病を処置するために要求されるならば、細胞はまた、ドーパミン作動性マーカー、例えば、ドーパミン作動性転写因子(例えば、アルデヒドデヒドロゲナーゼ1(Aldh1)、Engrailed1(En−1)、Nurr−1またはPaired様ホメオドメイン転写因子3(PITX−3)など)またはドーパミン作動性タンパク質(例えば、芳香族L−アミノ酸デカルボキシラーゼ(AADC)、カテコール−o−メチルトランスフェラーゼ(COMT)、ドーパミン輸送体(DAT)、ドーパミン受容体D2(DRD2)、GTPシクロヒドロラーゼ−1(GCH)、モノアミンオキシダーゼB(MAO−B)、トリプトファンヒドロキシラーゼ(TPH)、小胞モノアミン輸送体2(VMAT2)、Patchedホモログ(PTCH)、Smoothened(SMO)またはチロシンヒドロキシラーゼ(TH)など)を発現しなければならない。
2.細胞形態学(例えば、樹状突起を有すること)。
乏突起膠細胞に分化させた後で、下記のパラメーターが分析される場合がある:
1.乏突起膠細胞マーカーの発現:
GaABC2/ABCA2:ミエリン鞘ではなく、乏突起膠細胞についての特異的マーカー。特異的に乏突起膠細胞に突き止められつつあるリソソーム結合膜タンパク質として。乏突起膠細胞の細胞体においてのみ検出される。電子顕微鏡法によって、ほとんどがリソソームの周りに、一部がゴルジ装置において検出される。
アンホテリン(P30、HMG−1)およびRIP:発達中のラット脊髄における乏突起膠細胞の初期マーカー。
炭酸脱水酵素II(CAII):乏突起膠細胞に局在化する、乏突起膠細胞についてのマーカー。
CNPアーゼ:乏突起膠細胞についてのマーカー。
ガラクトセレブロシド:乏突起膠細胞についてのマーカー;培養中の乏突起膠細胞についての特異的な細胞表面抗原性マーカー。
微小管結合タンパク質4(MAP−4):アストログリアおよびオリゴデンドログリアについてのマーカー。
ミエリン−乏突起膠細胞糖タンパク質(MOG):乏突起膠細胞成熟化の表面マーカー。
NB3C4:乏突起膠細胞に特異的である新規なモノクローナル抗体。
ネスチン:乏突起膠細胞系譜細胞のマーカー。
Olig2:このオリゴデンドログリア系譜マーカーは神経始原体およびオリゴデンドログリアにおいて発現され、乏突起膠細胞の発達のために必須である。PMID:15198128。
POP66:腫瘍随伴性脳脊髄炎関連抗原であり、成体の乏突起膠細胞のマーカーである。
SulphI:これにより、乏突起膠細胞始原体細胞が特定される。
トランスフェリン結合タンパク質(TfBP):鳥類の乏突起膠細胞についてのマーカー。
トランスフェリン:ガラクトセレブロシドよりも早期に発現される乏突起膠細胞特異的マーカー。
2.ミエリンを産生する能力;および
3.細胞形態学(分岐および分枝した表現型ならびにミエリン膜の形成)。
1.乏突起膠細胞マーカーの発現:
GaABC2/ABCA2:ミエリン鞘ではなく、乏突起膠細胞についての特異的マーカー。特異的に乏突起膠細胞に突き止められつつあるリソソーム結合膜タンパク質として。乏突起膠細胞の細胞体においてのみ検出される。電子顕微鏡法によって、ほとんどがリソソームの周りに、一部がゴルジ装置において検出される。
アンホテリン(P30、HMG−1)およびRIP:発達中のラット脊髄における乏突起膠細胞の初期マーカー。
炭酸脱水酵素II(CAII):乏突起膠細胞に局在化する、乏突起膠細胞についてのマーカー。
CNPアーゼ:乏突起膠細胞についてのマーカー。
ガラクトセレブロシド:乏突起膠細胞についてのマーカー;培養中の乏突起膠細胞についての特異的な細胞表面抗原性マーカー。
微小管結合タンパク質4(MAP−4):アストログリアおよびオリゴデンドログリアについてのマーカー。
ミエリン−乏突起膠細胞糖タンパク質(MOG):乏突起膠細胞成熟化の表面マーカー。
NB3C4:乏突起膠細胞に特異的である新規なモノクローナル抗体。
ネスチン:乏突起膠細胞系譜細胞のマーカー。
Olig2:このオリゴデンドログリア系譜マーカーは神経始原体およびオリゴデンドログリアにおいて発現され、乏突起膠細胞の発達のために必須である。PMID:15198128。
POP66:腫瘍随伴性脳脊髄炎関連抗原であり、成体の乏突起膠細胞のマーカーである。
SulphI:これにより、乏突起膠細胞始原体細胞が特定される。
トランスフェリン結合タンパク質(TfBP):鳥類の乏突起膠細胞についてのマーカー。
トランスフェリン:ガラクトセレブロシドよりも早期に発現される乏突起膠細胞特異的マーカー。
2.ミエリンを産生する能力;および
3.細胞形態学(分岐および分枝した表現型ならびにミエリン膜の形成)。
本明細書中に記載される患者由来の分化細胞集団および非分化細胞集団は、脳障害の処置のために使用され得る作用因についてスクリーニングするために使用され得ることが理解されるであろう。
したがって、本発明のさらに別の局面によれば、脳疾患を処置するための作用因を選択する方法であって、脳障害の患者から単離されるMSCの集団が、前記脳障害に関連する系譜特異的細胞に向かって分化する能力を前記作用因の存在下および非存在下において分析することを含み、ただし、前記作用因の存在下におけるMSCの対照集団に由来する同一の系譜特異的細胞と比較して、前記系譜特異的細胞の機能または形態学の改善により、前記作用因が前記脳疾患の処置のために使用され得ることが示される、方法が提供される。
作用因はさらに、患者由来のMSCを系譜特異的細胞に分化させた後でスクリーニングされ得る。第2の系譜特異的細胞に対する上記系譜特異的細胞の影響が上記作用因の存在下および非存在下で分析され得る。例えば、ALS患者由来のMSCを星状膠細胞に分化し得る。この星状膠細胞を、推定される作用因の存在下および非存在下においてニューロン細胞(例えば、運動ニューロン)と共培養し得る。ニューロン細胞に対する星状膠細胞の細胞毒性を低下させる作用因が、ALSを処置するために好都合である場合がある。
スクリーニングされ得る例示的な作用因には、核酸、例えば、ポリヌクレオチド、リボザイム、siRNAおよびアンチセンス分子(限定されないが、RNA、DNA、RNA/DNAハイブリッド、ペプチド核酸、ならびに、変化させた骨格構造および/または塩基構造あるいは他の化学的修飾を有するポリヌクレオチドアナログを含む);タンパク質、ポリペプチド(例えば、ペプチド)、炭水化物、脂質および「小分子」薬物候補物が含まれる。「小分子」は、例えば、天然に存在する化合物(例えば、植物抽出物または微生物ブロスなどに由来する化合物)あるいは合成された有機化合物または有機金属化合物であって、分子量が約10000ダルトン未満であるもの、好ましくは約5000ダルトン未満であるもの、最も好ましくは約1500ダルトン未満であるものであり得る。
作用因が、患者MSCを分化させている期間中に培養培地に加えられる場合がある。作用因がポリペプチドまたはポリヌクレオチド(例えば、miRNA、またはmiRNAとハイブリダイゼーションし、その機能をダウンレギュレーションするポリヌクレオチド作用因)であるとき、患者MSCは、当該作用因を発現するように遺伝子改変される場合があることが理解されるであろう。細胞を遺伝子改変する様々な方法が本明細書中上記で記載される。
特定の細胞タイプについて分析され得る例示的な形態学、およびそのような分析を行う様々な方法が本明細書中上記で記載される。
分析され得る例示的な細胞機能には、例えば、特定のタンパク質または特定の一組のタンパク質の発現(発現の相対的量を含む)、特定のmiRNAまたは特定の一組のmiRNAの発現、特定の因子(例えば、神経栄養因子)の分泌、特定の因子(例えば、神経栄養因子)に応答する能力、および(本明細書中上記で記載されるように)別の細胞タイプに影響を与える能力が含まれる。
本発明者らは、患者に由来するMSC集団が、特定の疾患に関連する変異を含む場合があることを示している(実施例1(本明細書中下記)を参照のこと)。本発明では、これらの疾患に関連する変異を正常なMSC集団に導入すること(または遺伝子サイレンシングを行うこと)、およびこれらの変異させた集団を系譜特異的細胞に分化させることが意図される。そのような系譜特異的細胞は、疾患モデルとして、または新しい薬物についてスクリーニングするために、患者MSCに由来する系譜特異的細胞の代替または並行で使用することができる。
本明細書中に記載される患者間葉系幹細胞集団は個々に貯蔵される場合があり、またはバンクに含まれる場合があり、この場合、それぞれの集団が特定のパラメーターに従って分類される。
したがって、本発明のさらなる別の局面によれば、間葉系幹細胞(MSC)バンクを作製する方法であって、未分化間葉系幹細胞を、脳障害を有する複数の対象から採取して、複数の別個の細胞集団を得ること;前記間葉系幹細胞を系譜特異的細胞に向かって分化させること;前記未分化間葉系幹細胞および前記系譜特異的細胞を貯蔵し、それにより、間葉系幹細胞バンクを作製することを含む方法が提供される。
本発明のこの局面の間葉系幹細胞バンクは、脳障害の患者に由来する1つまたは複数のMSC集団(分化MSC集団および未分化MSC集団の両方)の物理的収集物である。そのようなバンクは好ましくは、それぞれのMSC集団の2つ以上のサンプル(すなわち、アリコート)を含有する。未分化間葉系幹細胞を採取することが本明細書中上記で記載される。MSC集団は、骨髄、脂肪組織、臍帯血および胎盤を含む様々な供給源に由来する場合がある。分化MSC集団が、本明細書中に記載される方法に従って作製される場合がある。上記バンクはまた、MSC集団を拡大および/または分化させるために使用されるヒトフィーダー細胞および/またはヒト血清の1つまたは複数のサンプルを含有する場合がある。
MSC集団は、幹細胞を生存したままで、かつ、機能を有したままで保つために(典型的には凍結によって)適切な条件のもとで貯蔵される。1つの実施形態によれば、MSC集団は、凍結保存された集団として貯蔵される。他の保存方法が、米国特許第5656498号、同第5004681号、同第5192553号、同第5955257号および同第6461645号に記載される。幹細胞のバンクを作製するための方法が、例えば、米国特許出願公開第2003/0215942号に記載される。
1つの実施形態によれば、バンクに貯蔵される未分化の細胞集団は、少なくとも1つの所定の特徴に従って特徴づけられる。
加えて、バンクに貯蔵される分化した細胞集団はまた、少なくとも1つの所定の特徴に従って特徴づけられる場合がある。
所定の特徴には、形態学的特徴、分化プロフィル、血液型、主要組織適合遺伝子複合体、ドナーの疾患状態、あるいは、疾患に関連または関連しない遺伝子型情報(例えば、遺伝子あるいはゲノムDNAまたはミトコンドリアDNAに関連する特異的な核酸配列の一塩基多型、すなわち、「SNP」)が含まれるが、これらに限定されない。
1つの具体的な実施形態によれば、分化細胞の所定の特徴は、(本明細書中上記で記載されるような)系譜特異的細胞の第2の集団に対する影響を含む。
カタログ作成は、それぞれの細胞集団について得られる特徴の集中記録、例えば、集められた文書記録、または情報が入力されるコンピューターデータベース(これらに限定されない)などを新たに作ることの一部となる場合がある。幹細胞バンクは、研究者または臨床医の要求のために好適である特定の間葉系幹細胞サンプルを複数のサンプルから選択することを容易にする。
1つの実施形態によれば、本明細書中に記載される間葉系幹細胞バンクは幹細胞データベースコンピューターユニットによって維持される。それぞれのコンピューターユニットが、情報を処理するためにそれぞれ、少なくとも1つの処理モジュールを含む。コンピューターユニットが、ディスプレーに通信接続される場合がある。間葉系幹細胞集団に関する情報がデータベースコンピューターに記憶される場合があり、この場合、情報は使用者にネットワーク接続によって伝えられる。そのようなシステムは、間葉系幹細胞集団を評価して、どれが進行中の研究および使用のために好適であるかを決定することができることを顧客に提供し、また、幹細胞を購入するという取引および適正な輸送を容易にするために役立つ場合もある。
当業者によって理解されるであろうように、本発明の様々な実施形態が、処理モジュール、および/または少なくとも1つのプログラムコードモジュールを含むコンピュータープログラム製造物を含むデバイスまたはシステムとして具体化される場合がある。したがって、本発明は、完全にハードウエアの実施形態の形態、またはソフトウエア側面およびハードウエア側面を組み合わせる実施形態の形態を取る場合がある。さらに、本発明は、コンピューター使用可能なプログラムコード手段が当該媒体において具体化されているコンピューター使用可能な記憶媒体におけるコンピュータープログラム製造物を含む場合がある。好適なコンピューター読み取り可能な媒体はどれも利用される場合があり、これには、ハードディスク、CD−ROM、DVD、光学的記憶デバイスまたは磁気記憶デバイスが含まれる。
用語「処理モジュール」は、単一の処理デバイスまたは複数の処理デバイスを含む場合がある。そのような処理デバイスは、マイクロプロセッサー、マイクロコントローラー、デジタルシグナルプロセッサー、マイクロコンピューター、中央処理ユニット、現場でプログラム可能なゲートアレイ、プログラム可能論理デバイス、ステートマシン、論理回路、アナログ回路、デジタル回路、および/またはシグナル(アナログおよび/またはデジタル)を操作命令に基づいて扱う任意のデバイスであり得る。処理モジュールは、メモリデバイスを、運用において処理モジュールにつながれて、または処理モジュールと一体化されて有する場合がある。メモリデバイスは、単一のメモリデバイスまたは複数のメモリデバイスである場合がある。そのようなメモリデバイスは、リード・オンリー・メモリ、ランダム・アクセス・メモリ、揮発性モメリ、不揮発性メモリ、スタティックメモリ、ダイナミックメモリ、フラッシュメモリ、および/またはデジタル情報を記憶する任意のデバイスであり得る。コンピューターは、本明細書中で使用される場合、少なくとも1つの処理モジュールおよび必要な場合には少なくとも1つのメモリデバイスを含むデバイスである。
コンピューター使用可能またはコンピューター読み取り可能な媒体は、例えば、電子的、磁気的、光学的、電磁的、赤外線または半導体のシステム、装置、デバイスまたは伝搬媒体であり得、またはそれらを含み得るが、これらに限定されない。コンピューター読み取り可能な媒体のより具体的な例(非網羅的リスト)には、下記のものが含まれるであろう:1つまたは複数のワイヤを有する電気的接続物、携帯可能なコンピューターディスケット、ランダム・アクセス・メモリ(RAM)、リード・オンリー・メモリ(ROM)、消去可能なプログラム可能リード・オンリー・メモリ(EPROMまたはフラッシュメモリ)、光ファイバー、および携帯可能なコンパクトディスク・リード・オンリー・メモリ(CD−ROM)、CD ROM、DVD(デジタルビデオディスク)あるいは他の電子的記憶媒体。コンピューター使用可能またはコンピューター読み取り可能な媒体は、プログラムが印刷される紙または別の好適な媒体でさえあり得ることには留意されたい。これは、プログラムは、例えば、紙または他の媒体の光学的走査により電子的に取り込むことができ、その後、必要ならば、好適な様式でコンパイルし、または解釈し、または他の場合には処理することができ、その後、コンピューターメモリに記憶することができるからである。
本発明のある特定の実施形態を実施するためのコンピュータープログラムコードは、Java(登録商標)、Smalltalk、Perl、Python、Ruby、Lisp、PHP、“C”、FORTRANまたはC++(これらに限定されない)を含めて、オブジェクト指向プログラミング言語および/または従来の手続き型プログラミング言語で書かれる場合がある。プログラムコードは、スタンドアロン型ソフトウエアパッケージとして、全体が使用者のコンピューターで、または一部が使用者のコンピューターで実行される場合があり、あるいは、一部が使用者のコンピューターで、かつ、一部がリモートコンピューターで実行される場合があり、あるいは、全体がリモートコンピューターで実行される場合がある。後者の状況では、リモートコンピューターがローカルエリアネットワーク(LAN)または広域ネットワーク(WAN)を介して使用者のコンピューターに接続される場合があり、あるいは、接続が、(例えば、インターネット・サービス・プロバイダーを使用してインターネットを介して)外部コンピューターに対してなされる場合がある。
本明細書中で使用される用語「約」は、±10%を示す。
用語「含む/備える(comprises、comprising、includes、including)」、「有する(having)」、およびそれらの同根語は、「含むが、それらに限定されない(including but not limited to)」ことを意味する。
用語「からなる(consisting of)」は、「含み、それらに限定される(including and limited to)」ことを意味する。
表現「から本質的になる(consisting essentially of)」は、さらなる成分、工程および/または部分が、主張される組成物、方法または構造の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合にだけ、組成物、方法または構造がさらなる成分、工程および/または部分を含み得ることを意味する。
本明細書中で使用される場合、単数形態(「a」、「an」および「the」)は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の参照物を包含する。例えば、用語「化合物(a compound)」または用語「少なくとも1つの化合物」は、その混合物を含めて、複数の化合物を包含し得る。
本開示を通して、本発明の様々な態様が範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は単に便宜上および簡潔化のためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈すべきでないことを理解しなければならない。従って、範囲の記載は、具体的に開示された可能なすべての部分範囲、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値を有すると見なさなければならない。例えば、1〜6などの範囲の記載は、具体的に開示された部分範囲(例えば、1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6など)、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値(例えば、1、2、3、4、5および6)を有すると見なさなければならない。このことは、範囲の広さにかかわらず、適用される。
数値範囲が本明細書中で示される場合には常に、示された範囲に含まれる任意の言及された数字(分数または整数)を含むことが意味される。第1の示された数字および第2の示された数字「の範囲である/の間の範囲」という表現、および、第1の示された数字「から」第2の示された数「まで及ぶ/までの範囲」という表現は、交換可能に使用され、第1の示された数字と、第2の示された数字と、その間のすべての分数および整数とを含むことが意味される。
本明細書中で使用される用語「方法(method)」は、所与の課題を達成するための様式、手段、技術および手順を示し、これには、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者に知られているそのような様式、手段、技術および手順、または、知られている様式、手段、技術および手順から、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者によって容易に開発されるそのような様式、手段、技術および手順が含まれるが、それらに限定されない。
明確にするため別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴が、単一の実施形態に組み合わせて提供されることもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで、あるいは本発明の他の記載される実施形態において好適なように提供することもできる。種々の実施形態の文脈において記載される特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なしに動作不能である場合を除いては、それらの実施形態の不可欠な特徴であると見なされるべきではない。
本明細書中に記載されるそれぞれのmiRNAについて、対応する配列(成熟型配列およびプレ配列)が、明細書の一部として見なされなければならない配列表において提供されることには留意される。
本明細書中上記に描かれるような、および、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。
本明細書で挙げた刊行物、特許および特許出願はすべて、個々の刊行物、特許および特許出願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。節の見出しが使用されている程度まで、それらは必ずしも限定であると解釈されるべきではない。
実施例1
筋萎縮性側索硬化症(ALS)
筋萎縮性側索硬化症(ALS)は、患者の上位および下位運動ニューロンを冒す原因不明の致死的な神経変性疾患である。合衆国ではおよそ5600人が毎年、ALSと診断される。ALSの発生率は100000人あたり2人であり、30000人もの多くのアメリカ人がある時点でこの疾患に罹り得ると推定されている。80%の患者が診断後5年以内に死亡し、この場合、通常、死亡は呼吸不全のためである。今日に至るまで、ALSのための効果的な治療法は何もなく、FDAによって現在承認されている唯一の薬物が、生存率を6ヶ月増大させるNMDA受容体アンタゴニスト(リルゾール)である。この疾患のための新しい薬物を見出し、また、依然として大部分が不明であるが、その原因および作用機構をよりよく理解しようと努めることは避けられない。
筋萎縮性側索硬化症(ALS)
筋萎縮性側索硬化症(ALS)は、患者の上位および下位運動ニューロンを冒す原因不明の致死的な神経変性疾患である。合衆国ではおよそ5600人が毎年、ALSと診断される。ALSの発生率は100000人あたり2人であり、30000人もの多くのアメリカ人がある時点でこの疾患に罹り得ると推定されている。80%の患者が診断後5年以内に死亡し、この場合、通常、死亡は呼吸不全のためである。今日に至るまで、ALSのための効果的な治療法は何もなく、FDAによって現在承認されている唯一の薬物が、生存率を6ヶ月増大させるNMDA受容体アンタゴニスト(リルゾール)である。この疾患のための新しい薬物を見出し、また、依然として大部分が不明であるが、その原因および作用機構をよりよく理解しようと努めることは避けられない。
ALSの病理発生に関与する3つの細胞タイプが、運動ニューロン、骨格筋細胞および星状膠細胞である。これらの細胞が、家族性ALS(fALS)および散発性ALS(sALS)の両方の病理発生に関与している。しかしながら、SOD1遺伝子における変異が、少なくともfALS患者の一部において役割を果たし得ることが知られているにもかかわらず、sALSにおいて、およびfALS患者の残りにおいて役割を果たす分子的機構が何であるかは現在、知られていない。SOD−マウスが、ALSを処置するための新規な取り組みを研究するための受け入れられ得る実験モデルを表すにもかかわらず、fALSに対するSOD−マウスの関連性は依然として疑問のままである。そのうえ、実験的動物モデルが、ALSの症例の大多数を表すsALSを研究するために何ら存在していない。最適な取り組みは、運動ニューロン変性の機構を、fALS患者およびsALS患者に由来する細胞を使用して調べることであると考えられる。しかしながら、関連性のある細胞タイプのすべてをこれらの患者から単離することは事実上不可能である。可能性のある解決策が、iPSを作製し、iPSを関連性のある細胞タイプに分化させることである。ALS由来のiPSを首尾よく作製し、それらを運動ニューロンに分化させることが可能となっているにもかかわらず、これらの技術のための様々な制限には、誤った遺伝子型特徴および表現型特徴を持ち込み得る胚性遺伝子の発現、ならびに、分化させたiPSは未だに臨床使用することができないので、これらの研究の結果を臨床にそのまま適用することができないことが挙げられる。
本発明者らは近年、骨髄および脂肪組織に由来する間葉系間質幹細胞(MSC)を星状膠細胞、骨格筋細胞および運動ニューロン始原体に分化させるための新規な取り組みを開発しており、ALS由来のMSCを下記の状況において用いることを提案する:
1.全ゲノム分析およびmiRNA分析。
全ゲノム分析およびmiRNA分析を、未分化のMSCと、運動ニューロン、星状膠細胞および骨格筋細胞に分化させられるMSCとの両方のマイクロアレイを使用して行って、これらの細胞における違いを、正常な個体に由来する類似した細胞と比較して特定する。これらの結果はその後、この疾患の病理発生において役割を果たし得る新規な機構を特定するために、同様にまた、新規な治療標的を特定するために使用することができる。そのうえ、分化MSCによる置換療法はALS患者のための最も合理的な治療的取り組みを表し得るので、これらの結果は、どの細胞タイプがALS患者の処置のために臨床使用されなければならないかを決定することにおいて臨床的意味合いを有する場合がある。実際、miRNAマイクロアレイ分析を使用する本発明者らの予備的研究では、特異的miRNAの発現におけるいくつかの変化が、ALS個体および正常な個体に由来するBM−MSCにおいて特定されている。
全ゲノム分析およびmiRNA分析を、未分化のMSCと、運動ニューロン、星状膠細胞および骨格筋細胞に分化させられるMSCとの両方のマイクロアレイを使用して行って、これらの細胞における違いを、正常な個体に由来する類似した細胞と比較して特定する。これらの結果はその後、この疾患の病理発生において役割を果たし得る新規な機構を特定するために、同様にまた、新規な治療標的を特定するために使用することができる。そのうえ、分化MSCによる置換療法はALS患者のための最も合理的な治療的取り組みを表し得るので、これらの結果は、どの細胞タイプがALS患者の処置のために臨床使用されなければならないかを決定することにおいて臨床的意味合いを有する場合がある。実際、miRNAマイクロアレイ分析を使用する本発明者らの予備的研究では、特異的miRNAの発現におけるいくつかの変化が、ALS個体および正常な個体に由来するBM−MSCにおいて特定されている。
2.星状膠細胞、骨格筋細胞および運動ニューロンへのMSCの分化。骨髄由来MSCおよび脂肪由来MSCの両方を正常者およびALS患者から得られるALSに関連性のある細胞のすべてに分化させるための新規な取り組みは、本発明者らに、この疾患のインビトロモデルを独自に作製することができることがもたらす。fALSおよびsALSの両方のこのモデルは、分子的機構(遺伝子アレイおよびmiRNAアレイ)、表現型変化および種々の機能的アッセイを明確化するために使用される場合がある。このモデルはまた、本発明者らがそれぞれの特異的な細胞タイプの役割を単独または組合せでこの疾患の病理発生において明確化することを可能にすることができる。加えて、このモデルは、運動ニューロンの生存を促進させること(mSOD1の影響を中和するか、または神経栄養性支持を提供すること)、骨格筋の萎縮を妨げること、または損なわれた星状膠細胞の機能を変化させることをALS患者においてもたらし得る小分子についてスクリーニングするためのハイスループット細胞型アッセイを開発するために使用することができる。
加えて、ALS由来のMSCは、特定のSOD変異体または他の関連変異体あるいはサイレンス変異SODまたは他の関連遺伝子を導入し、そのような種々の分化細胞の機能を分析することによって改変することができる。
したがって、MSCを、ALSの病理発生において役割を果たし得るすべての関連細胞タイプに分化できることは、患者自身のMSC、健康な家族の誰かのMSC、または処置のために臍帯もしくは胎盤に由来するMSCのいずれかを使用して、すべてのALS患者の関連性のある分子的異常および細胞異常を完全な個別化に基づいて特異的に特定するための実用的取り組みをもたらすことができ、また、最適な治療的取り組みのための手がかりをもたらすことができる。
3.ALS患者におけるMSCの臨床適用。
いくつかの研究により、患者由来のMSCを神経変性疾患(例えば、多発性硬化症およびALSなど)において使用することの安全性が明らかにされた。しかしながら、これらの細胞の治療効率は限定される。したがって、特異的細胞集団に取って代わることができるか、または、患者の細胞の異常な機能を改善し得る特異的な神経栄養因子を提供することができる分化MSCの使用が、より効率的な取り組みであり得る。インビトロモデルの研究は、疾患の病理発生と、必要としている患者の効率的処置のために使用され得る自己または同種の分化細胞によって達成され得る治療標的とに関する重要な情報を臨床医に提供することができる。実際、ALSの病理発生がよりよく理解された時点で考慮するべき非常に重要な点が、患者由来のMSCが治療的に使用されるべきか否か、あるいは、ALSの最適な処置が、正常なドナーから得られるMSC、しかもおそらくは、適応されるやいなや既製の治療用細胞として在庫から使用することができ、これにより患者自身または家族の誰かのMSCを分化させるために要求され得る時間の浪費を回避できる、非血縁者の胎盤または臍帯に由来するMSCの万能的集団から得られるMSCの使用に依存し得るかどうかである。近年の研究では、fALSおよびsALSの両方に由来する星状膠細胞が、運動ニューロンに対する神経毒性影響を及ぼし得ることが明らかにされた。このことは、分化MSCを含めて、患者に由来する細胞が、それらの治療的利益を損なう可能性がある表現型を示し得ることを示唆する。したがって、非改変MSCおよび分化MSCの機能を、正常な個体から得られる類似した細胞と比較して、疾患に関連性のある細胞の状況において分析することにより、患者を処置するための最適な細胞供給源に関して直接的な臨床的意味合いを有するであろう重要な情報がもたらされる場合がある。
いくつかの研究により、患者由来のMSCを神経変性疾患(例えば、多発性硬化症およびALSなど)において使用することの安全性が明らかにされた。しかしながら、これらの細胞の治療効率は限定される。したがって、特異的細胞集団に取って代わることができるか、または、患者の細胞の異常な機能を改善し得る特異的な神経栄養因子を提供することができる分化MSCの使用が、より効率的な取り組みであり得る。インビトロモデルの研究は、疾患の病理発生と、必要としている患者の効率的処置のために使用され得る自己または同種の分化細胞によって達成され得る治療標的とに関する重要な情報を臨床医に提供することができる。実際、ALSの病理発生がよりよく理解された時点で考慮するべき非常に重要な点が、患者由来のMSCが治療的に使用されるべきか否か、あるいは、ALSの最適な処置が、正常なドナーから得られるMSC、しかもおそらくは、適応されるやいなや既製の治療用細胞として在庫から使用することができ、これにより患者自身または家族の誰かのMSCを分化させるために要求され得る時間の浪費を回避できる、非血縁者の胎盤または臍帯に由来するMSCの万能的集団から得られるMSCの使用に依存し得るかどうかである。近年の研究では、fALSおよびsALSの両方に由来する星状膠細胞が、運動ニューロンに対する神経毒性影響を及ぼし得ることが明らかにされた。このことは、分化MSCを含めて、患者に由来する細胞が、それらの治療的利益を損なう可能性がある表現型を示し得ることを示唆する。したがって、非改変MSCおよび分化MSCの機能を、正常な個体から得られる類似した細胞と比較して、疾患に関連性のある細胞の状況において分析することにより、患者を処置するための最適な細胞供給源に関して直接的な臨床的意味合いを有するであろう重要な情報がもたらされる場合がある。
分化させた自己MSCがALS患者の処置に適さない可能性がある場合には、正常な家族の誰かから得られるMHC完全一致のMSCまたはハプロタイプ一致のMSCが、より良好な代替を表す場合がある。実際には、上記で示されるように、MSCの細胞表面におけるMHC(特にMHCクラスII)の低い発現を考慮すると、また、それらの拒絶を防止することができるそれらの免疫抑制性を考慮すると、胎盤および臍帯ワルトンゼリーから調製される分化MSCの使用により、ALS、同様にまた、他の神経変性障害を有する患者のための理想的な「在庫」処置がもたらされる場合がある。これに関連して、胎盤および臍帯に由来するMSCは、関連性のあるすべての細胞タイプに等しく申し分なく分化させることができることには言及しなければならない。
非血縁者の同種MSCの潜在的使用を、同系かつH−2同一のハプロタイプ一致ドナーまたはMHC完全不一致ドナーに由来する非改変MSCおよび分化MSCを使用して、同様にまた、ALS患者に由来するMSCによりマウスを処置することの治療的利益を胎盤または臍帯に由来する正常なMSCとの比較で比較することによって、fALSの動物モデルを現在表すSOD−マウスにおいて調べることができる。
4.ALSにおける送達ツールとしてのMSC。
MSCは、様々な因子を隣接細胞に送達することが示されている(例えば、増殖因子、ウイルス、siRNAおよびmiRNAなど)。重要な概念が、組織の神経支配が、神経支配された組織によって分泌されるシグナル伝達インプット(例えば、神経栄養因子など)に依存しているということである。したがって、本発明者らの仮説は、MSC由来の骨格筋細胞が、栄養性因子および関連性のあるsiRNAまたはmiRNAを、とりわけALSの早期段階において、すなわち、運動ニューロンが依然として機能的であるときにおいて、変性した運動ニューロンに送達するための最適な細胞であり得るということである。骨格筋に加えて、星状膠細胞が、神経栄養性の支援を提供すること、および神経毒性因子または過剰な興奮性神経伝達物質(例えば、グルタミン酸など)をニューロンの微小環境から除くことにおいて重要な役割を果たす別の細胞タイプである。したがって、本発明者らは、MSC由来の骨格筋細胞または星状膠細胞が、運動ニューロンの機能および生存のために重要である特異的な神経栄養因子(例えば、GDNF、VEGFおよびIGF−1など)を送達することができ、かつ、神経毒性因子を除くことができるかを分析するために本発明者らのALSインビトロモデルを使用することを提案する。
MSCは、様々な因子を隣接細胞に送達することが示されている(例えば、増殖因子、ウイルス、siRNAおよびmiRNAなど)。重要な概念が、組織の神経支配が、神経支配された組織によって分泌されるシグナル伝達インプット(例えば、神経栄養因子など)に依存しているということである。したがって、本発明者らの仮説は、MSC由来の骨格筋細胞が、栄養性因子および関連性のあるsiRNAまたはmiRNAを、とりわけALSの早期段階において、すなわち、運動ニューロンが依然として機能的であるときにおいて、変性した運動ニューロンに送達するための最適な細胞であり得るということである。骨格筋に加えて、星状膠細胞が、神経栄養性の支援を提供すること、および神経毒性因子または過剰な興奮性神経伝達物質(例えば、グルタミン酸など)をニューロンの微小環境から除くことにおいて重要な役割を果たす別の細胞タイプである。したがって、本発明者らは、MSC由来の骨格筋細胞または星状膠細胞が、運動ニューロンの機能および生存のために重要である特異的な神経栄養因子(例えば、GDNF、VEGFおよびIGF−1など)を送達することができ、かつ、神経毒性因子を除くことができるかを分析するために本発明者らのALSインビトロモデルを使用することを提案する。
加えて、近年の研究では、SOD1のサイレンシングがALS患者における治療的利益をもたらし得ることが示唆される。しかしながら、このタイプの治療に対する制限が送達様式である。近年、MSCはsiRNAおよび合成miRNA模倣体の両方を隣接細胞に効率的に送達することができることが明らかにされている。したがって、SOD1または関連性のある他のsiRNA、同様にまた、ALSの病理発生に関係づけられている関連性のあるmiRNA(例えば、筋形成においてもまた重要であるmiR−206およびmiR−1など)の両方の治療的可能性をスクリーニングするために本インビトロモデルを使用することが示唆される。特異的な神経栄養因子およびsiRNA/miRNAの組合せもまた、同様に試験される場合がある。
5.さらなる神経変性障害に対する類似したインビトロモデルの開発。
ALSについて提案されるものと類似したモデルを、さらなる神経変性障害についての病理発生および望ましい治療的取り組みを研究するために開発することができる。例えば、本発明者らはドーパミン作動性ニューロンをMSCから作製することができた。これらのニューロンは、パーキンソン病の病理発生の一因である新規な分子的機構を特定するために、また、薬物スクリーニングのための、または細胞に基づくパーキンソン病の最適な処置を設計するためのハイスループットシステムを提供するために用いられる場合がある。
ALSについて提案されるものと類似したモデルを、さらなる神経変性障害についての病理発生および望ましい治療的取り組みを研究するために開発することができる。例えば、本発明者らはドーパミン作動性ニューロンをMSCから作製することができた。これらのニューロンは、パーキンソン病の病理発生の一因である新規な分子的機構を特定するために、また、薬物スクリーニングのための、または細胞に基づくパーキンソン病の最適な処置を設計するためのハイスループットシステムを提供するために用いられる場合がある。
類似したインビトロモデルを、異なる不明の病理発生によってそれぞれが引き起こされる一群の障害をおそらくは表す自閉症スペクトラム障害(ASD)、レット症候群、アルツハイマー病、ハンチントン病、および原因が不明であり、かつ、用いることができる効果的な処置がないさらなる神経変性障害の病理発生を、疾患特異的な異常または患者特異的な欠如に注目して研究するために開発することができる。まとめると、所与の疾患の損傷した組織または異常な組織に似ている細胞を作製することが実行可能であることは、新しい薬物設計に向けた関連性のある疾患特異的モデルに基づいて、または最適な細胞処置に向けた道を開いて、不治であると現時点では見なされる多くの疾患のより良い診断および最適な処置のための新しい疾患特異的な取り組み、またはさらに個別化された取り組みをもたらす場合がある。
ALS患者に由来するMSCは、健常者対照に由来するMSCとは異なる遺伝子およびmiRNAを発現する:
ALS患者に由来するMSCが、健常者対照に由来するMSCと異なるかどうかを調べるために、本発明者らは、ALS患者から得られる7つのMSC培養物と、健常者対照から得られる7つのMSC培養物とを比較した。
ALS患者に由来するMSCが、健常者対照に由来するMSCと異なるかどうかを調べるために、本発明者らは、ALS患者から得られる7つのMSC培養物と、健常者対照から得られる7つのMSC培養物とを比較した。
最初に、これらのMSCから得られるDNAサンプルを、SOD1、およびさらなる遺伝子TARDBP(すなわち一部の散発性ALS患者において変異し、これらの患者の病理発生において役割を果たすことが報告されているタンパク質)における変異について調べた。
調べられた7つのMSCはどれも、SOD1の変異を有していなかった。対照的に、ALS患者の1名がTARDBP遺伝子における変異を有していた。
次に、遺伝子アレイおよびmiRNAアレイを、それらの遺伝子発現およびmiRNA発現における違いを特定するために、ALSおよび正常者対照から得られるMSCに対して行った。遺伝子アレイ(Agilent Array 4×44K)を使用した場合、ALS由来MSCおよび対照由来MSCにおいて示差的に発現した164個の遺伝子が特定された。
部分的なリストが下記に示される。
ダウンレギュレーションを受ける遺伝子
1.BMP6−運動ニューロンの生存において役割を果たす(−2.8)。
2.メラノコルチン2−脊髄において神経栄養効果を及ぼす(−3.5)。
3.MARKSL1−アクチン安定性およびニューロン遊走を決定する(−3.8)。
4.フィブリリン2−TGF−betaシグナル伝達および筋機能において役割を果たす(−4.3)。
5.COL5A3−筋萎縮において低下した(−4.4)。
6.DAP12−炎症を伴うことなく、死んだニューロンの除去のために要求され、ミエリン形成およびシナプス活性のために重要である(−5.2)。
1.BMP6−運動ニューロンの生存において役割を果たす(−2.8)。
2.メラノコルチン2−脊髄において神経栄養効果を及ぼす(−3.5)。
3.MARKSL1−アクチン安定性およびニューロン遊走を決定する(−3.8)。
4.フィブリリン2−TGF−betaシグナル伝達および筋機能において役割を果たす(−4.3)。
5.COL5A3−筋萎縮において低下した(−4.4)。
6.DAP12−炎症を伴うことなく、死んだニューロンの除去のために要求され、ミエリン形成およびシナプス活性のために重要である(−5.2)。
アップレギュレーションを受ける遺伝子
1.細胞質アルファアクチン(+2.9)
2.ヒトアルド−ケトレダクターゼ(+6.8)
3.DYNLT1ダイニン、軽鎖、Tctexタイプ1(+8.9)
1.細胞質アルファアクチン(+2.9)
2.ヒトアルド−ケトレダクターゼ(+6.8)
3.DYNLT1ダイニン、軽鎖、Tctexタイプ1(+8.9)
miRNA分析を使用した場合、これら2つの群のMSCにおいて示差的に発現した14個のmiRNAが特定された。この場合、それらのいくつかが脳筋に特異的であり、あるいは、ROSの生成またはBNDA受容体の機能不全に関連する。
miR−17−5p
miR−372
miR−373
miR−146b
miR−181a
miR−181d
miR−124a−脳特異的であり、ニューロン分化を誘導する
miR−128a−ROS生成を調節する
miR−128b−脳特異的である
miR−135b
miR−183
miR−219−NMDA受容体の機能不全に関連する
miR−133a−筋特異的である
miR−133b
miR−17−5p
miR−372
miR−373
miR−146b
miR−181a
miR−181d
miR−124a−脳特異的であり、ニューロン分化を誘導する
miR−128a−ROS生成を調節する
miR−128b−脳特異的である
miR−135b
miR−183
miR−219−NMDA受容体の機能不全に関連する
miR−133a−筋特異的である
miR−133b
まとめると、これらの結果はさらに、ALS患者に由来するMSCはそれらの遺伝子およびmiRNAの発現において異なること、また、これらの違いのいくつかがALSの病理発生に関連し得ることを明らかにする。
星状膠細胞に分化させられるALS由来MSCの馴化培地は運動ニューロンの細胞死を誘導する。
近年の研究では、星状膠細胞がALSの病理発生に関係づけられた。これらの研究は、ALS患者に由来する星状膠細胞を健常者個体に由来する運動ニューロンと共培養することにより、これらの細胞の細胞死が誘導されたことを明らかにした。類似した結果が、星状膠細胞に分化させられたALS由来MSCに由来する馴化培地に関して得られた(Diaz−Amarilla P.、Proc Natl Acad Sci USA、2011(Nov 1)、108(44):18126〜31、およびHaidet−Phillips AM.、Nat Biotechnol、2011(Aug 10)、29(9):824〜8)。
近年の研究では、星状膠細胞がALSの病理発生に関係づけられた。これらの研究は、ALS患者に由来する星状膠細胞を健常者個体に由来する運動ニューロンと共培養することにより、これらの細胞の細胞死が誘導されたことを明らかにした。類似した結果が、星状膠細胞に分化させられたALS由来MSCに由来する馴化培地に関して得られた(Diaz−Amarilla P.、Proc Natl Acad Sci USA、2011(Nov 1)、108(44):18126〜31、およびHaidet−Phillips AM.、Nat Biotechnol、2011(Aug 10)、29(9):824〜8)。
分化させたMSC由来の神経細胞がALSのためのインビトロモデルとして役立ち得ることを調べるために、ALS患者に由来する5つのMSC集団を星状膠細胞に分化させ、また、健常者対象に由来する5つのMSC集団を星状膠細胞に分化させた。培養された運動ニューロンの細胞死に対するそれらの馴化培地の影響を調べた。運動ニューロンを神経幹細胞から作製し、特異的マーカー(例えば、HB9、islet1およびChATなど)の発現によって特徴づけた。
図8A〜図8Bに例示されるように、健常者対照またはALS患者に由来する非改変MSCの馴化培地は運動ニューロン培養物の細胞死を及ぼさなかった。対照的に、星状膠細胞に分化させられたとき、5つのALS由来MSCのうちの3つが運動ニューロンの著しい細胞死を誘導し、これに対して、対照のMSCはどれも、有意な細胞死を誘導しなかった。これらの結果は、ALS由来星状膠細胞の神経毒性影響と類似して、星状膠細胞に分化したMSCは運動ニューロンの細胞死を誘導することができ、したがって、この障害における疾患機構を研究およびハイスループット薬物スクリーニングのための効率的なインビトロ系として用いることができることを示している。
これらの結果は、この疾患におけるMSCの治療的使用のための重要かつ即時的な意味合いもまた有しており、また、同種MSCがこれらの患者の処置のためのより良い選択であり得ることを示唆している。
MSC由来の星状膠細胞をALSにおけるインビトロモデルとして使用することの実現可能性をさらに調べるために、wt型SOD1または変異型SOD1(SOD1G93A)のどちらかを有する骨髄MSCを星状膠細胞様の細胞に分化させ、それらの影響を非改変MSCおよび運動ニューロンに分化させられるMSCの細胞毒性影響に関して調べた。
図9に示されるように、SOD1G93A変異体を発現するMSC由来の星状膠細胞様細胞は運動ニューロンの細胞死を誘導し、これに対して、非改変MSCは有意な影響を有していなかった。これらの結果は、SOD1G93A変異体を有するMSCに由来する星状膠細胞様の細胞は、ALS由来の星状膠細胞と類似する特徴を示すことを示しており、さらに、これらの細胞をこの疾患のためのインビトロモデルとして使用することの実現可能性を明らかにする。
実施例2
パーキンソン病
パーキンソン病(PD)は、強直、動作緩慢および静止時振戦によって特徴づけられる進行性の神経変性疾患である。この疾患の病理学的な際立った特徴が、中脳における黒質緻密部(SNc)でのドーパミン作動性ニューロンの選択的喪失である。PDの症例のほとんどが、未だに不明な原因および病理発生により散発的に発生する。可能性のある機構には、ミトコンドリア機能不全、酸化ストレス、小胞体ストレス、ユビキチン−プロテアソーム系の不全、いくつかの環境的要因、および遺伝的素因が含まれる。
パーキンソン病
パーキンソン病(PD)は、強直、動作緩慢および静止時振戦によって特徴づけられる進行性の神経変性疾患である。この疾患の病理学的な際立った特徴が、中脳における黒質緻密部(SNc)でのドーパミン作動性ニューロンの選択的喪失である。PDの症例のほとんどが、未だに不明な原因および病理発生により散発的に発生する。可能性のある機構には、ミトコンドリア機能不全、酸化ストレス、小胞体ストレス、ユビキチン−プロテアソーム系の不全、いくつかの環境的要因、および遺伝的素因が含まれる。
PDの散発性型に加えて、すべてのPD患者の約5%に認められる家族性型もまた存在する。PD症例のほとんどが散発性であるにもかかわらず、多数の遺伝的原因が知られており、これらには、アルファ−シヌクレイン遺伝子における優性変異、アラニン30のプロリンへの変異(A30P)およびアラニン53のトレオニンへの変異(A53T)、または正常なa−シヌクレインの増大した合成が含まれる。そのうえ、α−シヌクレインタンパク質が散発性PDにおけるレビー小体において特定された。このことは、PDの病理発生におけるこのタンパク質についての役割をさらに裏付けている。
家族性PDについてのさらなる遺伝子が今日までに特定されている:常染色体劣性パーキンソン症候群の家族性型でのパーキン(PARK2)、DJ−1(PARK7)またはPINK1(PARK6)における変異、ならびに、常染色体優性パーキンソン症候群の家族性型でのUCH−L1(PARK5)およびLRRK2/ダルダリン(PARK8)における変異またはα−シヌクレイン(PARK4)のゲノム三重化。
近年の研究では、上記遺伝子の遺伝子産物による機能の喪失または毒性機能の増加が家族性PDおよび散発性PDの両方の病理発生に関わっていることが示唆される。
加えて、星状膠細胞がその進行および早期のニューロン機能不全の開始において役割を果たし、星状膠細胞におけるα−シヌクレイン蓄積が、PDの臨床的症状の原因となる限られた脳領域における特異的ニューロン集団の細胞死を引き起こすことが近年には報告されている。最近の研究では、軸索を鞘で覆う乏突起膠細胞におけるa−シヌクレインの蓄積もまた、関連したニューロンの神経変性を誘導し得ることが示される。最後に、ミクログリア細胞がPDの早期段階において星状膠細胞による活性化を受け、その後、この活性化がドーパミン作動性ニューロンに対する毒性影響を及ぼすことが示されている。したがって、他の神経変性障害と類似して、PDの病理発生が病理学的な細胞・細胞相互作用によって媒介される。
遺伝型形態のヒトPDによく似る遺伝的病変(例えば、パーキンにおけるホモ接合性欠失またはα−シヌクレインの過剰発現など)を有する動物モデルは、ドーパミン作動性ニューロンの喪失を再現することができていない。対照的に、マウス胚性幹(ES)細胞に由来するドーパミン作動性ニューロン、またはパーキンソン病患者の線維芽細胞のiPSによって得られるドーパミン作動性ニューロンが、PDの病態生理学を研究するためのより良好なモデルを表すことが示されている。
このモデルの欠点が、このモデルは臨床応用に移すことができないことにある。ESCおよびiPSとは対照的に、骨髄、脂肪組織または胎盤に由来する成体間葉系間質細胞(MSC)、あるいは、臍帯細胞に由来するMSCは神経細胞に分化させることができ、また、PD患者の細胞治療に対して用いることができる。
新規な取り組みが、MSCをドーパミン作動性ニューロンおよび星状膠細胞に分化させ、また、CD34+細胞をミクログリア細胞に分化させるために開発されている。したがって、PD患者から得られる骨髄由来幹細胞を、ドーパミン作動性ニューロンの細胞死に関与する分子的機構を理解するために使用することができる。具体的には、種々のタイプのPDの患者から得られるMSCがドーパミン作動性ニューロンおよび星状膠細胞に分化させられ、CD34+細胞がミクログリア細胞に分化させられる。MSCおよびCD34+細胞がα−シヌクレインにおける変異について調べられ、遺伝子アレイについて分析される。分化細胞が、1ヶ月の経過にわたって細胞死について調べられる。
同様に、PD患者から得られる星状膠細胞の影響が、同じ患者から得られるCD34+細胞から作製されるミクログリア細胞の存在下および非存在下での共培養において、正常者およびPD患者から得られるドーパミン作動性ニューロンの細胞死に関して調べられる。細胞死に加えて、ニューロンは、酸化ストレスに対する感受性、プロテアソーム阻害、不溶性α−シヌクレインタンパク質の出現、ミトコンドリアの機能およびERのストレス応答について調べられる。
ドーパミン作動性ニューロン、星状膠細胞およびミクログリアはすべて、潜在的な細胞標的であるので、そのようなモデルは、この疾患のための可能性のある処置を開発するための重要な情報をもたらすことができる。加えて、非改変のMSC、ならびに、NSC、ニューロンおよび星状膠細胞への分化MSCは、この疾患のための可能性のある細胞治療処置として示唆されているので、このインビトロモデルは、どの細胞タイプが、すなわち、自己の、改変されたまたは分化させた、あるいは、同種の、MHC一致または「在庫」の臍帯由来MSCおよび胎盤由来MSCが、置換療法のためのより良好な供給源を提供し得るかという重要な情報をもたらすことができる。
最後に、ドーパミン作動性ニューロンおよび星状膠細胞に分化させられる種々のPD患者由来MSC、およびミクログリア細胞に分化させられるCD34+細胞の作製は、小分子、薬物または遺伝子治療取り組みおよびサイレンシング取り組みを分析するためのスクリーニングツールをもたらす場合がある。
実施例3
アルツハイマー病
アルツハイマー病(AD)は一般的な慢性神経変性疾患であり、認知症の最も一般的な原因である。この疾患の2つの際立った特徴が、老人斑(これは主に、アミロイドβの細胞外沈着から構成される)および神経原線維変化(これは、異常にリン酸化されたタウタンパク質の細胞間凝集物からなる)である。
アルツハイマー病
アルツハイマー病(AD)は一般的な慢性神経変性疾患であり、認知症の最も一般的な原因である。この疾患の2つの際立った特徴が、老人斑(これは主に、アミロイドβの細胞外沈着から構成される)および神経原線維変化(これは、異常にリン酸化されたタウタンパク質の細胞間凝集物からなる)である。
老人斑の存在はまた、ADにおける顕著な初期の役割を果たすと考えられる炎症性応答に関連する。
アルツハイマー病の症例の大多数が散発性であり、しかしながら、APP(これはアミロイド−β前駆体タンパク質をコードする)の変異または重複化、あるいは、プレセニリン遺伝子(これは、APPをアミロイド−βに切断するタンパク質分解酵素をコードする)における変異を有するアルツハイマー病の優性遺伝性家族性型の希な症例が存在する。ADの両方のタイプにおいて、さらなる細胞タイプ(例えば、星状膠細胞およびミクログリアなど)がこの疾患の病理発生に関係づけられている。このモデルでは、家族性AD患者および散発性AD患者の両方から得られるMSCがニューロンおよび星状膠細胞に分化させられ、CD34+細胞がミクログリア細胞に分化させられる。細胞が、アミロイド−β、リン酸化タウ、aGSK−3βおよびシナプシン1のレベルについて分析される。AD患者および対照から得られる星状膠細胞およびミクログリアの役割により、これらの細胞の役割が、この疾患の病理発生において、また、可能な治療標的として明確化されるであろう。実際、星状膠細胞は、ADについて典型的な神経毒性β−アミロイド(Aβ)沈着物をインビトロおよびインビボの両方で分解することができ、このことは、MSC由来の星状膠細胞を移植することが治療的に有益であり得ることを示唆している。
実施例4
レット症候群
レット症候群(RTT)は、メチルcpG結合タンパク質2(MsCP2)の機能の喪失によって引き起こされるX染色体連鎖の自閉症スペクトラム障害である。より初期の研究では、この疾患はニューロンにおけるMeCP2機能の喪失に起因すると結論されたにもかかわらず、近年の研究では、グリア細胞におけるMeCP2の喪失が負の影響を細胞非自律的様式でニューロンに及ぼすことが明瞭に明らかにされた。そのうえ、MeCP2完全欠損マウスでの星状膠細胞におけるMeCP2の再発現は、ヌルマウスと比較して、運動レベルおよび不安レベルを著しく改善し、呼吸の異常を正常なパターンにまで回復させ、かつ、寿命を大きく延ばした。加えて、変異型星状膠細胞に対するMeCP2の修復は、インビボにおける変異型ニューロンに対する細胞非自律的な陽性の影響を及ぼし、これにより、正常な樹状突起形態学を回復させ、また、興奮性グルタミン酸輸送体のレベルを増大させた。したがって、グリア細胞が、ニューロンと類似して、RTTの神経病理学の不可欠な構成要素であり、また、この疾患の随伴症状を改善するための1つの方策としての、正常なMeCP2レベルを有するグリア細胞を投与するという考えを裏づけているようである。
レット症候群
レット症候群(RTT)は、メチルcpG結合タンパク質2(MsCP2)の機能の喪失によって引き起こされるX染色体連鎖の自閉症スペクトラム障害である。より初期の研究では、この疾患はニューロンにおけるMeCP2機能の喪失に起因すると結論されたにもかかわらず、近年の研究では、グリア細胞におけるMeCP2の喪失が負の影響を細胞非自律的様式でニューロンに及ぼすことが明瞭に明らかにされた。そのうえ、MeCP2完全欠損マウスでの星状膠細胞におけるMeCP2の再発現は、ヌルマウスと比較して、運動レベルおよび不安レベルを著しく改善し、呼吸の異常を正常なパターンにまで回復させ、かつ、寿命を大きく延ばした。加えて、変異型星状膠細胞に対するMeCP2の修復は、インビボにおける変異型ニューロンに対する細胞非自律的な陽性の影響を及ぼし、これにより、正常な樹状突起形態学を回復させ、また、興奮性グルタミン酸輸送体のレベルを増大させた。したがって、グリア細胞が、ニューロンと類似して、RTTの神経病理学の不可欠な構成要素であり、また、この疾患の随伴症状を改善するための1つの方策としての、正常なMeCP2レベルを有するグリア細胞を投与するという考えを裏づけているようである。
星状膠細胞に加えて、ミクログリア細胞もまた、神経毒性である高レベルのグルタミン酸を分泌することによってこの疾患の病理発生に関係づけられている。
このインビトロモデルは、MSC由来のニューロンおよび星状膠細胞ならびにCD34+細胞由来のミクログリア細胞からなる。レット症候群ニューロンおよび正常なニューロンの生存がミクログリア細胞および星状膠細胞の存在下および非存在下での長期培養において求められる。このモデルは、新規薬物のハイスループット分析のために、また、新規薬物および細胞治療(自己、同種、万能的ドナー、分化細胞および増殖因子分泌性)の組合せのために使用することができる。
要約
近年の研究は、様々な神経変性障害(例えば、ALS、パーキンソン病、レット症候群およびアルツハイマー病など)の病理発生に対する、また、精神医学的疾患(例えば、統合失調症など)に対する細胞非自律的な成分を明瞭に示唆している。したがって、細胞・細胞相互作用をこれらの疾患において研究することは、分子的機構を明確化するために、また、効率的な薬物に基づく治療法および細胞に基づく治療法を設計するために非常に重要である。
近年の研究は、様々な神経変性障害(例えば、ALS、パーキンソン病、レット症候群およびアルツハイマー病など)の病理発生に対する、また、精神医学的疾患(例えば、統合失調症など)に対する細胞非自律的な成分を明瞭に示唆している。したがって、細胞・細胞相互作用をこれらの疾患において研究することは、分子的機構を明確化するために、また、効率的な薬物に基づく治療法および細胞に基づく治療法を設計するために非常に重要である。
関連性のある細胞タイプを使用するヒトのインビトロモデルが、下等生物種の系を補足するために、そして、それにより、ヒト疾患に対する直接の関連性があるさらなる機構および標的を確認し、評価し、同様にまた、発見するために必要である。
さらなる疾患特異的モデル:
近年の研究は、ほとんどの神経変性障害の病理発生の一因である2つの共通する要因、すなわち、細胞非自律的な成分と、細胞・細胞相互作用および神経炎症とが存在することを示している。
近年の研究は、ほとんどの神経変性障害の病理発生の一因である2つの共通する要因、すなわち、細胞非自律的な成分と、細胞・細胞相互作用および神経炎症とが存在することを示している。
したがって、MSC由来のニューロン細胞、星状膠細胞、ならびに、CD34+由来のミクログリア細胞から構成されるインビトロモデルが、神経変性障害の多くに共通し得るヒト疾患関連モデルの「基本的」成分を表す。そのうえ、これらの疾患の多くにおいて、それらの病理発生に関与するさらなる機構または二次的な機構が存在するので、対照細胞および分化細胞の全ゲノム分析により、新規な治療標的が明らかにされ得る。
具体的な例:
1.ハンチントン病−グリア細胞における変異型HD遺伝子の発現がHDの神経学的症状を悪化させることが示されている。HD遺伝子のコード領域内におけるCAG反復の拡大に加えて、様々な異常が、例えば、主に星状膠細胞において現れる低下した脳のコレステロール生合成およびApoE、同様にまた、グルタミン酸輸送体1の低下した機能などが認められる。ミクログリアの活性化もまた、種々の経路を介するHDの病理発生に関係づけられている。
2.精神医学的障害−統合失調症は、多数の特定された危険因子による複雑な遺伝的障害であり、最も研究されているものが、Disrupted in Schizophrenia1(DISC1)である。増え続ける多数の証拠は、統合失調症においてもまた神経炎症および免疫遺伝学の重要性を、ミクログリアおよび星状膠細胞をこの疾患の病理発生に関係づけて示している。
1.ハンチントン病−グリア細胞における変異型HD遺伝子の発現がHDの神経学的症状を悪化させることが示されている。HD遺伝子のコード領域内におけるCAG反復の拡大に加えて、様々な異常が、例えば、主に星状膠細胞において現れる低下した脳のコレステロール生合成およびApoE、同様にまた、グルタミン酸輸送体1の低下した機能などが認められる。ミクログリアの活性化もまた、種々の経路を介するHDの病理発生に関係づけられている。
2.精神医学的障害−統合失調症は、多数の特定された危険因子による複雑な遺伝的障害であり、最も研究されているものが、Disrupted in Schizophrenia1(DISC1)である。増え続ける多数の証拠は、統合失調症においてもまた神経炎症および免疫遺伝学の重要性を、ミクログリアおよび星状膠細胞をこの疾患の病理発生に関係づけて示している。
インビトロMSCモデルの利点:
1.個別化された疾患モデルの開発−「個別的」な患者疾患状態をインビトロにおいてモデル化すること
2.研究、薬物スクリーニング、毒性学スクリーニングおよび治療的試験のための新規な神経変性疾患モデルの作製
3.再生医療の個別化−自己対同種、非改変型対分化型、siRNA、miRNAまたは増殖因子分泌性
4.ハイスループット薬物スクリーニングのための、関連性のある細胞タイプに分化させられる患者特異的な特徴づけられたMSCのコレクションの開発
1.個別化された疾患モデルの開発−「個別的」な患者疾患状態をインビトロにおいてモデル化すること
2.研究、薬物スクリーニング、毒性学スクリーニングおよび治療的試験のための新規な神経変性疾患モデルの作製
3.再生医療の個別化−自己対同種、非改変型対分化型、siRNA、miRNAまたは増殖因子分泌性
4.ハイスループット薬物スクリーニングのための、関連性のある細胞タイプに分化させられる患者特異的な特徴づけられたMSCのコレクションの開発
実施例5
配列
配列
明確にするため別個の実施形態で説明されている本発明の特定の特徴は単一の実施形態に組み合わせて提供することもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで提供することもできる。
本発明はその特定の実施形態によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。本明細書中で言及した刊行物、特許および特許願並びにGeneBank Accession番号はすべて、個々の刊行物、特許または特許願またはGeneBank Accession番号が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。
Claims (35)
- 間葉系幹細胞(MSC)集団を認定する方法であって、
(a)対象に起源を有する間葉系幹細胞の集団を第1の系譜特異的細胞に向かってエクスビボ分化させること、ただし、前記第1の系譜特異的細胞は脳疾患に関連する;
(b)健常者対象に起源を有する間葉系幹細胞の集団を前記第1の系譜特異的細胞に向かってエクスビボ分化させること;
(c)前記脳疾患に関連する第2の系譜特異的細胞に対して、前記対象に由来する前記第1の系譜特異的細胞の影響を、前記健常者対象に由来する前記第1の系譜特異的細胞の影響と比較すること、ただし、所定のレベルを超えるか、または所定のレベルに達しない前記影響における違いにより、間葉系幹細胞集団が認定されることが示される、
を含む方法。 - 前記認定することは、前記MSC集団が、対象の前記脳疾患を処置するための自己細胞置換療法のために好適であるかどうかを確認することである、請求項1に記載の方法。
- 前記第1および/または前記第2の系譜特異的細胞に対する、前記対象に由来する第3の系譜特異的細胞の影響と前記健常者対象に由来する前記第3の系譜特異的細胞の影響とを比較することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第2の系譜特異的細胞は間葉系幹細胞の集団からエクスビボ分化させられている、請求項1に記載の方法。
- 前記脳疾患は、神経変性障害、神経炎症障害およびプリオン媒介障害からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病およびレット症候群からなる群から選択される、請求項5に記載の方法。
- 前記脳疾患は、多発性硬化症、ALS、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、レット症候群、自閉症スペクトラム障害、アスペルガー症候群、認知症および大脳萎縮、多系統萎縮症、クロイツフェルト・ヤコブ病、橋小脳形成不全、皮質基底核変性、進行性核上性麻痺、脊髄小脳萎縮症、脊髄&延髄性筋萎縮、シャルコー・マリー・トゥース病、巨大軸索ニューロパチー、カナバン病、フリードライヒ運動失調および他の運動失調、てんかん、早期乳児脳症、遺伝性痙性対麻痺、中枢神経系のアミロイドーシス、トゥレット症候群、シャイ・ドレーガー症候群、メニエール症候群、アルパース病、家族性自律神経異常症、失読症、ウェルドニッヒ・ホフマン病、結節性硬化症ならびに神経線維腫症である、請求項1に記載の方法。
- 前記脳疾患は精神医学的疾患である、請求項1に記載の方法。
- 前記方法は前記対象に起源を有する前記MSCの遺伝子異常について分析することをさらに含み、前記遺伝子異常は脳疾患に関連する、請求項1に記載の方法。
- 間葉系幹細胞(MSC)集団を認定する方法であって、前記MSCの前記集団から分化させられる系譜特異的細胞の機能および/または形態学を分析することを含み、ただし、対照の系譜特異的細胞と比較される前記系譜特異的細胞の前記機能または形態学における変化により、前記MSCが認定されることが示される、方法。
- MSCの前記集団は、脳疾患を有する対象に由来する、請求項10に記載の方法。
- 前記認定することは、前記MSCが、対象の脳疾患を自己処置するために好適であるかどうかを確認することである、請求項10に記載の方法。
- 前記方法は前記MSCの遺伝子異常について分析することをさらに含み、前記遺伝子異常は脳疾患に関連する、請求項10に記載の方法。
- 前記系譜特異的細胞の前記機能は、ミクログリア細胞に対する応答を含む、請求項10に記載の方法。
- 前記脳疾患は神経変性障害である、請求項10に記載の方法。
- 前記神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病およびレット症候群からなる群から選択される、請求項15に記載の方法。
- 前記脳疾患は精神医学的疾患である、請求項10に記載の方法。
- 前記脳疾患が筋萎縮性側索硬化症(ALS)であり、前記系譜特異的細胞が、運動ニューロン、骨格筋および星状膠細胞からなる群から選択される、請求項10に記載の方法。
- 前記脳疾患がパーキンソン病であるとき、前記系譜特異的細胞が、星状膠細胞およびドーパミン作動性ニューロンからなる群から選択される、請求項10に記載の方法。
- 前記脳疾患がレット症候群であるとき、前記系譜特異的細胞が、星状膠細胞およびニューロンからなる群から選択される、請求項10に記載の方法。
- 脳疾患を処置するための作用因を選択する方法であって、脳障害の患者から単離されるMSCの集団が、前記脳障害に関連する系譜特異的細胞に向かって分化する能力を前記作用因の存在下および非存在下において分析することを含み、ただし、前記作用因の存在下におけるMSCの対照集団に由来する同一の系譜特異的細胞と比較して、前記系譜特異的細胞の機能または形態学の改善により、前記作用因が前記脳疾患の処置のために使用され得ることが示される、方法。
- 間葉系幹細胞(MSC)バンクを製造する方法であって、未分化間葉系幹細胞を、脳障害を有する複数の対象から採取して、複数の別個の細胞集団を得ること;前記間葉系幹細胞を系譜特異的細胞に向かって分化させること;前記未分化間葉系幹細胞および前記系譜特異的細胞を貯蔵し、それにより、間葉系幹細胞バンクを製造すること、を含む方法。
- 前記未分化細胞集団を、少なくとも1つの所定の特徴を前記未分化細胞集団のそれぞれについて得るために特徴づけること、および前記未分化細胞集団のカタログを前記少なくとも1つの所定の特徴に従って作成することをさらに含む、請求項22に記載の方法。
- 前記分化細胞集団を、少なくとも1つの所定の特徴をそれぞれの分化細胞集団について得るために特徴づけること、および前記分化細胞集団のカタログを前記少なくとも1つの所定の特徴に従って作成することをさらに含む、請求項22または23に記載の方法。
- 前記特徴づけることは、前記疾患に関連する系譜特異的細胞に向かって分化する前記MSCの能力を分析することを含む、請求項23または24に記載の方法。
- 前記特徴づけることは、前記MSCの遺伝子異常について分析することを含み、ただし、前記遺伝子異常は前記疾患に関連する、請求項23または24に記載の方法。
- 前記貯蔵することは、前記細胞集団を凍結条件のもとで別個の容器に配置することを含む、請求項22に記載の方法。
- 前記カタログを作成することは、所与の細胞集団の前記所定の特徴に関する情報をデータベースコンピューターに入力することを含む、請求項23または24に記載の方法。
- 前記所定の特徴は前記対象の疾患状態情報を含む、請求項23または24に記載の方法。
- 脳障害の患者から単離される多数のMSC集団を含む幹細胞バンクであって、それぞれが個々に、別個の容器に配置される幹細胞バンク。
- 前記MSC集団から分化させられる系譜特異的細胞であって、前記脳障害に関連する系譜特異的細胞をさらに含む、請求項30に記載の幹細胞バンク。
- 前記MSC集団の所定の特徴に関する情報を含むカタログをさらに含む、請求項30に記載の幹細胞バンク。
- 前記所定の特徴は前記MSC集団の分化能を含む、請求項32に記載の幹細胞バンク。
- 前記所定の特徴は遺伝的特徴を含む、請求項32に記載の幹細胞バンク。
- 前記カタログは、少なくとも1つの処理モジュールと、前記多数の細胞集団の所定の特徴情報が入力される少なくとも1つのメモリデバイスと、所定の特徴情報を、前記データベースコンピューターに通信接続されるディスプレーに要求時に表示させるための少なくとも1つのプログラムコードモジュールとを含む少なくとも1つのデータベースコンピューターユニットである、請求項32に記載の幹細胞バンク。
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