CN114196676B - Itga2基因在调控猪米色脂肪形成中的应用 - Google Patents

Itga2基因在调控猪米色脂肪形成中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了ITGA2基因在调控猪米色脂肪形成中的应用。本发明利用RNA‑seq技术，通过分析藏猪成熟米色脂肪细胞和白色脂肪细胞的基因表达差异，筛选出米色脂肪特异性的高表达基因，并基于人、鼠、猪比较基因组学技术，成功鉴定出猪特异的米色脂肪调控基因ITGA2。进一步利用RNAi技术，敲降ITGA2基因的表达，通过油红O染色和seahorse实验证明猪米色脂肪的形成与功能维持需要ITGA2。本发明首次发现ITGA2在猪米色脂肪形成过程中的作用，该发现对于利用米色脂肪对猪进行脂肪沉积调控具有重要的意义。

Description

ITGA2基因在调控猪米色脂肪形成中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及ITGA2基因在调控猪米色脂肪形成中的应用。
背景技术
哺乳动物脂肪组织是调节能量平衡的重要内分泌器官。经典的脂肪组织按功能可分为两类：白色脂肪组织以甘油三酯的形式储存多余的能量，棕色脂肪组织通过适应性产热将能量以热量的形式散去。在寒冷暴露、药物、运动等各种刺激下，白色脂肪组织中会出现米色脂肪细胞，它们具有与棕色脂肪细胞相似的特征，如存在多房脂滴和解耦蛋白1(UCP1)阳性细胞。目前，已鉴定了人和小鼠米色脂肪细胞的分子特征，与棕色脂肪细胞相似，米色脂肪细胞的生热活性依赖于UCP1的激活。此外，已鉴定出许多特异性的米色细胞标记基因(如TBX1、TMEM26、CD137、FGF21、P2RX5、PAT2、CAR4和CITED1)和米色细胞特异性转录因子(TFs)，包括EBF2、ZFP516和PRDM16，已经被鉴定并被证明在调节米色分化中发挥重要作用。这些标志物不仅促进了对米色脂肪相关生物学的理解，也为肥胖及其相关代谢紊乱提供了治疗分子靶点。
目前普遍认为猪缺乏功能性棕色脂肪组织和UCP1。在猪的进化过程中UCP1基因的缺失，表明猪的产热过程可能与人类和啮齿动物的产热过程不同。小猪对寒冷很敏感，北方的农村很多小猪在出生后由于寒冷应激而死亡，给养猪业带来了巨大的损失。此前研究发现藏民猪等抗寒猪在急性冷刺激之后的脂肪组织中存在米色脂肪细胞。然而，对猪的米色形成的了解是有限的，目前还不知道在人类和小鼠细胞中识别的标记是否可以明确地定义猪米色脂肪细胞。
另外，猪器官移植治疗人类疾病具有重要意义，猪米色脂肪的研究对于人类肥胖等相关疾病的治疗将具有重要的参考价值。然而目前猪米色脂肪标记基因的研究鲜有报道，因此急需建立一个猪米色脂肪标记基因的筛选以及功能验证的方法，为治疗脂肪代谢紊乱相关疾病提供新的思路。
发明内容
本发明的目的是提供ITGA2基因的用途，特别是在调控猪米色脂肪形成中的应用。
本发明利用RNA-seq技术，将体内体外数据联合分析，筛选到米色脂肪形成关键基因ITGA2，并通过分化效率和产热功能的检测，验证了ITGA2基因在米色脂肪形成过程中的重要作用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供ITGA2基因的以下任一应用：
1)用于正向调控猪米色脂肪形成；
2)用于低脂优质猪品种的育种；
3)用于构建米色脂肪动物模型；
4)制备用于构建米色脂肪动物模型的试剂盒；
5)用于制备预防、缓解和/或治疗肥胖的药物或组合物；
6)用于制备治疗脂肪代谢紊乱相关疾病的药物或组合物；
7)用于研究动物脂肪发育和代谢。
本发明中，ITGA2基因在NCBI上的参考序列编号为397483，编码整合素亚基alpha2。
第二方面，本发明提供ITGA2基因抑制剂或靶向ITGA2的基因编辑系统的以下任一应用：
(1)促进动物脂肪沉积；
(2)用于改善脂肪营养不良；
(3)用于研究肥胖相关疾病；
(4)用于构建脂肪相关疾病动物模型。
其中，ITGA2基因抑制剂是能够从转录或翻译水平上抑制ITGA2基因表达的物质，所述抑制剂包括但不限于shRNA、siRNA、dsRNA、miRNA、cDNA、反义RNA/DNA、低分子化合物、肽、抗体、ITGA2基因打靶载体等中的至少一种。
优选地，所述抑制剂为siRNA，序列5’-GCAAGAGAUUCCGCUUAUUTT-3’(SEQ ID NO:1)。
第三方面，本发明提供一种用于预防、缓解和/或治疗肥胖的药物或组合物，有效成分为ITGA2基因编码的蛋白。
第四方面，本发明提供一种用于改善脂肪沉积和/或治疗脂肪代谢紊乱相关疾病的药物或组合物，有效成分为ITGA2基因编码的蛋白。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明首次发现ITGA2基因对于猪米色脂肪的形成和功能维持是不可或缺的，该发现对于利用米色脂肪对猪进行脂肪沉积调控具有重要的意义。
本发明利用siRNA降低ITGA2基因的表达，通过油红O染色和定量的方法，结果表明，抑制ITGA2基因的表达会抑制米色脂肪的形成；并利用seahorse实验检测米色脂肪细胞的耗氧量(OCR)，结果表明，抑制ITGA2基因的表达会抑制米色脂肪的产热。该基因对于研究脂肪代谢相关疾病具有重要的应用价值。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中猪米色脂肪体外分化模型的建立。其中，A：猪SVF细胞获取与分化示意图；B：分化成熟的white和beige油红O染色和BODIPY493/503染色拍照(标尺分别为200μm、50μm和10μm)；C：脂滴大小与数目统计结果(white:n＝5,943；Beige:n＝5,974)；D：white和beige OCR结果；E-G：对OCR结果的统计分析。***p＜0.001表示极显著。图中sWAT表示腹股沟皮下脂肪组织，SVF表示血管基质细胞，OCR指细胞的氧气消耗速率，FCCP是氧化磷酸化解偶联剂。
图2为本发明较佳实施例中米色脂肪细胞与白色脂肪细胞在转录水平的差异分析。其中，A：SVF细胞、white和beige RNA-seq测序结果的PCA分析结果；B-D：white/SVF、beige/SVF和beige/white上下调差异表达基因火山图；E-G：GSEA分析white/SVF、beige/SVF和beige/white三组主要富集的通路；H：SVF、white和beige3个组在adipogenesis、brown fat cell differentiation和oxidative phosphorylation通路前15个基因的热图；I：SVF、white和beige细胞中已知脂肪marker基因的表达水平检测。图中white表示成熟白色脂肪细胞，beige表示成熟米色脂肪细胞，GSEA：Gene Set Enrichment Analysis，指基因集富集分析。火山图中标记的基因为已知和候选米色脂肪标记基因。
图3为本发明较佳实施例中ITGA2是猪米色脂肪特异的标记基因。其中，A：beige上下调差异表达基因与藏猪冷刺激前后腹股沟脂肪组织上下调基因韦恩图；B：体内体外实验中差异表达前20的基因，ITGA2在体内外米色脂肪中均高表达；C：体内外共同高表达的95个基因GO分析通路图；D：猪米色脂肪细胞与人和小鼠核心棕色筛选基因韦恩图，ITGA2只在猪米色脂肪细胞中特异表达上调；E：人、小鼠和猪共同上调的18个基因和共同下调的14个基因在SVF、white和beige中的表达热图。
图4为本发明较佳实施例中ITGA2基因功能验证。其中，A：猪米色脂肪细胞干扰和诱导分化示意图；B：干扰ITGA2基因后转录水平对基因表达量进行验证；C-D：通过油红O和BODIPY493/503染色，验证干扰ITGA2基因后，米色脂肪细胞分化效率；E：干扰ITGA2基因对细胞耗氧量的检测；F-G：干扰ITGA2基因对细胞基础呼吸和质子漏呼吸进行检测。*p＜0.05和***p＜0.001表示显著和极显著。
具体实施方式
本发明旨在填补猪米色脂肪标记基因领域的研究空白，筛选猪米色脂肪形成的关键调控基因。本发明提供ITGA2基因与猪米色脂肪形成的相互关系，提供一个研究猪脂肪沉积的靶基因，同时也为研究脂肪代谢相关疾病提供药物研究的新靶点。
本发明利用RNA-seq技术，通过分析藏猪成熟米色脂肪细胞和白色脂肪细胞的基因表达差异，筛选出米色脂肪特异性的高表达基因，并基于人、鼠、猪比较基因组学技术，成功鉴定出猪特异的米色脂肪调控基因ITGA2。
进一步地，利用RNAi技术，敲降ITGA2基因的表达，通过油红O染色和seahorse实验证明猪米色脂肪的形成与功能维持需要ITGA2。
本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供整合素ITGA2基因的以下任一应用：
1)用于研究猪米色脂肪的特征；
2)用于研究动物脂肪发育和代谢；
3)用于构建米色脂肪动物模型；
4)用于低脂优质猪品种的培育；
5)制备用于研究肥胖相关疾病的药物；
6)制备用于制作米色脂肪动物模型的试剂盒；
7)制备用于研究肥胖相关疾病药物的试剂盒。
本研究中，所述动物为脊椎动物，优选猪。
本发明的第二方面，提供猪米色脂肪标记基因筛选的方法。所述方法包括：利用比较基因组学手段，筛选米色脂肪细胞与白色脂肪细胞以及血管基质细胞(SVF)相比，特异性表达上调的基因，以及米色脂肪细胞与冷刺激后藏猪共同上调的基因，筛选得到ITGA2基因，作为猪米色脂肪标记基因的候选基因。
本发明的第三方面，提供猪米色脂肪标记基因功能验证的方法。所述方法包括：利用基因工程手段，对ITGA2基因进行敲除，从转录和翻译水平上抑制或者降低ITGA2基因的表达，从线粒体氧化磷酸化水平抑制米色脂肪产热功能。
本发明的第四方面，提供整合素ITGA2基因抑制剂、整合素ITGA2蛋白抑制剂、ITGA2基因的编辑系统的以下任一应用：
A、促进动物脂肪沉积；
B、用于研究肥胖相关疾病；
C、用于改善脂肪营养不良；
D、制备用于研究脂肪相关疾病的动物模型；
E、制备用于研究脂肪相关疾病药物的试剂盒。
其中，所述整合素ITGA2基因抑制剂是能够从转录或翻译水平上抑制ITGA2基因表达的物质，所述抑制剂包括但不限于shRNA、siRNA、dsRNA、miRNA、cDNA、反义RNA/DNA、低分子化合物、肽、抗体等。可选地，所述ITGA2基因的编辑系统为siRNA抑制ITGA2基因表达的操作系统。
本发明的第五方面，提供ITGA2基因的以下任一应用：
(1)用于研究猪米色脂肪的筛选与鉴定；
(2)用于低脂优质猪品种的培育；
(3)用于低脂优质猪肉的研究与生产；
(4)用于预防、缓解和/或治疗肥胖；
(5)用于治疗脂肪代谢紊乱相关疾病；
(6)用于构建米色脂肪动物模型；
(7)用于制备预防、缓解和/或治疗肥胖的药物或组合物；
(8)用于制备治疗脂肪代谢紊乱相关疾病的药物或组合物。
本发明的第六方面，提供一种猪白色脂肪和米色脂肪诱导分化的方法。
本发明的第七方面，提供一种用于预防、缓解和/或治疗肥胖的药物或组合物，有效成分为整合素ITGA2。
本发明的第八方面，提供一种用于改善脂肪沉积和/或治疗脂肪代谢紊乱相关疾病的药物或组合物，有效成分为整合素ITGA2。
本发明的第九方面，提供构建的动物模型在筛选用于预防、缓解和/或治疗脂肪代谢紊乱等疾病的药物中的应用。
具体地，本发明提供猪米色脂肪标记基因的筛选方法：通过分离猪脂肪组织的SVF细胞，诱导其分化为成熟米色脂肪细胞，再筛选米色脂肪差异表达基因。
本发明提供一种猪米色脂肪细胞标记基因的筛选方法，包括如下步骤：分离猪腹股沟皮下脂肪组织，消化分解为SVF细胞，诱导其向白色脂肪和米色脂肪方向分化，通过RNA-seq测序筛选得到差异表达基因，通过与藏猪冷刺激后的差异表达基因比较，筛选出共有差异表达基因，作为猪米色脂肪标记基因的候选基因，并对候选基因的功能进行验证。
所述方法还可以进一步发展为猪、人、小鼠、牛、羊等品种米色脂肪标记基因的筛选方法。
本发明提供ITGA2基因的siRNA序列和si-NC序列：
si-ITGA2：5’-GCAAGAGAUUCCGCUUAUUTT-3’
antisense：5’-AAUAAGCGGAAUCUCUUGCTT-3’；
si-NC：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’
antisense：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。
本发明还提供ITGA2基因在筛选治疗肥胖等相关疾病药物中的用途。
本发明还提供ITGA2基因在研究猪脂肪发育和代谢过程中所发挥作用方面的应用。
本发明利用比较基因组学的方法，通过比较成熟米色脂肪细胞和白色脂肪细胞的差异表达基因，筛选到米色脂肪细胞特异高表达的基因，进一步通过比较米色脂肪细胞和冷刺激后藏猪腹股沟皮下脂肪组织的差异表达基因，筛选得到在米色脂肪细胞以及冷刺激后的米色脂肪组织中特异高表达的基因，作为猪米色脂肪调控基因的候选基因。该方法对后续研究猪米色脂肪标记基因具有重要的指导作用，筛选得到的所有基因在后续研究米色脂肪时都具有重要的参考作用。
本发明首次发现ITGA2在猪米色脂肪形成过程中的作用，该发现对于利用米色脂肪对猪进行脂肪沉积调控具有重要的意义。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1猪米色脂肪细胞体外分化体系的建立
本实施例中，从藏猪腹股沟皮下分离得到SVF细胞(血管基质细胞)，将其诱导分化为米色脂肪细胞，通过比较基因组学，分析米色脂肪细胞比白色脂肪细胞高表达的基因，并分析米色脂肪细胞的形态和分子特征(图1，A)。
1、猪SVF细胞分离、培养和诱导分化：
取1月龄雄性藏仔猪腹股沟皮下白色脂肪组织，切割、用含有5％的青霉素/链霉素的DPBS洗涤、剪碎，在37℃的含有2mg/ml I型胶原酶的Dulbecco Hanks平衡盐溶液中消化60min，用70μm细胞滤器过滤组织悬浮液，1500r/min离心10min，将细胞颗粒重悬于添加了10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素/链霉素(P/S)的DMEM/F12培养基中，细胞保持在含有5％CO2的37℃培养箱中。细胞长满后，接触抑制2天开始诱导分化。使用诱导分化成熟的细胞进行后续实验。将SVF细胞、分化成熟的白色脂肪细胞、米色脂肪细胞进行RNA-seq测序，筛选得到米色脂肪比白色脂肪细胞特异高表达的基因(FC>1.5，P＜0.05)。
2、白色脂肪诱导分化：基础培养基为DMEM高糖培养基(1％PS、10％FBS)+1×非必需氨基酸、1×微量元素A、1×微量元素B、1×微量元素C、0.1mM 2-巯基乙醇、200ng/mLIGF1(Long-R3-IGF1)、8ng/mL FGF、50μg/mL抗坏血酸。分化培养基在基础培养基中添加20mM HEPES(pH 7.4)，5μg/mL胰岛素，17μM泛酸盐，33μM生物素，1μM地塞米松，0.25mM异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)和50mM罗格列酮，5d后半数换液，换成成熟培养基。成熟培养基为分化培养基中不含IBMX和罗格列酮。诱导分化到第8d。
3、米色脂肪诱导分化：基础培养基为DMEM高糖培养基(1％PS、2％FBS)+1×非必需氨基酸、1×微量元素A、1×微量元素B、1×微量元素C、0.1mM 2-巯基乙醇、200ng/mL IGF1(Long-R3-IGF1)、8ng/mL FGF、50μg/mL抗坏血酸。分化培养基在基础培养基中添加1nM T3，1μM地塞米松，0.5mM IBMX和2μM罗格列酮。每2天换液一次。
细胞分化成熟后，通过油红O和免疫荧光染色与拍照，分析白色脂肪细胞和米色脂肪细胞的形态差异(图1，B和C)，米色脂肪细胞具有多房小脂滴的特。通过细胞呼吸代谢(图1，D～G)实验表明，米色脂肪细胞基础呼吸、ATP生产和产热能力都高于白色脂肪细胞。
SVF细胞、white和beige RNA-seq测序结果的PCA分析结果见图2中A。通过火山图分析可以筛选beige比white高表达的基因(图2，B～D)，GSEA分析和QPCR SVF、white和beige细胞进行比较分析，进一步验证猪米色脂肪体外分化体系构建成功(图2，E～I)。
实施例2 ITGA2基因为猪米色脂肪特异高表达的基因
此前发现藏猪在急性冷刺激后腹股沟皮下脂肪组织中会出现米色脂肪细胞，本实施例通过比较基因组学的方法，筛选米色脂肪细胞和藏猪冷刺激后均上调的基因共95个(图3，A)，差异表达倍数前20的基因包括已报到的KCNK3和ITGA2(图3，B)，这些基因主要富集在脂质合成与转运、脂质代谢等通路(图3，C)。已报到的人和小鼠棕色核心筛选基因的基因集中包含已知的米色脂肪marker基因KCNK3、EBF2和CD36，但是不包含ITGA2基因，说明ITGA2是在猪米色脂肪特异表达的基因(图3，D～E)。
实施例3 ITGA2基因为猪米色脂肪必需基因
本实施例利用RNAi技术敲降ITGA2基因，验证其在米色脂肪分化过程中的作用。实验设计如图4中A所示，分别在米色脂肪分化的第-2d、0d和3d加入转染试剂，诱导分化到第6d，检测ITGA2基因的表达，结果表明抑制ITGA2基因表达后(图4，B)，米色脂肪细胞的分化效率显著降低(图4，C和D)。通过用seahorse系统检测米色脂肪细胞的OCR(氧气消耗速率)，发现抑制ITGA2基因的表达后，细胞的基础呼吸和产热显著下降。实验结果说明，ITGA2基因是米色脂肪形成所必需的(图4，E、F和G)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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序列表
<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
<120> ITGA2基因在调控猪米色脂肪形成中的应用
<130> KHP211124745.7
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcaagagauu ccgcuuauu 19

Claims (2)

1.ITGA2基因的以下任一应用：
1)用于低脂优质猪品种的育种；
2)用于构建米色脂肪动物模型；
3)制备用于构建米色脂肪动物模型的试剂盒；
其中，ITGA2基因在NCBI上的参考序列编号为397483。
2.ITGA2基因抑制剂在构建米色脂肪动物模型中的应用；
其中，ITGA2基因抑制剂是能够从转录或翻译水平上抑制ITGA2基因表达的物质，所述抑制剂为siRNA；
ITGA2基因在NCBI上的参考序列编号为397483。
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