CN107532173A - 靶向中枢神经系统的aav载体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及靶向中枢神经系统的嵌合AAV衣壳，包含所述嵌合AAV衣壳的病毒载体，和使用所述载体以靶向中枢神经系统的方法。本发明还涉及靶向少突胶质细胞的嵌合AAV衣壳，包含所述嵌合AAV衣壳的病毒载体，和使用所述载体以靶向少突胶质细胞的方法。

Description

靶向中枢神经系统的AAV载体
优先权声明
本申请要求2014年11月21日提交的美国临时申请系列号62/082,897和2015年9月15日提交的美国临时申请系列号62/218,857的权益，其各自的完整内容通过引用结合到本文中。
发明领域
本发明涉及靶向中枢神经系统的嵌合AAV衣壳，包含所述嵌合AAV衣壳的病毒载体和使用所述载体靶向中枢神经系统的方法。本发明还涉及靶向少突胶质细胞的嵌合AAV衣壳，包含所述嵌合AAV衣壳的病毒载体和使用所述载体靶向少突胶质细胞的方法。
发明背景
十几年前腺伴随病毒(AAV)被首次报道有效转导肌肉(Xiao等人, (1996) J. Virol.70:8098-8108)。由外源表达盒和AAV反向末端重复(ITR)序列组成的重组AAV (rAAV)基因组以附加体形式存在于真核细胞中，所述附加体形式负责持续的转基因表达(Schnepp等人, (2003) J. Virol. 77:3495-3504)。AAV载体具有良好安全特性。没有人类疾病与野生型AAV感染有关，并且在rAAV转导后在人类受试者中观察到低毒性(Manno等人, (2003)Blood 101:2963-2972)。
AAV载体已用于中枢神经系统(CNS)病症的临床试验中。尽管已取得一些成功，但天然存在的AAV衣壳缺少对CNS的特异性，和不适合于某些疾病应用。AAV改造和定向进化的最新进展扩展了开发新的AAV血清型的能力，包括具有改变的向性的载体(Gray et al.,(2010) Mol. Ther. 18:570-578)。然而，没有AAV载体能够以对外周器官最小的向性进行广泛的CNS基因转移。
在脑中，大多数AAV载体显示对神经元的优势偏好，对其它细胞类型，例如少突胶质细胞的功效非常低。有效靶向少突胶质细胞的AAV载体尚未开发。
发明简述
本发明部分地基于嵌合AAV衣壳序列的开发，其能够在递送至CNS后以对外周器官最小的向性进行广泛的CNS基因转移。本发明还涉及在Rett综合征受试者中具有提高的转导能力的嵌合AAV衣壳。嵌合衣壳可用于产生在研究或治疗应用中使用的AV载体，其中广泛的CNS基因转移是需要的，而没有大量的载体生物分布至外周器官。
本发明还部分地基于能够在递送至CNS后以对外周器官最小的向性进行少突胶质细胞优选或特异的基因转移的嵌合AAV衣壳序列的开发。嵌合衣壳可用于产生在研究或治疗应用中使用的AAV载体，其中少突胶质细胞基因转移是需要的，而没有大量的载体生物分布至神经元或外周器官。
因此，本发明的一个方面涉及编码AAV衣壳的核酸，所述核酸包含与以下序列具有至少70%同一性的AAV衣壳编码序列：(a) SEQ ID NO:1-43中任一个的核苷酸序列；或(b)编码SEQ ID NO:44-86中任一个的核苷酸序列，以及包含所述核酸的细胞和病毒颗粒。
因此，本发明的一个方面涉及编码AAV衣壳的核酸，所述核酸包含与以下序列具有至少70%同一性的AAV衣壳编码序列：(a) SEQ ID NO: 87-107中任一个的核苷酸序列；或(b) 编码SEQ ID NO: 108-128中任一个的核苷酸序列，以及包含所述核酸的细胞和病毒颗粒。
本发明的另一方面涉及AAV衣壳，其包含与SEQ ID NO:44-86中任一个具有至少90%同一性的氨基酸序列，以及包含AAV载体基因组和本发明的AAV衣壳的AAV颗粒。
本发明的另一方面涉及AAV衣壳，其包含与SEQ ID NO: 108-128中任一个具有至少90%同一性的氨基酸序列，以及包含AAV载体基因组和本发明的AAV衣壳的AAV颗粒。
本发明的另外方面涉及产生包含AAV衣壳的重组AAV颗粒的方法，所述方法包括：在体外向细胞提供本发明的核酸、AAV rep编码序列、包含异源核酸的AAV载体基因组、和用于生成生产性AAV感染的辅助功能；并允许包含AAV衣壳和将AAV载体基因组壳体化的重组AAV颗粒的装配。
本发明的额外方面涉及药物制剂，其包含在制药上可接受的载体中的本发明的核酸、病毒颗粒、AAV衣壳或AAV颗粒。
本发明的另一方面涉及将目的核酸递送到CNS细胞的方法，所述方法包括使所述细胞接触本发明的AAV颗粒。
本发明的另外方面涉及在哺乳动物受试者中将目的核酸递送到CNS细胞的方法，所述方法包括将有效量的本发明的AAV颗粒或药物制剂给予哺乳动物受试者。
本发明的额外方面涉及在哺乳动物受试者中将目的核酸递送到与损害的血脑屏障区域毗邻的CNS区域的方法，所述方法包括将有效量的本发明的AAV颗粒或药物制剂经静脉内给予哺乳动物受试者。
本发明的另一方面涉及在有需要的哺乳动物受试者中治疗CNS功能失调的相关病症的方法，所述方法包括将治疗有效量的本发明的AAV颗粒或药物制剂给予哺乳动物受试者。
本发明的另一方面涉及在有需要的哺乳动物受试者中治疗Rett综合征的方法，所述方法包括将治疗有效量的本发明的AAV颗粒或药物制剂给予哺乳动物受试者。
本发明的另外方面涉及制备具有目的向性特征的AAV衣壳的方法，所述方法包括修饰本发明的AAV衣壳，以插入提供目的向性特征的氨基酸序列。
本发明的一个方面涉及编码AAV衣壳的核酸，所述核酸包含与以下序列具有至少70%同一性的AAV衣壳编码序列：(a) SEQ ID NO:129的核苷酸序列；或(b) 编码SEQ ID NO:130-132中任一个的核苷酸序列，以及包含所述核酸的细胞和病毒颗粒。
本发明的另一方面涉及包含与SEQ ID NO:130-132中任一个具有至少90%同一性的氨基酸序列的AAV衣壳，以及包含AAV载体基因组和本发明的AAV衣壳的AAV颗粒。
本发明的另一方面涉及递送目的核酸至少突胶质细胞的方法，所述方法包括使所述细胞接触本发明的AAV颗粒。
本发明的进一步的方面涉及在哺乳动物受试者中递送目的核酸至少突胶质细胞的方法，所述方法包括给予有效量的本发明的AAV颗粒或药物制剂至哺乳动物受试者。
本发明的另一方面涉及在有需要的哺乳动物受试者中治疗少突胶质细胞功能失调的相关病症的方法，所述方法包括给予治疗有效量的本发明的AAV颗粒或药物制剂至哺乳动物受试者。
本发明的进一步的方面涉及编码包含E532K取代的AAV8衣壳的核酸，以及包含所述核酸的细胞和病毒颗粒。
本发明的另一方面涉及包含E532K取代的AAV8衣壳，以及包含AAV载体基因组和本发明的AAV衣壳的AAV颗粒。
本发明的另一方面涉及递送目的核酸至少突胶质细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与本发明的AAV颗粒接触。
本发明的进一步的方面涉及在哺乳动物受试者中递送目的核酸至少突胶质细胞的方法，所述方法包括给予有效量本发明的AAV颗粒或药物制剂至哺乳动物受试者。
本发明的另一方面涉及在有需要的哺乳动物受试者中治疗少突胶质细胞功能失调的相关病症的方法，所述方法包括给予治疗有效量的本发明的AAV颗粒或药物制剂至哺乳动物受试者。
本发明的这些和其它方面在以下本发明描述中更详细地阐述。
附图简述
图1显示自野生型小鼠的脊髓分离的AAV衣壳克隆的嵌合结构。
图2显示自野生型小鼠的脑分离的AAV衣壳克隆的嵌合结构。
图3显示自Rett综合征小鼠分离的AAV衣壳克隆的嵌合结构。
图4A-4E显示分离的克隆的向性。
图5显示分离的克隆的向性。
图6显示分离的克隆的向性。
图7显示分离的克隆的转导效率。
图8显示分离的克隆的MeCP2向性。
图9显示分离的克隆的NeuN向性。
图10A-10E显示Olig001具有少突胶质细胞优选的向性。(A) 与AAV8相比，来自Olig001的cap基因的图示。不同的颜色表示在文库的输入反应中存在的不同的AAV亲本血清型(蓝色=AAV2，紫色=AAV8，红色= AAV9，黄色=AAV1和橙色=AAV6)。黑色垂直棒表示点突变。(B) 显示指示少突胶质细胞的特征的大鼠纹状体中细胞的Olig001转导，包括在纹状斑/基质的斑块中GFP阳性髓磷脂的定位。(C) 较高放大倍率的转导细胞的共焦图像，其再次反映了CNS少突胶质细胞的独特形态学。(D) 共焦图像揭示了在纹状体内缺少GFP阳性细胞与用GFAP (红色)标记的星形胶质细胞的共定位。(E) 共焦图像说明，纹状体内大多数Olig001转导的细胞不与神经元的标记物NeuN (红色)共定位。然而，箭头指示单个GFP/NeuN阳性细胞。
图11显示与AAV8相比，Olig001自外周组织脱靶。成年雌性C57Bl/6小鼠接受静脉内剂量为5x1010 vg (~2.5x1012 vg/kg体重)的Olig001-CBh-GFP (白色棒；n=4)或AAV8-CBh-GFP (灰色棒；n=5)。10天后，GFP基因组/二倍体小鼠基因组(LaminB2)的器官分布通过qPCR确定。误差棒表示平均值的标准误差。
图12A-12G显示具有E532K突变的AAV8是低向性的。(A) 与AAV8/E532K相比，来自Olig001的cap基因的图示。不同的颜色表示不同的AAV亲本血清型(蓝色=AAV2，紫色=AAV8，红色= AAV9，黄色=AAV1和橙色=AAV6)。黑色垂直棒表示点突变。AAV8/E532K用CBh-GFP包装，和将2x108 vg颅内注射至野生型雄性Sprague-Dawley大鼠的纹状体。注射后2周，大鼠经心脏灌注和将它们的脑固定和冠状切片。(B-D) 纹状体的共焦图像表明，GFP阳性细胞缺少与神经元(NeuN)标志物的共定位。(E-G) 纹状体的共焦图像表明，GFP阳性细胞缺少共定位和星形胶质细胞(GFAP)标志物。
图13A-13G显示Olig001少突胶质细胞优选向性不依赖于VP3序列。(A) 与Olig001/AAV VP3相比，来自Olig001的cap基因的图示。不同的颜色表示不同的AAV亲本血清型(蓝色=AAV2，紫色=AAV8，红色= AAV9，黄色=AAV1和橙色=AAV6)。黑色垂直棒表示点突变。具有AAV8的VP3的突变体Olig001 (Olig001/AAV8 VP3)以滴度2x108 vg/μl用CBh-GFP包装，和颅内注射至野生型雄性Sprague-Dawley大鼠的纹状体。两周后，大鼠经心脏灌注，和将它们的脑固定和冠状切片。(B-D) 纹状体的共焦图像表明，GFP阳性细胞显示纹状体的少突胶质细胞形态学和缺少与神经元(NeuN)标志物的共定位。(E-G) 纹状体的共焦图像表明，GFP阳性细胞显示纹状体的少突胶质细胞形态学和缺少共定位和星形胶质细胞(GFAP)标志物。
图14A-14B显示体外结合分析与体内向性一致。体外混合的神经胶质培养物通过离解新生第3天小鼠脑来产生。在4°C下将培养物用等量的AAV8-CBh-GFP或Olig001-CBh-GFP孵育1 h，以允许载体结合，但不摄取。(A) 结合至细胞的载体的量通过对GFP的qPCR定量和标准化至小鼠基因组的LaminB2。误差棒表示平均值的标准误差，*表示P<0.03的显著差异，和**表示P<0.01的显著差异。(B) 与AAV8相比，倍数差异使用对各病毒的平均结合确定。
图15显示结果概述。当输注至成年大鼠纹状体中时，用于本研究的cap基因与体内优势向性，和相对于AAV8的体外结合倍数的图示。不同的颜色表示不同的AAV亲本血清型(蓝色=AAV2，紫色=AAV8，红色= AAV9，黄色=AAV1和橙色=AAV6)。黑色垂直棒表示点突变。ND=未测定，和*表示未显示的数据。
图16显示与AAV8相比，衍生自Olig001的突变体自外周组织脱靶(亦参见图11)。成年雌性C57Bl/6小鼠接受静脉内剂量为5x1010 vg (~2.5x1012 vg/kg体重)的Olig001或如所示的包装sc CBh-GFP基因组的其突变体衍生物之一。10天后，GFP基因组/二倍体小鼠基因组(LaminB2)的器官分布通过qPCR确定。误差棒表示平均值的标准误差。
发明详述
本发明部分地基于能够在递送至CNS后以对外周器官最小的向性进行广泛的CNS基因转移的嵌合AAV衣壳序列的开发。本发明还涉及在Rett综合征受试者中具有提高的转导能力的嵌合AAV衣壳。嵌合衣壳可用于产生在研究或治疗应用中使用的AAV载体，其中广泛的CNS基因转移是需要的，没有大量的载体生物分布至外周器官。
本发明还部分地基于能够在递送至CNS后以对外周器官最小的向性进行少突胶质细胞-优选或特异的基因转移的嵌合AAV衣壳序列的开发。嵌合衣壳可用于产生在研究或治疗应用中使用的AAV载体，其中少突胶质细胞基因转移是需要的，没有大量的载体生物分布至神经元或外周器官。
本发明在以下被更详细地解释。该描述无意为可执行本发明的所有不同方式或可加入本发明的所有特征的详细目录。例如，关于一个实施方案说明的特征可并入其它实施方案，并且关于具体实施方案说明的特征可以从该实施方案删除。另外，鉴于本公开内容，对本文给出的各实施方案的不偏离本发明的许多改动和添加对于本领域技术人员会是显而易见的。因此，以下说明书意在说明本发明的某些具体实施方案，而不是详尽无遗地指定其所有排列、组合及变化。
除非上下文另外指出，否则明确意图的是，本文所述的本发明的多个特征可以任何组合使用。此外，本发明也考虑了在本发明的一些实施方案中，可以排除或省略本文给出的任何特征或特征组合。为了说明，如果说明书声明某复合物包含组分A、B和C，就明确意图的是，A、B或C的任一个或其组合可以单独地或以任何组合来省略和放弃。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域中普通技术人员通常所理解的相同含义。本发明的描述中使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，而无意限制本发明。
除非另外明确指出，否则核苷酸序列在本文中仅通过单链以5'至3'方向从左到右呈现。核苷酸和氨基酸在本文中以IUPAC-IUB生物化学命名委员会(BiochemicalNomenclature Commission)推荐的方式，或(对于氨基酸)通过两者均依照37 C.F.R. §1.822和确定用法的单字母代码或三字母代码表示。
除非另外指出，本领域技术人员已知的标准方法可以用于重组和合成多肽、抗体或其抗原结合片段的制备，对核酸序列的操作，转化细胞的制备，对rAAV构建体、修饰的衣壳蛋白、表达AAV rep和/或cap序列的包装载体以及瞬时转染和稳定转染的包装细胞的构建。这些技术对于本领域技术人员而言是已知的。参见例如SAMBROOK等人, MOLECULARCLONING: A LABORATORY MANUAL 第二版. (Cold Spring Harbor, NY, 1989)；F. M.AUSUBEL等人 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Green PublishingAssociates, Inc.和John Wiley & Sons, Inc., 纽约)。
本文提及的所有出版物、专利申请、专利、核苷酸序列、氨基酸序列和其它参考文献通过引用以其整体结合。
I. 定义
在本发明描述和所附权利要求书中在AAV衣壳亚基的所有氨基酸位置的命名都是关于VP1衣壳亚基编号。
除非上下文另外清楚指出，否则如本发明的描述和所附权利要求书中所用的，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“该（the）”也意在包括复数形式。
如本文使用的“和/或”指的是且包含相关列出项的一个或多个的任何和所有可能组合，以及在备选方案中解释时缺乏组合(“或”)。
此外，本发明也考虑在本发明的一些实施方案中，可以排除或省略本文阐述的任何特征或特征组合。
此外，如本文使用的术语“大约”当提及可测量值例如本发明的化合物或剂的量（剂量、时间、温度等）时，意在包含指定量的±20%、±10%、±5%、±1%、±0.5%、或甚至±0.1%的变化。
本文中关于核酸、蛋白或衣壳结构使用的术语“基本上由……组成”意指所述核酸、蛋白或衣壳结构不包含不同于所列举要素的显著改变(例如超过大约1%、5%或10%)所述核酸、蛋白或衣壳结构的目的功能，例如所述蛋白或衣壳或者由所述核酸编码的蛋白或衣壳的向性特征的任何要素。
在本发明的上下文中的术语“腺伴随病毒”(AAV)包括但不限于AAV 1型、AAV 2型、AAV 3型(包括3A型和3B型)、AAV 4型、AAV 5型、AAV 6型、AAV 7型、AAV 8型、AAV 9型、AAV10型、AAV 11型、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV和羊AAV以及目前已知的或随后发现的任何其它AAV。参见例如BERNARD N. FIELDS等人, VIROLOGY, 第2卷，第69章(第4版,Lippincott-Raven Publishers)。已鉴定出许多另外的AAV血清型和分化枝(参见例如Gao等人, (2004) J. Virol. 78:6381-6388和表1)，其也包括在术语“AAV”中。
各种AAV和自主细小病毒的基因组序列，以及ITR、Rep蛋白、和衣壳亚基的序列是本领域已知的。这些序列可在文献或公用数据库，例如GenBank®数据库中找到。参见例如GenBank®检索号NC 002077、NC 001401、NC 001729、NC 001863、NC 001829、NC 001862、NC000883、NC 001701、NC 001510、AF063497、U89790、AF043303、AF028705、AF028704、J02275、J01901、J02275、X01457、AF288061、AH009962、AY028226、AY028223、NC 001358、NC 001540、AF513851、AF513852、AY530579、AY631965、AY631966；其公开内容以其整体结合到本文中。也参见例如Srivistava等人, (1983) J. Virol.45:555；Chiorini等人, (1998) J. Virol. 71:6823；Chiorini等人, (1999) J. Virol. 73:1309；Bantel-Schaal等人,(1999) J. Virol. 73:939；Xiao等人, (1999) J. Virol. 73:3994；Muramatsu等人,(1996) Virology 221:208；Shade等人, (1986) J. Virol. 58:921；Gao等人, (2002)Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99:11854；国际专利公开 WO 00/28061、WO 99/61601、WO98/11244；美国专利号 6,156,303；其公开内容以其整体结合到本文中。也参见表1。AAV1、AAV2和AAV3末端重复序列的早期描述由下文提供：Xiao, X., (1996),“Characterization of Adeno- associated virus (AAV) DNA replication andintegration（腺伴随病毒（AAV）DNA复制和整合的表征）” Ph.D. Dissertation,University of Pittsburgh, Pittsburgh, PA (以其整体结合到本文中)。
表1
。
“嵌合”AAV核酸衣壳编码序列或AAV衣壳蛋白是将两个或更多个衣壳序列的一部分组合的AAV核酸衣壳编码序列或AAV衣壳蛋白。“嵌合”AAV病毒粒或颗粒包含嵌合AAV衣壳蛋白。
本文使用的术语“向性”指病毒优先进入某些(某种)细胞或组织类型内和/或促进进入某些细胞或组织类型的与细胞表面的优先相互作用，其任选和优选随后为由病毒基因组携带的序列在细胞中的表达(例如转录和任选翻译)，例如对于重组病毒，异源核苷酸序列的表达。本领域技术人员应当意识到，来自病毒基因组的异源核酸序列的转录在不存在例如用于诱导型启动子或另外调节的核酸序列的反式作用因子的情况下可能不起始。在rAAV基因组的情况下，来自病毒基因组的基因表达可以来自稳定整合的原病毒和/或来自未整合的附加体，以及病毒核酸可以在细胞内采取的任何其它形式。
术语“向性特征”是指一种或多种靶细胞、组织和/或器官的转导模式。嵌合AAV衣壳的代表性实例具有向性特征，其特征在于CNS细胞的有效转导，并且仅有外周器官的低转导。
本文使用的术语“对CNS细胞特异的”，是指病毒载体，其当直接给予CNS时，优先转导CNS的所有细胞类型，并且最小转导CNS外的细胞。在一些实施方案中，至少约80%的转导细胞是CNS细胞，例如至少约85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或更多是CNS细胞。
本文使用功能的术语“CNS功能失调的相关病症”是指疾病、病症或损伤，其中CNS细胞受损伤，损失或不适当地发挥功能。该术语包括其中CNS细胞直接受到影响的疾病、病症和损伤，以及其中CNS细胞继发于其它细胞的损伤(例如，心肌梗死或中风)而变得功能失调的疾病、病症和损伤。
本文使用的术语“对少突胶质细胞特异的”是指这样的病毒载体：当直接给予CNS时，相比神经元、星形细胞和其它CNS细胞种类，优先转导少突胶质细胞。在某些实施方案中，至少大约80%的转导细胞是少突胶质细胞，例如至少大约85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的少突胶质细胞。
本文使用的术语“少突胶质细胞功能失调的相关病症”是指其中少突胶质细胞被伤损、损失或不适当地起作用的疾病、病症或损伤。该术语包括少突胶质细胞受到直接影响的疾病、病症和损伤，以及继发于其它细胞的损伤(例如脊髓损伤)后少突胶质细胞变得功能失调的疾病、病症和损伤。
本文使用的术语“与损害的血脑屏障区域毗邻”是指临近其中屏障功能已经损害的血脑屏障的一部分的CNS细胞。
如本文所用的，通过病毒载体(例如AAV载体)的细胞“转导”意指通过将核酸并入病毒载体且随后经由该病毒载体转移入细胞而使该载体进入细胞并将遗传物质转移入细胞内。
除非另外指出，否则“有效转导”或“有效向性”或类似术语，可通过参考合适的阳性或阴性对照而确定(例如，分别为阳性对照的至少约50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或更多的转导或向性，或者分别为阴性对照的至少约110%、120%、150%、200%、300%、500%、1000%或更多的转导或向性)。
同样，通过参考合适对照可以确定病毒对于靶组织是否“未有效转导”或“不具有有效向性”或类似术语。在具体的实施方案中，所述病毒载体未有效转导CNS外的组织，例如肝、肾、性腺和/或生殖细胞(即对其不具有有效向性)。在具体的实施方案中，不期望的组织(例如肝)转导是所需靶组织(例如，CNS细胞)的转导水平的20%或更少、10%或更少、5%或更少、1%或更少、0.1%或更少。
除非另外指出，否则本文所用的术语“多肽”包括肽和蛋白二者。
“核酸”或“核苷酸序列”是核苷酸碱基序列，并且可以是RNA、DNA或DNA-RNA杂合序列(包括天然存在的和非天然存在的核苷酸两者)，但优选是单链或双链DNA序列。
如本文所用的“分离的”核酸或核苷酸序列(例如，“分离的DNA”或“分离的RNA”)意指以下核酸或核苷酸序列，其与天然存在的生物或病毒的其它组分的至少一些分离，或基本上不含天然存在的生物或病毒的其它组分的至少一些，所述其它组分例如细胞或病毒结构组分或通常发现与所述核酸或核苷酸序列相关的其它多肽或核酸。
同样，“分离的”多肽是指以下多肽，其与天然存在的生物或病毒的其它组分的至少一些分离，或基本上不含天然存在的生物或病毒的其它组分的至少一些，所述其它组分例如细胞或病毒结构组分或通常发现与所述多肽相关的其它多肽或核酸。
术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment of)”(或其语法上等同的术语)意指受试者病况的严重性被降低或至少部分改善或改进和/或实现在至少一种临床症状方面的一些减轻、缓解或减少和/或存在在病况进展中的延迟和/或疾病或病症发作的预防或延迟。
本文使用的术语“预防(prevent)”、“预防(prevents)”或“预防(prevention)”(和其语法上的等同物)是指疾病或病症的发作的延迟，或在疾病或病症发作时症状的减轻。该术语不意味着完全消除疾病，和包括减少病况的发生率或延迟病况的发作和/或进展的任何类型的预防性治疗。
本文使用的“有效”或“治疗有效”量是足以对受试者提供一些改善或益处的量。或者说，“有效”或“治疗有效”量是会在受试者的至少一种临床症状中提供一些减轻、缓解或减少的量。本领域技术人员应当意识到，疗效无需是完全的或治愈的，只要对受试者提供一些益处。
“异源核苷酸序列”或“异源核酸”是并非天然存在于病毒中的序列。通常，异源核酸或核苷酸序列包含编码多肽和/或非翻译RNA的可读框。
“治疗性多肽”可以是以下多肽，其可以缓解或减少因细胞或受试者中的蛋白不存在或缺陷所致的症状。另外，“治疗性多肽”可以是以下多肽，其另外地赋予受试者益处，例如抗癌作用或在移植生存性上的改善。
如本文所用的术语“载体”、“病毒载体”、“递送载体”(和类似术语)通常是指充当核酸递送媒介物的病毒颗粒，并且其包含包装在病毒粒内的病毒核酸(即载体基因组）。本发明的病毒载体包含本发明的嵌合AAV衣壳并且可以包装AAV或rAAV基因组或包括病毒核酸的任何其它核酸。或者，在一些情况中，术语“载体”、“病毒载体”、“递送载体”(和类似术语)可以用于指在没有病毒粒的载体基因组(例如，vDNA)和/或指充当运送者用以递送束缚至衣壳或包装在衣壳内的分子的病毒衣壳。
“重组AAV载体基因组”或“rAAV基因组”是AAV基因组(即vDNA)，其包含至少一个反向末端重复(例如，1、2或3个反向末端重复)和一个或多个异源核苷酸序列。rAAV载体通常以顺式(in cis)保留145碱基末端重复(TR)，以生成病毒；然而，包括部分或完全合成的序列的修饰的AAV TR和非-AAV TR也可用于该目的。所有其它病毒序列是可有可无的，并且可以以反式(in trans)供应(Muzyczka, (1992) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 158:97)。rAAV载体任选包含两个TR (例如，AAV TR)，其通常在异源核苷酸序列的5’和3’端，但不必与之邻接。TR可以彼此相同或不同。载体基因组在其3'或5'端也可含有单个ITR。
术语“末端重复”或“TR”包括形成发夹结构且充当反向末端重复(即，介导所需功能例如复制、病毒包装、整合和/或原病毒拯救等等)的任何病毒末端重复或合成序列。TR可以是AAV TR或非AAV TR。例如，非AAV TR序列例如其它细小病毒(例如犬细小病毒(CPV)、小鼠细小病毒(MVM)、人细小病毒B-19)的那些，或充当SV40复制起点的SV40发夹可以用作TR，其可以进一步通过截短、取代、缺失、插入和/或添加进行修饰。此外，TR可以部分地或完全地是合成的，例如如在Samulski等人的美国专利号5,478,745中所述的“双重D序列”。
“AAV末端重复”或“AAV TR”可以来自任何AAV，其包括但不限于血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11或目前已知的或以后发现的任何其它AAV (参见例如表1)。AAV末端重复无需具有天然末端重复序列(例如天然AAV TR序列可以通过插入、缺失、截短和/或错义突变而改变)，只要末端重复介导所需功能，例如复制、病毒包装、整合和/或原病毒拯救等等。
术语“rAAV颗粒”和“rAAV病毒粒”在这里可互换使用。“rAAV颗粒”或“rAAV病毒粒”包含包装在AAV衣壳内的rAAV载体基因组。
AAV衣壳结构更详细地描述于BERNARD N. FIELDS等人, VIROLOGY, 第2卷, 第69& 70章(第4版, Lippincott-Raven Publishers)。
“基本上保留”某性质，意指保留至少大约75%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%的所述性质(例如，活性或其它可测量的特征)。
II. 靶向CNS的嵌合AAV衣壳
发明人已鉴定了能够以对外周器官最小的向性提供广泛的CNS基因转移的嵌合AAV衣壳结构。因此，本发明的一个方面涉及在受试者，例如野生型受试者，例如不具有CNS病症的受试者中能够提供CNS基因转移的嵌合AAV衣壳结构。在某些实施方案中，本发明涉及编码AAV衣壳的核酸，所述核酸包含与以下序列具有至少70%同一性的AAV衣壳编码序列，基本上由其组成或由其组成：(a) SEQ ID NO:1-43中任一个的核苷酸序列；或(b) 编码SEQ IDNO:44-86中任一个的核苷酸序列；和包含所述嵌合AAV衣壳的病毒。在一些实施方案中，AAV衣壳编码序列与(a)或(b)的核苷酸序列具有至少70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%,77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%,92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%或99%同一性。在另一个实施方案中，AAV衣壳编码序列包含(a)或(b)的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成。
在某些实施方案中，本发明涉及编码AAV衣壳的核酸，所述核酸包含与以下序列具有至少70%同一性的AAV衣壳编码序列的VP1、VP2或VP1/VP2编码部分，基本上由其组成或由其组成：(a) SEQ ID NO:1-43中任一个的核苷酸序列；或(b) 编码SEQ ID NO:44-86中任一个的核苷酸序列；其可操作连接至不同的AAV衣壳编码序列的VP3编码部分；和包含所述嵌合AAV衣壳的病毒。在一些实施方案中，AAV衣壳编码序列的VP1、VP2或VP1/VP2编码部分与(a)或(b)的核苷酸序列的VP1、VP2或VP1/VP2编码部分具有至少70%, 71%, 72%, 73%,74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%,89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%或99%同一性。在另一个实施方案中，AAV衣壳编码序列的VP1、VP2或VP1/VP2编码部分包含(a)或(b)的核苷酸序列的VP1、VP2或VP1/VP2编码部分，基本上由其组成或由其组成。在一些实施方案中，不同的AAV衣壳编码序列的VP3编码部分是野生型衣壳序列(例如AAV8或AAV9)或不同于本发明的任何衣壳序列的嵌合序列。
本发明的另一方面涉及在具有CNS病症的受试者中能够提供CNS基因转移的嵌合AAV衣壳结构，所述病症例如神经发育病症，特别是Rett综合征，例如由编码甲基胞嘧啶结合蛋白2的基因(MECP2)的突变引起的病症。在某些实施方案中，本发明涉及编码AAV衣壳的核酸，所述核酸包含与以下序列具有至少70%同一性的AAV衣壳编码序列，基本上由其组成或由其组成：(a) SEQ ID NO: 87-107中任一个的核苷酸序列；或(b) 编码SEQ ID NO:108-128中任一个的核苷酸序列；和包含所述嵌合AAV衣壳的病毒。在一些实施方案中，AAV衣壳编码序列与(a)或(b)的核苷酸序列具有至少70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%,77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%,92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%或99%同一性。在另一个实施方案中，AAV衣壳编码序列包含(a)或(b)的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成。
在某些实施方案中，本发明涉及编码AAV衣壳的核酸，所述核酸包含与以下序列具有至少70%同一性的AAV衣壳编码序列的VP1、VP2或VP1/VP2编码部分，基本上由其组成或由其组成：(a) SEQ ID NO: 87-107中任一个的核苷酸序列；或(b) 编码SEQ ID NO: 108-128中任一个的核苷酸序列；其可操作连接至不同的AAV衣壳编码序列的VP3编码部分；和包含所述嵌合AAV衣壳的病毒。在一些实施方案中，AAV衣壳编码序列的VP1、VP2或VP1/VP2编码部分与(a)或(b)的核苷酸序列的VP1、VP2或VP1/VP2编码部分具有至少70%, 71%, 72%,73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%,88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%或99%同一性。在另一个实施方案中，AAV衣壳编码序列的VP1、VP2或VP1/VP2部分包含(a)或(b)的核苷酸序列的VP1、VP2或VP1/VP2编码部分，基本上由其组成或由其组成。在一些实施方案中，不同的AAV衣壳编码序列的VP3编码部分是野生型衣壳序列(例如AAV8或AAV9)或不同于本发明的任何衣壳序列的嵌合序列。
SEQ ID NO:44-86和108-128显示了VP1衣壳蛋白序列。在本发明的描述和所附权利要求书中的所有氨基酸位置的命名是关于VP1编号。本领域技术人员会理解AAV衣壳通常也含有较小的VP2和VP3衣壳蛋白。由于AAV衣壳蛋白编码序列的重叠，根据公开的序列所示的VP1序列，VP2和VP3衣壳蛋白的核酸编码序列和氨基酸序列将是显而易见的。具体地讲，VP2起始于SEQ ID NO:1的核苷酸412 (acg)和SEQ ID NO:44的苏氨酸138。VP3起始于SEQID NO:1的核苷酸607 (atg)和SEQ ID NO:44的甲硫氨酸203。在某些实施方案中，包含来自SEQ ID NO:44的序列的分离的VP2和VP3衣壳蛋白以及编码VP2或VP3蛋白或二者的分离的核酸都被考虑。
本发明也提供嵌合AAV衣壳蛋白和嵌合衣壳，其中所述衣壳蛋白包含在SEQ IDNO:44-86和108-128中所示的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成，其中SEQ ID NO:44-86和108-128的衣壳蛋白编码序列内的1个、2个或更少、3个或更少、4个或更少、5个或更少、6个或更少、7个或更少、8个或更少、9个或更少、10个或更少、12个或更少、15个或更少、20个或更少、25个或更少、30个或更少、40个或更少、或50个或更少的氨基酸被另一氨基酸(天然存在的、经修饰的和/或合成的)取代，任选保守氨基酸取代，和/或被缺失和/或存在1个、2个或更少、3个或更少、4个或更少、5个或更少、6个或更少、7个或更少、8个或更少、9个或更少、10个或更少、12个或更少、15个或更少、20个或更少、25个或更少、30个或更少、40个或更少、或50个或更少氨基酸的插入(包括N-末端和C-末端延伸)或取代、缺失和/或插入的任何组合，其中取代、缺失和/或插入不会过分损害包含变体衣壳蛋白或衣壳的病毒粒(例如，AAV病毒粒)的结构和/或功能。例如，在本发明的代表性实施方案中，包含嵌合衣壳蛋白的AAV病毒粒基本上保留包含在SEQ ID NO:44-86和108-128中所示的嵌合衣壳蛋白的嵌合病毒粒的至少一种性质。例如，包含嵌合衣壳蛋白的病毒粒可以基本上保留包含在SEQ IDNO:44-86和108-128中所示的嵌合AAV衣壳蛋白的病毒粒的CNS向性特征。评价生物学性质例如病毒转导的方法是本领域周知的(参见例如实施例)。
保守氨基酸取代是本领域已知的。在具体的实施方案中，保守氨基酸取代包括在以下的一个或多个组内的取代：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和/或苯丙氨酸、酪氨酸。
对本领域技术人员而言显而易见的是，SEQ ID NO:44-86和108-128的嵌合AAV衣壳蛋白的氨基酸序列可以被进一步修饰以掺入本领域已知的其它修饰，以赋予所需性质。作为非限制性可能性，衣壳蛋白可以被修饰以掺入靶向序列(例如，RGD)或者有利于纯化和/或检测的序列。例如，可将衣壳蛋白与谷胱甘肽-S-转移酶、麦芽糖结合蛋白、肝素/硫酸乙酰肝素结合结构域、聚His、配体和/或报告蛋白(例如，绿色荧光蛋白、β-葡萄糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶等)、免疫球蛋白Fc片段、单链抗体、血凝素、c-myc、FLAG表位等的全部或一部分融合，以形成融合蛋白。将靶向肽插入AAV衣壳的方法是本领域已知的(参见例如国际专利公开WO 00/28004；Nicklin等人, (2001) Mol. Ther. 474-181；White等人,(2004) Circulation 109:513-319；Muller等人, (2003) Nature Biotech. 21:1040-1046。
本发明的病毒可以进一步包含双链体化病毒基因组，如在国际专利公开WO 01/92551和美国专利号 7,465,583中所述。
本发明也提供包含本发明的嵌合AAV衣壳蛋白的AAV衣壳和包含该AAV衣壳的病毒颗粒(即病毒粒)，其中所述病毒颗粒包装(即壳体化)载体基因组，任选AAV载体基因组。在具体的实施方案中，本发明提供包含含有本发明的AAV衣壳蛋白的AAV衣壳的AAV颗粒，其中所述AAV衣壳包装AAV载体基因组。本发明也提供包含由本发明的嵌合核酸衣壳编码序列编码的AAV衣壳或AAV衣壳蛋白的AAV颗粒。
在具体的实施方案中，所述病毒粒是包含例如用于递送到细胞的目的异源核酸的重组载体。因此，本发明可用于在体外、离体和在体内将核酸递送到细胞。在代表性的实施方案中，本发明的重组载体可以有利地用于将核酸递送或转移到动物(例如，哺乳动物)细胞。
任何异源核苷酸序列都可以通过本发明的病毒载体递送。目的核酸包括编码多肽、任选治疗性(例如，用于医用或兽用)和/或免疫原性(例如，用于疫苗)多肽的核酸。
在一些实施方案中，所述多肽是刺激CNS细胞，例如神经元、神经胶质细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞和/或室管膜细胞的生长和/或分化的多肽。实例包括但不限于胰岛素样生长因子-1、神经胶质衍生的神经营养因子、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、artemin、neurterin、persephin、脑衍生的神经营养因子、神经生长因子、睫状神经营养因子、转化生长因子α、血小板衍生的生长因子、白血病抑制因子、催乳素、单羧酸转运蛋白1或核因子1A。
治疗性多肽包括但不限于囊性纤维化跨膜调节蛋白(CFTR)、肌营养蛋白(包括肌营养蛋白的小基因或微基因的蛋白产物，参见例如Vincent等人, (1993) Nature Genetics 5:130；美国专利公开号2003017131；Wang等人, (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:13714-9 [小肌营养蛋白]；Harper等人, (2002) Nature Med. 8:253-61[微肌营养蛋白])；小聚集蛋白，层粘连蛋白-α2，肌聚糖(α、β、γ或δ)、Fukutin-相关蛋白、肌肉生长抑制素前肽(myostatin pro-peptide)、滤泡素抑制素、显性失活肌肉生长抑制素、血管生成因子(例如，VEGF、促血管生成素-1或2)、抗凋亡因子(例如，血红素氧化酶-1、TGF-β、促凋亡信号抑制剂例如胱天蛋白酶、蛋白酶、激酶、死亡受体[例如，CD-095]、细胞色素C释放调节剂、线粒体孔打开和膨胀抑制剂)；激活素II型可溶性受体、抗炎多肽例如Ikappa B显性突变型、肌长蛋白（sarcospan）、肌营养相关蛋白、小肌营养相关蛋白、针对肌肉生长抑制素或肌肉生长抑制素前肽的抗体或抗体片段、细胞周期调节剂、Rho激酶调节剂例如Cethrin (其是修饰的细菌C3胞外酶) [可得自BioAxone Therapeutics, Inc.,Saint-Lauren, Quebec, Canada]、BCL-xL、BCL2、XIAP、FLICEc-s、显性失活胱天蛋白酶-8、显性失活胱天蛋白酶-9、SPI-6 (参见例如美国专利申请号20070026076)、转录因子PGC-α1、Pinch基因、ILK基因和胸腺素β4基因)、凝血因子(例如，因子VIII、因子IX、因子X等)、红细胞生成素、血管抑素、内皮抑制素、过氧化氢酶、酪氨酸羟化酶、胞内和/或胞外超氧化物歧化酶、瘦蛋白、LDL受体、中性溶酶、脂蛋白脂酶、鸟氨酸转氨甲酰酶、β-珠蛋白、α-珠蛋白、血影蛋白、α1-抗胰蛋白酶、甲基胞嘧啶结合蛋白2、腺苷脱氨酶、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、β-葡糖脑苷脂酶、鞘磷脂酶，溶酶体氨基己糖苷酶A、支链酮酸脱氢酶、RP65蛋白、细胞因子(例如，α-干扰素、β-干扰素、干扰素-γ、白介素-1至-14、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、淋巴毒素等)、肽生长因子、神经营养因子和激素(例如，生长激素、胰岛素、胰岛素样生长因子包括IGF-1和IGF-2、GLP-1、血小板衍生的生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、神经营养因子–3和–4、脑衍生的神经营养因子、神经胶质衍生的生长因子、转化生长因子–α和–β等)、骨形态发生蛋白(包括RANKL和VEGF)、溶酶体蛋白、谷氨酸受体、淋巴因子、可溶性CD4、Fc受体、T细胞受体、ApoE、ApoC、蛋白磷酸酶抑制剂1抑制剂1(I-1)、受磷蛋白、serca2a、溶酶体酸α-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶A、Barkct、β2-肾上腺素能受体、β2-肾上腺素能受体激酶(BARK)、磷酸肌醇-3激酶(PI3激酶)、calsarcin、受体(例如，肿瘤坏死生长因子-α可溶性受体)、抗炎因子例如IRAP、Pim-1、PGC-1α、SOD-1、SOD-2、ECF-SOD、激肽释放酶、胸腺素-β4、低氧诱导的转录因子[HIF]、血管生成因子、S100A1、小白蛋白、腺苷酸环化酶6型、实现G-蛋白偶联受体激酶2型敲减(knockdown)的分子例如截短的组成型活化bARKct；受磷蛋白抑制性或显性失活分子例如受磷蛋白S16E、单克隆抗体(包括单链单克隆抗体)或自杀基因产物(例如，胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、白喉毒素和肿瘤坏死因子例如TNF-α)、以及在有需要的受试者中具有疗效的任何其它多肽。
编码多肽的异源核苷酸序列包括编码报告多肽(例如酶)的那些。报告多肽是本领域已知的，和包括但不限于荧光蛋白(例如EGFP、GFP、RFP、BFP、YFP或dsRED2)、产生可检测产物的酶例如萤光素酶(例如来自Gaussia, Renilla或Photinus)、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、碱性磷酸酶和氯霉素乙酰转移酶基因，或可直接检测的蛋白。事实上任何蛋白可通过使用例如对所述蛋白特异性的抗体直接检测。适合于阳性或阴性选择真核细胞的另外的标记物(和相关的抗生素)公开于Sambrook和Russell (2001), Molecular Cloning,3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.和Ausubel et al. (1992), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, 包括定期更新的资料。
或者，所述异源核酸可以编码功能性RNA，例如反义寡核苷酸、核酶(例如，如描述于美国专利号5,877,022)、影响剪接体介导的反式剪接的RNA(参见, Puttaraju等人,(1999) Nature Biotech. 17:246；美国专利号 6,013,487；美国专利号 6,083,702)、介导基因沉默的包括小干扰RNA (siRNA)的干扰RNA (RNAi) (参见Sharp等人, (2000)Science 287:2431)、微RNA或其它非翻译的“功能性” RNA，例如“指导”RNA (Gorman等人,(1998) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95:4929；授予Yuan等人的美国专利号5,869,248)等。例示性的非翻译RNA包括针对多重耐药性(MDR)基因产物(例如，以治疗肿瘤和/或用于给予心脏以预防因化疗所致的损伤)的RNAi或反义RNA、针对肌肉生长抑制素的RNAi或反义RNA (杜氏或贝克尔氏肌营养不良)、针对VEGF或包括但不限于本文中明确描述的那些肿瘤免疫原的肿瘤免疫原(以治疗肿瘤)的RNAi或反义RNA、靶向突变的肌营养蛋白(杜氏或贝克尔氏肌营养不良)的RNAi或反义寡核苷酸、针对乙型肝炎表面抗原基因(以预防和/或治疗乙型肝炎感染)的RNAi或反义RNA、针对HIV tat和/或rev基因(以预防和/或治疗HIV)的RNAi或反义RNA和/或针对来自病原体的任何其它免疫原(以保护受试者免于病原体)或针对缺陷基因产物(以预防或治疗疾病)的RNAi或反义RNA。针对上述靶标或任何其它靶标的RNAi或反义RNA也可用作研究试剂。
如本领域中已知，反义核酸(例如，DNA或RNA)和抑制性RNA(例如，微RNA和RNAi例如siRNA或shRNA)序列可用于在因肌营养蛋白基因的缺陷所致的肌营养不良患者中诱导“外显子跳跃”。因此，所述异源核酸可以编码反义核酸或抑制性RNA，其诱导合适的外显子跳跃。本领域技术人员会意识到，具体的外显子跳跃方法取决于肌营养蛋白基因的根本缺陷的性质，并且各种这类策略是本领域已知的。例示性的反义核酸和抑制性RNA序列靶向肌营养蛋白外显子中的一个或多个(例如，外显子19或23)的上游分支点和/或下游供体剪接位点和/或内部剪接增强子序列。例如，在具体的实施方案中，所述异源核酸编码定向针对肌营养蛋白基因的外显子19或23的上游分支点和下游剪接供体位点的反义核酸或抑制性RNA。这样的序列可被并入AAV载体，其递送修饰的U7 snRNA和反义核酸或抑制性RNA (参见例如Goyenvalle等人, (2004) Science 306:1796-1799)。作为另一策略，可将修饰的U1snRNA同与肌营养蛋白外显子(例如，外显子19或23)上游和下游剪接位点互补的siRNA、微RNA或反义RNA一起并入AAV载体(参见例如Denti等人, (2006) Proc. Nat. Acad. Sci.USA 103:3758-3763)。此外，反义核酸和抑制性RNA可以靶向外显子19、43、45或53内的剪接增强子序列(参见例如美国专利号6,653,467；美国专利号6,727,355；和美国专利号6,653,466)。
核酶是RNA-蛋白复合物，其以位点特异性方式切割核酸。核酶具有特异性催化结构域，其具有核酸内切酶活性(Kim等人, (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:8788；Gerlach等人, (1987) Nature 328:802；Forster和Symons, (1987) Cell 49:211)。例如，大量核酶以高度特异性加速磷酸酯转移反应，通常仅切割寡核苷酸底物中的若干磷酸酯之一(Michel和Westhof, (1990) J. Mol. Biol. 216:585；Reinhold-Hurek和Shub, (1992)Nature 357:173)。该特异性被归因于以下需要：在化学反应前，底物通过特异性碱基配对相互作用与核酶的内部指导序列(“IGS”)结合。
主要已观察到核酶催化作为涉及核酸的序列-特异性切割/连接反应的一部分(Joyce, (1989) Nature 338:217)。例如，美国专利号5,354,855报道某些核酶可以充当序列特异性大于已知核糖核酸酶的序列特异性并接近DNA限制酶的序列特异性的核酸内切酶。因此，序列特异性核酶介导的对核酸表达的抑制可特别适合于治疗性应用(Scanlon等人, (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10591；Sarver等人, (1990) Science247:1222；Sioud等人, (1992) J. Mol. Biol. 223:831)。
微RNA (mir)是可通过控制mRNA的稳定性调节多种基因表达的天然细胞RNA分子。特定微RNA的过量表达或减少可用于治疗功能失调并已显示在许多疾病状态和疾病的动物模型中为有效的(参见例如Couzin, (2008) Science 319:1782-4)。嵌合AAV可用于将微RNA递送入细胞、组织和受试者中用于治疗遗传性和获得性疾病，或增强某些组织的功能性并促进某些组织的生长。例如，mir-1、mir-133、mir-206和/或mir-208可用于治疗心脏和骨骼肌疾病(参见例如Chen等人, (2006) Genet. 38:228-33；van Rooij等人, (2008)Trends Genet. 24:159-66)。微RNA也可用于在基因递送后调节免疫系统(Brown等人,(2007) Blood 110:4144-52)。
如本文所用的术语“反义寡核苷酸”(包括“反义RNA”)是指与给定的DNA或RNA序列互补并与之特异性杂交的核酸。反义寡核苷酸和编码反义寡核苷酸的核酸可以按照常规技术制备。参见例如授予Tullis的美国专利号5,023,243；授予Pederson等人的美国专利号5,149,797。
本领域技术人员会意识到，反义寡核苷酸不必与靶序列完全互补，只要序列相似性程度足以让反义核苷酸序列与其靶标特异性杂交(如上定义)并减少蛋白产物的产生(例如，达至少大约30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多)。
为了确定杂交的特异性，这些寡核苷酸与靶序列的杂交可以在减少的严格性、中等严格性或甚至严格的条件下进行。用于达到减少的、中等的和严格的杂交条件的合适条件如本文所述。
或者说，在具体的实施方案中，本发明的反义寡核苷酸与靶序列的互补物具有至少大约60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%或更高序列同一性并减少蛋白产物的产生(如上定义)。在一些实施方案中，与靶序列相比，所述反义序列含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个错配。
确定核酸序列的百分比同一性的方法更详细地描述于本文别处。
反义寡核苷酸的长度并不重要，只要它与预期靶标特异性杂交并减少蛋白产物的产生(如上定义)并且可以按照常规程序来确定。一般而言，反义寡核苷酸长度为至少大约8、10或12或15个核苷酸和/或长度为小于大约20、30、40、50、60、70、80、100或150个核苷酸。
RNA干扰(RNAi)是用于减少蛋白产物的产生的另一种有用的方法(例如，shRNA或siRNA)。RNAi是转录后基因沉默的机制，其中对应于目的靶序列的双链RNA (dsRNA)被引入细胞或生物体中，导致对应的mRNA的降解。RNAi实现基因沉默的机制已综述于：Sharp等人,(2001) Genes Dev 15: 485-490；和Hammond等人, (2001) Nature Rev. Gen. 2:110-119)。RNAi作用持续多次细胞分裂才恢复基因表达。RNAi因此是用于在RNA水平上进行靶向敲除或“敲减”的强大的方法。RNAi已在人体细胞包括人胚肾和HeLa细胞中被证明是成功的(参见例如Elbashir等人, Nature (2001) 411:494-8)。
在哺乳动物细胞中使用RNAi的最初尝试导致涉及响应于dsRNA分子的PKR的抗病毒防御机制(参见例如Gil等人, (2000) Apoptosis 5:107)。其后已经证明了大约21个核苷酸的短的合成dsRNA(称为“短干扰RNA” (siRNA))可以在哺乳动物细胞中介导沉默而不触发抗病毒反应(参见例如Elbashir等人, Nature (2001) 411:494-8；Caplen等人,(2001) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 98:9742)。
RNAi分子(包括siRNA分子)可以是短发夹RNA (shRNA；参见Paddison等人,(2002), Proc. Nat. Acad. Sci.USA 99:1443-1448)，其据信在细胞中通过RNase III样酶切酶(Dicer)的作用被加工成20-25聚体的siRNA分子。shRNA通常具有茎-环结构，其中两个反向重复序列被环出的短间隔序列分隔开。已有报告具有长度范围为3-23个核苷酸的环的shRNA。环序列通常并不重要。例示性的环序列包括以下基序：AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU、CCACACC和UUCAAGAGA。
RNAi可以进一步包含环状分子，其包括每侧具有两个环区的有义和反义区，以在dsRNA形成时在有义和反义区之间形成“哑铃”形状的结构。该分子可以在体外或在体内被加工以释放dsRNA部分，例如siRNA。
国际专利公开WO 01/77350描述了用于双向转录以在真核细胞中产生异源序列的有义和反义转录物二者的载体。该技术可以用于产生RNAi用于本发明的用途。
Shinagawa等人, (2003) Genes Dev. 17:1340报道了从CMV启动子(pol II启动子)表达长dsRNA的方法，该方法也可适用于组织特异性pol II启动子。同样，Xia等人,(2002) Nature Biotech. 20:1006的方法避免了多腺苷酸加尾并且可连同组织特异性启动子使用。
产生RNAi的方法包括化学合成、体外转录、经切酶的长dsRNA消化(体外或在体内)、自递送载体的体内表达、和自PCR-衍生的RNAi表达盒的体内表达(参见例如TechNotes10(3) “Five Ways to Produce siRNAs（产生siRNA的五种方法）,”来自Ambion, Inc.,Austin TX；可得自www.ambion.com)。
设计siRNA分子的指南是可得的(参见例如来自以下的文献：Ambion, Inc.,Austin TX；可得自www.ambion.com)。在具体的实施方案中，siRNA序列具有大约30-50% G/C含量。此外，如果RNA聚合酶III用于转录该RNA的话，通常避免大于4个T或A残基的长链段。在线siRNA靶发现者是可用的，例如从Ambion, Inc. (www.ambion.com)，通过WhiteheadInstitute of Biomedical Research (www.jura.wi.mit.edu)或从Dharmacon Research,Inc. (www.dharmacon.com)。
RNAi分子的反义区可以与靶序列完全互补，但不必如此，只要它与靶序列特异性杂交(如上定义)并减少蛋白产物的产生(例如，达至少大约30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多)。在一些实施方案中，这些寡核苷酸与靶序列的杂交可以在如上定义的减少的严格性、中等严格性或甚至严格性条件下进行。
在其它实施方案中，RNAi的反义区与靶序列的互补物具有至少大约60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%或更高序列同一性并减少蛋白产物的产生(例如，达至少大约30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多)。在一些实施方案中，与靶序列相比，所述反义区含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个错配。错配通常在dsRNA末端比在中间部位更好地被耐受。
在具体的实施方案中，所述RNAi是通过两个分开的有义和反义分子之间的分子间复合而形成。所述RNAi包含通过两个分开的链间的分子间碱基配对而形成的ds区。在其它实施方案中，所述RNAi包含通过包含通常作为反向重复的有义区和反义区两者的单一核酸分子内的分子内碱基配对而形成的ds区(例如，shRNA或其它茎环结构、或环状RNAi分子)。所述RNAi可以进一步包含有义区和反义区之间的间隔区。
通常，RNAi分子是高度选择性的。如有期需的话，本领域技术人员可以通过搜索相关数据库以鉴定与其它已知序列没有实质上的序列同源性的RNAi序列，例如，使用BLAST(可得自www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)而容易地消除可能干扰不同于靶标的核酸的表达的候选RNAi。
用于产生RNAi的试剂盒是例如从New England Biolabs, Inc.和Ambion, Inc商售可得的。
所述重组病毒载体也可包含与宿主染色体上的基因座共享同源性并与之重组的异源核苷酸序列。该方法可用于纠正宿主细胞中的遗传缺陷。
本发明也提供表达免疫原性多肽的重组病毒载体，例如用于免疫接种。所述异源核酸可以编码本领域已知的任何目的免疫原，其包括但不限于来自人免疫缺陷病毒、流感病毒、gag蛋白、肿瘤抗原、癌抗原、细菌抗原、病毒抗原等的免疫原。或者，所述免疫原可以存在于病毒衣壳中(例如，并入其中)或束缚到病毒衣壳上(例如，通过共价修饰)。
细小病毒作为疫苗的用途是本领域已知的(参见例如Miyamura等人, (1994)Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:8507；授予Young等人的美国专利号5,916,563, 授予Mazzara等人的5,905,040, 美国专利号5,882,652, 授予Samulski等人美国专利号5,863,541；其公开内容通过引用以其整体结合到本文中)。所述抗原可以存在于病毒衣壳中。或者，所述抗原可以从引入重组载体基因组的异源核酸中表达。
免疫原性多肽或免疫原可以是适于保护受试者免遭疾病的任何多肽，所述疾病包括但不限于微生物性疾病、细菌性疾病、原生动物性疾病、寄生虫性疾病、真菌性疾病和病毒性疾病。例如，所述免疫原可以是正黏病毒免疫原(例如，流感病毒免疫原如流感病毒血凝素(HA)表面蛋白或流感病毒核蛋白基因、或马流感病毒免疫原)、或慢病毒免疫原(例如，马传染性贫血病毒免疫原、猴免疫缺损病毒(SIV)免疫原、或人免疫缺损病毒(HIV)免疫原，例如HIV或SIV被膜GP160蛋白、HIV或SIV基质/衣壳蛋白、和HIV或SIV gag、pol和env基因产物)。所述免疫原也可以是沙粒病毒免疫原(例如，拉沙热病毒免疫原，例如拉沙热病毒核衣壳蛋白基因和拉沙热被膜糖蛋白基因)、痘病毒免疫原(例如，痘苗例如痘苗L1或L8基因)、黄病毒（flavivirus）免疫原(例如，黄热病病毒免疫原或日本脑炎病毒免疫原)、线状病毒免疫原(例如，埃博拉病毒免疫原或马尔堡病毒免疫原，例如NP和GP基因)、布尼亚病毒免疫原(例如，RVFV、CCHF和SFS病毒)、或冠状病毒免疫原(例如，感染性人冠状病毒免疫原，例如人冠状病毒被膜糖蛋白基因、或猪传染性胃肠炎病毒免疫原、或禽感染性支气管炎病毒免疫原、或严重急性呼吸综合征(SARS)免疫原例如S [S1或S2]、M、E、或N蛋白或其免疫原性片段)。所述免疫原可以进一步是脊髓灰质炎免疫原、疱疹免疫原(例如，CMV、EBV、HSV免疫原)、流行性腮腺炎免疫原、麻疹免疫原、风疹免疫原、白喉毒素或其它白喉免疫原、百日咳抗原、肝炎(例如，甲型肝炎、乙型肝炎或丙型肝炎)免疫原或本领域已知的任何其它疫苗免疫原。
或者，所述免疫原可以是任何肿瘤或癌细胞抗原。任选地，所述肿瘤或癌抗原是在癌细胞表面上表达。例示性的癌和肿瘤细胞抗原描述于S.A. Rosenberg, (1999)Immunity 10:281)。说明性的癌和肿瘤抗原包括但不限于：BRCA1基因产物、BRCA2基因产物、gp100、酪氨酸酶、GAGE-1/2、BAGE、RAGE、NY-ESO-1、CDK-4、b-联蛋白、MUM-1、胱天蛋白酶-8、KIAA0205、HPVE、SART-1、PRAME、p15、黑素瘤肿瘤抗原(Kawakami等人, (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3515；Kawakami等人, (1994) J. Exp. Med., 180:347；Kawakami等人, (1994) Cancer Res. 54:3124)，其包括MART-1 (Coulie等人, (1991) J. Exp. Med. 180:35)、gp100 (Wick等人, (1988) J. Cutan. Pathol. 4:201)和MAGE抗原(MAGE-1、MAGE-2和MAGE-3) (Van der Bruggen等人, (1991) Science, 254:1643)、CEA、TRP-1；TRP-2；P-15和酪氨酸酶(Brichard等人, (1993) J. Exp. Med. 178:489)；HER-2/neu基因产物(美国专利号4,968,603)；CA 125；HE4；LK26；FB5 (内皮唾液酸蛋白)；TAG 72；AFP；CA19-9；NSE；DU-PAN-2；CA50；Span-1；CA72-4；HCG；STN (唾液酸Tn抗原)；c-erbB-2蛋白；PSA；L-CanAg；雌激素受体；乳脂球蛋白；p53肿瘤抑制蛋白(Levine, (1993) Ann. Rev. Biochem. 62:623)；黏蛋白抗原(国际专利公开WO 90/05142)；端粒酶；核基质蛋白；前列腺酸性磷酸酶；乳头瘤病毒抗原；和以下癌症相关抗原：黑素瘤、腺癌、胸腺瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、结直肠癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病、子宫癌、乳癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、脑癌、肾癌、胃癌、食道癌、头颈部癌和其它(参见例如Rosenberg, (1996) Annu. Rev. Med. 47:481-91)。
或者，所述异源核苷酸序列可以编码任何多肽，其在体外、离体或在体内在细胞内合意地产生。例如，可将所述病毒载体引入培养细胞并从中分离表达的蛋白产物。
本领域技术人员会理解，可将目的异源核酸与合适的控制序列可操作连接。例如，可将异源核酸与表达控制元件可操作连接，所述元件例如转录/翻译控制信号、复制起点、多腺苷酸化信号、内部核糖体进入位点(IRES)、启动子、增强子等。
本领域技术人员会进一步意识到各种启动子/增强子元件都可以使用，取决于所需的水平和组织特异性表达。启动子/增强子可以是组成型或诱导型的，取决于所需的表达模式。启动子/增强子可以是天然的或外源的，并且可以是天然的或合成的序列。外源的意指转录起始区不存在于其中转录起始区被引入其内的野生型宿主内。
启动子/增强子元件可以对于待处理的靶细胞或受试者是天然的和/或对于异源核酸序列是天然的。启动子/增强子元件一般经选择，使得它在目的靶细胞中起作用。在代表性的实施方案中，启动子/增强子元件是哺乳动物启动子/增强子元件。启动子/增强子元件可以是组成型或诱导型的。
诱导型表达控制元件通常被用于其中希望对异源核酸序列的表达提供调节的那些应用。用于基因递送的诱导型启动子/增强子元件可以是组织特异性或组织优选的启动子/增强子元件，并且包括肌肉特异性或优选的(包括心肌、骨骼肌和/或平滑肌)、神经组织特异性或优选的(包括脑特异性)、眼(包括视网膜特异性和角膜特异性)、肝特异性或优选的、骨髓特异性或优选的、胰腺特异性或优选的、脾特异性或优选的、和肺特异性或优选的启动子/增强子元件。在一个实施方案中，使用CNS细胞-特异性或CNS细胞-优选的启动子。神经元特异性或优选的启动子的实例包括但不限于，神经元特异性烯醇酶、突触蛋白和MeCP2。星形胶质细胞特异性或优选的启动子的实例包括但不限于，神经胶质纤维酸性蛋白和S100β。室管膜细胞特异性或优选的启动子的实例包括但不限于，wdr16、Foxj1和LRP2。小胶质细胞特异性或优选的启动子的实例包括但不限于，F4/80、CX3CR1和CD11b。少突胶质细胞特异性或优选的启动子的实例包括但不限于，髓磷脂碱性蛋白、环状核苷酸磷酸二酯酶、蛋白脂质蛋白、Gtx和Sox10。CNS细胞特异性或优选的启动子的使用可以通过进一步限制异源核酸的表达到CNS而增加经嵌合AAV载体所实现的特异性。其它诱导型启动子/增强子元件包括激素诱导型和金属诱导型元件。例示性诱导型启动子/增强子元件包括但不限于Tet开/关元件、RU486诱导型启动子、蜕皮激素诱导型启动子、雷帕霉素诱导型启动子和金属硫蛋白启动子。
在其中所述异源核酸序列在靶细胞中转录且随后翻译的实施方案中，特异性起始信号通常用于插入的蛋白质编码序列的有效翻译。可以包括ATG起始密码子和相邻序列的这些外源翻译控制序列，可以具有多种天然和合成的来源。
本发明也提供包含AAV衣壳和AAV基因组的嵌合AAV颗粒，其中所述AAV基因组“对应于”(即编码)AAV衣壳。也提供的是这些嵌合AAV颗粒的集合或文库，其中所述集合或文库包含2个或更多、10个或更多、50个或更多、100个或更多、1000个或更多、104个或更多、105个或更多、或106个或更多不同序列。
本发明进一步包括“空”衣壳颗粒(即没有载体基因组)，其包含本发明的嵌合AAV衣壳蛋白、由本发明的嵌合AAV衣壳蛋白组成或基本上由本发明的嵌合AAV衣壳蛋白组成。本发明的嵌合AAV衣壳可用作“衣壳媒介物”，如在美国专利号5,863,541中所述。可与病毒衣壳共价连接、结合或被其包装并转移到细胞中的分子包括DNA、RNA、脂质、碳水化合物、多肽、有机小分子或其组合。此外，分子可以与病毒衣壳外面缔合(例如，“束缚至”)，用于将分子转移至宿主靶细胞中。在本发明的一个实施方案中，将所述分子与衣壳蛋白共价连接(即缀合或化学偶联)。将分子共价连接的方法是本领域技术人员已知的。
本发明的病毒衣壳在产生针对新的衣壳结构的抗体中也找到用途。作为进一步的备选方案，可将外源氨基酸序列插入病毒衣壳，用于将抗原呈递给细胞，例如用于给予受试者以产生对外源氨基酸序列的免疫应答。
本发明也提供编码本发明嵌合病毒衣壳和嵌合衣壳蛋白的核酸(例如，分离的核酸)。进一步提供的是包含所述核酸的载体和包含本发明的核酸和/或载体的细胞(在体内或在培养中)。这样的核酸、载体和细胞可用作例如用于产生如本文所述的病毒载体的试剂(例如，辅助构建体或包装细胞)。
在例示性的实施方案中，本发明提供编码SEQ ID NO:44-86或108-128的AAV衣壳或与SEQ ID NO:1-44或87-107的核苷酸序列具有至少70%同一性的核酸序列。本发明也提供编码如上所述的AAV衣壳变体、衣壳蛋白变体和融合蛋白的核酸。在具体的实施方案中，所述核酸在本领域技术人员已知的标准条件下与本文中明确公开的核酸序列的互补物杂交并编码变体衣壳和/或衣壳蛋白。任选地，所述变体衣壳或衣壳蛋白基本上保留由SEQ IDNO:1-44或87-107的核酸序列编码的衣壳和/或衣壳或衣壳蛋白的至少一种性质。例如，包含所述变体衣壳或变体衣壳蛋白的病毒颗粒可以基本上保留包含由SEQ ID NO:1-44或87-107核酸编码序列编码的衣壳或衣壳蛋白的病毒颗粒的CNS向性特征。
例如，这些序列的杂交可以在减少的严格性、中等严格性或甚至严格性条件的条件下进行。减少的、中等的和严格性杂交的例示性条件如下：(例如，分别地，在37℃下带有5x Denhardt’s溶液、0.5% SDS和1x SSPE的35-40%甲酰胺的洗涤严格性所表示的条件；在42℃下带有5x Denhardt’s溶液、0.5% SDS和1x SSPE的40-45%甲酰胺的洗涤严格性所表示的条件；和在42℃下带有5x Denhardt’s溶液、0.5% SDS和1x SSPE的50%甲酰胺的洗涤严格性所表示的条件）。参见例如Sambrook等人, Molecular Cloning, A Laboratory Manual （分子克隆，实验室手册）(第二版. 1989) (Cold Spring Harbor Laboratory)。
在其它实施方案中，编码本发明变体衣壳或衣壳蛋白的核酸序列与SEQ ID NO:1-44或87-107的核酸序列具有至少大约70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%,79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%,94%, 95%, 96%, 97%, 98%或99%或更高序列同一性，并且任选地编码基本上保留由SEQ IDNO:1-44或87-107的核酸编码的衣壳或衣壳蛋白的至少一种性质的变体衣壳或衣壳蛋白。
如本领域已知，许多不同的程序可用于鉴定核酸或多肽与已知序列是否具有序列同一性。本文使用的百分比同一性意指当使用BLASTN，与另一核酸(或其互补链)最佳比对(具有合适的核苷酸插入或缺失)时，核酸或其片段与另一核酸共享指定的百分比同一性。为了确定两个不同核酸之间的百分比同一性，使用BLASTN程序“BLAST 2序列”确定百分比同一性。此程序对于公众使用可得自互联网上的国立生物技术信息中心(National Centerfor Biotechnology Information (NCBI))(Altschul等人, (1997) Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402)。要用参数是以下产生最高计算的百分比同一性(如下计算)的任意组合，缺省参数显示于括号中：程序--blastn Matrix--0 BLOSUM62匹配奖分--0或1 (1)错配罚分--0, -1, -2或-3 (-2)开放缺口罚分--0, 1, 2, 3, 4或5 (5)延伸缺口罚分--0或1(1)缺口放弃阈值(Gap x_dropoff)--0或50 (50)期望--10。
当提及多肽时，百分比同一性或相似性是指，当与另一蛋白或其一部分在共同长度上比较时，所讨论的多肽表现出经使用BLASTP确定的指定的百分比同一性或相似性。该程序对于公众使用也可得自互联网上的国立生物技术信息中心(NCBI) (Altschul等人,(1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402)。对于多肽，百分比同一性或相似性通常使用序列分析软件来测量。参见例如Genetics Computer Group, University ofWisconsin Biotechnology Center, 910 University Avenue, Madison, Wis. 53705的序列分析软件包。蛋白分析软件使用分配给各种取代、缺失和其它修饰的同源性的衡量值匹配相似序列。保守取代通常包括以下组内的取代：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。
在具体的实施方案中，所述核酸可包含载体、基本上由载体组成或由载体组成，所述载体包括但不限于质粒、噬菌体、病毒载体(例如，AAV载体、腺病毒载体、疱疹病毒载体或杆状病毒载体)、细菌人工染色体(BAC)、或酵母人工染色体(YAC)。例如，所述核酸可包含含有5’和/或3'末端重复(例如，5'和/或3'AAV末端重复)的AAV载体、由包含5’和/或3'末端重复(例如，5'和/或3'AAV末端重复)的AAV载体组成或基本上由包含5'和/或3'末端重复(例如，5'和/或3' AAV末端重复)的AAV载体组成。
在一些实施方案中，编码所述嵌合AAV衣壳蛋白的核酸进一步包含AAV rep编码序列。例如，所述核酸可以是用于产生病毒原种(viral stock)的辅助构建体。
本发明也提供包装细胞，其稳定地包含本发明的核酸。例如，所述核酸可以被稳定地并入细胞的基因组或可以以附加体形式(例如，“基于EBV的核附加体”)稳定地维持。
所述核酸可以被并入递送载体，例如病毒递送载体。为了说明，本发明的核酸可以被包装在AAV颗粒、腺病毒颗粒、疱疹病毒颗粒、杆状病毒颗粒或任何其它合适的病毒颗粒中。
此外，所述核酸可以与启动子元件可操作连接。启动子元件在本文中有更详细描述。
本发明进一步提供产生本发明的病毒载体的方法。在代表性的实施方案中，本发明提供产生重组病毒载体的方法，所述方法包括在体外向细胞提供：(a)模板，其包含(i)异源核酸和(ii)足以将AAV模板壳体化入病毒颗粒的包装信号序列(例如，一个或多个(例如，2个)末端重复，例如AAV末端重复)，和(b)足以复制所述模板并将所述模板壳体化入病毒颗粒的AAV序列(例如，编码本发明AAV衣壳的AAV rep和AAV cap序列)。在使得在细胞中产生包含包装在衣壳内的模板的重组病毒颗粒的条件下提供所述模板和AAV复制和衣壳序列。所述方法可以进一步包括自所述细胞中收集所述病毒颗粒的步骤。可以自培养基和/或通过裂解细胞而收集病毒颗粒。
在一个说明性的实施方案中，本发明提供产生包含AAV衣壳的rAAV颗粒的方法，所述方法包括：在体外向细胞提供编码本发明的嵌合AAV衣壳的核酸、AAV rep编码序列、包含异源核酸的AAV载体基因组、和用于产生生产性AAV感染的辅助功能；并允许包含AAV衣壳和将AAV载体基因组壳体化的AAV颗粒的装配。
所述细胞通常是容许AAV病毒复制的细胞。可以使用本领域已知的任何合适的细胞，例如哺乳动物细胞。提供从复制缺陷型辅助病毒中缺失的功能的反式互补包装细胞系也是合适的，所述细胞系例如293细胞或其它E1a反式互补细胞。
所述AAV复制和衣壳序列可以以本领域任何已知方法提供。现有方案通常在单个质粒上表达AAV rep/cap基因。AAV复制和包装序列不必在一起提供，尽管这样做可以是方便的。AAV rep和/或cap序列可以通过任何病毒或非病毒载体提供。例如，rep/cap序列可通过杂合腺病毒或疱疹病毒载体提供(例如，插入到缺失的腺病毒载体的E1a或E3区)。EBV载体也可用于表达AAV cap和rep基因。该方法的一个优势是EBV载体是附加的，但在连续细胞分裂中一直也会维持高拷贝数(即被稳定地整合到细胞中作为染色体外元件，标示为基于EBV的核附加体。
作为进一步的备选方案，rep/cap序列可以稳定地携带(附加的或整合的)于细胞内。
通常，AAV rep/cap序列将不被AAV包装序列(例如，AAV ITR)侧接，以防这些序列的拯救和/或包装。
所述模板(例如，rAAV载体基因组)可以使用本领域已知的任何方法提供给细胞。例如，所述模板可以由非病毒(例如，质粒)或病毒载体提供。在具体的实施方案中，所述模板由疱疹病毒或腺病毒载体提供(例如，插入到缺失的腺病毒的E1a或E3区)。作为另一说明，Palombo等人, (1998) J. Virol. 72:5025, 描述了携带由AAV ITR侧接的报告基因的杆状病毒载体。EBV载体也可用于递送模板，如上关于rep/cap基因所述。
在另一代表性的实施方案中，所述模板由复制性rAAV病毒提供。在再另外的实施方案中，AAV原病毒被稳定地整合到细胞染色体中。
为了得到最大病毒滴度，生产性AAV感染所必需的辅助病毒功能(例如，腺病毒或疱疹病毒)通常被提供给细胞。AAV复制所需的辅助病毒序列是本领域已知的。通常，这些序列由辅助腺病毒或疱疹病毒载体提供。或者，所述腺病毒或疱疹病毒序列可由另一非病毒或病毒载体提供，例如，作为非感染性腺病毒小质粒，其携带有效AAV产生所需的所有辅助基因，如以下文献所述：Ferrari等人, (1997) Nature Med.3:1295，和美国专利号6,040,183和6,093,570。
此外，所述辅助病毒功能可由具有整合到染色体中的或作为稳定的染色体外元件维持的辅助基因的包装细胞提供。在代表性的实施方案中，所述辅助病毒序列不可被包装入AAV病毒粒中，例如，不由AAV ITR侧接。
本领域技术人员会意识到，在单个辅助构建体上提供AAV复制和衣壳序列和辅助病毒序列(例如，腺病毒序列)可以是有利的。该辅助构建体可以是非病毒或病毒构建体，但任选是包含AAV rep/cap基因的杂合腺病毒或杂合疱疹病毒。
在一个具体实施方案中，AAV rep/cap序列和腺病毒辅助序列由单个腺病毒辅助载体提供。此载体进一步含有rAAV模板。AAV rep/cap序列和/或rAAV模板可以被插入到腺病毒的缺失区(例如，E1a或E3区)。
在进一步的实施方案中，AAV rep/cap序列和腺病毒辅助序列由单个腺病毒辅助载体提供。rAAV模板作为质粒模板提供。
在另一说明性的实施方案中，AAV rep/cap序列和腺病毒辅助序列是由单个腺病毒辅助载体提供，并且rAAV模板作为原病毒整合到细胞。或者，rAAV模板由EBV载体提供，所述载体作为染色体外元件维持在细胞内(例如，作为“基于EBV的核附加体” 参见Margolski, (1992) Curr. Top. Microbiol. Immun. 158:67)。
在另外的例示性的实施方案中，AAV rep/cap序列和腺病毒辅助序列由单一腺病毒辅助者提供。rAAV模板作为单独的复制性病毒载体提供。例如rAAV模板可以由rAAV颗粒或第二重组腺病毒颗粒提供。
根据前述方法，所述杂合腺病毒载体通常包含足够腺病毒复制和包装的腺病毒5'和3'顺式序列(即，腺病毒末端重复和PAC序列)。AAV rep/cap序列和如果存在的话，rAAV模板，被嵌入腺病毒骨架中并且由5'和3'顺式序列侧接，使得这些序列可以被包装入腺病毒衣壳。如上所述，在代表性的实施方案中，所述腺病毒辅助序列和AAV rep/cap序列不被AAV包装序列(例如，AAV ITR)侧接，使得这些序列不被包装入AAV病毒粒。
在AAV包装方法中，疱疹病毒也可用作辅助病毒。编码AAV rep蛋白的杂合疱疹病毒可以有利地促进更可缩放的AAV载体生产方案。表达AAV-2 rep和cap基因的杂合单纯疱疹病毒I型(HSV-1)载体已有描述(Conway等人, (1999) Gene Therapy 6:986和WO 00/17377，其公开内容以其整体结合到本文中)。
作为进一步的备选方案，本发明的病毒载体可以使用杆状病毒载体在昆虫细胞中产生，以递送rep/cap基因和rAAV模板，如以下文献所述：Urabe等人, (2002) Human Gene Therapy 13:1935-43。
产生AAV的其它方法使用稳定转化的包装细胞(参见例如美国专利号5,658,785)。
无污染性辅助病毒的AAV载体原种可通过本领域任何已知方法获得。例如，AAV和辅助病毒可以根据大小容易地区分。AAV还可以基于对于肝素底物的亲和力与辅助病毒分离开(Zolotukhin等人, (1999) Gene Therapy 6:973)。在代表性的实施方案中，使用缺失的复制缺陷辅助病毒使得任何污染性辅助病毒均无复制能力。作为进一步的备选方案，可以采用缺乏晚期基因表达的腺病毒辅助者，因为只有腺病毒早期基因表达是介导AAV包装所必需的。对于晚期基因表达缺陷的腺病毒突变体是本领域已知的(例如，ts100K和ts149腺病毒突变体)。
本发明的包装方法可用于产生高滴度的病毒颗粒原种。在具体的实施方案中，病毒原种具有至少大约105转导单位(tu)/ml、至少大约106tu/ml、至少大约107tu/ml、至少大约108tu/ml、至少大约109tu/ml、或至少大约1010tu/ml的滴度。
新的衣壳蛋白和衣壳结构在产生抗体中找到用途，例如用于诊断性用途或治疗性用途或作为研究试剂。因此，本发明也提供针对本发明的新的衣壳蛋白和衣壳的抗体。
本文使用的术语“抗体”是指所有类型的免疫球蛋白，包括IgG、IgM、IgA、IgD、和IgE。所述抗体可以是单克隆的或多克隆的并且可以具有任何物种来源，包括(例如)小鼠、大鼠、兔、马、山羊、绵羊或人，或可以是嵌合抗体。参见例如Walker等人, Mol. Immunol.26, 403-11 (1989)。所述抗体可以是重组单克隆抗体，例如，按照美国专利号4,474,893或美国专利号4,816,567中公开的方法制备的重组单克隆抗体。所述抗体也可是经化学构建的，例如按照美国专利号4,676,980中公开的方法。
本发明范围内包括的抗体片段包括例如Fab、F(ab')2、和Fc片段、和得自不同于IgG的抗体的相应片段。这些片段可以通过已知技术产生。例如，F(ab´)2片段可以通过胃蛋白酶消化抗体分子产生，而Fab片段可以通过还原F(ab´)2片段的二硫桥而产生。或者，可以构建Fab表达文库以允许快速和容易地鉴定具有所需特异性的单克隆Fab片段(Huse等人,(1989) Science 254, 1275-1281)。
多克隆抗体可以按照已知程序如下制备：通过用单克隆抗体所靶向结合的抗原免疫合适的动物(例如，兔、山羊等)，自动物收集免疫血清，并自免疫血清分离多克隆抗体。
按照以下文献的技术，单克隆抗体可以在杂交瘤细胞系中制备：Kohler和Milstein, (1975) Nature 265, 495-97。例如，可将含有合适抗原的溶液注射入小鼠，并且在足够时间后，处死小鼠并获取脾细胞。然后通常在聚乙二醇存在下，通过将脾细胞与骨髓瘤细胞或淋巴瘤细胞融合，使脾细胞永生化，以产生杂交瘤细胞。然后将杂交瘤细胞在合适的培养基中培养并筛选上清液中的具有所需特异性的单克隆抗体。单克隆Fab片段可以通过本领域技术人员已知的重组技术在大肠杆菌中制备。参见例如W. Huse, (1989)Science 246, 1275-81。
对靶多肽特异的抗体也可通过本领域已知的噬菌体展示技术而获得。
多种免疫测定可用于筛选以鉴定具有所需特异性的抗体。使用具有已确定特异性的多克隆抗体或单克隆抗体的竞争性结合或免疫放射测定的多个方案是本领域众所周知的。这些免疫测定通常涉及抗原及其特异性抗体间的复合物形成(例如，抗原/抗体复合物形成)的测量。可以使用利用与两个非干扰表位反应的单克隆抗体的两位点式基于单克隆的免疫测定和竞争性结合测定。
按照已知技术，可将抗体缀合到固体支持物(例如，由例如乳胶或聚苯乙烯等材料所形成的珠、板、片或孔)。按照已知技术，同样可将抗体直接或间接缀合到可检测基团例如放射性标记(例如，35S、125I、131I)、酶标记(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶)、和荧光标记(例如，荧光素)。在本发明方法中，抗体/抗原复合物形成的确定可通过例如沉淀、凝集、絮凝、放射性、显色或变色、荧光、发光等的检测进行，正如本领域众所周知的那样。
Ⅲ.使用靶向CNS的嵌合AAV衣壳的方法
本发明也涉及将异源核苷酸序列递送到CNS同时使至外周器官的递送最小化的方法。可以使用本发明的病毒载体，以将目的核苷酸序列在体外递送到CNS细胞，例如，以在体外产生多肽或核酸或用于离体基因治疗。所述载体额外地可用于将核苷酸序列递送给有需要的受试者例如以表达治疗性或免疫原性多肽或核酸的方法。以此方式，可因此在受试者体内产生所述多肽或核酸。所述受试者可以是需要所述多肽或核酸，因为该受试者缺乏所述多肽，或因为在该受试者中的所述多肽或核酸的产生可给予某些疗效，作为治疗方法或其它，并且如以下进一步所解释。
在具体的实施方案中，所述载体可用于表达多肽或核酸，所述多肽或核酸为CNS提供有益作用，例如，促进神经元或神经胶质细胞的生长和/或分化。将载体靶向CNS的能力可以特别可用于治疗涉及CNS功能失调的疾病或病症。在其它实施方案中，所述载体可用于表达为CNS中的细胞(例如，神经元和/或神经胶质细胞)提供有益作用的多肽或核酸。
因此，本发明的一方面涉及将目的核酸递送到CNS细胞的方法，所述方法包括使CNS细胞接触本发明的AAV颗粒。
在另一方面中，本发明涉及在哺乳动物受试者中将目的核酸递送到CNS细胞的方法，所述方法包括将有效量的本发明的AAV颗粒或药物制剂给予哺乳动物受试者。
本发明的另外方面涉及在有需要的受试者中治疗CNS功能失调的相关病症的方法，所述方法包括将治疗有效量的本发明的AAV颗粒给予受试者。
CNS病症包括但不限于思考和认知障碍例如精神分裂症和谵妄；健忘障碍；心境障碍，例如情感障碍和焦虑障碍(包括创伤后应激障碍、分离焦虑障碍、选择性缄默、反应性依恋障碍、刻板运动障碍、惊恐障碍、广场恐怖症、特定恐怖症、社交恐怖症、强制性障碍、急性应激障碍、广泛性焦虑障碍、物质诱导的焦虑障碍和/或未另行指明的焦虑障碍)；社会行为障碍；学习和记忆障碍，例如学习障碍(例如，诵读困难)；运动技能障碍；沟通障碍(例如，口吃)；广泛性发育障碍(例如，孤独症、Rett's障碍(Rett综合征)、童年期瓦解性障碍、阿斯伯格障碍(Asperger's disorder)、和/或未另行指明的广泛性发育障碍)和痴呆。因此，术语“中枢神经系统病症”包括以上所列的病症以及抑郁障碍(包括重度抑郁障碍、心境恶劣障碍、未另行指明的抑郁障碍、产后忧郁症)；季节性情感障碍；躁狂症；双相性精神障碍(包括双相I型障碍、双相II型障碍、循环性情感障碍、未另行指明的双相性精神障碍)；注意力缺陷和破坏性行为障碍(包括注意力缺陷障碍伴有多动症、品行障碍、对立违抗性障碍和/或未另行指明的破坏性行为障碍)；药物成瘾/物质滥用(包括阿片类、苯丙胺、酒精、致幻剂、大麻、吸入剂、苯环己哌啶、镇定剂、催眠药、抗焦虑药和/或可卡因的滥用)；酒精诱发的病症；苯丙胺诱发的病症；咖啡因诱发的病症；大麻诱发的病症；可卡因诱发的病症；致幻剂诱发的病症；吸入剂诱发的病症；烟碱诱发的病症；阿片类诱发的病症；苯环己哌啶诱发的病症；镇静剂、催眠药或抗焦虑药诱发的病症；激动；冷漠；精神病；易怒；脱抑制；精神分裂样障碍；情感分裂障碍；妄想障碍；短时精神障碍、共享精神障碍；物质诱发的精神障碍；未另行指明的精神障碍；单极障碍、心境障碍(例如，伴精神病特点的心境障碍)；躯体形式障碍；造作性障碍；分离性障碍(disassociative disorder)；智力迟钝；婴儿或幼儿的喂食和进食障碍；进食障碍例如神经性厌食症、神经性贪食和/或未另行指明的进食障碍；睡眠障碍(例如，睡眠失调例如原发性失眠、原发性睡眠过度、发作性睡病、呼吸相关的睡眠障碍和生理节律睡眠障碍和/或异态睡眠)；冲动控制障碍(例如，盗窃癖、纵火狂、拔毛癖、病态赌博和/或间歇性暴发障碍)；适应障碍；人格障碍(例如，妄想狂样的人格障碍、分裂样人格障碍、分裂型人格障碍、反社会人格障碍、边缘人格障碍、癔症样人格障碍、自恋型人格障碍、回避型人格障碍、依赖型人格障碍和/或强制性人格障碍)；抽搐障碍(例如，图雷特氏障碍(Tourette's disorder)、慢性运动或发声抽搐障碍、短暂性抽搐障碍和/或未另行指明的抽搐障碍)；排泄性障碍；和上述的任何组合以及以下文献所述的任何其它病症或病症组：Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders（精神症的诊断和统计手册）-第4版(DSM-IV；the American Psychiatric Association, Washington D.C.,1994)。“中枢神经系统病症”也包括涉及CNS的其它病况，包括但不限于神经变性疾病例如阿尔茨海默病、不随意运动障碍例如帕金森病、亨廷顿舞蹈病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)等。其它CNS病症包括但不限于癫痫、多发性硬化、神经性疼痛、精神性疼痛、和偏头痛。
在一个实施方案中，CNS功能失调的相关病症是脱髓鞘疾病。在一个实施方案中，CNS功能失调的相关病症是多发性硬化、佩利措伊斯-梅茨巴赫病、克拉伯病、异染性脑白质营养不良、肾上腺脑白质营养不良、卡纳万病、亚历山大病、正染脑白质营养不良、Zellweger病、18q-综合征、脑麻痹、脊髓损伤、创伤性脑损伤、中风、苯丙酮尿或病毒感染，或已知或后来发现与CNS功能失调有关的任何其它病症。在另一个实施方案中，本发明的方法用于治疗与CNS功能失调不直接相关，但通过在CNS细胞中表达异源多肽或核酸会获益的病症。实例包括但不限于神经变性疾病例如阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病、CNS肿瘤和其它CNS病症。
在其它实施方案中，所述CNS病症包括上述疾病的任何子集或排除上述病况的任何一种或多种。在具体的实施方案中，术语“中枢神经系统病症”不包括CNS的良性和/或恶性肿瘤。
在某些实施方案中，CNS病症是Rett综合征。在进一步的实施方案中，本发明涉及在有需要的哺乳动物受试者中治疗Rett综合征的方法。在某些实施方案中，所述方法包括给予治疗有效量的本发明的AAV颗粒，例如包含编码甲基胞嘧啶结合蛋白2的核酸的AAV颗粒。
在本发明的另一方面中，本发明的嵌合AAV衣壳和载体是完全的或近乎完全的脱靶向的(detargeted)载体，其可以针对用于靶向一种或多种外周器官或组织的所期望的向性特征被进一步修饰，如下所述。在该方面，本发明也涉及将异源核苷酸序列递送到宽范围的细胞的方法，所述宽范围的细胞包括分裂的和非分裂的细胞。本发明的病毒载体可以用于在体外将目的核苷酸序列递送给细胞，例如，以在体外产生多肽或用于离体基因治疗。所述载体额外地可用于将核苷酸序列递送给有需要的受试者例如以表达治疗性或免疫原性多肽或核酸的方法。以此方式，可因此在受试者体内产生所述多肽或核酸。所述受试者可以是需要该多肽或核酸，因为所述受试者缺乏所述多肽，或因为在受试者中的所述多肽或核酸的产生可能给予某些疗效，作为治疗方法或其它，并且如以下进一步所解释。
一般而言，本发明的病毒载体可以用于递送具有生物效应的任何外源核酸以治疗或改进基因表达相关的任何病症相关的症状。此外，本发明可用于治疗对其而言递送治疗性多肽是有益的任何疾病状态。说明性的疾病状态包括但不限于：囊性纤维化(囊性纤维化跨膜调节蛋白)和其它肺病、血友病A (因子VIII)、血友病B (因子IX)、地中海贫血(ß-珠蛋白)、贫血(红细胞生成素)和其它血液病症、阿尔茨海默病(GDF；中性溶酶)、多发性硬化(ß-干扰素)、帕金森病(神经胶质-细胞系衍生的神经营养因子[GDNF])、亨廷顿舞蹈病(抑制性RNA，其包括但不限于RNAi例如siRNA或shRNA、反义RNA或微RNA，以移出重复)、肌萎缩性侧索硬化、癫痫(甘丙肽、神经营养因子)、和其它神经性病症、癌症(内皮抑制素、制管张素、TRAIL、FAS-配体、细胞因子，其包括干扰素；抑制性RNA，其包括但不限于RNAi (例如siRNA或shRNA)、反义RNA和微RNA，包括针对VEGF、多重耐药基因产物或癌症免疫原的抑制性RNA)、糖尿病(胰岛素、PGC-α1、GLP-1、肌肉生长抑制素前肽、葡萄糖转运蛋白4)、肌营养不良，其包括杜氏或贝克尔氏(例如，肌营养蛋白、小肌营养蛋白、微肌营养蛋白、胰岛素样生长因子I、肌聚糖[例如，α、β、γ]、针对肌肉生长抑制素或肌肉生长抑制素前肽的抑制性RNA[例如，RNAi、反义RNA或微RNA]、层粘连蛋白-α2、Fukutin-相关蛋白、显性失活肌肉生长抑制素、滤泡素抑制素、激活素II型可溶性受体、抗炎多肽例如Ikappa B显性突变体、肌长蛋白、肌营养相关蛋白、小肌营养相关蛋白、针对肌营养蛋白基因的剪接点以诱导外显子跳跃的抑制性RNA [例如，RNAi、反义RNA或微RNA] [参见例如WO/2003/095647]、针对U7 snRNA以诱导外显子跳跃的抑制性RNA (例如，RNAi、反义RNA或微RNA] [参见例如WO/2006/021724]、和针对肌肉生长抑制素或肌肉生长抑制素前肽的抗体或抗体片段)、戈谢病(Gaucher disease)(葡糖脑苷脂酶)、胡尔勒病(Hurler’s disease) (α-L-艾杜糖苷酸酶)、腺苷脱氨酶缺乏(腺苷脱氨酶)、糖原贮积病(例如，法布里病(Fabry disease)[α-半乳糖苷酶]和蓬佩病(Pompe disease) [溶酶体酸性α-葡萄糖苷酶])和其它代谢缺陷，其包括其它溶酶体贮积病症和糖原贮积病症、先天性肺气肿(α1-抗胰蛋白酶)、莱施-奈恩综合征(Lesch-Nyhan Syndrome) (次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)、尼曼-匹克病(Niemann-Pick disease) (鞘磷脂酶)、枫糖尿病(支链酮酸脱氢酶)、视网膜变性疾病(以及眼和视网膜的其它疾病；例如，针对黄斑变性的PDGF、内皮抑制素和/或制管张素)、实体器官例如脑的疾病(包括帕金森病[GDNF]、星形细胞瘤[内皮抑制素、制管张素和/或针对VEGF的RNAi]、成胶质细胞瘤[内皮抑制素、制管张素和/或针对VEGF的RNAi])、肝(针对乙型肝炎和/或丙型肝炎基因的RNAi例如siRNA或shRNA、微RNA或反义RNA)、肾、心(包括充血性心力衰竭或外周动脉病(PAD)) (例如，通过递送蛋白磷酸酶抑制剂I [I-1]、受磷蛋白、肌质内质网(sarcoplasmic endoreticulum)Ca2+-ATP酶[serca2a]、调节受磷蛋白基因的锌指蛋白、Pim-1、PGC-1α、SOD-1、SOD-2、ECF-SOD、激肽释放酶、胸腺素-β4、低氧诱导的转录因子[HIF]、βarkct、β2-肾上腺素能受体、β2-肾上腺素能受体激酶[βARK]、磷酸肌醇-3激酶[PI3激酶]、calsarcin、血管生成因子、S100A1、小白蛋白、腺苷酸环化酶6型、影响G-蛋白偶联受体激酶2型敲减的分子例如截短的组成型活化bARKct、针对受磷蛋白的抑制性RNA [例如，RNAi、反义RNA或微RNA]；受磷蛋白抑制性或显性失活分子例如受磷蛋白S16E等)、关节炎(胰岛素样生长因子)、关节障碍(胰岛素样生长因子)、内膜增生(例如，通过递送enos、inos)、改进心脏移植的生存(超氧化物歧化酶)、AIDS (可溶性CD4)、肌肉萎缩(胰岛素样生长因子I、肌肉生长抑制素前肽、抗凋亡因子、滤泡素抑制素)、肢体缺血(VEGF、FGF、PGC-1α、EC-SOD、HIF)、肾缺陷(红细胞生成素)、贫血(红细胞生成素)、关节炎(抗炎因子例如IRAP和TNFα可溶性受体)、肝炎(α-干扰素)、LDL受体不足(LDL受体)、高氨血症(鸟氨酸转氨甲酰酶)、包括SCA1、SCA2和SCA3的脊髓脑共济失调、苯丙酮尿(苯丙氨酸羟化酶)、自身免疫性疾病等。本发明可以进一步在器官移植后使用，以增加移植的成功和/或减少器官移植或附属治疗的负面副作用(例如，通过给予免疫抑制剂或抑制性核酸以阻断细胞因子产生)。作为另一实例，骨形态发生蛋白(包括RANKL和/或VEGF) 可以与骨同种异体移植一起给予，例如，在癌症患者的中断(break)或手术除去后。
可按照本发明治疗的例示性的溶酶体贮积病包括但不限于：胡尔勒综合征(Hurler’s Syndrome ) (MPS IH)、谢伊综合征(Scheie’s Syndrome ) (MPS IS)、和胡-射综合征(Hurler-Scheie Syndrome ) (MPS IH/S) (α-L-艾杜糖苷酸酶)；亨特综合征(Hunter’s Syndrome) (MPS II) (硫酸艾杜糖醛酸硫酸酯酶)；桑菲列普A型综合征(Sanfilippo A Syndrome)(MPS IIIA) (乙酰肝素-S-硫酸氨基硫酸酯酶(Heparan-S-sulfate sulfaminidase))、桑菲列普B型综合征(MPS IIIB) (N-乙酰基-D-氨基葡萄糖苷酶)、桑菲列普C型综合征(MPS IIIC) (乙酰基-CoA-氨基葡萄糖苷N-乙酰基转移酶)、桑菲列普D型综合征(MPS IIID) (N-乙酰基-氨基葡萄糖苷（glucosaminine）-6-硫酸硫酸酯酶)；莫尔基奥A型疾病(Morquio A disease)(MPS IVA) (半乳糖胺-6-硫酸硫酸酯酶)、莫尔基奥B型疾病(MPS IV B) (β-半乳糖苷酶)；Maroteaux-lmay疾病(MPS VI) (芳基硫酸酯酶B)；斯利综合征(Sly Syndrome )(MPS VII) (β-葡萄糖醛酸酶)；透明质酸酶缺乏(MPSIX) (透明质酸酶)；涎酸贮积症(粘脂贮积病I)、粘脂贮积病II (I-细胞疾病) (N-乙酰葡糖氨基-1-磷酸转移酶催化亚基)、粘脂贮积病III (假胡尔勒多处营养不良) (N-乙酰葡糖氨基-1-磷酸转移酶；IIIA型[催化亚基]和IIIC型[底物识别亚基])；GM1神经节苷脂贮积病(神经节苷脂β-半乳糖苷酶)、GM2神经节苷脂贮积病I型(泰-萨疾病(Tay-sachs disease))(β-氨基己糖苷酶A)、GM2神经节苷脂贮积病II型(山德霍夫疾病(Sandhoff's disease))(β-氨基己糖苷酶B)；尼曼-匹克病(A和B型) (鞘磷脂酶)；戈谢病(葡糖脑苷脂酶)；法伯病(Farber’s disease ) (ceraminidase)；法布里病(α-半乳糖苷酶A)；克拉伯病(半乳糖酰基鞘氨醇β-半乳糖苷酶)；异染性脑白质营养不良(芳基硫酸酯酶A)；溶酶体酸性脂肪酶缺乏，其包括Wolman’s 疾病(溶酶体酸性脂肪酶)；巴腾病(青少年神经元蜡样质脂褐质沉积症) (溶酶体跨膜CLN3蛋白)涎酸贮积症(神经氨酸苷酶1)；半乳糖唾液酸沉积症(戈德堡氏综合征(Goldberg’s syndrome)) (保护性蛋白/组织蛋白酶A)；α-甘露糖苷贮积症(α-D-甘露糖苷酶)；β-甘露糖苷贮积症(β-D-甘露糖苷贮积症)；岩澡糖苷贮积症(α-D-岩澡糖苷酶)；天冬氨酰葡萄糖胺尿症(N-天冬氨酰葡萄糖胺酶)；和涎尿(Na磷酸共转运蛋白)。
可按照本发明治疗的例示性的糖原贮积病包括但不限于Ia型GSD (冯·吉尔克病(von Gierke disease)) (葡萄糖-6-磷酸酶)、Ib型GSD (葡萄糖-6-磷酸移位酶)、Ic型GSD(微粒体磷酸或焦磷酸转运蛋白)、Id型GSD (微粒体葡萄糖转运蛋白)、II型GSD，其包括蓬佩病或婴儿IIa型GSD (溶酶体酸性α-葡萄糖苷酶)和IIb型(Danon) (溶酶体膜蛋白-2)、IIIa和IIIb型GSD (脱支酶；淀粉葡萄糖苷酶和寡葡萄糖转移酶)、IV型GSD (安德森病(Andersen's disease)) (分支酶)、V型GSD (麦卡德尔病(McArdle disease)) (肌肉磷酸化酶)、VI型GSD (赫斯病(Hers' disease)) (肝磷酸化酶)、VII型GSD (塔里病(Tarui'sdisease)) (磷酸果糖激酶)、GSD VIII/IXa型(伴X染色体的磷酸化酶激酶)、GSD IXb型(肝和肌肉磷酸化酶激酶)、GSD IXc型(肝磷酸化酶激酶)、GSD IXd型(肌肉磷酸化酶激酶)、GSDO (糖原合酶)、Fanconi-Bickel综合征(葡萄糖转运蛋白-2)、磷酸葡糖异构酶缺乏、肌肉磷酸甘油酸激酶缺乏、磷酸甘油酸变位酶缺乏、果糖1,6-二磷酸酶缺乏、磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶缺乏、和乳酸脱氢酶缺乏。
可以递送给心肌的核酸和多肽包括在治疗受损的、变性的或萎缩的心肌和/或先天性心脏缺陷中有益的那些。例如，在心脏病治疗中可用于促进血管化的血管生成因子包括但不限于血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF II、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF121、VEGF138、VEGF145、VEGF165、VEGF189、VEGF206、低氧诱导因子1α (HIF 1α)、内皮NO合酶(eNOS)、iNOS、VEFGR-1 (Flt1)、VEGFR-2 (KDR/Flk1)、VEGFR-3 (Flt4)、血管生成素、表皮生长因子(EGF)、促血管生成素、血小板衍生的生长因子、血管生成因子、转化生长因子-α (TGF-α)、转化生长因子-β (TGF-β)、血管渗透因子(VPF)、肿瘤坏死因子α (TNF-α)、白介素-3 (IL-3)、白介素-8 (IL-8)、血小板-衍生的内皮生长因子(PD-EGF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、肝细胞生长因子(HGF)、散射因子(SF)、多效营养因子、增殖素、滤泡素抑制素、胎盘生长因子(PIGF)、中期因子、血小板衍生的生长因子-BB (PDGF)、CXXXC趋化因子、ICAM-1、促血管生成素-1和-2 (Ang1和Ang2)、Tie-2、神经毡蛋白-1、ICAM-1、刺激平滑肌细胞、单核细胞或白细胞迁移的趋化因子和细胞因子、抗凋亡肽和蛋白、成纤维细胞生长因子(FGF)、FGF-1、FGF-1b、FGF-1c、FGF-2、FGF-2b、FGF-2c、FGF-3、FGF-3b、FGF-3c、FGF-4、FGF-5、FGF-7、FGF-9、酸性FGF、碱性FGF、单核细胞趋化蛋白-1、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、IGF-2、早期生长反应因子-1 (EGR-1)、ETS-1、人组织激肽释放酶(HK)、基质金属蛋白酶、糜蛋白酶、尿激酶型纤溶酶原激活物和肝素酶。(参见例如美国专利申请号20060287259和美国专利申请号20070059288)。
在成人中发现的最常见的先天性心脏病是二叶主动脉瓣，而心房中隔缺损是成人中所见的30-40%的先天性心脏病的原因。儿童群体中最常见的先天性心脏缺陷是室中隔缺损。其它先天性心脏病包括艾森门格尔综合征(Eisenmenger's syndrome)、动脉导管未闭、肺动脉瓣狭窄、主动脉缩窄、大动脉转位、三尖瓣闭锁、单心室心脏、埃布斯坦畸形(Ebstein's anomaly)和右心室双出口。许多研究已经鉴定出与这些先天性心脏病中的一种或多种相关的推定的遗传基因座。例如，唐氏综合征相关的先天性心脏病的推定基因是21q22.2-q22.3，介于ETS2和MX1之间。同样，迪乔治综合征(DiGeorge syndrome)的大部分病例由染色体22q11.2(迪乔治综合征染色体区或DGCR)缺失产生。在该缺失中丢失若干基因，其包括推定的转录因子TUPLE1。该缺失与多种表型相关，例如，斯普林泽综合征(Shprintzen syndrome)；异常面容综合征(conotruncal anomaly face)(或高雄综合征(Takao syndrome))；和心脏的分离流出道缺陷，其包括法洛四联症(Tetralogy ofFallot)、动脉干和中断的主动脉弓。所有前述病症都可以按照本发明来治疗。
心脏和血管系统的其它重要疾病据信也具有遗传的、通常是多基因的病因学组分。这些疾病包括例如左心发育不全综合征、心脏瓣膜发育不良、Pfeiffer心脑(cardiocranial)综合征、眼面心牙(oculofaciocardiodental)综合征、Kapur-Toriello综合征、Sonoda综合征、Ohdo Blepharophimosis综合征、心-手综合征、皮-罗综合征（Pierre-Robin syndrome）、希尔施普龙病(Hirschsprung disease)、Kousseff 综合征、Grange闭塞性动脉综合征、基-塞综合征（Kearns-Sayre syndrome）、卡塔格纳综合征（Kartagenersyndrome）、Alagille综合征、Ritscher-Schinzel综合征、Ivemark 综合征、Young-Simpson综合征、血色素沉着病、Holzgreve综合征、巴氏综合征(Barth syndrome)、史-伦-奥三氏综合征(Smith-Lemli-Opitz syndrome)、糖原贮积病、戈谢样病、法布里病、Lowry-Maclean综合征、Rett综合征、奥皮茨综合征（Opitz syndrome）、马凡综合征（Marfan syndrome）、Miller-Dieker无脑回综合征、粘多糖贮积症、Bruada综合征、肱骨脊骨发育障碍（humerospinal dysostosis）、Phaver综合征、McDonough综合征、Marfanoid运动过度综合征、无转铁蛋白血症、科妮莉亚德兰格综合征（Cornelia de Lange syndrome）、豹斑综合征（Leopard syndrome）、戴-布二氏贫血（Diamond-Blackfan anemia）、Steinfeld综合征、早老症和Williams-Beuren综合征。所有这些病症可以按照本发明来治疗。
抗凋亡因子可以递送到骨骼肌、膈肌和/或心肌，以治疗肌肉萎缩病、肢体缺血、心脏梗塞、心力衰竭、冠状动脉病和/或I或II型糖尿病。
可递送到骨骼肌的核酸包括在治疗受损的、变性的和/或萎缩的骨骼肌中有益的那些。对于多种形式的疾病而言，引起肌营养不良的遗传缺陷是已知的。这些缺陷的基因或不能产生蛋白产物，或产生不能适当起作用的蛋白产物，再或产生干扰细胞的恰当功能的功能失调的蛋白产物。所述异源核酸可以编码治疗性功能的蛋白或多核苷酸，其抑制功能失调蛋白的产生或活性。可从递送的核酸表达或被递送的核酸抑制(例如，通过递送RNAi、微RNA或反义RNA)的多肽包括但不限于肌营养蛋白、小肌营养蛋白或微肌营养蛋白(杜氏和贝克尔氏MD)；肌营养蛋白相关糖蛋白β-肌聚糖(肢带型MD 2E)、δ-肌聚糖(肢带型MD 22F)、α-肌聚糖(肢带型MD 2D)和γ-肌聚糖(肢带型MD 2C)、肌营养相关蛋白、钙蛋白酶(常染色体隐形肢带型MD 2A型)、小窝蛋白-3 (常染色体显性肢带型MD)、层粘连蛋白-α2 (分区蛋白缺陷的先天性MD)、小集聚蛋白 (层粘连蛋白-α2缺陷的先天性MD)、fukutin(Fukuyama型先天性MD)、伊默菌素(Emery-Dreifuss MD)、肌节蛋白、核纤层蛋白A/C、钙蛋白酶-3、dysferlin、和/或视松蛋白。此外，所述异源核酸可以编码mir-1、mir-133、mir-206、mir-208或反义RNA、RNAi (例如，siRNA或shRNA)或微RNA，以在缺陷的肌营养蛋白基因中诱导外显子跳跃。
在具体的实施方案中，将所述核酸递送到舌肌(例如，以治疗营养不良性舌)。递送到舌的方法可以是本领域任何已知方法，包括直接注射、口服给予、局部给予到舌头、静脉内给予、关节内给予等。
前述蛋白也可给予膈肌以治疗肌营养不良。
或者，可以给予基因转移载体，其编码任何其它治疗性多肽。
在具体的实施方案中，本发明的病毒载体用于递送本文所述的目的核酸到骨骼肌、膈肌和/或心肌，例如，以治疗与这些组织中的一种或多种相关的病症，例如肌营养不良、心脏病(包括PAD和充血性心力衰竭)等。
基因转移在了解和提供疾病状态的治疗中具有大量潜在用途。存在许多遗传性疾病，其中已知缺陷的基因并已将其克隆。一般而言，上述疾病状态落入两类：通常以隐性方式遗传的缺乏状态，通常是酶的缺乏状态；和不平衡状态，其可涉及调控或结构蛋白，并且其通常以显性方式遗传。就缺乏状态疾病而言，基因转移可用于使正常的基因进入受影响的组织用于替代性治疗，以及使用抑制性RNA例如RNAi (例如，siRNA或shRNA)、微RNA或反义RNA产生疾病的动物模型。就不平衡疾病状态而言，基因转移可以用于在模型系统中产生疾病状态，其然后可以用于致力于对抗疾病状态。因此，本发明的病毒载体允许治疗遗传性疾病。本文中使用的疾病状态是通过部分或完全地补救导致疾病或者使它更加严重的缺乏或不平衡而得以治疗。导致突变或纠正缺陷的核酸序列的位点特异性重组的应用也是可行的。
本发明的病毒载体也可用于在体外或体内提供反义核酸或抑制性RNA (例如，微RNA或RNAi例如siRNA或shRNA)到细胞。抑制性RNA在靶细胞中的表达减少了特定蛋白经细胞的表达。因此，可以给予抑制性RNA以在有需要的受试者中减少特定蛋白的表达。也可在体外将抑制性RNA给予细胞，以调节细胞生理学，例如，以优化细胞或组织培养系统。
作为进一步的方面，本发明的病毒载体可用于在受试者中产生免疫应答。按照本实施方案，可将包含编码免疫原的核酸的病毒载体给予受试者，并且针对该免疫原的活性免疫应答(任选地保护性免疫应答)通过受试者产生。免疫原如上文所述。
或者，可将病毒载体给予离体细胞并将改变的细胞给予受试者。将所述异源核酸引入细胞，并将所述细胞给予受试者，其中任选表达编码免疫原的异源核酸并在受试者中诱导针对免疫原的免疫应答。在具体的实施方案中，所述细胞是抗原呈递细胞(例如，树突细胞)。
“活性免疫应答”或“活性免疫力”特征在于“在遇到免疫原后宿主组织和细胞的参与。它涉及淋巴网状组织中的免疫活性细胞的分化和增殖，这导致抗体的合成或细胞介导的反应性的发展，或这两者。” Herbert B. Herscowitz, Immunophysiology: Cell Function and Cellular Interactions in Antibody Formation（免疫生理学：在抗体形 成中细胞功能和细胞相互作用）,载于IMMUNOLOGY: BASIC PROCESSES 117 (Joseph A.Bellanti编辑, 1985)。或者说，活性免疫应答由在通过感染或通过接种而暴露于免疫原后的宿主产生。活性免疫力可以与被动免疫力对比，后者是通过“将来自活性免疫的宿主的预先形成的物质(抗体、转移因子、胸腺移植、白介素-2)转移给非免疫宿主”而获得。同上。
本文使用的“保护性”免疫应答或“保护性”免疫力是指免疫应答给予受试者一些益处，因为它预防或减少疾病的发生。或者，保护性免疫应答或保护性免疫力可以用于治疗疾病、尤其是癌症或肿瘤(例如，通过引起癌症或肿瘤的衰退和/或通过预防转移和/或通过阻止转移结节的生长)。保护性作用可以是完全的或部分的，只要治疗益处胜过其任何缺点。
也可给予本发明的病毒载体，用于癌症免疫治疗，即通过给予表达癌细胞抗原(或免疫上类似的分子)或产生针对癌细胞的免疫应答的任何其它免疫原的病毒载体。为了说明，在受试者中可以针对癌细胞抗原产生免疫应答，即通过给予包含编码癌细胞抗原的异源核苷酸序列的病毒载体，例如以治疗癌症患者。所述病毒载体可以在体内或通过使用离体方法给予受试者，如本文所述。
如本文所用的术语“癌症”包括肿瘤形成癌症。同样，术语“癌组织”包括肿瘤。“癌细胞抗原”包括肿瘤抗原。
术语“癌症”具有本领域理解的含义，例如不受控制的组织生长，其具有扩散到身体的远处位点的潜力(即转移)。例示性的癌症包括但不限于白血病、淋巴瘤(例如，霍奇金和非霍奇金淋巴瘤)、结直肠癌、肾癌、肝癌、乳癌、肺癌、前列腺癌、睾丸癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、脑癌(例如，胶质瘤和成胶质细胞瘤)、骨癌、肉瘤、黑素瘤、头颈部癌、食道癌、甲状腺癌等。在本发明的实施方案中，实践本发明以治疗和/或预防肿瘤形成癌症。
术语“肿瘤”在本领域中也被理解为例如在多细胞生物内的未分化的细胞的异常块。肿瘤可以是恶性或良性的。在代表性的实施方案中，本文公开的方法用于预防和治疗恶性肿瘤。
癌细胞抗原在上文已有描述。术语“治疗癌症”或“癌症的治疗”意图癌症的严重性被降低或癌症被预防或至少部分被消除。例如，在具体的背景中，这些术语是指癌症转移被预防或减少或至少被部分地消除。在进一步代表性的实施方案中，这些术语是指转移结节的生长(例如，在原发性肿瘤经手术切除后)被预防或减少或至少被部分地消除。术语“癌症的预防”或“预防癌症”意图所述方法至少部分地消除或减少癌症的发生或发作。或者说，在受试者中的癌症发作或发展可以被减缓、控制、在可能性或概率上减少或延迟。
在具体的实施方案中，可将细胞从患癌症的受试者中取出并与本发明的病毒载体接触。随后将修饰的细胞给予所述受试者，藉此引起针对癌细胞抗原的免疫应答。该方法特别有利地用于无免疫应答的受试者，所述受试者体内不能产生足够的免疫应答(即不能以足够量产生增强的抗体)。
本领域已知的是通过免疫调节性细胞因子(例如，α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、ω-干扰素、τ-干扰素、白介素-1α、白介素-1β、白介素-2、白介素-3、白介素-4、白介素5、白介素-6、白介素-7、白介素-8、白介素-9、白介素-10、白介素-11、白介素12、白介素-13、白介素-14、白介素-18、B细胞生长因子、CD40配体、肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β、单核细胞趋化蛋白-1、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、和淋巴毒素)可以增强免疫应答。因此，免疫调节性细胞因子(例如，CTL诱导的细胞因子)可以与所述病毒载体联合给予受试者。
细胞因子可以以本领域已知的任何方法给予。可将外源细胞因子给予受试者，或备选地，可使用合适的载体将编码细胞因子的核苷酸序列递送到受试者，并在体内产生细胞因子。
所述病毒载体进一步可用于靶向CNS细胞，用于研究目的，例如用于在体外或动物中研究CNS功能或用于产生和/或研究疾病的动物模型。例如，所述载体可用于在神经损伤(例如，创伤性脑损伤或脊髓损伤)的动物模型或神经变性疾病的动物模型中递送异源核酸到神经元。例如，所述载体可用于在脱髓鞘疾病动物模型中递送异源核酸到少突胶质细胞。脱髓鞘可通过各种方式在动物中诱发，所述方式包括但不限于给予病毒(例如，西门利启病毒(Semliki virus)、鼠肝炎病毒、或塞勒氏(Theiler’s)鼠脑脊髓炎病毒)和给予化学品(例如，双环己酮草酰二腙（cuprizone）、溴化乙锭或溶血卵磷脂)。在一些实施方案中，所述载体也可用于实验性自身免疫脑脊髓炎的动物模型。该病况可以通过例如给予钾盐镁矾、SIN-1、抗半乳糖脑苷脂或辐射而诱发。在其它实施方案中，所述病毒载体可用于将毒剂或产生毒剂的酶(例如，胸苷激酶)特异性递送到少突胶质细胞，以杀伤一些或全部细胞。
此外，本发明的病毒载体在诊断和筛选方法中找到另外的用途，藉此目的基因在细胞培养系统中或备选地在转基因动物模型中瞬时或稳定地表达。也可实践本发明以递送核酸，用于蛋白生产的目的，例如用于实验室、工业或商业目的。
本发明的重组病毒载体在兽用和医用二者中都找到用途。合适的受试者包括禽类和哺乳动物。本文使用的术语“禽”包括但不限于鸡、鸭、鹅、鹌鹑、火鸡、野鸡、鹦鹉、长尾鹦鹉。本文使用的术语“哺乳动物”包括但不限于人类、灵长类非人类灵长类(例如，猴和狒狒)、牛、绵羊、山羊、猪、马、猫、狗、兔、啮齿类(例如，大鼠、小鼠、仓鼠等)等。人类受试者包括新生儿、婴儿、青少年和成人。任选地，所述受试者“需要”本发明的方法，例如，因为所述受试者具有以下病症或据信处于其风险中，所述病症包括本文所述的那些病症或会从包括本文所述的那些的核酸的递送中获益。例如，在具体的实施方案中，所述受试者具有(或已经具有)脱髓鞘病症或脊髓或脑损伤或处于其风险中。作为另外的选项，所述受试者可以是实验动物和/或疾病的动物模型。
在具体的实施方案中，本发明提供药物组合物，其包含在制药上可接受的载体中的本发明的病毒载体，和任选其它医药剂、制药剂、稳定剂、缓冲液、载体、佐剂、稀释剂等。对于注射，所述载体通常会是液体。对于其它给予方法，所述载体可以是固体或液体。对于吸入给予，所述载体会是可呼吸的，并且会优选呈固体或液体颗粒形式。
对于“制药上可接受的”意指无毒或无以其它方式不想要的材料，即所述材料可以给予受试者而不引起任何不想要的生物学效应。
本发明的一方面是将核苷酸序列转移到体外细胞的方法。按照适合特定靶细胞的标准转导方法，可将所述病毒载体以合适的感染复数引入细胞。给予的病毒载体或衣壳的滴度可以不同，这取决于靶细胞类型和数量，和特定病毒载体或衣壳，并且可由本领域技术人员无需过度实验而确定。在具体的实施方案中，将至少大约103感染单位，更优选至少大约105感染单位引入细胞。
可以将所述病毒载体引入的细胞可以是任何类型，包括但不限于神经细胞(包括外周和中枢神经系统的细胞，具体地讲，脑细胞例如神经元、少突胶质细胞、神经胶质细胞、星形细胞)、肺细胞、眼的细胞(包括视网膜细胞、视网膜色素上皮和角膜细胞)、上皮细胞(例如，肠和呼吸道上皮细胞)、骨骼肌细胞(包括成肌细胞、肌管和肌纤维)、膈肌细胞、树突细胞、胰腺细胞(包括胰岛细胞)、肝细胞、胃肠道细胞(包括平滑肌细胞、上皮细胞)、心脏细胞(包括心肌细胞)、骨细胞(例如，骨髓干细胞)、造血干细胞、脾细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、内皮细胞、前列腺细胞、关节细胞(包括例如，软骨、半月板、滑膜和骨髓)、生殖细胞等。或者，所述细胞可以是任何祖细胞。作为进一步的备选方案，所述细胞可以是干细胞(例如，神经干细胞、肝脏干细胞)。作为再进一步的备选方案，所述细胞可以是癌症细胞或肿瘤细胞(癌症和肿瘤如上所述)。此外，所述细胞可以来自任何来源的物种，如上所述。
可将所述病毒载体在体外引入细胞，用于将修饰的细胞给予受试者的目的。在具体的实施方案中，所述细胞已从受试者中取出，将所述病毒载体引入其中，并随后将所述细胞放回受试者中。将细胞从受试者中取出用于离体处理，接着放回受试者中的方法是本领域已知的(参见例如美国专利号5,399,346)。或者，将重组病毒载体引入来自另一受试者的细胞，引入培养的细胞，或引入来自任何其它合适来源的细胞，并将所述细胞给予有需要的受试者。
用于离体基因治疗的合适细胞如上所述。给予受试者的细胞剂量将因受试者的年龄、病况和物种、细胞种类、细胞表达的核酸、给予方式等而不同。通常，每一剂量将给予在制药上可接受的载体中的至少大约102至大约108或大约103至大约106个细胞。在具体的实施方案中，将用所述病毒载体转导的细胞以有效量与药物载体组合给予受试者。
在一些实施方案中，可以给予用病毒载体转导的细胞，以引起针对所递送的多肽(例如，作为转基因或在衣壳中表达)的免疫原性反应。通常，将表达有效量的多肽的一定量的细胞与制药上可接受的载体组合给予。任选地，所述剂量足以产生保护性免疫应答(如上定义)。所赋予的保护程度不一定是完全的或永久的，只要给予免疫原性多肽的益处胜过其任何缺点。
本发明的另外方面是将本发明的病毒载体或衣壳给予受试者的方法。在具体的实施方案中，所述方法包括将目的核酸递送到动物受试者的方法，所述方法包括：将有效量的本发明的病毒载体给予动物受试者。将本发明的病毒载体给予有需要的人类受试者或动物可以通过本领域已知的任何方式进行。任选地，所述病毒载体以有效剂量在制药上可接受的载体中被递送。
本发明的病毒载体可以进一步给予受试者，以引起免疫原性反应(例如，作为疫苗)。通常，本发明的疫苗包含与制药上可接受的载体组合的有效量的病毒。任选地，所述剂量足以产生保护性免疫应答(如上定义)。所赋予的保护程度不一定是完全的或永久的，只要给予免疫原性多肽的益处胜过其任何缺点。受试者和免疫原都如上所述。
要给予受试者的病毒载体的剂量会取决于给予方式、要治疗的疾病或病况、单个受试者的病况、具体的病毒载体和要递送的核酸，并且可以常规方式来确定。达到疗效的例示性的剂量是至少大约105、106、107、108、109、1010、1011、1012、103、1014、1015转导单位或更多、优选大约107或108、109、1010、1011、1012、1013或1014转导单位、还更优选大约1012转导单位的病毒滴度。
在具体的实施方案中，可以采用不止一次给予(例如，2、3、4次或更多次给予)，以在不同间隔时段内(例如每天、每周、每月、每年等)实现所需水平的基因表达。
例示性的给予方式包括口服、直肠、透粘膜、局部、鼻内、吸入(例如，经由气溶胶)、含服(例如，舌下)、阴道、鞘内、眼内、透皮、宫内(或卵巢内)、胃肠外(例如，静脉内、皮下、皮内、肌肉内[包括给予骨骼肌、膈肌和/或心肌]、皮内、胸膜内、脑内和关节内)、局部(例如，到皮肤和粘膜二者表面，包括气道表面、和透皮给予)、淋巴内等以及直接组织或器官注射(例如，到肝脏、骨骼肌、心肌、膈肌或脑)。也可给予到肿瘤(例如在肿瘤或淋巴结内或附近)。在任何给定情况下，最合适的途径将取决于所治疗病况的性质和严重性以及所使用的具体载体的性质。
在一些实施方案中，将所述病毒载体直接给予CNS，例如，脑或脊髓。直接给予可以导致对CNS细胞的高度特异性转导，例如，其中至少80%、85%、90%、95%或更多的转导细胞是CNS细胞。本领域已知的将载体直接给予CNS的任何方法都可使用。所述载体可以被引入脊髓、脑干(延髓、脑桥)、中脑(下丘脑、丘脑、上丘脑、脑下垂体、黑质、松果体)、小脑、终脑(纹状体、大脑包括枕叶、颞叶、顶叶和额叶、皮质、基底神经节、海马和杏仁核)、边缘系统、新皮质、纹状体、大脑和下丘。所述载体也可给予眼的不同区例如视网膜、角膜或视神经。所述载体可以递送到脑脊液(例如，通过腰椎穿刺)，用于所述载体的更分散的给予。
所述递送载体可以通过本领域任何已知途径给予CNS的所需区，包括但不限于：鞘内、脑内、心室内、鼻内、耳内、眼内(例如，玻璃体内、视网膜下、前房)和眼周围(例如，亚Tenon's区)递送或其任何组合。
通常，所述病毒载体会以液体制剂的形式通过直接注射(例如，立体定位注射)给予到CNS中的所需区或区室。在一些实施方案中，所述载体可以经由贮池和/或泵来递送。在其它实施方案中，所述载体可以通过局部施用到所需区或通过鼻内给予气溶胶制剂来提供。可以通过局部施用液体液滴给予到眼或给予入耳。作为另外的备选方案，所述载体可以作为固体的缓释制剂给予。细小病毒和AAV载体的控释描述于国际专利公开WO 01/91803。
在其中受试者具有损害的血脑屏障(BBB)的一些实施方案中，所述病毒载体可以全身地递送(例如，静脉内)到受试者，其中所述载体转导在BBB受损区(例如毗邻)中的CNS细胞。在某些实施方案中，所述载体转导在受损区中的细胞而非非受损区中的细胞。因此，本发明的一方面涉及在哺乳动物受试者中将目的核酸递送到与损害的血脑屏障区域毗邻的CNS区的方法，所述方法包括静脉内给予有效量的本发明的AAV颗粒。
在一些实施方案中，BBB的损害是由于疾病或病症所致。实例包括但不限于：神经变性疾病例如阿尔茨海默病、帕金森病、疾病、肌萎缩性侧索硬化和多发性硬化、癫痫、CNS肿瘤或脑梗死。在其它实施方案中，BBB损害可以是诱导的破坏，例如，以促进将剂递送到CNS。临时BBB损害可以通过例如有毒化学品(例如戊四氮、VP-16、顺铂、羟基脲、氟尿嘧啶和依托泊苷)、渗透剂(例如甘露醇和阿拉伯糖)、生物试剂(例如视黄酸、十四烷酸乙酸大戟二萜醇酯、白三烯C4、缓激肽、组胺、RMP-7、和烷基甘油)、或辐射(例如超声或电磁辐射)而诱导。
按照本发明对骨骼肌给予包括但不限于对肢体(例如，上臂、下臂、大腿和/或小腿)、背、颈、头(例如，舌)、胸、腹、骨盆/会阴、和/或指/趾中的骨骼肌的给予。合适的骨骼肌组织包括但不限于小指展肌(在手中)、小趾展肌（在脚中）、外展拇趾(指)肌、第五趾(指)展肌(abductor ossis metatarsi quinti)、拇短展肌、拇长展肌、内收短肌、拇收肌、长收肌、大收肌、拇内收肌、肘肌、前斜角肌（anterior scalene）、膝关节肌、肱二头肌、股二头肌、肱肌、肱桡肌、颊肌、喙肱肌、皱眉肌、三角肌、口角降肌、降下唇肌、二腹肌、背侧骨间肌(在手中)、背侧骨间肌(在脚中)、桡侧腕短伸肌、桡侧腕长伸肌、尺侧腕伸肌、小指(趾)伸肌、指(趾)伸肌、趾(指)短伸肌、趾(指)长伸肌、拇短伸肌、拇长伸肌、食指伸肌、拇短伸肌、拇长伸肌、桡侧腕屈肌、尺侧腕屈肌、小指短屈肌(在手中)、小趾短屈肌(在脚中)、趾(指)短屈肌、趾(指)长屈肌、指(趾)深屈肌、指(趾)浅屈肌、拇短屈肌、拇长屈肌、拇短屈肌、拇长屈肌、额肌、腓肠肌、颏舌骨肌、臀大肌、臀中肌、臀小肌、股薄肌、颈髂肋肌、腰髂肋肌、胸髂肋肌、髂肌、下孖肌、下斜肌、下直肌、冈下肌、棘间肌、横突间肌、翼外肌、外直肌、背阔肌、提口角肌、提上唇肌、上唇鼻翼提肌、提上睑肌、肩胛提肌、长回旋肌、头最长肌、颈最长肌、胸最长肌、头长肌、颈长肌、蚓状肌(在手中)、蚓状肌(在脚中)、咬肌、翼内肌、内直肌、中斜角肌、多裂肌、下颌舌骨肌、头下斜肌、头上斜肌、闭孔外肌、闭孔内肌、枕肌、肩胛舌骨肌、小指对掌肌、拇指(趾)对掌肌、眼轮匝肌、口轮匝肌、骨间掌侧肌、掌短肌、掌长肌、耻骨肌、胸大肌、胸小肌、腓骨短肌、腓骨长肌、第三腓骨肌、梨状肌、骨间足底肌、跖肌、颈阔肌、腘肌、后斜角肌、旋前方肌、旋前圆肌、腰大肌、股方肌、足底方肌、头前直肌、头侧直肌、头后大直肌、头后小直肌、股直肌、大菱形肌、小菱形肌、笑肌、缝匠肌、小斜角肌、半膜肌、头半棘肌、颈半棘肌、胸半棘肌、半腱肌、前锯肌、短回旋肌、比目鱼肌、头棘肌、颈棘肌、胸棘肌、头夹肌、颈夹肌、胸锁乳突肌、胸骨舌骨肌、胸骨甲状肌、茎舌骨肌、锁骨下肌、肩胛下肌、上孖肌、上斜肌、上直肌、旋后肌、冈上肌、颞肌、阔筋膜张肌、大圆肌、小圆肌、胸肌、甲状舌骨肌、胫骨前肌、胫骨后肌、斜方肌、肱三头肌、股中间肌、股外侧肌、股内侧肌、颧大肌和颧小肌和本领域已知的任何其它合适的骨骼肌。
所述病毒载体可以通过任何合适方法递送到骨骼肌，所述方法包括但不限于静脉内给予、动脉内给予、腹膜内给予、隔离的肢体灌注(腿和/或臂；参见例如Arruda等人,(2005) Blood 105:3458-3464)，和/或直接肌内注射。
给予心肌包括但不限于给予左心房、右心房、左心室、右心室和/或隔膜。所述病毒载体可以通过本领域已知的任何方法递送到心肌，所述方法包括例如静脉内给予、动脉内给予例如主动脉内给予、直接心脏注射(例如到左心房、右心房、左心室、右心室)、和/或冠状动脉灌注。
给予膈肌可以通过任何合适方法，包括静脉内给予、动脉内给予、和/或腹膜内给予。
递送到这些组织的任一处也可通过递送包含病毒载体的贮库制剂而完成，所述贮库制剂可以植入到骨骼肌、心肌和/或膈肌组织或者可使组织与包含病毒载体的膜或其它基质接触。这些可植入基质或基材的实例描述于美国专利号7,201,898。
在具体的实施方案中，将本发明的病毒载体给予骨骼肌、膈肌和/或心肌(例如，以治疗肌营养不良或心脏病[例如，PAD或充血性心力衰竭])。
本发明可用于治疗骨骼肌、心肌和/或膈肌的病症。或者，可以实践本发明以将核酸递送给骨骼肌、心肌和/或膈肌，其被用作用于产生在血液中正常循环的蛋白产物(例如，酶)或非翻译的RNA(例如，RNAi、微RNA、反义RNA)的平台，或用于全身递送到其它组织以治疗病症(例如，代谢病症，例如糖尿病(例如，胰岛素)、血友病(例如，因子IX或因子VIII)、或溶酶体贮积病症(例如戈谢病[葡糖脑苷脂酶]、蓬佩病[溶酶体酸性α-葡萄糖苷酶]或法布里病[a-半乳糖苷酶A])或糖原贮积病症(例如蓬佩病[溶酶体酸性a葡萄糖苷酶])。治疗代谢病症的其它合适的蛋白如上文所述。
在代表性的实施方案中，本发明提供在有需要的受试者中治疗肌营养不良的方法，所述方法包括：将有效量的本发明的病毒载体给予哺乳动物受试者，其中所述病毒载体包含有效治疗肌营养不良的异源核酸。在例示性的实施方案中，所述方法包括：将有效量的本发明的病毒载体给予哺乳动物受试者，其中所述病毒载体包含编码以下的异源核酸：肌营养蛋白、小肌营养蛋白、微肌营养蛋白、肌营养相关蛋白、小肌营养相关蛋白、层粘连蛋白-α2、小聚集蛋白、Fukutin-相关蛋白、滤泡素抑制素、显性失活肌肉生长抑制素、α-肌聚糖、β-肌聚糖、γ-肌聚糖、δ-肌聚糖、IGF-1、肌肉生长抑制素前肽、激活素II型可溶性受体、抗炎多肽例如Ikappa B显性突变体、肌长蛋白、针对肌肉生长抑制素或肌肉生长抑制素前肽的抗体或抗体片段、或针对肌肉生长抑制素的抑制性RNA (例如，反义RNA、微RNA或RNAi)、mir-1、mir-133、mir-206、mir-208或在缺陷的肌营养蛋白基因中诱导外显子跳跃的抑制性RNA (例如，微RNA、RNAi或反义RNA)。在具体的实施方案中，所述病毒载体可以给予骨骼肌、膈肌和/或心肌，如本文另外的地方所描述。
本发明另外包括在有需要的受试者中治疗代谢病症的方法。在代表性的实施方案中，所述方法包括：将有效量的本发明的病毒载体给予受试者的骨骼肌，其中所述病毒载体包含编码多肽的异源核酸，其中所述代谢病症是所述多肽缺乏和/或缺陷的结果。说明性的代谢病症和编码多肽的异源核酸在本文中被描述。作为另外的选项，所述异源核酸可以编码分泌蛋白。
也可实践本发明以产生抑制性RNA (例如，反义RNA、微RNA或RNAi)用于全身的递送。
本发明也提供在有需要的受试者中治疗先天性心力衰竭的方法，所述方法包括将有效量的本发明的病毒载体给予哺乳动物受试者，其中所述病毒载体包含有效治疗先天性心力衰竭的异源核酸。在代表性的实施方案中，所述方法包括将有效量的本发明的病毒载体给予哺乳动物受试者，其中所述病毒载体包含编码以下的异源核酸：肌质内质网Ca2+-ATP酶(SERCA2a)、血管生成因子、受磷蛋白、PI3激酶、calsarcan、β-肾上腺素能受体激酶(βARK)、βARKct、蛋白磷酸酶1抑制剂1、Pim-1、PGC-1α、SOD-1、SOD-2、EC-SOD、激肽释放酶、HIF、胸腺素-β4、S100A1、小白蛋白、腺苷酸环化酶6型、影响G-蛋白偶联受体激酶2型敲减的分子例如截短的组成型活化bARKct；受磷蛋白抑制性或显性失活分子例如受磷蛋白S16E、mir-1、mir-133、mir-206、mir-208。
可注射剂可以以常规形式制备，作为液体溶液剂或混悬剂、在注射前适合用于呈液体的溶液剂或混悬剂的固体形式或作为乳剂。或者，可以局部而不是全身的方式给予病毒载体，例如以贮库制剂或者持续释放制剂的形式。此外，所述病毒载体可以干燥到手术可植入的基质例如骨移植替代物、缝线、支架等(例如，如美国专利7,201,898所述)方式递送。
适于口服给予的药物组合物可以以离散单元存在，所述离散单元例如胶囊剂、扁囊剂、锭剂或片剂，其各自含有预定量的本发明组合物；作为粉剂或颗粒剂；作为在水性或非水性液体中的溶液剂或混悬剂；或作为水包油或油包水乳剂。口服递送可以通过将本发明的病毒载体与能够经受住动物肠道中的消化酶降解的载体复合而进行。这些载体的实例包括塑料胶囊剂或片剂，如本领域已知。这些制剂通过任何合适的制药方法制备，其包括使所述组合物和合适的载体(其可含有一种或多种如上所述的配合剂)缔合的步骤。一般而言，本发明实施方案的药物组合物按如下制备：将所述组合物与液体或细碎的固体载体或这两者均匀且密切地混合，并且然后，如果必要，使所得混合物成型。例如，片剂可以如下制备：通过将含有所述组合物的粉剂或颗粒剂任选与一种或多种配合剂一起压制或模制。压制片可按如下制备：在合适机器中，将自由流动形式的组合物例如任选与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂和/或表面活性/分散剂混合的粉剂或颗粒剂压制。模制片可按如下制备：在合适机器中，将用惰性液体粘合剂润湿的粉末状化合物模制。
适于含服(舌下)给予的药物组合物包括在矫味基料(通常是蔗糖和阿拉伯胶或西黄蓍胶)中包含本发明的组合物的锭剂；和在惰性基料（例如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶）中包含所述组合物的锭剂。
适于胃肠外给予的药物组合物可包含本发明组合物的无菌水性和非水性注射溶液剂，其制剂是任选与预期接受者的血液等渗。这些制剂可含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和溶质，其使得所述组合物与预期接受者的血液等渗。水性和非水性无菌混悬剂、溶液剂和乳剂可包括助悬剂和增稠剂。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄榄油、和可注射的有机酯例如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水性溶液剂、乳剂或混悬剂，包括盐水和缓冲介质。胃肠外溶媒包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格液或固定油类。静脉内溶媒包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于林格氏右旋糖的那些)等。也可存在防腐剂和其它添加剂，例如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。
所述组合物可以存在于单位/剂量或多剂量容器中，例如，在密封安瓿和小瓶中，并且可以贮存在冷冻干燥(冻干)条件下，临用前仅需要添加无菌液体载体，例如，盐水或注射用水。
临时的注射溶液剂和混悬剂可以由先前所述类型的无菌粉剂、颗粒剂和片剂制备。例如，可在密封容器中提供呈单位剂型的可注射、稳定、无菌的本发明组合物。可以冻干物形式提供所述组合物，其可用合适的制药上可接受的载体重构以形成适于注射入受试者的液体组合物。单位剂型可以是大约1µg至大约10克的本发明组合物。当所述组合物基本上不溶于水时，足够量的生理上可接受的乳化剂可以以足够的量包含以将所述组合物乳化在水性载体中。一种这样有用的乳化剂是磷脂酰胆碱。
适于直肠给予的药物组合物可以作为单位剂量栓剂提供。这些可以通过将组合物与一种或多种常规固体载体例如可可脂混合并随后使所得混合物成型而制备。
适于局部施用到皮肤的本发明的药物组合物可以采用软膏剂、乳膏剂、洗剂、糊剂、凝胶剂、喷剂、气溶胶或油的形式。可使用的载体包括但不限于凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、醇、透皮增强剂及其两种或更多种的组合。在一些实施方案中，例如，局部递送可以通过将本发明的药物组合物与能够进入皮肤的亲脂试剂(例如，DMSO)混合而进行。
适于透皮给予的药物组合物可以呈离散贴剂形式，其适于长期保持与受试者表皮的密切接触。适于透皮给予的组合物也可通过离子电渗法递送(参见例如Pharm. Res. 3:318 (1986))和通常采用本发明组合物的任选缓冲的水性溶液剂形式。合适的制剂可包含柠檬酸盐或bis\tris缓冲液(pH 6)或乙醇/水并且可含有0.1-0.2M活性成分。
本文公开的病毒载体可以通过合适的任何方式给予受试者的肺部，例如通过给予包含所述病毒载体的可呼吸颗粒的气溶胶混悬剂，其被受试者吸入。可呼吸颗粒可以是液体或固体。包含病毒载体的液体颗粒的气溶胶可以通过任何合适方式来制备，例如用压力驱动的气溶胶喷雾器或超声波喷雾器，如本领域技术人员已知。参见例如美国专利号4,501,729。包含病毒载体的固体颗粒的气溶胶可以同样地通过制药领域已知的技术，用任何固体微粒药物气溶胶发生器来制备。
Ⅳ.AAV衣壳靶向外周组织的用途
本发明的AAV衣壳和载体已被证明对于外周器官和组织是完全或几乎完全脱靶向的。这种脱靶向使得载体作为“空白”载体是理想的，所述“空白”载体可被改变而产生所需向性特征，例如，以靶向特定器官和组织和/或脱靶向其它器官和组织。因此，本发明的一方面涉及制备具有目的向性特征的AAV衣壳的方法，所述方法包括修饰本发明的AAV衣壳以插入提供目的向性特征的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述目的向性特征是增强的对选自以下的组织的选择性：骨骼肌、心肌、膈、肾、肝、胰腺、脾、胃肠道、肺、关节组织、舌、卵巢、睾丸、生殖细胞、癌细胞或其组合，和/或减弱的对选自以下的组织的选择性：肝、卵巢、睾丸、生殖细胞或其组合。
特异性靶向和脱靶向的序列的实例是本领域已知的。一个实例是优先肝向性的分子基础，在AAV2和AAV6的情况下，其已被作图到看起来涉及任一血清型与肝素的相互作用的连续的碱性足迹。具体而言，先前已经证明AAV6上的单个赖氨酸残基(K531)规定肝素结合能力并因此规定肝向性。推论是，用赖氨酸残基取代诱变在其它血清型上的相应谷氨酸/天冬氨酸残基可能通过在衣壳表面上形成最小连续碱性足迹赋予肝素结合。另一实例是包含在国际公开号WO 2012/093784中公开的在三折叠轴环4中的变化的衣壳突变体，所述国际公开号WO 2012/093784通过引用以其整体结合到本文中。这些突变体表现出一种或多种性质，其包括(i)减少的肝转导，(ii)增强的穿过内皮细胞的运动，(iii)全身的转导；(iv)增强的肌肉组织(例如，骨骼肌、心肌和/或膈肌)的转导，和/或(v)减少的脑组织(例如，神经元)的转导。其它向性序列描述于以下文献：Li等人, (2012) J. Virol. 86:7752-7759；Pulicherla等人, (2011) Mol. Ther. 19:1070-1078；Bowles等人, (2012) Mol. Ther.20:443-455；Asokan等人, (2012) Mol. Ther. 20:699-708；和Asokan等人, (2010)Nature Biotechnol. 28:79-82；所述文献各自通过引用以其整体结合。
在一些实施方案中，本发明的AAV衣壳可以通过DNA混杂(scrambling)和/或定向进化而修饰，以鉴定具有所需向性特征的修饰的衣壳。AAV衣壳的DNA混杂和定向进化的技术描述于国际公开号WO 2009/137006，其通过引用以其整体结合到本文中。
V. 靶向少突胶质细胞的嵌合AAV衣壳
本发明人已鉴定了相对于神经元和CNS的其它细胞能够优先转导少突胶质细胞的嵌合AAV衣壳结构。因此，本发明的一个方面涉及编码AAV衣壳的核酸，所述核酸包含与以下序列具有至少90%同一性的AAV衣壳编码序列的VP1、VP2或VP1/VP2编码部分，基本上由其组成或由其组成：(a) SEQ ID NO:129的核苷酸序列(BNP61)；或(b) 编码SEQ ID NO:130的核苷酸序列(BNP61)；其可操作连接至不同的AAV衣壳编码序列的VP3部分；和包含嵌合AAV衣壳的病毒。在一些实施方案中，AAV衣壳编码序列的VP1、VP2或VP1/VP2部分与(a)或(b)的核苷酸序列的VP1、VP2或VP1/VP2编码部分具有至少91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%或99%同一性。在另一个实施方案中，AAV衣壳编码序列包含(a)或(b)的核苷酸序列的VP1、VP2或VP1/VP2编码部分，基本上由其组成或由其组成。在一些实施方案中，不同的AAV衣壳编码序列的VP3编码部分是野生型衣壳序列(例如AAV8或AAV9)或不同于本发明的任何衣壳序列的嵌合序列。
在某些实施方案中，本发明的核酸进一步编码衣壳蛋白中的E532K取代(相对于AAV8衣壳序列编号)。
在一些实施方案中，编码AAV衣壳的核酸包含与编码SEQ ID NOS:131 (BNP62)或132 (BNP63)的核苷酸序列具有至少90%同一性的AAV衣壳编码序列的VP1、VP2或VP1/VP2编码部分，基本上由其组成或由其组成，其可操作连接至不同的AAV衣壳序列的VP3编码部分；和包含嵌合AAV衣壳的病毒。在一些实施方案中，AAV衣壳编码序列的VP1、VP2或VP1/VP2编码部分与编码SEQ ID NOS:131或132的核苷酸序列的VP1、VP2或VP1/VP2编码部分具有至少91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%或99%同一性。在另一个实施方案中，AAV衣壳编码序列包含编码SEQ ID NOS:131或132的核苷酸序列的VP1、VP2或VP1/VP2编码部分，基本上由其组成或由其组成，其可操作连接至不同的AAV衣壳编码序列的VP3部分。在一些实施方案中，不同的AAV衣壳编码序列的VP3编码部分是野生型衣壳序列(例如AAV8或AAV9)或不同于本发明的任何衣壳序列的嵌合序列。
在某些实施方案中，本发明的核酸还编码衣壳蛋白中的E532K取代(相对于AAV8衣壳序列编号)。
SEQ ID NO:130-132显示了本发明的VP1衣壳蛋白序列的实例。在本发明的描述和所附权利要求书中的所有氨基酸位置的命名是关于VP1编号。本领域技术人员会理解AAV衣壳通常也含有较小的VP2和VP3衣壳蛋白。由于AAV衣壳蛋白编码序列的重叠，根据SEQ IDNO:129-132所示的VP1序列，VP2和VP3衣壳蛋白的核酸编码序列和氨基酸序列将是显而易见的。具体地讲，VP2起始于SEQ ID NO:129的核苷酸412 (acg)和SEQ ID NO:130的苏氨酸148。VP3起始于SEQ ID NO:129的核苷酸607 (atg)和SEQ ID NO:130的甲硫氨酸203。在某些实施方案中，包含来自SEQ ID NO:130-132的序列的分离的VP2和VP3衣壳蛋白以及编码VP2或VP3蛋白或二者的分离的核酸都被考虑。
在某些实施方案中，本发明的衣壳还包含E532K取代(相对于AAV8衣壳序列编号)。
本发明也提供嵌合AAV衣壳蛋白和嵌合衣壳，其中所述衣壳蛋白包含在SEQ IDNO:130-132之一中所示的氨基酸序列、基本上由在SEQ ID NO:130-132之一中所示的氨基酸序列组成或由在SEQ ID NO:130-132之一中所示的氨基酸序列组成，其中SEQ ID NO:130-132之一的衣壳蛋白编码序列内的1个、2个或更少、3个或更少、4个或更少、5个或更少、6个或更少、7个或更少、8个或更少、9个或更少、10个或更少、12个或更少、15个或更少、20个或更少、25个或更少、30个或更少、40个或更少、或50个或更少的氨基酸被另一氨基酸(天然存在的、经修饰的和/或合成的)取代，任选保守氨基酸取代，和/或被缺失和/或存在1个、2个或更少、3个或更少、4个或更少、5个或更少、6个或更少、7个或更少、8个或更少、9个或更少、10个或更少、12个或更少、15个或更少、20个或更少、25个或更少、30个或更少、40个或更少、或50个或更少氨基酸的插入(包括N-末端和C-末端延伸)或取代、缺失和/或插入的任何组合，其中取代、缺失和/或插入不会过分损害包含变体衣壳蛋白或衣壳的病毒粒(例如，AAV病毒粒)的结构和/或功能。例如，在本发明的代表性实施方案中，包含嵌合衣壳蛋白的AAV病毒粒基本上保留包含在SEQ ID NO:130-132之一中所示的嵌合衣壳蛋白的嵌合病毒粒的至少一种性质。例如，包含嵌合衣壳蛋白的病毒粒可以基本上保留包含在SEQ ID NO:130-132之一中所示的嵌合AAV衣壳蛋白的病毒粒的少突胶质细胞向性特征。评价生物学性质例如病毒转导的方法是本领域周知的(参见例如实施例)。
本发明的另外的实施方案涉及编码AAV8衣壳的核酸，所述衣壳包含E532K取代。在一些实施方案中，所述核酸包含与以下序列具有至少90%同一性的AAV衣壳编码序列，基本上由其组成或由其组成：(a) SEQ ID NO:133的核苷酸序列(AAV8 E532K衣壳核苷酸序列)；或(b) 编码SEQ ID NO:134 (AAV8 E532K衣壳氨基酸序列)的核苷酸序列；和包含嵌合AAV衣壳的病毒。在一些实施方案中，AAV衣壳编码序列与(a)或(b)的核苷酸序列具有至少91%,92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%或99%同一性。在另一个实施方案中，AAV衣壳编码序列包含(a)或(b)的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成。在一些实施方案中，AAV8E532K衣壳编码序列还包含本发明的衣壳序列的VP1、VP2或VP1/VP2编码部分。
保守氨基酸取代是本领域已知的。在具体的实施方案中，保守氨基酸取代包括在以下的一个或多个组内的取代：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和/或苯丙氨酸、酪氨酸。
对本领域技术人员而言显而易见的是，SEQ ID NO:130-132的嵌合AAV衣壳蛋白和/或AAV8 E532K取代的氨基酸序列可以被进一步修饰以掺入本领域已知的其它修饰，以赋予所需性质。作为非限制性可能性，衣壳蛋白可以被修饰以掺入靶向序列(例如，RGD)或者有利于纯化和/或检测的序列。例如，可将衣壳蛋白与谷胱甘肽-S-转移酶、麦芽糖结合蛋白、肝素/硫酸乙酰肝素结合结构域、聚His、配体和/或报告蛋白(例如，绿色荧光蛋白、β-葡萄糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶等)、免疫球蛋白Fc片段、单链抗体、血凝素、c-myc、FLAG表位等的全部或一部分融合，以形成融合蛋白。将靶向肽插入AAV衣壳的方法是本领域已知的(参见例如国际专利公开WO 00/28004；Nicklin等人, (2001) Mol. Ther. 474-181；White等人, (2004) Circulation 109:513-319；Muller等人, (2003) Nature Biotech. 21:1040-1046。
本发明的病毒可以进一步包含双链体化病毒基因组，如在国际专利公开WO 01/92551和美国专利号 7,465,583中所述。
本发明也提供包含本发明的嵌合AAV衣壳蛋白的AAV衣壳和包含该AAV衣壳的病毒颗粒(即病毒粒)，其中所述病毒颗粒包装(即壳体化)载体基因组，任选AAV载体基因组。在具体的实施方案中，本发明提供包含含有本发明的AAV衣壳蛋白的AAV衣壳的AAV颗粒，其中所述AAV衣壳包装AAV载体基因组。本发明也提供包含由本发明的嵌合核酸衣壳编码序列编码的AAV衣壳或AAV衣壳蛋白的AAV颗粒。
在具体的实施方案中，所述病毒粒是包含例如用于递送到细胞的目的异源核酸的重组载体。因此，本发明可用于在体外、离体和在体内将核酸递送到细胞。在代表性的实施方案中，本发明的重组载体可以有利地用于将核酸递送或转移到动物(例如，哺乳动物)细胞。
任何异源核苷酸序列都可以通过本发明的病毒载体递送。目的核酸包括编码多肽、任选治疗性(例如，用于医用或兽用)和/或免疫原性(例如，用于疫苗)多肽的核酸。
在一些实施方案中，所述多肽是刺激少突胶质细胞生长和/或分化的多肽。实例包括但不限于胰岛素样生长因子-1、神经胶质衍生的神经营养因子、神经营养蛋白-3、artemin、转化生长因子α、血小板衍生的生长因子、白血病抑制因子、催乳素、单羧酸转运蛋白1或核因子1A。
治疗性多肽包括但不限于上文描述的那些。
编码多肽的异源核苷酸序列包括编码上文所述的报告多肽的那些。
或者，异源核酸可编码反义寡核苷酸、核酶、实现剪接体-介导的反式-剪接的RNA、介导基因沉默的干扰RNA (RNAi)包括小干扰RNA (siRNA)、微RNA或其它非翻译的“功能”RNA，例如“指导”RNA等，如上文所述。
本发明还提供表达免疫原性多肽的重组病毒载体，例如用于疫苗接种，如上文所述。
或者，所述异源核苷酸序列可以编码任何多肽，其在体外、离体或在体内在细胞内合意地产生。例如，可将所述病毒载体引入培养细胞并从中分离表达的蛋白产物。
本领域技术人员将理解，目的异源核酸可与上述的合适的控制序列操作性关联。有利的是，与现有技术的AAV载体(其需要使用少突胶质细胞-特异性启动子)相比，本发明的少突胶质细胞-特异性的嵌合衣壳允许使用组成型启动子从而以少突胶质细胞-特异性的方式表达目的异源核酸。
本发明也提供包含AAV衣壳和AAV基因组的嵌合AAV颗粒，其中所述AAV基因组“对应于”(即编码)AAV衣壳。也提供的是这些嵌合AAV颗粒的集合或文库，其中所述集合或文库包含2个或更多、10个或更多、50个或更多、100个或更多、1000个或更多、104个或更多、105个或更多、或106个或更多不同序列。
本发明进一步包括“空”衣壳颗粒(即没有载体基因组)，其包含本发明的嵌合AAV衣壳蛋白、由本发明的嵌合AAV衣壳蛋白组成或基本上由本发明的嵌合AAV衣壳蛋白组成。本发明的嵌合AAV衣壳可用作“衣壳媒介物”，如在美国专利号5,863,541中所述。可与病毒衣壳共价连接、结合或被其包装并转移到细胞中的分子包括DNA、RNA、脂质、碳水化合物、多肽、有机小分子或其组合。此外，分子可以与病毒衣壳外面缔合(例如，“束缚至”)，用于将分子转移至宿主靶细胞中。在本发明的一个实施方案中，将所述分子与衣壳蛋白共价连接(即缀合或化学偶联)。将分子共价连接的方法是本领域技术人员已知的。
本发明的病毒衣壳在产生针对新的衣壳结构的抗体中也找到用途。作为进一步的备选方案，可将外源氨基酸序列插入病毒衣壳，用于将抗原呈递给细胞，例如用于给予受试者以产生对外源氨基酸序列的免疫应答。
本发明也提供编码本发明嵌合病毒衣壳和嵌合衣壳蛋白的核酸(例如，分离的核酸)。进一步提供的是包含所述核酸的载体和包含本发明的核酸和/或载体的细胞(在体内或在培养中)。这样的核酸、载体和细胞可用作例如用于产生如本文所述的病毒载体的试剂(例如，辅助构建体或包装细胞)。
在例示性的实施方案中，本发明提供编码SEQ ID NO:130-132的AAV衣壳或与SEQID NO:129的核苷酸序列具有至少90%同一性的核酸序列。本发明也提供编码如上所述的AAV衣壳变体、衣壳蛋白变体和融合蛋白的核酸。在具体的实施方案中，所述核酸在本领域技术人员已知的标准条件下与本文中明确公开的核酸序列的互补物杂交并编码变体衣壳和/或衣壳蛋白。任选地，所述变体衣壳或衣壳蛋白基本上保留由SEQ ID NO:129的核酸序列编码的衣壳和/或衣壳或衣壳蛋白的至少一种性质。例如，包含所述变体衣壳或变体衣壳蛋白的病毒颗粒可以基本上保留包含由SEQ ID NO:129核酸编码序列编码的衣壳或衣壳蛋白的病毒颗粒的少突胶质细胞向性特征。
例如，这些序列的杂交可以在减少的严格性、中等严格性或甚至严格性条件的条件下进行，如上所述。
在其它实施方案中，编码本发明变体衣壳或衣壳蛋白的核酸序列与SEQ ID NO:129的核酸序列具有至少大约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或更高序列同一性，并且任选地编码基本上保留由SEQ ID NO:129的核酸编码的衣壳或衣壳蛋白的至少一种性质的变体衣壳或衣壳蛋白。
如本领域已知的，许多不同的程序可用于鉴定核酸或多肽是否与上述的已知序列具有序列同一性。
在具体的实施方案中，所述核酸可包含载体、基本上由载体组成或由载体组成，所述载体包括但不限于质粒、噬菌体、病毒载体(例如，AAV载体、腺病毒载体、疱疹病毒载体或杆状病毒载体)、细菌人工染色体(BAC)、或酵母人工染色体(YAC)。例如，所述核酸可包含含有5’和/或3'末端重复(例如，5'和/或3'AAV末端重复)的AAV载体、由包含5’和/或3'末端重复(例如，5'和/或3'AAV末端重复)的AAV载体组成或基本上由包含5'和/或3'末端重复(例如，5'和/或3' AAV末端重复)的AAV载体组成。
在一些实施方案中，编码所述嵌合AAV衣壳蛋白的核酸进一步包含AAV rep编码序列。例如，所述核酸可以是用于产生病毒原种(viral stock)的辅助构建体。
本发明也提供包装细胞，其稳定地包含本发明的核酸，如上所述。
所述核酸可以被并入递送载体，例如病毒递送载体。为了说明，本发明的核酸可以被包装在AAV颗粒、腺病毒颗粒、疱疹病毒颗粒、杆状病毒颗粒或任何其它合适的病毒颗粒中。
此外，所述核酸可以与启动子元件操作性关联。启动子元件在本文中有更详细描述。
本发明还提供产生本发明的病毒载体的方法，如上文所述。
本发明的包装方法可用于产生高滴度的病毒颗粒原种。在具体的实施方案中，病毒原种具有至少大约105转导单位(tu)/ml、至少大约106tu/ml、至少大约107tu/ml、至少大约108tu/ml、至少大约109tu/ml、或至少大约1010tu/ml的滴度。
新的衣壳蛋白和衣壳结构在产生抗体中找到用途，例如用于诊断性用途或治疗性用途或作为研究试剂。因此，本发明也提供针对如上所述的本发明的新的衣壳蛋白和衣壳的抗体。
VI. 使用靶向少突胶质细胞的嵌合AAV衣壳的方法
本发明也涉及将异源核苷酸序列递送到少突胶质细胞的方法。可以使用本发明的病毒载体，例如以将目的核苷酸序列在体外递送到少突胶质细胞，例如，以在体外产生多肽或核酸或用于离体基因治疗。所述载体额外地可用于将核苷酸序列递送给有需要的受试者例如以表达治疗性或免疫原性多肽或核酸的方法。以此方式，可因此在受试者体内产生所述多肽或核酸。所述受试者可以是需要所述多肽或核酸，因为该受试者缺乏所述多肽，或因为在该受试者中的所述多肽或核酸的产生可给予某些疗效，作为治疗方法或其它，并且如以下进一步所解释。
在具体的实施方案中，所述载体可用于表达多肽或核酸，所述多肽或核酸为少突胶质细胞提供有益作用，例如，促进少突胶质细胞的生长和/或分化。将载体靶向少突胶质细胞的能力可以特别可用于治疗涉及少突胶质细胞功能失调和/或神经元脱髓鞘的疾病或病症。在其它实施方案中，所述载体可用于表达为少突胶质细胞附近的细胞(例如，神经元)提供有益作用的多肽或核酸。
因此，本发明的一方面涉及将目的核酸递送到少突胶质细胞的方法，所述方法包括使少突胶质细胞接触本发明的AAV颗粒。
在另一方面中，本发明涉及在哺乳动物受试者中将目的核酸递送到少突胶质细胞的方法，所述方法包括将有效量的本发明的AAV颗粒或药物制剂给予哺乳动物受试者。
本发明的另外方面涉及在有需要的受试者中治疗少突胶质细胞功能失调相关病症的方法，所述方法包括将治疗有效量的本发明的AAV颗粒给予受试者。在一个实施方案中，少突胶质细胞功能失调的相关病症是脱髓鞘疾病。在一个实施方案中，少突胶质细胞功能失调的相关病症是多发性硬化、佩利措伊斯-梅茨巴赫病(Pelizaeus-Merzbacherdisease)、克拉伯病(Krabbe’s disease)、异染性脑白质营养不良、肾上腺脑白质营养不良、卡纳万病(Canavan disease)、亚历山大病(Alexander disease)、正染脑白质营养不良(orthochromatic leukodystrophy)、Zellweger病、18q-综合征、脑麻痹、脊髓损伤、创伤性脑损伤、中风、苯丙酮尿或病毒感染、或已知或以后发现与少突胶质细胞功能失调相关的任何其它病症。在另一个实施方案中，本发明的方法用于治疗这样的病症，所述病症与少突胶质细胞功能失调并非直接相关，但通过异源多肽或核酸除了在神经元、星形细胞或其它CNS细胞种类中的表达之外在少突胶质细胞中的表达会获益或者通过异源多肽或核酸在少突胶质细胞中的表达而非在神经元、星形细胞或其它CNS细胞种类中的表达会获益。实例包括但不限于神经变性病症例如阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)、帕金森病(Parkinson's disease)、和亨廷顿舞蹈病(Huntington's disease)、CNS肿瘤和其它CNS病症，如上所述。
在本发明的另一方面中，本发明的嵌合AAV衣壳和载体是完全或近乎完全脱靶向的(detargeted)载体，其可以针对用于靶向一种或多种外周器官或组织的所期望的向性特征被进一步修饰，如上所述。在该方面，本发明也涉及将异源核苷酸序列递送到宽范围的细胞的方法，所述宽范围的细胞包括分裂的和非分裂的细胞。本发明的病毒载体可以用于在体外将目的核苷酸序列递送给细胞，例如，以在体外产生多肽或用于离体基因治疗。所述载体额外地可用于将核苷酸序列递送给有需要的受试者例如以表达治疗性或免疫原性多肽或核酸的方法。以此方式，可因此在受试者体内产生所述多肽或核酸。所述受试者可以是需要该多肽或核酸，因为所述受试者缺乏所述多肽，或因为在受试者中的所述多肽或核酸的产生可能给予某些疗效，作为治疗方法或其它，并且如以下进一步所解释。
一般而言，本发明的病毒载体可用于递送具有生物学效果的任何外源核酸以治疗或减轻与涉及基因表达的任何病症相关的症状。此外，本发明可用于治疗递送治疗性多肽是有利的任何疾病状态。说明性的疾病状态包括上文所述的那些。
本发明的病毒载体也可用于在体外或体内提供反义核酸或抑制性RNA (例如，微RNA或RNAi例如siRNA或shRNA)到细胞。抑制性RNA在靶细胞中的表达减少了特定蛋白经细胞的表达。因此，可以给予抑制性RNA以在有需要的受试者中减少特定蛋白的表达。也可在体外将抑制性RNA给予细胞，以调节细胞生理学，例如，以优化细胞或组织培养系统。
作为进一步的方面，本发明的病毒载体可用于在受试者中产生免疫应答。按照本实施方案，可将包含编码免疫原的核酸的病毒载体给予受试者，并且针对该免疫原的活性免疫应答(任选地保护性免疫应答)通过受试者产生。免疫原如上文所述。
或者，可将病毒载体给予离体细胞并将改变的细胞给予受试者。将所述异源核酸引入细胞，并将所述细胞给予受试者，其中任选表达编码免疫原的异源核酸并在受试者中诱导针对免疫原的免疫应答。在具体的实施方案中，所述细胞是抗原呈递细胞(例如，树突细胞)。
也可给予本发明的病毒载体，用于癌症免疫治疗，即通过给予表达癌细胞抗原(或免疫上类似的分子)或产生针对癌细胞的免疫应答的任何其它免疫原的病毒载体，如上所述。所述病毒载体可以在体内或通过使用离体方法给予受试者，如本文所述。
在具体的实施方案中，可将细胞从患癌症的受试者中取出并与本发明的病毒载体接触。随后将修饰的细胞给予所述受试者，藉此引起针对癌细胞抗原的免疫应答。该方法特别有利地用于无免疫应答的受试者，所述受试者体内不能产生足够的免疫应答(即不能以足够量产生增强的抗体)。
本领域已知的是通过免疫调节性细胞因子(例如，α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、ω-干扰素、τ-干扰素、白介素-1α、白介素-1β、白介素-2、白介素-3、白介素-4、白介素5、白介素-6、白介素-7、白介素-8、白介素-9、白介素-10、白介素-11、白介素12、白介素-13、白介素-14、白介素-18、B细胞生长因子、CD40配体、肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β、单核细胞趋化蛋白-1、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、和淋巴毒素)可以增强免疫应答。因此，免疫调节性细胞因子(例如，CTL诱导的细胞因子)可以与所述病毒载体联合给予受试者。
细胞因子可以以本领域已知的任何方法给予。可将外源细胞因子给予受试者，或备选地，可使用合适的载体将编码细胞因子的核苷酸序列递送到受试者，并在体内产生细胞因子。
所述病毒载体进一步可用于靶向少突胶质细胞，用于研究目的，例如用于在体外或动物中研究CNS功能或用于产生和/或研究疾病的动物模型。例如，所述载体可用于在脱髓鞘疾病动物模型中递送异源核酸到少突胶质细胞。脱髓鞘可通过各种方式在动物中诱发，所述方式包括但不限于给予病毒(例如，西门利启病毒(Semliki virus)、鼠肝炎病毒、或塞勒氏(Theiler’s)鼠脑脊髓炎病毒)和给予化学品(例如，双环己酮草酰二腙（cuprizone）、溴化乙锭或溶血卵磷脂)。在一些实施方案中，所述载体也可用于实验性自身免疫脑脊髓炎的动物模型。该病况可以通过例如给予钾盐镁矾、SIN-1、抗半乳糖脑苷脂或辐射而诱发。在其它实施方案中，所述病毒载体可用于将毒剂或产生毒剂的酶(例如，胸苷激酶)特异性递送到少突胶质细胞，以杀伤一些或全部细胞。
此外，本发明的病毒载体在诊断和筛选方法中找到另外的用途，藉此目的基因在细胞培养系统中或备选地在转基因动物模型中瞬时或稳定地表达。也可实践本发明以递送核酸，用于蛋白生产的目的，例如用于实验室、工业或商业目的。
本发明的重组病毒载体在兽用和医用二者中都找到用途。合适的受试者包括禽类和哺乳动物，如上所述。任选地，所述受试者“需要”本发明的方法，例如，因为所述受试者具有以下病症或据信处于其风险中，所述病症包括本文所述的那些病症或会从包括本文所述的那些的核酸的递送中获益。例如，在具体的实施方案中，所述受试者具有(或已经具有)脱髓鞘病症或脊髓或脑损伤或处于其风险中。作为另外的选项，所述受试者可以是实验室动物和/或疾病的动物模型。
在具体的实施方案中，本发明提供药物组合物，其包含在制药上可接受的载体中的本发明的病毒载体，和任选其它医药剂、制药剂、稳定剂、缓冲液、载体、佐剂、稀释剂等。对于注射，所述载体通常会是液体。对于其它给予方法，所述载体可以是固体或液体。对于吸入给予，所述载体会是可呼吸的，并且会优选呈固体或液体颗粒形式。
对于“制药上可接受的”意指无毒或无以其它方式不想要的材料，即所述材料可以给予受试者而不引起任何不想要的生物学效应。
本发明的一方面是将核苷酸序列转移到体外细胞的方法。按照适合特定靶细胞的标准转导方法，可将所述病毒载体以合适的感染复数引入细胞。给予的病毒载体或衣壳的滴度可以不同，这取决于靶细胞类型和数量，和特定病毒载体或衣壳，并且可由本领域技术人员无需过度实验而确定。在具体的实施方案中，将至少大约103感染单位，更优选至少大约105感染单位引入细胞。
病毒载体可引入的细胞可以具有任何类型，如上文所述。
可将所述病毒载体在体外引入细胞，用于将修饰的细胞给予受试者的目的。在具体的实施方案中，所述细胞已从受试者中取出，将所述病毒载体引入其中，并随后将所述细胞放回受试者中。将细胞从受试者中取出用于离体处理，接着放回受试者中的方法是本领域已知的(参见例如美国专利号5,399,346)。或者，将重组病毒载体引入来自另一受试者的细胞，引入培养的细胞，或引入来自任何其它合适来源的细胞，并将所述细胞给予有需要的受试者。
用于离体基因治疗的合适细胞如上所述。给予受试者的细胞剂量将因受试者的年龄、病况和物种、细胞种类、细胞表达的核酸、给予方式等而不同。通常，每一剂量将给予在制药上可接受的载体中的至少大约102至大约108或大约103至大约106个细胞。在具体的实施方案中，将用所述病毒载体转导的细胞以有效量与药物载体组合给予受试者。
在一些实施方案中，可以给予用病毒载体转导的细胞，以引起针对所递送的多肽(例如，作为转基因或在衣壳中表达)的免疫原性反应，如上所述。
本发明的另外方面是将本发明的病毒载体或衣壳给予受试者的方法。在具体的实施方案中，所述方法包括将目的核酸递送到动物受试者的方法，所述方法包括：将有效量的本发明的病毒载体给予动物受试者。将本发明的病毒载体给予有需要的人类受试者或动物可以通过本领域已知的任何方式进行。任选地，所述病毒载体以有效剂量在制药上可接受的载体中被递送。
本发明的病毒载体可以进一步给予受试者，以引起免疫原性反应(例如，作为疫苗)，如上所述。
要给予受试者的病毒载体的剂量会取决于给予方式、要治疗的疾病或病况、单个受试者的病况、具体的病毒载体和要递送的核酸，并且可以常规方式来确定。达到疗效的例示性的剂量是至少大约105、106、107、108、109、1010、1011、1012、103、1014、1015转导单位或更多、优选大约107或108、109、1010、1011、1012、1013或1014转导单位、还更优选大约1012转导单位的病毒滴度。
在具体的实施方案中，可以采用不止一次给予(例如，2、3、4次或更多次给予)，以在不同间隔时段内(例如每天、每周、每月、每年等)实现所需水平的基因表达。
例示性的给予方式包括口服、直肠、透粘膜、局部、鼻内、吸入(例如，经由气溶胶)、含服(例如，舌下)、阴道、鞘内、眼内、透皮、宫内(或卵巢内)、胃肠外(例如，静脉内、皮下、皮内、肌肉内[包括给予骨骼肌、膈肌和/或心肌]、皮内、胸膜内、脑内和关节内)、局部(例如，到皮肤和粘膜二者表面，包括气道表面、和透皮给予)、淋巴内等以及直接组织或器官注射(例如，到肝脏、骨骼肌、心肌、膈肌或脑)。也可给予到肿瘤(例如在肿瘤或淋巴结内或附近)。在任何给定情况下，最合适的途径将取决于所治疗病况的性质和严重性以及所使用的具体载体的性质。
在一些实施方案中，将所述病毒载体直接给予CNS，例如，脑或脊髓。直接给予可以导致对少突胶质细胞的高度特异性转导，例如，其中至少80%、85%、90%、95%或更多的转导细胞是少突胶质细胞。本领域已知的将载体直接给予CNS的任何方法都可使用。所述载体可以被引入脊髓、脑干(延髓、脑桥)、中脑(下丘脑、丘脑、上丘脑、脑下垂体、黑质、松果体)、小脑、终脑(纹状体、大脑包括枕叶、颞叶、顶叶和额叶、皮质、基底神经节、海马和杏仁核)、边缘系统、新皮质、纹状体、大脑和下丘。所述载体也可给予眼的不同区例如视网膜、角膜或视神经。所述载体可以递送到脑脊液(例如，通过腰椎穿刺)，用于所述载体的更分散的给予。
所述递送载体可以通过本领域任何已知途径给予CNS的所需区，包括但不限于：鞘内、脑内、心室内、鼻内、耳内、眼内(例如，玻璃体内、视网膜下、前房)和眼周围(例如，下Tenon's区)递送或其任何组合。
通常，所述病毒载体会以液体制剂的形式通过直接注射(例如，立体定位注射)给予到CNS中的所需区或区室。在一些实施方案中，所述载体可以经由贮池和/或泵来递送。在其它实施方案中，所述载体可以通过局部施用到所需区或通过鼻内给予气溶胶制剂来提供。可以通过局部施用液体液滴给予到眼或给予入耳。作为另外的备选方案，所述载体可以作为固体的缓释制剂给予。细小病毒和AAV载体的控释描述于国际专利公开WO 01/91803。
在其中受试者具有损害的血脑屏障(BBB)的一些实施方案中，所述病毒载体可以全身地递送(例如，静脉内)到受试者，其中所述载体转导在BBB受损区(例如毗邻)中的少突胶质细胞。在某些实施方案中，所述载体转导在受损区中的细胞而非非受损区中的细胞。因此，本发明的一方面涉及在哺乳动物受试者中将目的核酸递送到与损害的血脑屏障区域毗邻的CNS区的方法，所述方法包括静脉内给予有效量的本发明的AAV颗粒。
在一些实施方案中，BBB的损害是由于上文所述的疾病或病症导致。在其它实施方案中，BBB损害可以是一种诱导的破坏，例如以促进递送试剂至CNS，如上文所述。
可注射剂可以以常规形式制备，作为液体溶液剂或混悬剂、在注射前适合用于呈液体的溶液剂或混悬剂的固体形式或作为乳剂。或者，可以局部而不是全身的方式给予病毒载体，例如以贮库制剂或者持续释放制剂的形式。此外，所述病毒载体可以干燥递送到手术可植入的基质例如骨移植替代物、缝线、支架等(例如，如美国专利7,201,898所述)。
适合于不同的给药途径的药物组合物可如上文所述。
已经描述了本发明，其将在以下实施例中更详细解释，所述实施例包括在本文中仅用于说明的目的，而无意限制本发明。
实施例1
具有提高的CNS向性和最小的外周器官向性的AAV衣壳的开发
AAV衣壳通过称为衣壳DNA改组(shuffling)和定向进化的方法开发，其用于产生新的AAV衣壳序列的文库。然后在小鼠中将这些衣壳经受多轮选择性压力，其中在各轮选择之间发生可能另外的衣壳突变。回收的衣壳克隆用作报告转基因(GFP)或治疗转基因(对于Rett综合征的MeCP2)的载体，和在小鼠中评价生物分布和治疗潜力。
使用的原始文库由自AAV血清型1、2、6、8、9和rh10改组的衣壳组成。还并入另外的工程改造衣壳：AAV2.5, AAV2i8, AAV9.47, Seiz32, Seiz83和来自Dr. Gray实验室的未描述的衣壳(倒转克隆1和114)。文库按之前所述产生(Li et al., Mol. Ther. 16:1252-1260 (2008))。野生型小鼠或模拟Rett综合征的小鼠(B6.129P2(C)-Mecp2 tm1.1Bird /J)用于体内选择。对于各轮选择，小鼠(WT小鼠、敲除的雄性Rett小鼠、杂合的雌性Rett小鼠)接受单次腰椎鞘内注射文库，然后2-5天后从颈部脊髓和多个脑区域回收组织。按所述的(Li et al., Mol. Ther. 16:1252-1260 (2008))，从这些样品，将组织经机械解离，以优先回收神经元。从神经元富集的样品中使用DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen, cat. #69506)回收DNA。使用taq聚合酶以低起始模板和50个扩增循环，用之前描述的引物(Li et al., Mol.Ther. 16:1252-1260 (2008))，使用易错PCR以在各轮之间进一步使文库多样化。合并的PCR产物经克隆回到WT AAV骨架(pSSV9)，和合并的克隆用于产生下一轮的起始文库。用腺病毒辅助质粒(pXX680)和10倍过量的包含AAV2 Rep和Cap的pXR2，将合并的克隆转染至HEK293细胞。通过这种方法，嵌合衣壳被包装至大部分AAV2衣壳。然后，AAV2-衣壳化的嵌合体以0.5基因组/细胞的MOI与5感染单位/细胞的MOI的WT腺病毒一起加入至HEK293细胞，以在其自身的衣壳中主要包装各嵌合AAV基因组。72小时后，收获细胞，按所述纯化病毒(Grieger et al., Nat. Protoc. 1:1412-28 (2006))和通过qPCR滴定。进行总共3轮选择。在各轮后回收的衣壳样品亚克隆至重组AAV2骨架(缺少ITR元件)和有SSV9复制能力的骨架，并测序。
为了评价回收的衣壳的生物分布和(在一些情况下，治疗潜力)，通过单次腰椎鞘内给药以5微升的体积，将一些克隆给予至小鼠。当评价生物分布时，注射后2-4周处死小鼠，和按所述分析组织样品的载体DNA生物分布(Li et al., Mol. Ther. 16:1252-1260(2008))。当评价回收的衣壳克隆的治疗潜力时，将人MeCP2基因(由小鼠MeCP2启动子驱动)包装至各衣壳中，然后通过腰椎鞘内注射给予至4-5周龄的雄性敲除Rett小鼠。监测小鼠损失其峰值体重的20%的时间，其用作预定的终点以表明存活，如之前所述(Gadallaet al.,Mol. Ther.21(1):18-30 (2013))。
代表性的克隆在图1-3中显示。克隆ITbrain-2.02和ITbrain-2.04的CNS向性在图4A-4E中显示。除非在图4A中指明的，向成年WT C57BL/6小鼠经IT注射1x1010 vg的scAAV/GFP载体，然后在注射后3周时处死用于GFP表达的IHC和外周器官的qPCR生物分布。图4B =前脑，皮层。图4C = 中脑，海马。图4D = 后脑，小脑。图4E显示腰脊髓的腹角和中央管。n.d.= 无数据。(A)中的标度尺表示S.E.M。(B-E)的标度尺在右下角显示，并且是100微米。AAV9表示在CSF内给药后用于广泛CNS基因转移的当前“金标准”，和Olig001是单独衍生的改组衣壳。图5显示克隆ITcord-1.06和ITcord3.03的CNS和外周分布。向成年WT C57BL/6小鼠经IT注射1x1010 vg的scAAV/GFP载体，然后在注射后3周时处死，用于CNS组织和外周器官的qPCR生物分布。误差棒表示SEM。图6显示克隆RTTF-1.11的CNS向性。该图表明来自在4-5周龄时接受鞘内注射克隆F1.11 (包装了GFP基因，1x1010 vg/小鼠)，然后4周后处死的小鼠的脑切片的抗-GFP免疫组织化学。与WT小鼠(右)相比，来自Rett小鼠的图片(左)显示沿整个前后轴的更强转导。显示了代表性的结果。
测试了9种嵌合AAV/GFP病毒的转导效率和向性。各病毒经池内注射(5E10 vg/小鼠)至5-7月龄的三只MeCP2+/-雌性小鼠(除非另外注明)。注射后三周，小鼠经灌流和收获脑。在包含4%低聚甲醛的1X PBS中固定48小时后，使用Leica VT 1000S震动刀片切片机将脑以50 µm切片。在室温下将切片在5%正常山羊血清/0.3M PBST中孵育1小时，然后在第一抗体溶液(5%山羊血清/0.3M PBST，鸡抗-GFP (Aves; 1:500)加兔抗-小鼠MeCP2 (CellSignaling; 1:500)，或鸡抗-GFP (Aves; 1:500)加兔抗-小鼠NeuN (Cell Signaling; 1:500))中在4°C下孵育40 – 48小时。用0.3M PBST洗涤三次后，在室温下在第二抗体溶液(0.3M PBST，山羊抗-鸡Alexa-fluor 488 (Invitrogen; 1:1000)，山羊抗兔Alexa-fluor594 (Invitrogen; 1:1000))中将切片孵育4小时，然后用0.3M PBST再洗涤三次。然后在室温下将切片用0.5 µg/mL DAPI/0.3M PBST孵育30分钟和用0.3M PBS洗涤一次。免疫标记的切片使用Zeiss LSM 780共焦显微镜成像。使用20X物镜和4X数字缩放获得图像。
为了评价对特定脑区的转导效率，对于来自海马、皮层、脑干、下托、脑核和小脑的切片的随机区域(n = 12 – 25)，计算表达GFP的神经元与DAPI-染色的核的比率。平均转导效率/衣壳通过将所有分析的平均效率取平均值来计算(图7)。为了确定MeCP2向性，对于每个以下区域，计算GFP+/MeCP2+神经元与GFP+神经元的比率：海马、皮层、脑干、下托、脑核和小脑(图8)。具有神经胶质形态学的细胞不用于计算MeCP2向性，因为在遗传上WT的神经胶质细胞可以太低而不能通过免疫荧光检测的水平表达MeCP2。与用于MeCP2类似的方法用于计算NeuN向性(图9)。
实施例2
优先靶向少突胶质细胞的AAV衣壳的开发
材料和方法
AAV衣壳DNA改组和体内克隆拯救
由来自AAV血清型1–6、8、9、rh10的改组衣壳、数种嵌合衣壳和突变体衣壳，和含E533K突变的AAV8组成的文库使用之前所述的方法产生(Li et al., Mol. Ther. 16:1252(2008))。将改组文库静脉内注射至之前接受纹状体6-羟基多巴胺处理的大鼠。三天后，处死大鼠和自纹状体机械解离细胞。自神经元富集的样品使用Qiagen DNeasy血液和组织试剂盒回收DNA，和随后通过乙醇沉淀浓缩。用之前所述的引物，Expand Long Template PCRSystem (目录号11681834001，低起始模板，50个循环；Roche, Indianapolis, IN)用于回收完整衣壳文库序列(Li et al., Mol. Ther. 16:1252 (2008))。随后使用易错PCR步骤在各轮之间进一步将文库多样化。合并的突变产生的PCR产物经克隆回到WT AAV骨架(pSSV9)，和合并的克隆用于产生下一轮的起始文库。用腺病毒辅助质粒(pXX680)和10倍过量的包含AAV2 rep和cap的pXR2，将合并的克隆转染至HEK293细胞。通过该方法，嵌合衣壳基因组被包装至大部分AAV2衣壳中。AAV2-衣壳化的嵌合文库的滴度使用qPCR确定。然后，AAV2-衣壳化的嵌合物以0.5 vg/细胞的多重性感染与5感染单位/细胞的多重性感染的WT腺病毒一起加入至HEK293细胞，以在其自身的衣壳中主要包装各嵌合AAV基因组。48 h后，收获细胞和按所述纯化病毒(Gray et al., Gene Ther. 20:450 (2013))和通过qPCR滴定。进行总共两轮选择。回收的克隆在每轮后回收和亚克隆至rAAV pXR2骨架和有SSV9复制能力的骨架，并测序。
克隆
在pGSK2/8 (repAAV2-capAAV8)中使用定点诱变(Agilent quik change II kit)，制备AAV8/E532K以引入单突变(E532K，使用Olig001 VP1编号)。使用Agilent QuikChangePrimer Design Program设计引物；正向：5'gggaaaaaaacgctccttgtcgtctttgtgtgttg3'(SEQ ID NO:135)和反向：5’CAACACACAAAGA CGACAAGGAGCGTTTTTTTCCC (SEQ ID NO:136)。使单菌落生长和通过Sanger测序验证。为了制备Olig001/AAV8 VP3，包含VP1和VP2的Olig001的N-末端使用正向(F1)：5’AATGTGGATTTGGATGACTG (SEQ ID NO:137)和在VP3转录起始的诱变反向引物：5'CGTTATTGTCTGCCATTGGTGCGCCACCGCCTGCAGCCATTGTAAGAGA3' (SEQID NO:138)扩增，产生659 bp片段。AAV8 VP3序列的C-末端部分自pGSK2/8使用所用的正向引物：
5'ACCAATGGCAGACAATAACGAAG GCGCCGACGGAGTGGGTA3' (SEQ ID NO:139)和所用的反向引物(R2)：5'agagccgagaacgtac3' (SEQ ID NO:140)扩增，产生437 bp产物。这两个PCR产物彼此具有20 bp重叠序列。完全嵌合cap基因使用两个片段和F1和R2引物扩增。最终的PCR产物(Olig001/AAV8 VP3)和pGSK2/8用SwaI和BsiWI消化。6266 bp GSK2/8条带和1070bp嵌合cap基因PCR产物用凝胶提取。片段以3:1的插入物与载体摩尔比使用100 ng的pGSK2/8载体连接。将连接混合物转化至Blue-XL (Agilent; 200249)细胞和接种到LB-Amp平板上。使单菌落生长和通过Sanger测序验证。
AAV载体产生
重组AAV在HEK293细胞中使用三重质粒转染方法产生，接着碘克沙醇梯度离心和离子交换色谱，如之前所述(Gray et al., Gene Ther. 20:450 (2013))。所有AAV载体用具有增强的GFP、在CMV增强子、微型鸡β肌动蛋白启动子(CBh)和MVM内含子控制下的自身互补基因组包装(Gray et al., Hum. Gene Ther. 22:1143 (2011))。峰级分在含5%山梨醇的磷酸缓冲盐水(PBS)中透析，和加入NaCl至终浓度350 mM NaCl。通过qPCR获得病毒滴度(见下文)。
用于生物分布研究和病毒滴度的qPCR
qPCR用于确定病毒滴度和用于生物分布研究(Gray et al., Current protocols inneuroscience / editorial board, Jacqueline N. Crawley ... [et al.] Chapter 4:Unit 4 17 (2011))。所有反应使用SyBR Green-based Lightcycler fast start DNAmaster mix (Roche)在Roche 480 Lightcycler仪器上按制造商的说明书进行。为了制备用于滴定的病毒样品，它们用DNase处理1 h，然后加入EDTA和在70˚C加热10 min灭活DNaseI。为了释放衣壳化的病毒基因组用于qPCR分析，反应混合物用蛋白酶K在50˚C消化至少2h，然后煮沸10 min以灭活蛋白酶K。样品在PCR-级水中稀释，和用作qPCR反应的模板。对于GFP病毒定量，质粒DNA用作标准品。对于小鼠基因组DNA的定量，纯化和定量的小鼠基因组DNA用作标准品。所有成功的反应通过解链曲线分析得到单一产物，使用R2值为1的标准曲线，和平行运行不含模板(其得不到产物)的反应。GFP引物如下：
正向：5'agcagcacgacttcttcaactcc3' (SEQ ID NO:141)
反向：5'tgtagttgtactccagcttgtgcc3' (SEQ ID NO:142)。
用于定量小鼠基因组DNA的LaminB2引物如下：
正向：5'gttaacactcaggcgcatgggcc3' (SEQ ID NO:143)
反向：5'ccat cagggtcacctctggttcc3' (SEQ ID NO:144)。
为了滴定AAV载体，使用以下引物：
正向：5'AACATGCTACGCAGAGAGGGAGTGG3' (SEQ ID NO:145)
反向：5'CATGAGACAAGGAACCCCTAGTGATGGAG3' (SEQ ID NO:146)。
动物程序
用于这些研究的所有动物为雄性Sprague-Dawley大鼠(Charles River,Morrisville, NC, USA, 250-250克)或成年雌性C57Bl/6小鼠(Jackson Labs, BarHarbor, ME)，其保持在12-h光照-黑暗循环中和自由获取水和食物。所有护理和程序按照国立卫生研究院实验动物管理和使用指南进行，和所有程序提前获得北卡罗来纳大学动物管理和使用委员会的批准。
6-羟基多巴胺处理
开始时，大鼠(N=2)用50 mg/kg戊巴比妥i.p.麻醉，和置于定向框中。接下来，大鼠接受单侧输注6-羟基多巴胺(2 µl, 20 µg)至右纹状体(前囟点前0.5 mm，3.5 mm横向，5.5 mm纵向，根据Paxinos和Watson的图谱(Paxinos G, Watson C., The rat brain instereotaxic coordinates, 6th ed. Academic Press/Elsevier, Amsterdam ; Boston(2007))。该处理导致处理后14天纹状体多巴胺含量的显著减少。
AAV衣壳文库给予
6-羟基多巴胺处理后14天，给予AAV衣壳文库。对于每个选择轮次，2只大鼠初始用戊巴比妥(50 mg/kg i.p.)麻醉，和随后接受尾静脉内注射AAV衣壳文库病毒。三天后，将大鼠安乐死，和摘出右纹状体。随后，按之前所述将细胞机械解离(Gray et al., Mol. Ther. 18:570 (2010))用于随后的PCR克隆拯救。
定向AAV载体给予
如上所述，大鼠用戊巴比妥麻醉和置于定向框中。每个不同的AAV克隆(在磷酸缓冲盐水(PBS)、5%山梨醇和350 mM NaCl中)以1 µl/5 min的速率输注至纹状体(0.5 mm前囟点前0.5 mm，3.5 mm横向，5.5 mm纵向，根据Paxinos和Watson的图谱(Paxinos G, Watson C.,The rat brain in stereotaxic coordinates, 6th ed. Academic Press/Elsevier,Amsterdam ; Boston (2007))。载体输注后14天，处死大鼠用于免疫组织化学评价。
免疫组织化学
载体输注后14天，大鼠接受过剂量的戊巴比妥(100 mg/kg, i.p.)和随后经心脏灌注100 ml的冰冷的0.1 M PBS pH 7.4 (25ml/min)，接着180 ml的冰冷的4%低聚甲醛-磷酸缓冲液(pH 7.4)(30ml/min)。各脑在4%低聚甲醛-磷酸缓冲液(pH 7.4)中在4˚C进行后固定过夜。固定的脑在Leica振动切片机上经冠状切片(40-µm厚)和在冰冷的0.1 M PBS pH 7.4中贮存，直至进一步处理。对于免疫染色，在0.1 M PBS pH 7.4中将载玻片洗涤三次，持续5min，然后在10%山羊血清和0.1% Triton-X /0.1 M PBS pH 7.4中封闭30 min。第一抗体NeuN (1:500;Millipore; MAB377)和GFAP (1:2000; Dako; Z0334)在5%山羊血清和0.05%Triton-X/0.1 M PBS pH 7.4中在4˚C下孵育过夜，同时轻轻搅动。切片在0.1 M PBS pH7.4中洗涤和再次封闭，如上所述。对于NeuN的第二山羊抗-小鼠Alexa 594 (A11032)或对于GFAP的山羊抗-兔Alexa 594 (A11080) (二者均1:500在5%山羊血清和0.5% Triton-X/0.1 M PBS pH 7.4中，在4˚C轻轻搅动45 min)。切片用0.1 M PBS pH 7.4洗涤三次，各自5min。将切片漂浮，和放于玻璃载片上和在室温下干燥过夜。载玻片用荧光固定介质固定，和滑动封盖。共焦成像在UNC-Chapel Hill的Michael Hooker Microscopy Core中使用LeicaSp2 confocal进行。载玻片使用40X物镜，使用连续激光扫描以获得z-堆栈来可视化。Z-堆栈大约为4µm，其中10-12个载玻片0.36µm厚/堆栈。堆栈在Leica软件中平化，和在Image J中处理。至少5个独立的视野用于计数GFP阳性细胞和它们与NeuN或GFAP的共标记以确定向性。
生物分布
成年雌性C57Bl/6小鼠(Jackson labs; Bar Harbor, ME)在尾静脉中经静脉内注射在200 µl含5% D-山梨醇的PBS中的5x1010 vg (~2.5x1012 vg/kg体重)。注射后10天，收获器官。来自各器官的总DNA用Qiagen DNeasy血液和组织试剂盒提取，和GFP和小鼠基因组LaminB2的总拷贝通过qPCR确定。对于AAV8自5只小鼠和对于Olig001自4只小鼠汇编数据。
体外结合
混合的神经胶质培养物自C57BL/6J三天新生幼崽制备。将前脑切碎，离解和洗涤，然后接种至T75烧瓶。从烧瓶取出细胞，然后以大约5x105个细胞再接种至5个35-mm组织培养皿。在95%汇合时，分别稀释和加入MOI为100 vg/细胞的四种包含CBh-GFP报告基因组的AAV病毒(Olig001/AAV8 VP3; Olig001; AAV8; AAV8/ E532K)，一式四份，和在4˚C下孵育，同时每10 min混合，持续1 h。将板用冰冷的PBS漂洗3次，将细胞从各板上刮下，沉淀，和在-80˚C冷冻。仅PBS的平皿也包括在内作为模拟样品。DNA使用Qiagen DNeasy血液和组织试剂盒自样品分离。病毒GFP和小鼠基因组LaminB2的量通过qPCR确定。统计学分析和作图在Prism中进行。异常值使用Grubbs检验确定和随后除去。统计显著性(P<0.05)使用单尾Mann-Whitney检验确定。倍数变化根据来自AAV8的各病毒的平均值确定。
结果
少突胶质细胞优选的AAV衣壳的鉴定
单侧给予6-羟基多巴胺(6-OHDA)后2周，静脉内给予改组的AAV衣壳文库，和3天后AAV克隆通过PCR自离解的纹状体细胞回收。令人惊讶的是，10个选择的克隆全都高度类似，即使没有相同的序列。甚至对于第二轮衣壳改组、文库给予和克隆选择，12个克隆全都具有几乎相同的序列，类似于第一轮(图10A)。当嵌合病毒(称为Olig001)静脉内给予至单侧6-OHDA处理的大鼠时，2周后免疫组织化学揭示在同侧纹状体中仅几个GFP阳性神经元和很少的少突胶质细胞样细胞。明显不同的是，纹状体输注Olig001克隆至幼稚大鼠后2周，少突胶质细胞占转导细胞的大部分，即使基因表达受组成型CBh启动子驱动(图10B-10E)。GFP阳性细胞显示典型的少突胶质细胞形态学，其中在纹状体斑块/基质中清楚标记髓磷脂(图10B-10C)。此外，GFP阳性细胞不与神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)，一种星形胶质细胞标记物共定位(图10D)，和大约仅5%的GFP阳性细胞与NeuN，一种神经元标记物共定位(图10E)。因此，几乎所有的GFP阳性细胞(>95%)是少突胶质细胞，仅少量的神经元和没有GFP阳性星形胶质细胞或小胶质细胞。这种向性变化直接与AAV8 (其与Olig001衣壳序列的VP3-特异性部分共有99.3%同源性(7个氨基酸不同))的神经元向性特征形成对比(图10A)。
Olig001自外周组织脱靶
鉴于选择方法涉及静脉内给予衣壳文库，我们试图表征与AAV8相比，Olig001在野生型啮齿动物中的生物分布。成年雌性C57Bl/6小鼠接受静脉内给予等量的任一病毒。10天后，收获器官，对于Olig001-CBh-GFP (白色柱)和AAV8-CBh-GFP (灰色柱) (图11)，生物分布通过qPCR定量。与AAV8相比，Olig001的生物分布在测试的所有外周器官中显著减少，特别是肝脏(图11)。与我们之前的结果一起，这些数据表明在CNS内和外，Olig001具有与相关的AAV8高度差异的向性。
AAV8中的E532K突变产生自神经元至少突胶质细胞的向性转变
在区分Olig001与AAV8的VP3区的7个氨基酸中，仅1个残基(E532K，使用Olig001 VP1编号或E533K，使用AAV8 VP1编号)之前与受体/配体相互作用的变化相关(Wu et al., J. Virol. 80:11393 (2006))。Wu和同事发现，在紧密相关的AAV1和AAV6之间见到的组织向性和配体结合的差异单独通过对应的532残基的赖氨酸或谷氨酸来解释，和AAV8中的E533K突变赋予结合硫酸肝素的新能力(Wu et al., J. Virol. 80:11393 (2006))。随后，我们测试了在脑中E532K突变对AAV8的向性的影响(图12A)。AAV8/E532K用CBh-GFP包装，和以2X108 vg/μl的滴度注射至野生型雄性Sprague-Dawley大鼠的纹状体。注射后2周，收获脑，和评价与神经元(NeuN)和星形胶质细胞(GFAP)标志物的天然GFP共定位(图12B-12G)。天然GFP不与神经元(图12B-12D)或星形胶质细胞(图12E-12G)标志物共定位。相比之下，GFP阳性细胞显示少突胶质细胞的特征性形态学。总之，具有E532K突变的AAV8改变AAV8的向性，从神经元优选至少突胶质细胞优选，表明Olig001的所述残基指导少突胶质细胞向性的作用。然而，在Olig001的情况下，我们发现反转突变(K532E)不影响少突胶质细胞向性(概述于图15)。
Olig001少突胶质细胞向性由VP3外的氨基酸赋予
传统上，认为仅VP3残基促进细胞外受体结合和AAV血清型的向性，而N-末端部分的特定的VP1和VP2部分介导内体逃逸和核输入(Bleker et al., J. Virol. 79:2528 (2005);Grieger et al., J. Virol. 80:5199 (2006); Kronenberg et al., J. Virol. 79:5296 (2005); Sonntag et al., J. Virol. 80:11040 (2006))。为了鉴定Olig001衣壳中促进少突胶质细胞向性的特定的氨基酸，我们制备Olig001突变体，其返回VP3内的7个残基差异至AAV8残基。然而，Olig001 VP3内没有单一突变或突变簇减少大鼠纹状体中Olig001的少突胶质细胞向性至小于98%的细胞(概述于图15)。类似地，在所有测试的突变体中外周器官分布高度减少，保持VP1/VP2-特定区域Olig001的突变体中见到最大减少(图16)。作为下一步骤，我们用AAV8 VP3序列替换所有Olig001 VP3序列，以评价VP3的总体贡献(图13A)。具有AAV8 VP3的突变体Olig001 (Olig001/ AAV8 VP3)用CBh-GFP包装，和注射至野生型雄性Sprague-Dawley大鼠的纹状体。2周后，收获大脑，和评价天然GFP与神经元(NeuN)和星形胶质细胞(GFAP)标志物的共定位(图13B-13G)。天然GFP罕见(2%的细胞)与NeuN共定位(图13B-13D)和不与GFAP共定位(图13E-13G)。另外，GFP阳性细胞显示纹状体少突胶质细胞的特征性形态学。这些结果表明衣壳的VP1/VP2-特定部分对AAV向性具有之前未认识到的影响。
体外结合数据
Olig001衣壳的VP1/VP2-特定部分可通过与少突胶质细胞上的受体的增加的细胞外结合，或通过可能是少突胶质细胞特异性的未知机制经过增强的细胞外运输，指导少突胶质细胞的优选转导。为了区分这2种情况，我们进行体外结合实验，使用混合的神经胶质培养物，包括Olig001、Olig001/VP3 AAV8突变体、AAV8和AAV8/E532K突变体，全都用CBh-GFP包装。混合的神经胶质培养物用等量的各病毒在4°C孵育1 h。该程序允许载体结合细胞表面，但阻止内在化(Xiao et al., Mol. Ther. 20:317 (2012))。结合细胞的载体的量通过对于GFP的qPCR定量，和标准化至小鼠基因组LaminB2 (图14A)。与我们的体内结果一致，Olig001结合混合的神经胶质细胞群体是AAV8的9倍(图14B)。Olig001/AAV VP3的结合略微低于Olig001 (AAV8的4倍)，而AAV8/E532K结合是AAV8的46倍(图11B)。这些结果表明，E532K突变和VP1/VP2-特定的N-末端结构域二者以冗余的方式各自促进Olig001的少突胶质细胞向性。因此，体外数据与观察到的体内向性数据一致。
这些研究产生了具有对少突胶质细胞偏好的体内向性的新的嵌合AAV衣壳变体，此发现代表了与嵌合的亲本AAV血清型的正常神经元向性的重大背离。过去的研究已经描述了AAV2或AAV8以低效率转导少突胶质细胞的能力，但这些研究要求使用少突胶质细胞启动子以阻止神经元(这些载体的优选细胞类型)中的表达(Chen et al., J. Neurosci. Res. 55:504 (1999); Chen et al., Gene Ther. 5:50 (1998); Klein et al., Mol. Ther. 13:517 (2006); Lawlor et al., Mol. Ther. 17:1692 (2009))。相比之下，使用普遍存在的启动子，Olig001在颅内给予后具有有效和优先转导少突胶质细胞的能力。因此，Olig001具有对少突胶质细胞的优先向性和对神经元的低向性，这不同于任何之前报道的AAV衣壳。
我们鉴定了Olig001衣壳的两个单独和多余的区域，其足以驱动这种少突胶质细胞向性。有趣的是，AAV8 (AAV8/E532K)中的单个氨基酸的突变E532K足以强烈减少其神经元向性，有利于增加的少突胶质细胞向性。然而，这种少突胶质细胞偏好并不是起因于简单的神经元向性损失，因为AAV8/E532K突变体显示体外显著增加的对少突胶质细胞的结合(AAV8的46倍)(图15)。赋予其少突胶质细胞向性的Olig001的第二个结构域鉴于其在衣壳ORF的VP1/VP2-特定的N-末端内的位置，可能更有价值。通常认为衣壳的VP3-特定区域(其占据60个总衣壳亚单位/病毒体中的54个(Johnson et al., J. Virol. 8:860 (1971);Rose et al., J. Virol. 8:766 (1971))含有参与受体结合的大多数元件(综述于(Agbandje-McKenna et al., Meth. Mol. Biol. 807:47 (2011))。明显相反，AAV向性的VP1/VP2依赖性改变证明了VP3序列的操纵不是AAV载体向性的唯一贡献因素。明显的是，我们的发现表明VP1和VP2 (其占据60个总衣壳亚单位/病毒体中的54个(Johnson et al., J. Virol. 8:860 (1971); Rose et al., J. Virol. 8:766 (1971))可发挥对AAV载体向性的主要影响，其起因于细胞外结合而非细胞内运输。
本文所述的Olig001载体可用于需要基因转移至少突胶质细胞的体内和体外研究应用，其对于有效的化学转染或载体介导的转导通常是不响应的。此外，体内有效靶向少突胶质细胞的能力可改进对脱髓鞘疾病例如卡纳万病或克拉伯病的治疗策略。这些研究还挑战了通常接受的概念，即AAV的向性仅由衣壳的VP3-特定区域而非VP1/VP1-特定的N-末端结构域规定。
前述是说明本发明的，不得视为对其的限制。本发明由所附权利要求书限定，所述权利要求书的等同方案包括在其中。

Claims (171)

1. 编码AAV衣壳的核酸，所述核酸包含与以下序列具有至少70%同一性的AAV衣壳编码序列：
(a)SEQ ID NO:1-43中任一个的核苷酸序列；或
(b)编码SEQ ID NO:44-86中任一个的核苷酸序列。
2.权利要求1的核酸，其中所述AAV衣壳编码序列与(a)或(b)的核苷酸序列具有至少80%同一性。
3.权利要求1的核酸，其中所述AAV衣壳编码序列与(a)或(b)的核苷酸序列具有至少90%同一性。
4.权利要求1的核酸，其中所述AAV衣壳编码序列与(a)或(b)的核苷酸序列具有至少95%同一性。
5.权利要求1的核酸，其中所述AAV衣壳编码序列包含(a)或(b)的核苷酸序列。
6. 编码AAV衣壳的核酸，所述核酸包含与以下序列具有至少70%同一性的AAV衣壳编码序列的VP1、VP2或VP1/VP2编码部分：
(a)SEQ ID NO:1-43中任一个的核苷酸序列；或
(b)编码SEQ ID NO:44-86中任一个的核苷酸序列；
其可操作连接至不同的AAV衣壳编码序列的VP3编码部分。
7.权利要求6的核酸，其中AAV衣壳编码序列的VP1、VP2或VP1/VP2编码部分与(a)或(b)的核苷酸序列具有至少80%同一性。
8.权利要求6的核酸，其中AAV衣壳编码序列的VP1、VP2或VP1/VP2编码部分与(a)或(b)的核苷酸序列具有至少90%同一性。
9.权利要求6的核酸，其中AAV衣壳编码序列的VP1、VP2或VP1/VP2编码部分与(a)或(b)的核苷酸序列具有至少95%同一性。
10.权利要求6的核酸，其中AAV衣壳编码序列的VP1、VP2或VP1/VP2编码部分包含(a)或(b)的核苷酸序列。
11.权利要求1-10中任一项的核酸，其中所述核酸是质粒、噬菌体、病毒载体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。
12.权利要求1-11中任一项的核酸，其中所述核酸是包含所述编码序列的AAV载体。
13. 权利要求1-12中任一项的核酸，其中所述核酸进一步包含AAV rep编码序列。
14.体外的细胞，其包含稳定地并入基因组的权利要求1-13中任一项的核酸。
15.病毒颗粒，其包含权利要求1-13中任一项的核酸。
16.权利要求15的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒是AAV颗粒、腺病毒颗粒、疱疹病毒颗粒或杆状病毒颗粒。
17. AAV衣壳，其包含与SEQ ID NO:44-86中任一个具有至少90%同一性的氨基酸序列。
18. 权利要求17的AAV衣壳，其包含与SEQ ID NO:44-86中任一个具有至少95%同一性的氨基酸序列。
19. 权利要求17的AAV衣壳，其包含与SEQ ID NO:44-86中任一个具有至少99%同一性的氨基酸序列。
20. 权利要求17的AAV衣壳，其包含SEQ ID NO:44-86中任一个的氨基酸序列。
21. AAV衣壳，其包含VP1、VP2或VP1/VP2部分，所述部分包含与SEQ ID NOS:44-86中任一个具有至少90%同一性的氨基酸序列；
其可操作连接至不同的AAV衣壳的VP3部分。
22. 权利要求21的AAV衣壳，其包含VP1、VP2或VP1/VP2部分，所述部分包含与SEQ IDNOS:44-86中任一个具有至少95%同一性的氨基酸序列。
23. 权利要求21的AAV衣壳，其包含VP1、VP2或VP1/VP2部分，所述部分包含与SEQ IDNOS:44-86中任一个具有至少99%同一性的氨基酸序列。
24. 权利要求21的AAV衣壳，其包含VP1、VP2或VP1/VP2部分，所述部分包含SEQ IDNOS:44-86中任一个的氨基酸序列。
25.权利要求21-24中任一项的AAV衣壳，其与选自以下的化合物共价连接、结合或将所述化合物壳体化：DNA分子、RNA分子、多肽、碳水化合物、脂质和有机小分子。
26. AAV颗粒，其包含：
AAV载体基因组；和
权利要求21-24中任一项的AAV衣壳，其中所述AAV衣壳将所述AAV载体基因组壳体化。
27.权利要求26的AAV颗粒，其中所述AAV载体基因组包含异源核酸。
28.权利要求27的AAV颗粒，其中所述异源核酸编码反义RNA、微RNA或RNAi。
29.权利要求27的AAV颗粒，其中所述异源核酸编码多肽。
30.权利要求29的AAV颗粒，其中所述异源核酸编码治疗性多肽。
31.权利要求29的AAV颗粒，其中所述异源核酸编码生长因子或分化因子。
32.权利要求29的AAV颗粒，其中所述异源核酸编码胰岛素样生长因子-1、神经胶质衍生的神经营养因子、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、artemin、neurterin、persephin、脑衍生的神经营养因子、神经生长因子、睫状神经营养因子、转化生长因子α、血小板衍生的生长因子、白血病抑制因子、催乳素、单羧酸转运蛋白1或核因子1A。
33.权利要求29的AAV颗粒，其中所述异源核酸编码报告蛋白。
34.权利要求26-33中任一项的AAV颗粒，其中所述异源核酸与组成型启动子可操作连接。
35.权利要求26-33中任一项的AAV颗粒，其中所述异源核酸与中枢神经系统(CNS)细胞特异性或CNS细胞优选的启动子可操作连接。
36.权利要求35的AAV颗粒，其中所述CNS细胞特异性或CNS细胞优选的启动子是来自以下的启动子：神经元特异性烯醇酶、突触蛋白、MeCP2、神经胶质纤维酸性蛋白、S100β、wdr16、Foxj1、LRP2、髓磷脂碱性蛋白、环状核苷酸磷酸二酯酶、蛋白脂质蛋白、Gtx或Sox10。
37. 产生包含AAV衣壳的重组AAV颗粒的方法，所述方法包括：
在体外向细胞提供权利要求1-8中任一项的核酸、AAV rep编码序列、包含异源核酸的AAV载体基因组和用于产生生产性AAV感染的辅助功能；和
允许包含AAV衣壳和将AAV载体基因组壳体化的重组AAV颗粒的装配。
38.通过权利要求37的方法产生的AAV颗粒。
39.药物制剂，其在制药上可接受的载体中包含权利要求1-13中任一项的核酸，权利要求15或16中任一项的病毒颗粒，权利要求17-25中任一项的AAV衣壳，或权利要求26-36或38中任一项的AAV颗粒。
40.将目的核酸递送到CNS细胞的方法，所述方法包括使所述细胞接触权利要求26-36或38中任一项的AAV颗粒。
41.在哺乳动物受试者中将目的核酸递送到CNS细胞的方法，所述方法包括：
将有效量的权利要求26-36或38中任一项的AAV颗粒或权利要求30的药物制剂给予哺乳动物受试者。
42.权利要求41的方法，其中所述哺乳动物受试者是人类受试者。
43.权利要求41或42的方法，其中所述AAV颗粒被递送到CNS。
44.权利要求43的方法，其中所述AAV颗粒通过鞘内、脑内、心室内、鼻内、耳内、眼内或眼周围递送或其任何组合直接递送到CNS。
45.权利要求43的方法，其中所述受试者具有损害的血脑屏障并且所述AAV颗粒通过静脉内给予而递送到CNS。
46.在哺乳动物受试者中将目的核酸递送到与损害的血脑屏障区域毗邻的CNS区的方法，所述方法包括：
将有效量的权利要求26-36或38中任一项的AAV颗粒或权利要求30的药物制剂经静脉内给予哺乳动物受试者。
47.在有需要的哺乳动物受试者中治疗CNS功能失调的相关病症的方法，所述方法包括将治疗有效量的权利要求26-36或38中任一项的AAV颗粒或权利要求30的药物制剂给予哺乳动物受试者。
48. 编码AAV衣壳的核酸，所述核酸包含与以下序列具有至少70%同一性的AAV衣壳编码序列：
(a) SEQ ID NO:87-107中任一个的核苷酸序列；或
(b) 编码SEQ ID NO:108-128中任一个的核苷酸序列。
49.权利要求48的核酸，其中所述AAV衣壳编码序列与(a)或(b)的核苷酸序列具有至少80%同一性。
50.权利要求48的核酸，其中所述AAV衣壳编码序列与(a)或(b)的核苷酸序列具有至少90%同一性。
51.权利要求48的核酸，其中所述AAV衣壳编码序列与(a)或(b)的核苷酸序列具有至少95%同一性。
52.权利要求48的核酸，其中所述AAV衣壳编码序列包含(a)或(b)的核苷酸序列。
53. 编码AAV衣壳的核酸，所述核酸包含与以下序列具有至少70%同一性的AAV衣壳编码序列的VP1、VP2或VP1/VP2编码部分：
(a) SEQ ID NO:87-107中任一个的核苷酸序列；或
(b) 编码SEQ ID NO:108-128中任一个的核苷酸序列；
其可操作连接至不同的AAV衣壳编码序列的VP3编码部分。
54.权利要求53的核酸，其中AAV衣壳编码序列的VP1、VP2或VP1/VP2编码部分与(a)或(b)的核苷酸序列具有至少80%同一性。
55.权利要求53的核酸，其中AAV衣壳编码序列的VP1、VP2或VP1/VP2编码部分与(a)或(b)的核苷酸序列具有至少90%同一性。
56.权利要求53的核酸，其中AAV衣壳编码序列的VP1、VP2或VP1/VP2编码部分与(a)或(b)的核苷酸序列具有至少95%同一性。
57.权利要求53的核酸，其中AAV衣壳编码序列的VP1、VP2或VP1/VP2编码部分包含(a)或(b)的核苷酸序列。
58.权利要求48-57中任一项的核酸，其中所述核酸是质粒、噬菌体、病毒载体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。
59.权利要求48-58中任一项的核酸，其中所述核酸是包含编码序列的AAV载体。
60. 权利要求48-59中任一项的核酸，其中所述核酸还包含AAV rep编码序列。
61.体外的细胞，其包含稳定地并入基因组的权利要求48-60中任一项的核酸。
62.病毒颗粒，其包含权利要求48-60中任一项的核酸。
63.权利要求62的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒是AAV颗粒、腺病毒颗粒、疱疹病毒颗粒或杆状病毒颗粒。
64. AAV衣壳，其包含与SEQ ID NO:108-128中任一个具有至少90%同一性的氨基酸序列。
65. 权利要求64的AAV衣壳，其包含与SEQ ID NO:108-128中任一个具有至少95%同一性的氨基酸序列。
66. 权利要求64的AAV衣壳，其包含与SEQ ID NO:108-128中任一个具有至少99%同一性的氨基酸序列。
67. 权利要求64的AAV衣壳，其包含SEQ ID NO:108-128中任一个的氨基酸序列。
68. AAV衣壳，其包含VP1、VP2或VP1/VP2部分，所述部分包含与SEQ ID NO:108-128中任一个具有至少90%同一性的氨基酸序列；
其可操作连接至不同的AAV衣壳的VP3部分。
69. 权利要求21的AAV衣壳，其包含VP1、VP2或VP1/VP2部分，所述部分包含与SEQ IDNO: 108-128中任一个具有至少95%同一性的氨基酸序列。
70. 权利要求21的AAV衣壳，其包含VP1、VP2或VP1/VP2部分，所述部分包含与SEQ IDNO: 108-128中任一个具有至少99%同一性的氨基酸序列。
71. 权利要求21的AAV衣壳，其包含VP1、VP2或VP1/VP2部分，所述部分包含SEQ ID NO:108-128中任一个的氨基酸序列。
72.权利要求64-71中任一项的AAV衣壳，其与选自以下的化合物共价连接、结合或将所述化合物壳体化：DNA分子、RNA分子、多肽、碳水化合物、脂质和有机小分子。
73. AAV颗粒，其包含：
AAV载体基因组；和
权利要求64-71中任一项的AAV衣壳，其中所述AAV衣壳将AAV载体基因组壳体化。
74.权利要求73的AAV颗粒，其中所述AAV载体基因组包含异源核酸。
75.权利要求74的AAV颗粒，其中所述异源核酸编码反义RNA、微RNA或RNAi。
76.权利要求74的AAV颗粒，其中所述异源核酸编码多肽。
77.权利要求76的AAV颗粒，其中所述异源核酸编码治疗性多肽。
78.权利要求77的AAV颗粒，其中所述治疗性多肽是甲基胞嘧啶结合蛋白2。
79.权利要求76的AAV颗粒，其中所述异源核酸编码生长因子或分化因子。
80.权利要求76的AAV颗粒，其中所述异源核酸编码胰岛素样生长因子-1、神经胶质衍生的神经营养因子、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、artemin、neurterin、persephin、脑衍生的神经营养因子、神经生长因子、睫状神经营养因子、转化生长因子α、血小板衍生的生长因子、白血病抑制因子、催乳素、单羧酸转运蛋白1或核因子1A。
81.权利要求76的AAV颗粒，其中所述异源核酸编码报告蛋白。
82.权利要求73-81中任一项的AAV颗粒，其中所述异源核酸与组成型启动子可操作连接。
83.权利要求73-81中任一项的AAV颗粒，其中所述异源核酸与CNS细胞特异性或CNS细胞优选的启动子可操作连接。
84.权利要求83的AAV颗粒，其中所述CNS细胞特异性或CNS细胞优选的启动子是来自以下的启动子：神经元特异性烯醇酶、突触蛋白、MeCP2、神经胶质纤维酸性蛋白、S100β、wdr16、Foxj1、LRP2、髓磷脂碱性蛋白、环状核苷酸磷酸二酯酶、蛋白脂质蛋白、Gtx或Sox10。
85. 产生包含AAV衣壳的重组AAV颗粒的方法，所述方法包括：
在体外向细胞提供权利要求48-60中任一项的核酸、AAV rep编码序列、包含异源核酸的AAV载体基因组和用于产生生产性AAV感染的辅助功能；和
允许包含AAV衣壳和将AAV载体基因组壳体化的重组AAV颗粒的装配。
86.通过权利要求85的方法产生的AAV颗粒。
87.药物制剂，其在制药上可接受的载体中包含权利要求48-60中任一项的核酸，权利要求62或63中任一项的病毒颗粒，权利要求64-72中任一项的AAV衣壳，或权利要求73-84或86中任一项的AAV颗粒。
88.将目的核酸递送到CNS细胞的方法，所述方法包括使所述细胞接触权利要求73-84或86中任一项的AAV颗粒。
89.在哺乳动物受试者中将目的核酸递送到CNS细胞的方法，所述方法包括：
将有效量的权利要求73-84或86中任一项的AAV颗粒或权利要求87的药物制剂给予哺乳动物受试者。
90.权利要求89的方法，其中所述哺乳动物受试者是人类受试者。
91.权利要求89或90的方法，其中所述受试者具有Rett综合征。
92.权利要求89-91中任一项的方法，其中所述AAV颗粒被递送到CNS。
93.权利要求92的方法，其中所述AAV颗粒通过鞘内、脑内、心室内、鼻内、耳内、眼内或眼周围递送或其任何组合直接递送到CNS。
94.权利要求92的方法，其中所述受试者具有损害的血脑屏障并且所述AAV颗粒通过静脉内给予而递送到CNS。
95.在哺乳动物受试者中将目的核酸递送到与损害的血脑屏障区域毗邻的CNS区的方法，所述方法包括：
将有效量的权利要求73-84或86中任一项的AAV颗粒或权利要求87的药物制剂经静脉内给予哺乳动物受试者。
96.权利要求95的方法，其中所述受试者具有Rett综合征。
97.在有需要的哺乳动物受试者中治疗Rett综合征的方法，所述方法包括将治疗有效量的权利要求73-84或86中任一项的AAV颗粒或权利要求87的药物制剂给予哺乳动物受试者。
98. 编码AAV衣壳的核酸，所述核酸包含与以下序列具有至少90%同一性的AAV衣壳编码序列的VP1、VP2或VP1/VP2编码部分：
(a) SEQ ID NO:129的核苷酸序列；或
(b) 编码SEQ ID NO:130-132中任一个的核苷酸序列；
其可操作连接至不同的AAV衣壳编码序列的VP3编码部分。
99.权利要求98的核酸，其中AAV衣壳编码序列的VP1、VP2或VP1/VP2编码部分与(a)或(b)的核苷酸序列具有至少95%同一性。
100.权利要求98的核酸，其中AAV衣壳编码序列的VP1、VP2或VP1/VP2编码部分包含(a)或(b)的核苷酸序列。
101.权利要求98-100中任一项的核酸，进一步编码E532K取代。
102.权利要求98-101中任一项的核酸，其中所述核酸是质粒、噬菌体、病毒载体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。
103.权利要求98-102中任一项的核酸，其中所述核酸是包含编码序列的AAV载体。
104. 权利要求98-103中任一项的核酸，其中所述核酸还包含AAV rep编码序列。
105.体外的细胞，其包含稳定地并入基因组的权利要求98-104中任一项的核酸。
106.病毒颗粒，其包含权利要求98-104中任一项的核酸。
107.权利要求106的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒是AAV颗粒、腺病毒颗粒、疱疹病毒颗粒或杆状病毒颗粒。
108. AAV衣壳，其包含与SEQ ID NO:130-132中任一个具有至少96%同一性的氨基酸序列。
109. 权利要求108的AAV衣壳，其包含与SEQ ID NO:130-132中任一个具有至少99%同一性的氨基酸序列。
110. 权利要求109的AAV衣壳，其包含SEQ ID NO:130-132中任一个的氨基酸序列。
111.权利要求108-110中任一项的AAV衣壳，进一步编码E532K取代。
112.权利要求108-111中任一项的AAV衣壳，其与选自以下的化合物共价连接、结合或将所述化合物壳体化：DNA分子、RNA分子、多肽、碳水化合物、脂质和有机小分子。
113. AAV颗粒，其包含：
AAV载体基因组；和
权利要求108-112中任一项的AAV衣壳，其中所述AAV衣壳将AAV载体基因组壳体化。
114.权利要求113的AAV颗粒，其中所述AAV载体基因组包含异源核酸。
115.权利要求113的AAV颗粒，其中所述异源核酸编码反义RNA、微RNA或RNAi。
116.权利要求113的AAV颗粒，其中所述异源核酸编码多肽。
117.权利要求116的AAV颗粒，其中所述异源核酸编码治疗性多肽。
118.权利要求116的AAV颗粒，其中所述异源核酸编码生长因子或分化因子。
119.权利要求116的AAV颗粒，其中所述异源核酸编码胰岛素生长因子-1、神经胶质衍生的神经营养因子、神经营养蛋白-3、artemin、转化生长因子α、血小板衍生的生长因子、白血病抑制因子、催乳素、单羧酸转运蛋白1或核因子1A。
120.权利要求116的AAV颗粒，其中所述异源核酸编码报告蛋白。
121.权利要求113-120中任一项的AAV颗粒，其中所述异源核酸与组成型启动子可操作连接。
122.权利要求113-120中任一项的AAV颗粒，其中所述异源核酸与少突胶质细胞特异性或少突胶质细胞优选的启动子可操作连接。
123.权利要求122的AAV颗粒，其中所述少突胶质细胞特异性或少突胶质细胞优选的启动子是选自以下的启动子：髓磷脂碱性蛋白、环状核苷酸磷酸二酯酶、蛋白脂质蛋白、Gtx或Sox10。
124. 产生包含AAV衣壳的重组AAV颗粒的方法，所述方法包括：
在体外向细胞提供权利要求98-104中任一项的核酸、AAV rep编码序列、包含异源核酸的AAV载体基因组和用于产生生产性AAV感染的辅助功能；和
允许包含AAV衣壳和将AAV载体基因组壳体化的重组AAV颗粒的装配。
125.通过权利要求124的方法产生的AAV颗粒。
126.药物制剂，其在制药上可接受的载体中包含权利要求98-104中任一项的核酸，权利要求106或107中任一项的病毒颗粒，权利要求108-112中任一项的AAV衣壳，或权利要求113-123或125中任一项的AAV颗粒。
127.将目的核酸递送到少突胶质细胞的方法，所述方法包括使所述少突胶质细胞接触权利要求113-123或125中任一项的AAV颗粒。
128.在哺乳动物受试者中将目的核酸递送到少突胶质细胞的方法，所述方法包括：
将有效量的权利要求113-123或125中任一项的AAV颗粒或权利要求126的药物制剂给予哺乳动物受试者。
129.权利要求128的方法，其中所述哺乳动物受试者是人类受试者。
130.权利要求128或129的方法，其中所述AAV颗粒被递送到中枢神经系统(CNS)。
131.权利要求130的方法，其中所述AAV颗粒通过鞘内、脑内、心室内、鼻内、耳内、眼内或眼周围递送或其任何组合直接递送到CNS。
132.权利要求131的方法，其中所述受试者具有损害的血脑屏障并且所述AAV颗粒通过静脉内给予而递送到CNS。
133.在哺乳动物受试者中将目的核酸递送到与损害的血脑屏障区域毗邻的CNS区的方法，所述方法包括：
将有效量的权利要求113-123或125中任一项的AAV颗粒或权利要求126的药物制剂经静脉内给予哺乳动物受试者。
134.在有需要的哺乳动物受试者中治疗少突胶质细胞功能失调的相关病症的方法，所述方法包括将治疗有效量的权利要求113-123或125中任一项的AAV颗粒或权利要求126的药物制剂给予哺乳动物受试者。
135.权利要求134的方法，其中所述少突胶质细胞功能失调的相关病症是脱髓鞘疾病。
136.权利要求134的方法，其中所述少突胶质细胞功能失调的相关病症是多发性硬化、佩利措伊斯-梅茨巴赫病、克拉伯病、异染性脑白质营养不良、肾上腺脑白质营养不良、卡纳万病、亚历山大病、正染脑白质营养不良、Zellweger病、18q-综合征、脑麻痹、脊髓损伤、创伤性脑损伤、中风、苯丙酮尿或病毒感染。
137.制备具有目的向性特征的AAV衣壳的方法，所述方法包括修饰权利要求108-112中任一项的AAV衣壳以插入提供目的向性特征的氨基酸序列。
138.权利要求137的方法，其中所述目的向性特征是选自以下的组织：骨骼肌、肝、心肌、膈、肾、肝、胰腺、脾、胃肠道、肺、关节组织、舌、卵巢、睾丸、生殖细胞、癌细胞或其组合。
139.编码AAV8衣壳的核酸，所述衣壳包含E532K取代。
140.权利要求139的核酸，其中所述核酸是质粒、噬菌体、病毒载体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。
141.权利要求139-140中任一项的核酸，其中所述核酸是包含所述编码序列的AAV载体。
142. 权利要求139-141中任一项的核酸，其中所述核酸进一步包含AAV rep编码序列。
143.体外的细胞，其包含稳定地并入基因组的权利要求139-142中任一项的核酸。
144.病毒颗粒，其包含权利要求139-142中任一项的核酸。
145.权利要求144的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒是AAV颗粒、腺病毒颗粒、疱疹病毒颗粒或杆状病毒颗粒。
146. AAV8衣壳，其包含E532K取代。
147.权利要求146的AAV衣壳，其与选自以下的化合物共价连接、结合或将所述化合物壳体化：DNA分子、RNA分子、多肽、碳水化合物、脂质和有机小分子。
148. AAV颗粒，其包含：
AAV载体基因组；和
权利要求146-147中任一项的AAV衣壳，其中所述AAV衣壳将所述AAV载体基因组壳体化。
149.权利要求148的AAV颗粒，其中所述AAV载体基因组包含异源核酸。
150.权利要求148的AAV颗粒，其中所述异源核酸编码反义RNA、微RNA或RNAi。
151.权利要求148的AAV颗粒，其中所述异源核酸编码多肽。
152.权利要求151的AAV颗粒，其中所述异源核酸编码治疗性多肽。
153.权利要求151的AAV颗粒，其中所述异源核酸编码生长因子或分化因子。
154.权利要求151的AAV颗粒，其中所述异源核酸编码胰岛素生长因子-1、神经胶质衍生的神经营养因子、神经营养蛋白-3、artemin、转化生长因子α、血小板衍生的生长因子、白血病抑制因子、催乳素、单羧酸转运蛋白1或核因子1A。
155.权利要求151的AAV颗粒，其中所述异源核酸编码报告蛋白。
156.权利要求148-155中任一项的AAV颗粒，其中所述异源核酸与组成型启动子可操作连接。
157.权利要求148-155中任一项的AAV颗粒，其中所述异源核酸与少突胶质细胞特异性或少突胶质细胞优选的启动子可操作连接。
158.权利要求157的AAV颗粒，其中所述少突胶质细胞特异性或少突胶质细胞优选的启动子是选自以下的启动子：髓磷脂碱性蛋白、环状核苷酸磷酸二酯酶、蛋白脂质蛋白、Gtx或Sox10。
159. 产生包含AAV衣壳的重组AAV颗粒的方法，所述方法包括：
在体外向细胞提供权利要求139-142中任一项的核酸、AAV rep编码序列、包含异源核酸的AAV载体基因组和用于产生生产性AAV感染的辅助功能；和
允许包含AAV衣壳和将AAV载体基因组壳体化的重组AAV颗粒的装配。
160.通过权利要求159的方法产生的AAV颗粒。
161.药物制剂，其在制药上可接受的载体中包含权利要求139-142中任一项的核酸，权利要求144或145中任一项的病毒颗粒，权利要求146-147中任一项的AAV衣壳，或权利要求148-158或160中任一项的AAV颗粒。
162.将目的核酸递送到少突胶质细胞的方法，所述方法包括使所述少突胶质细胞接触权利要求148-158或160中任一项的AAV颗粒。
163.在哺乳动物受试者中将目的核酸递送到少突胶质细胞的方法，所述方法包括：
将有效量的权利要求148-158或160中任一项的AAV颗粒或权利要求161的药物制剂给予哺乳动物受试者。
164.权利要求163的方法，其中所述哺乳动物受试者是人类受试者。
165.权利要求163或164的方法，其中所述AAV颗粒被递送到中枢神经系统(CNS)。
166.权利要求165的方法，其中所述AAV颗粒通过鞘内、脑内、心室内、鼻内、耳内、眼内或眼周围递送或其任何组合直接递送到CNS。
167.权利要求165的方法，其中所述受试者具有损害的血脑屏障并且所述AAV颗粒通过静脉内给予而递送到CNS。
168.在哺乳动物受试者中将目的核酸递送到与损害的血脑屏障区域毗邻的CNS区的方法，所述方法包括：
将有效量的权利要求148-158或160中任一项的AAV颗粒或权利要求161的药物制剂经静脉内给予哺乳动物受试者。
169.在有需要的哺乳动物受试者中治疗少突胶质细胞功能失调的相关病症的方法，所述方法包括将治疗有效量的权利要求148-158或160中任一项的AAV颗粒或权利要求161的药物制剂给予哺乳动物受试者。
170.权利要求169的方法，其中所述少突胶质细胞功能失调的相关病症是脱髓鞘疾病。
171.权利要求169的方法，其中所述少突胶质细胞功能失调的相关病症是多发性硬化、佩利措伊斯-梅茨巴赫病、克拉伯病、异染性脑白质营养不良、肾上腺脑白质营养不良、卡纳万病、亚历山大病、正染脑白质营养不良、Zellweger病、18q-综合征、脑麻痹、脊髓损伤、创伤性脑损伤、中风、苯丙酮尿或病毒感染。
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