KR20150103280A - 연령-관련 황반 변성 치료 - Google Patents

연령-관련 황반 변성 치료

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Abstract

본 발명은 RNA 간섭 (RNAi) 작용제와 연령-관련 황반 변성을 치료하기 위한 상기 RNAi 작용제의 용도, 그리고 본 발명의 RNAi 작용제를 함유한 제약학적 조성물에 관한 것이다. RNAi 작용제는 AMD 연관 유전자의 발현을 저해하고, 방지하고 또는 감소시키기 위하여, 세포내 (생체내를 포함) 상기 작용제를 발현하기 위한 발현 카세트 또는 구조체를 가진, DNA-유도 RNA 간섭 (ddRNAi) 작용제 (RNA 분자가 됨)이다. 바람직하게 상기 AMD 연관 유전자는 습성 AMD와 연관된 것이다.

Description

연령-관련 황반 변성 치료{AGE-RELATED MACULAR DEGENERATION TREATMENT}
발명 분야
본 발명은 RNA 간섭 (RNAi) 작용제 및 연령-관련 황반 변성을 치료하기 위한 상기 RNAi 작용제의 용도, 그리고 본 발명의 RNAi 작용제를 함유한 제약학적 조성물에 관한 것이다.
발명 배경
연령 관련 황반 변성 (AMD)은 미국과 수많은 다른 산업화 국가에서 비가역적인 시력 손실의 주요 원인이다. "건조" AMD는 황반 변성 중 가장 흔한 유형이고 이 질환을 가진 사람 중 90%에서 발병한다. 건조 형태는 눈으로 들어오는 빛을 포획하는 망막의 특수화된 구조 영역인, 황반 내에 드루젠(drusen)의 형성으로 특징지어 진다. 전형적으로, 드루젠은 망막 색소 상피 (RPE) 세포 아래에 형성되고 이의 존재는 광수용체 세포를 지지하는 RPE 층의 얇아짐 또는 붕괴에 기인한 광수용체의 위축을 초래하는 것으로 간주된다. 망막 내에 드루젠의 잔존은 지속적인 염증 반응을 야기하고 결과적으로 습성 AMD를 초래할 수 있는 이차 반응의 캐스캐이드를 야기하는 것으로도 또한 간주된다.
AMD의 "습성" 형태는 맥락막 신생혈관 (CNV)으로서 종종 언급되는 과정에서 망막 뒤에 위치된 맥관 구조로부터 혈관의 비정상적인 돌출로 특징지어진다. 건조 형태만큼 일반적이지는 않지만, 이는 더 빠르게 발병하고 더욱 심각한 표현형이며, 종종 시야의 실질적인 부분의 감소를 초래한다.
습성 AMD에 대한 현재 치료 기준은 세포로부터 분비되고 발생기 혈관의 형성 또는 성장을 야기하는 것으로 공지된 분자 모이어티인, 혈관 내피 성장 인자-A (VEGF-A)에 대해 강한 친화도를 가진 단클로 항체 단편인 라니비주맙 (RAN)이다. RAN는 VEGF-A에 결합하고 이의 생물학적 활성을 저해하며, 그렇게 함으로써 내피 세포의 표면 상에서 VEGF-A와 이의 수용체 (VEGFR1 및 VEGFR2)의 상호작용을 방지한다. 이것은 내피 세포 증식에서의 감소, 더 적은 혈관 누출, 및 CNV의 새로운 혈관 형성 특징에서의 감소를 야기한다.
하지만, RAN의 안구 반감기는 유리체내 주사 후 단지 9일이고, 따라서 혈관 증식을 억제하는 데에서 효과적이도록 치료학적 용량이 환자에게 매달 투여되어야 한다. 거의 95%의 환자에서 시력을 안정화하는 것이 유용하지만, 개선된 시력은 단지 29%-40%의 환자에서만 나타났다. RAN는 분비된 VEGF-A를 흡수시키기 위한 분자 스폰지로서 작용한다. 이 과정에서 비효율성은 대부분의 환자에서 왜 시력이 단지 안정화되고, 개선되지는 않았는지에 대한 한 가지 이유일 수 있다. 다시 말하자면, 증상을 치료하긴 하지만, 원인을 치료하지는 않는다.
현존하는 단클론 항체 습성 AMD 치료법이 가진 주요 결점은 빈번하고 지속적인 치료가 요구된다는 점이고, 전형적으로 눈 안으로 매달 주사하는 것을 수반한다. 빠르게 노화되는 인구와 유리체내 주사를 투여할 자격이 있는, 상대적으로 적은 수의 임상의를 통합하면, 이 치료법의 적용은 건강관리 시스템에 대해 막대한 부담이 된다. 따라서, 더 오래 지속되는 치료 및/또는 증상을 반전시킬 수 있는 치료가 분명히 필요하다. 습성 AMD에 대한 대안 치료는 그들의 투여 빈도의 결과로서뿐만 아니라 그들의 부작용 또는 불량한 효능에 대해서도 유사하게 만족스럽지 못했다.
임상 시험을 시작하기 위한 더 새로운 약물 중 하나는 VEGFR-1 수용체의 제2 결합 도메인 및 VEGFR2 수용체 1의 제3 도메인을 편입시키는 VEGF Trap Eye (VTE)의 약물이다. 이들 세포외 단백질 서열을 인간 IgG 골격(backbone)의 Fc 단편과 융합시킴으로써, 개발자는 매우 높은 VEGF 결합 친화도를 가진 키메라 단백질을 만들었다 (Stewart MW. Br J Ophthalmol (2012). doi:10.1136/bjophthalmol-2011-300654). VEGF-A 패밀리의 모든 이성질체를 결합시키는 것뿐만 아니라, VEGF-B 및 태반 성장 인자를 또한 결합시킨다.
키메라 단백질이 여전히 상대적으로 짧은 반감기를 가지고 있다는 사실을 고려하면, 어쨌든 VTE는 여전히 정기적으로 - 매 2달마다 투여되어야 한다.
AAV2-sFLT01은 인간 IgG1 Fc에 커플링되는 변형된 가용성 Flt1 수용체를 발현하는 유전자 치료 벡터이다. 고 친화도 VEGF 결합 단백질로서, AAV2-sFLT01은 유리체내 주사를 통해 습성 AMD의 치료를 위한 VEGF의 전-신생혈관 활성을 중화하는 기능을 한다. (Wasworth et al. Molecular Therapy vol. 19 no. 2 Feb. 2011; 326-334). AAV 벡터의 용도는 단일 주사로부터 수 개월 동안 또는 심지어 수년 동안 지속되는, 장기간 발현을 보장하는 것으로 예상된다. 하지만, sFLT01 및 IgG1 중쇄 Fc 융합 단백질을 제공하기 위하여, 단일 가닥 AAV가 이용되어야 하고, 이는 결과적으로 효율적인 형질도입을 위해 많은 수량의 벡터를 요구하고 따라서 바이러스 외피 단백질에 대한 면역 반응의 위험을 증가시킨다. 더욱이, 매우 보편적인 정상 성인 인구는 AAV의 혈청형 2 변이체에 노출되었고, 이에 대항하는 기존 면역력을 가질 수도 있다.
분자 PF-04523655는 저산소-유도성 유전자 RTP801의 발현을 저해하는 19 뉴클레오티드 siRNA이다 (Nguyen et al. Ophthalmology. 2012 Sep;119(9):1867-73). 지금까지 수행된 임상 연구에서, 신생혈관 및 혈관 누출을 예방하는 것이 밝혀졌고, 하지만, 이는 VEGF와는 다른 경로를 통해 이루어진다. siRNA는 여러 주 동안 눈에만 고수한다는 점이 입증되었고, 이는 수 많은 다른 현존 및 개발 치료법과 유사하게, 환자는 치료를 위해 정기적인 유리체내 주사를 요구할 것이라는 점을 의미한다. 많은 치료로 이렇게 하는 것에 대한 실패는 시력의 지속적인 손실과 변성 진행으로 나타났다.
더욱 일반적으로, 습성 AMD를 치료하고 관리하기 위한 이전 siRNA-기반 기법은 실패하였다. 초기 전-임상 실험 결과가 유망하였음에도 불구하고, 이들 분자의 작용 방식은 서열 특이적인 RNAi-기반 메커니즘을 통한 것이 아니었고, 이보다는 톨-유사(Toll-like) 수용체 TLR3과 siRNA의 상호작용에 의해 매개된 비-특이적인 인터페론 반응의 유도를 통한 것이었다는 점이 차후에 입증되었다 (Kleinmann et al 2008). 톨-유사 수용체는 선천적 면역계에서 주요 역할을 하는 막관통 단백질이다. 세포 표면 상에 또는 세포간 소포, 가령 엔도솜 상에 종종 위치하여, 이 패밀리의 몇몇 패밀리 구성원은 외래 물질로서, 일반적으로는 내생 세포에 존재하지 않는, 이중 가닥 RNA를 인식하고 분자 반응의 캐스캐이드를 유발한다. 이것은 생쥐 모델에서 일시적인 치료 효과를 갖는 인터페론 활성화를 초래한다. 하지만 인터페론은 인간에서는 훨씬 더 낮은 효능을 가지며, 이는 인간 임상 검사에서 이 치료의 불량한 효능을 설명한다.
레티노스태트(Retinostat)는 엔지오스태틴(angiostatin) 및 앤도스태틴(endostatin)을 발현하는 말(equine) 감염성 빈혈 바이러스 (EIAV) 기반 렌티바이러스 벡터이고, 엔지오스태틴과 앤도스태틴 둘 모두 안구 구획내 자연적으로 발생한 혈관신생 저해제이다. 엔도스태틴은 VEGF 신호전달을 차단하고, 혈관 침투성을 감소시키고, 세포 기질 접착을 줄이고 내피 세포 아폽토시스를 촉진한다. 엔지오스태틴은 내피 세포 증식 및 이동을 방지한다. 유전자는 망막하 주사를 통해 전달되고 새로운 혈관의 형성을 저해한다. 하지만 망막하 전달은 집중적인 외과적 절차를 필요로 하고, 이는 유리체내 전달과는 다르게, 외래 환자 치료 또는 지역 의원에서의 치료에는 적합하지 않다.
AMD 치료제, 특히 습성 AMD의 분야에서 많은 양의 개발 활동에도 불구하고, 부작용, 치료 방식 및 이의 빈도에 관하여 환자에게도 친화적인 더욱 효과적인 치료법을 만들어야 할 필요성이 남아있다. 본 발명은 개체에서 습성 AMD를 치료하고 관리하기 위한 RNA 간섭 (RNAi) 작용제 및 상기 RNAi 작용제의 용도에 관한 것이다.
RNAi 경로는 이중 가닥 RNA (dsRNA) 분자를 ~20-25개 뉴클레오티드의 짧은 단편 (일반적으로 siRNA로서 언급됨)으로 절단시키는, 효소 다이서(Dicer)에 의해 시작된다. 가이드 가닥(guide strand) 또는 활성 가닥(active strand)으로서 공지된, 각각의 단편의 두 가닥 중 하나는 이후, 아르고너트(Argonaute) 단백질 패밀리의 구성원과의 결합을 통해 RNA-유도 침묵 복합체 (RISC) 내로 편입된다. RISC 내로 통합 후, 이의 표적 mRNA를 가진 가이드 가닥 염기-쌍은 (번역 기구를 지연시킴으로써) 번역을 저해시킴으로써 및/또는 mRNA의 절단을 유도함으로써 표적을 저해시키고, 그렇게 함으로써 이것이 번역 주판으로서 이용되는 것을 방지하는 것으로 간주된다.
다이서에 의해 생성된 단편이 이중-가닥이지만, 오로지 가이드 가닥만이 유전자 침묵을 유도한다. 항-가이드 가닥 (일반적으로, 패신저(passenger) 가닥, 캐리어(carrier) 가닥 또는 * 가닥으로서 언급됨)은 RISC 활성화 동안 빈번하게 분해된다 (Gregory R et al., 2005). RISC 어셈블리(assembly)는 어떤 dsRNA 다이서 산물의 가닥이 RISC 내에서 로딩되는 지 선택하는 효소에 의해 좌우되는 것으로 간주된다. 이 가닥은 주로 5' 말단이 이의 상보체와 덜 단단하게 쌍을 이루는 가닥이다. 또한, 몇 가지 아르고너트 단백질과의 결합을 촉진하기 위해 5' 위치에서 A, 그리고 보다 적게는 U에 대한 뚜렷한 편향이 있는 것으로 나타난다 (Schwarz DS et al., 2003; Frank F et al., 2010).
본 발명은 이 분야에서 RNAi 치료제에 의해 직면한 이전 어려움을 극복하면서, 상기 이미 논의된 바와 같은 다른 치료법과 연관된 문제점을 극복하고자 한다.
명세서내 임의의 사전 기술에 대한 언급은 이 사전 기술이 호주에서 또는 임의의 다른 관할권에서 일반적인 공통 지식의 일부를 형성하고 또는 이 사전 기술이 해당 분야의 통상의 기술자에 의해 관련 있는 것으로서 확인되고, 이해되고 그리고 언급되는 것으로 합리적으로 예상될 수 있다는 승인으로서 또는 임의의 형태의 제안으로서 받아들여지지 않고, 그리고 받아들여져서도 안 된다.
발명의 요약
AMD, 특히 습성 AMD에 대한 장기간 치료법에 대해 충족되지 않은 요구가 있다. 특정한 RNAi 구조체는 AMD의 발병과 연관된 유전자 (종합적으로 'AMD 연관 유전자'로서 언급됨)의 발현을 하향-조절하는 능력을 갖는다는 점이 현재 발명자에 의해 밝혀졌다. 결과적으로, 이것은 AMD의 진행 및 수반되는 시력 손실을 늦출 수 있고, 몇몇 경우에는 시력 개선을 야기할 수 있다. 비-침습성 방식으로 RNAi 작용제를 표적 세포로 유도하는 벡터 전달 비히클의 이용과 함께, 이들 표적 서열의 장기간 억제를 성취하기 위한 RNAi 기술을 활용함으로써, 이 요구가 충족될 수 있고 그리고 환자의 편의 그리고 친화적인 방식으로 충족될 수 있다. 더욱이, DNA 유도 RNAi (ddRNAi) 구조체로부터 발현된 RNA 작용제가 핵에서 생성되고 세포 표면 상에서 또는 엔도솜 구획 내에서 톨-유사 수용체와 상호작용하지 않기 때문에, ddRNAi 작용제는 TLR을 통해 인터페론 반응을 활성화하는 것 없이 생성될 수 있다.
본 발명의 하나의 측면에서, AMD 연관 유전자, 바람직하게는 습성 AMD 연관 유전자에서 하나 이상의 표적 서열의 발현을 저해하고, 방지하고 또는 감소시키기 위하여, 세포에서 (생체내를 포함) 하기 작용제를 발현하기 위한 DNA-유도 RNA 간섭 (ddRNAi) 작용제 (RNA 분자가 됨), 및 발현 카세트 또는 구조체가 제공되며, 여기서 작용제는
● 적어도 17개 뉴클레오티드 길이의 효과기 서열 (아래 추가로 설명됨), 그리고
● 효과기 상보 서열을 포함하고
여기서 효과기 서열은 하나 이상의 표적 서열의 전사체내 하나 이상의 표적 영역과 상보적이거나 실질적으로 상보적이다.
표적 영역은 서열 번호: 1-39 중 어느 하나 이상에서 선택된 표적 서열의 전사체 내에서 임의의 10개 이상의 근접 뉴클레오티드로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 효과기 상보 서열은 효과기 서열과 실질적으로 상보적이고 따라서 이중 가닥 RNA 조각을 형성하기 위하여 어닐링될 경향이 있을 것이다.
효과기 서열은 표적 유전자의 표적 서열의 전사체 내에서의 표적 영역으로 유도된다. 따라서 효과기 서열은 표적 영역을 포함한 표적 유전자로부터의 전사체에 대해 서열에서 실질적으로 상보성 ('실질적인 상보성'은 아래에서 정의된 바와 같음)이 됨으로써 표적 영역으로 '유도'된다. 따라서 효과기 서열을 함유한 이중-가닥 부분을 가진 RNAi 작용제, 가령 ddRNAi 작용제는 표적 영역을 포함한 표적 유전자 서열로 인하여 "표적 유전자 서열의 발현을 저해"할 수 있다. 이에 따라, AMD 연관 유전자를 가진 세포 내에서, RNAi 작용제는 표적 유전자 서열의 발현을 저해할 수 있는데, 그 이유는 효과기 ('효과기'는 아래에서 정의된 바와 같음)의 서열이 표적 유전자의 mRNA 표적 서열의 (적어도) 한 영역과 실질적으로 상보적이기 때문이다. 이것은 다음의 무작위이며, 가상적인 짧은 서열을 고려함으로써 설명될 수 있다:
5'GGCATTGCG3' - 표적 서열 내에서 표적 영역
5'GGCAUUGCG3' - 표적 서열의 전사체
3'GUAACG5' - 표적 서열의 전사체내 표적 영역과 실질적으로 상보적인, 효과기 서열.
전형적으로, 표적 영역은 침묵되는 것으로 의도되는 또는 (전사 또는 번역 수준에서) 유전자의 발현이 감소, 저해 또는 방지되도록 의도되는 유전자의 mRNA 내에서의 핵산 서열의 영역이다.
상기 설명을 위한 비교에서 보여지는 바와 같이, 효과기 서열과 효과기 상보 서열 사이에서 '실질적인 상보성'은 100% 상보성일 수 있다. 하지만, 아래에서 추가로 더 특정하게 설명되고 정의된 바와 같이, 실질적인 상보성은 80% 내지 100% 상보적일 수 있다. 따라서, 예를 들어 20개 뉴클레오티드의 길이를 가진 효과기 서열에서, 효과기 서열은 20개 뉴클레오티드 중 17개가 상보적, 즉 85% 상보성이라면, 효과기 상보 서열과 실질적으로 상보적이다. 더욱이, 주로 이중 가닥 조각의 한 쪽 말단은 shRNA로서 언급되는 '헤어핀(hairpin)' 모양의 구조를 형성하기 위하여 루프(loop) 서열에 의해 연결될 것이다. 이것은 또한 '방해된 역 반복' 구조로서 또한 공지되는데, 그 이유는 이러한 RNA 서열을 인코딩하는 DNA는 루프를 인코딩하는 스터퍼(stuffer) 또는 스페이서(spacer) 서열에 의해 방해되는, 효과기 서열로 전사되는 표적 유전자의 영역의 역 반복을 포함하기 때문이다.
상기 문단에서 설명된 실질적인 상보성의 개념은 효과기 서열과 표적 서열 사이의 실질적인 상보성에 동일하게 적용되고, 여기서 실질적인 상보성은 80% 내지 100% 상보성일 수 있다. 즉, 표적 서열 내에서 표적 영역은 20개 뉴클레오티드 길이이고, 그리고 효과기 서열은 20개 뉴클레오티드 길이라면, 효과기 서열은 예를 들어 표적과 상보적인 16, 17, 18 또는 20개 뉴클레오티드를 가질 수 있고, 이때 상기 뉴클레오티드는 각각, 80%, 85%, 90% 및 100% 상보성에 해당한다.
둘 모두의 상황에서, 실질적인 상보성은 정수에 해당하지 않을 것이라는 점을 이해할 것이다. 예를 들어, 22개 뉴클레오티드의 서열에 대한 적어도 85% 상보성은 18.7개 뉴클레오티드일 것이고, 따라서 상보적이기 위해서 22개 중 19개가 사실상 필요조건이 된다.
대안으로, (효과기 및 표적, 그리고 효과기 및 이의 상보체 사이에서 실질적인 상보성의 맥락에서 모두) 80 내지 100% 상보성 중 실질적인 상보성은 G-C/A-U 염기쌍 (아래 설명되는 바와 같은 워블 쌍(wobble pair)은 제외)이 아닌 뉴클레오티드의 수와 관련하여 설명될 수 있다. 뉴클레오티드 서열에 걸쳐 적어도 80% 상보성인 것으로 고려될 때 다른 가닥 상의 뉴클레오티드와 그들 자체가 상보적이지 않은 2개의 RNA 간의 상보적인 영역 내에는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 뉴클레오티드가 있을 수 있다. 염기쌍이 아닌 1, 2, 3, 4 또는 5개의 뉴클레오티드가 있을 수 있는 지의 여부에 대한 것은 관련 서열의 길이에 의존한다. 예를 들어, 효과기 서열이 17개 뉴클레오티드 길이라면, 염기쌍이 아닌 5개의 뉴클레오티드를 가질 수 없는데, 그 이유는 이것이 단지 71% 상보성에 해당할 것이기 때문이다. 17개의 뉴클레오티드 서열에서, 적어도 80% 상보성을 위해 17개의 뉴클레오티드 중 14개 사이에서 상보적이어야 한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 효과기 서열 및 이의 상보체에 의해 형성된 이중 가닥 영역은 내생 RNAi 가공처리 경로를 위한 천연 기질인 내생 miRNA의 구조와 유사한 마이크로RNA (miRNA) 구조의 일부로서 발현된다. ddRNAi 구조체로부터 발현된 이중 가닥 RNA의 가공처리는 부정확할 수 있고, 그리고 독성을 야기할 수 있다. McBride et al. (2008)는 내생 miRNA의 염기 및 루프로부터 서열을 발현한 "인공 miRNA" 구조체를 설계하였고, 그리고 miR-골격으로부터 발현된 shRNA의 더 정확한 가공처리는 구조체로부터 감소된 독성을 초래한다는 점을 제시하였다. Wu et al. (2011)은 (패신저 가닥에서 미스매치를 함유한) 미스매치된 복식(mismatched duplex)이 아마도 내생 miRNA와 그들의 더 큰 구조적 유사성으로 인해 가끔씩 증가된 침묵 활성을 나타내었다는 점을 보여주었다.
본 발명의 하나의 측면에서, AMD 연관 유전자, 바람직하게는 습성 AMD 연관 유전자의 발현을 저해하고, 방지하고 또는 감소시키기 위하여, ddRNAi 작용제 그리고 세포에서 작용제를 발현하기 위한 발현 카세트가 제공되고, 여기서 작용제는
표적 영역의 전사체에서 하나 이상의 표적 영역과 상보적인 또는 실질적으로 상보적인 적어도 17개 뉴클레오티드 길이의 효과기 서열, 그리고 효과기 상보 서열을 포함하고,
여기서 효과기 서열 및 효과기 상보 서열은 miRNA 구조 내에서 발현된다. 표적 영역은 서열 번호: 1-39 중 임의의 하나 이상에서 선택된 서열의 전사체 내에서 임의의 10개 이상의 근접 뉴클레오티드로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 몇몇 형태에서, 작용제는 하나보다 더 많은 효과기 서열을 가진다. 다수의 효과기는 습성 AMD 연관 유전자의 동일한 영역 (전형적으로 동일한 영역의 변이체), 습성 AMD 연관 유전자의 상이한 영역, 하나보다 더 많은 습성 AMD 연관 유전자, 또는 상기 모두의 조합을 표적할 수 있다.
RNAi 작용제, 가령 ddRNAi 작용제는 2 또는 3개 이상의 효과기 서열을 함유할 수 있다. 상기 설명된 바와 같이, ddRNAi 작용제는 각각의 효과기 서열에 대한 효과기 상보 서열을 포함하고, 따라서 효과기-효과기 상보체 쌍 (즉 제1 효과기 - 제1 효과기 상보체 쌍, 제2 효과기 - 제2 효과기 상보체 쌍)을 형성한다. 이들 쌍은 RNAi 작용제가 각각의 쌍이 어닐링되도록 하기 위하여 접힐 수 있는 한, 서로 근접할 수 있지만, 반드시 근접할 필요는 없다. 여러 가지 다른 고려사항은 RNAi 작용제의 길이에 따라 효과기 및 효과기 상보체의 한 가지 순서 또는 또 다른 순서를 제안한다. 추가로, 해당 분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 그리고 도면에서 설명되는 바와 같이, 임의의 특정 효과기 서열은 작용제에서 이의 상보체와 위치가 바뀔 수 있다. 아래의 여러 가지 구체예에서 예시화된 바와 같이, 중요한 특징은 효과기 서열이 이중 가닥 영역을 형성하기 위해 이의 상보체로 어닐링될 수 있다는 점이다. 예를 들어:
● 5'에서 3'으로의 방향으로, 제1 효과기 서열; 제2 효과기 서열; 제2 효과기 상보 서열; 및 제1 효과기 상보 서열을 포함하는 ddRNAi 작용제;
● 5'에서 3'으로의 방향으로, 제1 효과기 서열; 제2 효과기 서열; 제3 효과기 서열; 제3 효과기 상보 서열; 제2 효과기 상보 서열; 및 제1 효과기 상보 서열을 포함하는 ddRNAi 작용제;
● 5'에서 3'으로의 방향으로, 제1 효과기; 제1 효과기 상보 서열; 제2 효과기 서열; 및 제2 효과기 상보 서열을 포함하는 ddRNAi 작용제;
● 5'에서 3'으로의 방향으로, 제1 효과기 서열; 제1 효과기 상보 서열; 제2 효과기 서열; 제2 효과기 상보 서열; 제3 효과기 서열; 및 제3 효과기 상보 서열을 포함하는 ddRNAi 작용제;
● 5'에서 3'으로의 방향으로, 제1 효과기 서열; 제2 효과기 서열; 2 내지 100개의 비-자가-상보적 뉴클레오티드의 루프 서열; 제2 효과기 상보 서열; 및 제1 효과기 상보 서열을 포함하는 ddRNAi 작용제;
● 5'에서 3'으로의 방향으로, 제1 효과기 서열; 2 내지 100개의 비-자가-상보적 뉴클레오티드의 루프 서열; 제1 효과기 상보 서열; 2 내지 100개의 비-자가-상보적 뉴클레오티드의 서열; 제2 효과기 서열; 2 내지 100개의 비-자가-상보적 뉴클레오티드의 루프 서열; 및 제2 효과기 상보 서열을 포함하는 ddRNAi 작용제;
● 5'에서 3'으로의 방향으로, 제1 효과기 서열; 2 내지 100개의 비-자가-상보적 뉴클레오티드의 루프 서열; 제1 효과기 상보 서열; 2 내지 100개의 비-자가-상보적 뉴클레오티드의 스페이서 서열; 제2 효과기 서열; 2 내지 100개의 비-자가-상보적 뉴클레오티드의 루프 서열; 및 제2 효과기 상보 서열을 포함하는 ddRNAi 작용제;
● 5'에서 3'으로의 방향으로, 제1 효과기 서열; 제1 효과기 상보 서열; 2 내지 100개의 비-자가-상보적 뉴클레오티드의 스페이서 서열; 제2 효과기 서열; 제2 효과기 상보 서열; 2 내지 100개의 비-자가-상보적 뉴클레오티드의 스페이서 서열; 제3 효과기 서열; 및 제3 효과기 상보 서열을 포함하는 ddRNAi 작용제.
비-자가-상보적 뉴클레오티드는 효과기 및 이의 상보체 사이에 위치될 때 루프 서열로서, 그리고 하나의 효과기 서열의 상보체, 및 그 다음 효과기 서열 사이에 위치될 때 스페이서 서열로서 작용한다. 이들 구체예 각각에서, 효과기 서열 및 이의 상보체, 그리고 임의의 추가적인 서열, 가령 2 내지 100개의 비-자가-상보적 뉴클레오티드의 서열은 miRNA 구조 내에서 또는 상기 구조의 일부로서 발현된다.
상기 설명된 구체예 각각의 특정한 형태에서, 각각의 효과기 서열은 적어도 17개 뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 17 내지 30개 뉴클레오티드 길이, 그리고 더욱 바람직하게는 17 내지 21개 뉴클레오티드 길이이고, 그리고 서열 번호: 40-78 중 어느 하나로부터의 서열로부터 임의의 10개 이상의 근접 뉴클레오티드로 구성된 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 효과기 서열은 모두 동일할 수 있고, 또는 모두 상이할 수 있고, 또는 가령 서열 번호: 47의 적어도 10개의 근접 뉴클레오티드의 2개의 효과기 서열 그리고 서열 번호: 56의 적어도 10개의 근접 뉴클레오티드의 하나의 효과기 서열의 조합일 수 있다.
바람직하게, 효과기 서열은 서열 번호: 40-78 중 어느 하나 내에서 임의의 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개 근접 뉴클레오티드, 바람직하게는 서열 번호: 40-78 중 어느 하나 내에서 17개 이상의 근접 뉴클레오티드 그리고 가장 바람직하게는 서열 번호: 40-78 중 어느 하나 내에서 17 내지 21개의 근접 뉴클레오티드로 구성된 군에서 선택된다. 전형적으로, 효과기 상보체는 이의 상응하는 효과기 서열과 동일한 길이, 또는 대략 동일한 길이 (즉 ± 15% 뉴클레오티드 길이, 또는 전체 길이에 따라 1 내지 3개의 뉴클레오티드)일 것이다.
특정한 구체예에서, ddRNAi 작용제의 효과기 서열은 포함된 서열 번호: 40-78 중 어느 하나로 구성된 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열로 구성되거나 본질적으로 구성된다. 이들 구체예에서, ddRNAi 작용제 서열 번호: 40-78 그리고 추가적인 뉴클레오티드 또는 다른 화학 변형은 아래 설명되는 어세이에 따라 결정될 수 있는 바와 같이, 표적 유전자의 발현을 저해하고, 감소시키고 또는 방지하기 위하여 활성을 나타내는 한, 서열 번호: 40-78로 "본질적으로 구성"될 것이다. 유사하게, RNAi 작용제는 서열 번호: 40-78 중 하나로 "본질적으로 구성"되고, 여기서 상기 서열 번호는 아래 설명되는 어세이에 따라 결정될 수 있는 바와 같이, 표적 유전자의 발현을 저해하고, 감소시키고 또는 방지하기 위하여 활성을 나타내는 한, 상응하는 서열 번호보다 더 짧다.
대안적인 구체예에서, dsRNA는 복식을 형성하기 위해 어닐링되는 2개의 분리된 RNA 가닥으로 구성된다. 그 복식은 이후, miRNA 골격에 내장될 수 있다.
ddRNAi 작용제는 임의의 적합한 벡터 또는 ddRNAi 구조체 내로 삽입된 DNA 발현 카세트로부터 발현될 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 측면에서, 다음을 (특정한 순서 없이) 포함한 ddRNAi 발현 카세트가 제공된다:
● 하나 이상의 프로모터 서열
● 하나 이상의 효과기 서열을 인코딩하는 하나 이상의 DNA 서열, 바람직하게는 서열 번호: 40-78 중 어느 하나로부터의 서열 내에서 임의의 10개 이상 바람직하게는 임의의 17개 이상의 근접 뉴클레오티드를 인코딩하는 DNA 서열이 됨,
● 하나 이상의 효과기 상보 서열을 인코딩하는 하나 이상의 DNA 서열 그리고 선택적으로
● 하나 이상의 종결 서열
● 스페이서 서열, 루프 서열, 또는 둘 모두를 인코딩하는 하나 이상의 DNA 서열; 그리고
● 하나 이상의 인헨서 서열.
몇몇 구체예에서, 하나의 프로모터는 다수의 효과기-인코딩 영역에 작동가능하게 연결되고 따라서 다수의 효과기 서열을 가진 ddRNAi 작용제가 생성된다. 대안적인 구체예에서, 각각의 효과기-인코딩 영역이 이의 자체 프로모터에 작동가능하게 연결되는 경우, 다수의 ddRNAi 작용제는 단일 발현 카세트로부터 생성된다. 다수의 프로모터가 있는 구조체에서, 이들은 모두 동일하거나 상이할 수 있다. 바람직한 프로모터는 pol III 프로모터, 가령 U6 및 H1; pol II 프로모터, 가령 RPE 세포 특이적 프로모터 RPE-65 (Boye et al. 2012) 및 VMD2 (Zhu et al. 2010), 및 맥락막 내피-특이적 프로모터 FLT-1 또는 ICAM2이고 또한 ddRNAi 구조체의 발현을 유도하는 데에 이용될 수 있다.
효과기 서열 및 이의 상보체가 miRNA 구조 내에서 발현되는 구체예에서, ddRNAi 발현 카세트는 miRNA 인코딩 (ME) 서열로서 본 명세서에서 언급된 miRNA 구조에 대해 인코딩하는 서열을 추가로 포함한다. ME 서열은 또한 루프 서열에 대해 인코딩할 수 있다.
ddRNAi 발현 카세트가 발현을 위해 삽입되는 ddRNAi 발현 구조체가 또한 제공된다. 추가로, 구조체의 벡터 골격이 전달 시스템과 양립할 수 있을 때, ddRNAi 발현 구조체는 또한 전달 구조체이다. 특히 바람직한 전달 구조체는 바이러스 벡터, 가령 유리체내 주사 후 망막 깊은 곳의 적절한 세포로 ddRNAi 발현 카세트가 전달되게 하는 변형된 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터 (Petrs-Silva et al. 2011)이다. 세포 내로부터 치료학적 ddRNAi 작용제를 생성하는 발현 구조체를 전달하기 위한 변형된 AAV의 용도는 표면-발현 톨-유사 수용체 3과 핵산의 직접적인 상호작용에 의해 종종 야기되는 인터페론 반응을 방지한다. 이것은 임상 시험에서 siRNA-기반 안구 약물의 다수의 실패에 대한 원인에 대해 추정된다.
추가로, 이 구체예에서, AMD 연관 유전자에서 하나 이상의 표적 서열의 발현을 저해하기 위한 ddRNAi 작용제를 발현하기 위한 ddRNAi 발현 카세트를 포함하는 ddRNAi 발현 구조체가 제공되고, 발현 카세트는 (특정한 순서 없이)
하나 이상의 프로모터 서열
하나 이상의 효과기 서열을 인코딩하는 하나 이상의 DNA 서열,
하나 이상의 효과기 상보 서열을 인코딩하는 하나 이상의 DNA 서열;
그리고 선택적으로
하나 이상의 종결 서열
루프 서열, 스페이서 서열 또는 둘 모두를 인코딩하는 하나 이상의 DNA 서열,
하나 이상의 인헨서 서열을 포함하며, 여기서 구조체는 바이러스 벡터 전달 비히클이다.
바람직하게 발현 카세트는 ddRNAi 작용제가 miRNA 구조의 일부로서 또는 상기 구조 내에서 발현되도록 ME 서열을 추가로 포함한다.
한 가지 구체예에서, 바이러스 벡터 전달 구조체의 발현 카세트는 AMD-연관 유전자 VEGF-A의 5' UAUGUGGGUGGGUGUGUCUAC 3' (서열 번호: 47) 내에서 임의의 10개 이상의 근접 뉴클레오티드의 제1 효과기 서열을 인코딩하는 하나의 DNA 서열을 포함한다.
추가적인 구체예에서, 바이러스 벡터 전달 구조체의 발현 카세트는 AMD-연관 유전자 VEGRF-2의 5' UGUAACAGAUGAGAUGCUCCA 3' (서열 번호: 56) 내에서 임의의 10개 이상의 근접 뉴클레오티드의 제1 효과기 서열 그리고 AMD-연관 유전자 VEGFA의 5' UAUGUGGGUGGGUGUGUCUAC 3' (서열 번호: 47) 내에서 임의의 10개 이상의 근접 뉴클레오티드의 제2 효과기 서열을 인코딩하는 2개의 DNA 서열을 포함한다.
또 다른 대안적인 구체예에서, 바이러스 벡터 전달 구조체의 발현 카세트는 AMD-연관 유전자 VEGRF-2의 5' AAGUAGCCAGAAGAACAUGGC 3' (서열 번호: 52) 내에서 임의의 10개 이상의 근접 뉴클레오티드의 제1 효과기 서열; AMD-연관 유전자 CFB의 5' UUAUAGAAAACCCAAAUCCUC 3' (서열 번호: 78) 내에서 임의의 10개 이상의 근접 뉴클레오티드의 제2 효과기 서열; 및 AMD-연관 유전자 PDGFR-β의 5' UAGCUGAAGCCCACGAGGUCC 3' (서열 번호: 63) 내에서 임의의 10개 이상의 근접 뉴클레오티드의 제3 효과기 서열을 인코딩하는 3개의 DNA 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 서열 번호: 40-78 중 어느 하나로부터의 서열 내에서 임의의 10개 이상의 근접 뉴클레오티드로 구성된 군에서 선택된 적어도 17개 뉴클레오티드 길이의 서열 그리고 서열과 복식을 형성하는 서열 상보체를 포함하고, 습성 AMD 연관 유전자의 발현을 저해할 수 있는 siRNA 작용제를 또한 제공한다.
몇몇 구체예에 따라서, 대상에서 AMD 연관 유전자에 의해 인코딩되는 mRNA 또는 폴리펩티드의 발현을 저해하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 1, 2, 3, 4 또는 5개의 뉴클레오티드에 의해 서열 번호: 40-78에서 달라지는 서열 그리고 서열 번호: 40-78 중 어느 하나로 구성된 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열로 구성되거나 본질적으로 구성되는 ddRNAi 작용제를 포함한 본 발명의 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. ddRNAi 작용제를 발현하기 위한 ddRNAi 발현 카세트 또는 ddRNAi 발현 구조체가 또한 투여될 수 있다.
또 다른 구체예에서 본 발명은 대상에서 AMD, 바람직하게는 습성 AMD의 치료, 또는 망막 내에서 부적절한 혈관신생에 의해 야기되는 다른 질병의 치료를 위한 조성물을 제공하고, 상기 조성물은 AMD 연관 유전자에서 하나 이상의 표적 서열의 발현을 저해하고, 방지하고 또는 감소시키기 위하여 활성 성분으로서, 본 발명의 ddRNAi 작용제, ddRNAi 발현 카세트 또는 ddRNAi 발현 구조체를 포함한다.
또 다른 구체예에서 본 발명은 AMD 연관 유전자에서 하나 이상의 표적 서열의 발현을 저해하고, 방지하고 또는 감소시키기 위한 주요 성분으로서 본 발명의 ddRNAi 작용제, ddRNAi 발현 카세트 또는 ddRNAi 발현 구조체의 유효량을 포함하는 제약학적 조성물을 제공한다. 조성물은 예를 들어 대상에서 AMD, 바람직하게는 습성 AMD의 치료, 또는 망막 내에서 부적절한 혈관신생에 의해 야기되는 다른 질병의 치료를 위해 이용될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 조성물은 제약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 추가로 포함한다.
또 다른 구체예에서 본 발명은 대상에서 AMD, 바람직하게는 습성 AMD의 치료, 또는 망막 내에서 부적절한 혈관신생에 의해 야기되는 다른 질병의 치료를 위한 조성물을 제공하고, 상기 조성물은 AMD 연관 유전자에서 하나 이상의 표적 서열의 발현을 저해하고, 방지하고 또는 감소시키기 위하여 활성 성분으로서 본 발명의 ddRNAi 작용제, ddRNAi 발현 카세트 또는 ddRNAi 발현 구조체를 포함한다.
또 다른 구체예에서 본 발명은 대상에서 습성 AMD의 치료에서 이용하기 위한 본 발명의 ddRNAi 작용제, ddRNAi 발현 카세트 또는 ddRNAi 발현 구조체를 포함한 AMD 연관 유전자에서 하나 이상의 표적 서열의 발현을 저해하고, 방지하고 또는 감소시키기 위한 조성물을 제공한다. 몇몇 구체예에서, 조성물은 제약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 추가로 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 대상에서 AMD의 치료를 위한 약의 제조에서 AMD 연관 유전자에서 하나 이상의 표적 서열의 발현을 저해하고, 방지하고 또는 감소시키기 위한 ddRNAi 작용제, ddRNAi 발현 카세트 또는 ddRNAi 발현 구조체를 제공한다. 바람직하게 약은 습성 AMD를 위한 것이다.
또 다른 구체예에서 본 발명은 선택적으로, 제약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 함께 주요 성분으로서 AMD 연관 유전자에서 하나 이상의 표적 서열의 발현을 저해하고, 방지하고 또는 감소시키기 위한 본 발명의 ddRNAi 작용제, ddRNAi 발현 카세트 또는 ddRNAi 발현 구조체의 유효량을 포함하는 AMD 치료 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 대상의 망막 내에서 부적절한 혈관신생에 의해 야기되는 지병의 진행을 치료하거나 지연시키기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 AMD 연관 유전자에서 하나 이상의 표적 서열의 발현을 저해하고, 방지하고 또는 감소시키기 위한 본 발명의 ddRNAi 작용제, ddRNAi 발현 카세트 또는 ddRNAi 발현 구조체 또는 조성물을 대상에게 투여하고, 그렇게 함으로써 AMD의 중증도를 감소시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 대상에서 AMD, 바람직하게는 습성 AMD의 진행을 감소시키기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 AMD 연관 유전자에서 하나 이상의 표적 서열의 발현을 저해하고, 방지하고 또는 감소시키기 위한 본 발명의 ddRNAi 작용제, ddRNAi 발현 카세트 또는 ddRNAi 발현 구조체 또는 조성물을 대상에게 투여하고, 그렇게 함으로써 AMD의 중증도를 감소시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법 각각에서, 본 발명의 ddRNAi 작용제, ddRNAi 발현 카세트 또는 ddRNAi 발현 구조체 또는 조성물은 유리체내 주사 또는 망막하 주사로 대상이 눈/눈들에 바람직하게 전달된다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 (a) 본 발명의 ddRNAi 작용제, ddRNAi 발현 카세트 또는 ddRNAi 발현 구조체 또는 조성물 및 (b) 제약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 비롯한 성분 키트(kit of parts)를 제공한다.
특정한 구체예에서, 본 발명의 RNAi 작용제 또는 제약학적 조성물은 RNAi 작용제 또는 제약학적 조성물을 담고 있기 위한 리셉터클(receptacle)을 비롯한, 일회용 또는 재사용이 가능한 장치의 형태로 제공될 수 있다. 한 가지 구체예에서, 장치는 주사기, 바람직하게는 유리체내 주사 또는 망막하 주사에 적합한 주사기이다. RNAi 작용제 또는 제약학적 조성물은 추가 성분의 혼합 또는 첨가를 요구하는 상태에서 또는 이용하기 위해 준비된 상태에서 장치로 제공될 수 있다.
본 발명이 인간에서의 적용을 발견하지만, 본 발명은 또한 수의학 목적을 위해서도 유용하다. 본 발명은 AMD 또는 가축 동물, 가령 소, 양, 말 및 가금류; 반려 동물, 가령 고양이 및 개; 그리고 동물원 동물에서 부적절한 혈관신생에 의해 야기되는 다른 질병의 치료를 위해 유용하다.
그림/도면의 간단한 설명
도 1A-G는 본 발명의 ddRNAi 작용제 구조 몇 가지를 설명한다.
도 2: A. pSilencer (Invitrogen)의 지도. 이 발현 카세트는 인간 U6 프로모터 (흑색 화살표)를 함유하고 BamH I / Hind III 단편으로서 이 벡터 내로 클로닝된 shRNA 서열을 발현하도록 설계되었다. B. AMD 연관 유전자를 침묵시키도록 설계된 BamH I / Hind III shRNA 단편의 도식적인 배치도를 보여주는 일반화된 지도. BamHi / Hind III 제한 부위의 위치가 나타난다; 백색 화살표는 mir30a의 루프 및 miR30a의 3' 스템(stem)으로부터 유래된 서열, miR30a의 5' 스템으로부터의 서열을 나타낸다. 회색 화살표는 예측되는 패신저 가닥 그리고 흑색 화살표는 예측되는 가이드 가닥을 나타낸다. 예측되는 가이드 가닥 및 예측되는 패신저 가닥의 상대적인 위치결정은 호환적일 수 있다. 흑색 선은 pol III 말단 신호를 나타낸다. C. 유력하게 VEGF-A를 침묵시키는 miR-8 단편의 DNA 서열이 나타나고 서열 번호: 98에 상응한다. 소문자는 제한 부위, mir30a-관련 서열 및 pol III 종결 서열을 나타낸다. 밑줄 친 서열은 인간 miR30a 전-구체 RNA (5' 및 3' 둘 모두)의 염기로부터 유래된다; 이탤릭체의 서열은 miR30a의 루프 서열로부터 유래된다. 대문자 서열은 예측되는 패신저 가닥 서열을 나타내고, 굵은 글씨체의 대문자 사열을 예측되는 효과기 서열 (서열 번호: 47)을 나타낸다. D. M-폴드 프로그램 (서열 번호: 147)을 이용하여 결정된, miR-8의 예측되는 RNA 이차 구조; 예측되는 다이서 및 드로샤(Drosha) 가공처리 부위는 화살표로 명시된다.
도 3: A. pGL3-VEGFA-센스 리포터의 지도. 플라스미드는 SV40 프로모터 (회색 화살표) 및 진핵생물 전사 종결자에 의해 유도되는 반딧불이 루시퍼라아제 (Fluc+)를 인코딩한다. VEGF-A 유전자의 비-코딩 가닥의 일부분은 모 플라스미드의 3' UTR에 존재하는 Xba I 및 Fse I 제한 부위를 이용하여 FLuc+ 전사 단위의 3' UTR 내로 삽입되었다 (pGL3; Promega). 이 플라스미드는 이중 루시퍼라아제 어세이에서 miR-2의 패신저 가닥의 저해 활성을 정량화하는 데에 이용되었다. B. pGL3-VEGFa-안티센스 리포터의 지도, 특징은 도 3A에서 나타난다. 도 3A에서 이용된 VEGF-A 유전자의 상응하는 부분은 Xba I 및 Fse I 제한 부위를 이용하여 FLuc+ 전사 단위의 3' UTR 내로 삽입되었고, 하지만 VEGF-A 유전자의 코딩 가닥이 이용되었다. 이 플라스미드는 이중 루시퍼라아제 어세이에서 miR-2의 효과기 가닥의 저해 활성을 정량화하는 데에 이용되었다.
도 4: A. 그래프는 이중 루시퍼라아제 어세이를 이용하여 결정된 VEGF-A 발현의 저해 퍼센트를 보여준다; 센서 구조체에서 센스 및 안티센스 표적 모두에 대한 활성이 나타난다 (n = 3 ± SD). B. 그래프는 전장 VEGF-A 단백질을 발현하는 전장 cDNA와 함께 miR-2, miR-5 및 miR-8로 공동-형질 감염된 HEK293T 세포에서qRT PCR에 의해 결정된 VEGF-A mRNA 수준의 저해 퍼센트를 보여준다. 저해 퍼센트는 형질 감염되지 않은 세포 및 빈 벡터(empty vector) 대조 (pSilencer 및 빈 U6 발현 카세트)로 계산된다. C. 그래프는 아데노바이러스 벡터 발현 miR-8로 형질도입되었던 ARPE-19 세포에서 VEGF-A mRNA 및 단백질의 수준을 보여준다. RNA 및 단백질의 샘플은 형질도입 후 24, 48, 72 및 96시간에 수집되었다. 삼각형은 루프 서열이 절단된 성숙, 가공된 miR-8의 세포간 수준을 보여준다.
도 5: A. 그래프는 이전에 설명된 바와 같은 반딧불이 루시퍼라아제 리포터를 이용하여 결정된 VEGFR2의 저해 퍼센트를 보여준다; 센스 및 안티센스 리포터 구조체 모두에 대한 활성이 나타난다 (n = 3 ± SD). B. 그래프는 VEGFR2에 대한 전장 cDNA를 발현하는 플라스미드 및 miR-V-2, miR-V-3, miR-V-7 또는 miR-V-10으로 공동-형질 감염되었던 HEK203T 세포에서 RT QPCR에 의해 결정된 VEGFR2 mRNA 수준의 저해 퍼센트를 보여준다. 저해 퍼센트는 빈 벡터 대조 (pSilencer; Invitrogen 및 비관련 플라스미드)와 비교하여 남아있는 mRNA로서 계산되었다. C. 5B에서와 같은 유사한 조건으로 형질 감염된 세포의 웨스턴 블롯 분석 그리고 VEGFR2에서 감소를 보여줌 (화살표). HUVEC 세포로부터 단백질 추출물은 겔 상에서 VEGFR2의 위치결정을 보여주기 위해 동시에 러닝되었다.
도 6: A. 그래프는 PDGFR-β에 대한 전장 cDNA를 발현하는 플라스미드 및 miR-V-4 또는 miR-V-9 중 하나로 공동-형질 감염되었던 HEK293T 세포에서 PDGFR-β mRNA 수준의 저해 퍼센트를 보여준다. 저해 퍼센트는 대조 (pSilencer, Invitrogen 및 비관련 플라스미드 및 빈 U6 발현 카세트)와 비교하여 남아있는 mRNA로서 계산되었다. B. 6B에서와 같은 유사한 조건으로 형질 감염된 세포의 웨스턴 블롯 분석 그리고 PDGFR-β에서 감소를 보여줌 (화살표).
도 7: A. 그래프는 이전에 설명된 바와 같은 반딧불이 루시퍼라아제 리포터를 이용하여 결정된 CFB 발현의 저해 퍼센트를 보여준다; 센스 및 안티센스 리포터 구조체 모두에 대한 활성이 나타난다 (n = 3 ± SD). B. 그래프는 CFB에 대한 전장 cDNA를 발현하는 플라스미드 및 miR-C-1, miR-C-8 또는 miR-C-9로 공동-형질 감염된 HEK293T 세포에서 CFB mRNA 수준의 저해 퍼센트를 보여준다. 저해 퍼센트는 대조 (pSilencer, Invitrogen, 비관련 플라스미드 및 빈 U6 발현 카세트)와 비교하여 계산되었다. C. 7B에서와 같이 유사하게 처리된 웰 상에서 수행된 웨스턴 블롯 분석은 CFB에서 감소를 보여주었다 (화살표).
도 8: A. U6-miR-7의 지도. 이것은 VEGF-A를 표적하는, miR-7의 발현을 유도하기 위해 인간 U6 프로모터 (흑색 화살표)를 이용한다. miR-7 코딩 서열은 도 2A에서의 것들과 동일하고 백색 화살표로 나타나고, miR-7 패신저 및 miR-7 효과기 서열의 위치는 회색 화살표로서 나타난다. U6-miR-7 단편의 서열은 서열 번호: 132로서 열거된다. B. VMD2-miR-7의 지도. 이것은 VEGF-A를 표적하는, miR-7 (백색 화살표)의 발현을 유도하기 위해 인간 VMD2 프로모터 (흑색 화살표)를 이용한다. VMD2-miR-7 단편의 서열은 서열 번호: 133으로서 열거된다. C. ICAM2-miR-7의 지도. 이것은 VEGF-A를 표적하는, miR-7 (백색 화살표)의 발현을 유도하기 위해 인간 ICAM2 프로모터 (흑색 화살표)를 이용한다. ICAM2-miR-7 단편의 서열은 서열 번호: 134로서 열거된다. D. RPE-65-miR-7의 지도. 이것은 VEGF-A를 표적하는, miR-7 (백색 화살표)의 발현을 유도하기 위해 인간 RPE65 프로모터 (흑색 화살표)를 이용한다. RPE65-miR-7 단편의 서열은 서열 번호: 135로서 열거된다. E. FLT-miR-7의 지도. 이것은 VEGF-A를 표적하는, miR-7 (백색 화살표)의 발현을 유도하기 위해 인간 FLT 프로모터 (흑색 화살표)를 이용한다. FLT-miR-7 단편의 서열은 서열 번호: 136으로서 열거된다.
도 9: A. U6-miR-7-miR-V-7의 지도. 이것은 VEGF-A 및 VEGFR2를 표적하는 miR-7-miR-V-7의 발현을 유도하기 위해 인간 U6 프로모터 (흑색 화살표)를 이용한다. miR-7-miR-V-7 코딩 서열은 백색 화살표로서 나타나고, miR-7 패신저 및 miR-7 효과기 서열 그리고 miR-V-7 패신저 및 miR-V-7 효과기 서열의 위치결정은 회색 화살표로서 나타난다. U6-miR-7 단편의 서열은 서열 번호: 137로서 열거된다. B. VMD2-miR-7 miR-V-7의 지도. 이것은 VEGF-A 및 VEGFR2를 표적하는, miR-7 miR-V-7 (백색 화살표)의 발현을 유도하기 위해 인간 VMD2 프로모터 (흑색 화살표)를 이용한다. VMD2-miR-7 miR-V-7 단편의 서열은 서열 번호: 138로서 열거된다. C. ICAM2-miR-7 miR-V-7의 지도. 이것은 VEGF-A 및 VEGFR2를 표적하는, miR-7 miR-V-7 (백색 화살표)의 발현을 유도하기 위해 인간 ICAM2 프로모터 (흑색 화살표)를 이용한다. ICAM2-miR-7 miR-V-7 단편의 서열은 서열 번호: 139로서 열거된다. D. RPE-65-miR-7 miR-V-7의 지도. 이것은 VEGF-A 및 VEGFR2를 표적하는, miR-7 miR-V-7 (백색 화살표)의 발현을 유도하기 위해 인간 RPE65 프로모터 (흑색 화살표)를 이용한다. RPE65-miR-7 miR-V-7 단편의 서열은 서열 번호: 140으로서 열거된다. E. FLT-miR-7 miR-V-7의 지도. 이것은 VEGF-A 및 VEGFR2를 표적하는, miR-7 miR-V-7 (백색 화살표)의 발현을 유도하기 위해 인간 FLT 프로모터 (흑색 화살표)를 이용한다. FLT-miR-7 단편의 서열은 서열 번호: 141로서 열거된다.
도 10: A. U6-miR-V-7-miR-C-8-miR-P-9의 지도. 이것은 VEGFR2, CFB 및 PDGFR-β를 표적하는 miR-V-7-miR-C-8-miR-P-9의 발현을 유도하기 위해 인간 U6 프로모터 (흑색 화살표)를 이용한다. miR-V-7-miR-C-8-miR-P-9 코딩 서열은 백색 화살표로서 나타나고, miR-V-7 패신저 및 miR-V-7 효과기 서열, miR-C-8 패신저 및 miR-C-8 효과기 서열, 그리고 miR-P-9 패신저 및 miR-P-9 효과기 서열의 위치결정은 회색 화살표로서 나타난다. U6-miR-V-7-miR-C-8-miR-P-9 단편의 서열은 서열 번호: 142로서 열거된다. B. VMD2-miR-V-7-miR-C-8-miR-P-9의 지도. 이것은 VEGFR2, CFB 및 PDGFR-β를 표적하는, miR-V-7-miR-C-8-miR-P-9 (백색 화살표)의 발현을 유도하기 위해 인간 VMD2 프로모터 (흑색 화살표)를 이용한다. VMD2-miR-V-7-miR-C-8-miR-P-9 단편의 서열은 서열 번호: 143으로서 열거된다. C. ICAM2-miR-V-7-miR-C-8-miR-P-9의 지도. 이것은 VEGFR2, CFB 및 PDGFR-β를 표적하는, miR-V-7-miR-C-8-miR-P-9 (백색 화살표)의 발현을 유도하기 위해 인간 ICAM2 프로모터 (흑색 화살표)를 이용한다. ICAM2 miR-V-7-miR-C-8-miR-P-9 단편의 서열은 서열 번호: 144로서 열거된다. D. RPE65-miR-V-7-miR-C-8-miR-P-9의 지도. 이것은 VEGFR2, CFB 및 PDGFR-β를 표적하는, miR-V-7-miR-C-8-miR-P-9 (백색 화살표)의 발현을 유도하기 위해 인간 RPE65 프로모터 (흑색 화살표)를 이용한다. RPE65-miR-V-7-miR-C-8-miR-P-9의 단편의 서열은 서열 번호: 145로서 열거된다. E. FLT-miR-V-7-miR-C-8-miR-P-9의 지도. 이것은 VEGFR2, CFB 및 PDGFR-β를 표적하는, miR-V-7-miR-C-8-miR-P-9 (백색 화살표)의 발현을 유도하기 위해 인간 FLT 프로모터 (흑색 화살표)를 이용한다. FLT- miR-V-7-miR-C-8-miR-P-9 단편의 서열은 서열 번호: 146으로서 열거된다.
도 11: 본 명세서 전체에 걸쳐 언급되는 서열.
구체예의 상세한 설명
지금부터 본 발명의 특정한 구체예에 대해 상세하게 설명될 것이다. 본 발명이 구체예와 함께 설명될 것이지만, 그 의도는 이들 구체예에 본 발명을 제한시키지 않는다는 것으로 이해될 것이다. 대조적으로, 본 발명은 청구 범위로 정의되는 바와 같은 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있는 모든 대체, 변형, 및 등가물을 다루는 것으로 의도된다.
해당 분야의 통상의 기술자는 본 명세서에서 설명된 것들과 유사하거나 동일한 다수의 방법 및 물질을 인식할 것이고, 이는 본 발명의 실시에서 이용될 수 있었다. 본 발명은 설명된 방법 및 물질에 결코 제한되지 않는다.
본 명세서에서 개시되고 정의된 본 발명은 본문 또는 도면에서 언급되거나 분명히 나타난 개별적인 특징 중 2개 이상의 모든 대안적인 조합으로 연장된다는 점이 이해될 것이다. 이들 상이한 조합 모두, 본 발명의 여러 가지 대안적인 측면을 구성한다.
본 명세서를 해석하는 목적을 위하여, 다음 정의가 적용될 것이고 적절한 경우 언제든지, 단수형으로 이용된 용어는 복수형을 포함하기도 할 것이고 복수형이 단수형을 포함하기도 할 것이다. 임의의 정의가 참조로서 본 명세서에 편입된 임의의 문헌과의 상충을 제시하는 경우에, 아래에 제시된 정의가 우세할 것이다.
정의
맥락이 달리 요구하지 않는 경우를 제외하고, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "포함한다" 및 상기 용어의 변형어, 가령 "포함하는", "포함하다" 및 "포함된"은 추가적인 첨가물, 성분, 정수 또는 단계를 제외하는 것으로 의도되지 않는다.
용어 "RNA 간섭" 또는 "RNAi"는 세포의 세포질에서 이중 가닥 RNA (dsRNA) 분자에 의해 개시되는 RNA 의존 유전자 침묵 과정을 일반적으로 나타낸다. dsRNA는 RNA 발현 산물이 감소된 DNA, 또는 dsRNA 분자와 실질적인 상동 또는 전체 상동을 공유하는 RNA일 수 있는, 표적 핵산 서열의 발현을 감소시킨다.
"이중 가닥 RNA" 또는 "dsRNA"에 따르면, 이는 상동을 공유하는 표적 핵산 서열의 발현을 저해할 수 있는 이중 가닥 RNA 분자를 의미한다. 몇몇 구체예에서, dsRNA는 적어도 1개의 뉴클레오티드에 의해 선택적으로 연결되는 복식 영역을 가진, 헤어핀 또는 스템 루프 구조이며, "헤어핀 RNA" 또는 "짧은 헤어핀 RNAi 작용제" 또는 "shRNA"로서 언급된다. 효과기 서열 및 "효과기 상보체"로서 본 명세서에서 언급되는, 효과기 서열에 대해 상보적인 서열 사이에서 복식이 형성된다. 전형적으로, 효과기 상보체는 이의 상응하는 효과기 서열과 동일한 길이일 것이다. 하기 설명되는 바와 같이, 효과기 서열은 표적 핵산 서열과 상보적이다.
"효과기 서열"은 RISC 복합체의 일부일 때, 표적 뉴클레오티드 서열에 결합하고, 그렇게 함으로써 세포에 의한 파괴를 위한 그 서열을 표적하는 뉴클레오티드 서열이다. 이는 배경 부문에서 논의된 "가이드" 가닥과 유사하다. 효과기 서열은 서열에 있어서 표적 영역으로부터의 전사체에 상보성이 되거나 실질적으로 상보성이 됨으로써 "표적 영역"으로 "유도되고" 따라서 효과기 서열을 함유한 이중 가닥 부분을 갖는 RNA 작용제는 표적 유전자 서열의 발현을 저해한다.
배경에서 논의된 패신저 가닥과 유사한 "효과기 상보체"는 효과기에 대해 충분히 상보성이고 따라서 이는 효과기 서열에 어닐링된다. 효과기 상보체는 표적 유전자 서열에 유사한 서열일 것이라는 가능성이 있지만, 꼭 그런 것일 필요는 없다.
상기 부문에서 이미 상세하게 설명된 바와 같이, "실질적으로 상보적인" 또는 "실질적인 상보성"은 서열이 (추후에 정의되는 바와 같이) 어닐링의 혼성화를 가능하게 하는 데에 충분히 상보성이라는 점을 의미한다. 간단히 하자면, 상기 설명된 바와 같은 실질적인 상보성은 다음에 관하여 설명될 수 있다:
● 효과기 및 이의 상보체, 또는 효과기 및 표적 서열의 표적 영역 사이에서 동일성 백분율 (80 내지 100%임); 또는
● 상보적이지 않은 뉴클레오티드의 수, 1, 2, 3, 4 또는 5개임, 단, 이 수는 80 내지 100%의 동일성 백분율 필수조건과 일치함.
따라서, 실질적인 상보성은 100% 상보성을 포함하지만, 100% 상보성은 또한 "상보적인", 또는 "상보성이 되는"으로서 본 명세서 전반에 걸쳐 언급될 수 있다. 표적 유전자의 영역과 상보적인 또는 실질적으로 상보적인 서열은 근접한 표적 서열에 걸쳐 서열 상보성 등급을 갖는다. 일반적으로, 본 발명의 이중 가닥 RNA 영역은 단일 또는 여러 가지 뉴클레오티드 치환, 삭제 또는 첨가를 일으키기 위해 돌연변이가 유발될 수 있다. 효과기 및 이의 상보체 사이, 또는 효과기 및 표적 서열의 표적 영역 사이에서 이러한 차이 수준은 표적 서열의 발현을 저해할 수 있게 하는 ddRNAi 작용제의 능력에 부정적인 영향을 미치지 않을 것이고 여겨진다.
제1 효과기 서열이 표적 서열과의 G-C/A-U 염기쌍을 이루지 않을 1, 2, 3, 4 또는 5개의 뉴클레오티드를 가질 때, 차이는 효과기 서열의 중앙 부분에서 단지 1 또는 2개의 뉴클레오티드 변화와 함께, 제1 효과기 서열의 첫 번째 또는 마지막 5개 뉴클레오티드에 있다는 점이 바람직하다..
상기 나타난 바와 같이, 실질적인 상보성은 서열이 혼성화가 가능하거나 어닐링이 가능하다는 점을 의미하는 것으로 의도된다. 용어 "혼성화하는" 및 "어닐링하는" (그리고 문법적 동의어)은 뉴클레오티드 서열에 관하여 본 명세서에서 호환적으로 사용되고 그리고 그들의 상보성으로 인해 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기 쌍을 형성할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 바람직하게 실질적으로 상보적인 서열은 중간 또는 높은 엄격성 조건 하에 혼성화될 수 있다.
● 높은 엄격성 조건: 0.1xSSPE (또는 0.1xSSC), 0.1%SDS, 65℃
● 중간 엄격성 조건: 0.2xSSPE (또는 1.0xSSC), 0.1%SDS, 50℃
대안으로, "실질적으로 상보적인"은 특히 RNA 서열의 맥락에서, 비-왓슨-크릭 염기 쌍형성, 가령 RNA에서 구아노신 및 우라실 잔기 사이에서 형성될 수 있는 소위 "워블 쌍"을 포함하는 것으로 해당 분야의 통상의 기술자에게도 또한 이해될 것이다. "상보적인"은 왓슨-크릭 염기 쌍형성을 나타내기 위한 이의 통상적인 방식으로 본 명세서에서 사용되고, 그리고 "비-상보적인"은 이러한 비-상보적인 서열이 워블 쌍 또는 다른 상호작용을 형성할 수 있긴 하지만, 비-왓슨-크릭 염기 쌍형성을 의미하는 것으로 사용된다. 본 발명의 맥락에서, "비-쌍형성" 서열에 대한 참조는 구체적으로 왓슨-크릭 쌍 염기가 형성되지 않는 서열과 관련된다.
용어 "RNAi 작용제"는 RNAi를 유발시키는 dsRNA 서열을 나타낸다. 이 용어는 "작은 간섭 RNA" (siRNA 작용제) 및 작은 헤어핀 RNA (shRNAi 또는 hpRNAi 작용제)와 호환적으로 사용될 수 있고, 여기서 헤어핀은 스템-루프 구조를 갖는다.
헤어핀 구조의 "루프"는 추가적인 서열이고, 여기서 적어도 몇 가지의 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 자체, 표적 서열, 효과기 서열 또는 효과기 상보체에 비-상보적이다. 루프는 루프를 형성할 수 있는 2 내지 100개 뉴클레오티드의 서열일 수 있다. 루프 서열의 모든 뉴클레오티드가 어닐링되지 않을(non-annealed) 필요는 없다. 예를 들어, ACU GUGAAGCAGAUG AGU 의 루프 서열에서, 뉴클레오티드 ACU는 AGU와 어닐링될 수 있고, 반면에 개재 GUGAAGCAGAUG 서열은 어닐링되지 않은 채로 남아 있다.
ddRNAi 작용제가 miRNA 구조의 일부로서 발현되는 구체예에서, 루프 서열은 miRNA로부터 유래될 수 있고, 그리고 ME 서열에 의해 인코딩된다.
"마이크로RNA" 또는 "miRNA"는 유전자 발현의 전사-후 조절로 기능하는 유기체내 존재하는 자연적으로 발생한, 작은 비-코딩 RNA 분자이다. miRNA 전사체는 헤어핀-유사 구조를 형성할 수 있고; 전형적으로 미스매치를 함유하고 그리고 이중 가닥 RNA 영역 내에서 또는 상기 영역에 근접하여 불룩 튀어 나와 있다. 본 발명의 ddRNAi 작용제가 바람직하게 발현되는 miRNA 구조는 상기 상세 설명된 바와 같이, 미스매치 및 삽입을 함유한다. Wu et al. (2011)는 (패신저 가닥에서 미스매치를 함유한) 미스매치된 복식이 아마도 내생 miRNA와 그들의 더 큰 구조적 유사성으로 인해, 가끔씩 증가된 침묵 활성을 나타내었다는 점을 보여주었다. 유사하게, Gu et al. (2012)는 shRNA 분자에서 루프 서열에 근접한 돌출부의 도입이 다이서 가공처리의 증가된 정밀성을 야기할 수 있다는 점을 보여주었다.
이중 가닥의 접힌 miRNA 구조에서, 상부 가닥 상의 적어도 50%의 뉴클레오티드는 하부 가닥이 뉴클레오티드에 어닐링된다. 비-어닐링된 (즉 쌍을 이루지 않은) 뉴크레오티드 중에서, 그들은 삽입될 수 있다, 즉 그들은 반대 가닥 상에서 상보적인 뉴클레오티드가 결합되거나, 미스매치될 수 있고 따라서 그들은 어닐링되지 않는다. 예를 들어, G 및 A. 이중 가닥의, 접힌 miRNA 구조는 1개 이상의 비-어닐링된 뉴클레오티드에 의해 분리된, 2개 이상의 어닐링된 뉴클레오티드를 함유하여, 뉴클레오티드가 어닐링되지 않는 "버블(bubble)" 또는 '돌출부"를 가진 이중 가닥 RNA 구조를 제공할 수 있다.
"miRNA 인코딩 서열" 또는 "ME 서열"에 따르면, 이는 miRNA 구조 내로 접힐 수 있는 RNA에 대해 인코딩하는 ddRNAi 발현 카세트 (아래 정의와 설명을 참고) 내에 함유된 DNA 서열을 의미한다. ddRNAi 작용제의 효과기 서열 및 효과기 상보체는 그 miRNA 구조 내에서 또는 상기 구조의 일부로서 발현된다. ME 서열은 제1 및 제2 부분을 가진다. 단일 헤어핀 (하나 이상의 효과기/효과기 상보체 쌍을 가짐)을 발현하기 위한 발현 카세트에서, ME 서열의 제1 부분은 가장 5'쪽의 효과기 또는 효과기 상보체 인코딩 서열의 상류영역 (즉 5')에 위치하고, 그리고 제2 부분은 가장 3'쪽의 효과기 또는 효과기 상보체 인코딩 서열의 하류영역 (즉 3')에 위치한다.
다중 헤어핀 구조에 대한 발현 카세트의 경우에, 각각의 효과기/효과기 상보체 쌍은 상응하는 제1 및 제2 ME 서열을 가지고, 여기서 제1 ME 서열은 효과기 또는 효과기 상보체 인코딩 서열의 상류영역이고 그리고 제2 부분은 상응하는 효과기 또는 효과기 상보체 인코딩 서열의 하류영역이다. 5'에서 3'으로의 방향으로, 다음 예시적인 구조를 가진 발현 카세트에서:
● 프로모터
● 제1 ME 서열;
● 제1 효과기;
● 제1 효과기 상보 서열;
● 제2 ME 서열;
● 제3 ME 서열;
● 제2 효과기 서열;
● 제2 효과기 상보 서열; 및
● 제4 ME 서열
제2 및 제3 ME 서열은 (요점을 설명하기 위한 예시적인 서열을 이용하여) 연속적일 수 있고, 그들 사이에서 개재 서열을 가질 수 있고, 또는 제2 및 제3 ME 서열과 동일한 기능을 제공하는 단일 ME 서열일 수 있다는 점이 인식될 것이다.
i) 연속: ggtatattgctgttgacagtgagcgaggtatattgctggggacagtgagccc
ME 서열 2 ME 서열 3
ii) 개재: ggtatattgctgttgacagtgagcgaATTGCCATGggtatattgctggggacagtgagccc ME 서열 2 개재 ME 서열 3
iii) 단일: ggtatattgctgttgacagtgagcgaggtatattgctggggacagtgagccc
ME 서열
RNAi 작용제의 이중 가닥 또는 복식 영역은 적어도 17개 염기쌍 길이이고, 그리고 주로 17 내지 30개의 염기 쌍의 범위에 있다. RNAi 작용제는 세포의 밖에서 화학적으로 또는 효소적으로 합성될 수 있고, 차후 세포에 전달되고 그리고 세포내 적절한 벡터에 의해 생체 내에서 발현될 수 있다 (가령, 미국 특허 번호 제6,573,099호, WO 2004/106517 및 WO1999/49029를 참고, 이들 모두 참조로서 본 명세서에 편입됨).
용어 "DNA-유도 RNAi 작용제" 또는 "ddRNAi 작용제"는 DNA 발현 카세트 ("ddRNAi 발현 카세트")로부터 전사되는 RNAi 작용제를 나타낸다. ddRNAi 발현 카세트 내에서 종결자 및 프로모터의 배열에 따라서, 그들은 단일 또는 다수의 효과기 서열을 가진 ddRNAi 작용제를 발현할 수 있고, 또는 다수의 ddRNAi 작용제를 발현할 수 있다. 발현 카세트로부터 전사되는 ddRNAi 작용제는 적어도 2개의 뉴클레오티드에 의해 연결된 복식 영역을 가진 단일 헤어핀 구조 내로 자가-어닐링될 수 있는 단일 RNA로서 전사될 수 있다. 단일 헤어핀은 하나의 효과기 서열 및 이의 상보체 (도 1B 또는 E를 참고) 또는 다수의 효과기 서열 및 그들의 상보체 (도 1A 또는 D를 참고)를 포함할 수 있다. 대안으로, 작용제는 다수의 shRNA 도메인을 가진 단일 RNA일 수 있다 (즉, 효과기 서열 및 그들의 상보체에 의해 형성된 다중 헤어핀 구조 - 도 1C 또는 F를 참고).
ddRNAi 발현 카세트는 ddRNAi 벡터 또는 ddRNAi 구조체로서 언급되는 벡터 내로 결찰될 수 있다. 벡터는 생체 내에서 또는 시험관 내에서 ddRNAi 발현 카세트의 전사를 명시하는 서열을 제공할 수 있다. 벡터는 추가적으로, ddRNAi 발현 카세트에 대한 전달 비히클로서 역할을 할 수 있다. 예를 들어, 바이러스 기반 벡터는 바이러스 전달과 양립할 수 있는 것뿐만 아니라 ddRNAi 발현 카세트의 발현에 유용한 ddRNAi 구조체를 발생시킬 것이다.
세포는 외생 또는 이형 핵산이 세포 내로 도입되었을 때 외생 또는 이형 핵산 또는 벡터에 의해 "형질전환", "형질도입" 또는 "형질감염"되었다. 형질전환 DNA는 세포의 게놈 내로 (공유결합으로 연결되어) 통합될 수 있거나 통합되지 않을 수 있다. 진핵 세포에 관하여, 안정하게 형질전환된 세포는 형질전환 DNA가 숙주 세포 염색체 내로 통합되었던 세포이고 또는 형질전환 DNA가 세포 복제 동안 딸 세포에 의해 유전되도록 염색체-외로 (에피좀으로) 유지된다. 비-복제, 분화된 세포에서 형질전환 DNA는 에피좀으로서 지속될 수 있다.
"유전자 발현"은 전사 또는 번역 중 하나 또는 둘 모두에 대한 참고가 될 수 있다.
"발현의 저해"는 표적 유전자로부터의 단백질 및/또는 mRNA 산물의 수준에서의 부재 또는 관찰가능한 감소를 나타낸다. 저해는 절대적이어야 하는 것은 아니지만, 본 발명의 RNAi 또는 ddRNAi 작용제 또는 siRNA 작용제 또는 ddRNAi 발현 카세트 또는 발현 구조체의 투여의 결과로서 그것에 탐지가능한 또는 관찰가능한 변화에 대해 충분한 부분적인 저해일 수 있다. 저해는 ddRNAi 작용제 또는 구조체가 결핍된 세포에 비해 표적 핵산으로부터의 mRNA 및/또는 단백질 산물의 수준의 감소를 결정함으로써 측정될 수 있고, 그리고 1%, 5% 또는 10% 저해만큼 적을 수 있고 또는 절대적, 즉 100% 저해일 수 있다. 저해의 효과는 표면상 특성, 즉 세포 또는 유기체의 정량적 및/또는 정성적 표현형의 검사에 의해 결정될 수 있다.
"오프-타겟(off-target)" 효과는 RNAi 시약으로의 치료의 의도치 않은 부작용을 설명하는 데에 이용되는 용어이다. 이것은 패신저 또는 효과기 서열 및 또 다른 표적 유전자와 상동인 기회의 결과로서 표적 서열의 의도치 않은 넉다운(knockdown)을 수반하는 것으로 종종 간주되지만, 넉다운의 물질대사 보상작용에서 일어나는 감지하기 어려운 효과도 또한 발생할 수 있다. 내생 RNAi 경로에 의한 miRNA의 가공처리는 종종, RISC 내로 오로지 효과기 가닥의 로딩, 그리고 패신저 가닥의 분해를 야기한다. 오프-타겟 효과의 한 가지 잠재적인 공급원은 RISC 내로 패신저 가닥의 예상치 못한 편입이며, 따라서 패신저 서열은 그들과 우발적으로 상동을 공유하는 유전자를 결과적으로 침묵시킬 수 있다. RISC 로딩에서의 단계는 dsRNA 전구체내 잠재적인 표적 부위에 걸쳐 RNA 복식의 예측되는 열역학적 안정성을 "감지"하고 그리고 5' 말단이 복식의 덜 안정한 말단으로부터 나온 가닥을 우선적으로 로딩한다는 증거가 있다. 오프-타겟 효과에 대한 잠재성을 최소화시키기 위한 한 가지 전략은 듀얼 루시퍼라아제 어세이(Dual Luciferase assay)를 이용하여 패신저 가닥의 활성에 대해 ddRNAi 분자를 스크리닝하는 것이다. RISC 내로 이 가닥의 로딩은 바람직하지 않다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "혈관 내피 성장 인자-A 유전자" 또는 "VEGF-A 유전자"는 혈관신생을 자극하는 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함한다. 한 가지 구체예에서 VEGF-A 유전자는 수탁 번호 제NM_001025366호로 Genbank에서 나타난 바와 같은 뉴클레오티드 서열 (서열 번호: 79)을 인코딩하며 여기서 상기 서열은 인간 VEGF-A를 인코딩한다. 또 다른 구체예에서, VEGF-A 유전자는 수탁 번호 제NM_001025250호 (머스 머스쿨러스(Mus musculus), 서열 번호: 80) 또는 제XM_001089925호 (마카카 물라타(Macaca mulatta), 서열 번호: 81)로 Genbank에서 나타난 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 VEGF-A 유전자에 대한 이종상동성 유전자 또는 유사 유전자이다. 또 다른 구체예에서, VEGF-A 유전자는 본 명세서에서 설명된 바와 같은 동물로부터의 유전자 또는 인간 유전자일 수 있고 대립유전자 변인(allelic variant)을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "혈관 내피 성장 인자 수용체 2 유전자" 또는 "VEGFR2 유전자"는 VEGF에 대한 수용체를 인코딩하는 유전자를 포함한다. 한 가지 구체예에서 VEGFR2 유전자는 수탁 번호 제NM_002253호로 Genbank에서 나타난 바와 같은 뉴클레오티드 서열 (서열 번호: 82)을 인코딩하며, 여기서 상기 서열은 인간 VEGFR2를 인코딩한다. 또 다른 구체예에서, VEGFR2 유전자는 수탁 번호 제NM_010612호 (머스 머스쿨러스(Mus musculus), 서열 번호: 83) 또는 제XM_001086814호 (마카카 물라타(Macaca mulatta), 서열 번호: 84)로 Genbank에서 나타난 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 VEGFR2에 대한 이종상동성 유전자 또는 유사 유전자이다. 또 다른 구체예에서, VEGFR2 유전자는 본 명세서에서 설명된 바와 같은 동물로부터의 유전자 또는 인간 유전자일 수 있고 대립유전자 변인을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "베타-유형 혈소판 유래 성장 인자 수용체 유전자" 또는 "PDGFR-β 유전자"는 PDGFR-β 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함한다. 한 가지 구체예에서, PDGFR-β 단백질은 수탁 번호 제NM_002609호로 Genbank에서 나타난 바와 같은 뉴클레오티드 서열 (서열 번호: 85)을 인코딩하며, 여기서 상기 서열은 인간 PDGFR-β를 인코딩한다. 또 다른 구체예에서, PDGFR-β 유전자는 수탁 번호 제NM_001142706호 (머스 머스쿨러스(Mus musculus), 서열 번호: 86) 또는 제XM_00110759호 (마카카 물라타(Macaca mulatta), 서열 번호: 87)로 Genbank에서 나타난 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 PDGFR-β에 대한 이종상동성 유전자 또는 유사 유전자이다. 또 다른 구체예에서, PDGFR-β 유전자는 본 명세서에서 설명된 바와 같은 동물로부터의 유전자 또는 인간 유전자일 수 있고 대립유전자 변인을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "보체 인자 B 유전자" 또는 "CFB 유전자"는 드루젠의 성분인, CFB 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함한다. 한 가지 구체예에서 CFB 유전자는 수탁 번호 제NM_001710호로 Genbank에서 나타난 바와 같은 뉴클레오티드 서열 (서열 번호: 88)을 인코딩하며, 여기서 상기 서열은 인간 CFB를 인코딩한다. 또 다른 구체예에서, CFB 유전자는 수탁 번호 제NM_00114270호 (머스 머스쿨러스(Mus musculus), 서열 번호: 89) 또는 제XM_001113553호 (마카카 물라타(Macaca mulatta), 서열 번호: 90)로 Genbank에서 나타난 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 CFB에 대한 이종상동성 유전자 또는 유사 유전자이다. 또 다른 구체예에서, CFB 유전자는 본 명세서에서 설명된 바와 같은 동물로부터의 유전자 또는 인간 유전자일 수 있고 대립유전자 변인을 포함한다.
서열은 그들이 유전자 중복 사건에 의해 분리된다면, "유사"하다: 유기체내 유전자가 중복되어 동일한 게놈에서 두 가지 상이한 위치를 차지한다면, 두 개의 복사체는 유사하다.
서열은 그들이 종분화 사건에 의해 분리된다면 "이종상동성"이다: 종이 2개의 개별적인 종으로 분기될 때, 결과적 종에서 단일 유전자의 분기한 복사체는 이종상동성인 것으로 불리운다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "정량적 표현 형질"은 숙주 세포에서 핵산의 분자적 발현과 연관된 형질을 나타내고 따라서 전사된 또는 복제된 RNA 분자의 정량, 전사-후 변형된 RNA 분자의 정량, 번역된 펩티드 또는 단백질의 정량, 또는 이러한 펩티드 또는 단백질의 활성을 포함할 수 있다.
표현형이 정량적 형질인 핵산의 표현형 발현의 감소는 본 발명의 RNAi 작용제의 존재에서, 표현 형질이 RNAi 작용제가 부재인 상황과 비교할 때와 다른 상태로 바뀐다는 점을 의미한다. 따라서 핵산의 표현 발현의 감소는 그 핵산 (일부)의 안정한 상태 수준의 감소, 그 핵산 (일부)의 번역의 감소 또는 전사된 RNA(들) 또는 번역된 폴리펩티드(들)의 존재에서 진핵 세포 또는 유기체에 미치는 영향의 감소로서 측정될 수 있고, 그리고 궁극적으로 변경된 표현 형질을 초래할 것이다. 관심 핵산의 표현 발현의 감소는 표현형에서의 관찰가능한 변화를 수반할 수 있고 또는 상기 변화와 관련이 있을 수도 있다는 점이 명확하다. 평가는 생화학적 기술, 가령 노던(Northern) 혼성화, 정량적 실시간 PCR 어세이, 유전자 발현 어세이, 항체 결합, ELISA, RIA, 웨스턴 블롯팅(western blotting) 및 해당 분야에 공지된 다른 어세이와 기술로써 이루어질 수 있다.
"표적 핵산"은 RNA 또는 DNA 중 하나 일 수 있고, 이의 전사 산물은 내생 또는 외생인, 표적, 코딩 또는 비-코딩 서열이다.
"치료학적 조성물" 또는 "제약학적 조성물" 또는 "치료를 위한 조성물"은 ddRNAi 작용제, ddRNAi 발현 카세트, ddRNAi 구조체 또는 siRNA 작용제를 포함한 조성물을 나타낸다.
단어 "치료하다" 또는 "치료"는 치료학적 처리를 나타내며, 이때 목적은 바람직하지 않은 생리학적 변화 또는 장애를 늦추기 (줄이기) 위함이다. 본 발명의 목적을 위하여, 이로운 또는 바람직한 임상적 결과는 AMD 증상의 완화, 안정화된 (즉, 더 악화되지 않는 또는 진행되지 않는) AMD, 그리고 안정화된 CNV를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
구절 "치료학적 유효량"은 (i) 특정한 질병, 질환, 또는 장애를 치료하고, (ii) 특정한 질병, 질환, 또는 장애의 하나 이상의 증상을 완화하고, 개선하고, 또는 제거하고, (iii) 본 명세서에서 설명된 특정한 질병, 질환, 또는 장애의 하나 이상의 증상의 개시를 예방하거나 지연시키고, (iv) 특정한 질병, 질환, 또는 장애의 진행을 예방하거나 지연시키고, 또는 (v) 치료에 앞서 야기되는 손상을 어느 정도까지는 반전시키는 본 발명의 화합물의 양을 의미한다. 반전은 절대적이어야 하는 것은 아니지만, 치료-후 임의의 임상적으로 관련된 시력의 회복은 손상의 반전으로 간주된다.
본 발명은 새로운 RNAi 작용제, 그리고 병든 개체, 특히 습성 AMD를 가진 개체에서 AMD와 연관된 시력 퇴행을 감소시키기 위한 RNAi 작용제의 용도를 제공한다. 치료는 다음 중 하나 이상을 목표로 한다:
i. VEGF-A 발현과 연관된 침묵 특이적 유전자를 목표로 하는 하나 이상의 서열을 함유한 DNA 구조체를 이용하여 VEGF-A 번역의 장기간 넉다운 및 망막 세포로부터의 차후 분비에 의해 맥락막 신생혈관 (CNV)과 연관된 혈관신생을 조절한다. VEGF-A는 혈관신생을 자극하고, 따라서 망막 뒤 맥관구조로부터 혈관의 비정상적인 돌출이 생긴다. 다수의 기존 치료법은 오로지 분비된 VEGF-A를 "빨아 들이는" 역할을 하고, 이는 시력을 안정화시키지만, 모든 환자에서 시력을 필수적으로 개선시키지는 않는다.
ii. 혈관신생의 추가적인 조절은 VEGF-A 및 이의 수용체 VEGFR2 둘 모두의 넉다운에 의해 이루어질 수 있는데, 그 이유는 이 전략이 두 가지 별개의 단계에서의 과정을 방해하는 것으로 예측될 것이기 때문이다.
iii. AMD의 반전은 3개의 표적, 즉 VEGFR2, PDGFR-β 및 CFB의 넉다운에 의해 성취될 수 있다. VEGFR2 넉다운은 혈관신생을 조절하는 것으로 예상될 것이고, PDGFR-β 넉다운은 발생기 혈관 형성을 저해하거나 반전시키는 것으로 예상될 것이고 그리고 CFB 넉다운은 드루젠 침착을 저해하거나 심지어 반전시키는 것으로 예상될 것이다.
iv) 처리 빈도를 제한하고, 그리고 치료학적 분자의 국부화 주사를 통해 RPE 세포에 대한 치료를 제한한다.
표적 유전자 내에서 적절한 표적 서열을 식별하고, 그리고 이들 서열에 기반하여 작용하는 RNAi 작용제를 설계하는 것은 정례적이지 않다. 결과 부문에서 입증되는 바와 같이, 이론적으로 좋은 후보로 보이는 표적 서열이 반드시 효과적으로 표적을 침묵시키는 것이 아닐 수 있고, 또는 치료학적 목적을 위한 효과적인 수준으로 반드시 효과적으로 표적을 침묵시키는 것이 아닐 수 있다. 몇 가지 효과기 서열은 표적을 침묵시키는 데에 다른 것들보다 훨씬 더 효과적으로 작용하고, 특히 RISC 내로 패신저 가닥의 편입은 바람직하지 않은데 그 이유는 이것이 상당한 오프-타겟 효과 및 결과적 독성을 초래할 수 있기 때문이다. 하지만, 서열 자체의 단순한 육안 검사에 의하여, 서열들이 어느 정도까지 침묵될 수 있는지는 커녕, 어떠한 서열이 침묵될 수 있는지, 그리고 그것이 본 발명의 목적을 위해 충분한지 예측하는 것은 가능하지 않다. 2개 이상의 비관련 표적을 침묵시키는 것을 추구할 때는 더욱 그러하다.
VEGF-A가 AMD 치료법에 적합한 표적이라는 점이 해당 분야에서 인식됨에도 불구하고, 지금까지 효과적인 치료법을 만들기 위한 노력은 배경에서 요약된 문제점에 의해 번거로웠다. 특정한 RNAi 기술에 의해 침묵되는 것에 관하여, 시험관 내에서 생성된 siRNA 작용제를 이용한 이전 노력은 막 결합 TLR3과의 siRNA 상호작용 및 인터페론의 추후 활성화로 인해 성공적이지 못하였다. 추가로, 대다수의 VEGF-A를 분비하는 세포는 눈 뒤쪽에 특수화된 세포의 층 아래에 묻혀있는 것으로 일반적으로 발견되는 RPE 세포이다. RNAi 모이어티는 복합체를 크게 차지하고 있고 세포의 물리적 특성 때문에 세포의 다중 층을 가로지는 것이 어려울 수 있다. 활용되는 바이러스 전달 작용제, ddRNAi 작용제 및 표적의 새로운 범위가 이들 사안을 극복하기 위해 추구된다.
VEGF-A 뿐만 아니라, 이들 표적은 다음 중 하나 이상을 포함한다:
● VEGFR2: VEGF-A에 대한 수용체; VEGFR2를 침묵시키는 것은 VEGF-A를 침묵시키는 것과 유사한 결과를 갖는 것으로 예상된다.
● PDGFR-β: PDGFR-β에 대한 수용체. 이 분자는 내피 세포를 모집하고 안정화하는 역할을 하며, 이는 발생기 혈관의 안정화에 중요하다.
● CFB: 이것은 AMD와 연관된 특질적인 세포외 침착물인, 드루젠의 주요 성분이다. (Anderson et al 2010). CFB를 침묵시키는 것은 드루젠의 형성을 저해할 수 있다.
RNA 간섭 (RNAi)은 세포의 세포질에서 짧은 이중-가닥 RNA 분자에 의해 개시되는 RNA-의존 유전자 침묵 과정이다. 포유류에서, RNAi는 작은 간섭 RNA (siRNA)로서 언급되는 이중-가닥 RNA 분자에 의해 매개된다. RNA 작용제의 이중 가닥, 또는 복식 영역은 길이가 적어도 17개 염기쌍, 그리고 주로 17 내지 30개 염기쌍의 범위이다. RNAi 작용제는 세포의 밖에서 화학적으로 또는 효소적으로 합성될 수 있고 그리고 차후 세포에 전달될 수 있고 또는 세포 (가령 AAV, 아데노바이러스, 렌티바이러스, 또는 비-바이러스 리포좀-기반 전달 시스템)내 적절한 벡터에 의해 생체 내에서 발현될 수 있다.
AMD 치료제로서 RNAi 작용제의 전-임상 검사는 동물 모델의 범용을 요구한다. 생쥐 (머스 머스쿨라리스 (Mus muscularis)) 및 영장류 (가령 마카크, 마카카 파스시울라리스(Macaca fasciularis)) 모델은 치료의 효능을 검사하는 데에 광범위하게 이용되고, 그리고 다른 종, 가령 개 (캐니스 패밀리아리스(Canis familiaris))는 치료학적 화합물의 임상 안정성을 결정하는 데에 모델로서 일반적으로 이용된다. RNAi 치료제를 위하여, 인간과 다양한 전-임상 검사 종 사이에서 매우 보존된 AMD-연관 유전자의 뉴클레오티드 서열을 표적하는 시약을 설계하는 것이 이로운데, 그 이유는 단일 RNAi 시약이 전-임상 검사의 모든 단계에서 이용될 수 있기 때문이다. 불량하게 보존된 유전자에 대하여 상이한 검사 종 사이에서 약간 차이가 있는 서열을 가진 다수의 RNAi 시약은 잠재적인 독성을 정확하게 결정하기 위해 동시에 검사되어야 한다.
이에 따라, 본 출원에서 설명된 RNAi 시약은 가능한 경우, 인간과 잠재적인 검사 종 (생쥐, 개 및 영장류, 가령 마카크) 사이에서 보존된 서열을 표적하도록 설계되는데, 그 이유는 이것이 약물 개발 프로그램에 대해 상당한 이점을 제공하기 때문이다.
ddRNAi 작용제
RNAi 작용제는 DNA-유도 RNAi, 또는 ddRNAi로서 언급되는, DNA 벡터로부터 발현될 수 있다. 그들은 최소 오프-타겟 사건을 갖는 유전자의 활성을 직접적으로 표적할 수 있다. AMD의 경우에, 이것은 충족되지 않는 임상 치료 요구를 다루는 특유의 기회를 제공한다. 이에 따라, 본 발명의 하나의 측면에서, AMD-연관 유전자에서 하나 이상의 표적 서열의 발현을 저해하기 위한 DNA-유도 RNA 간섭 (ddRNAi) 작용제가 제공되고, 상기 ddRNAi 작용제는 적어도 다음을 포함한다:
적어도 17개 뉴클레오티드 길이의 제1 효과기 서열; 및
제1 효과기 상보 서열;
여기서 제1 효과기 서열은 하나 이상의 표적 서열의 전사물에서 하나 이상의 표적 영역과 상보적이거나 실질적으로 상보적임.
전형적으로, 제1 효과기 서열은 제1 효과기 상보 서열을 가진 이중 가닥 영역을 형성한다.
본 발명의 ddRNAi 작용제의 서열은 표적 특이적인 RNAi를 매개하기 위하여, AMD-연관 유전자, 가령 VEGF-A, VEGFR2, CFB 및 PDGFR-β 유전자에 대해 충분한 독자성을 가져야 한다.
제1 효과기 서열은 적어도 17개 뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 17 내지 30개 뉴클레오티드 그리고 더욱 바람직하게는 17 내지 21개 뉴클레오티드이다. 상기 서열은 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 제1 효과기 서열이 17개 뉴클레오티드보다 더 길 때, 제1 효과기 서열의 적어도 17개의 근접 뉴클레오티드는 상보적인 가닥을 가진 이중 가닥 영역을 형성한다는 점이 바람직하다. 따라서 본 발명의 이 구체예에 따른 ddRNAi 작용제는 효과기 서열/서열들의 길이와 수에 의해 결정된 최대 길이를 가지고, 즉 각각의 효과기 서열은 더 긴 서열 내에서는 구성되지 않는다.
본 발명의 ddRNAi 작용제는 AMD-연관 표적 유전자의 발현을 저해한다. 바람직하게, AMD-연관 유전자는 VEGF-A, 또는 VEGFR2, CFB 및 PDGFR-β 중 하나 이상이고, 각각의 효과기 서열은 서열 번호: 40-78 중 어느 하나로부터의 서열 내에서 임의의 10개 이상의 근접 뉴클레오티드로 구성된 군에서 선택된다.
아래 표에서 설명되는 바와 같이, 저해되고, 방지되고 또는 감소되어야 하는 AMD-연관 유전자가 VEGF-A일 때, 각각의 효과기 서열은 서열 번호: 40-49에서 선택된다. 저해되고, 방지되고 또는 감소되어야 하는 AMD-연관 유전자가 VEGFR2일 때, 각각의 효과기 서열은 서열 번호: 50-59에서 선택된다. 저해되고, 방지되고 또는 감소되어야 하는 AMD-연관 유전자가 PDGFR-β일 때, 각각의 효과기 서열은 서열 번호: 60-69에서 선택된다. 저해되고, 방지되고 또는 감소되어야 하는 AMD-연관 유전자가 CFB일 때, 각각의 효과기 서열은 서열 번호: 70-78에서 선택된다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
본 발명의 ddRNAi 작용제는 miRNA 구조 내에서 또는 상기 구조의 일부로서 바람직하게 발현된다. 이들 miRNA 구조는 "miR 서열"로서 나타나는 서열을 가지며 그리고 표 2에서 열거되고 (서열 번호: 91-129), 이는 명시된 효과기 서열 (서열 번호: 40-78)을 발현하도록 설계되었다. miRNA 구조를 발현하기 위해 발현 카세트를 함유한 상응 구조체는 또한 "miR-명칭"으로서 나타난다.
Figure pct00004
본 발명의 임의의 ddRNAi 작용제는 miRNA 구조 내에서 또는 상기 구조의 일부로서 발현될 수 있다. 본 명세서에 걸쳐 설명되는 바와 같이, 이것은 ddRNAi 작용제의 더 정확한 가공처리, 및 세포 내에서 더 낮은 독성을 보조할 수 있다.
본 발명의 한 가지 구체예에서, 본 발명의 ddRNAi 작용제는 VEGF-A 유전자에서 하나 이상의 표적 서열의 발현을 저해한다. 표적 서열은 표 1에서 열거된 ddRNAi VEGF-A 표적 서열 (서열 번호: 1-10)에서 바람직하게 선택된다; 이들 서열을 표적하는 ddRNAi 작용제의 다이서 가공처리에 의해 생성되는 상응하는 효과기 서열은 각각 서열 번호: 40-49에서 나타난다. VEGF-A 표적 서열 및 효과기 서열은 인간 및 전-임상 검사 종 생쥐, 개 및 마카크 사이에서 뉴클레오티드 서열의 보존을 보여주는 것으로 선택되었다는 점에 주목한다.
본 발명의 대안적인 구체예에서, 본 발명의 ddRNAi 작용제는 VEGFR2 유전자에서 하나 이상의 표적 서열의 발현을 저해한다. 표적 서열은 표 2에서 열거된 ddRNAi VEGFR2 표적 서열 (서열 번호: 11-20)에서 바람직하게 선택된다; 따라서 상응하는 효과기 서열은 표 2에서 나타나는 바와 같이 각각 서열 번호: 50-59에서 선택된다. VEGFR2 표적 (서열 번호: 11-20) 및 효과기 서열 (서열 번호: 50-59)은 인간 및 전-임상 검사 종 생쥐 및 마카크 사이에서 오로지 단일 뉴클레오티드와 동일하거나 오로지 단일 뉴클레오티드에서만 차이가 있다는 점에 주목한다.
본 발명의 대안적인 구체예에서, 본 발명의 ddRNAi 작용제는 PDGFR-β 유전자에서 하나 이상의 표적 서열의 발현을 저해한다. 표적 서열은 표 2에서 열거된 ddRNAi PDGFR-β 표적 서열 (서열 번호: 21-30)에서 바람직하게 선택된다; 따라서 상응하는 효과기 서열은 표 2에서 나타나는 바와 같이 각각 서열 번호: 60-69에서 선택된다. PDGFR-β 표적 (서열 번호: 21-30) 및 효과기 서열 (서열 번호: 60-69)은 인간 및 전-임상 검사 종 생쥐 및 마카크 사이에서 오로지 단일 뉴클레오티드와 동일하거나 오로지 단일 뉴클레오티드에서만 차이가 있다는 점에 주목한다.
본 발명의 대안적인 구체예에서, 본 발명의 ddRNAi 작용제는 CFB 유전자에서 하나 이상의 표적 서열의 발현을 저해한다. 표적 서열은 표 1에서 열거된 ddRNAi CFB 표적 서열 (서열 번호: 31-39)에서 바람직하게 선택된다; 따라서 상응하는 효과기 서열은 표 2에서 나타나는 바와 같이 각각 서열 번호: 70-78에서 선택된다. CFB 표적 (서열 번호: 31-39) 및 효과기 서열 (서열 번호: 70-78)은 인간 및 전-임상 검사 종 생쥐 및 마카크 사이에서 오로지 단일 뉴클레오티드와 동일하거나 오로지 단일 뉴클레오티드에서만 차이가 있다는 점에 주목한다.
이전에 제공된 설명에 따라서, ddRNAi 작용제의 DNA 표적 서열 및 상응하는 효과기 서열 사이의 관계가 다음과 같이 나타날 수 있다 (표 1로부터의 표적 서열 번호: 2 및 이의 상응하는 효과기 서열 서열 번호: 41을 이용):
5' GGCCTCCGAAACCATGAACTT 3' - VEGF-A의 표적 서열 (서열 번호: 2)
5' GGCCUCCGAAACCAUGAACUU 3' - 서열 번호: 2의 mRNA 전사체
3' AAGUUCAUGGUUUCGGAGGCC 5' - 표적 서열 번호: 2에 대한 ddRNAi 작용제의 효과기 서열 (서열 번호: 41), 이는 5'에서 3'으로의 방향으로 판독할 때, 표적 서열의 전사체와 실질적으로 상보적인 것으로 나타날 수 있음.
배경 부문에서 설명된 바와 같이, ddRNAi 작용제의 두 가닥 모두 효과기 서열이 될 잠재성을 가진다. 하지만 서열의 특정한 특징은 RISC에 들어가기 위한 하나의 가닥을 선호할 수 있고 다른 가닥은 파괴되어야 한다는 증거가 있다. RISC 로딩에서 단계는 dsRNA 전구체에서 잠재적인 표적 부위에 걸친 RNA 복식의 열역학적 안정성을 "감지하고" 그리고 바람직하게는 5' 말단이 복식의 덜 안정한 말단으로부터 나온 가닥을 로딩한다는 증거가 있다. 따라서 표적 부위 서열은 표적 부위의 3' 말단에서 AT 염기쌍의 수를 최대화시키도록 전형적으로 조정된다, 즉 효과기 가닥의 5' 말단에서 A 또는 U 염기의 수를 최대화시킨다. 이후 정제된 표적 부위의 목록은 가능성 있는 검사 종, 구체적으로 생쥐 및 원숭이 사이의 보존에 대해 스크리닝되었다. 이후 표적 부위 서열은 BLAST를 이용하여 인간 전사체에 대하여 스크리닝되었고, 그리고 다른 인간 유전자 (>3 미스매치)와 높은 상동을 보이는 것들은 폐기되었다. 이들 표적 서열에 기반한 구조체는 miRNA 골격으로 제조되었고 그리고 아래에서 설명되는 바와 같이 활성 및 가닥 선별성에 대해 실증적으로 검사되었다. 이들 서열의 선호도는 바람직한 구체예에서 반영되고, 그리고 데이터는 다른 서열에 비해 몇몇 서열의 이점을 보여주는 실시예 부문에서 제공된다.
예를 들어, 본 발명의 이 측면의 한 가지 구체예에서, AMD-연관 유전자에서 하나 이상의 표적 서열의 발현을 저해하기 위한 DNA-유도 RNA 간섭 (ddRNAi) 작용제가 제공되고, ddRNAi 작용제는 적어도 다음을 포함한다:
5' UAUGUGGGUGGGUGUGUCUAC 3' (서열 번호: 47) 내에서 임의의 10개 이상의 근접 뉴클레오티드의 제1 효과기 서열; 및
제1 효과기 상보 서열.
제1 효과기 서열은 AMD-연관 유전자에서 하나 이상의 표적 서열의 전사체내 표적 영역과 실질적으로 상보적이다. 이 예시에서, 표적 유전자는 VEGF-A이다.
바람직하게 제1 효과기 서열은 5' UAUGUGGGUGGGUGUGUCUAC 3' (서열 번호: 47) 내에서 적어도 17개 이상의 근접 뉴클레오티드이다.
제1 효과기 서열이 서열 번호: 47과 상이한 뉴클레오티드를 1, 2, 3, 4 또는 5개 가질 때, 그 차이는 바람직하게, 첫 번째 및/또는 마지막 5개 뉴클에오티드에 존재하고, 그리고 바람직하게는 적어도 중앙의 10개 뉴클레오티드는 하나 이상의 표적 서열의 전사체내 표적 영역과 100% 상보적이다.
대안적인 구체예에서, ddRNAi 작용제는 서열 번호: 40, 서열 번호: 41, 서열 번호: 42, 서열 번호: 43, 서열 번호: 44, 서열 번호: 45, 서열 번호: 46, 서열 번호: 47, 서열 번호: 48, 서열 번호: 49, 서열 번호: 50, 서열 번호: 51, 서열 번호: 52, 서열 번호: 53, 서열 번호: 54, 서열 번호: 55, 서열 번호: 56, 서열 번호: 57, 서열 번호: 58, 서열 번호: 59, 서열 번호: 60, 서열 번호: 61, 서열 번호: 62, 서열 번호: 63, 서열 번호: 64, 서열 번호: 65, 서열 번호: 66, 서열 번호: 67, 서열 번호: 68, 서열 번호: 69, 서열 번호: 70, 서열 번호: 71, 서열 번호: 72, 서열 번호: 73, 서열 번호: 74, 서열 번호: 75, 서열 번호: 76, 서열 번호: 77 또는 서열 번호: 78 내에서 임의의 10개 이상, 바람직하게는 임의의 17개 이상의 근접 뉴클레오티드의 제1 효과기 서열을 포함한다.
특히 바람직한 구체예에서, ddRNAi 작용제는 표적 유전자 영역의 발현을 적어도 70% 저해할 수 있는 서열 내에서 임의의 10개 이상, 바람직하게는 임의의 17개 이상의 근접 뉴클레오티드의 제1 효과기 서열을 포함한다. 바람직하게, 이 구체예에서, 제1 효과기는 서열 번호: 47에서 선택되고, 이는 서열 번호: 8의 서열을 표적한다.
제1 효과기 서열은 서열 번호: 40-78로 구성된 군으로부터의 서열 내에서 임의의 10개 이상 그리고 바람직하게는 임의의 17개 이상의 근접 뉴클레오티드에서 선택된 서열을 포함할 수 있고, 또는 대안으로, 각각의 효과기 서열은 1, 2, 3, 4 또는 5개의 뉴클레오티드 변이를 가진, 서열 번호: 40-78의 변이체일 수 있다. 추가적인 구체예에서, 각각의 효과기 서열은 20개의 뉴클레오티드로 구성될 수 있고, 이들 중 17, 18, 19개 또는 20개 모두의 뉴클레오티드는 서열 번호: 40-78로 구성된 군에서 선택된 서열로부터의 근접 뉴클레오티드이다.
다중 표적화 ddRNAi 작용제
다수의 효과기 서열을 가진 ddRNAi 작용제는 다양한 분자 표적 및 개체 간에 존재할 수 있는 이의 자연적으로 발생한 변이체를 표적할 수 있는 이점, 그리고 단일 효과기 서열과는 대조적으로 다수의 효과기 서열로 획득한 상가 효과 또는 상승 효과의 이점을 갖는다. 본 발명에서, 한 가지 구체예에서 VEGF-A, VEGFR2, CFB 및 PDGFR-β에서 선택된 상이한 표적 유전자가 2개 또는 3개 있는 경우, 2개 또는 3개의 유전자를 표적하는 데에 활용되어야 하는 것이 단일 구조체에 특히 유리하다. 이것은 상이한 유전자를 각각 표적하는 다수의 ddRNAi 작용제를 전달해야 하는 필요성을 없애준다. 해당 분야의 통상의 기술자에게 인식되는 바와 같이, 전달이 작용제 각각의 동일하고 충분한 농도를 야기할 것이라는 점을 보장하는 것은 어려울 것이다.
본 발명의 한 가지 구체예에서, ddRNAi 작용제는 AMD-연관 유전자의 하나 보다 더 많은 표적 서열의 표적화를 가능하게 하는 있는 2개 이상의 효과기 서열을 포함한다. 다수의 표적 서열은 하나의 유전자의 동일한 영역 내에 있을 수 있다. 예를 들어, 개체 간의 서열에서 자연적인 변이를 가진 VEGF-A, VEGFR2, CFB 또는 PDGFR-β 내에서, 17 내지 30개 뉴클레오티드 영역, 바람직하게는 17 내지 21개 뉴클레오티드 영역. 대안으로, 표적 서열은 하나의 표적 유전자의 상이한 영역 내에 있을 수 있고, 여기서 표적 유전자는 VEGF-A, VEGFR2, CFB 또는 PDGFR-β일 수 있다.
상기 언급된 바와 같은 표적 서열은 상이한 AMD-연관 유전자 내에 또한 있을 수 있다. 예를 들어, 제1 효과기 서열은 VEGFR2내 서열을 표적하지만, 동일한 ddRNAi 작용제내 제2 효과기 서열은 VEGF-A 유전자내 서열을 표적한다. 바람직한 구체예에서, 적어도 2개의 효과기 서열이 있고, 각각의 서열은 VEGF-A 및 VEGFR 각각에서의 서열을 표적한다. 대안적인 구체예에서, 적어도 3개의 효과기 서열이 있고, 각각의 서열은 VEGFR2, CFB 및 PDGFR-β 각각에서의 서열을 표적한다.
더욱 큰 특이성을 제공하기 위하여 ddRNAi 작용제는 (특정한 순서 없이) 다음을 포함한다:
● 적어도 17개 뉴클레오티드 길이의 제1 효과기 서열;
● 적어도 17개 뉴클레오티드 길이의 제2 효과기 서열;
● 제1 효과기 상보 서열; 및
● 제2 효과기 상보 서열.
다중 표적화 ddRNAi 작용제의 제1 및 제2 효과기 서열은 그들 각각의 효과기 상보체로 이중 가닥 영역을 형성한다. 바람직하게, 제1 및 제2 효과기 서열은 17 내지 30개 뉴클레오티드 길이이다. 더욱 바람직하게, 제1 및 제2 효과기 서열은 모두, 상기 표 1에서 열거된 서열 번호: 40-78 중 어느 하나의 서열 내에서 임의의 10개 이상 그리고 바람직하게는 임의의 17개 이상의 근접 뉴클레오티드에서 선택되고, 또는 표 1에서 열거된 이들 서열과 1, 2, 3, 4 또는 5개의 뉴클레오티드 차이가 있는 서열이다.
한 가지 구체예에서, 제1 효과기 서열은 서열 번호: 40-78로 구성된 군 중 어느 하나로부터의 서열 내에서 임의의 10개 이상 그리고 바람직하게는 임의의 17개 이상의 근접 뉴클레오티드에서 선택되고 그리고 제2 효과기 서열은 서열 번호: 40-78로 구성된 군 중 어느 하나로부터의 서열 내에서 임의의 10개 이상 그리고 바람직하게는 임의의 17개 이상의 근접 뉴클레오티드에서 선택된다. 제1 및 제2 효과기 서열은 둘 다 동일한 서열일 수 있고 또는 대안으로 상이한 서열일 수 있다.
제1 및 제2 효과기 서열은 각각, 서열 번호: 40-78로 구성된 군으로부터의 서열 내에서 임의의 10개 이상의 근접 뉴클레오티드에서 선택된 서열을 포함할 수 있고, 또는 대안으로, 각각의 효과기 서열은 또한, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 뉴클레오티드 변이를 가진, 서열 번호: 40-78의 변이체일 수 있다. 추가적인 구체예에서, 각각의 효과기 서열은 20개의 뉴클레오티드로 구성될 수 있고, 이들 중 17, 18, 19개 또는 20개 모두의 뉴클레오티드는 서열 번호: 40-78로 구성된 군에서 선택된 서열로부터의 근접 뉴클레오티드이다. 2개 이상의 효과기 서열이 있을 때, 그들은 상기 설명된 3개의 유형의 조합을 나타낼 수 있다.
특히 바람직한 구체예에서, 제1 및 제2 효과기 서열은 표적 유전자 영역의 발현을 적어도 70% 저해할 수 있는 서열 내에서 임의의 10개 이상, 바람직하게는 임의의 17개 이상의 근접 뉴클레오티드를 포함한다. 바람직하게 이 구체예에서, 각각의 효과기 서열은 서열 번호: 47 및 서열 번호: 56로 구성된 서열 내에서 임의의 10개 이상 그리고 바람직하게는 임의의 17개 이상의 근접 뉴클레오티드에서 선택되고 따라서 AMD 연관 유전자에서 하나 이상의 표적 서열의 발현을 저해하기 위한 DNA-유도 RNA 간섭 (ddRNAi) 작용제가 제공되며, ddRNAi 작용제는 5'에서 3'으로의 방향으로,
5' UAUGUGGGUGGGUGUGUCUAC 3' (서열 번호: 47) 내에서 임의의 10개 이상의 근접 뉴클레오티드의 제1 효과기 서열;
제1 효과기 상보 서열;
5' UGUAACAGAUGAGAUGCUCCA 3' (서열 번호: 56) 내에서 임의의 10개 이상의 근접 뉴클레오티드의 제2 효과기 서열; 및
제2 효과기 상보 서열을 포함하고,
여기서 각각의 효과기 서열은 하나 이상의 표적 서열의 전사체내 하나 이상의 표적 영역과 실질적으로 상보적이다.
긴 헤어핀 버전
ddRNAi 작용제가 하나보다 더 많은 효과기 서열을 함유하고, 그리고 ddRNAi 작용제가 RNA의 단일 가닥으로서 발현될 때, 상기 작용제는 효과기 서열 및 효과기 서열과 상보적인 서열의 순서에 따라 상이한 구조를 형성하기 위해 접힐 것이다. 한 가지 구체예에서, AMD-연관 유전자에서, 바람직하게는 VEGF-A 유전자에서 및/또는 VEGFR2, CFB 및 PDGFR-β 유전자 중 하나 이상에서 하나 이상의 표적 서열의 발현을 저해하기 위한 DNA-유도 RNA 간섭 (ddRNAi) 작용제가 제공되고, ddRNAi 작용제는 5'에서 3'으로의 방향으로, 적어도 다음을 포함한다:
적어도 17개 뉴클레오티드 길이의 제1 효과기 서열;
적어도 17개 뉴클레오티드 길이의 제2 효과기 서열;
제2 효과기 상보 서열; 및
제1 효과기 상보 서열
여기서 각각의 효과기 서열은 하나 이상의 표적 서열의 전사체내 하나 이상의 표적 영역과 실질적으로 상보적임. 이것은 도 1A에서 나타난 바와 같은 구조를 가진 ddRNAi 작용제를 야기할 것이다. 또한, WO2004/106517을 참고하며, 이는 참조로서 본 명세서에 편입된다.
대안으로, 적어도 하나의 효과기, 바람직하게는 둘 모두의 효과기 서열은 하나 이상의 표적 서열의 전사체내 하나 이상의 표적 영역과 100% 상보적이다. 바람직하게 제1 및 제2 효과기 서열은 둘 모두, 서열 번호: 40-78 중 어느 하나 내에서 임의의 10개 이상 그리고 바람직하게는 임의의 17개 이상의 근접 뉴클레오티드로 구성된 군에서 선택된다. 예를 들어, 한 가지 구체예에서, AMD-연관 유전자에서 하나 이상의 표적 서열의 발현을 저해하기 위한 DNA-유도 RNA 간섭 (ddRNAi) 작용제가 제공되고, ddRNAi 작용제는 5'에서 3'으로의 방향으로, 적어도 다음을 포함한다:
5' AAGUUCAUGGUUUCGGAGGCC 3' (서열 번호: 41)의 제1 효과기 서열;
5' UCUUUCUUUGGUCUGCAUUCA 3' (서열 번호: 44)의 제2 효과기 서열;
제2 효과기 상보체; 및
제1 효과기 상보체
여기서 AMD-연관 유전자는 VEGF-A임.
각각의 효과기 서열은 하나 이상의 표적 서열의 전사체내 하나 이상의 표적 영역과 실질적으로 상보적이다.
대안으로, 적어도 하나의 효과기, 그리고 바람직하게는 둘 모두의 효과기 서열은 하나 이상의 표적 서열의 전사체내 하나 이상의 표적 영역과 100% 상보적이다.
특히 바람직한 구체예에서, 제1 및 제2 효과기 서열은 표적 유전자 영역의 발현을 적어도 70% 저해할 수 있는 서열 내에서 임의의 10개 이상, 바람직하게는 임의의 17개 이상의 근접 뉴클레오티드를 포함한다. 바람직하게, 이 구체예에서, 각각의 효과기 서열은 서열 번호: 40-78에서, 더욱 바람직하게 서열 번호: 40-59에서 그리고 가장 바람직하게는 서열 번호: 40-49에서 선택된다.
ddRNAi 작용제가 3개의 효과기 서열을 갖는 구체예가 되는, 또 다른 구체예에서, 표적 유전자에서 하나 이상의 표적 서열의 발현을 저해하기 위한 DNA-유도 RNA 간섭 (ddRNAi) 작용제가 제공되고, ddRNAi 작용제는 5'에서 3'으로의 방향으로, 적어도 다음을 포함한다:
5' AAGUUCAUGGUUUCGGAGGCC 3' (서열 번호: 41)의 제1 효과기 서열;
5' UCUUUCUUUGGUCUGCAUUCA 3' (서열 번호: 44)의 제2 효과기 서열;
5' UAUGUGGGUGGGUGUGUCUAC 3'(서열 번호: 47)의 제3 효과기 서열;
제3 효과기 상보 서열;
제2 효과기 상보 서열; 및
제1 효과기 상보 서열.
각각의 효과기 서열은 하나 이상의 표적 서열의 전사체내 하나 이상의 표적 영역과 실질적으로 상보적이다.
대안으로, 적어도 하나의 효과기, 그리고 선택적으로 3개 중 2개 또는 3개 모두의 효과기는 하나 이상의 표적 서열의 전사체내 하나 이상의 표적 영역과 100% 상보적이다.
특히 바람직한 구체예에서, 제1, 제2 및 제3 효과기 서열은 표적 유전자 영역의 발현을 적어도 70% 저해할 수 있는 서열 내에서 임의의 10개 이상, 바람직하게는 임의의 17개 이상의 근접 뉴클레오티드를 포함한다. 바람직하게, 이 구체예에서, 각각의 효과기 서열은 서열 번호: 40-78에서, 더욱 바람직하게 서열 번호: 40-59에서, 그리고 가장 바람직하게는 서열 번호: 40-49에서 선택된다.
효과기 및 효과기 상보체의 순서는 변경될 수 있고, 단 단일, 긴 헤어핀 구조는 dsRNA를 형성하기 위해 효과기 서열이 이의 효과기 상보체로 어닐링됨으로써 형성된다. 예를 들어, 2-효과기 서열 ddRNAi 작용제에서, 서열은 다음 예시적인 5'에서 3'으로의 순서로 배열될 수 있다:
● 제1 효과기 - 제2 효과기 - 제2 효과기 상보체 - 제1 효과기 상보체;
● 제2 효과기 - 제1 효과기 - 제1 효과기 상보체 - 제2 효과기 상보체;
● 제1 효과기 - 제2 효과기 상보체 - 제2 효과기 - 제1 효과기 상보체;
● 제1 효과기 상보체 - 제2 효과기 상보체 - 제2 효과기 - 제1 효과기;
● 제1 효과기 상보체 - 제2 효과기 - 제2 효과기 상보체 - 제1 효과기.
3-효과기 서열 ddRNAi 작용제에서, 서열은 다음 예시적인 5'에서 3'으로의 순서로 배열될 수 있다:
● 제1 효과기 - 제2 효과기 - 제3 효과기 - 제3 효과기 상보체 - 제2 효과기 상보체 - 제1 효과기 상보체
● 제1 효과기 - 제2 효과기 상보체 - 제3 효과기 - 제3 효과기 상보체 - 제2 효과기 - 제1 효과기 상보체;
● 제1 효과기 - 제2 효과기 - 제3 효과기 상보체 - 제3 효과기 - 제2 효과기 상보체 - 제1 효과기 상보체
● 제1 효과기 - 제3 효과기 - 제2 효과기 상보체 - 제2 효과기 - 제3 효과기 상보체 - 제1 효과기 상보체
● 제1 효과기 상보체 - 제2 효과기 상보체 - 제3 효과기 상보체 - 제3 효과기 - 제2 효과기 - 제1 효과기 상보체
● 제1 효과기 상보체 - 제2 효과기 상보체 - 제3 효과기 - 제3 효과기 상보체 - 제2 효과기 - 제1 효과기.
또 다른 구체예에서, 제1 효과기 서열은 서열 번호: 40-78로 구성된 군으로부터의 서열 내에서 임의의 10개 이상 그리고 바람직하게는 임의의 17개 이상의 근접 뉴클레오티드에서 선택될 수 있다; 제2 효과기 서열은 서열 번호: 40-78로 구성된 군으로부터의 서열 내에서 임의의 10개 이상 그리고 바람직하게는 임의의 17개 이상의 근접 뉴클레오티드에서 선택될 수 있다; 제3 효과기 서열은 서열 번호: 40-78로 구성된 군으로부터의 서열 내에서 임의의 10개 이상 그리고 바람직하게는 임의의 17개 이상의 근접 뉴클레오티드에서 선택될 수 있다; 그리고 임의의 추가적인 효과기 서열은 서열 번호: 40-78로 구성된 군으로부터의 서열 내에서 임의의 10개 이상 그리고 바람직하게는 임의의 17개 이상의 근접 뉴클레오티드에서 선택될 수 있다. 대안으로, 각각의 효과기 서열은 또한, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 뉴클레오티드 변이를 가진, 서열 번호: 40-78의 변이체일 수 있다. 바람직하게, 차이는 첫 번째 및/또는 마지막 5개 뉴클레오티드에 존재하고, 그리고 적어도 중앙의 11-12개 뉴클레오티드는 하나 이상의 표적 서열의 전사체내 하나 이상의 표적 영역과 100% 상보적이다. 구체예 각각에서, 오로지 VEGF-A만 표적이 되어야 하는 경우, 각각의 효과기 서열은 서열 번호: 40-49에서 선택되고; 오로지 VEGFR2만 표적되어야 하는 경우, 각각의 효과기 서열은 서열 번호: 50-59에서 선택되고; 오로지 PDGFR-β만 표적되어야 하는 경우, 각각의 효과기 서열은 서열 번호: 60-69에서 선택되고; 오로지 CFB만 표적되어야 하는 경우, 각각의 효과기 서열은 서열 번호: 70-78에서 선택된다.
제1, 제2 및 제3 효과기 서열은 서열 번호: 40-78로 구성된 군으로부터의 서열 내에서 임의의 10개 이상의 근접 뉴클레오티드에서 선택된 서열을 각각 포함할 수 있고, 또는 대안으로, 각각의 효과기 서열은 또한, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 뉴클레오티드 변이를 가진, 서열 번호: 40-78의 변이체일 수 있다. 추가적인 구체예에서, 각각의 효과기 서열은 20개의 뉴클레오티드로 구성될 수 있고, 이들 중 17, 18, 19개 또는 20개 모두의 뉴클레오티드는 서열 번호: 40-78로 구성된 군에서 선택된 서열로부터의 근접 뉴클레오티드이다. 다수의 효과기 서열이 있을 때, 그들은 상기 설명된 3개의 유형의 조합을 나타낼 수 있다.
다중 헤어핀 버전
하나 이상의 AMD-연관 유전자, 바람직하게는 VEGF-A, VEGFR2, CFB 또는 PDGFR-β 유전자에서 하나 이상의 표적 서열의 발현을 저해하기 위한 DNA-유도 RNA 간섭 (ddRNAi) 작용제가 제공되고, ddRNAi 작용제는 5'에서 3'으로의 방향으로, 적어도 다음을 포함한다:
적어도 17개 뉴클레오티드 길이의 제1 효과기 서열;
제1 효과기 상보체;
적어도 17개 뉴클레오티드 길이의 제2 효과기 서열; 및
제2 효과기 상보체
여기서 각각의 효과기 서열은 하나 이상의 표적 서열의 전사체내 하나 이상의 표적 영역과 실질적으로 상보적임.
대안으로, 적어도 하나의 효과기, 그리고 바람직하게는 둘 모두의 효과기 서열은 하나 이상의 표적 서열의 전사체의 하나 이상의 표적 영역과 100% 상보적이다.
이것은 작용제를 발현시키는 데에 이용되는 발현 카세트의 유형에 따라, 도 1B 또는 C에서 나타난 바와 같은 구조를 가진 ddRNAi 작용제를 야기할 것이다 (추후에 본 명세서를 참고). 또한, WO2005/087926 및 WO2006/084209를 참고하며, 이들은 참조로서 본 명세서에 편입된다.
2개의 표적 서열이 있는 데, 이중 하나의 구체예에서, 제1 및 제2 효과기 서열 둘 모두, 그들 각각의 표적 서열의 전사체의 하나 이상의 표적 영역과 실질적으로 상보적이라는 점이 바람직하다.
바람직하게 제1 및 제2 효과기 서열 둘 모두, 서열 번호: 40-78로 구성된 군으로부터의 서열 내에서 임의의 10개 이상 그리고 바람직하게는 임의의 17개 이상의 근접 뉴클레오티드에서 선택된다. 예를 들어, 한 가지 구체예에서, AMD-연관 유전자에서 하나 이상의 표적 서열의 발현을 저해하기 위한 DNA-유도 RNA 간섭 (ddRNAi) 작용제가 제공되고, ddRNAi 작용제는 5'에서 3'으로의 방향으로, 적어도 다음을 포함한다:
5' UAUGUGGGUGGGUGUGUCUAC 3' (서열 번호: 47) 내에서 임의의 10개 이상의 근접 뉴클레오티드의 제1 효과기 서열;
제1 효과기 상보 서열;
5' AAGUUCAUGGUUUCGGAGGCC 3' (서열 번호: 41) 또는 5' UCUUUCUUUGGUCUGCAUUCA 3' (서열 번호: 44) 내에서 임의의 10개 이상의 근접 뉴클레오티드의 제2 효과기 서열; 및
제2 효과기 상보 서열,
여기서 AMD-연관 유전자는 VEGF-A임.
각각의 효과기 서열은 하나 이상의 표절 서열의 전사체에서 하나 이상의 표적 영역과 실질적으로 상보적이다.
대안으로, 적어도 하나의 효과기, 그리고 바람직하게는 둘 모두의 효과기 서열은 하나 이상의 표적 서열의 전사체내 하나 이상의 표적 영역과의 100% 상보성을 갖는다.
특히 바람직한 구체예에서, 제1 및 제2 효과기 서열은 표적 영역의 발현을 적어도 70% 저해할 수 있는 서열 내에서 임의의 10개 이상, 바람직하게는 임의의 17개 이상의 근접 뉴클레오티드를 포함한다. 바람직하게, 이 구체예에서, 각각의 효과기 서열은 서열 번호: 40-78에서, 더욱 바람직하게 서열 번호: 40-59에서, 그리고 가장 바람직하게는 서열 번호: 40-49에서 선택된다.
ddRNAi 작용제가 3개의 효과기 서열을 갖는 구체예가 되는, 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 AMD-연관 유전자에서 하나 이상의 표적 서열의 발현을 저해하기 위한 DNA-유도 RNA 간섭 (ddRNAi) 작용제가 제공되고, ddRNAi 작용제는 5'에서 3'으로의 방향으로, 적어도 다음을 포함한다:
5' AAGUUCAUGGUUUCGGAGGCC 3' (서열 번호: 41) 내에서 임의의 10개 이상의 근접 뉴클레오티드의 제1 효과기 서열;
제1 효과기 상보 서열;
5' UCUUUCUUUGGUCUGCAUUCA 3' (서열 번호: 44) 내에서 임의의 10개 이상의 근접 뉴클레오티드의 제2 효과기 서열;
제2 효과기 상보 서열;
5' UAUGUGGGUGGGUGUGUCUAC 3' (서열 번호: 47) 내에서 임의의 10개 이상의 근접 뉴클레오티드의 제3 효과기 서열; 및
제3 효과기 상보 서열,
여기서 AMD-연관 유전자는 VEGF-A임.
ddRNAi 작용제가 2개의 효과기 서열을 갖는 구체예가 되는, 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 AMD-연관 유전자에서 하나 이상의 표적 서열의 발현을 저해하기 위한 DNA-유도 RNA 간섭 (ddRNAi) 작용제가 제공되고, ddRNAi 작용제는 5'에서 3'으로의 방향으로, 적어도 다음을 포함한다:
AMD-연관 유전자 VEGRF-2의 5' UGUAACAGAUGAGAUGCUCCA 3' (서열 번호: 56) 내에서 임의의 10개 이상의 근접 뉴클레오티드의 제1 효과기 서열;
제1 효과기 상보 서열;
AMD-연관 유전자 VEGFA의 5' UAUGUGGGUGGGUGUGUCUAC 3' (서열 번호: 47) 내에서 임의의 10개 이상의 근접 뉴클레오티드의 제2 효과기 서열; 및
제2 효과기 상보 서열.
이들 구체예에서 각각의 효과기 서열은 하나 이상의 표적 서열의 전사체내 하나 이상의 표적 영역과 실질적으로 상보적이다.
VEGFA 서열은 첫 번째일 수 있고 VEGFR2 서열은 두 번째일 수 있다는 점이 해당 분야의 통상의 기술자에게 인식될 것이다. 이것은 동등한 구체예이다.
ddRNAi 작용제가 3개의 효과기 서열을 갖는 구체예가 되는, 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 AMD-연관 유전자에서 하나 이상의 표적 서열의 발현을 저해하기 위한 DNA-유도 RNA 간섭 (ddRNAi) 작용제가 제공되고, ddRNAi 작용제는 5'에서 3'으로의 방향으로, 적어도 다음을 포함한다:
AMD-연관 유전자 VEGRF-2에서 5' AAGUAGCCAGAAGAACAUGGC 3' (서열 번호: 52) 내에서 임의의 10개 이상의 근접 뉴클레오티드의 제1 효과기 서열;
제1 효과기 상보 서열;
AMD-연관 유전자 CFB의 5' UUAUAGAAAACCCAAAUCCUC 3' (서열 번호: 78) 내에서 임의의 10개 이상의 근접 뉴클레오티드의 제2 효과기 서열;
제2 효과기 상보 서열;
AMD-연관 유전자 PDGFR-β의 5' UAGCUGAAGCCCACGAGGUCC 3' (서열 번호: 63) 내에서 임의의 10개 이상의 근접 뉴클레오티드의 제3 효과기 서열; 및
제3 효과기 상보 서열.
이들 구체예 모두에서 각각의 효과기 서열은 하나 이상의 표적 서열의 전사체내 하나 이상의 표적 영역과 실질적으로 상보적이다. 서열은 상이한 5'에서 3'으로의 순서로 있을 수 있고 동등한 구체예를 나타낼 수 있다는 점이 해당 분야의 통상의 기술자에게 인식될 것이다. 예를 들어, PDGFR-β는 첫 번째일 수 있고, VEGFR2는 두 번째일 수 있고 그리고 CFB는 세 번째일 수 있다. 대안으로, 적어도 하나의 효과기, 그리고 선택적으로 3개 중 2개 또는 3개의 효과기 모두, 하나 이상의 표적 서열의 전사체내 하나 이상의 표적 영역과 100% 상보적이다.
특히 바람직한 구체예에서, 제1, 제2 및 제3 효과기 서열은 표적 유전자 영역의 발현을 적어도 70% 저해할 수 있는 서열 내에세 임의의 10개 이상, 바람직하게는 임의의 17개 이상의 근접 뉴클레오티드를 포함한다. 바람직하게, 이 구체예에서, 각각의 효과기 서열은 서열 번호: 40-78에서, 더욱 바람직하게 서열 번호: 40-59에서, 그리고 가장 바람직하게는 서열 번호: 40-49에서 선택된다.
추가적인 구체예에서, 제1 효과기 서열은 서열 번호: 40-78로 구성된 군에서 선택된 서열 내에서 임의의 10개 이상의 근접 뉴클레오티드일 수 있고; 제2 효과기 서열은 서열 번호: 40-78로 구성된 군에서 선택된 서열 내에서 임의의 10개 이상의 근접 뉴클레오티드일 수 있고; 제3 효과기 서열은 서열 번호: 40-78로 구성된 군에서 선택된 서열 내에서 임의의 10개 이상의 근접 뉴클레오티드일 수 있고; 그리고 임의의 추가적인 효과기 서열은 서열 번호: 40-78로 구성된 군에서 선택된 서열 내에서 임의의 10개 이상의 근접 뉴클레오티드일 수 있다. 바람직하게, 각각의 효과기 서열은 적어도 17개의 근접 뉴클레오티드이다.
각각의 효과기 서열은 또한, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 뉴클레오티드 변이를 가진, 서열 번호: 40-78의 변이체일 수 있다. 바람직하게, 차이는 첫 번째 및/또는 마지막 5개 뉴클레오티드에 존재하고, 그리고 적어도 중앙의 10-12개 뉴클레오티드는 하나 이상의 표적 서열의 전사체내 하나 이상의 표적 영역과 100% 상보적이다.
제1, 제2 및 제3 효과기 서열은 각각, 서열 번호: 40-78로 구성된 군으로부터의 서열 내에서 임의의 10개 이상의 근접 뉴클레오티드에서 선택되는 서열을 포함하고, 또는 대안으로, 각각의 효과기 서열은 또한, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 뉴클레오티드 변이를 가진, 서열 번호: 40-78의 변이체일 수 있다. 추가적인 구체예에서, 각각의 효과기 서열은 20개의 뉴클레오티드로 구성될 수 있고, 이들 중 17, 18, 19개 또는 20개 모두의 뉴클레오티드는 서열 번호: 40-78로 구성된 군에서 선택된 서열로부터의 근접 뉴클레오티드이다. 다수의 효과기 서열이 있을 때, 그들은 상기 설명된 3개의 유형의 조합을 나타낼 수 있다.
추가로, 긴 헤어핀 구조 또는 다중 헤어핀 구조에서 ddRNAi 작용제는 다음 화학식 중 하나에 따른 추가적인 효과기 서열 및 상응하는 상보 서열을 포함할 수 있다:
긴 헤어핀:
● [효과기 서열]1-10 [효과기 상보 서열]1-10
다중 헤어핀:
● [효과기 서열-효과기 상보 서열]1-10
바람직하게, 긴 헤어핀 화학식에서, 효과기 서열의 수는 효과기 상보 서열의 수와 동일하다. 전형적으로, 2, 3, 4 또는 5개의 효과기 서열이 있고, 이에 따라, 각각 2, 3, 4 또는 5개의 효과기 상보 서열이 있다.
ddRNAi 작용제가 하나보다 더 많은 효과기 서열을 함유할 때, 효과기 서열은 동일하거나 상이하다. 예를 들어, ddRNAi 작용제가 3개의 효과기 서열을 갖는다면, 2개의 효과기 서열은 동일한 서열을 가질 수 있고, 반면에 1개의 서열은 상이하다. 대안으로, 3개의 효과기 서열 모두, 상이할 수 있다. 바람직하게, 효과기 서열은 서열 번호: 40-78로 구성된 군에서 선택된 서열 내에서 임의의 10개 이상 그리고 바람직하게는 임의의 17개 이상의 근접 뉴클레오티드이거나, 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 뉴클레오티드 변이를 가진 이의 변이체이다. 바람직하게, 차이는 첫 번째 및/또는 마지막 5개 뉴클레오티드에 존재하고, 그리고 적어도 중앙의 10-12개 뉴클레오티드는 하나 이상의 표적 서열의 전사체내 하나 이상의 표적 영역과 100% 상보적이다.
자연적으로 발생한 변이체를 가진 표적 서열의 단일 영역, 또는 단일 뉴클레오티드 다형성을 표적할 때, 바람직하게도 적어도 하나의 효과기 서열은 서열 번호: 40-78로 구성된 군에서 선택된 서열 내에서 임의의 10개 이상 그리고 바람직하게는 임의의 17개 이상의 근접 뉴클레오티드에서 선택되고, 반면에 다른 효과기 서열은 선택된 서열의 변이체이다. 예를 들어, 제1 효과기 서열은 서열 번호: 47의 20개 뉴클레오티드를 포함할 수 있고; 따라서 제2 효과기 서열은 서열 번호: 47의 변이체이어야 한다.
헤어핀 구조
상기 구체예에서, 효과기 서열은 헤어핀 구조를 형성하기 위해 이의 상응하는 효과기 상보 서열과 혼성화 된다. 헤어핀 말단에서, 2개 이상의 결합되지 않은 뉴클레오티드는 '힌지' 또는 '루프'를 형성한다. 한 가지 구체예에서, 결합되지 않은 뉴클레오티드는 효과기 서열 및 효과기 상보체의 일부이고, 따라서 효과기 서열의 적어도 17개 뉴클레오티드의 일부분만이 이의 상응하는 상보 서열과 복식을 형성할 것이다. 예를 들어, 효과기 서열 및 이의 상보체 둘 모두, 20개 뉴클레오티드 길이일 때, 18개의 뉴클레오티드는 이중 가닥 영역을 형성하기 위해 염기쌍을 이룰 수 있고, 전체 4개의 뉴클레오티드는 그 사이에서 단일 가닥 루프를 형성하도록 남겨두고 효과기 서열과 이의 효과기 상보 서열은 연결된다.
대안적인 구체예에서, 그 자체와 비-상보적인 추가적인 서열, 표적 서열, 효과기 서열 또는 효과기 상보체는 '루프'를 형성하기 위하여 ddRNAi에 포함될 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 구체예에서, ddRNAi 작용제는 루프를 형성할 수 있는 2 내지 100개의 무쌍 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 2 내지 10개의 무쌍 뉴클레오티드의 서열을 추가로 포함한다. 바람직한 구체예에서 루프는 뉴클레오티드 서열 AA, UU, UUA, UUAG, UUACAA, CAAGAGA 또는 N1AAN2를 포함하고, 여기서 N1 및 N2는 C, G, U 및 A 중 어느 하나일 수 있고 동일하거나 상이할 수 있다. 그렇지 않으면, 특이적인 루프 서열은 ACUGUGAAGCAGAUGGGU를 포함한다. 이들 루프에서, 모든 루프 서열이 어닐링되지 않은 채로 남아 있을 필요는 없다. 예를 들면 18개의 뉴클레오티드의 루프에서, 예를 들어 첫 번째와 마지막 3개의 뉴클레오티드는 서로 어닐링될 수 있고, 개재하는 15개 뉴클레오티드는 어닐링되지 않은 채로 남겨둔다.
ddRNAi 작용제가 miRNA 구조의 일부로서 발현되는 구체예에서, 루프 서열은 miRNA로부터 유래될 수 있고, 그리고 miRNA 인코딩 (ME) 서열에 의해 인코딩된다.
ddRNAi 작용제 구조에 따라 하나 이상의 루프가 있을 수 있다. ddRNAi 작용제가 화학식 [효과기 서열]1-10 [효과기 상보 서열]1-10에 기반하는 구조를 가질 때, 단일 루프 구조를 생기게 하기 위한 추가적인 비-자가-상보 서열은 도 1D에서 설명된 바와 같이, 마지막 효과기 서열 및 마지막 효과기 서열의 효과기 상보 서열 사이에 포함된다. 따라서, 이 구체예에서, VEGF-A, VEGFR2, CFB 및 PDGFR-β에서 선택된 AMD-연관 유전자에서 하나 이상의 표적 서열의 발현을 저해하기 위한 DNA-유도 RNA 간섭 (ddRNAi) 작용제가 제공되고, ddRNAi 작용제는 5'에서 3'으로의 방향으로, 적어도 다음을 포함한다:
적어도 17개 뉴클레오티드 길이의 제1 효과기 서열;
적어도 17개 뉴클레오티드 길이의 제2 효과기 서열;
2 내지 100개의 비-자가-상보적 뉴클레오티드의 루프 서열;
제2 효과기 상보 서열; 및
제1 효과기 상보 서열
여기서 각각의 효과기 서열은 하나 이상의 표적 서열의 전사체내 하나 이상의 표적 영역과 실질적으로 상보적임.
ddRNAi 작용제가 화학식 [효과기 서열-효과기 상보 서열]1-10에 기반한 다중 헤어핀 구조를 가질 때, 추가적인 비-자가-상보 서열은 (작용제를 발현시키는 데에 이용되는 발현 카세트의 유형에 따라 - 추후에 본 명세서를 참고) 도 1E 및 F에서 설명된 바와 같이, 루프 구조를 생기게 하기 위해 각각의 효과기 서열 및 이의 상보 서열 사이에 포함된다. 이 구체예에서, AMD-연관 유전자에서 하나 이상의 표적 서열의 발현을 저해하기 위한 DNA-유도 RNA 간섭 (ddRNAi) 작용제가 제공되고, ddRNAi 작용제는 5'에서 3'으로의 방향으로, 적어도 다음을 포함한다:
적어도 17개 뉴클레오티드 길이의 제1 효과기 서열;
2 내지 100개의 비-자가-상보적 뉴클레오티드의 루프 서열;
제1 효과기 상보 서열;
적어도 17개 뉴클레오티드 길이의 제2 효과기 서열;
2 내지 100개의 비-자가-상보적 뉴클레오티드의 루프 서열; 및
제2 효과기 상보 서열
여기서 각각의 효과기 서열은 AMD-연관 유전자에서 하나 이상의 표적 서열의 전사체내 하나 이상의 표적 영역과 실질적으로 상보적이고, 그리고 유전자는 VEGF-A, VEGFR2, CFB 및 PDGFR-β 중 하나 이상에서 선택된다.
2개보다 더 많은 효과기 및 상보 서열이 있고, 그러므로 2개보다 더 많은 헤어핀 구조가 있다는 이 구체예에서, 각각의 루프 구조를 형성하는 추가적인 비-자가-상보적 서열의 길이는 동일할 필요가 없다. 예를 들어, 하나의 루프 구조는 5개의 뉴클레오티드를 가질 수 있는 반면에, 또 다른 루프 구조는 9개의 뉴클레오티드를 가질 수 있다.
추가로, 2개 이상의 헤어핀 구조가 있을 때, 각각의 루프 사이에서 스페이서 서열로서 작용하는 추가적인 비-자가-상보 서열이 있을 수 있다. 이 구체예에서, AMD-연관 유전자에서 하나 이상의 표적 서열의 발현을 저해하기 위한 DNA-유도 RNA 간섭 (ddRNAi) 작용제가 제공되고, ddRNAi 작용제는 5'에서 3'으로의 방향으로, 적어도 다음을 포함한다:
적어도 17개 뉴클레오티드 길이의 제1 효과기 서열;
2 내지 100개의 비-자가-상보적 뉴클레오티드의 루프 서열;
제1 효과기 상보 서열;
2 내지 100개의 비-자가-상보적 뉴클레오티드의 스페이서 서열;
적어도 17개 뉴클레오티드 길이의 제2 효과기 서열;
2 내지 100개의 비-자가-상보적 뉴클레오티드의 루프 서열; 및
제2 효과기 상보 서열
여기서 각각의 효과기 서열은 AMD-연관 유전자에서 하나 이상의 표적 서열의 전사체내 하나 이상의 표적 영역과 실질적으로 상보적이고, 그리고 유전자는 VEGF-A, VEGFR2, CFB 및 PDGFR-β 중 하나 이상에서 선택된다.
2개 가닥의 작용제
해당 분야의 통상의 기술자에 의해 인식되는 바와 같이, 전체 ddRNAi 작용제는 하나의 서열로서 발현된다는 점이 필수적인 것은 아니다. 예를 들어, 본 발명의 구체예에서, 제1 효과기 서열은 생성될 수 있고 (가령, 하나의 DNA 서열에 의해 전사됨), 그리고 제1 효과기 상보 서열이 생성될 수 있다 (가령, 별개의 DNA 서열로부터 전사됨). 선택적으로, 루프 서열은 전사체 또는 하나의 전사체의 3' 말단 그리고 다른 전사체의 5' 말단에 부착된 루프의 일부에 부착될 수 있고, 그리고 그 루프 서열은 효과기 또는 효과기 상보 서열이 miRNA 구조의 일부로서 발현될 때 miRNA로부터 유래될 수 있다. 세포 내에서, 이후 2개의 전사체는 제1 효과기 서열 및 이의 상보체 사이에서의 어닐링을 통한 혼성화에 의해 ddRNAi 작용제를 형성한다.
화학적으로 합성된 siRNA의 시험관내 발현 ddRNAi 작용제
습성 AMD의 효과적인 치료는 (아래에서 약술되는 바와 같이) ddRNAi 구조체로부터 생체 내에서 발현되어야 할 ddRNAi 작용제를 요구할 것이라는 점이 구상되지만, 시험관 내에서 발현되는 ddRNAi 작용제를 투여하거나 화학적으로 합성된 siRNA를 투여하여, 그렇게 함으로써 효과의 일시적인 지속기간을 지닌 치료법으로서 기능하는 것이 바람직한 경우일 수도 있다. 예를 들어 치료에 대한 환자들의 반응에 대해 그들을 스크리닝하는 것은 생체내 발현 ddRNAi 작용제를 이용한 장기간 치료를 시작하기 전에 세포에서 통합되거나 복제되지 않는 siRNA를 이용한 단기간 치료에서 혜택을 얻을 수 있다.
따라서 본 발명의 ddRNAi 작용제는 시험관 내에서 발현될 수 있고 이후 표적 세포에 전달될 수 있다. 대안으로, siRNA는 화학적으로 합성될 수 있고 이후 표적 세포에 전달될 수 있다. 이에 비추어, 본 발명의 또 다른 측면에서, AMD-연관 유전자에서 하나 이상의 표적 서열의 발현을 저해하기 위한 작은 간섭 RNAi 작용제 (siRNA 작용제)가 제공되고, siRNA는
적어도 17개 뉴클레오티드 길이의 제1 효과기 서열; 및
제1 효과기 상보 서열을 포함하고;
여기서 효과기 서열은 하나 이상의 표적 서열의 전사체내 하나 이상의 표적 영역과 실질적으로 상보적이다.
상기 설명된 ddRNAi 작용제와 유사하게, siRNA 작용제도 또한, 다중 표적화, 가령 단일 유전자, 가령 VEGF-A의 다중 표적, 또는 하나보다 더 많은 유전자, 가령 VEGFR2, CFB 및 PDGFR-β에서의 표적을 위한 하나 보다 많은 효과기 서열을 포함할 수 있다. 효과기 서열은 서열 번호: 40-78로 구성된 군으로부터의 서열 내에서 임의의 10개 이상 및 바람직하게는 임의의 17개 이상의 근접 뉴클레오티드에서 바람직하게 선택된다.
상당한 신축성의 siRNA를 설계할 수 있다. 전형적으로 siRNA는 5'-포스페이트 및 3'-하이드록실 잔기를 가진 dsRNA 분자로 구성되고, 가닥의 길이는 20-29개 뉴클레오티드에서 달라질 수 있고 그리고 선택적으로 2개의 뉴클레오티드 3' 돌출부를 포함하도록 설계될 수 있다. 몇 가지 구체예에서, 각각의 가닥은 N19- 27TT (여기서 TT는 데옥시리보뉴클레오티드일 수 있음)로서 합성될 수 있다. siRNA는 상기 설명된 바와 같은 서열 번호: 40-78의 영역에 기반하여 쉽게 설계될 수 있고 그리고 단일 서열로서 또는 임의로 조합하여 치료학적으로 이용될 수 있다. 대안으로 siRNA 작용제는 ddRNAi 발현 카세트로부터 발현된 것들과 유사하거나 동일한 효과기 및 효과기 상보 서열을 함유한 단일 RNA 분자로 구성될 수 있다. 이들 서열은 서열 번호: 40-78에 기반할 수 있고 그리고 단일 서열로서 또는 또 다른 서열과 임의로 조합하여 치료학적으로 이용될 수 있다. siRNA는 적절하게 보호된 리보뉴클레오티드 포스포르아미데이트 및 종래의 합성기(synthesizer)와 화학적으로 합성될 수 있고 따라서 광범위하게 상업적으로 이용가능하고 해당 분야의 일과적인 방법에 따라 설계되고 합성될 수 있다. 바람직한 구체예에서, siRNA는 서열 번호: 40-78 중 하나 이상으로부터의 서열 내에서 임의의 10개 이상의 근접 뉴클레오티드의 서열을 가진다.
발현 카세트 및 miRNA 골격
본 발명의 ddRNAi 작용제는 DNA 발현 카세트로부터 발현된다. 발현 카세트는 ddRNAi 작용제 그 자체를 인코딩하는 DNA 서열과 함께, 발현에 요구되는 조절 서열, 가령 프로모터를 포함한다. ddRNAi 작용제가 miRNA 구조의 일부로서 발현되는 구체예에서, 발현 카세트는 또한 그 miRNA 구조에 대해 인코딩하는 DNA 서열을 포함한다.
ddRNAi 발현 카세트는 (특정한 순서 없이) 다음을 포함한다:
● 하나 이상의 프로모터 서열
● 하나 이상의 효과기 서열을 인코딩하는 하나 이상의 DNA 서열
● 하나 이상의 효과기 상보 서열을 인코딩하는 하나 이상의 DNA 서열;
그리고 선택적으로
● 하나 이상의 종결 서열
● 루프 서열, 스페이서 서열 또는 이 둘 모두를 인코딩하는 하나 이상의 DNA 서열
● 하나 이상의 인헨서 서열.
제1 프로모터 서열 및 마지막 종결 서열은 발현 카세트가 클로닝되는 벡터로부터 유래될 수 있다.
한 가지 구체예에서, ddRNAi 작용제를 발현하기 위한 DNA-유도 RNA 간섭 (ddRNAi) 발현 카세트가 제공되고, 여기서 ddRNAi 작용제는 AMD-연관 유전자에서 하나 이상의 표적 서열의 발현을 저해하고, ddRNAi 구조체는 5'에서 3'로의 방향으로, 다음을 포함한다:
프로모터 서열
제1 효과기 서열을 인코딩하는 DNA 서열
제1 효과기 상보 서열을 인코딩하는 DNA 서열; 및
종결 서열.
제1 효과기 서열에 대해 인코딩하는 DNA 서열은 바람직하게, 서열 번호: 40-78 중 어느 하나로부터의 서열 내에서 10개 이상, 바람직하게는 17개 이상의 근접 뉴클레오티드에 대해 인코딩하는 DNA이다. 특히 바람직한 구체예에서, 제1 효과기 서열은 표적 유전자 영역의 발현을 적어도 70% 저해할 수 있는 서열 내에서 10개 이상, 바람직하게는 17개 이상의 근접 뉴클레오티드를 포함한다. 바람직하게, 이 구체예에서, 제1 효과기 서열은 서열 번호: 40-78에서, 더욱 바람직하게 서열 번호: 40-59에서, 그리고 가장 바람직하게는 서열 번호: 40-49에서 선택된다.
대안으로, ddRNAi 작용제 그 자체에 관하여 상기 약술된 바와 같이, 효과기 서열에 대해 인코딩하는 서열은 표적 서열의 전사체와 염기쌍을 이루고 표적 서열의 발현을 저해하는 인코딩된 서열의 능력에 영향을 주는 것 없이 1, 2, 3, 4 또는 5개의 뉴클레오티드에 의해 서열 번호: 40-78에서 달라지는 효과기 서열을 인코딩할 수 있다.
통상의 기술자는 임의의 주어진 RNA 서열을 인코딩하는 DNA 서열은 RNA와 동일한 서열이지만 우라실 (U) 염기 대신에 티민 (T) 염기를 가진 서열이라는 점을 인식할 것이다. 긴 헤어핀 구조에서 하나보다 더 많은 효과기 서열을 가진 ddRNAi 작용제를 인코딩하는 ddRNAi 발현 카세트는 5'에서 3'로의 방향으로, 다음을 포함한다:
프로모터 서열;
제1 효과기 서열을 인코딩하는 DNA 서열;
제2 효과기 서열을 인코딩하는 DNA 서열;
선택적으로, 루프를 형성할 수 있는 서열을 인코딩하는 서열;
제2 효과기 상보 서열을 인코딩하는 DNA 서열;
제1 효과기 상보 서열을 인코딩하는 DNA 서열; 및
선택적으로 종결 서열.
바람직하게 DNA 서열은 서열 번호: 40-78로 구성된 군으로부터의 서열 내에서 임의의 10개 이상 또는 더욱 바람직하게는 임의의 17개 이상의 근접 뉴클레오티드에서 선택된 제1 및 제2 효과기 서열을 인코딩한다. 바람직하게, 제1 및 제2 효과기 서열은 서열 번호: 40-59에서 선택된다. 대안으로, DNA 서열은 표적 서열의 전사체와 염기쌍을 이루고 표적 서열의 발현을 저해하는 인코딩된 서열의 능력에 영향을 주는 것 없이 1, 2, 3, 4 또는 5개의 뉴클레오티드에 의해 서열 번호: 40-78에서 달라지는 효과기 서열에 대해 인코딩한다.
ddRNAi 작용제가 하나 보다 많은 효과기 서열 및 화학식 [효과기 서열-효과기 상보 서열]1-10에 기반한 다중 헤어핀 구조를 가질 때, 각각의 [효과기 서열-효과기 상보 서열] 쌍의 발현은 단일 프로모터에 의해, 또는 대안으로 개별적인 프로모터에 의해 조절될 수 있다. 개별적인 프로모터가 고려될 때, ddRNAi 발현 카세트는 5'에서 3'로의 방향으로, 다음을 포함한다:
프로모터 서열
제1 효과기 서열을 인코딩하는 DNA 서열
제1 효과기 상보 서열을 인코딩하는 DNA 서열;
선택적으로 종결 서열;
프로모터 서열;
제2 효과기 서열을 인코딩하는 DNA 서열;
제2 효과기 상보 서열을 인코딩하는 DNA 서열; 및
선택적으로 종결 서열.
이 구체예에서, 다수의 ddRNAi 작용제는 하나의 발현 카세트로부터 생성되는데, 그 이유는 각각의 효과기/효과기 상보체가 단일 헤어핀 구조로서 발현되기 때문이다.
단일 프로모터가 고려될 때, ddRNAi 발현 카세트는 5'에서 3'로의 방향으로, 다음을 포함한다:
프로모터 서열
제1 효과기 서열을 인코딩하는 DNA 서열
제1 효과기 상보 서열을 인코딩하는 DNA 서열;
제2 효과기 서열을 인코딩하는 DNA 서열;
제2 효과기 상보 서열을 인코딩하는 DNA 서열; 및
선택적으로 종결 서열.
상기 구체예와 유사하게, DNA 서열은 바람직하게, 서열 번호: 40-78로 구성된 군으로부터의 서열 내에서 임의의 10개 이상 그리고 바람직하게는 임의의 17개 이상의 근접 뉴클레오티드에서 선택된 제1 및 제2 효과기 서열, 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 뉴클레오티드에 의해 서열 번호: 40-78로부터의 서열에서 달라지는 효과기 서열을 인코딩한다. 바람직하게, 제1 및 제2 효과기 서열은 서열 번호: 40-78에서, 바람직하게 서열 번호: 40-59에서, 그리고 가장 바람직하게는 서열 번호: 40-49에서 선택된다.
상기 언급된 임의의 ddRNAi 작용제는 발현 카세트로부터의 miRNA 구조에서 바람직하게 발현된다.
ddRNAi 구조로부터 발현되는 shRNA의 가공처리는 부정확할 수 있다. RNAi 가공처리 경로를 위한 천연 기질인, miRNA와 같은 RNA 구조 내에서 또는 상기 구조의 일부로서 ddRNAi의 발현은 이를 최소화하기 위한 한 가지 방식이다. McBride et al. (2008)는 내생 miRNA의 염기 및 루프로부터의 서열이 발현되는 "인공 miRNA" 구조체를 설계하였다; 이들은 발현된 shRNA의 더욱 정확한 가공처리를 제시하는 감소된 독성을 보여주었다. Wu et al. (2011)은 (패신저 가닥에서 미스매치를 함유한) 미스매치된 복식이 아마도 내생 miRNA와 그들의 더 큰 구조적 유사성으로 인해, 가끔씩 증가된 침묵 활성을 나타내었다는 점을 보여주었다. 유사하게, Gu et al. (2012)는 shRNA 분자에서 루프 서열에 근접한 돌출부의 도입이 다이서 가공처리의 증가된 정밀성을 야기할 수 있다는 점을 보여주었다.
효과기 및 효과기 상보체가 miRNA 구조로서 발현되는 구체예에서, ddRNAi 발현 카세트는 "miRNA 인코딩서열" 또는 "ME 서열"로서 본 명세서에서 언급된 miRNA 구조에 대해 인코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 이것은 일단 발현되면, miRNA 구조로 접히는 RNA에 대해 인코딩하는 ddRNAi 발현 카세트 내에 함유된 DNA 서열이다. 따라서 효과기 서열 및 효과기 상보체는 miRNA 구조의 일부로서 또는 상기 구조 내에서 발현된다. miRNA 구조에서 발현되는 ddRNAi 작용제를 설명하는 도면으로부터 인식되는 바와 같이, 그리고 본 명세서에서 이전에 상세 설명된 바와 같이, ME 서열은 요구되는 바와 같은 효과기 서열 및 효과기 상보 서열의 상류영역 및 하류영역에 위치할 것이다. 예시로서 단일 효과기-효과기 상보체를 가진 ddRNAi 작용제를 발현하는 발현 카세트를 이용하여, ddRNAi 작용제를 발현하기 위한 DNA-유도 RNA 간섭 (ddRNAi) 발현 카세트가 제공되고, 여기서 ddRNAi 작용제는 AMD-연관 유전자에서 하나 이상의 표적 서열의 발현을 저해하고, ddRNAi 카세트는 5'에서 3'로의 방향으로, 다음을 포함한다:
프로모터 서열
제1 ME 서열
제1 효과기 서열을 인코딩하는 DNA 서열
선택적으로, 루프를 형성할 수 있는 서열을 인코딩하는 서열
제1 효과기 상보 서열을 인코딩하는 DNA 서열;
제2 ME 서열; 및
선택적으로 종결 서열,
여기서 제1 및 제2 ME 서열에 의해 인코딩되는 서열은 miRNA 구조를 형성할 수 있음. 따라서 효과기 서열 및 효과기 상보체는 miRNA 구조의 일부으로서 또는 상기 구조 내에서 발현된다.
루프를 형성할 수 있는 서열에 대해 인코딩하는 선택적인 서열은 또한 ME 서열일 수 있다. 예를 들어, ddRNAi 작용제가 구조 내에서 또는 구조의 일부로서 발현되는 구조로서 특정한 miRNA 구조가 활용된다면, ddRNAi 작용제의 루프 서열은 동일한 miRNA로부터 기원한 것일 수 있다. 대안적인 구체예에서, 루프 서열은 ME 서열에 의해 인코딩되는 miRNA 구조와 상이한 miRNA로부터 기원할 수 있지만, 그렇더라도 여전히 miRNA 유래 또는 기원 서열이다.
ddRNAi 발현 카세트는 대안으로, 발현된 ddRNAi 작용제의 총 길이에 대한 참조에 의해 설명될 수 있으며, 이는 프로모터 및 종결자 사이의 총 서열 길이의 산물이다. 예를 들어, 단일 효과기 ddRNAi에서 효과기 서열의 길이가 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 뉴클레오티드로 구성될 때, ddRNAi 발현 카세트는 프로모터 및 종결자 사이에서 34 내지 60개 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 이 길이는 "루프" 또는 "힌지" 서열의 2 내지 100개 뉴클레오티드를 추가로 포함하여, 36 내지 160개 뉴클레오티드 길이를 제공할 수 있다. 다수의 효과기 서열을 가진 ddRNAi 작용제에 대하여, 각각의 효과기 서열이 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 뉴클레오티드로 구성되는 경우, 전체 길이는 비례하여 증가된다.
miRNA 구조/구조들을 인코딩하기 위한 ME 서열의 존재는 또한 전체 길이를 늘릴 것이다.
본 발명의 ddRNAi 발현 카세트를 설계하는 한 가지 유용한 방식은 다이서가 뉴클레오티드를 22개씩 자르고 (또한 '22nt 단계화(phasing)'로도 불림), 따라서 효과기 서열은 적절한 프로모터에 대한 적절한 스페이서 및 다른 서열 필요조건과 함께, 번호: 40-78로 구성된 군으로부터의 서열 내에서 임의의 10개 이상, 그리고 바람직하게는 임의의 17개 이상의 근접 뉴클레오티드를 인코딩하도록 설계될 수 있다는 점을 추정하는 것이다.
mRNA의 상이한 부위를 표적하는 작용제들은 shRNA 구성에 적합한데, 그 이유는 그들이 mRNA의 이차 구조의 영향을 회피할 수 있고, 따라서 그들의 기능을 독립적으로 수행할 수 있기 때문이다.
U6 프로모터가 이용될 때, 프로모터에 작동가능하게 연결된 DNA 서열은 구아닌 (G) 염기로 시작하는 것이 바람직하지만 필수적인 것은 아니다; H1 프로모터가 이용될 때, 프로모터에 작동가능하게 연결된 DNA 서열은 아데닌 (A) 염기로 시작하는 것이 바람직하지만 필수적인 것은 아니다. 따라서 효과기 암호화 서열은 이에 따라 변형될 수 있다.
shRNA의 발현을 유도하기 위한 miRNA-유래 서열의 이용은 pol II 프로모터를 이용할 때 특히 유리하다. pol II 프로모터에 대한 전사 개시 부위는 종종 부정확하다. shRNA의 다이서 가공처리는 대체로 shRNA의 구조에 의존하기 때문에, 가공처리는 대부분의 경우에 전사 개시 부위에서의 작은 변이에 의해 크게 영향받지 않을 것이다. 따라서 miRNA 유래 서열의 이용은 pol II 프로모터를 활용하는 ddRNAi 구조체를 설계하는 데에 있어 더 큰 융통성을 허용한다.
몇 가지 경우에 shRNA의 길이를 증가시키는 것이 이로울 수 있다. 이를 완수하기 위한 한 가지 방식은 표적 서열에 대한 이의 상보성을 최대화하기 위해 5' 또는 3' 방향으로, shRNA내 효과기 서열의 길이를 연장시키고 그리고 또한 shRNA의 스템 내에서 염기 쌍을 최대화하기 위해 효과기 상보체의 길이도 연장시키는 것이다. 예를 들어 서열 번호: 47에 기반한 shRNA는 서열 번호: 8에서의 것들에 근접한 추가적인 서열을 표적하기 위해 5' 또는 3' 방향으로 쉽게 연장되어 30개의 뉴클레오티드 스템을 가진 shRNA를 생성할 수 있었다. 효과기 서열은 본 명세서내 다른 부분에서 정의된 바와 같은 표적에 대한 실질적인 상동을 공유할 수 있었다.
몇 가지 경우에 효과기, 효과기 상보체 또는 루프 서열 내에서 DNA 서열 TTTT를 회피하는 것이 바람직할 수 있는데, 그 이유는 이들이 U6 또는 H1과 같은 Pol III 프로모터를 이용하는 발현 구조체에서 전사 종결자로서 작용할 수 있기 때문이다. shRNA 설계는 U6 종결이shRNA의 3' 말단에 1 내지 5개의 U 잔기를 첨가하는 것으로 예상된다는 점을 고려해야한다. 긴 헤어핀 RNA를 설계할 때, 다이서 가공처리된 효과기 서열은 5' U 또는 A를 포함할 것이고 그렇게 함으로써 AGO2 내로 편입을 장려하는 가능성을 최대화하기 위해 (서열 번호: 40-78로부터의 서열 또는 이에 근접한 서열을 이용하여) 효과기 서열의 정확한 선택을 변형하는 것이 때로는 유리하다.
개별적인 프로모터 또는 단일 프로모터로 각각의 [효과기 서열-효과기 상보 서열] 쌍의 발현을 조절할지 안할지에 대한 선택은 다수의 요인에 의존한다. 단일 프로모터는 프로모터 간의 간섭을 최소화하는 데에 활용될 수 있다. 오로지 단일 프로모터만 가진 ddRNAi 구조체는 또한 크기가 더 작고, 이는 생성 (가령 대장균(E.coli)에서의 복제) 및 전달 동안에 모두, 경우에 따라서 구조체의 안정성에 중요할 수 있다. 추가로, 단일 프로모터의 이용은 프로모터 간에 임의의 상동 재조합의 가능성을 방지한다.
각각의 효과기 서열 또는 상보체의 발현의 조절 정도가 요구되는 경우에, 다수의 프로모터를 갖는 ddRNAi 구조체를 설계하는 것이 유리하고, 그리고 이에 의해 각각의 [효과기 서열 - 효과기 상보 서열] 쌍의 발현이 별개의 프로모터에 의해 조절된다. 효과기 서열이 상이한 서열인 경우에, 서열의 성질은 하나의 서열이 더욱 높은 발현 수준까지 발현된다는 것을 의미할 것이다. 각각의 효과기 서열의 더욱 동일한 발현 수준을 보장하는 것이 바람직할 때, 더욱 높게 발현되는 효과기 서열은 더 약한 프로모터와 쌍을 이룰 수 있고 그 반대의 경우도 될 수 있다. 더욱이, 전사되어야 할 어느 하나의 서열의 길이가 pol III 프로모터에 대해 특히 더 짧기 때문에, 더욱 효과적인 발현이 성취될 수 있다. 다수의 프로모터가 이용될 때, 모든 프로모터가 발현 카세트에서 그들 사이에서 임의의 상동 재조합의 위험을 최소화하기 위해 동일한 것은 아니라는 점이 바람직하다. 2개의 프로모터의 경우에 각각은 바람직하게는 상이하다. 3개의 프로모터의 경우에, 적어도 2개가 그리고 선택적으로 3개 모두 서로 상이하다.
효과기 서열을 인코딩하는 DNA 서열은 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된다. 서열은 또 다른 뉴클레오티드 서열과의 기능적 관계에 있을 때 또 다른 뉴크레오티드 서열에 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들어, 코딩 서열이 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된다면, 이것은 일반적으로 프로모터가 코딩 서열의 전사를 촉진할 수 있다는 점을 의미한다. 작동가능하게 연결된다는 연결되는 DNA 서열이 전형적으로 근접하고, 2개의 단백질 코딩 영역을 연결할 필요가 있는 경우, 근접하고 그리고 해독틀(reading frame) 내에 있는 것을 의미한다. 하지만, 인핸서는 여러 가지 킬로베이스(kilobase)에 의해 프로모터로부터 분리될 때 기능할 수 있고 인트론 서열은 가변적인 길이일 수 있기 때문에, 몇 가지 뉴클레오티드 서열은 작동가능하게 연결될 수 있지만, 근접하지는 않다.
"프로모터" 또는 "프로모터 서열" 또는 "프로모터 요소"는 일반적으로, 세포에서 RNA 폴리머라아제를 결합시킬 수 있고 임의의 RNA 폴리머라아제의 임의의 종류에 의해 전사된 RNA의 임의의 종류 또는 mRNA와 같은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 코딩 서열의 전사를 개시할 수 있는 DNA 조절 영역이다. 프로모터 및 종결자는 상이한 유전자로부터 수득될 수 있지만, 전형적으로 서로 일치된다; 즉, 프로모터 및 종결자 요소는 그들이 자연적으로 발생하는 동일한 유전자로부터 수득된다. 프로모터는 또한, 더 약하거나 더 강한 수준의 전사를 얻기 위해 분자 기술을 이용하여, 또는 그렇지 않으면, 가령 조절 요소의 변형을 통하여 변형될 수 있고 또는 변형되지 않을 수도 있다.
프로모터에 대해 참조될 때 용어 "구성적인"은 프로모터가 특이적인 자극 (가령, 열충격, 화학물질, 빛 등)의 부재에서 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 전사를 유도할 수 있다는 점을 의미한다. 전형적으로, 구성적인 프로모터는 실질적으로 임의의 세포 및 임의의 조직에서 코딩 서열의 발현을 유도할 수 있다. 바람직하게 ddRNAi 작용제를 전사하는 데에 이용된 프로모터는 RNA 폴리머라아제 II에 의해 조절되는 유비퀴틴, CMV, β-액틴, 히스톤 H4, EF-1알파 또는 pgk 유전자, 또는 RNA 폴리머라아제 I에 의해 조절되는 프로모터 요소에 대한 프로모터와 같은, 구성적인 프로모터이다. 다른 구체예에서, Pol II 프로모터, 가령 CMV, SV40, U1, hAAT, β-액틴 또는 하이브리드 Pol II 프로모터가 이용된다. 다른 구체예에서, RNA 폴리머라아제 III에 의해 조절된 프로모터 요소, 가령 U6 프로모터 (가령 U6-1, U6-8, U6-9), H1 프로모터, 7SL 프로모터, 인간 Y 프로모터 (hY1, hY3, hY4 (Maraia et al., (1994)를 참고) 및 hY5 (Maraia et al., (1994)를 참고), 인간 MRP-7-2 프로모터, 아데노바이러스 VA1 프로모터, 인간 tRNA 프로모터, 5S 리보솜 RNA 프로모터, 그리고 기능적 혼성체 및 이들 프로모터의 임의의 조합이 이용된다. 이들 프로모터 모두의 변이체도 또한 활용될 수 있고, 여기서 프로모터는 이의 활성이 증가되거나 감소되도록 변형된다. 예를 들어, 강한 프로모터가 이에 작동가능하게 연결된 서열의 너무 과도한 발현을 야기한다면, 이의 활성은 감소되도록 변형될 수 있다.
U6 프로모터가 이용될 때, 프로모터에 작동가능하게 연결된 DNA 서열은 구아닌 (G) 염기로 시작하는 것이 바람직하다; H1 프로모터가 이용될 때, 프로모터에 작동가능하게 연결된 DNA 서열은 아데닌 (A) 염기로 시작하는 것이 바람직하다. 따라서 핵산의 서열은 다른 것보다 하나의 프로모터의 이용이 선호될 수 있다.
대안으로 몇 가지 구체예에서, ddRNAi 구조체로부터 발현되는 다수의 ddRNAi 작용제의 유도가능한 발현을 허용하는 프로모터를 선별하는 것이 최적일 수 있다. 이러한 프로모터를 이용하여 유도가능한 발현을 위한 다수의 시스템이 해당 분야에 공지되며, 테트라사이클린 반응 시스템 및 락크(lac) 작동자-억제자 시스템 (WO 03/022052 A1 공개공보; 및 미국 특허 공개공보 2002/0162126 A1을 참고), 엑다이손(ecdyson) 조절 시스템, 또는 글루코코르티코이드, 프로게스틴, 에스트로겐, RU-486, 스테로이드, 갑상선 호르몬, 환형 AMP, 사이토카인, 조절자의 칼시페롤 패밀리, 또는 (아연 또는 카드뮴과 같은 무기성 금속에 의해 조절되는) 메탈로티오네인 프로모터에 의해 조절되는 프로모터를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 몇 가지 구체예에서 유용한 프로모터는 조직-특이적 또는 세포-특이적일 수 있다. 프로모터에 적용되는 바와 같은 용어 "조직-특이적"은 상이한 유형의 조직 (가령, 뇌)에서 동일한 관심 뉴클레오티드 서열의 발현의 부재와 비교하여 특이적인 유형의 조직에 관심 뉴클레오티드 서열의 선별적인 발현을 유도할 수 있는 프로모터를 나타낸다. 프로모터에 적용되는 바와 같은 용어 "세포-특이적"은 동일한 조직 내의 상이한 유형의 세포에서 동일한 관심 뉴클레오티드 서열의 발현의 부재와 비교하여 특이적인 유형의 세포에서 관심 뉴클레오티드 서열의 선별적인 발현을 유도할 수 있는 프로모터는 나타낸다. 프로모터에 적용될 때 용어 "세포-특이적"은 또한 단일 조직 내의 영역에서 관심 뉴클레오티드 서열의 선별적인 발현을 촉진할 수 있는 프로모터를 의미한다. 대안으로, 프로모터는 구성적이거나 조절가능할 수 있다. 추가로, 프로모터는 상이한 특이성을 보유하기 위하여 변형될 수도 있다.
본 발명에서 특정하게 유용한 세포 특이적인 프로모터의 예시는 RPE 세포 특이적 프로모터 RPE-65 및 VMD2, 그리고 맥락막 내피-특이적 프로모터 FLT-1 또는 ICAM2를 포함한다.
상기 언급된 바와 같이, 인핸서 요소는 본 발명의 ddRNAi 구조체에 선택적으로 포함된다.
ddRNAi 발현 카세트 또는 구조체가 하나 보다 더 많은 종결 서열 또는 요소를 함유할 때, 종결 서열 또는 요소는 동일하거나, 상이할 수 있고, 또는 임의의 카세트 내에서 오로지 한 번 나타난 종결 요소와 2회 이상 나타난 종결 요소의 조합이 있을 수 있다. 어떠한 종결 서열 또는 요소가 이용되더라도, 그들은 이용된 간-특이적 프로모터와 그들이 적절하게 작동한다는 점을 보장하도록 선별되어야 한다. 예를 들면 Pol I, Pol II 또는 Pol III 프로모터가 이용되는 경우, 적절한 종결 서열이 이용되어야 한다. 본 발명에서 유용한 종결 요소는 U1 종결 서열 (U1 박스), 합성 폴리A 종결자, 및 소위 최소 폴리A 종결자를 포함한다. 전사 중지 부위, 가령 MAZ1 및 MAZ2 (Ashfield et al EMBO J 1994 Vol13 No 23 5656 pp 및 Yonaha and Proudfoot EMBO J. 2000 Jul. 17;19(14):3770-7을 참고)는 폴리아데닐화 및 전사 종결의 커플링을 보조하기 위해 폴리A 종결자의 상류영역에 삽입될 수 있다. Pol III 프로모터에 대하여, 서열 TTTT, TTTTT 또는 TTTTTT가 종결자로서 흔히 이용된다. 이들 경우에 전사체는 서열 UU에 의해 전형적으로 종결된다.
ddRNAi 작용제 발현 구조체
ddRNAi 작용제는 'ddRNAi 구조체'로서 본 명세서에서 언급된 임의의 적합한 벡터 또는 ddRNAi 구조체 내로 삽입된 DNA 발현 카세트로부터 발현될 수 있다. AMD에 대한 치료제를 개발하려는 과거의 도전은 되풀이되는 투여의 요구 없이 장기간 발현을 보장하기 위해 정확한 세포의 효율적이고 균일한 형질도입이었다.
구조체의 벡터 골격이 전달 시스템과 양립할 수 있을 때, ddRNAi 발현 구조체는 또한 전달 구조체이다. 특히 바람직한 전달 구조체는 바이러스 벡터이다. 세포 내로부터 치료학적 ddRNAi 작용제를 생성하는 발현 구조체를 전달하기 위한 아데노-연관 바이러스 (AAV), 아데노바이러스 (Ad) 또는 렌티바이러스 (LV)와 같은, 바이러스 벡터의 용도는 표면-발현 톨-유사 수용체 3과 핵산의 직접적인 상호작용에 의해 종종 야기되는 인터페론 반응을 방지한다. 이것은 임상 시험에서 siRNA-기반 안구 약물의 다수의 실패에 대한 주된 원인이다.
본 발명의 경우에, 본 발명의 ddRNAi 작용제는 망막층 깊은 곳에 있는 망막 색소 상피 (RPE) 세포 또는 다른 세포에 도달하도록 요구된다. 이 효과를 위하여, 본 발명은 유리체내 주사후 RPE 층을 투과할 수 있도록 쥣과 모델에서 보여준, 변형된 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터를 활용한다. 야생형인, 비변형 AAV 혈청형은 이 경로를 통하여 눈 안으로 도입될 때 세포의 서로 접한 층보다도 더 형질도입하는 능력이 제한되었다. 이러한 이유 때문에, 본 발명에서 변형된 AAV 벡터가 활용되는 것이 바람직하다.
예를 들어, AAV 균주의 위치 지정 돌연변이가 티로신 잔기를 치환하는 데에 이용되었고, 이는 증가된 형질도입을 초래한다 (Li Zhong, Baozheng Li, Cathryn S. Mah, (2008) Proc Natl Acad Sci U S A. 105(22): 7827-7832). AAV 벡터와 유사한 변형은 유리체내 주사 후 망막의 모든 층을 가로질러 형질도입할 수 있는 벡터를 생성하였다 (Hilda Petrs-Silva, Astra Dinculescu, Qiuhong Li et al. (2009) Mol Ther. 17(3): 463-471). 이와 유사하게, AAV 벡터내 특이적인 세린, 트레오닌 또는 리신 잔기는 숙주 세포 키나아제/유비퀴틴화/프로테아좀 기계를 피하기 위해 그리고 형질도입 효능을 유의적으로 증가시키기 위해 변형되었다 (Gabriel N, Hareendran S, Sen D et al. (2013) Hum Gene Ther Methods. 2013 (2):80-93). AAV 캡시드 돌연변이체의 라이브러리를 발생시키는 방법은 감소된 면역원성 또는 특이적인 표적 조직에 대한 증가된 조직 특이성의 바람직한 특성을 가진 변이체를 단리시키기 위해 스크리닝될 수 있다. 최근에, Schaffer et al은 7량체(7mer) 펩티드가 캡시드 서열 내로 삽입된 AAV 돌연변이 벡터의 유리체내 주사 후 광범위한 망막투과 전달을 보여줄 수 있었다 (Dalkara, D., L.C. Byrne, R.R. Klimczak et al. (2013) Science Translational Medicine, 5:189ra76).
전형적으로, AAV의 게놈은 오로지 2개의 유전자를 함유한다. "rep" 유전자는 DNA 복제에서 활용되는 적어도 4개의 개별적인 단백질을 코딩한다. "cap" 유전자 산물은 바이러스의 캡시드를 포함하는 3개의 단백질을 발생시키기 위해 차등을 두어 스플라이싱된다. 게놈을 발생기 바이러스 내로 포장할 때, 오로지 역 말단 반복부위 (ITR)만 절대 서열(obligate sequence)이고; rep 및 cap은 게놈으로부터 삭제될 수 있고 선택된 이형 서열로 교체될 수 있다. 하지만, 복제해야 할 필요가 있는 단백질을 생성하고 발생기 비리온 내로 AAV-기반 이형 구조체를 포장하기 위하여, rep 및 cap 단백질은 트랜스(trans)로 제공되어야 한다. 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스와 같은 보조 바이러스로의 공동-감염에 의해 일반적으로 제공되는 보조 기능도 또한 하나 이상의 DNA 발현 플라스미드의 형태에서의 트랜스로 제공될 수 있다. 일반적으로 게놈은 오로지 2개의 유전자만 인코딩하기 때문에 전달 비히클로서, AAV가 4.5 단일 가닥 킬로베이스 (kb)의 포장 수용력으로 제한된다는 점이 놀라운 것은 아니다. 하지만, 이 크기 제한은 대체 유전자 치료법을 위해 전달될 수 있는 유전자를 제한할 수도 있지만, ddRNAi 벡터와 같은 더 짧은 서열의 포장 및 발현에 악영향을 주지 않는다.
본 발명은 AMD 연관 유전자에서 하나 이상의 표적 서열의 발현을 저해하기 위한 ddRNAi 작용제를 발현하는 것에 따라 ddRNAi 발현 카세트를 포함한 ddRNAi 발현 구조체를 제공하고, 상기 발현 카세트는 (특정한 순서 없이)
하나 이상의 프로모터 서열
하나 이상의 효과기 서열을 인코딩하는 하나 이상의 DNA 서열,
하나 이상의 효과기 상보 서열을 인코딩하는 하나 이상의 DNA 서열;
그리고 선택적으로
하나 이상의 종결 서열
루프 서열, 스페이서 서열, 또는 둘 모두를 인코딩하는 하나 이상의 DNA 서열
하나 이상의 인헨서 서열을 포함하고,
여기서 구조체는 바이러스 전달 구조체이고, 바람직하게 바이러스 전달 구조체는 AAV 변형 벡터이다.
바람직하게 발현 카세트는 ddRNAi 작용제가 miRNA 구조의 일부로서 또는 상기 구조 내에서 발현되도록 ME 서열을 추가로 포함한다.
바람직한 구체예에서, 바이러스 전달 구조체의 발현 카세트는 AMD-연관 유전자 VEGRF-2의 5' UGUAACAGAUGAGAUGCUCCA 3' (서열 번호: 56) 내에서 임의의 10개 이상의 근접 뉴클레오티드의 제1 효과기 서열 그리고 AMD-연관 유전자 VEGF-A의 5' UAUGUGGGUGGGUGUGUCUAC 3' (서열 번호: 47) 내에서 임의의 10개 이상의 근접 뉴클레오티드의 제2 효과기 서열을 인코딩하는 2개의 DNA 서열을 포함한다.
바이러스 전달 후 본 발명의 ddRNAi 작용제의 발현은 약물의 단일 투여에서부터, 잠재적으로 환자의 수명까지 지속 가능할 것이다. 이에 따라, 본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명에 따라 ddRNAi 발현 카세트가 삽입되는 바이러스 벡터를 포함한 ddRNAi 치료제가 제공된다. 바람직하게 발현 카세트는 본 명세서 전체 걸쳐 설명된 조합 및 구체예에서 선택된 긴 헤어핀 구조 또는 다중 헤어핀 구조 중 한 가지로서, 다수의 ddRNAi 작용제에 대해 인코딩한다. 바람직한 구체예에서, ddRNAi 작용제의 효과기 서열 및 효과기 상보 서열은 miRNA 구조 내에서 발현된다.
전형적으로, 바이러스 벡터의 생성에서, 바이러스의 정상적인 내생 유전자는 게놈으로부터 삭제될 수 있고 선택된 이형 서열로 교체될 수 있다. 하지만, 복제해야할 필요가 있는 단백질을 생성하고 발생기 비리온 내로 바이러스-기반 이형 구조체를 포장하기 위하여, 게놈으로부터 제거된 바이러스 단백질은 트랜스로 제공되어야 한다. 구조체의 발생은 PCR의 표준 기술, 올리고뉴클레오티드 합성, DNA 합성, 제한 효소 절단, 결찰, 형질전환, 플라스미드 정제, 및 DNA 서열화를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 해당 분야에 잘 공지된 임의의 적합한 유전자 조작 기술을 이용하여 완수될 수 있다. 바이러스 구조체는 또한, 바이러스의 복제 및 전파를 허용하는 유전자를 함유할 수 있지만, 바람직한 구체예에서, 이러한 유전자는 트랜스로 공급될 것이다. 추가적으로, ddRNAi 구조체는 원래의 형태로 편입된 또는 변형된 임의의 공지된 유기체의 게놈으로부터의 유전자 또는 유전적 서열을 함유할 수 있다. 예를 들어, 바람직한 바이러스 구조체는 박테리아에서 구조체의 복제에 유용한 서열을 포함한다.
바이러스 기반 ddRNAi 구조체의 발생 후, 구조체는 바이러스 입자 내로 포장된다. 해당 분야에 공지된 임의의 방법은 감염성 바이러스 입자를 생성하는 데에 이용될 수 있고 상기 바이러스 입자의 게놈은 바이러스 ddRNAi 구조체의 복사체를 포함한다. 한 가지 방법은 조직 유입을 위한 바이러스-유래 리간드 또는 인공 리간드 그리고 특정한 바이러스 전달 시스템에 필수적이거나 바람직한 다른 서열 (예를 들어, 복제에 필요한 서열, 구조적 단백질 및 바이러스 어셈블리)뿐만 아니라, 바이러스 입자 내로 바이러스 ddRNAi 구조체의 편입에 요구되는 바이러스 단백질을 트랜스로 안정하게 발현하는 패키징 세포(packaging cell)를 활용한다. 패키징 세포 내로 바이러스 ddRNAi 구조체의 형질감염 후, 그 다음, 패키징 세포는 바이러스 서열을 복제하고 바이러스 단백질을 발현하고 그리고 감염성 바이러스 입자 내로 ddRNAi 발현 구조체를 포장한다. 패키징 세포주는 바이러스 단백질을 발현할 수 있는 임의의 세포주일 수 있고, 상기 세포주는 293, HeLa, A549, PerC6, D17, MDCK, BHK, 빙 체리(bing cherry), 피닉스(phoenix), Cf2Th, 또는 해당 분야의 통상의 기술자에게 공지된 또는 상기 기술자에 의해 개발된 임의의 다른 세포주를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 한 가지 패키징 세포주는 예를 들어, 미국 특허 번호 제6,218,181호에서 설명된다.
대안으로, 필수적인 바이러스 단백질을 안정하게 발현하지 않는 세포주는 기능적 입자의 효율적인 생성을 성취하기 위해 하나 이상의 구조체와 공동-형질감염될 수 있다. 구조체들 중 하나는 바이러스 기반 ddRNAi 구조체이다; 다른 구조체는 세포가 기능적 바이러스 그리고 다른 보조 기능체를 생성하도록 하는 데에 필수적인 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함한다.
패키징 세포주 또는 복제 및 패키징 구조체는 엔벨로프 유전자(envelope gene) 산물을 발현할 수 없다. 이들 구체예에서, 엔벨로프 유전자를 인코딩하는 유전자는 바이러스 기반 ddRNAi 구조체로 공동-형질감염된 별개의 구조체 상에 제공될 수 있다. 엔벨로프 단백질이 바이러스 입자의 숙주 범위를 어느 정도는 차지하므로, 바이러스는 위형이 될수 있다. 상기 설명된 바와 같이, "위형" 바이러스는 게놈이 유래되는 바이러스 외의 바이러스로부터의 엔벨로프 단백질을 가진 바이러스 입자이다. 해당 분야의 통상의 기술자는 이용되는 바이러스 전달 시스템 그리고 표적되어야할 세포에 대한 적절한 위형을 선택할 수 있다.
특이적인 숙주 범위를 부여하는 것에 더불어, 선택된 위형은 바이러스가 매우 높은 역가로 농축되도록 할 수 있다. 바이러스는 대안으로, 특이적인 종에 감염을 제한하는 동종지향성(ecotropic) 엔벨로프 단백질로 위형이 될수 있다 (가령, 동종지향성 엔벨로프는 예를 들어, 오로지 쥣과 세포의 감염을 허용하고, 반면에 양종지향성(amphotropic) 엔벨로프는 가령 인간과 쥣과 세포 모두의 감염을 허용한다). 추가로, 유전적으로-변형된 리간드는 세포-특이적 표적화를 위해 이용될 수 있다.
패키징 세포주의 생성 후, ddRNAi 발현 카세트를 함유한 바이러스 입자는 정제되고 정량화된다 (적정됨). 정제 전략은 밀도 구배 원심분리, 또는, 바람직하게, 칼럼 크로마토그래피 방법을 포함한다.
방법
본 발명의 siRNA 작용제의 ddRNAi 구조체인, ddRNAi 작용제의 투여는 망막 내에 세포에서 발현되는 유전자의 발현을 저해한다. 이에 따라, 본 발명의 또 다른 측면에서, 개체에서 AMD를 치료하는 방법이 제공되고 상기 방법은 치료가 필요한 환자에게 ddRNAi 구조체의 치료학적 유효량을 투여하는 것을 포함하고, 여기서 ddRNAi 작용제는 AMD-연관 유전자, 바람직하게는 VEGF-A 유전자에서 하나 이상의 표적 서열의 발현을 저해한다. 바람직하게, 치료되어야 할 AMD는 습성 AMD이다.
환자에게 투여되어야 할 ddRNAi 작용제는 다음 중 하나 이상일 수 있다:
● 제1 효과기 서열; 및 제1 효과기 상보 서열을 포함하는 ddRNAi 작용제; 여기서 효과기 서열은 하나 이상의 표적 서열의 전사체내 하나 이상의 표적 영역과 실질적으로 상보적임
● 5'에서 3'으로의 방향으로, 제1 효과기 서열; 제2 효과기 서열; 제2 효과기 상보 서열; 및 제1 효과기 상보 서열을 포함하는 ddRNAi 작용제, 여기서 각각의 효과기 서열은 하나 이상의 표적 서열의 전사체내 하나 이상의 표적 영역과 실질적으로 상보적임
● 5'에서 3'으로의 방향으로, 제1 효과기 서열; 제2 효과기 서열; 제3 효과기 서열; 제3 효과기 상보 서열; 제2 효과기 상보 서열; 및 제1 효과기 상보 서열을 포함하는 ddRNAi 작용제, 여기서 각각의 효과기 서열은 하나 이상의 표적 서열의 전사체내 하나 이상의 표적 영역과 실질적으로 상보적임
● 5'에서 3'으로의 방향으로, 제1 효과기 서열; 제1 효과기 상보 서열; 제2 효과기 서열; 및 제2 효과기 상보 서열을 포함하는 ddRNAi 작용제, 여기서 각각의 효과기 서열은 하나 이상의 표적 서열의 전사체내 하나 이상의 표적 영역과 실질적으로 상보적임
● 5'에서 3'으로의 방향으로, 제1 효과기 서열; 제1 효과기 상보 서열; 제2 효과기 서열; 제2 효과기 상보 서열; 제3 효과기 서열; 및 제3 효과기 상보 서열을 포함하는 ddRNAi 작용제; 여기서 각각의 효과기 서열은 하나 이상의 표적 서열의 전사체내 하나 이상의 표적 영역과 실질적으로 상보적임
● 5'에서 3'으로의 방향으로, 제1 효과기 서열; 제2 효과기 서열; 2 내지 100개의 비-자가-상보적 뉴클레오티드의 루프 서열; 제2 효과기 상보 서열; 및 제1 효과기 상보 서열을 포함하는 ddRNAi 작용제, 여기서 각각의 효과기 서열은 하나 이상의 표적 서열의 전사체내 하나 이상의 표적 영역과 실질적으로 상보적임
● 5'에서 3'으로의 방향으로, 제1 효과기 서열; 2 내지 100개의 비-자가-상보적 뉴클레오티드의 루프 서열; 제1 효과기 상보 서열; 제2 효과기 서열; 2 내지 100개의 비-자가-상보적 뉴클레오티드의 루프 서열; 및 제2 효과기 상보 서열을 포함하는 ddRNAi 작용제, 여기서 각각의 효과기 서열은 하나 이상의 표적 서열의 전사체내 하나 이상의 표적 영역과 실질적으로 상보적임
● 5'에서 3'으로의 방향으로, 제1 효과기 서열; 2 내지 100개의 비-자가-상보적 뉴클레오티드의 루프 서열; 제1 효과기 상보 서열; 2 내지 100개의 비-자가-상보적 뉴클레오티드의 스페이서 서열; 제2 효과기 서열; 2 내지 100개의 비-자가-상보적 뉴클레오티드의 루프 서열; 및 제2 효과기 상보 서열을 포함하는 ddRNAi 작용제, 여기서 각각의 효과기 서열은 하나 이상의 표적 서열의 전사체내 하나 이상의 표적 영역과 실질적으로 상보적임
● 5'에서 3'으로의 방향으로, 제1 효과기 서열; 제1 효과기 상보 서열; 2 내지 100개의 비-자가-상보적 뉴클레오티드의 스페이서 서열; 제2 효과기 서열; 제2 효과기 상보 서열; 2 내지 100개의 비-자가-상보적 뉴클레오티드의 스페이서 서열; 제3 효과기 서열; 및 제3 효과기 상보 서열을 포함하는 ddRNAi 작용제
● miRNA 구조 내에서 또는 상기 구조의 일부로서 상기 언급된 ddRNAi 작용제 중 어느 하나.
해당 분야의 통상의 기술자에 의해 이해되고, 도면에서 설명되는 바와 같이, 임의의 특정한 효과기 서열은 ddRNAi 작용제에서 이의 상보체와 위치가 바뀔 수 있다. 상기 설명 구체예 각각의 특정한 형태에서, 각각의 효과기 서열은 서열 번호: 40-78 중 어느 하나로부터의 서열 내에서 임의의 10개 이상 그리고 바람직하게는 임의의 17개 이상의 근접 뉴클레오티드로 구성된 군에서 선택된 적어도 17개 뉴클레오티드 길이이다. 효과기 서열은 모두 동일하거나 모두 상이할 수 있고, 또는 가령 서열 번호: 47의 적어도 10개의 근접 뉴클레오티드의 효과기 서열 2개 그리고 (예를 들어) 서열 번호: 56의 적어도 10개의 근접 뉴클레오티드의 효과기 서열 1개의 조합일 수 있다.
바람직하게, 효과기 서열은 번호: 40-78 중 어느 하나 내에서 임의의 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 근접 뉴클레오티드, 그리고 가장 바람직하게는 서열 번호: 40-78 중 어느 하나 내에서 17개 이상의 근접 뉴클레오티드로 구성된 군에서 선택된다. 전형적으로, 효과기 상보체는 동일한 길이일 것이고, 또는 거의 동일한 길이 (즉 ± 15% 뉴클레오티드 길이, 또는 전체 길에 따라 1 내지 3개의 뉴클레오티드가 상이함)일 것이다.
이들 ddRNAi 작용제 각각은 본 명세서의 이전 부문에서 설명된 바와 같이, ddRNAi 구조체내 ddRNAi 발현 카세트를 통해 투여될 수 있다. 바람직하게 ddRNAi 구조체는 눈의 뒤쪽에서 RPE 세포에 대해 구조체의 표적화를 가능하게 하는 AAV 기반 구조체이다. 다중 표적화는 각각 단일 ddRNAi 작용제를 발현할 수 있는 2개 이상의 ddRNAi 발현 카세트 또는 구조체를 전달함으로써, 또는 대안으로, 그리고 가장 바람직하게, 하나 보다 많은 ddRNAi 작용제를 발현할 수 있는 하나의 ddRNAi 발현 카세트 또는 구조체를 전달함으로써 성취될 수 있다.
대안적인 구체예에서, 효과기 서열 각각은 하나 이상의 표적 서열의 전사체내 하나 이상의 표적 영역과 100% 상보적일 수 있고, 또는 오로지 1, 2, 3, 4 또는 5개의 뉴클레오티드에 의해서만 달라질 수도 있다.
AMD를 치료하는 방법은 AMD의 증상을 가진 그리고 치료를 필요로 하는 개체를 식별하는 예비 단계를 선택적으로 포함할 수 있다. 식별 단계는 습성 AMD 또는 건조 AMD를 가진 개체를 구별하여 진단하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 ddRNAi 작용제의 더 장기간이거나 안정한 공급을 위하여, ddRNAi 작용제는 본 발명의 ddRNAi 구조체를 통해, 즉 세포에 전달되는 적합한 벡터 내로 삽입된 ddRNAi 발현 카세트로부터 ddRNAi 작용제의 생체내 발현을 통해 제공된다. ddRNAi 발현 카세트는 다음을 포함한다:
하나 이상의 프로모터 서열
서열 번호: 40-78로부터의 서열 내에서 임의의 10개 이상의 근접 뉴클레오티드를 인코딩하는 서열로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 DNA 서열;
하나 이상의 효과기 상보 서열을 인코딩하는 하나 이상의 DNA 서열;
그리고 선택적으로
하나 이상의 종결 서열
루프 서열, 스페이서 서열 또는 이 둘 모두를 인코딩하는 하나 이상의 DNA 서열
하나 이상의 인헨서 서열.
본 명세서에서 이전에 약술된 바와 같이, ddRNAi 발현 카세트의 이들 성분은 상이한 5'에서 3'으로의 배열을 가질 수 있고, 이들 모두 본 발명의 방법에서 이용하기에 적합하다. 발현 카세트는 또한 바람직하게, miRNA 구조를 형성할 수 있는 서열을 인코딩하는 DNA 서열을 포함한다.
바람직하게, 본 발명의 방법에서 표적 AMD-연관 유전자는 VEGF-A이다. 이에 따라, 본 발명의 한 가지 구체예에서, ddRNAi 작용제는 VEGF-A 유전자에서 하나 이상의 표적 서열의 발현을 저해한다. 제1 효과기 서열에 대해 인코딩하는 DNA 서열은 표 1에서 열거된 서열 번호: 40-49로부터의 서열 내에서 임의의 10개 이상의 근접 뉴클레오티드의 서열을 인코딩하는 ddRNAi 효과기에서 바람직하게 선택된다. 대안으로, 앞서 설명된 바와 같이, 효과기 서열에 대해 인코딩하는 서열은 표적 서열과 염기쌍을 이루고 VEGF-A 표적 서열의 발현을 저해하는 인코딩된 서열의 능력에 영향을 주는 것 없이 1, 2, 3, 4 또는 5개의 뉴클레오티드에 의해 서열 번호: 40-49에서 달라질 수 있다.
전형적으로, 각각의 효과기 서열은 상응하는 효과기 상보 서열과 이중 가닥 영역을 형성한다.
대안적인 구체예에서, 본 발명의 방법에서 표적 AMD-연관 유전자는 VEGFR2, CFB 및 PDGFR-β 중 하나 이상이다.
대안적인 구체예에서, 개체에서 AMD를 치료하는 방법은 AMD 연관 유전자에서 하나 이상의 표적 서열의 발현을 저해하고, 방지하고 또는 감소시키기 위해, 하나 보다 더 많은 효과기 서열, 가령 서열 번호: 40-78로서 상기 열거된 것들을 가진 ddRNAi 작용제를 인코딩하는 ddRNAi 구조체의 치료학적 유효량의 투여를 포함한다.
본 발명의 치료 방법 중 어느 하나에서, 환자는 또한, 다른 치료를 받을 수도 있고, 따라서 투여되는 ddRNAi 구조체는 부가적인 치료법이 된다.
AMD, 그리고 특히 습성 AMD는 맥락막 신생혈관 (CNV)으로서 종종 언급되는 과정에서 망막 뒤에 위치된 맥관 구조로부터의 혈관의 비정상적인 돌출로 특징 지어진다. 따라서 CNV를 조절하는 것은 습성 AMD를 앓는 환자에게 긍정적인 영향을 미친다. 이에 따라, 본 발명의 또 다른 측면은 개체에서 맥락막 신생혈관을 치료하는 방법이고, 상기 방법은 치료가 필요한 환자에게 본 발명의 ddRNAi 작용제, 발현 카세트 또는 구조체의 치료학적 유효량의 투여를 포함하며, 여기서 ddRNAi 작용제는 VEGF-A, VEGFR2, CFB 및 PDGFR-β 중 하나 이상에서 하나 이상의 표적 서열의 발현을 저해한다. 이들 유전자 각각은 혈관신생, 신혈관 형성, 또는 VEGF 경로에서의 그들의 역할에 의한 관심 표적이다.
AMD의 발병에서 또 다른 중요 인자는 드루젠이라고 불리우는 눈 밑부분에서의 세포외 침착물의 형성이다. 이들 침착물은 황반의 일그러짐에 기여하고 또한, 신혈관 형성의 역할을 할 수도 있다. CFB는 드루젠의 성분이다. 따라서, CFB 유전자를 표적하여 이의 단백질 산물의 발현을 저해하는 것은 침착되는 드루젠의 양을 감소시킬 수 있고, 따라서 AMD를 앓는 환자에게 긍정적인 영향을 미칠 수 있다. 따라서 개채에서 드루젠 침착물을 감소시키는 방법이 제공되고 상기 방법은 치료가 필요한 환자에게 본 발명의 ddRNAi 작용제, 발현 카세트 또는 구조체의 치료학적 유효량의 투여를 포함하며, 여기서 ddRNAi 작용제는 CFB에서 하나 이상의 표적 서열의 발현을 저해한다.
그러므로, VEGF-A, VEGFR2, CFB 및 PDGFR-β의 조합을 표적함으로써 드루젠 침착을 저해하기 위한 탐구와 함께, 혈관신생을 최소화시키고 따라서 CNV를 최소화하기 위한 탐구는 해당 분야에서 이전에는 고려되지 않았었던, AMD, 특히 습성 AMD에 대한 다면적인 공격 전략을 제공하고 그리고 AMD의 진행을 멈추게하는 것뿐만 아니라, 시력을 회복시키는 것도 모색한다.
몇 가지 경우에, 통합되거나 안정하게 유지된 ddRNAi 구조체로부터 ddRNAi 작용제의 장기간 발현과는 대조적으로 ddRNAi 작용제 또는 siRNA 작용제의 일시적인 존재에 의존하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 치료에 대한 환자의 내성이 우선 결정되어야 한다. 이 경우에, 시험관 내에서 생성된 본 발명의 ddRNAi 작용제 또는 siRNA 작용제가 투여될 수 있다.
본 발명의 추가적인 측면에서, AMD를 치료하고, CNV를 치료하고, 드루젠 침착을 최소화하고 또는 AMD의 증상을 완화시키기 위하여, AMD 연관 유전자에서 하나 이상의 표적 서열의 발현을 저해하고, 방지하고 또는 감소시키기 위한 활성 성분으로서 ddRNAi 구조체, ddRNAi 작용제 또는 siRNA 작용제를 포함한 조성물이 제공된다.
본 발명의 추가적인 측면에서, AMD를 치료하고, CNV를 치료하고, 드루젠 침착을 최소화하고 또는 AMD의 증상을 완화시키기 위하여, AMD 연관 유전자에서 하나 이상의 표적 서열의 발현을 저해하고, 방지하고 또는 감소시키기 위한 ddRNAi 구조체, ddRNAi 작용제 또는 siRNA 작용제의 용도가 제공된다. 유사하게, AMD를 치료하고, CNV를 치료하고, 드루젠 침착을 최소화하고 또는 AMD의 증상을 완화시키기 위하여, AMD 연관 유전자에서 하나 이상의 표적 서열의 발현을 저해하고, 방지하고 또는 감소시키기 위한 약의 제조에서 ddRNAi 구조체, ddRNAi 작용제 또는 siRNA 작용제의 용도가 제공된다.
바람직하게 AMD는 습성 AMD이다.
본 발명의 방법에서 이용된 ddRNAi 구조체, ddRNAi 작용제 또는 siRNA 작용제의 하나 이상의 효과기 서열은 AMD-연관 표적 유전자 영역의 발현이 적어도 70% 저해될 수 있는 서열 내에서 임의의 10개 이상, 바람직하게는 임의의 17개 이상의 근접 뉴클레오티드를 포함한다. 바람직하게 하나 이상의 효과기 서열은 서열 번호: 40-78에서, 더욱 바람직하게 서열 번호: 40-59, 그리고 가장 바람직하게는 서열 번호: 40-49에서 선택된다.
본 발명의 방법 각각에서, 본 발명의 ddRNAi 작용제, ddRNAi 발현 카세트 또는 ddRNAi 발현 구조체는 망막하 주사도 활용될 수 있음에도 불구하고, 유리체내 주사에 의해 대상의 눈/눈들에 바람직하게 전달된다.
제약학적 조성물
본 발명의 ddRNAi 발현 카세트를 포함한 ddRNAi 작용제, siRNA 작용제 또는 벡터는 적절하고, 제약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와의 조합에 의해 제약학적 조성물로 조제될 수 있다. 이에 따라, AMD 연관 유전자에서 하나 이상의 표적 서열의 발현을 저해하고, 방지하고 또는 감소시키기 위한 본 발명의 ddRNAi 작용제, ddRNAi 발현 카세트, ddRNAi 구조체 또는 siRNA 작용제를 포함한 제약학적 조성물, 그리고 제약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제가 제공된다.
또 다른 구체예에서 본 발명은 AMD 연관 유전자에서 하나 이상의 표적 서열의 발현을 저해하고, 방지하고 또는 감소시키기 위한 주요 성분으로서 본 발명의 ddRNAi 작용제, ddRNAi 발현 카세트 또는 ddRNAi 발현 구조체의 유효량을 포함한 AMD 치료 조성물을 선택적으로, 제약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 함께, 제공한다.
제약학적 제형에서, ddRNAi 발현 카세트를 포함한 작용제 또는 벡터는 단독으로 또는 제약학적으로 활성인 다른 화합물과 공동으로 또는 조합하여 투여될 수 있다. 해당 분야의 통상의 기술자는 ddRNAi 발현 카세트를 포함한 작용제 또는 벡터에 대한 용량 수준은 전달 비히클의 성질의 기능, 표적 세포의 형질도입의 상대적인 편의성, 표적 세포에서 RNAi 작용제의 발현 수준 등에 따라 달라질 것이라는 점을 인식할 것이다.
본 발명의 ddRNAi 발현 카세트를 포함한 ddRNAi 작용제, siRNA 작용제 또는 벡터는 수성, 또는 비-수성 용매, 가령 오일, 합성 지방족 산 글리세라이드, 고급 지방족 산의 에스테르 또는 프로필렌 글리콜에서; 그리고 요망되는 경우, 가용화제, 등장제, 현탁제, 에멀젼화제, 안정화제 및 보존제와 같은 종래의 첨가제와 함께, 그들을 용해시키고, 현탁시키고 또는 에멀젼화시킴으로써 주사 또는 투여를 위한 제제로 조제될 수 있다.
대상의 눈/눈들에 본 발명의 제약학적 조성물을 투여하는 가장 바람직한 방식은 유리체내 주사에 의한 것이다. 투여의 대안적인 방법은 망막하 주사이다.
본 발명에 의해 고려되는 제약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제는 이용되는 투여량 및 농도에서 수여자에게 비독성인 임의의 희석제, 담체, 부형제, 및 안정화제를 포함하고, 그리고 완충제, 가령 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 아스코르빈산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제; 보존제 (가령 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 가령 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜타올; 및 m-크레솔); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 가령 혈장 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 폴리머, 가령 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 가령 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코오스, 만노오스, 또는 덱스트린을 비롯한 다른 탄수화물; 킬레이트제, 가령 EDTA; 당, 가령 수크로오스, 만니톨, 트레할로오스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온, 가령 나트륨; 금속 복합체 (가령 Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 가령 TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다.
일반적으로, 제제는 액상 담체 또는 미세하게 나뉜 고형 담체 또는 이 둘 모두와 활성 성분의 회합을 균일하게 그리고 밀접하게 야기함으로써, 그리고 필요하다면, 산물을 성형함으로써 제조된다. 주위 온도에서, 적절한 pH에서, 그리고 바람직한 순도에서, 생리학적으로 허용되는 담체, 즉 이용되는 투여량 및 농도에서 수여자에게 비-독성인 담체와 함께 혼합함으로써 조제가 수행된다.
본 발명의 조성물에서 이용되는 ddRNAi 구조체, ddRNAi 작용제 또는 siRNA 작용제의 하나 이상의 효과기 서열은 AMD-연관 표적 유전자 영역의 발현을 적어도 70% 저해할 수 있는 서열 내에서 임의의 10개 이상, 바람직하게는 임의의 17개 이상의 근접 뉴클레오티드를 포함한다. 바람직하게, 하나 이상의 효과기 서열은 서열 번호: 40-78에서, 더욱 바람직하게 서열 번호: 40-59에서, 그리고 가장 바람직하게는 서열 번호: 40-49에서 선택된다.
또 다른 구체예에서 상기 설명된 바와 같은 RNAi 작용제 또는 제약학적 조성물을 포함한 키트 또는 제조품이 제공된다.
다른 구체예에서, 상기 언급된 치료학적 적용에서 이용하기 위한 키트가 제공되고, 상기 키트는 다음을 포함한다:
- RNAi 작용제 또는 제약학적 조성물을 담고 있는 용기;
- 사용을 위한 설명이 있는 포장 삽입물 또는 라벨.
특정한 구체예에서, 키트는 상기 설명된 바와 같은 AMD-관련 질환을 치료하기 위한 또는 AMD의 치료를 위한 하나 이상의 추가적인 유효 성분 또는 활성 성분을 함유할 수 있다.
키트 또는 "제조품"은 용기 그리고 용기 상에 또는 용기와 관련된 패키지 삽입물 또는 라벨을 포함할 수 있다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 유리병, 주사기, 블리스터 팩(blister pack) 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 여러 가지 물질로부터 형성될 수 있다. 용기는 질환을 치료하는 데에 효과적인 RNAi 작용제 또는 제약학적 조성물을 담고 있고 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어 용기는 정맥내 수액 백(intravenous solution bag) 또는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개가 있는 유리병일 수 있음). 라벨 또는 포장 삽입물은 RNAi 작용제 또는 제약학적 조성물이 선택된 질환을 치료하기 위해 이용된다는 점을 명시한다. 한 가지 구체예에서, 라벨 또는 포장 삽입물은 사용 설명서를 포함하고 RNAi 작용제 또는 제약학적 조성물이 상기 설명된 바와 같은 AMD-관련 질환을 치료하기 위해 또는 AMD를 치료하는 데에 이용될 수 있다는 점을 명시한다.
키트는 (a) RNAi 작용제 또는 제약학적 조성물; 및 (b) 이에 함유된 이차 유효 성분을 또는 활성 성분을 가진 이차 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 이 구체예에서 키트는 RNAi 작용제 또는 제약학적 조성물 및 다른 유효 성분이 상기 설명된 바와 같은 AMD-관련 질환을 치료하기 위해 또는 AMD를 치료하는 데에 이용될 수 있다는 점을 명시하는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안으로, 또는 추가적으로, 키트는 제약학적으로 허용되는 완충제, 가령 정균처리 주사용수(bacteriostatic water for injection (BWFI)), 인산-완충 식염수, 링거액(Ringer's solution) 및 덱스트로오스 용액을 포함한 이차 (또는 삼차) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 완충제, 희석제, 여과장치, 주사 및 주사기를 비롯한, 상업적 관점 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수도 있다.
특정한 구체예에서 RNAi 작용제 또는 제약학적 조성물은 RNAi 작용제 또는 제약학적 조성물을 담고 있기 위한 리셉터클을 비롯한, 일회용 또는 재사용이 가능한 장치의 형태로 제공될 수 있다. 한 가지 구체예에서, 장치는 주사기, 바람직하게는 유리체내 주사 또는 망막하 주사에 적합한 주사기이다. 장치는 1-2 mL의 RNAi 작용제 또는 제약학적 조성물을 담을 수 있다. RNAi 작용제 또는 제약학적 조성물은 사용이 준비된 상태로 또는 추가적인 성분의 혼합 또는 첨가가 요구되는 상태로 장치에 제공될 수 있다.
본 발명은 이제 다음 비-제한 실시예에 관하여 설명된다.
실시예
1. VEGF -A를 침묵시키기 위한 구조체의 설계 및 제조
VEGF-A를 표적하는 shRNA를 발현하는 ddRNAi 구조체는 인간 및 전-임상 검사 종 생쥐와 마카크 사이에서 잘 보존된 VEGF-A mRNA내 RNAi 표적 서열을 인식하도록 설계되었다. 10개의 ddRNAi 구조체 (miR-1, miR-2, miR-3, miR-4, miR-5, miR-6, miR-7, miR-8, miR-9 및 miR-10)가 발생되어 표 2에서 열거된 효과기 서열을 발현하였다. 올리고뉴클레오티드가 합성되고 (Sigma Aldrich) 조립되어 제조자의 프로토콜 (Invitrogen)에 따라 pSilencer 2.1-U6 하이그로의 BamHI / Hind III 부위 내로 클로닝된 BamHI / Hind III 단편을 생성하였다. 이들 구조체는 shRNA의 발현을 유도하기 위해 인간 U6 프로모터를 이용하였다. 벡터의 지도 및 한 가지 이러한 구조체에 대한 삽입이 도 2A 및 2B에서 나타난다. 삽입 서열 및 miR-8에 대해 발현된 shRNA의 예측되는 이차 구조가 도 2C 및 2D에서 나타난다. miR-1 내지 10을 제조하는 데에 이용되는 BamHI / Hind III의 서열은 서열 번호: 91-100으로서 열거된다.
2. VEGF -A를 표적하는 구조체의 활성 및 가닥-특이성
듀얼 루시퍼라아제 어세이는 miR 구조체의 활성을 결정하는 데에 이용되었다. 반딧불이 루시퍼라아제가 상대적으로 짧은 대략 4시간의 반감기를 가지기 때문에, 반딧불이 루시퍼라아제 활성의 측정은 RNAi 저해 활성을 평가하기 위한 대리 지표(surrogate marker)를 제공한다. 이들 실험을 위하여, VEGF-A cDNA의 영역을 포함한 센서 구조체는 반딧불이 루시퍼라아제 발현 구조체 pGL3의 3' UTR (Promega) 내로 클로닝되었다. Open Biosystems (Thermo Scientific 회사)로부터 얻은 VEGF-A cDNA 클론의 영역은 해당 분야에서 잘 공지된 방법을 이용하여 PCR에 의해 증폭되어, 측면에 XbaI 및 FseI 제한 부위가 있는 단편을 제조하였다; 이들 증폭된 단편은 이후, pGL3의 3' UTR내 XbaI / FseI 부위 내로 클로닝되었다. VEGF-A의 5개의 분리된 영역은 표 3에서 나타난 바와 같이, miR 1-10을 어세이하는 데에 이용될 수 있었던 리포터 구조체를 제조하기 위한 이 방식으로 증폭되었다. 이들 5개의 영역 (A 내지 E, 표 3)은 결정되어야 할 RISC 로딩의 가닥 선호도를 허용하는 둘 모두의 배향으로 클로닝되었다. "센스" 리포터 구조체는 패신저 가닥의 활성을 어세이하였고, 반면에 "안티센스"로 불리우는 리포터는 효과기 가닥의 활성을 어세이하였다. 강한 효과기 활성 및 약한 패신저 활성을 가진 ddRNAi 구조체는 치료용으로 매우 선호되는데, 그 이유는 상기 논의된 바와 같이, 이들이 오프 타겟 효과를 더 적게 생성할 가능성이 있기 때문이다.
VEGF-A를 표적하는 miR 구조체 각각의 활성 및 가닥-선호도를 어세이하기 위하여, 듀얼 루시퍼라아제 어세이는 제조자의 프로토콜 (Promega)에 따라 수행되었다. 간단히 하자면, 특이적인 ddRNAi 구조체는 적절한 VEGF-A 센서 및 레닐라(Renilla) 루시퍼라아제 발현 플라스미드 (pRL: Promega)와 함께 공동-형질감염되었고, 이들 중 후자는 웰 사이의 형질감염 효능을 위해, 제조자의 프로토콜 (Roche Applied Sciences)에 따라 Fugene을 이용하여 HEK293T 세포 내로 정상화되기 위함이었다. 세포는 48시간 동안 배양되었고 듀얼 루시퍼라아제 어세이는 Turner Biosystems Veritas 광도계를 이용하여 제조자의 프로토콜 (Promega)에 따라 수행되었다.
전형적인 실험의 결과는 도 4A에서 나타난다. 이들 데이터는 10개 모두의 ddRNAi 구조체가 안티센스 표적의 상당한 침묵을 보여주었지만, 센스 표적에 대한 활성에서는 유의적으로 차이가 있었고, 이는 상이한 ddRNAi 구조체 사이의 패신저 가닥의 RISC 로딩에서 현저한 차이를 반영한다는 점을 나타내었다. 이들 데이터에 기반하여 miR-2, 5 및 8이 추가적인 분석을 위해 선택되었다.
고유 VEGF-A에 대한 이들 구조체의 활성을 확인하기 위하여, HEK293T 세포는 제조자의 프로토콜 (Roche Applied Sciences)에 따라 Fugene을 이용하여 miR-2, 5 및 8에 대한 발현 구조체와 함께 VEGF-A 단백질을 발현하는 발현 플라스미드로 공동-형질감염되었다. 48시간 후 RNA는 변형된 트리졸(Trizol) 프로토콜 (Invitrogen)을 이용하여 단리되었다. VEGF-A mRNA 수준은 제조자의 프로토콜 (Applied Biosystems Inc)에 따라 주문형 RT QPCR 어세이 (RT QPCR Assay on Demand)를 이용하여 결정되었다. 이들 데이터 (도 4B)는 VEGF-A shMiR 2, 5 및 8이 형질감염된 세포에서 안정한 상태의 VEGF-A mRNA 수준을 유의적으로 감소시킨다는 점을 보여준다.
내생적으로 발현되는 VEGF-A에 대한 shMiR-8의 활성을 추가로 입증하기 위하여, ARPE-19로 불리우는, 자발적으로 생긴 망막 색소 상피 (RPE) 세포주가 miR-8을 발현하는 아데노바이러스 구조체 (MOI=200)로 형질도입되었다. RNA 및 단백질은 24, 48, 72 및 96시간에 세포로부터 단리되었다. VEGF-A mRNA 수준은 상기 설명된 바와 같은 RTQPCR을 이용하여 결정되었다. 단백질 수준은 제조자의 프로토콜 (R&D Systems)에 따라 인간 VEGF Quantikine ELISA 키트로 수행되는 ELISA 어세이를 이용하여 결정되었다. 이들 데이터 (도 4C)는 miR-8이 단백질 및 mRNA 수준 모두에서 VEGF-A 발현을 강력하게 침묵시키고, 여기서 넉다운 수준은 시간이 지남에 따라 증가된다는 점을 보여주었다.
miR-8로부터 shRNA 발현의 수준을 정량화하기 위하여, 맞춤형 RT-QPCR 어세이가 개발되었다. 합성 RNA 가닥 (Sigma Aldrich) 및 전방향 DNA 프라이머 (Sigma Aldrich)는 miR-8의 발현된 shRNA로부터 가공처리된 효과기 RNA의 수준을 정량화하기 위하여 이 어세이를 개발하는 데에 이용되었다. 합성 RNA 가닥 및 DNA 서열의 서열은 다음과 같다:
합성 RNA 가닥: UGGGUUAUGUGGGUGGGUGUGUCUACCGCCU (서열 번호: 130)
전방향 프라이머 (DNA):TATGTGGGTGGGTGTGTCTAC (서열 번호: 131)
역방향 프라이머 (DNA): 키트 (Qiagen)로부터의 miScript 범용 프라이머(Universal Primer)
RNA는 제조자의 프로토콜 (Qiagen)에 따라 miSCRIPT 역방향 전사 키트를 이용하여 역전사되었다. 이 키트의 성분은 역 전사효소 및 cDNA 합성을 위한 프라이머로서 작용하는 고정된 올리고 dT 프라이머의 작용을 통해 RNA를 폴리아데닐화하고 cDNA 복사체를 합성한다. cDNA는 해당 분야에 익숙한 기술자에게 잘 알려진 프로토콜을 이용하여, SYBR 녹색 QRT PCR 어세이를 이용하여 증폭되고 정량화되었다. 공지된 양의 합성 RNA 표준은 역전사되었고 QPCR은 증폭되어 표준 곡선을 만들었다. RNA는 전술한 ARPE-19 세포로부터 단리되었고 그리고 발현된 shRNA의 수준은 이 어세이를 이용하여 정량화되었다. 도 4B는 가공처리된 shRNA의 수준이 시간이 지남에 따라 증가되는 형태의 miR-8을 발현하였고 그리고 단백질 및 RNA 수준에서 VEGF-A 넉다운 수준과 관련이 있었다는 점을 보여준다. 종합하여 이들 데이터는 miR-8이 강력하게 VEGF-A를 침묵시켰다는 점을 보여주었다. miR-2, 5 및 8의 VEGF-A 표적 서열 및 효과기 서열은 인간 및 전-임상 검사 종 생쥐 및 마카크 사이에서 뉴클레오티드 서열의 절대적인 보존을 보여준다는 점에 주목한다.
3. VEGFR2를 침묵시키기 위한 구조체의 설계 및 제조
VEGFR2를 표적하는 shRNA를 발현하는 ddRNAi 구조체는 상기 설명된 기준을 이용하여, 인간 및 전-임상 검사 종 생쥐 및 마카크 사이에서 보존된 VEGFR2 mRNA에서 표적 서열을 인식하도록 설계되었다. 대부분의 경우, 인간, 생쥐 및 원숭이 종 사이에서 절대적으로 보존되었던 서열을 찾는 것은 어려웠다. 10개의 ddRNAi 구조체 (miR-V-1, miR-V-2, miR-V-3, miR-V-4, miR-V-5, miR-V-6, miR-V-7, miR-V-8, miR-V-9 및 miR-V-10)가 구축되었다. 이들을 제조하는 데에 이용된 BamHI / HindIII 단편의 서열은 표 2에서 요약된 바와 같은 서열 번호: 101-110으로서 열거된다. 삽입물은 실시예 1에서 설명된 바와 같은 pSilencer 2.1-U6 하이그로 내로 클로닝되었다.
4. VEGFR2를 표적하는 구조체의 활성 및 가닥-특이성
듀얼 루시퍼라아제 어세이는 실시예 2에서 설명된 프로토콜 및 표 3에서 열거된 리포터 구조체를 이용하여 miR-V-1 내지 miR-V-10의 활성 및 가닥-선호도를 결정하기 위해 상기 설명된 바와 같이 수행되었다.
Figure pct00005
이들 실험의 결과는 도 5A에서 나타난다. 이들 데이터는 모든 10개의 구조체가 안티센스 리포터 구조체의 상당한 침묵을 성취할 수 있었지만, 센스 리포터 구조체에 대한 활성에서는 유의적으로 차이가 있었고, 이는 오프-타켓 효과에 대한 결과적인 성향 및 상이한 ddRNAi 구조체 사이의 패신저 가닥의 RISC 로딩에서 현저한 차이를 반영한다는 점을 나타내었다. 이들 데이터에 기반하여, miR-V-2, -3, -7 및 -10이 차후 분석을 위해 선택되었다.
고유 VEGFR2 mRNA에 대한 이들 구조체의 활성을 확인하기 위하여, HEK 293T 세포는 제조자의 프로토콜 (Roche Applied Sciences)에 따라 Fugene을 이용하여 VEGFR2에 대한 전장 cDNA를 발현하는 발현 플라스미드 및 VEGFR2 miR-V-2, 3, 7 및 10을 발현하는 플라스미드로 공동-형질감염되었다. VEGFR2 mRNA 수준은 제조자의 프로토콜에 따라 "주문형" RT QPCR 어세이를 이용하여 결정되었다. 이들 데이터 (도 5B)는 miR-V-2, 3, 7 및 10이 대조와 비교하여 안정한 상태의 VEGFR2 mRNA 수준을 유의적으로 감소시켰다는 점을 보여주었다. 도 5C는 miR-V-2, 3, 7 및 10이 또한, 웨스턴 블롯 분석에 의해 평가되는 바와 같은 형질감염된 세포의 유사한 웰에서 VEGFR2 단백질 수준을 매우 감소시켰다는 점을 보여준다. 종합하여 이들 데이터는 miR-V-2, 3, 7 및 10이 강력하게 VEGFR-2를 침묵시켰다는 점을 보여주었다.
5. PDGFR -β를 침묵시키기 위한 구조체의 설계 및 제조
PDGFR-B를 표적하는 shRNA를 발현하는 ddRNAi 구조체는 상기 설명된 기준을 이용하여, 인간 및 전-임상 검사 종 생쥐 및 마카크 사이에서 잘 보존된 PDGFR-B mRNA에서 표적 서열을 인식하도록 설계되었다. 대부분의 경우에, 생쥐 및 원숭이 모델 모두에서의 인간 서열 및 상응하는 서열 사이에 단일 뉴클레오티드 미스매치가 있다. 10개의 ddRNAi 구조체 (miR-P-1, miR-P-2, miR-P-3, miR-P-4, miR-P-5, miR-P-6, miR-P-7, miR-P-8, miR-P-9 및 miR-P-10)가 만들어졌다. 이들을 제조하는 데에 이용된 BamHI / HindIII 단편의 서열은 표 2에서 요약된 바와 같은 서열 번호: 111-120로서 열거된다. 삽입물은 실시예 1에서 설명된 바와 같은 pSilencer 2.1-U6 하이그로 내로 클로닝되었다.
6. PDGFR -β를 표적하는 구조체의 활성 및 가닥-특이성
듀얼 루시퍼라아제 어세이는 실시예 2에서 설명된 프로토콜 및 표 3에서 열거된 리포터 구조체를 이용하여 miR-P-1 내지 miR-10의 활성 및 가닥 선호도를 결정하기 위해 상기 설명된 바와 같이 수행되고 이용되었다. 이들 데이터는 10개의 모든 구조체가 안티센스 리포터 구조체의 상당한 침묵을 보여주었다는 점을 나타내었다. 이들 데이터에 기반하여 miR-P-4 및 miR-P-9가 차후 분석을 위해 선택되었다.
고유 PDGFR-β mRNA에 대한 이들 구조체의 활성을 확인하기 위하여, HEK 293T 세포는 제조자의 프로토콜 (Roche Applied Sciences)에 따라 Fugene을 이용하여 PDGFR-β에 대한 전장 cDNA를 발현하는 플라스미드 및 PDGFR-β miR-P-4 또는 miR-P-9를 발현하는 플라스미드로 공동-형질감염되었다. 48시간 후 RNA는 상기 설명된 바와 같이 단리되었다. PDGFR-β mRNA 수준은 제조자의 프로토콜에 따라 "주문형" RT QPCR 어세이를 이용하여 결정되었다. 이들 데이터 (도 6A)는 miR-P-4 및 miR-P-9가 대조와 비교하여 안정한 상태의 PDGFR-B mRNA 수준을 유의적으로 감소시켰다는 점을 보여주었다. 도 6B는 miR-P-4 및 miR-P-9가 또한, 대조와 비교하여 세포의 유사하게 형질감염된 웰에서 PDGFR-β 단백질 수준을 매우 감소시켰다는 점을 보여준다. 종합하여 이들 데이터는 miR-P-4 및 miR-P-9가 PDGFR-β를 강력하게 침묵시켰다는 점을 보여주었다.
7. CFB를 침묵시키기 위한 구조체의 설계 및 제조
CFB를 표적하는 shRNA를 발현하는 ddRNAi 구조체는 상기 설명된 기준을 이용하여, 인간 및 전-임상 검사 종 생쥐 및 마카크 사이에서 보존된 CFB mRNA에서 표적 서열을 인식하도록 설계되었다. 대부분의 경우에, 생쥐 및 원숭이 모델 모두에서의 인간 서열 및 상응하는 서열 사이에 단일 뉴클레오티드 미스매치 및 다수의 미스매치가 있다. 9개의 ddRNAi 구조체 (miR-C-1, miR-C-2, miR-C-3, miR-C-4, miR-C-5, miR-C-6, miR-C-7, miR-C-8 및 miR-C-9)가 만들어졌다. 이들을 제조하는 데에 이용된 BamHI / HindIII 단편의 서열은 표 2에서 요약된 바와 같은 서열 번호: 121-129로서 열거된다. 삽입물은 실시예 1에서 설명된 바와 같은 pSilencer 2.1-U6 하이그로 내로 클로닝되었다.
8. CFB를 표적하는 구조체의 활성 및 가닥-특이성
듀얼 루시퍼라아제 어세이는 표 3에서 열거된 리포터 구조체와 함께 실시예 2에서 설명된 프로토콜을 이용하여 miR-C-1 내지 9의 활성 및 가닥 선호도를 결정하기 위해 상기 설명된 바와 같이 이용되었다. 이들 실험의 결과는 도 7A에서 나타난다. 이들 데이터는 대부분의 구조체가 안티센스 리포터 구조체의 상당한 침묵을 보여주었지만, 센스 리포터 구조체에 대한 활성에서는 유의적으로 차이가 있었고, 이는 오프-타켓 효과에 대한 잠재적인 결과적인 및 상이한 ddRNAi 구조체 사이의 패신저 가닥의 RISC 로딩에서 현저한 차이를 반영한다는 점을 나타내었다. 이들 데이터에 기반하여, miR-C-1, miR-C-8 및 miR-C-9가 차후 분석을 위해 선택되었다.
고유 CFB mRNA에 대한 이들 구조체의 활성을 확인하기 위하여, HEK 293T 세포는 상기 언급된 방법을 이용하여 CFB에 대한 전장 cDNA를 발현하는 플라스미드 및 miR-C-1, miR-C-8 또는 miR-C-9를 발현하는 플라스미드로 공동-형질감염되었다. 48시간 후 RNA가 수확되었고 CFB mRNA 수준이 "주문형" RT QPCR 어세이를 이용하여 결정되었다. 이들 데이터 (도 7B)는 miR-C-1, miR-C-8 및 miR-C-9가 대조 처리된 세포와 비교하여 안정한 상태의 CFB mRNA 수준을 유의적으로 감소시켰다는 점을 보여주었다. 도 7C는 miR-C-1, miR-C-8 또는 miR-C-9가 또한, 대조와 비교하여 유사하게 형질감염된 세포의 CFB 단백질 수준을 매우 감소시켰다는 점을 보여준다. 종합하여 이들 데이터는 miR-C-1, miR-C-8 및 miR-C-9가 CFB를 강력하게 침묵시켰다는 점을 보여주었다.
9. VEGF -A를 표적하는 구조체
VEGF-A를 표적하는 치료학적 miR-기반 shRNA를 발현하도록 설계된 구조체가 제조되었다. 이들은 모든 세포에서 shRNA를 발현할 U6 프로모터, 또는 적절한 세포에서 치료학적 shRNA를 발현하는 네 가지 조직-특이적 프로모터 중 하나를 이용하였다. 네 가지 조직-특이적 프로모터는 인간 VDM2 프로모터, 인간 ICAM2 프로모터, 인간 RPE65 프로모터 및 인간 FLT 프로모터였다.
도 2C에서 설명된 miR-7 서열과 융합된 프로모터 서열로 구성된 DNA 단편이 합성되었다 (Blue Herron). 이들 단편은 플랭킹(flanking) 제한 부위를 함유하여 AAV 벡터 내로 클로닝되도록 하였다; pol II 프로모터를 이용한 구조체의 경우 AAV 벡터는 최소한의 폴리아데닐화 부위를 함유하여 적절한 전사 종결을 보장하였다. 이들 단편의 지도는 도 9에서 나타나고 서열 번호: 132 내지 서열 번호: 136로서 열거된다.
10. VEGF -A 및 VEGFR2를 표적하는 구조체
VEGFF-A 및 VEGFR2를 표적하는 치료학적 miR-기반 shRNA를 발현하도록 설계된 구조체가 제조되었다. 이들은 모든 세포에서 shRNA를 발현할 U6 프로모터, 또는 실시예 9에서의 네 가지 조직-특이적 프로모터 중 하나를 이용하였다.
miR-7-miR-V-7 서열에 융합된 프로모터 서열로 구성된 DNA 단편이 합성되었고 (Blue Herron) 그리고 상기 단편은 플랭킹 제한 부위를 함유하여 실시예 9에서 설명된 바와 같은 AAV 벡터 내로 클로닝되도록 하였다. 이들 단편의 지도는 도 10에서 나타나고 서열 번호: 137 내지 서열 번호: 141로서 열거된다.
11. VEGFR2 , PDGFR -β 및 CFB를 표적하는 구조체
VEGFR2, PDGFR-β 및 CFB를 표적하는 치료학적 miR-기반 shRNA를 발현하도록 설계된 구조체가 제조되었다. 이들은 모든 세포에서 shRNA를 발현할 U6 프로모터, 또는 실시예 9에서의 네 가지 조직-특이적 프로모터 중 하나를 이용하였다. 단일 구조체 miR-V-7, miR-C-8 및 miR-P-9 서열로부터의 헤어핀 각각은 단일 벡터 내로 조작된 일련의 제한 효소를 이용하여 (동일한 순서로) 단일 벡터 내로 아클로닝되었다. 결과적 발현 구조체는 또한 플랭킹 제한 부위를 함유하여 실시예 9에서 설명된 바와 같은 AAV 벡터 내로 클로닝되도록 하였다. 이들 구조체의 발현을 위해 이용되도록 실시하기 위해 감소된 프로모터는 Blue Heron에서 독립적으로 합성되었던 인간 U6 프로모터, FLT 프로모터, 및 ICAM2 프로모터를 포함하였다. 생성된 구조체 각각은 이용하기에 앞서 확증된 서열이었다. 이들 단편의 지도는 도 11에서 나타나고 서열 번호: 142 내지 서열 번호: 146로서 열거된다.
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WO2003/022052
SEQUENCE LISTING <110> Benitec Biopharma Limited <120> Age-related macular degeneration treatment <130> M50054727:KAB <150> US 61/750,086 <151> 2013-01-08 <160> 147 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 agcaagagct ccagagagaa g 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 ggcctccgaa accatgaact t 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 cgagaccctg gtggacatct t 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 gcacatagga gagatgagct t 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 tgaatgcaga ccaaagaaag a 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 cagaacagtc cttaatccag a 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 tctgggattc ctgtagacac a 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 gtagacacac ccacccacat a 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 ggtgctactg tttatccgta a 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 cgagatattc cgtagtacat a 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ggcgagactc cggcggaagc attcccgggc gggtgaccca gcacggtccc 1980 tcttggaatt ggattcgcca ttttattttt cttgctgcta aatcaccgag cccggaagat 2040 tagagagttt tatttctggg attcctgtag acacacccac ccacatacat acatttatat 2100 atatatatat tatatatata taaaaataaa tatctctatt ttatatatat aaaatatata 2160 tattcttttt ttaaattaac agtgctaatg ttattggtgt cttcactgga tgtatttgac 2220 tgctgtggac ttgagttggg aggggaatgt tcccactcag atcctgacag ggaagaggag 2280 gagatgagag actctggcat gatctttttt ttgtcccact tggtggggcc agggtcctct 2340 cccctgccca ggaatgtgca aggccagggc atgggggcaa atatgaccca gttttgggaa 2400 caccgacaaa cccagccctg gcgctgagcc tctctacccc aggtcagacg gacagaaaga 2460 cagatcacag gtacagggat gaggacaccg gctctgacca ggagtttggg gagcttcagg 2520 acattgctgt gctttgggga ttccctccac atgctgcacg cgcatctcgc ccccaggggc 2580 actgcctgga agattcagga gcctgggcgg ccttcgctta ctctcacctg cttctgagtt 2640 gcccaggaga ccactggcag atgtcccggc gaagagaaga gacacattgt tggaagaagc 2700 agcccatgac agctcccctt cctgggactc gccctcatcc tcttcctgct ccccttcctg 2760 gggtgcagcc taaaaggacc tatgtcctca caccattgaa accactagtt ctgtcccccc 2820 aggagacctg gttgtgtgtg tgtgagtggt tgaccttcct ccatcccctg gtccttccct 2880 tcccttcccg aggcacagag agacagggca ggatccacgt gcccattgtg gaggcagaga 2940 aaagagaaag tgttttatat acggtactta tttaatatcc ctttttaatt agaaattaaa 3000 acagttaatt taattaaaga gtagggtttt ttttcagtat tcttggttaa tatttaattt 3060 caactattta tgagatgtat cttttgctct ctcttgctct cttatttgta ccggtttttg 3120 tatataaaat tcatgtttcc aatctctctc tccctgatcg gtgacagtca ctagcttatc 3180 ttgaacagat atttaatttt gctaacactc agctctgccc tccccgatcc cctggctccc 3240 cagcacacat tcctttgaaa taaggtttca atatacatct acatactata tatatatttg 3300 gcaacttgta tttgtgtgta tatatatata tatatgttta tgtatatatg tgattctgat 3360 aaaatagaca ttgctattct gttttttata tgtaaaaaca aaacaagaaa aaatagagaa 3420 ttctacatac taaatctctc tcctttttta attttaatat ttgttatcat ttatttattg 3480 gtgctactgt ttatccgtaa taattgtggg gaaaagatat taacatcacg tctttgtctc 3540 tagtgcagtt tttcgagata ttccgtagta catatttatt tttaaacaac gacaaagaaa 3600 tacagatata 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tggtttctgc ctgtgtgctt atgttaaaaa aaaaaaaaaa 5460 aaaa 5464 <210> 84 <211> 5871 <212> DNA <213> Macaca fascicularis <400> 84 tcccgggacc ccgggagagc aggcggtgtg tggtcactgc gtttcctctg cctgcgccgg 60 gcatcacttg cgcgccgcag agagccagtc tggcagccgg gatatcctct cctactggca 120 tccgcagacg cccctgcagc cgcggtcggc acccgggctc ccaagccgtg tgcgctcaac 180 ggtcctgcgc tgcgcggtgg cgcggattcc gtctccgcgc ctccttctct agacaggcgc 240 tgggagaaag aatcggcttc agagttctgg gcattttgcc cagctcgagg tgcaggatgg 300 cgagcaaggt gctgctggcc gtcgccctgt ggctctgcgt ggagacccgg gccgcctctg 360 tgggtttgcc tagtgtttct cttgatctgc ccaggctcag catacaaaaa gacatactta 420 caattaaggc taatacaact cttcaaatta cttgcagggg acagagggac ttggactggc 480 tttggcccaa taatcagagt ggcagtgagc aaagggtgga ggtgactgag tgcagcgatg 540 gcctcttctg taagacactc acaattccaa aagtgatcgg aaatgacact ggagcctaca 600 agtgcttcta ccgggaaact gacttggcct cggtcattta tgtctatgtt caagattaca 660 gatctccatt tattgcttct gttagtgacc aacatggagt cgtgtacatt actgagaaca 720 aaaacaaaac tgtggtgatt ccatgtctcg 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ggatccgcta gcggtatatt gctgttgaca gtgagcgagc tgtggtgtct gagtacttac 60 tgtgaagcag atgggtaagt actcagacac cacagcccgc ctactgcctc ggacttcaag 120 gtaccttttt aagctt 136 <210> 128 <211> 136 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-C-8 structure <400> 128 ggatccgcta gcggtatatt gctgttgaca gtgagcgaag gatatcaaag ctctgtttac 60 tgtgaagcag atgggtaaac agagctttga tatcctgcgc ctactgcctc ggacttcaag 120 gtaccttttt aagctt 136 <210> 129 <211> 136 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-C-9 structure <400> 129 ggatccgcta gcggtatatt gctgttgaca gtgagcgacg gaaggaggtc tacatcaaac 60 tgtgaagcag atgggtttga tgtagacctc cttccgacgc ctactgcctc ggacttcaag 120 gtaccttttt aagctt 136 <210> 130 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial primer (qRT PCR RNA) <400> 130 uggguuaugu gggugggugu gucuaccgcc u 31 <210> 131 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial primer (qRT PCR) <400> 131 tatgtgggtg ggtgtgtcta c 21 <210> 132 <211> 470 <212> DNA <213> Artificial 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ctgcaaggcc tcaggggtca gaacactggt ggagcagatc ctttagcctc 180 tggattttag ggccatggta gagggggtgt tgccctaaat tccagccctg gtctcagccc 240 aacaccctcc aagaagaaat tagaggggcc atggccaggc tgtgctagcc gttgcttctg 300 agcagattac aagaagggac taagacaagg actcctttgt ggaggtcctg gcttagggag 360 tcaagtgacg gcggctcagc actcacgtgg gcagtgccag cctctaagag tgggcagggg 420 cactggccac agagtcccag ggagtcccac cagcctagtc gccagaccga tccggtatat 480 tgctgttgac agtgagcgac tgggattcct gtagacacaa ctgtgaagca gatgggttgt 540 gtctacagga atcccagacg cctactgcct cggacttcaa gctagcggta ccggtatatt 600 gctgttgaca gtgagcgagg agcatctcat ctgttacaac tgtgaagcag atgggttgta 660 acagatgaga tgctccacgc ctactgcctc ggacttcaaa agctt 705 <210> 139 <211> 578 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ICAM2-miR-7-miR-V-7 - DNA construct <400> 139 cctaaggatg ggatttgggg ttccccagat ctggggcttg taggcctgac tctcccctgt 60 gcacacgtct catacacgca tgcgtgcacc cattgcctgc cccgcccctt gcacagggag 120 tcagcaggga ggactgggtt atgccctgct tatcagcagc ttcccagctt cctctgcctg 180 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gcacctcccc acgcgcgctc ggccccgggc 60 cacccgccct cgtcggcccc cgcccctctc cgtagccgca gggaagcgag cctgggagga 120 agaagagggt aggtggggag gcggatgagg ggtgggggac cccttgacgt caccagaagg 180 aggtgccggg gtaggaagtg ggctggggaa aggttataaa tcgcccccgc cctcggctgc 240 tcttcatcga ggtccgcggg aggctcggag cgcgccaggc ggacactcct ggatccggta 300 tattgctgtt gacagtgagc gactgggatt cctgtagaca caactgtgaa gcagatgggt 360 tgtgtctaca ggaatcccag acgcctactg cctcggactt caagctagcg gtaccaagct 420 t 421 <210> 142 <211> 690 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> U6-miR-V-7-miR-C-8-miR-P9 - DNA construct <400> 142 cctaaggccc agtggaaaga cgcgcaggca aaacgcacca cgtgacggag cgtgaccgcg 60 cgccgagcgc gcgccaaggt cgggcaggaa gagggcctat ttcccatgat tccttcatat 120 ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag ataattagaa ttaatttgac tgtaaacaca 180 aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt 240 ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat 300 ttcttgggtt tatatatctt gtggaaagga cgcgggatcc ggtatattgc tgttgacagt 360 gagcgaggag catctcatct gttacaactg tgaagcagat gggttgtaac agatgagatg 420 ctccacgcct actgcctcgg acttcaagct agcggtatat tgctgttgac agtgagcgaa 480 ggatatcaaa gctctgttta ctgtgaagca gatgggtaaa cagagctttg atatcctgcg 540 cctactgcct cggacttcaa ggtaccggta tattgctgtt gacagtgagc gacagttcta 600 caatgccatc aaactgtgaa gcagatgggt ttgatggcat tgtagaactg ccgcctactg 660 cctcggactt caacaattgt ttttaagctt 690 <210> 143 <211> 824 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VDM2-miR-V-7-miR-C-8-miR-P-9 - DNA construct <400> 143 cctaaggcat tctttccata gcccacaggg ctgtcaaaga ccccagggcc tagtcagagg 60 ctcctccttc ctggagagtt cctggcacag aagttgaagc tcagcacagc cccctaaccc 120 ccaactctct ctgcaaggcc tcaggggtca gaacactggt ggagcagatc ctttagcctc 180 tggattttag ggccatggta gagggggtgt tgccctaaat tccagccctg gtctcagccc 240 aacaccctcc aagaagaaat tagaggggcc atggccaggc tgtgctagcc gttgcttctg 300 agcagattac aagaagggac taagacaagg actcctttgt ggaggtcctg gcttagggag 360 tcaagtgacg gcggctcagc actcacgtgg gcagtgccag cctctaagag tgggcagggg 420 cactggccac agagtcccag ggagtcccac cagcctagtc gccagaccgg atccggtata 480 ttgctgttga cagtgagcga ggagcatctc atctgttaca actgtgaagc agatgggttg 540 taacagatga gatgctccac gcctactgcc tcggacttca agctagcggt atattgctgt 600 tgacagtgag cgaaggatat caaagctctg tttactgtga agcagatggg taaacagagc 660 tttgatatcc tgcgcctact gcctcggact tcaaggtacc ggtatattgc tgttgacagt 720 gagcgacagt tctacaatgc catcaaactg tgaagcagat gggtttgatg gcattgtaga 780 actgccgcct actgcctcgg acttcaacaa ttgtttttaa gctt 824 <210> 144 <211> 697 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ICAM2-miR-V-7-miR-C-8-miR-P-9 - DNA construct <400> 144 cctaaggatg ggatttgggg ttccccagat ctggggcttg taggcctgac tctcccctgt 60 gcacacgtct catacacgca tgcgtgcacc cattgcctgc cccgcccctt gcacagggag 120 tcagcaggga ggactgggtt atgccctgct tatcagcagc ttcccagctt cctctgcctg 180 gattcttaga ggcctggggt cctagaacga gctggtgcac gtggcttccc aaagatctct 240 cagataatga gaggaaatgc agtcatcagt ttgcagaagg ctagggattc tgggccatag 300 ctcagacctg cgcccaccat ctccctccag gcagcccttg gggatccggt atattgctgt 360 tgacagtgag cgaggagcat ctcatctgtt acaactgtga agcagatggg ttgtaacaga 420 tgagatgctc cacgcctact gcctcggact tcaagctagc ggtatattgc tgttgacagt 480 gagcgaagga tatcaaagct ctgtttactg tgaagcagat gggtaaacag agctttgata 540 tcctgcgcct actgcctcgg acttcaaggt accggtatat tgctgttgac agtgagcgac 600 agttctacaa tgccatcaaa ctgtgaagca gatgggtttg atggcattgt agaactgccg 660 cctactgcct cggacttcaa caattgtttt taagctt 697 <210> 145 <211> 1204 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RPE65-miR-V-7-miR-C-8-miR-P-9 - DNA construct <400> 145 cctaaggttc caaggacttc tttgggcagt accttgtctg tgctggcaag caactgagac 60 ttaatgaaag agtattggag atatgaatga attgatgctg tatactctca gagtgccaaa 120 catataccaa tggacaagaa ggtgaggcag agagcagaca ggcattagtg acaagcaaag 180 atatgcagaa tttcattctc agcaaatcaa aagtcctcaa cctggttgga agaatattgg 240 cactgaatgg tatcaataag gttgctagag agggttagag gtgcacaatg tgcttccata 300 acattttata cttctccaat cttagcacta atcaaacatg gttgaatact ttgtttacta 360 taactcttac agagttataa gatctgtgaa gacagggaca gggacaatac ccatctctgt 420 ctggttcata ggtggtatgt aatagatatt tttaaaaata agtgagttaa tgaatgaggg 480 tgagaatgaa ggcacagagg tattaggggg aggtgggccc cagagaatgg tgccaaggtc 540 cagtggggtg actgggatca gctcaggcct gacgctggcc actcccacct agctcctttc 600 tttctaatct gttctcattc tccttgggaa ggattgaggt ctctggaaaa cagccaaaca 660 actgttatgg gaacagcaag cccaaataaa gccaagcatc agggggatct gagagctgaa 720 agcaacttct gttccccctc cctcagctga aggggtgggg aagggctccc aaagccataa 780 ctccttttaa gggatttaga aggcataaaa aggcccctgg ctgagaactt ccttcttcat 840 tctgcagtgg atccggtata ttgctgttga cagtgagcga ggagcatctc atctgttaca 900 actgtgaagc agatgggttg taacagatga gatgctccac gcctactgcc tcggacttca 960 agctagcggt atattgctgt tgacagtgag cgaaggatat caaagctctg tttactgtga 1020 agcagatggg taaacagagc tttgatatcc tgcgcctact gcctcggact tcaaggtacc 1080 ggtatattgc tgttgacagt gagcgacagt tctacaatgc catcaaactg tgaagcagat 1140 gggtttgatg gcattgtaga actgccgcct actgcctcgg acttcaacaa ttgtttttaa 1200 gctt 1204 <210> 146 <211> 646 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FLT-miR-V-7-miR-C-8-miR-P-9 - DNA construct <400> 146 cctaagggcg ctcccgggcc cgcgtcgcca gcacctcccc acgcgcgctc ggccccgggc 60 cacccgccct cgtcggcccc cgcccctctc cgtagccgca gggaagcgag cctgggagga 120 agaagagggt aggtggggag gcggatgagg ggtgggggac cccttgacgt caccagaagg 180 aggtgccggg gtaggaagtg ggctggggaa aggttataaa tcgcccccgc cctcggctgc 240 tcttcatcga ggtccgcggg aggctcggag cgcgccaggc ggacactcct ggatccggta 300 tattgctgtt gacagtgagc gaggagcatc tcatctgtta caactgtgaa gcagatgggt 360 tgtaacagat gagatgctcc acgcctactg cctcggactt caagctagcg gtatattgct 420 gttgacagtg agcgaaggat atcaaagctc tgtttactgt gaagcagatg ggtaaacaga 480 gctttgatat cctgcgccta ctgcctcgga cttcaaggta ccggtatatt gctgttgaca 540 gtgagcgaca gttctacaat gccatcaaac tgtgaagcag atgggtttga tggcattgta 600 gaactgccgc ctactgcctc ggacttcaac aattgttttt aagctt 646 <210> 147 <211> 121 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-8 structure <400> 147 gguauauugc uguugacagu gagcgauaga cacacccacc cacauaacug ugaagcagau 60 ggguuaugug ggugggugug ucuaccgccu acugccucgg acuucaagcu agcgguaccu 120 u 121

Claims (22)

  1. AMD 연관 유전자에서 하나 이상의 표적 서열의 발현을 저해하기 위한 DNA-유도 RNA 간섭 (ddRNAi) 작용제에 있어서, ddRNAi 작용제는 5'에서 3'으로의 방향으로,
    적어도 17개 뉴클레오티드 길이의 제1 효과기 서열;
    제1 효과기 상보 서열을 포함하고,
    여기서 효과기 서열은 하나 이상의 표적 서열의 전사체내 하나 이상의 표적 영역과 실질적으로 상보적인 ddRNAi 작용제.
  2. 제1항에 있어서, 제2 효과기 서열 및 제2 효과기 상보 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 ddRNAi 작용제.
  3. 제2항에 있어서, 5'에서 3'으로의 방향으로
    적어도 17개 뉴클레오티드 길이의 제1 효과기 서열;
    적어도 17개 뉴클레오티드 길이의 제2 효과기 서열
    제2 효과기 상보 서열; 및
    제1 효과기 상보 서열을 포함하고,
    여기서 각각의 효과기 서열은 하나 이상의 표적 서열의 전사체내 하나 이상의 표적 영역과 실질적으로 상보적인 것을 특징으로 하는 ddRNAi 작용제.
  4. 제2항에 있어서, 5'에서 3'으로의 방향으로
    적어도 17개 뉴클레오티드 길이의 제1 효과기 서열;
    제1 효과기 상보 서열;
    적어도 17개 뉴클레오티드 길이의 제2 효과기 서열; 및
    제2 효과기 상보 서열을 포함하고,
    여기서 각각의 효과기 서열은 하나 이상의 표적 서열의 전사체에서 하나 이상의 표적 영역과 실질적으로 상보적인 것을 특징으로 하는 ddRNAi 작용제.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, AMD 연관 유전자는 VEGF-A, VEGFR2, PDGFR-β 및 CFB 중 하나 이상에서 선택되는 것을 특징으로 하는 ddRNAi 작용제.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 서열은 서열 번호: 1-39 중 어느 하나로부터의 서열 내에서 임의의 10개 이상의 근접 뉴클레오티드로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 ddRNAi 작용제.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, AMD 연관 유전자는 VEGF-A이고 각각의 효과기 서열은 서열 번호: 40-49에서 선택되는 것을 특징으로 하는 ddRNAi 작용제.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, AMD 연관 유전자는 VEGFR2이고, 각각의 효과기 서열은 서열 번호: 50-59에서 선택되는 것을 특징으로 하는 ddRNAi 작용제.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, AMD 연관 유전자는 PDGFR-β이고 각각의 효과기 서열은 서열 번호: 60-69에서 선택되는 것을 특징으로 하는 ddRNAi 작용제.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, AMD 연관 유전자는 CFB이고 각각의 효과기 서열은 서열 번호: 70-78에서 선택되는 것을 특징으로 하는 ddRNAi 작용제.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 작용제는 miRNA 구조 내에서 발현되는 것을 특징으로 하는 ddRNAi 작용제.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, AMD는 습성 AMD인 것을 특징으로 하는 ddRNAi 작용제.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 ddRNAi 작용제를 발현하기 위한 ddRNAi 발현 카세트에 있어서, 발현 카세트는 (특정한 순서 없이)
    하나 이상의 프로모터 서열
    하나 이상의 효과기 서열을 인코딩하는 하나 이상의 DNA 서열,
    하나 이상의 효과기 상보 서열을 인코딩하는 하나 이상의 DNA 서열;
    그리고 선택적으로
    하나 이상의 종결 서열
    루프(loop) 서열, 스페이서(spacer) 서열, 또는 둘 모두를 인코딩하는 하나 이상의 DNA 서열
    하나 이상의 인헨서 서열을 포함하는 ddRNAi 발현 카세트.
  14. miRNA 인코딩 (ME) 서열을 추가로 포함하는 ddRNAi 발현 카세트.
  15. 제13항 또는 제14항에 따른 ddRNAi 발현 카세트를 포함하는 ddRNAi 발현 구조체.
  16. 제15항에 있어서, 구조체는 바이러스 전달 구조체인 것을 특징으로 하는 ddRNAi 발현 구조체.
  17. 대상에서 AMD를 치료하는 방법에 있어서, 제15항 또는 제16항의 ddRNAi 발현 구조체의 치료학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, AMD는 습성 AMD인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 대상에서 맥락막 신생혈관을 치료하는 방법에 있어서, 제15항 또는 제16항의 ddRNAi 발현 구조체의 치료학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  20. 대상에서 드루젠(drusen) 침착물을 감소시키는 방법에 있어서, 제15항 또는 제16항의 ddRNAi 발현 구조체의 치료학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, ddRNAi 발현 구조체는 유리체내 주사에 의해 대상의 눈/눈들에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제15항 또는 제16항의 ddRNAi 발현 구조체, 및 제약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 제약학적 조성물.
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