CN105143450A - 年龄相关性黄斑变性治疗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及RNA干扰(RNAi)剂和所述RNAi剂治疗年龄相关性黄斑变性的用途，以及含有本发明的所述RNAi剂的药物组合物。所述RNAi剂是DNA指导的RNA干扰(ddRNAi)剂(为RNA分子)，连同表达盒或构建体用以在细胞中(包括体内)表达所述剂，用于抑制、阻止或减少AMD相关基因的表达。优选地，所述AMD相关基因是与湿性AMD相关的基因。

Description

年龄相关性黄斑变性治疗
发明领域
本发明涉及RNA干扰(RNAi)剂和所述RNAi剂治疗年龄相关性黄斑变性的用途，以及含有本发明的RNAi剂的药物组合物。
发明背景
年龄相关性黄斑变性(AMD)在美国和许多其它工业国家是不可逆视力丧失的主要原因。“干性”AMD是黄斑变性的最常见类型且影响了90％的患有所述病况的人。所述干性形式的特征在于在黄斑内形成玻璃疣，所述黄斑是视网膜中捕捉进入眼睛的光线的专门结构区。典型地，玻璃疣在视网膜色素上皮(RPE)细胞下面形成且其存在被认为由于支持光感受器细胞的RPE层崩溃或变薄而引起光感受器萎缩。还认为视网膜内玻璃疣的持续性引起持续发炎反应并且导致二级反应级联，其最终可引起湿性AMD。
AMD的“湿性”形式的特征在于在通常称为脉络膜新生血管(CNV)的过程中来自位于视网膜后面的脉管系统的血管的异常外生长。虽然不如所述干性形式流行，但其具有更快速发作并且为更严重表型，通常导致大部分视野减少。
湿性AMD的现行护理标准是来尼珠单抗(RAN)，它是与血管内皮生长因子-A(VEGF-A)具有强亲和力的单克隆抗体片段，所述VEGF-A是由细胞分泌并且已知引起初生血管的形成或生长的分子部分。RAN结合于VEGF-A并且抑制其生物活性，由此阻止VEGF-A与内皮细胞表面上的其受体(VEGFR1和VEGFR2)的相互作用。这使得内皮细胞增殖减少、较少血管渗漏以及CNV所特有的新血管形成的减少。
然而，RAN的眼睛半衰期在玻璃体内注射后仅为9天，因此治疗剂量必须每月施用于患者以保持有效抑制血管增生。尽管适用于使将近95％的患者的视敏度稳定，但仅在29％-40％的患者中注意到改善的视力。RAN充当分子海绵以吸干分泌的VEGF-A。这一过程中的无效性可能是为何仅使大多数患者中视力稳定而未改善的一种原因。换句话说，它治标不治本。
现有单克隆抗体湿性AMD疗法的主要缺点在于需要频繁、持续治疗，典型地涉及每月向眼睛注射。结合快速老龄化人群和相应地少数有资格施用玻璃体内注射的临床医师，应用这种疗法。这对卫生保健系统造成巨大的压力。因此，明确地需要更持久治疗和/或可逆转症状的治疗。湿性AMD的替代治疗同样无法令人满意，这也是由于其施用频率，以及其副作用或不良效力。
一种开始临床试验的较新药物是并入VEGFR-1受体的第二结合结构域和VEGFR2受体1的第三结构域的VEGFTrapEye(VTE)药物。通过将这些细胞外蛋白序列融合至人IgG骨架的Fc区段，开发者已经创造了具有极高的VEGF结合亲和力的嵌合蛋白(StewartMW.BrJOphthalmol(2012).doi:10.1136/bjophthalmol-2011-300654)。不仅结合VEGF-A家族的所有异构体，它还结合VEGF-B和胎盘生长因子。
假定所述嵌合蛋白仍具有相对较短的半衰期的事实，VTE无论如何仍必须定期施用—每隔2个月。
AAV2-sFLT01是表达偶合于人IgG1Fc的经过修饰的可溶性Flt1受体的基因疗法载体。作为高亲和力的VEGF结合蛋白，AAV2-sFLT01用以中和用于经由玻璃体内注射治疗湿性AMD的VEGF的促血管生成活性。(Wasworth等人MolecularTherapy第19卷第2期2011年2月；326–334)。预期AAV载体的使用确保长期表达，从单次注射持续数月或甚至数年。然而，为了适应sFLT01和IgG1重链Fc融合蛋白，必须使用单链AAV，其反过来需要大量用于有效转导的载体且因此增加对病毒壳体蛋白的免疫反应的风险。此外，正常成年人群体的高发病率已经暴露于AAV的血清型2变体，并且可具有先前存在的针对所述血清型的免疫性。
分子PF-04523655是抑制低氧可诱导基因RTP801的表达的19个核苷酸的siRNA(Nguyen等人Ophthalmology.2012年9月；119(9):1867-73)。在迄今进行的临床研究中，已经发现其阻止新生血管和血管渗漏，不过经由不同于VEGF的途径进行。已经证明所述siRNA仅在眼睛中持续数周，意味着如同许多其它现有和发展中的疗法，患者将需要定期玻璃体内注射来进行治疗。使用多种治疗的失败已经可见视敏度的持续丧失，和变性的进展。
更一般说来，先前用于治疗和管理湿性AMD的基于siRNA的方法已经失败。尽管最初的临床前实验结果振奋人心，但随后证明这些分子的作用模式不是通过基于序列特异性RNAi的机制，而是通过诱导由siRNA与Toll样受体TLR3的相互作用介导的非特异性干扰素反应(Kleinmann等人2008)。Toll样受体是在天然免疫系统中起关键作用的跨膜蛋白。通常位于细胞表面上或如核内体的细胞内囊泡上，这一家族的一些家族成员识别通常不存在于内源细胞中而是作为外源物质且触发分子反应的级联的双链RNA。这引起干扰素活化，所述活化在小鼠模型中具有短暂治疗效应。然而，干扰素在人中具有低得多的效力，这解释了这种治疗在人临床测试中的不良效力。
瑞替诺泰(Retinostat)是表达血管抑素和内皮抑素的基于马传染性贫血病毒(EIAV)的慢病毒载体，血管抑素和内皮抑素均为眼室中的天然存在血管生成抑制剂。内皮抑素阻断VEGF信号传导，降低血管渗透性，减少细胞基质粘着并且促进内皮细胞凋亡。血管抑素阻止内皮细胞增殖和迁移。所述基因经由视网膜下注射递送并且抑制新血管的形成。然而，视网膜下递送需要加强的手术程序，所述程序不同于玻璃体内递送，不适合门诊病人治疗或在当地医生处的治疗。
尽管在AMD治疗剂并且具体说来湿性AMD的领域中存在大量开发工作，但仍需要创造在副作用、治疗模式以及其频率方面也对患者友好的更有效疗法。本发明涉及RNA干扰(RNAi)剂和所述RNAi剂管理且治疗个体的湿性AMD的用途。
所述RNAi途径通过酶Dicer起始，所述酶将双链RNA(dsRNA)分子裂解成约20-25个核苷酸的短片段(通常称作siRNA)。各片段的两条链之一(称作引导链或活性链)接着通过结合于Argonaute蛋白家族的成员而并入RNA诱导的沉默复合物(RISC)中。在整合至RISC中之后，引导链与其靶标mRNA碱基配对并且被认为通过抑制翻译(通过停止翻译机构)和/或诱导所述mRNA的裂解，从而阻止其用作翻译模板来抑制靶标。
虽然通过Dicer产生的片段为双链的，但仅引导链引导基因沉默。抗引导链(通常称作过客链、载体链或*链)在RISC活化期间经常降解(GregoryR等人,2005)。RISC组装被认为由选择dsRNADicer产物的哪条链装载至RISC中的酶管理。这条链通常是5′端不太紧密地与其补体配对的链。另外似乎5'位置明显偏好A，并且在较小程度上偏好U以促进结合于一些Argonaute蛋白(SchwarzDS等人,2003；FrankF等人,2010)。
本发明设法克服与上文已经讨论的其它疗法有关的问题，同时克服在这个领域中的RNAi治疗剂所面临的先前挑战。
本说明书中并未参考任何现有技术，并且不应被视为承认或以任何形式建议这一现有技术在澳大利亚或任何其它管辖区域中形成一般常识的一部分或这一现有技术可能合理地预期由本领域技术人员确认、理解并且视为相关的。
发明概述
存在对于AMD并且具体说来湿性AMD的长期疗法的未满足的需要。本发明的发明人已经发现，特定RNAi构建体具有下调与AMD的发展有关的基因(统称为‘AMD相关基因’)的表达的能力。这又可减慢AMD和伴随的视力丧失的进展，并且在一些情况下，引起视敏度的改善。通过使用RNAi技术来实现那些靶标序列的长期抑制，连同使用以非侵袭性方式将所述RNAi剂引导至靶标细胞的载体递送媒介物，这种需要可得到满足并且其可以患者便利性且友好的方式得到满足。此外，因为从DNA指导的RNAi(ddRNAi)构建体表达的RNA剂在细胞核中产生并且不与在细胞表面上或在内体隔室内的Toll样受体相互作用，所以可产生ddRNAi剂而不经由TLR激活干扰素反应。
在本发明的一方面，提供DNA指导的RNA干扰(ddRNAi)剂(为RNA分子)，和表达盒或构建体用以在细胞中(包括体内)表达所述剂，用于抑制、阻止或减少AMD相关基因、优选地湿性AMD相关基因中的一种或多种靶标序列的表达，其中所述剂包含
●至少17个核苷酸的效应子序列(下文进一步描述)，和
●效应子补体序列
其中所述效应子序列与所述一种或多种靶标序列的转录物中的一个或多个靶标区互补或基本上互补。
所述靶标区可选自由选自SEQIDNO:1-39中任何一者或多者的靶标序列的转录物内的任何10个或更多个相邻核苷酸组成的组。所述效应子补体序列与所述效应子序列基本上互补，使得其将倾向于退火以便形成双链RNA区段。
所述效应子序列针对靶标基因的靶标序列的转录物内的靶标区。因此，所述效应子序列通过与来自含有靶标区的靶标基因的转录物基本上序列互补(‘基本上互补’定义于下文)而‘针对’所述靶标区。具有含有所述效应子序列的双链部分的RNAi剂(如ddRNAi剂)可因此凭借含有靶标区的靶标基因序列而“抑制靶标基因序列的表达”。因此，在具有AMD相关基因的细胞内，所述RNAi剂能够抑制靶标基因序列的表达，因为所述效应子(‘效应子’定义于下文)的序列与靶标基因的mRNA靶标序列的(至少)一个区域基本上互补。这可通过考虑以下随机、假设的短序列来说明：
5’GGCATTGCG3’–在靶标序列内的靶标区
5’GGCAUUGCG3’–靶标序列的转录物
3’GUAACG5’–效应子序列，其与靶标序列的转录物中的靶标区基本上互补。
典型地，靶标区是在意图沉默或使得其表达(在转录或翻译的水平上)降低、受到抑制或被阻止的基因的mRNA内的核酸序列的区域。
如以上说明性比较中可见，在所述效应子序列与所述效应子补体序列之间的‘基本上互补性’可为100％互补性。然而，如下文进一步更特定地解释且定义，基本上互补性可为80％至100％互补。因此，在具有例如20个核苷酸的长度的效应子序列中，如果所述20个核苷酸中的17个互补，即85％互补，那么所述效应子序列与效应子补体序列基本上互补。此外，双链区段的一个末端通常通过环序列连接以便形成‘发夹’形状结构，所述结构称作shRNA。这种结构还称作‘中断的反向重复’结构，因为编码这类RNA序列的DNA含有转录为效应子序列的靶标基因的所述区域的反向重复，其由编码所述环的填充物或间隔区序列中断。
上一段落中所述的基本上互补的概念同样适用于所述效应子序列与所述靶标序列之间的基本上互补性，其中基本上互补性可为80％至100％互补性。即，如果在靶标序列内的靶标区为20个核苷酸长并且所述效应子序列是20个核苷酸长，那么所述效应子序列可具有例如与所述靶标互补的16、17、18或20个核苷酸，分别等于80％、85％、90％以及100％互补性。
在两种情形下，应理解基本上互补性可能不等于整数。例如，与22个核苷酸的序列的至少85％互补性将为18.7个核苷酸，因此有效地需要22个中的19个互补。
或者，80至100％互补性的基本上互补性(在效应子与靶标之间的基本上互补性和效应子与其补体之间的基本上互补性的情况下)可参考将不为G-C/A-U碱基对(除了如下文所述的摇摆对以外)的核苷酸的数目来描述。当在核苷酸序列中考虑至少80％互补性时，在本身不与另一链上的核苷酸互补的2个RNA之间的互补区内可存在1、2、3、4或5个核苷酸。关于是否可存在1、2、3、4或5个不进行碱基配对的核苷酸的问题，视相关序列的长度而定。例如，如果所述效应子序列是17个核苷酸长，那么其无法具有5个将不进行碱基配对的核苷酸，因为这将等于仅71％互补性。在17个核苷酸的序列中，针对至少80％互补性，在所述17个核苷酸的14个之间必须存在互补性。
在本发明的一个优选实施方案中，由所述效应子序列与其补体形成的双链区表达为微RNA(miRNA)结构的一部分，所述结构类似于作为内源RNAi加工途径的天然底物的内源miRNA的结构。由ddRNAi构建体表达的双链RNA的加工可不精确，并且可引起毒性。McBride等人(2008)设计了表达来自内源miRNA的碱基和环的序列的“人工miRNA”构建体，并且提出从所述miR骨架表达的shRNA的更精确加工使得所述构建体的毒性降低。Wu等人(2011)显示错配的双链体(在过客链中含有错配)有时显示增加的沉默活性，这可能归因于其与内源miRNA的较大的结构相似性。
在本发明的一方面，提供ddRNAi剂和用以在细胞中表达所述剂的表达盒，用于抑制、阻止或减少AMD相关基因、优选地湿性AMD相关基因的表达，其中所述剂包含
与靶标区的转录物中的一个或多个靶标区互补或基本上互补的至少17个核苷酸长的效应子序列，和效应子补体序列
其中所述效应子序列和所述效应子补体序列在miRNA结构内表达。所述靶标区可选自由选自SEQIDNO:1-39中任何一者或多者的序列的转录物内的任何10个或更多个相邻核苷酸组成的组。
在本发明的一些形式中，所述剂具有超过一种效应子序列。多种效应子可靶向湿性AMD相关基因的同一区(典型地同一区的变体)，湿性AMD相关基因、超过一种湿性AMD相关基因的不同区，或以上所有的组合。
RNAi剂(如ddRNAi剂)可含有2种或3种或更多种效应子序列。如上文所解释，所述ddRNAi剂包含针对各效应子序列的效应子补体序列，因此形成效应子-效应子补体对(即第一效应子-第一效应子补体对、第二效应子-第二效应子补体对等)。这些对可为但无需为彼此邻接，只要所述RNAi剂可折叠以便允许各对退火。各种其它考虑提出所述效应子和效应子补体沿所述RNAi剂的长度的一种顺序或另一顺序。另外，如本领域技术人员应了解且如图中所说明，任何特定效应子序列均可在适当位置与所述剂中的其补体交换。如以下各种实施方案中所例证的重要特征在于所述效应子序列能够与其补体退火以形成双链区。例如：
●ddRNAi剂，其按5’至3’方向包含第一效应子序列；第二效应子序列；第二效应子补体序列；以及第一效应子补体序列；
●ddRNAi剂，其按5’至3’方向包含第一效应子序列；第二效应子序列；第三效应子序列；第三效应子补体序列；第二效应子补体序列；以及第一效应子补体序列；
●ddRNAi剂，其按5’至3’方向包含第一效应子；第一效应子补体序列；第二效应子序列；以及第二效应子补体序列；
●ddRNAi剂，其按5’至3’方向包含第一效应子序列；第一效应子补体序列；第二效应子序列；第二效应子补体序列；第三效应子序列；以及第三效应子补体序列；
●ddRNAi剂，其按5’至3’方向包含第一效应子序列；第二效应子序列；2至100个非自补核苷酸的环序列；第二效应子补体序列；以及第一效应子补体序列；
●ddRNAi剂，其按5’至3’方向包含第一效应子序列；2至100个非自补核苷酸的环序列；第一效应子补体序列；2至100个非自补核苷酸的序列；第二效应子序列；2至100个非自补核苷酸的环序列；以及第二效应子补体序列；
●ddRNAi剂，其按5’至3’方向包含第一效应子序列；2至100个非自补核苷酸的环序列；第一效应子补体序列；2至100个非自补核苷酸的间隔区序列；第二效应子序列；2至100个非自补核苷酸的环序列；以及第二效应子补体序列；
●ddRNAi剂，其按5’至3’方向包含第一效应子序列；第一效应子补体序列；2至100个非自补核苷酸的间隔区序列；第二效应子序列；第二效应子补体序列；2至100个非自补核苷酸的间隔区序列；第三效应子序列；以及第三效应子补体序列。
所述非自补核苷酸在位于效应子与其补体之间时充当环序列，并且在位于一种效应子序列的补体与下一效应子序列之间时充当间隔区序列。在这些实施方案中的每一者中，所述效应子序列与其补体以及任何额外序列(如2至100个非自补核苷酸的序列)在miRNA结构内或作为miRNA结构的一部分表达。
在上述实施方案中的每一者的特定形式中，各效应子序列为至少17个核苷酸长，优选地17至30个核苷酸长，并且更优选地17至21个核苷酸长，并且包含选自由来自SEQIDNO:40-78中的任一者的序列的任何10个或更多个相邻核苷酸组成的组的核苷酸序列。所述效应子序列可均为相同的，或可均为不同的，或可为组合，例如SEQIDNO:47的至少10个相邻核苷酸的2种效应子序列和SEQIDNO:56的至少10个相邻核苷酸的一种效应子序列。
优选地，所述效应子序列选自由在SEQIDNO:40-78中的任一者内的任何相邻的11、12、13、14、15或16个核苷酸，并且优选地在SEQIDNO:40-78中的任一者内的17个或更多个相邻核苷酸并且最优选地在SEQIDNO:40-78中的任一者内的17至21个相邻核苷酸组成的组。典型地，所述效应子补体将为与其相应的效应子序列相同的长度，或约相同的长度(即，±15％核苷酸长度，或1至3个核苷酸，视总长度而定)。
在特定实施方案中，所述ddRNAi剂的效应子序列由选自由SEQIDNO:40-78(包括端点在内)中的任一者组成的组的核苷酸序列组成，或基本上由所述核苷酸序列组成。在这些实施方案中，ddRNAi剂SEQIDNO:40-78以及额外核苷酸或其它化学修饰将“基本上由SEQIDNO:40-78组成”，只要其展现抑制、降低或阻止靶标基因的表达的活性，如可根据下文所述的测定来确定。同样，RNAi剂“基本上由SEQIDNO:40-78中的一者(其中其比相应的SEQID短)组成”，只要其展现抑制、降低或阻止靶标基因的表达的活性，如可根据下文所述的测定来确定。
在替代实施方案中，所述dsRNA包含2条单独的RNA链，所述链退火形成双链体。所述双链体可接着嵌入miRNA骨架中。
ddRNAi剂可从插入任何合适载体中的DNA表达盒或ddRNAi构建体表达。因此，在本发明的多个方面，提供一种ddRNAi表达盒，其包含(无特定顺序)：
●一种或多种启动子序列
●编码一种或多种效应子序列的一种或多种DNA序列，优选地是编码在来自SEQIDNO:40-78中的任一者的序列内的任何10个或更多个并且优选地任何17个或更多个相邻核苷酸的DNA序列，
●编码一种或多种效应子补体序列的一种或多种DNA序列
以及任选地
●一种或多种终止子序列
●编码间隔区序列、环序列或二者的一种或多种DNA序列；以及
●一种或多种增强子序列。
在一些实施方案中，一种启动子可操作地连接于多个效应子编码区，使得产生具有多种效应子序列的ddRNAi剂。在其中各效应子编码区可操作地连接于其本身的启动子的替代实施方案中，从单一表达盒产生多种ddRNAi剂。在其中存在多种启动子的构建体中，这些启动子可为均相同或不同的。优选的启动子为polIII启动子，如U6和H1；polII启动子，如RPE细胞特异性启动子RPE-65(Boye等人2012)和VMD2(Zhu等人2010)，并且脉络膜内皮特异性启动子FLT-1或ICAM2也可用于驱动ddRNAi构建体的表达。
在其中所述效应子序列和其补体在miRNA结构中表达的实施方案中，所述ddRNAi表达盒另外包含编码所述miRNA结构的序列，所述序列在本文中称作miRNA编码(ME)序列。所述ME序列也可编码环序列。
还提供ddRNAi表达构建体，所述ddRNAi表达盒插入其中以用于表达。另外，当所述构建体的载体骨架可与递送系统相容时，所述ddRNAi表达构建体也为递送构建体。尤其优选的递送构建体是病毒载体，如在玻璃体内注射后允许递送ddRNAi表达盒至视网膜深处的适当细胞的经过修饰的腺相关病毒(AAV)载体(Petrs-Silva等人2011)。使用经过修饰的AAV递送从细胞内部产生治疗性ddRNAi剂的表达构建体会避免通常由核酸与表面表达的toll样受体3的直接相互作用引起的干扰素反应。假设这是临床试验中基于siRNA的眼睛药物多次失败的原因。
因此，在这个实施方案中，提供一种ddRNAi表达构建体，所述构建体包含用于表达用于抑制AMD相关基因中一种或多种靶标序列的表达的ddRNAi剂的ddRNAi表达盒，所述表达盒包含(无特定顺序)
一种或多种启动子序列
编码一种或多种效应子序列的一种或多种DNA序列，
编码一种或多种效应子补体序列的一种或多种DNA序列；
以及任选地
一种或多种终止子序列
编码环序列、间隔区序列或二者的一种或多种DNA序列，
一种或多种增强子序列，
其中所述构建体是病毒载体递送媒介物。
优选地，所述表达盒进一步包含ME序列，使得所述ddRNAi剂作为miRNA结构的一部分或在miRNA结构内表达。
在一个实施方案中，所述病毒载体递送构建体的表达盒包含一种DNA序列，所述序列编码在AMD相关基因VEGF-A的5’UAUGUGGGUGGGUGUGUCUAC3’(SEQIDNO:47)内的任何10个或更多个相邻核苷酸的第一效应子序列。
在另一实施方案中，所述病毒载体递送构建体的表达盒包含两种DNA序列，所述序列编码AMD相关基因VEGRF-2的5’UGUAACAGAUGAGAUGCUCCA3’(SEQIDNO:56)内的任何10个或更多个相邻核苷酸的第一效应子序列和AMD相关基因VEGFA的5’UAUGUGGGUGGGUGUGUCUAC3’(SEQIDNO:47)内的任何10个或更多个相邻核苷酸的第二效应子序列。
在另一替代实施方案中，所述病毒载体递送构建体的表达盒包含三种DNA序列，所述序列编码AMD相关基因VEGRF-2的5’AAGUAGCCAGAAGAACAUGGC3’(SEQIDNO:52)内的任何10个或更多个相邻核苷酸的第一效应子序列；AMD相关基因CFB的5’UUAUAGAAAACCCAAAUCCUC3’(SEQIDNO:78)内的任何10个或更多个相邻核苷酸的第二效应子序列；以及AMD相关基因PDGFR-β的5’UAGCUGAAGCCCACGAGGUCC3’(SEQIDNO:63)内的任何10个或更多个相邻核苷酸的第三效应子序列。
本发明还提供siRNA剂，所述siRNA剂包含选自由来自SEQIDNO:40-78中的任一者的序列内的任何10个或更多个相邻核苷酸组成的组的至少17个核苷酸长的序列和与所述序列形成双链体的序列补体，并且所述siRNA剂能够抑制湿性AMD相关基因的表达。
根据一些实施方案，提供一种抑制受试者中由AMD相关基因编码的mRNA或多肽的表达的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含ddRNAi剂的本发明组合物，所述ddRNAi剂基本上由选自由SEQIDNO:40-78中的任一者组成的组的核苷酸序列和与SEQIDNO:40-78的不同之处在于1、2、3、4或5个核苷酸的序列组成或由所述序列组成。也可施用用于表达所述ddRNAi剂的ddRNAi表达盒或ddRNAi表达构建体。
在另一实施方案中，本发明提供一种用于治疗受试者的AMD、优选地湿性AMD或治疗由视网膜内的不当血管形成引起的其它疾病的组合物，所述组合物包含作为活性成分的用于抑制、阻止或降低AMD相关基因中一种或多种靶标序列的表达的本发明的ddRNAi剂、ddRNAi表达盒或ddRNAi表达构建体。
在另一实施方案中，本发明提供一种药物组合物，其包含有效量的本发明的ddRNAi剂、ddRNAi表达盒或ddRNAi表达构建体作为用于抑制、阻止或降低AMD相关基因中一种或多种靶标序列的表达的主要成分。所述组合物可用于例如治疗受试者的AMD、优选地湿性AMD或治疗由视网膜内的不当血管形成引起的其它疾病。在一些实施方案中，所述组合物进一步包含药学上可接受的载体或稀释剂。
在另一实施方案中，本发明提供一种用于治疗受试者的AMD、优选地湿性AMD或治疗由视网膜内的不当血管形成引起的其它疾病的组合物，所述组合物包含作为活性成分的用于抑制、阻止或降低AMD相关基因中一种或多种靶标序列的表达的本发明的ddRNAi剂、ddRNAi表达盒或ddRNAi表达构建体。
在另一实施方案中，本发明提供一种用于抑制、阻止或降低AMD相关基因中一种或多种靶标序列的表达的组合物，所述组合物包含用于治疗受试者的湿性AMD的本发明的ddRNAi剂、ddRNAi表达盒或ddRNAi表达构建体。在一些实施方案中，所述组合物进一步包含药学上可接受的载体或稀释剂。
在另一实施方案中，本发明提供一种用于抑制、阻止或降低AMD相关基因中一种或多种靶标序列的表达的ddRNAi剂、ddRNAi表达盒或ddRNAi表达构建体，所述ddRNAi剂、ddRNAi表达盒或ddRNAi表达构建体用于制备用于治疗受试者的AMD的药剂。优选地，所述药剂是针对湿性AMD。
在另一实施方案中，本发明提供一种AMD治疗组合物，其包含有效量的用于抑制、阻止或降低AMD相关基因中一种或多种靶标序列的表达的本发明的ddRNAi剂、ddRNAi表达盒或ddRNAi表达构建体作为主要成分，任选地连同药学上可接受的载体或稀释剂。
本发明还提供一种用于治疗受试者中由视网膜内的不当血管形成引起的疾病或延迟所述疾病的进展的方法，所述方法包括向所述受试者施用用于抑制、阻止或降低AMD相关基因中一种或多种靶标序列的表达的本发明的ddRNAi剂、ddRNAi表达盒或ddRNAi表达构建体或组合物，由此降低AMD的严重程度。
本发明的另一方面提供一种用于减少受试者的AMD、优选地湿性AMD的进展的方法，所述方法包括向所述受试者施用用于抑制、阻止或降低AMD相关基因中一种或多种靶标序列的表达的本发明的ddRNAi剂、ddRNAi表达盒或ddRNAi表达构建体或组合物，由此降低AMD的严重程度。
在本发明的各方法中，本发明的ddRNAi剂、ddRNAi表达盒或ddRNAi表达构建体或组合物优选地通过玻璃体内注射或视网膜下注射递送至受试者的眼睛。
另一方面，本发明提供组分的试剂盒，其包括(a)本发明的ddRNAi剂、ddRNAi表达盒或ddRNAi表达构建体或组合物和(b)药学上可接受的载体或稀释剂。
在某些实施方案中，本发明的RNAi剂或药物组合物可以一次性或可重复使用的装置形式提供，包括用于容纳所述RNAi剂或药物组合物的容器。在一个实施方案中，所述装置是注射器，优选地是适用于玻璃体内注射或视网膜下注射的注射器。所述RNAi剂或药物组合物可在呈备用状态或呈需要混合或添加其它组分的状态的装置中提供。
尽管本发明在人中得到应用，本发明还适用于兽医目的。本发明适用于治疗家畜，如牛、绵羊、马以及家禽；宠物，如猫和狗；以及动物园动物中的AMD或由不当血管形成引起的其它疾病。
附图简述
图1A-G说明本发明的一些ddRNAi剂结构。
图2：A.pSilencer(Invitrogen)的图。这种表达盒含有人U6启动子(黑色箭头)并且设计为将克隆至这种载体中的shRNA序列表达为BamHI/HindIII片段。B.示出设计为使AMD相关基因沉默的BamHI/HindIIIshRNA片段的示意图的概图。示出BamHi/HindIII限制位点的位置；白色箭头表示来自miR30a的5’茎的序列、源自mir30a的环以及miR30a的3’茎的序列。灰色箭头表示预测的过客链并且黑色箭头表示预测的引导链。所述预测的引导链和所述预测的过客链的相对定位可互换。黑线表示polIII终止信号。C.示出有效地使VEGF-A沉默的miR-8片段的DNA序列并且所述序列对应于SEQIDNO:98。小写字母表示限制位点、mir30a相关序列以及polIII终止子序列。加下划线的序列源自人miR30a前体RNA(5’和3’)的碱基；呈斜体的序列源自miR30a的环序列。大写字母序列指示预测的过客链序列，粗体大写字母序列表示预测的效应子序列(SEQIDNO:47)。D.使用M倍(M-fold)程序确定的miR-8的预测的RNA二级结构(SEQIDNO:147)；预测的Dicer和Drosha加工位点由箭头指示。
图3：A.pGL3-VEGFA有义报告基因的图。所述质粒编码由SV40启动子(灰色箭头)和真核细胞转录终止子驱动的萤火虫荧光素酶(Fluc+)。使用存在于亲本质粒(pGL3；Promega)的3’UTR中的XbaI和FseI限制位点将VEGF-A基因的非编码链的一部分插入FLuc+转录单元的3’UTR中。这种质粒用于在双重荧光素酶测定中定量miR-2的过客链的抑制活性。B.pGL3-VEGFa反义报告基因的图，特征显示于图3A中。使用XbaI和FseI限制位点将图3A中所用的VEGF-A基因的相应部分插入FLuc+转录单元的3’UTR中，但使用VEGF-A基因的编码链。这种质粒用于在双重荧光素酶测定中定量miR-2的效应子链的抑制活性。
图4：A.本图示出使用双重荧光素酶测定确定的VEGF-A表达的抑制百分比；示出针对传感器构建体中的有义和反义靶标的活性(n＝3±SD)。B.本图示出在共转染miR-2、miR-5以及miR-8连同表达全长VEGF-A蛋白的全长cDNA的HEK293T细胞中通过qRTPCR确定的VEGF-AmRNA含量的抑制百分比。抑制百分比是相对于未转染的细胞和空载体对照物(pSilencer和空U6表达盒)计算。C.本图示出在已经转导表达miR-8的腺病毒载体的ARPE-19细胞中VEGF-AmRNA和蛋白质的含量。RNA和蛋白质的样品在转导后24、48、72以及96小时收集。三角形示出其中环序列已经裂解的成熟、加工过的miR-8的细胞内含量。
图5：A.本图示出使用如先前所述的萤火虫荧光素酶报告基因确定的VEGFR2的抑制百分比；示出针对有义和反义报告基因构建体的活性(n＝3±SD)。B.本图示出在共转染miR-V-2、miR-V-3、miR-V-7或miR-V-10和表达VEGFR2的全长cDNA的质粒的HEK203T细胞中通过RTQPCR确定的VEGFR2mRNA含量的抑制百分比。将抑制百分比计算为如与空载体对照物(pSilencer；Invitrogen和无关质粒)相比剩余的mRNA。C.在与5B中平行的条件下转染的细胞的蛋白质印迹分析并且示出VEGFR2的减少(箭头)。来自HUVEC细胞的蛋白质萃取物平行操作以示出凝胶上VEGFR2的定位。
图6：A.本图示出在共转染miR-V-4或miR-V-9和表达PDGFR-β的全长cDNA的质粒的HEK293T细胞中PDGFR-βmRNA含量的抑制百分比。将抑制百分比计算为如与对照物(pSilencer,Invitrogen和无关质粒以及空U6表达盒)相比剩余的mRNA。B.在与6B中平行的条件下转染的细胞的蛋白质印迹分析并且示出PDGFR-β的减少(箭头)。
图7：A.本图示出使用如先前所述的萤火虫荧光素酶报告基因确定的CFB表达的抑制百分比；示出针对有义和反义报告基因构建体的活性(n＝3±SD)。B.本图示出在共转染miR-C-1、miR-C-8或miR-C-9和表达CFB的全长cDNA的质粒的HEK293T细胞中CFBmRNA含量的抑制百分比。将抑制百分比与对照物(pSilencer,Invitrogen、无关质粒以及空U6表达盒)相比计算。C.对与7B中平行处理的孔进行的蛋白质印迹分析示出CFB的减少(箭头)。
图8：A.U6-miR-7的图。本图使用人U6启动子(黑色箭头)来驱动靶向VEGF-A的miR-7的表达。miR-7编码序列与图2A中的那些序列一致并且以白色箭头示出，miR-7过客和miR-7效应子序列的位置以灰色箭头示出。U6-miR-7片段的序列列出为SEQIDNO:132。B.VMD2-miR-7的图。本图使用人VMD2启动子(黑色箭头)来驱动靶向VEGF-A的miR-7(白色箭头)的表达。VMD2-miR-7片段的序列列出为SEQIDNO:133。C.ICAM2-miR-7的图。本图使用人ICAM2启动子(黑色箭头)来驱动靶向VEGF-A的miR-7(白色箭头)的表达。ICAM2-miR-7片段的序列列出为SEQIDNO:134。D.RPE-65-miR-7的图。本图使用人RPE65启动子(黑色箭头)来驱动靶向VEGF-A的miR-7(白色箭头)的表达。RPE65-miR-7片段的序列列出为SEQIDNO:135。E.FLT-miR-7的图。本图使用人FLT启动子(黑色箭头)来驱动靶向VEGF-A的miR-7(白色箭头)的表达。FLT-miR-7片段的序列列出为SEQIDNO:136。
图9：A.U6-miR-7-miR-V-7的图。本图使用人U6启动子(黑色箭头)来驱动靶向VEGF-A和VEGFR2的miR-7-miR-V-7的表达。miR-7-miR-V-7编码序列以白色箭头示出，miR-7过客和miR-7效应子序列以及miR-V-7过客和miR-V-7效应子序列的位置以灰色箭头示出。U6-miR-7片段的序列列出为SEQIDNO:137。B.VMD2-miR-7miR-V-7的图。本图使用人VMD2启动子(黑色箭头)来驱动靶向VEGF-A和VEGFR2的miR-7miR-V-7(白色箭头)的表达。VMD2-miR-7miR-V-7片段的序列列出为SEQIDNO:138。C.ICAM2-miR-7miR-V-7的图。本图使用人ICAM2启动子(黑色箭头)来驱动靶向VEGF-A和VEGFR2的miR-7miR-V-7(白色箭头)的表达。ICAM2-miR-7miR-V-7片段的序列列出为SEQIDNO:139。D.RPE-65-miR-7miR-V-7的图。本图使用人RPE65启动子(黑色箭头)来驱动靶向VEGF-A和VEGFR2的miR-7miR-V-7(白色箭头)的表达。RPE65-miR-7miR-V-7片段的序列列出为SEQIDNO:140。E.FLT-miR-7miR-V-7的图。本图使用人FLT启动子(黑色箭头)来驱动靶向VEGF-A和VEGFR2的miR-7miR-V-7(白色箭头)的表达。FLT-miR-7片段的序列列出为SEQIDNO:141。
图10：A.U6-miR-V-7-miR-C-8-miR-P-9的图。本图使用人U6启动子(黑色箭头)来驱动靶向VEGFR2、CFB以及PDGFR-β的miR-V-7-miR-C-8-miR-P-9的表达。miR-V-7-miR-C-8-miR-P-9编码序列以白色箭头示出，miR-V-7过客和miR-V-7效应子序列、miR-C-8过客和miR-C-8效应子序列以及miR-P-9过客和miR-P-9效应子序列的位置以灰色箭头示出。U6-miR-V-7-miR-C-8-miR-P-9片段的序列列出为SEQIDNO:142。B.VMD2-miR-V-7-miR-C-8-miR-P-9的图。本图使用人VMD2启动子(黑色箭头)来驱动靶向VEGFR2、CFB以及PDGFR-β的miR-V-7-miR-C-8-miR-P-9(白色箭头)的表达。VMD2-miR-V-7-miR-C-8-miR-P-9片段的序列列出为SEQIDNO:143。C.ICAM2-miR-V-7-miR-C-8-miR-P-9的图。本图使用人ICAM2启动子(黑色箭头)来驱动靶向VEGFR2、CFB以及PDGFR-β的miR-V-7-miR-C-8-miR-P-9(白色箭头)的表达。ICAM2miR-V-7-miR-C-8-miR-P-9片段的序列列出为SEQIDNO:144。D.RPE65-miR-V-7-miR-C-8-miR-P-9的图。本图使用人RPE65启动子(黑色箭头)来驱动靶向VEGFR2、CFB以及PDGFR-β的miR-V-7-miR-C-8-miR-P-9(白色箭头)的表达。RPE65-miR-V-7-miR-C-8-miR-P-9片段的序列列出为SEQIDNO:145。E.FLT-miR-V-7-miR-C-8-miR-P-9的图。本图使用人FLT启动子(黑色箭头)来驱动靶向VEGFR2、CFB以及PDGFR-β的miR-V-7-miR-C-8-miR-P-9(白色箭头)的表达。FLT-miR-V-7-miR-C-8-miR-P-9片段的序列列出为SEQIDNO:146。
图11：本说明书通篇提到的序列。
实施方案的详述
现在将详细地参考本发明的某些实施方案。虽然本发明将结合所述实施方案加以描述，但应了解，不意图将本发明限于那些实施方案。相反，本发明意图涵盖可包括在如权利要求书所界定的本发明范围内的所有替代物、修改和等效物。
本领域技术人员将认识到类似于或等效于本文所述的那些方法和材料的多种方法和材料，其可能用于本发明的实践。本发明绝不限于所述的方法和材料。
应了解，本说明书中所公开和定义的本发明延伸至本文或附图所提到或显现的个别特征中的两者或更多者的所有替代组合。所有这些不同组合构成本发明的各种替代方面。
出于解释本说明书的目的，以下定义将适用并且在适当时，以单数形式使用的术语还将包括复数形式，并且反之亦然。在所陈述的任何定义与以引用的方式并入本文的任何文献冲突的情况下，应以下文所陈述的定义为准。
定义
如本文所用，除非上下文另外需要，否则术语“包含(comprise)”和所述术语的变化形式，如“包含(comprising)”、“包含(comprises)”以及“包含(comprised)”不意图排除其它添加剂、组分、整数或步骤。
术语“RNA干扰”或“RNAi”一般是指由细胞的细胞质中的双链RNA(dsRNA)分子起始的RNA依赖性基因沉默方法。所述dsRNA降低靶标核酸序列的表达，所述靶标核酸序列可为RNA表达产物减少的DNA，或与所述dsRNA分子共享大部分或总的同源性的RNA。
所谓“双链RNA”或“dsRNA”意味着能够抑制与其共享同源性的靶标核酸序列的表达的双链RNA分子。在一些实施方案中，所述dsRNA是发夹或茎环结构，具有任选地通过至少1个核苷酸连接的双链体区，并且称作“发夹RNA”或“短发夹RNAi剂”或“shRNA”。所述双链体在效应子序列和与所述效应子序列互补的序列(本文称作“效应子补体”)之间形成。典型地，所述效应子补体将为与其相应的效应子序列相同的长度。如下文将解释，所述效应子序列与所述靶标核酸序列互补。
“效应子序列”是核苷酸序列，当作为RISC复合物的一部分时结合于靶标核苷酸序列，由此靶向所述序列以由细胞破坏。其类似于背景章节中所讨论的“引导”链。所述效应子序列通过与来自靶标区的转录物序列互补或基本上互补而‘针对’所述靶标区，使得具有含有所述效应子序列的双链部分的RNA剂抑制靶标基因序列的表达。
类似于背景中所讨论的过客链的“效应子补体”与所述效应子具有充足互补性，使得其与所述效应子序列退火。有可能所述效应子补体将具有与所述靶标基因序列类似的序列，但不必要必须如此。
如以上章节中已经详述,“基本上互补(substantiallycomplementary)”或“基本互补性(substantialcomplementarity)”意味着所述序列具有充足互补性以使得能够进行退火杂交(如以后定义)。简单地说，如上文所述的基本互补性可在以下方面描述：
●在效应子与其补体之间，或在效应子与靶标序列的靶标区之间的同一性百分比(为80至100％)；或
●不互补的核苷酸的数目，为1、2、3、4或5，限制条件在于数目与80至100％的同一性百分比需求一致。
基本互补性因此包括100％互补性，但100％互补性也可在本说明书中通篇称作“互补(complementary)”或“互补(beingcomplementary)”。与靶标基因的区域互补或基本上互补的序列在连续靶标序列上具有序列互补性程度。一般来说，本发明的双链RNA区可经诱变以产生单一或数种核苷酸取代、缺失或添加。据信在效应子与其补体之间或在效应子与靶标序列的靶标区之间的这种差异程度将不会对所述ddRNAi剂能够抑制靶标序列的表达的能力造成负面影响。
当所述第一效应子序列确实具有将不与所述靶标序列进行G-C/A-U碱基配对的1、2、3、4或5个核苷酸时，优选差异在所述第一效应子序列的最初或最后5个核苷酸中，其中在所述效应子序列的中心部分中仅有1或2个核苷酸改变。
如上文所述，基本互补性意图意味序列是可杂交的或可退火的。术语“杂交”和“退火”(以及语法等效物)在本说明书中可关于核苷酸序列互换使用并且是指能够因其互补性而形成Watson-Crick碱基对的核苷酸序列。优选地，基本上互补的序列能够在中等或高严格度条件下杂交：
●高严格度条件：0.1xSSPE(或0.1xSSC)，0.1％SDS，65℃
●中等严格度条件：0.2xSSPE(或1.0xSSC)，0.1％SDS，50℃
或者，“基本上互补”还将由本领域技术人员理解为涉及非Watson-Crick碱基配对，尤其在RNA序列的情况下，如所谓的“摇摆对”，其可在RNA中的鸟苷与尿嘧啶残基之间形成。“互补”在本文中以其常见方式使用来指示Watson-Crick碱基配对，并且“非互补”用于意味非Watson-Crick碱基配对，即使所述非互补的序列可形成摇摆对或其它相互作用。在本发明的情况下，提及“非配对”序列具体说来涉及其间并未形成Watson-Crick碱基对的序列。
术语“RNAi剂”是指引发RNAi的dsRNA序列。这一术语可与“小干扰RNA”(siRNA剂)和小发夹RNA(shRNAi或hpRNAi剂)互换使用，其中发夹具有茎-环结构。
发夹结构的“环”是额外序列，其中至少一些核苷酸与本身、靶标序列、效应子序列或效应子补体非互补。所述环可为能够形成环的2至100个核苷酸的序列。并非所述环序列的所有核苷酸均需要为非退火的。例如，在环序列ACUGUGAAGCAGAUGAGU中，核苷酸ACU可与AGU退火，而间插GUGAAGCAGAUG序列保持为非退火的。
在其中所述ddRNAi剂作为miRNA结构的一部分表达的实施方案中，环序列可源自所述miRNA，并且由ME序列编码。
“微RNA”或“miRNA”是存在于生物体中的天然存在的小的非编码RNA分子，其在基因表达的转录后调节中起作用。miRNA转录物能够形成发夹样结构；典型地在双链RNA区内或邻近处含有错配和凸起。其中优选地表达本发明的ddRNAi剂的miRNA结构含有错配和插入，如上文详述。Wu等人(2011)显示错配的双链体(在过客链中含有错配)有时显示增加的沉默活性，这可能归因于其与内源miRNA的较大的结构相似性。同样，Gu等人(2012)显示在shRNA分子中的环序列的邻近处引入凸起可导致增加的Dicer加工的精确度。
在双链、折叠的miRNA结构中，上部链的至少50％的核苷酸与底部链的核苷酸退火。关于非退火(即，未配对)核苷酸，其可为插入，即其在相对链上缺乏互补核苷酸，或其可为错配，使得其不退火。例如，G和A。所述双链、折叠的miRNA结构可含有2个或更多个退火的核苷酸，由1个或多个非退火核苷酸分离，以生成具有“泡”或“凸起”的双链RNA结构，其中核苷酸并未退火。
所谓“miRNA编码序列”或“ME序列”意味着含于ddRNAi表达盒(参见下文定义和描述)内的DNA序列，所述表达盒编码能够折叠成miRNA结构的RNA。ddRNAi剂的效应子序列和效应子补体在所述miRNA结构内或作为所述miRNA结构的一部分表达。所述ME序列具有第一和第二部分。在用于表达单一发夹(具有一个或多个效应子/效应子补体对)的表达盒中，所述ME序列的第一部分位于5’最末端效应子或效应子补体编码序列的上游(即5’)，并且第二部分位于3’最末端效应子或效应子补体编码序列的下游(即3’)。
在用于多发夹结构的表达盒的情况下，各效应子/效应子补体对具有相应的第一和第二ME序列，其中所述第一ME序列在效应子或效应子补体编码序列的上游并且所述第二部分在相应的效应子或效应子补体编码序列的下游。在具有以下示例性结构的表达盒中，按5’至3’方向：
●启动子
●第一ME序列；
●第一效应子；
●第一效应子补体序列；
●第二ME序列；
●第三ME序列；
●第二效应子序列；
●第二效应子补体序列；以及
●第四ME序列。
应了解，所述第二和第三ME序列可为(使用示例性序列来说明这一点)连续的，可在其间具有间插序列，或可为与所述第二和第三ME序列起相同作用的单一ME序列。
i)连续的：ggtatattgctgttgacagtgagcgaggtatattgctggggacagtgagccc
ME序列2ME序列3
ii)间插的：ggtatattgctgttgacagtgagcgaATTGCCATGggtatattgctggg gacagtgagccc
ME序列2间插的ME序列3
iii)单一的：ggtatattgctgttgacagtgagcgaggtatattgctggggacagtgagccc
ME序列
所述RNAi剂的双链或双链体区为至少17个碱基对长，并且通常在17至30个碱基对范围内。RNAi剂可以化学方式或以酶促方式在细胞外部合成并且随后递送至细胞，或可通过适当载体在细胞中体内表达(参见例如美国专利号6,573,099、WO2004/106517以及WO1999/49029，其均以引用的方式并入本文)。
术语“DNA指导的RNAi剂”或“ddRNAi剂”是指从DNA表达盒(“ddRNAi表达盒”)转录的RNAi剂。视所述ddRNAi表达盒内的终止子和启动子的布置而定，所述表达盒可表达具有单一或多种效应子序列的ddRNAi剂，或可表达多种ddRNAi剂。从所述表达盒转录的ddRNAi剂可转录为能够自身退火成单一发夹结构的单一RNA，所述单一发夹结构具有通过至少2个核苷酸连接的双链体区。所述单一发夹可包括一个效应子序列和其补体(参见图1B或E)或多个效应子序列和其补体(参见图1A或D)。或者，所述剂可为具有多个shRNA结构域的单一RNA(即，由所述效应子序列和其补体形成的多发夹结构—参见图1C或F)。
所述ddRNAi表达盒可连接至称作ddRNAi载体或ddRNAi构建体的载体中。所述载体可提供指定所述ddRNAi表达盒的体内或体外转录的序列。所述载体可另外用作所述ddRNAi表达盒的递送媒介物。基于病毒的载体例如将产生适用于所述ddRNAi表达盒的表达以及可与病毒递送相容的ddRNAi构建体。
当外源或异质核酸或载体已经引入细胞中时，所述细胞已经通过所述核酸“转化”、“转导”或“转染”。转化DNA可或可不整合(共价连接)至细胞的基因组中。关于真核细胞，稳定转化的细胞是其中转化的DNA已经整合至宿主细胞染色体中或维持在染色体外(游离基因)，使得所述转化DNA在细胞复制期间由子细胞继承的细胞。在非复制型、分化细胞中，转化DNA可持续为游离基因。
“基因表达”可提及转录或翻译或两者。
“表达的抑制”是指来自靶标基因的蛋白质和/或mRNA产物的缺乏或其含量的可观测的降低。所述抑制并非必须为绝对的，而是可为足以由于施用本发明的RNAi或ddRNAi剂或siRNA剂或ddRNAi表达盒或表达构建体而存在可检测或可观测的改变的部分抑制。抑制可通过确定来自靶标核酸的mRNA和/或蛋白质产物的含量相对于缺乏所述ddRNAi剂或构建体的细胞的降低来测量，并且可低达1％、5％或10％，或可为绝对的，即100％抑制。抑制的效应可通过检查细胞或生物体的外观特性，即定量和/或定性表型来确定。
“脱靶”效应是用于描述使用RNAi试剂的治疗的无意副作用的术语。这个术语经常被认为涉及由于与过客或效应子序列和另一靶标基因的偶然同源所致的靶标基因的无意敲低，不过也可发生起因于敲低的代谢补偿的微妙效应。通过内源RNAi途径加工miRNA经常导致仅效应子链装载至RISC中，和过客链的降解。脱靶效应的一种可能来源是过客链非预期地并入RISC中，使得过客序列可因此使偶然地与其共享同源性的基因沉默。有证据表明RISC装载中的步骤“感测”在dsRNA前体中的潜在靶标位点中RNA双链体的预测的热力学稳定性，并且优先装载5’末端来自所述双链体的不太稳定的末端的链。一种使脱靶效应的可能性降至最低的策略是使用双重荧光素酶测定针对过客链的活性筛选ddRNAi分子。这条链装载至RISC中是不合需要的。
如本文所用，“血管内皮生长因子-A基因”或“VEGF-A基因”包括编码刺激血管生成的蛋白质的基因。在一个实施方案中，所述VEGF-A基因编码如Genbank中以登录号NM_001025366所示的核苷酸序列(SEQIDNO:79)，所述序列编码人VEGF-A。在另一实施方案中，VEGF-A基因是所述VEGF-A基因的直系同源或旁系同源基因，包括但不限于如Genbank中以登录号NM_001025250(小家鼠，SEQIDNO:80)或XM_001089925(猕猴，SEQIDNO:81)所示的核苷酸序列。在另一实施方案中，所述VEGF-A基因可为人基因或来自如本文所述的动物的基因并且包括等位基因变体。
如本文所用，“血管内皮生长因子受体2基因”或“VEGFR2基因”包括编码VEGF的受体的基因。在一个实施方案中，所述VEGFR2基因编码如Genbank中以登录号NM_002253所示的核苷酸序列(SEQIDNO:82)，所述序列编码人VEGFR2。在另一实施方案中，VEGFR2基因是所述VEGFR2的直系同源或旁系同源基因，包括但不限于如Genbank中以登录号NM_010612(小家鼠，SEQIDNO:83)或XM_001086814(猕猴，SEQIDNO:84)所示的核苷酸序列。在另一实施方案中，VEGFR2基因可为人基因或来自如本文所述的动物的基因并且包括等位基因变体。
如本文所用，“β型血小板源性生长因子受体基因”或“PDGFR-β基因”包括编码PDGFR-β蛋白的基因。在一个实施方案中，所述PDGFR-β基因编码如Genbank中以登录号NM_002609所示的核苷酸序列(SEQIDNO:85)，所述序列编码人PDGFR-β。在另一实施方案中，PDGFR-β基因是所述PDGFR-β的直系同源或旁系同源基因，包括但不限于如Genbank中以登录号NM_001142706(小家鼠，SEQIDNO:86)或XM_00110759(猕猴，SEQIDNO:87)所示的核苷酸序列。在另一实施方案中，PDGFR-β基因可为人基因或来自如本文所述的动物的基因并且包括等位基因变体。
如本文所用，“补体因子B基因”或“CFB基因”包括编码CFB蛋白(玻璃疣的组分)的基因。在一个实施方案中，所述CFB基因编码如Genbank中以登录号NM_001710所示的核苷酸序列(SEQIDNO:88)，所述序列编码人CFB。在另一实施方案中，CFB基因是所述CFB的直系同源或旁系同源基因，包括但不限于如Genbank中以登录号NM_00114270(小家鼠，SEQIDNO:89)或XM_001113553(猕猴，SEQIDNO:90)所示的核苷酸序列。在另一实施方案中，CFB基因可为人基因或来自如本文所述的动物的基因并且包括等位基因变体。
如果序列由基因复制事件分离，那么所述序列是“旁系同源的”：如果生物体中的基因复制以占据同一基因组中的两个不同位置，那么两个拷贝是旁系同源的。
如果序列由物种形成事件分离，那么所述序列是“直系同源的”：当物种趋异成两种独立物种时，所得物种中的单一基因的趋异拷贝被认为直系同源的。
如本文所用，“定量表型性状”是指与宿主细胞中核酸的分子表达相关的性状并且可因此包括转录或复制的RNA分子的量、转录后修饰的RNA分子的量、翻译的肽或蛋白质的量或所述肽或蛋白质的活性。
其中表型是定性性状的核酸的表型表达的减少意味着在本发明的RNAi剂存在下，当与其中所述RNAi剂不存在的情形相比时，所述表型性状转变成不同状态。核酸的表型表达的减少可因此作为(一部分)所述核酸的稳态含量的减少、(一部分)所述核酸的翻译的减少或转录的RNA或翻译的多肽的存在对真核细胞或生物体的影响的减少来测量，并且将最终导致改变的表型性状。显然，所关注的核酸的表型表达的减少可伴随表型的可观测的改变或与表型的可观测的改变有关。所述测定可经由生物化学技术，如Northern杂交、定量实时PCR测定、基因表达测定、抗体结合、ELISA、RIA、蛋白质印迹以及本领域中已知的其它测定和技术来进行。
“靶标核酸”可为RNA或DNA，其转录产物是被靶向的编码或非编码序列、内源或外源的。
“治疗组合物”或“药物组合物”或“用于治疗的组合物”是指包括ddRNAi剂、ddRNAi表达盒、ddRNAi构建体或siRNA剂的组合物。
措辞“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”是指治疗性治疗，其中目标是减慢(减轻)不合需要的生理学改变或病症。出于本发明的目的，有益或所需的临床结果包括但不限于AMD症状的缓和、使AMD稳定(即，不恶化或进展)以及使CNV稳定。
措辞“治疗有效量”意味本发明化合物的量，其(i)治疗特定疾病、病况或病症，(ii)削弱、改善或消除所述特定疾病、病况或病症的一种或多种症状，(iii)预防或延迟本文所述的特定疾病、病况或病症的一种或多种症状的发作，(iv)预防或延迟所述特定疾病、病况或病症的进展，或(v)在一定程度上逆转治疗之前所引起的损害。所述逆转并非必须为绝对的，但治疗后视敏度的任何临床上相关的恢复均被视为损害的逆转。
本发明提供一种新型RNAi剂，和所述RNAi剂用于降低受影响的个体、特别是具有湿性AMD的那些个体中与AMD相关的视敏度的衰退的用途。治疗旨在以下一者或多者：
i.使用含有一种或多种旨在使与VEGF-A表达相关的特异性基因沉默的序列的DNA构建体通过VEGF-A翻译和从视网膜细胞的后续分泌的长期敲低来控制与脉络膜新生血管(CNV)相关的血管生成。VEGF-A刺激血管生成，并且因此刺激来自视网膜后面的脉管系统的血管的异常外生长。多种现有疗法仅用于“吸干”分泌的VEGF-A，其可使视力稳定，但并非必定改善所有患者的视力。
ii.血管生成的额外控制可通过VEGF-A和其受体VEGFR2的基因敲低获得，因为这种策略将预期在两个不同步骤中干扰所述方法。
iii.AMD的逆转可通过三种靶标，即VEGFR2、PDGFR-β以及CFB的敲低实现。VEGFR2敲低将预期控制血管生成，PDGFR-β敲低将预期抑制或逆转初生血管形成并且CFB基因敲低将预期抑制或甚至逆转玻璃疣沉积
iv)限制治疗频率，并且限制经由局部注射治疗性分子来治疗RPE细胞。
鉴定靶标基因内的适当靶标序列和设计基于那些序列工作的RNAi剂并不是常规的。如结果章节中将证明，理论上看起来像良好候选物的靶标序列可能未必有效地使所述靶标沉默，或可能无法达成用于治疗性目的的有效含量。一些效应子序列比其它效应子序列有效得多地使靶标沉默，具体说来将过客链并入RISC中是不合需要的，因此这可导致显著脱靶效应和随之发生的毒性。但仅通过肉眼检查序列本身无法预测哪些序列能够被沉默，无论其可沉默至何种程度，并且即使其将足以达成本发明的目的。当设法使2种或更多种无关靶标沉默时，更是如此。
尽管本领域中承认VEGF-A是用于AMD疗法的合适靶标，但迄今创建有效疗法的努力已经受到背景中所概述的问题困扰。关于具体通过RNAi技术沉默，先前使用体外产生的siRNA剂的努力已经由于siRNA与膜结合TLR3的相互作用和干扰素的后续活化而未成功。另外，分泌大部分VEGF-A的细胞是RPE细胞，一般发现埋在朝向眼睛后面的专门细胞层下面。RNAi部分是高电荷态复合物并且可能由于这种物理特性而难以跨越多个细胞层。靶标的新范围、所述ddRNAi剂以及所用的病毒递送剂设法克服这些问题。
除VEGF-A以外，这些靶标还包括以下一者或多者：
●VEGFR2：VEGF-A的受体；预期使VEGFR2沉默具有与使VEGF-A沉默类似的结果
●PDGFR-β：PDGFR-β的受体。这种分子在内皮细胞的募集和稳定化中起作用，这对于初生血管的稳定化至关重要。
●CFB：这是玻璃疣的主要组分，玻璃疣是与AMD相关的标志细胞外沉积物。(Anderson等人2010)。使CFB沉默可抑制玻璃疣的形成。
RNA干扰(RNAi)是由细胞的细胞质中的短双链RNA分子起始的RNA依赖性基因沉默方法。在哺乳动物中，RNAi是由称作小干扰RNA(siRNA)的双链RNA分子介导。所述RNAi剂的双链或双链体区为至少17个碱基对长，并且通常在17至30个碱基对范围内。RNAi剂可以化学方式或以酶促方式在细胞外部合成并且随后递送至细胞，或可通过适当载体在细胞中体内表达(如AAV、腺病毒、慢病毒或非基于病毒脂质体的递送系统)。
RNAi剂作为AMD治疗剂的临床前测试需要广泛使用动物模型。小鼠(小家鼠)和灵长类动物(例如猕猴、食蟹猴)模型广泛用于测试治疗的功效，并且其它物种常用作模型来确定治疗化合物的临床安全性，如狗(家犬)。关于RNAi治疗剂，宜设计靶向在人与各种临床前测试物种之间高度保守的AMD相关基因的核苷酸序列的试剂，因为单一RNAi试剂可用于临床前测试的所有阶段。关于不良保守性基因，具有在不同测试物种之间略有不同的序列的多种RNAi试剂必须平行测试以精确地确定潜在毒性。
因此，可能的情况下本申请中所述的RNAi试剂设计成靶向在人与潜在测试物种(小鼠、狗以及灵长类动物，如猕猴)之间保守的序列，因此这对于药物开发程序提供显著益处。
ddRNAi剂
RNAi剂可从DNA载体表达，称作DNA指导的RNAi或ddRNAi。其可以最少脱靶事件直接靶向基因活性。在AMD的情况下，这提供解决未满足的临床治疗需要的唯一机会。因此，在本发明的一方面，提供一种用于抑制AMD相关基因中一种或多种靶标序列的表达的DNA指导的RNA干扰(ddRNAi)剂，所述ddRNAi剂至少包含：
至少17个核苷酸长的第一效应子序列；和
第一效应子补体序列；
其中所述第一效应子序列与所述一种或多种靶标序列的转录物中的一个或多个靶标区互补或基本上互补。
典型地，所述第一效应子序列与所述第一效应子补体序列形成双链区。
本发明的ddRNAi剂的序列必须具有与所述AMD相关基因(如VEGF-A、VEGFR2、CFB以及PDGFR-β基因)的充足同一性，以便介导靶标特异性RNAi。
所述第一效应子序列为至少17个核苷酸长，优选地17至30个核苷酸并且更优选地17至21个核苷酸。其可为17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸长。当所述第一效应子序列比17个核苷酸长时，优选所述第一效应子序列的至少17个相邻核苷酸与互补链形成双链区。根据本发明的这个实施方案的ddRNAi剂因此具有通过效应子序列的长度和数目确定的最大长度，即各效应子序列并未包含在较长序列内。
本发明的ddRNAi剂抑制AMD相关靶标基因的表达。优选地，所述AMD相关基因是VEGF-A，或VEGFR2、CFB以及PDGFR-β中的一者或多者，并且各效应子序列选自由来自SEQIDNO:40-78中的任一者的序列内的任何10个或更多个相邻核苷酸组成的组。
如下表所说明，当将要抑制、阻止或降低的AMD相关基因是VEGF-A时，各效应子序列选自SEQIDNO:40-49。当将要抑制、阻止或降低的AMD相关基因是VEGFR2时，各效应子序列选自SEQIDNO:50-59。当将要抑制、阻止或降低的AMD相关基因是PDGFR-β时，各效应子序列选自SEQIDNO:60-69。当将要抑制、阻止或降低的AMD相关基因是CFB时，各效应子序列选自SEQIDNO:70-78。
表1：VEGF-A、VEGFR2、CFB以及PDGFR-β基因靶标序列和其相应的ddRNAi效应子序列
a靶标基因是人VEGF-A(NM_0010253660)、VEGFR2(NM_002253)、PDGFR-β(NM_002609)以及CFB(NM_001710)；基因名称下面的命名是指靶向所述特定基因的ddRNAi构建体的型式。
b针对所列出的人序列的靶标位置。
c靶标序列是由所述效应子序列识别的DNA序列。
d效应子序列是通过靶向AMD相关基因的ddRNAi剂的dicer加工所产生的预测的RNA序列；T是指其中效应子经过修饰以维持所表达RNA的结构的构建体。
本发明的ddRNAi剂优选地在miRNA结构内或作为miRNA结构的部分表达。这些miRNA结构具有显示为“miR序列”的序列并且在表2中列出(SEQIDNO:91-129)，所述序列设计成表达所指示的效应子序列(SEQIDNO:40-78)。含有用于表达所述miRNA结构的表达盒的相应构建体也显示为“miR-命名”。
表2：呈现AMD相关基因的强序列特异性沉默的miR构建体
a关于针对所指示的人靶标基因的沉默活性和有利链特异性测试的miR构建体(参见图4–7)。
b对应于miR构建体的插入物的SEQIDNO。
c由所指示的miR构建体产生的预测的效应子序列的SEQIDNO。
本发明的任何ddRNAi剂均可在miRNA结构内或作为miRNA结构的部分表达。如本说明书中通篇将解释，这可有助于所述ddRNAi剂的更精确加工和细胞内的较低毒性。
在本发明的一个实施方案中，本发明的ddRNAi剂抑制VEGF-A基因中一种或多种靶标序列的表达。靶标序列优选地选自在表1中列出的ddRNAiVEGF-A靶标序列(SEQIDNO:1-10)；将通过靶向这些序列的ddRNAi剂的dicer加工产生的相应的效应子序列分别以SEQIDNO:40-49显示。应注意已经选择VEGF-A靶标序列和效应子序列来显示在人与临床前测试物种小鼠、狗以及猕猴之间核苷酸序列的保守性。
在本发明的一个替代实施方案中，本发明的ddRNAi剂抑制VEGFR2基因中一种或多种靶标序列的表达。靶标序列优选地选自在表2中列出的ddRNAiVEGFR2靶标序列(SEQIDNO:11-20)；相应的效应子序列因此选自分别如表2中所示的SEQIDNO:50-59。应注意VEGFR2靶标(SEQIDNO:11-20)和效应子序列(SEQIDNO:50-59)在人与临床前测试物种小鼠和猕猴之间是同一的或差别仅在于单一核苷酸。
在本发明的一个替代实施方案中，本发明的ddRNAi剂抑制PDGFR-β基因中一种或多种靶标序列的表达。靶标序列优选地选自在表2中列出的ddRNAiPDGFR-β靶标序列(SEQIDNO:21-30)；相应的效应子序列因此选自分别如表2中所示的SEQIDNO:60-69。应注意PDGFR-β靶标(SEQIDNO:21-30)和效应子序列(SEQIDNO:60-69)在人与临床前测试物种小鼠和猕猴之间是同一的或差别仅在于单一核苷酸。
在本发明的一个替代实施方案中，本发明的ddRNAi剂抑制CFB基因中一种或多种靶标序列的表达。靶标序列优选地选自在表1中列出的ddRNAiCFB靶标序列(SEQIDNO:31-39)；相应的效应子序列因此选自分别如表2中所示的SEQIDNO:70-78。应注意CFB靶标(SEQIDNO:31-39)和效应子序列(SEQIDNO:70-78)在人与临床前测试物种小鼠和猕猴之间是同一的或差别仅在于单一核苷酸。
根据先前提供的解释，在DNA靶标序列与所述ddRNAi剂的相应的效应子序列之间的关系可显示为(使用来自表1的靶标SEQIDNO:2和其相应的效应子序列SEQIDNO:41)：
5’GGCCTCCGAAACCATGAACTT3’-VEGF-A的靶标序列(SEQIDNO:2)
5’GGCCUCCGAAACCAUGAACUU3’–SEQIDNO:2的mRNA转录物
3’AAGUUCAUGGUUUCGGAGGCC5’–针对靶标SEQIDNO:2的ddRNAi剂的效应子序列(SEQIDNO:41)，当按5’至3’方向读取时，可见所述序列与所述靶标序列的转录物基本上互补。
如背景章节中所解释，所述ddRNAi剂的两条链均具有作为效应子序列的潜能。然而，有证据表明序列的特定特征可有利于一条链进入RISC并且另一条链受到破坏。有证据表明RISC装载中的步骤“感测”在dsRNA前体中的潜在靶标位点中RNA双链体的热力学稳定性，并且优先装载5’末端来自所述双链体的不太稳定的末端的链。因此，典型地调节靶标位点序列以使在所述靶标位点的3’末端的AT碱基对的数目增至最大，即，使效应子链的5’末端的A或U碱基的数目增至最大。精确的靶标位点的清单接着针对可能测试物种(具体说来小鼠和猴)之间的保守性进行筛选。靶标位点序列接着针对人转录物组使用BLAST筛选，并且弃去那些显示与其它人基因(>3个错配)的高同源性的序列。基于这些靶标序列的构建体在miRNA骨架中制备并且如下文所述凭经验测试活性和链选择性。这些序列偏好在优选的实施方案中反映出，并且数据在显示一些序列优于其它序列的优势的实施例章节中提供。
例如，在本发明的这方面的一个实施方案中，提供一种用于抑制AMD相关基因中一种或多种靶标序列的表达的DNA指导的RNA干扰(ddRNAi)剂，所述ddRNAi剂至少包含：
在5’UAUGUGGGUGGGUGUGUCUAC3’(SEQIDNO:47)内的任何10个或更多个相邻核苷酸的第一效应子序列；和
第一效应子补体序列。
所述第一效应子序列与AMD相关基因中一种或多种靶标序列的转录物中的靶标区基本上互补。在这个实施例中，所述靶标基因是VEGF-A。
优选地，所述第一效应子序列是在5’UAUGUGGGUGGGUGUGUCUAC3’(SEQIDNO:47)内的至少17个或更多个相邻核苷酸。
当所述第一效应子序列具有不同于SEQIDNO:47的1、2、3、4或5个核苷酸时，所述差异优选地存在于最初和/或最后5个核苷酸中，并且优选地，至少中心10个核苷酸与一种或多种靶标序列的转录物中的靶标区100％互补。
在替代实施方案中，所述ddRNAi剂包含在SEQIDNO:40、SEQIDNO:41、SEQIDNO:42、SEQIDNO:43、SEQIDNO:44、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52、SEQIDNO:53、SEQIDNO:54、SEQIDNO:55、SEQIDNO:56、SEQIDNO:57、SEQIDNO:58、SEQIDNO:59、SEQIDNO:60、SEQIDNO:61、SEQIDNO:62、SEQIDNO:63、SEQIDNO:64、SEQIDNO:65、SEQIDNO:66、SEQIDNO:67、SEQIDNO:68、SEQIDNO:69、SEQIDNO:70、SEQIDNO:71、SEQIDNO:72、SEQIDNO:73、SEQIDNO:74、SEQIDNO:75、SEQIDNO:76、SEQIDNO:77或SEQIDNO:78内的任何10个或更多个、优选地任何17个或更多个相邻核苷酸的第一效应子序列。
在尤其优选的实施方案中，所述ddRNAi剂包含在能够将靶标基因区的表达抑制至少70％的序列内的任何10个或更多个、优选地任何17个或更多个相邻核苷酸的第一效应子序列。优选地，在这个实施方案中，所述第一效应子选自SEQIDNO:47，其靶向SEQIDNO:8的序列。
所述第一效应子序列可包含选自在来自由SEQIDNO:40-78组成的组的序列内的任何10个或更多个并且优选地任何17个或更多个相邻核苷酸的序列，或者，各效应子序列可为SEQIDNO:40-78的变体，具有1、2、3、4或5个核苷酸的变化。在又一实施方案中，各效应子序列可由20个核苷酸组成，其中17、18、19或所有20个核苷酸是来自选自由SEQIDNO:40-78组成的组的序列的相邻核苷酸。
多重靶向ddRNAi剂
具有多种效应子序列的ddRNAi剂具有能够靶向可存在于个体之间的多种分子靶标和其天然存在的变体的优势，以及如与单一效应子序列相对用多种效应子序列实现的相加或协同效应的优势。在本发明中，在一个实施方案中存在选自VEGF-A、VEGFR2、CFB以及PDGFR-β的2种或3种不同靶标基因，尤其有利的是使用单一构建体来靶向所述2种或3种基因。这消除了递送各靶向不同基因的多种ddRNAi剂的需要。如本领域技术人员应了解，将难以确保递送将产生各剂的相等并且充足的浓度。
在本发明的一个实施方案中，所述ddRNAi剂包含两种或更多种效应子序列以使得能够靶向AMD相关基因的超过一种靶标序列。所述多种靶标序列可在一种基因的同一区域中。例如，在个体之间具有天然序列变化的VEGF-A、VEGFR2、CFB或PDGFR-β内的17至30个核苷酸的区域，优选地17至21个核苷酸的区域。或者，所述靶标序列可在一种靶标基因的不同区域中，其中所述靶标基因可为VEGF-A、VEGFR2、CFB或PDGFR-β。
如上文所注，所述靶标序列也可在不同的AMD相关基因中。例如，第一效应子序列靶向VEGFR2中的序列，而在相同ddRNAi剂中的第二效应子序列靶向VEGF-A基因中的序列。在一个优选实施方案中，存在至少2种效应子序列，每一种靶向VEGF-A和VEGFR中的每一者中的序列。在一个替代实施方案中，存在至少3种效应子序列，每一种靶向VEGFR2、CFB以及PDGFR-β中的每一者中的序列。
为了提供较大特异性，所述ddRNAi剂包含以下(无特定顺序)：
●至少17个核苷酸长的第一效应子序列；
●至少17个核苷酸长的第二效应子序列；
●第一效应子补体序列；以及
●第二效应子补体序列。
多重靶向ddRNAi剂的第一和第二效应子序列与其各自的效应子补体形成双链区。优选地，所述第一和第二效应子序列是17至30个核苷酸长。更优选地，所述第一和第二效应子序列均选自在以上表1中列出的序列SEQIDNO:40-78中的任一者内的任何10个或更多个并且优选地任何17个或更多个相邻核苷酸，或是具有1、2、3、4或5个与表1中列出的那些序列不同的核苷酸的序列。
在一个实施方案中，所述第一效应子序列选自在来自由SEQIDNO:40-78组成的组中的任一者的序列内的任何10个或更多个并且优选地任何17个或更多个相邻核苷酸，并且所述第二效应子序列选自在来自由SEQIDNO:40-78组成的组中的任一者的序列内的任何10个或更多个并且优选地任何17个或更多个相邻核苷酸。所述第一和第二效应子序列可均为相同序列，或可或者为不同序列。
所述第一和第二效应子序列可各自包含选自在来自由SEQIDNO:40-78组成的组的序列内的任何10个或更多个相邻核苷酸的序列，或者，各效应子序列也可为SEQIDNO:40-78的变体，具有1、2、3、4或5种核苷酸变化。在又一实施方案中，各效应子序列可由20个核苷酸组成，其中17、18、19或所有20个核苷酸是来自选自由SEQIDNO:40-78组成的组的序列的相邻核苷酸。当存在两种或更多种效应子序列时，所述序列可表示上文所述的3种类型的组合。
在尤其优选的实施方案中，所述第一和第二效应子序列包含在能够将靶标基因区的表达抑制至少70％的序列内的任何10个或更多个、优选地任何17个或更多个相邻核苷酸。优选地，在这个实施方案中，各效应子序列选自在由SEQIDNO:47和SEQIDNO:56组成的序列内的任何10个或更多个并且优选地任何17个或更多个相邻核苷酸，使得提供一种用于抑制AMD相关基因中一种或多种靶标序列的表达的DNA指导的RNA干扰(ddRNAi)剂，所述ddRNAi剂按5’至3’方向包含
在5’UAUGUGGGUGGGUGUGUCUAC3’(SEQIDNO:47)内的任何10个或更多个相邻核苷酸的第一效应子序列；
第一效应子补体序列；
在5’UGUAACAGAUGAGAUGCUCCA3’(SEQIDNO:56)内的任何10个或更多个相邻核苷酸的第二效应子序列；以及
第二效应子补体序列
其中各效应子序列与所述一种或多种靶标序列的转录物中的一个或多个靶标区基本上互补。
长发夹型式
当所述ddRNAi剂含有超过一种效应子序列，并且所述ddRNAi剂作为RNA的单一链表达时，其将折叠以形成不同结构，这视所述效应子序列和与所述效应子序列互补的序列的顺序而定。在一个实施方案中，提供一种用于抑制AMD相关基因、优选地VEGF-A基因和/或VEGFR2、CFB以及PDGFR-β基因中的一者或多者中一种或多种靶标序列的表达的DNA指导的RNA干扰(ddRNAi)剂，所述ddRNAi剂按5’至3’方向至少包含：
至少17个核苷酸长的第一效应子序列；
至少17个核苷酸长的第二效应子序列；
第二效应子补体序列；以及
第一效应子补体序列
其中各效应子序列与所述一种或多种靶标序列的转录物中的一个或多个靶标区基本上互补。这将产生具有如图1A中所示的结构的ddRNAi剂。还参见WO2004/106517，其以引用的方式并入本文。
或者，至少一种效应子并且优选地两种效应子序列与所述一种或多种靶标序列的转录物中的一个或多个靶标区100％互补。优选地，所述第一和第二效应子序列均选自由在SEQIDNO:40-78中的任一者内的任何10个或更多个并且优选地任何17个或更多个相邻核苷酸组成的组。例如，在一个实施方案中，提供一种用于抑制AMD相关基因中一种或多种靶标序列的表达的DNA指导的RNA干扰(ddRNAi)剂，所述ddRNAi剂按5’至3’方向至少包含：
第一效应子序列5’AAGUUCAUGGUUUCGGAGGCC3’(SEQIDNO:41)；
第二效应子序列5’UCUUUCUUUGGUCUGCAUUCA3’(SEQIDNO:44)；
第二效应子补体；以及
第一效应子补体
其中所述AMD相关基因是VEGF-A。
各效应子序列与所述一种或多种靶标序列的转录物中的一个或多个靶标区基本上互补。
或者，至少一种效应子并且优选地两种效应子序列与所述一种或多种靶标序列的转录物中的一个或多个靶标区100％互补。
在尤其优选的实施方案中，所述第一和第二效应子序列包含在能够将靶标基因区的表达抑制至少70％的序列内的任何10个或更多个、优选地任何17个或更多个相邻核苷酸。优选地，在这个实施方案中，各效应子序列选自SEQIDNO:40-78，更优选地选自SEQIDNO:40-59并且最优选地选自SEQIDNO:40-49。
在另一实施方案(即其中所述ddRNAi剂具有3种效应子序列的实施方案)中，提供一种用于抑制靶标基因中一种或多种靶标序列的表达的DNA指导的RNA干扰(ddRNAi)剂，所述ddRNAi剂按5’至3’方向至少包含：
第一效应子序列5’AAGUUCAUGGUUUCGGAGGCC3’(SEQIDNO:41)；
第二效应子序列5’UCUUUCUUUGGUCUGCAUUCA3’(SEQIDNO:44)；
第三效应子序列5’UAUGUGGGUGGGUGUGUCUAC3’(SEQIDNO:47)；
第三效应子补体序列；
第二效应子补体序列；以及
第一效应子补体序列。
各效应子序列与所述一种或多种靶标序列的转录物中的一个或多个靶标区基本上互补。
或者，至少一种效应子并且任选地所述3种效应子中的2种或所有3种效应子与所述一种或多种靶标序列的转录物中的一个或多个靶标区100％互补。
在尤其优选的实施方案中，所述第一、第二以及第三效应子序列包含在能够将靶标基因区的表达抑制至少70％的序列内的任何10个或更多个、优选地任何17个或更多个相邻核苷酸。优选地，在这个实施方案中，各效应子序列选自SEQIDNO:40-78，更优选地选自SEQIDNO:40-59并且最优选地选自SEQIDNO:40-49。
熟练人员还应了解，效应子和效应子补体的顺序可改变，限制条件在于通过使所述效应子序列与其效应子补体退火以形成dsRNA而形成单一、长发夹结构。例如，在2种效应子序列的ddRNAi剂中，所述序列可按以下示例性5’至3’顺序布置：
●第一效应子-第二效应子-第二效应子补体-第一效应子补体；
●第二效应子-第一效应子-第一效应子补体-第二效应子补体；
●第一效应子-第二效应子补体-第二效应子-第一效应子补体；
●第一效应子补体-第二效应子补体-第二效应子-第一效应子；
●第一效应子补体-第二效应子-第二效应子补体-第一效应子。
在3种效应子序列的ddRNAi剂中，所述序列可按以下示例性5’至3’顺序布置：
●第一效应子-第二效应子-第三效应子-第三效应子补体-第二效应子补体-第一效应子补体
●第一效应子-第二效应子补体-第三效应子-第三效应子补体-第二效应子-第一效应子补体；
●第一效应子-第二效应子-第三效应子补体-第三效应子-第二效应子补体-第一效应子补体
●第一效应子-第三效应子-第二效应子补体-第二效应子-第三效应子补体-第一效应子补体
●第一效应子补体-第二效应子补体-第三效应子补体-第三效应子-第二效应子-第一效应子补体
●第一效应子补体-第二效应子补体-第三效应子-第三效应子补体-第二效应子-第一效应子。
在其它实施方案中，所述第一效应子序列可选自在来自由SEQIDNO:40-78组成的组的序列内的任何10个或更多个并且优选地任何17个或更多个相邻核苷酸；所述第二效应子序列可选自在来自由SEQIDNO:40-78组成的组的序列内的任何10个或更多个并且优选地任何17个或更多个相邻核苷酸；所述第三效应子序列可选自在来自由SEQIDNO:40-78组成的组的序列内的任何10个或更多个并且优选地任何17个或更多个相邻核苷酸；并且任何其它效应子序列均可选自在来自由SEQIDNO:40-78组成的组的序列内的任何10个或更多个并且优选地任何17个或更多个相邻核苷酸。或者，各效应子序列也可为SEQIDNO:40-78的变体，具有1、2、3、4或5个核苷酸的变化。优选地，所述差异存在于最初和/或最后5个核苷酸中，并且至少中心11-12个核苷酸与所述一种或多种靶标序列的转录物中的一个或多个靶标区100％互补。在其中将仅靶向VEGF-A的实施方案中，各效应子序列选自SEQIDNO:40-49；在其中将仅靶向VEGFR2的实施方案中，各效应子序列选自SEQIDNO:50-59；在其中将仅靶向PDGFR-β的实施方案中，各效应子序列选自SEQIDNO:60-69；并且在其中将仅靶向CFB的实施方案中，各效应子序列选自SEQIDNO:70-78。
所述第一、第二以及第三效应子序列可各自包含选自在来自由SEQIDNO:40-78组成的组的序列内的任何10个或更多个相邻核苷酸的序列，或者，各效应子序列也可为SEQIDNO:40-78的变体，具有1、2、3、4或5个核苷酸的变化。在又一实施方案中，各效应子序列可由20个核苷酸组成，其中17、18、19或所有20个核苷酸来自选自由SEQIDNO:40-78组成的组的序列的相邻核苷酸。当存在多种效应子序列时，所述序列可表示上文所述的3种类型的组合。
多发夹型式
在一个替代实施方案中，提供一种用于抑制一种或多种AMD相关基因、优选地VEGF-A、VEGFR2、CFB或PDGFR-β基因中一种或多种靶标序列的表达的DNA指导的RNA干扰(ddRNAi)剂，所述ddRNAi剂按5’至3’方向至少包含：
至少17个核苷酸长的第一效应子序列；
第一效应子补体；
至少17个核苷酸长的第二效应子序列；以及
第二效应子补体
其中各效应子序列与所述一种或多种靶标序列的转录物中的一个或多个靶标区基本上互补。
或者，至少一种效应子并且优选地两种效应子序列与所述一种或多种靶标序列的转录物的一个或多个靶标区100％互补。
这将产生具有如图1B或C所示的结构的ddRNAi剂，这视用于表达它的表达盒的类型而定(参见下文说明书)。还参见WO2005/087926和WO2006/084209，其以引用的方式并入本文。
在其中存在2种靶标序列的任一实施方案中，优选所述第一和第二效应子序列均与其各自的靶标序列的转录物的一个或多个靶标区基本上互补。
优选地，所述第一和第二效应子序列均选自在来自由SEQIDNO:40-78组成的组的序列内的任何10个或更多个并且优选地任何17个或更多个相邻核苷酸。例如，在一个实施方案中，提供一种用于抑制AMD相关基因中一种或多种靶标序列的表达的DNA指导的RNA干扰(ddRNAi)剂，所述ddRNAi剂按5’至3’方向至少包含：
在5’UAUGUGGGUGGGUGUGUCUAC3’(SEQIDNO:47)内的任何10个或更多个相邻核苷酸的第一效应子序列；
第一效应子补体序列；
在5’AAGUUCAUGGUUUCGGAGGCC3’(SEQIDNO:41)或5’UCUUUCUUUGGUCUGCAUUCA3’(SEQIDNO:44)内的任何10个或更多个相邻核苷酸的第二效应子序列；以及
第二效应子补体序列，
其中所述AMD相关基因是VEGF-A。
各效应子序列与所述一种或多种靶标序列的转录物中的一个或多个靶标区基本上互补。
或者，至少一种效应子并且优选地两种效应子序列具有与所述一种或多种靶标序列的转录物中的一个或多个靶标区的100％互补性。
在尤其优选的实施方案中，所述第一和第二效应子序列包含在能够将靶标区的表达抑制至少70％的序列内的任何10个或更多个、优选地任何17个或更多个相邻核苷酸。优选地，在这个实施方案中，各效应子序列选自SEQIDNO:40-78，更优选地选自SEQIDNO:40-59，并且最优选地选自SEQIDNO:40-49。
在另一实施方案(即其中所述ddRNAi剂具有3种效应子序列的实施方案)中，提供一种用于抑制一种或多种AMD相关基因中一种或多种靶标序列的表达的DNA指导的RNA干扰(ddRNAi)剂，所述ddRNAi剂按5’至3’方向至少包含：
在5’AAGUUCAUGGUUUCGGAGGCC3’(SEQIDNO:41)内的任何10个或更多个相邻核苷酸的第一效应子序列；
第一效应子补体序列；
在5’UCUUUCUUUGGUCUGCAUUCA3’(SEQIDNO:44)内的任何10个或更多个相邻核苷酸的第二效应子序列；
第二效应子补体序列；
在5’UAUGUGGGUGGGUGUGUCUAC(SEQIDNO:47)内的任何10个或更多个相邻核苷酸的第三效应子序列；以及
第三效应子补体序列，
其中所述AMD相关基因是VEGF-A。
在另一实施方案(即其中所述ddRNAi剂具有2种效应子序列的实施方案)中，提供一种用于抑制一种或多种AMD相关基因中一种或多种靶标序列的表达的DNA指导的RNA干扰(ddRNAi)剂，所述ddRNAi剂按5’至3’方向至少包含：
在所述AMD相关基因VEGRF-2的5’UGUAACAGAUGAGAUGCUCCA3’(SEQIDNO:56)内的任何10个或更多个相邻核苷酸的第一效应子序列；
第一效应子补体序列；
在所述AMD相关基因VEGFA的5’UAUGUGGGUGGGUGUGUCUAC3’(SEQIDNO:47)内的任何10个或更多个相邻核苷酸的第二效应子序列；以及
第二效应子补体序列。
这些实施方案中的各效应子序列与所述一种或多种靶标序列的转录物中的一个或多个靶标区基本上互补。
熟练人员应了解，所述VEGFA序列可为第一并且所述VEGFR2序列可为第二。这是一个等效实施方案。
在另一实施方案(即其中所述ddRNAi剂具有3种效应子序列的实施方案)中，提供一种用于抑制一种或多种AMD相关基因中一种或多种靶标序列的表达的DNA指导的RNA干扰(ddRNAi)剂，所述ddRNAi剂按5’至3’方向至少包含：
在所述AMD相关基因VEGRF-2的5’AAGUAGCCAGAAGAACAUGGC3’(SEQIDNO:52)内的任何10个或更多个相邻核苷酸的第一效应子序列；
第一效应子补体序列；
在所述AMD相关基因CFB的5’UUAUAGAAAACCCAAAUCCUC3’(SEQIDNO:78)内的任何10个或更多个相邻核苷酸的第二效应子序列；
第二效应子补体序列；
在所述AMD相关基因PDGFR-β的5’UAGCUGAAGCCCACGAGGUCC3’(SEQIDNO:63)内的任何10个或更多个相邻核苷酸的第三效应子序列；以及
第三效应子补体序列。
这些实施方案中的两者中的各效应子序列与所述一种或多种靶标序列的转录物中的一个或多个靶标区基本上互补。熟练人员应了解，所述序列可按不同的5’至3’顺序并且代表等效实施方案。例如，PDGFR-β可为第一，VEGFR2可为第二并且CFB可为第三。或者，至少一种效应子并且任选地所述3种效应子中的2种或所有3种效应子与所述一种或多种靶标序列的转录物中的一个或多个靶标区100％互补。
在尤其优选的实施方案中，所述第一、第二以及第三效应子序列包含在能够将靶标基因区的表达抑制至少70％的序列内的任何10个或更多个、优选地任何17个或更多个相邻核苷酸。优选地，在这个实施方案中，各效应子序列选自SEQIDNO:40-78，更优选地选自SEQIDNO:40-59，并且最优选地选自SEQIDNO:40-49。
在其它实施方案中，所述第一效应子序列可为在选自由SEQIDNO:40-78组成的组的序列内的任何10个或更多个相邻核苷酸；所述第二效应子序列可为在选自由SEQIDNO:40-78组成的组的序列内的任何10个或更多个相邻核苷酸；所述第三效应子序列可为在选自由SEQIDNO:40-78组成的组的序列内的任何10个或更多个相邻核苷酸；并且任何其它效应子序列均可为在选自由SEQIDNO:40-78组成的组的序列内的任何10个或更多个相邻核苷酸。优选地，各效应子序列为至少17个相邻核苷酸。
各效应子序列也可为SEQIDNO:40-78的变体，具有1、2、3、4或5种核苷酸变化。优选地，所述差异存在于最初和/或最后5个核苷酸中，并且至少中心10-12个核苷酸与所述一种或多种靶标序列的转录物中的一个或多个靶标区100％互补。
所述第一、第二以及第三效应子序列可各自包含选自在来自由SEQIDNO:40-78组成的组的序列内的任何10个或更多个相邻核苷酸的序列，或者，各效应子序列也可为SEQIDNO:40-78的变体，具有1、2、3、4或5个核苷酸的变化。在又一实施方案中，各效应子序列可由20个核苷酸组成，其中17、18、19或所有20个核苷酸是来自选自由SEQIDNO:40-78组成的组的序列的相邻核苷酸。当存在多种效应子序列时，所述序列可表示上文所述的3种类型的组合。
此外，在所述长发夹结构或所述多发夹结构中，所述ddRNAi剂可根据下式之一包括额外效应子序列和相应的补体序列：
长发夹：
●[效应子序列]1-10[效应子补体序列]1-10
多发夹：
●[效应子序列-效应子补体序列]1-10
优选地，在所述长发夹式中，效应子序列的数目等于效应子补体序列的数目。典型地，存在2、3、4或5种效应子序列，并且相应地，分别存在2、3、4或5种效应子补体序列。
当所述ddRNAi剂确实含有超过一种效应子序列时，所述效应子序列可相同或不同。例如，如果ddRNAi剂具有3种效应子序列，那么2种效应子序列可具有相同序列，而1种为不同的。或者，所有3种效应子序列可为不同的。优选地，所述效应子序列是在选自由SEQIDNO:40-78组成的组的序列内的任何10个或更多个并且优选地任何17个或更多个相邻核苷酸，或具有1、2、3、4或5个核苷酸的变化的SEQIDNO:40-78的变体。优选地，所述差异存在于最初和/或最后5个核苷酸中，并且至少中心10-12个核苷酸与所述一种或多种靶标序列的转录物中的一个或多个靶标区100％互补。
当靶向具有天然存在的变体或单一核苷酸多态性的靶标序列的单一区域时，优选至少一种效应子序列选自在选自由SEQIDNO:40-78组成的组的序列内的任何10个或更多个并且优选地任何17个或更多个相邻核苷酸，而其它效应子序列是所述选择的序列的变体。例如，第一效应子序列可包含SEQIDNO:47的20个核苷酸；第二效应子序列应因此为SEQIDNO:47的变体。
发夹结构
在以上实施方案中，所述效应子序列与其相应的效应子补体序列杂交以形成发夹结构。在所述发夹的末端，两个或更多个未结合的核苷酸形成‘铰链’或‘环’。在一个实施方案中，所述未结合的核苷酸是所述效应子序列和所述效应子补体的部分，使得仅所述效应子序列的至少17个核苷酸的一部分将与其相应的补体序列形成双链体。例如，当所述效应子序列和其补体均为20个核苷酸长时，所述核苷酸中的18个可碱基配对以形成双链区，留下总共4个核苷酸以在所述效应子序列与其效应子补体序列之间形成单链环并且连接所述序列。
在一个替代实施方案中，本身不互补的额外序列、所述靶标序列、所述效应子序列或所述效应子补体可包括于所述ddRNAi中以便产生‘环’。因而，在本发明的另一实施方案中，所述ddRNAi剂进一步包括能够形成环的2至100个未配对核苷酸、更优选地2至10个未配对核苷酸的序列。在一个优选实施方案中，所述环包括核苷酸序列AA、UU、UUA、UUAG、UUACAA、CAAGAGA或N1AAN2，其中N1和N2是C、G、U以及A中任一者并且可为相同或不同的。另外，特异性环序列包括ACUGUGAAGCAGAUGGGU。在这些环中，所述环序列并非全部必须保留非退火。在例如18个核苷酸的环中，例如最初和最后3个核苷酸可彼此退火，留下间插15个核苷酸非退火。
在其中所述ddRNAi剂作为miRNA结构的一部分表达的实施方案中，环序列可源自所述miRNA，并且由miRNA编码(ME)序列编码。
可存在一个或多个环，这视ddRNAi剂结构而定。当ddRNAi剂具有基于式[效应子序列]1-10[效应子补体序列]1-10的结构时，用于产生单一环结构的额外非自补序列含于最后一个效应子序列与所述最后一个效应子序列的效应子补体序列之间，如图1D中所说明。在这个实施方案中，因此提供一种用于抑制选自VEGF-A、VEGFR2、CFB以及PDGFR-β的AMD相关基因中一种或多种靶标序列的表达的DNA指导的RNA干扰(ddRNAi)剂，所述ddRNAi剂按5’至3’方向至少包含：
至少17个核苷酸长的第一效应子序列；
至少17个核苷酸长的第二效应子序列；
2至100个非自补核苷酸的环序列；
第二效应子补体序列；以及
第一效应子补体序列
其中各效应子序列与所述一种或多种靶标序列的转录物中的一个或多个靶标区基本上互补。
当所述ddRNAi剂具有基于式[效应子序列-效应子补体序列]1-10的多发夹结构时，额外非自补序列含于各效应子序列与其补体序列之间以产生环结构，如图1E和F中所说明(视用于表达它的表达盒的类型而定-参见下文说明书)。在这个实施方案中，提供一种用于抑制AMD相关基因中一种或多种靶标序列的表达的DNA指导的RNA干扰(ddRNAi)剂，所述ddRNAi剂按5’至3’方向至少包含：
至少17个核苷酸长的第一效应子序列；
2至100个非自补核苷酸的环序列；
第一效应子补体序列；
至少17个核苷酸长的第二效应子序列；
2至100个非自补核苷酸的环序列；以及
第二效应子补体序列
其中各效应子序列与所述AMD相关基因中一种或多种靶标序列的转录物中的一个或多个靶标区基本上互补，并且基因选自VEGF-A、VEGFR2、CFB以及PDGFR-β中的一者或多者。
在其中存在超过两种效应子和补体序列并且因此存在超过两种发夹结构的这个实施方案中，形成各环结构的额外非自补序列的长度并非必须相同。例如，一种环结构可具有5个核苷酸，而另一环结构可具有9个核苷酸。
另外，当存在两种或更多种发夹结构时，可存在充当各环之间的间隔区序列的额外非自补序列。在这个实施方案中，提供一种用于抑制AMD相关基因中一种或多种靶标序列的表达的DNA指导的RNA干扰(ddRNAi)剂，所述ddRNAi剂按5’至3’方向至少包含：
至少17个核苷酸长的第一效应子序列；
2至100个非自补核苷酸的环序列；
第一效应子补体序列；
2至100个非自补核苷酸的间隔区序列；
至少17个核苷酸长的第二效应子序列；
2至100个非自补核苷酸的环序列；以及
第二效应子补体序列
其中各效应子序列与所述AMD相关基因中一种或多种靶标序列的转录物中的一个或多个靶标区基本上互补，并且基因选自VEGF-A、VEGFR2、CFB以及PDGFR-β中的一者或多者。
双链ddRNAi剂
如本领域技术人员应了解，完整ddRNAi剂不必要作为一种序列表达。例如，在本发明的一个实施方案中，可产生所述第一效应子序列(例如，通过一种DNA序列转录)，并且可产生所述第一效应子补体序列(例如，从不同DNA序列转录)。任选地，环序列可连接至任一转录物，或可为连接至一种转录物的3'末端和另一转录物的5'末端的环的一部分，并且当所述效应子或效应子补体序列作为miRNA结构的部分表达时，所述环序列可源自miRNA。在细胞内，两种转录物接着通过经由在所述第一效应子序列与其补体之间的退火进行杂交而形成所述ddRNAi剂。
以化学方式合成的siRNA的体外表达的ddRNAi剂
尽管设想湿性AMD的有效治疗将需要ddRNAi剂从ddRNAi构建体体内表达(如下文将概述)，但可存在如下情形，其中需要施用体外表达的ddRNAi剂或施用以化学方式合成的siRNA，由此充当具有短暂的效应持续时间的疗法。例如针对患者对所述治疗的反应筛选患者可受益于在开始使用体内表达的ddRNAi剂的长期疗法之前使用siRNA的短期治疗，所述siRNA不在细胞中整合并且复制。
本发明的ddRNAi剂可因此体外表达并且接着递送至靶标细胞。或者，siRNA可以化学方式合成并且接着递送至靶标细胞。鉴于此，在本发明的另一方面，提供一种用于抑制AMD相关基因中一种或多种靶标序列的表达的小干扰RNAi剂(siRNA剂)，所述siRNA包含
至少17个核苷酸长的第一效应子序列；和
第一效应子补体序列；
其中所述效应子序列与所述一种或多种靶标序列的转录物中的一个或多个靶标区基本上互补。
类似于上文所述的ddRNAi剂，所述siRNA剂也可包括用于多重靶向的超过一种效应子序列，所述多重靶向即单一基因(如VEGF-A)中的多种靶标，或超过一种基因(如VEGFR2、CFB以及PDGFR-β)中的靶标。所述效应子序列优选地选自在来自由SEQIDNO:40-78组成的组的序列内的任何10个或更多个并且优选地任何17个或更多个相邻核苷酸。
siRNA的设计有可能存在相当大的灵活性。典型地，siRNA由具有5'-磷酸酯基和3'-羟基残基的dsRNA分子组成，链长度可自20-29个核苷酸变化并且可任选地设计成包括2个核苷酸的3'突出。在一些实施方案中，各链可合成为N19-27TT(其中TT可为脱氧核糖核苷酸)。siRNA可容易地基于如上文所述的SEQIDNO:40-78的区域设计并且可在治疗上呈单一序列或呈任何组合使用。或者，siRNA剂可由含有效应子和效应子补体序列的单一RNA分子组成，所述有效应子和效应子补体序列与从ddRNAi表达盒表达的那些相似或同一。这些序列可基于SEQIDNO:40-78并且可在治疗上呈单一序列或呈与彼此的任何组合使用。所述siRNA可以化学方式用适当保护的核糖核苷磷酰胺酯和常规合成剂合成并且因此广泛地在市面上有售且能够根据本领域中的常规方法进行设计和合成。在优选实施方案中，所述siRNA具有在来自SEQIDNO:40-78中的一者或多者的序列内的任何10个或更多个相邻核苷酸的序列。
表达盒和miRNA骨架
本发明的ddRNAi剂从DNA表达盒表达。所述表达盒包含表达所需的调节序列，如启动子，连同编码所述ddRNAi剂本身的DNA序列。在其中所述ddRNAi剂作为miRNA结构的部分表达的实施方案中，所述表达盒还包括编码所述miRNA结构的DNA序列。
所述ddRNAi表达盒包含(无特定顺序)：
●一种或多种启动子序列
●编码一种或多种效应子序列的一种或多种DNA序列
●编码一种或多种效应子补体序列的一种或多种DNA序列；
以及任选地
●一种或多种终止子序列
●编码环序列、间隔区序列或二者的一种或多种DNA序列
●一种或多种增强子序列。
所述第一启动子序列和最后终止子序列可源自其中克隆所述表达盒的载体。
在一个实施方案中，提供一种用于表达ddRNAi剂的DNA指导的RNA干扰(ddRNAi)表达盒，其中所述ddRNAi剂抑制AMD相关基因中一种或多种靶标序列的表达，所述ddRNAi构建体按5’至3’方向包含：
启动子序列
编码第一效应子序列的DNA序列
编码第一效应子补体序列的DNA序列；以及
终止子序列。
所述编码第一效应子序列的DNA序列优选地是编码在来自SEQIDNO:40-78中的任一者的序列内的10个或更多个、优选地17个或更多个相邻核苷酸的DNA。在一个尤其优选的实施方案中，所述第一效应子序列包含在能够将靶标基因区的表达抑制至少70％的序列内的任何10个或更多个、优选地任何17个或更多个相邻核苷酸。优选地，在这个实施方案中，所述第一效应子序列选自SEQIDNO:40-78，更优选地选自SEQIDNO:40-59，并且最优选地选自SEQIDNO:40-49。
或者，如上文关于所述ddRNAi剂本身所概述，编码所述效应子序列的序列可编码与SEQIDNO:40-78相比有1、2、3、4或5个核苷酸变化的效应子序列，而不影响所编码的序列与所述靶标序列的转录物碱基配对并且抑制所述靶标序列的表达的能力。
熟练人员应了解，编码任何给定的RNA序列的DNA序列均是与所述RNA相同的序列，但具有胸腺嘧啶(T)碱基来代替尿嘧啶(U)碱基。编码在长发夹结构中具有超过一种效应子序列的ddRNAi剂的ddRNAi表达盒按5’至3’方向包含：
启动子序列；
编码第一效应子序列的DNA序列；
编码第二效应子序列的DNA序列；
任选地，编码能够形成环的序列的序列；
编码第二效应子补体序列的DNA序列；
编码第一效应子补体序列的DNA序列；以及
任选地，终止子序列。
优选地，所述DNA序列编码选自在来自由SEQIDNO:40-78组成的组的序列内的任何10个或更多个并且优选地任何17个或更多个相邻核苷酸的第一和第二效应子序列。优选地，所述第一和第二效应子序列选自SEQIDNO:40-59。或者，所述DNA序列编码与SEQIDNO:40-78相比有1、2、3、4或5个核苷酸变化的效应子序列，而不影响所编码的效应子序列与所述靶标序列的转录物碱基配对并且抑制所述靶标序列的表达的能力。
当所述ddRNAi剂具有超过一种效应子序列和基于式[效应子序列-效应子补体序列]1-10的多发夹结构时，各[效应子序列-效应子补体序列]对的表达可通过单一启动子或者通过不同启动子控制。当涵盖不同启动子时，所述ddRNAi表达盒按5’至3’方向包含：
启动子序列
编码第一效应子序列的DNA序列
编码第一效应子补体序列的DNA序列；
任选地，终止子序列；
启动子序列；
编码第二效应子序列的DNA序列；
编码第二效应子补体序列的DNA序列；以及
任选地，终止子序列。
在这个实施方案中，多种ddRNAi剂从一种表达盒产生，因为各效应子/效应子补体是作为单一发夹结构表达。
当涵盖单一启动子时，所述ddRNAi表达盒按5’至3’方向包含：
启动子序列
编码第一效应子序列的DNA序列
编码第一效应子补体序列的DNA序列；
编码第二效应子序列的DNA序列；
编码第二效应子补体序列的DNA序列；以及
任选地，终止子序列。
类似于以上实施方案，所述DNA序列优选地编码选自在来自由SEQIDNO:40-78组成的组的序列内的任何10个或更多个并且优选地任何17个或更多个相邻核苷酸的第一和第二效应子序列，或与SEQIDNO:40-78相比序列有1、2、3、4或5个核苷酸变化的效应子序列。优选地，所述第一和第二效应子序列选自SEQIDNO:40-78，更优选地选自SEQIDNO:40-59，并且最优选地选自SEQIDNO:40-49。
任何上述ddRNAi剂均优选地在miRNA结构中从表达盒表达。
从ddRNAi构建体表达的shRNA的加工可为不精确的。在如miRNA的RNA结构内或作为所述RNA结构的一部分的ddRNAi的表达是使这种不精确性降至最低的一种方式，所述RNA结构是用于RNAi加工途径的天然底物。McBride等人(2008)设计了表达来自内源miRNA的碱基和环的序列的“人工miRNA”构建体；这些构建体显示降低的毒性，表明所表达的shRNA的更精确加工。Wu等人(2011)显示错配的双链体(在过客链中含有错配)有时显示增加的沉默活性，这可能归因于其与内源miRNA的较大的结构相似性。同样，Gu等人(2012)显示在shRNA分子中的环序列的邻近处引入凸起可导致增加的dicer加工精确度。
在其中所述效应子和效应子补体作为miRNA结构表达的实施方案中，所述ddRNAi表达盒进一步包括编码所述miRNA结构的序列，所述序列在本文中称作“miRNA编码序列”或“ME序列”。这种序列是含于编码在表达后折叠成miRNA结构的RNA的ddRNAi表达盒内的DNA序列。所述效应子序列和所述效应子补体因此作为所述miRNA结构的一部分或在所述miRNA结构内表达。如从说明在miRNA结构中表达的ddRNAi剂的图应了解，并且如先前在说明书中所详述，所述ME序列将根据需要位于所述效应子序列和所述效应子补体序列的上游和下游。使用表达例如具有单一效应子-效应子补体对的ddRNAi剂的表达盒，提供一种用于表达ddRNAi剂的DNA指导的RNA干扰(ddRNAi)表达盒，其中所述ddRNAi剂抑制AMD相关基因中一种或多种靶标序列的表达，所述ddRNAi盒按5’至3’方向包含：
启动子序列
第一ME序列
编码第一效应子序列的DNA序列
任选地，编码能够形成环的序列的序列
编码第一效应子补体序列的DNA序列；
第二ME序列；以及
任选地，终止子序列，
其中由所述第一和第二ME序列编码的序列能够形成miRNA结构。所述效应子序列和所述效应子补体因此作为所述miRNA结构的部分或在所述miRNA结构内表达。
编码能够形成环的序列的任选序列也可为ME序列。例如，如果特定miRNA结构正用作其中所述ddRNAi剂在内部或作为一部分表达的结构，那么所述ddRNAi剂的环序列可来自相同miRNA。在替代实施方案中，所述环序列可来自与由所述ME序列编码的miRNA结构不同的miRNA，但尽管如此仍为miRNA源性或起源序列。
所述ddRNAi表达盒或者可通过参考所表达的ddRNAi剂的总长度来描述，所述表达盒是所述启动子与终止子之间的序列的总长度的产物。例如，当单一效应子ddRNAi中的效应子序列的长度由17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸组成时，所述ddRNAi表达盒将具有在所述启动子与终止子之间34至60个核苷酸的长度。这个长度可进一步包括“环”或“铰链”序列的2至100个核苷酸，产生在36至160个核苷酸之间的长度。对于具有多种效应子序列的ddRNAi剂(其中各效应子序列由17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸组成)，总长度按比例增加。
用于编码所述miRNA结构的ME序列的存在也将增加总长度。
设计本发明的ddRNAi表达盒的一种有用方式是假定Dicer切割每22个核苷酸(还称作‘22nt定相’)，并且效应子序列可因此设计为编码在来自由SEQIDNO:40-78组成的组的序列内的任何10个或更多个并且优选地任何17个或更多个相邻核苷酸，连同针对适当启动子的适当间隔区和其它序列需求。
靶向不同mRNA位点的剂适用于shRNA构建，因为其可避免mRNA的二级结构的影响，并且因此独立地执行其功能。
当使用U6启动子时，优选但非必要的是可操作性连接于所述启动子的DNA序列由鸟嘌呤(G)碱基开始；当使用H1启动子时，优选但非必要的是可操作性连接于所述启动子的DNA序列由腺嘌呤(A)碱基开始。所述效应子编码序列可因此相应地进行修饰。
当使用polII启动子时，使用miRNA源性序列来驱动shRNA的表达是尤其有利的。针对polII启动子的转录起始位点经常是不精确的。由于shRNA的dicer加工主要取决于所述shRNA的结构，加工在大多数情况下将不会由转录开始位点的略微变化而受到极大地影响。miRNA源性序列的使用因此在利用polII启动子的ddRNAi构建体的设计中允许较大灵活性。
在一些情况下，增加shRNA的长度可能是有利的。实现此举的一种方式是在5’或3’方向延长shRNA中的效应子序列的长度以使所述效应子序列与靶标序列的互补性增至最大，并且还延长效应子补体的长度以使所述shRNA的茎内的碱基配对增至最多。例如，基于SEQIDNO:47的shRNA可能容易地在5’或3’方向延伸以靶向与SEQIDNO:8中的那些序列相邻的额外序列，从而产生具有30个核苷酸的茎的shRNA。所述效应子序列可能与本说明书中别处所定义的靶标共享基本上同源性。
在一些情况下，可能需要避免效应子、效应子补体或环序列内的DNA序列TTTT，因为这些序列可充当使用PolIII启动子(如U6或H1)的表达构建体中的转录终止子。shRNA设计也应考虑，预期U6终止向所述shRNA的3'末端添加一个至五个U残基。当设计长发夹RNA时，有时有利的是修饰效应子序列的精确选择(使用来自SEQIDNO:40-78或与SEQIDNO:40-78相邻的序列)以使Dicer加工的效应子序列将包括5’U或A，由此促进并入AGO2中的可能性增至最大。
是否用个别启动子或单一启动子控制各[效应子序列-效应子补体序列]对的表达的选择取决于多种因素。单一启动子可用于使启动子之间的干扰降至最低。仅具有单一启动子的ddRNAi构建体另外尺寸较小，这在一些情况下对于所述构建体的稳定性可为重要的，在产生(例如，大肠杆菌中的复制)和递送期间均是如此。另外，单一启动子的使用避免了启动子之间任何同源重组的可能性。
在其中尽管需要各效应子序列或补体的表达的调节程度的情况下，有利的是设计具有多种启动子的ddRNAi构建体，由此各[效应子序列-效应子补体序列]对的表达由不同启动子控制。在其中所述效应子序列具有不同序列的情况下，所述序列的性质可意味着一种序列表达至较高表达水平。当需要确保各效应子序列的更加相等表达水平时，更高度表达的效应子序列可与较弱启动子配对并且反之亦然。此外，可实现更有效表达，因为将转录的任何一种序列的长度尤其对于polIII启动子来说是较短的。当使用多种启动子时，优选的是并非所有启动子均相同以使表达盒中所述启动子之间任何同源重组的风险降至最低。在2种启动子的情况下，各启动子优选地是不同的。在3种启动子的情况下，至少2种并且任选地所有3种彼此不同。
编码所述效应子序列的DNA序列可操作性连接于启动子序列。当序列与另一核苷酸序列呈功能关系放置时，所述序列“可操作性连接”于另一核苷酸序列。例如，如果编码序列可操作性连接于启动子序列，那么这一般意味着所述启动子可促进所述编码序列的转录。可操作性连接意味着所连接的DNA序列典型地是相邻的并且在有必要接合两个蛋白质编码区时，是相邻的并且在阅读框中。然而，由于增强子在通过数千碱基与启动子分离时可起作用并且内含子序列可具有可变长度，一些核苷酸序列可操作性连接，但并未相邻。
“启动子”或“启动子序列”或“启动子元件”一般为能够结合细胞中的RNA聚合酶并且起始多核苷酸或多肽编码序列(如mRNA或通过任何类别的任何RNA聚合酶转录的任何种类的RNA)的转录的DNA调节区。所述启动子和终止子可从不同基因获取，但典型地彼此匹配；即，所述启动子和终止子元件是从其中所述元件天然地存在的相同基因中获取。启动子也可或可不使用分子技术或以其它方式，例如通过修饰调节元件来修饰以获得较弱或较强程度的转录。
术语“组成型的”在参考启动子时意味着所述启动子能够在特异性刺激(例如，热休克、化学品、光等)不存在下指导可操作性连接的核酸序列的转录。典型地，组成型启动子能够在基本上任何细胞和任何组织中指导编码序列的表达。用于转录所述ddRNAi剂的启动子优选地是组成型启动子，如通过RNA聚合酶II控制的用于泛素、CMV、β-肌动蛋白、组蛋白H4、EF-1α或pgk基因的启动子，或通过RNA聚合酶I控制的启动子元件。在其它实施方案中，使用PolII启动子，如CMV、SV40、U1、hAAT、β-肌动蛋白或杂合PolII启动子。在其它实施方案中，使用通过RNA聚合酶III控制的启动子元件，如U6启动子(例如U6-1、U6-8、U6-9)、H1启动子、7SL启动子、人Y启动子(hY1、hY3、hY4(参见Maraia等人,(1994))以及hY5(参见Maraia等人,(1994))、人MRP-7-2启动子、腺病毒VA1启动子、人tRNA启动子、5S核糖体RNA启动子，以及这些启动子中的任一者的功能杂合物和组合。也可使用所有这些启动子的变体，其中所述启动子经过修饰以降低或增加其活性。例如，如果强启动子使得可操作性连接于其的序列表达过多，那么所述启动子可经过修饰以降低其活性。
当使用U6启动子时，优选的是可操作性连接于所述启动子的DNA序列由鸟嘌呤(G)碱基开始；当使用H1启动子时，优选的是可操作性连接于所述启动子的DNA序列由腺嘌呤(A)碱基开始。核酸的序列可因此相对另一启动子偏好使用一种启动子。
或者，在一些实施方案中，可能最佳的是选择允许从所述ddRNAi构建体表达的多种ddRNAi剂的诱导性表达的启动子。使用所述启动子进行诱导性表达的多种系统为本领域中已知的，包括但不限于四环素反应性系统和lac操作子-阻遏子系统(参见WO03/022052A1公布；和美国专利公布2002/0162126A1)、蜕皮激素调节系统或通过糖皮质激素、孕激素、雌激素、RU-486、类固醇、甲状腺激素、环状AMP、细胞因子、调节剂的钙化醇家族调节的启动子或金属硫蛋白启动子(通过如锌或镉的无机金属调节)。
适用于本发明的一些实施方案的启动子可为组织特异性的或细胞特异性的。术语“组织特异性”在应用于启动子时是指能够在相对不存在所关注的相同核苷酸序列在不同类型的组织(例如脑)中的表达的情况下向特定类型的组织指导所关注的核苷酸序列的选择性表达的启动子。术语“细胞特异性”在应用于启动子时是指能够在相对不存在所关注的相同核苷酸序列在相同组织内的不同类型细胞中的表达的情况下在特定类型的细胞中指导所关注的核苷酸序列的选择性表达的启动子。术语“细胞特异性”在应用于启动子时还意味能够在单一组织内的区域中促进所关注的核苷酸序列的选择性表达的启动子。或者，启动子可为组成型的或可调节的。另外，启动子可经过修饰以便具有不同特异性。
尤其适用于本发明的细胞特异性启动子的实例包括RPE细胞特异性启动子RPE-65和VMD2，和脉络膜内皮特异性启动子FLT-1或ICAM2。
如上文所述，增强子元件任选地包括于本发明的ddRNAi构建体中。
当所述ddRNAi表达盒或构建体含有超过一种终止子序列或元件时，所述终止子序列或元件可为相同的或不同的，或可存在任何盒内仅显示一次的终止元件和显示两次或更多次的终止元件的组合。无论使用何种终止子序列或元件，其应经过选择以确保其适当地与所用的肝脏特异性启动子一起工作。在其中使用PolI、PolII或PolIII启动子的情况下，应使用适当的终止子序列。适用于本发明的终止元件包括U1终止序列(U1盒)、合成聚腺苷酸终止子以及所谓的最小聚腺苷酸终止子。如MAZ1和MAZ2的转录暂停位点(参见Ashfield等人EMBOJ1994第13卷第23期第5656页和Yonaha和ProudfootEMBOJ.2000年7月17日；19(14):3770-7)可插入所述聚腺苷酸终止子的上游以帮助转录终止和聚腺苷酸化的联合。对于PolIII启动子，序列TTTT、TTTTT或TTTTTT常用作终止子。在这些情况下，转录物典型地通过序列UU终止。
ddRNAi剂表达构建体
ddRNAi剂可从插入任何合适载体或ddRNAi构建体(本文中称作‘ddRNAi构建体’)中的DNA表达盒表达。过去开发用于AMD的治疗剂的挑战是有效且均匀转导恰当细胞以确保长期表达而无需循环施用。
当所述构建体的载体骨架可与递送系统相容时，所述ddRNAi表达构建体也为递送构建体。尤其优选的递送构建体是病毒载体。使用病毒载体，如腺相关病毒(AAV)、腺病毒(Ad)或慢病毒(LV)来递送从细胞内部产生治疗性ddRNAi剂的表达构建体会避免通常由核酸与表面表达的toll样受体3的直接相互作用引起的干扰素反应。这是临床试验中基于siRNA的眼睛药物多次失败的主要原因。
在本发明的情况下，本发明的ddRNAi剂需要到达视网膜层内深处的视网膜色素上皮(RPE)细胞或其它细胞。为了这种效应，本发明使用经过修饰的腺相关病毒(AAV)载体，所述载体在鼠类模型中显示为能够在玻璃体内注射后穿透所述RPE层。野生型、未修饰的AAV血清型在通过这种途径引入至眼睛中时比邻接的细胞层转导更多的能力有限。为此，优选在本发明中使用经过修饰的AAV载体。
例如，AAV菌株的定点诱变已经用于取代酪胺酸残基，导致增加的转导(LiZhong,BaozhengLi,CathrynS.Mah,(2008)ProcNatlAcadSciUSA.105(22):7827–7832)。AAV载体的相似修饰已经产生可在玻璃体内注射后跨视网膜的所有层转导的载体(HildaPetrs-Silva,AstraDinculescu,QiuhongLi等人(2009)MolTher.17(3):463–471)。同样，AAV载体中的特异性丝氨酸、苏氨酸或赖氨酸残基已经过修饰以避免宿主细胞激酶/泛素化/蛋白酶体机构并且显著增加转导效率(GabrielN,HareendranS,SenD等人(2013)HumGeneTherMethods.2013(2):80-93)。产生AAV衣壳突变体文库的方法可经过筛选以分离具有所需特性(即对特异性靶标组织的增加的组织特异性或降低的免疫原性)的变体。最近，Schaffer等人已经能够在其中7mer肽已经插入至衣壳序列中的AAV突变型载体的玻璃体内注射后显示广泛跨视网膜递送(Dalkara,D.,L.C.Byrne,R.R.Klimczak等人(2013)ScienceTranslationalMedicine,5:189ra76)
典型地，AAV的基因组仅含有两种基因。“rep”基因编码DNA复制中所用的至少四种不同蛋白质。“cap”基因产物经过差异剪接以产生构成所述病毒的衣壳的三种蛋白质。在将所述基因组包装至初生病毒中时，仅反向末端重复(ITR)是专性序列；rep和cap可从基因组缺失并且由所选的异源序列置换。然而，为了产生复制和包装基于AAV的异源构建体至初生病毒粒子中所需的蛋白质，所述rep和cap蛋白必须以反式提供。通常通过共感染辅助病毒(如腺病毒或疱疹病毒)而提供的辅助功能也可以反式呈一种或多种DNA表达质粒的形式提供。由于所述基因组通常仅编码两种基因，不意外的是作为递送媒介物，AAV受限于单链4.5千碱基(kb)的包装能力。然而，尽管这种尺寸限制可限制可递送用于置换基因疗法的基因，但其不会不利地影响较短序列(如ddRNAi载体)的包装和表达。
本发明提供一种ddRNAi表达构建体，所述构建体包含相应用于表达用于抑制AMD相关基因中一种或多种靶标序列的表达的ddRNAi剂的ddRNAi表达盒，所述表达盒包含(无特定顺序)
一种或多种启动子序列
编码一种或多种效应子序列的一种或多种DNA序列，
编码一种或多种效应子补体序列的一种或多种DNA序列；
以及任选地
一种或多种终止子序列
编码环序列、间隔区序列或二者的一种或多种DNA序列
一种或多种增强子序列，
其中所述构建体是病毒递送构建体；优选地，所述病毒递送构建体是AAV修饰载体。
优选地，所述表达盒进一步包含ME序列，使得所述ddRNAi剂作为miRNA结构的一部分或在miRNA结构内表达。
在一个优选实施方案中，所述病毒递送构建体的表达盒包含两种DNA序列，所述序列编码AMD相关基因VEGRF-2的5’UGUAACAGAUGAGAUGCUCCA3’(SEQIDNO:56)内的任何10个或更多个相邻核苷酸的第一效应子序列和AMD相关基因VEGF-A的5’UAUGUGGGUGGGUGUGUCUAC3’(SEQIDNO:47)内的任何10个或更多个相邻核苷酸的第二效应子序列。
在病毒递送后本发明的ddRNAi剂的表达从所述药物的单次施用起将为持久的，可能长达患者的一生。因此，在本发明的另一方面，提供一种ddRNAi治疗剂，所述治疗剂包含其中插入根据本发明的ddRNAi表达盒的病毒载体。优选地，所述表达盒编码呈选自本说明书中通篇所述的组合和实施方案的长发夹结构或多发夹结构的多种ddRANi剂。在一个优选实施方案中，所述ddRNAi剂的效应子序列和效应子补体序列在miRNA结构内表达。
典型地，在病毒载体的产生中，病毒的正常内源基因可从基因组缺失并且由所选的异源序列置换。然而，为了产生复制和包装基于病毒的异源构建体至初生病毒粒子中所需的蛋白，从基因组剥离的病毒蛋白必须以反式提供。所述构建体的产生可使用本领域中众所周知的任何合适的遗传工程技术来实现，所述技术包括不限于PCR、寡核苷酸合成、DNA合成、限制性核酸内切酶消化、连接、转化、质粒纯化以及DNA测序的标准技术。所述病毒构建体也可含有允许病毒的复制和增殖的基因，不过在优选的实施方案中，所述基因将以反式供应。另外，所述ddRNAi构建体可含有来自以原生形式并入或经过修饰的任何已知生物体的基因组的基因或基因序列。例如，优选的病毒构建体包含适用于所述构建体在细菌中的复制的序列。
在基于病毒的ddRNAi构建体产生后，将所述构建体包装至病毒粒子中。本领域中已知的任何方法均可用于产生基因组包含所述病毒ddRNAi构建体的拷贝的传染性病毒粒子。一种方法使用以反式稳定表达将所述病毒ddRNAi构建体并入病毒粒子中所需的病毒蛋白的包装细胞，以及特定病毒递送系统(例如，复制所需的序列、结构蛋白以及病毒组装)所必需或优选的其它序列，以及用于组织进入的病毒源性或人工配体。在所述病毒ddRNAi构建体转染至包装细胞中之后，所述包装细胞接着复制病毒序列，表达病毒蛋白并且包装所述ddRNAi表达构建体至传染性病毒粒子中。包装细胞系可为能够表达病毒蛋白的任何细胞系，包括但不限于293、HeLa、A549、PerC6、D17、MDCK、BHK、樱桃(bingcherry)、phoenix、Cf2Th或本领域技术人员已知或开发的任何其它系。一种包装细胞系描述于例如美国专利号6,218,181中。
或者，并未稳定表达必需的病毒蛋白的细胞系可共转染一种或多种构建体以实现功能粒子的有效产生。一种所述构建体是基于病毒的ddRNAi构建体；其它构建体包含编码使细胞产生功能性病毒以及其它辅助功能所必需的蛋白质的核酸。
所述包装细胞系或复制和包装构建体可不表达包膜基因产物。在这些实施方案中，编码所述包膜基因的基因可设置于共转染所述基于病毒的ddRNAi构建体的不同构建体上。由于所述包膜蛋白部分地负责所述病毒粒子的宿主范围，所述病毒可为假型的。如上文所述，“假型”病毒是具有包膜蛋白的病毒粒子，所述包膜蛋白来自除基因组所起源的病毒外的病毒。本领域技术人员可针对所用的病毒递送系统和将靶向的细胞选择适当假型。
除赋予特异性宿主范围外，所选的假型还可允许病毒浓缩至极高的滴度。病毒或者可由将感染限于特定物种的嗜亲性包膜蛋白假型化(例如，嗜亲性包膜允许仅感染例如鼠类细胞，其中双嗜性包膜允许感染例如人和鼠类细胞)。另外，遗传修饰的配体可用于细胞特异性靶向。
在包装细胞系中产生之后，含有所述ddRNAi表达盒的病毒粒子进行纯化并且定量(滴定)。纯化策略包括密度梯度离心或优选地柱色谱方法。
方法
本发明的ddRNAi剂、ddRNAi构建体或siRNA剂的施用抑制视网膜内的细胞中所表达的基因的表达。因此，在本发明的另一方面，提供一种治疗个体中的AMD的方法，所述方法包括向需要治疗的患者施用治疗有效量的ddRNAi构建体，其中所述ddRNAi剂抑制AMD相关基因、优选地VEGF-A基因中一种或多种靶标序列的表达，优选地，将治疗的AMD是湿性AMD。
将施用至所述患者的ddRNAi剂可为以下一者或多者：
●包含第一效应子序列和第一效应子补体序列的ddRNAi剂；其中所述效应子序列与所述一种或多种靶标序列的转录物中的一个或多个靶标区基本上互补
●按5’至3’方向包含第一效应子序列、第二效应子序列、第二效应子补体序列以及第一效应子补体序列的ddRNAi剂，其中各效应子序列与所述一种或多种靶标序列的转录物中的一个或多个靶标区基本上互补
●按5’至3’方向包含第一效应子序列、第二效应子序列、第三效应子序列、第三效应子补体序列、第二效应子补体序列以及第一效应子补体序列的ddRNAi剂，其中各效应子序列与所述一种或多种靶标序列的转录物中的一个或多个靶标区基本上互补
●按5’至3’方向包含第一效应子序列、第一效应子补体序列、第二效应子序列以及第二效应子补体序列的ddRNAi剂，其中各效应子序列与所述一种或多种靶标序列的转录物中的一个或多个靶标区基本上互补
●按5’至3’方向包含第一效应子序列、第一效应子补体序列、第二效应子序列、第二效应子补体序列、第三效应子序列以及第三效应子补体序列的ddRNAi剂；其中各效应子序列与所述一种或多种靶标序列的转录物中的一个或多个靶标区基本上互补
●按5’至3’方向包含第一效应子序列、第二效应子序列、2至100个非自补核苷酸的环序列、第二效应子补体序列以及第一效应子补体序列的ddRNAi剂，其中各效应子序列与所述一种或多种靶标序列的转录物中的一个或多个靶标区基本上互补
●按5’至3’方向包含第一效应子序列、2至100个非自补核苷酸的环序列、第一效应子补体序列、第二效应子序列、2至100个非自补核苷酸的环序列以及第二效应子补体序列的ddRNAi剂，其中各效应子序列与所述一种或多种靶标序列的转录物中的一个或多个靶标区基本上互补
●按5’至3’方向包含第一效应子序列、2至100个非自补核苷酸的环序列、第一效应子补体序列、2至100个非自补核苷酸的间隔区序列、第二效应子序列、2至100个非自补核苷酸的环序列以及第二效应子补体序列的ddRNAi剂，其中各效应子序列与所述一种或多种靶标序列的转录物中的一个或多个靶标区基本上互补
●按5’至3’方向包含第一效应子序列、第一效应子补体序列、2至100个非自补核苷酸的间隔区序列、第二效应子序列、第二效应子补体序列、2至100个非自补核苷酸的间隔区序列、第三效应子序列以及第三效应子补体序列的ddRNAi剂
●在miRNA结构内或作为miRNA结构的一部分表达的任何上文所提及的ddRNAi剂。
如本领域技术人员应了解且如图中所说明，任何特定效应子序列均可在适当位置与所述ddRNAi剂中的其补体交换。在上述实施方案中的每一者的特定形式中，各效应子序列为至少17个核苷酸长，选自由来自SEQIDNO:40-78中的任一者的序列的任何10个或更多个并且优选地任何17个或更多个相邻核苷酸组成的组。所述效应子序列可均为相同的，或可均为不同的，或可为组合，例如SEQIDNO:47的至少10个相邻核苷酸的2种效应子序列和(例如)SEQIDNO:56的至少10个相邻核苷酸的1种效应子序列。
优选地，所述效应子序列选自由在SEQIDNO:40-78中的任一者内的任何相邻的11、12、13、14、15或16个核苷酸，并且最优选地在SEQIDNO:40-78中的任一者内的17个或更多个相邻核苷酸组成的组。典型地，所述效应子补体将为与其相应的效应子序列相同的长度，或约相同的长度(即，±15％核苷酸长度，或1至3个核苷酸，视总长度而不同)。
这些ddRNAi剂中的每一者均可经由ddRNAi构建体中的ddRNAi表达盒施用，如本说明书的先前章节中所述。优选地，所述ddRNAi构建体是基于AAV的构建体以使得能够将所述构建体靶向眼睛后面的RPE细胞。多重靶向可通过递送各自能够表达单一ddRNAi剂的两种或更多种ddRNAi表达盒或构建体，或者并且最优选地，通过递送能够表达超过一种ddRNAi剂的一种ddRNAi表达盒或构建体来实现。
在替代实施方案中，各效应子序列可与所述一种或多种靶标序列的转录物中的一个或多个靶标区100％互补，或可仅有1、2、3、4或5个核苷酸变化。
所述治疗AMD的方法可任选地包括鉴定具有AMD症状并且需要治疗的个体的预备步骤。所述鉴定步骤可包括将受试者差异诊断为具有湿性AMD或干性AMD。
关于本发明的ddRNAi剂的较长期或稳定提供，所述ddRNAi剂是经由本发明的ddRNAi构建体来提供，即所述ddRNAi剂从插入递送至细胞的合适载体中的ddRNAi表达盒体内表达。所述ddRNAi表达盒包含：
一种或多种启动子序列
选自由编码在来自SEQIDNO:40-78的序列内的任何10个或更多个相邻核苷酸的序列组成的组的一种或多种DNA序列；
编码一种或多种效应子补体序列的一种或多种DNA序列；
以及任选地
一种或多种终止子序列
编码环序列、间隔区序列或二者的一种或多种DNA序列
一种或多种增强子序列。
如本说明书中先前所概述，所述ddRNAi表达盒的这些组分可具有不同的5’至3’布置，所有布置均适用于本发明方法。所述表达盒优选地还包括编码能够形成miRNA结构的序列的DNA序列。
优选地，本发明方法中的靶标AMD相关基因是VEGF-A。因此，在本发明的一个实施方案中，所述ddRNAi剂抑制VEGF-A基因中一种或多种靶标序列的表达。编码所述第一效应子序列的DNA序列优选地选自在来自表1中所列的SEQIDNO:40-49的序列内的任何10个或更多个相邻核苷酸的ddRNAi效应子编码序列。或者，如先前所详述，编码所述效应子序列的序列可与SEQIDNO:40-49相比有1、2、3、4或5个核苷酸变化，而不影响所编码的序列与所述靶标序列碱基配对并且抑制VEGF-A靶标序列的表达的能力。
典型地，各效应子序列与相应的效应子补体序列形成双链区。
在一个替代实施方案中，本发明方法中的靶标AMD相关基因是VEGFR2、CFB以及PDGFR-β中的一者或多者。
在一个替代实施方案中，所述治疗个体中的AMD的方法包括施用治疗有效量的ddRNAi构建体，所述构建体编码具有超过一种效应子序列(如上文列出为SEQIDNO:40-78的那些序列)的ddRNAi剂，用于抑制、阻止或降低AMD相关基因中一种或多种靶标序列的表达。
在本发明的任何治疗方法中，所述患者也可接受其它治疗，使得所施用的ddRNAi构建体是辅助疗法。
AMD并且尤其是湿性AMD的特征在于在通常称为脉络膜新生血管(CNV)的过程中来自位于视网膜后面的脉管系统的血管的异常外生长。控制CNV因此对患有湿性AMD的患者具有积极效应。因此，本发明的另一方面是一种治疗个体中的脉络膜新生血管的方法，所述方法包括向需要治疗的患者施用治疗有效量的本发明的ddRNAi剂、表达盒或构建体，其中所述ddRNAi剂抑制VEGF-A、VEGFR2、CFB以及PDGFR-β中的一者或多者中一种或多种靶标序列的表达。这些基因中的每一者均由于其在血管生成、新生血管或VEGF途径中的作用而为所关注的靶标。
AMD的发病机理中的另一重要因素是在眼睛底部形成细胞外沉积物，所述沉积物称为玻璃疣。这些沉积物促进黄斑的变形并且也可在新生血管中起作用。CFB是玻璃疣的组分。因而，靶向所述CFB基因以抑制其蛋白产物的表达可减少所沉积的玻璃疣的量，因此对患有AMD的患者具有积极效应。因此，提供一种减少个体中的玻璃疣沉积物的方法，所述方法包括向需要治疗的患者施用治疗有效量的本发明的ddRNAi剂、表达盒或构建体，其中所述ddRNAi剂抑制CFB中一种或多种靶标序列的表达。
设法使血管生成并且因此使CNV减至最少，连同设法经由靶向VEGF-A、VEGFR2、CFB以及PDGFR-β的组合来抑制玻璃疣沉积因此提供一种针对AMD、尤其湿性AMD的多管齐下的攻击策略，所述策略先前尚未涵盖于本领域中并且设法不仅停止AMD的进展，而且恢复视敏度。
在一些情况下，如与ddRNAi剂从整合的或稳定维持的ddRNAi构建体长期表达相对，可优选依赖于ddRNAi剂或siRNA剂的短暂存在。例如，在将首先确定患者对所述治疗的耐受性的情况下。在这种情况下，可施用体外产生的本发明的ddRNAi剂或siRNA剂。
在本发明的另一方面，提供一种组合物，所述组合物包含作为活性成分的用于抑制、阻止或降低AMD相关基因中一种或多种靶标序列的表达的ddRNAi构建体、ddRNAi剂或siRNA剂，以治疗AMD、治疗CNV、使玻璃疣沉积减至最少或缓和AMD的症状。
在本发明的另一方面，提供ddRNAi构建体、ddRNAi剂或siRNA剂用于抑制、阻止或降低AMD相关基因中一种或多种靶标序列的表达的用途，以治疗AMD、治疗CNV、使玻璃疣沉积减至最少或缓和AMD的症状。同样，提供ddRNAi构建体、ddRNAi剂或siRNA剂在制备用于抑制、阻止或降低AMD相关基因中一种或多种靶标序列的表达的药剂中的用途，以治疗AMD、治疗CNV、使玻璃疣沉积减至最少或缓和AMD的症状。
优选地，所述AMD是湿性AMD。
用于本发明方法的ddRNAi构建体、ddRNAi剂或siRNA剂的一种或多种效应子序列包含在能够将AMD相关靶标基因区的表达抑制至少70％的序列内的任何10个或更多个、优选地任何17个或更多个相邻核苷酸。优选地，所述一种或多种效应子序列选自SEQIDNO:40-78，更优选地选自SEQIDNO:40-59，并且最优选地选自SEQIDNO:40-49。
在本发明的各方法中，本发明的ddRNAi剂、ddRNAi表达盒或ddRNAi表达构建体优选地通过玻璃体内注射递送至受试者的眼睛，不过也可使用视网膜下注射。
药物组合物
本发明的ddRNAi剂、siRNA剂或包含ddRNAi表达盒的载体可通过与适当的药学上可接受的载体或稀释剂组合而配制成药物组合物。因此，提供一种药物组合物，其包含用于抑制、阻止或降低AMD相关基因中一种或多种靶标序列的表达的本发明的ddRNAi剂、ddRNAi表达盒、ddRNAi构建体或siRNA剂，和药学上可接受的载体或稀释剂。
在另一实施方案中，本发明提供一种AMD治疗组合物，其包含有效量的作为主要成分的用于抑制、阻止或降低AMD相关基因中一种或多种靶标序列的表达的本发明的ddRNAi剂、ddRNAi表达盒或ddRNAi表达构建体，任选地连同药学上可接受的载体或稀释剂。
在药物剂型中，所述剂或包含所述ddRNAi表达盒的载体可单独或与其它药学上的活性化合物联合或组合施用。本领域技术人员应容易了解，剂或包含所述ddRNAi表达盒的载体的剂量水平将随递送媒介物的性质、靶标细胞的转导的相对简易性、所述RNAi剂在靶标细胞中的表达水平等变化。
本发明的ddRNAi剂、siRNA剂或包含ddRNAi表达盒的载体可通过将其溶解、悬浮或乳化于水性或非水性溶剂(如油、合成脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸酯或丙二醇)中；并且必要时，使用常规添加剂，如增溶剂、等张剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂以及防腐剂而配制成用于注射或施用的制剂。
本发明的药物组合物施用于受试者的眼睛的最优选方式是通过玻璃体内注射。替代的施用方法是视网膜下注射。
本发明所涵盖的药学上可接受的载体或稀释剂包括在所用的剂量和浓度下对接受者无毒的任何稀释剂、载体、赋形剂以及稳定剂，并且包括缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐以及其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血浆白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖以及其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子，如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
一般来说，所述制剂是通过使所述活性成分与液体载体或精细分散的固体载体或两者均匀地并且紧密地结合并且必要时使产物成形来制备。配制可通过在环境温度下在适当pH下并且在所需程度的纯度下与生理学上可接受的载体，即在所用的剂量和浓度下对接受者无毒的载体混合来进行。
用于本发明的组合物的ddRNAi构建体、ddRNAi剂或siRNA剂的一种或多种效应子序列包含在能够将AMD相关靶标基因区的表达抑制至少70％的序列内的任何10个或更多个、优选地任何17个或更多个相邻核苷酸。优选地，所述一种或多种效应子序列选自SEQIDNO:40-78，更优选地选自SEQIDNO:40-59，并且最优选地选自SEQIDNO:40-49。
在另一实施方案中，提供一种包括如上文所述的RNAi剂或药物组合物的试剂盒或制品。
在其它实施方案中，提供一种用于上文所提及的治疗应用的试剂盒，所述试剂盒包括：
-容纳RNAi剂或药物组合物的容器；
-具有使用说明书的标签或包装插页。
在某些实施方案中，所述试剂盒可含有用于治疗AMD或用于治疗如上文所述的AMD相关病况的一种或多种其它活性要素或成分。
所述试剂盒或“制品”可包含容器和在所述容器上或与所述容器联合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、泡罩包装等。所述容器可由多种材料，如玻璃或塑料形成。所述容器容纳有效用于治疗所述病况的RNAi剂或药物组合物并且可具有无菌存取口(例如，所述容器可为静脉内溶液袋或具有可通过皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。所述标签或包装插页指示所述RNAi剂或药物组合物用于治疗所选择的病况。在一个实施方案中，所述标签或包装插页包括使用说明书并且指示所述RNAi剂或药物组合物可用于治疗AMD或用于治疗如上文所述的AMD相关病况。
所述试剂盒可包含(a)RNAi剂或药物组合物；和(b)其中含有第二活性要素或成分的第二容器。在本发明的这个实施方案中，所述试剂盒可进一步包含指示所述RNAi剂或药物组合物以及其它活性要素可用于治疗AMD或用于治疗如上文所述的AMD相关病况的包装插页。或者或另外，所述试剂盒可进一步包含第二(或第三)容器，所述容器包含药学上可接受的缓冲液，如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲生理盐水、林格氏溶液以及右旋糖溶液。其可进一步包括从商业和用户观点来说需要的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针以及注射器。
在某些实施方案中，RNAi剂或药物组合物可以一次性或可重复使用的装置形式提供，包括用于容纳所述RNAi剂或药物组合物的容器。在一个实施方案中，所述装置是注射器，优选地是适用于玻璃体内注射或视网膜下注射的注射器。所述装置可容纳1-2mL的所述RNAi剂或药物组合物。所述RNAi剂或药物组合物可在呈备用状态或呈需要混合或添加其它组分的状态的装置中提供。
本发明现参考以下非限制性实施例加以描述。
实施例
1.设计和制备构建体以使VEGF-A沉默
设计表达靶向VEGF-A的shRNA的ddRNAi构建体，以识别VEGF-AmRNA中在人与临床前测试物种小鼠和猕猴之间充分保守的RNAi靶标序列。产生10种ddRNAi构建体(miR-1、miR-2、miR-3、miR-4、miR-5、miR-6、miR-7、miR-8、miR-9以及miR-10)以表达表2中所列出的效应子序列。合成寡核苷酸(SigmaAldrich)并且组装以产生BamHI/HindIII片段，所述片段根据制造商的方案(Invitrogen)克隆至pSilencer2.1-U6hygro的BamHI/HindIII位点中。这些构建体使用人U6启动子来驱动shRNA的表达。所述载体的图和一种所述构建体的插入物显示于图2A和2B中。所述插入物的序列和针对miR-8所表达的shRNA的预测的二级结构显示于图2C和2D中。用于制备miR-1至10的BamHI/HindIII片段的序列列出为SEQIDNO:91-100。
2.靶向VEGF-A的构建体的活性和链特异性
使用双重荧光素酶测定来确定miR构建体的活性。因为萤火虫荧光素酶具有约四小时的相对较短半衰期，所以萤火虫荧光素酶活性的测量会提供用于测定RNAi抑制活性的代用标志物。关于这些实验，将含有VEGF-AcDNA的区域的传感器构建体克隆至萤火虫荧光素酶表达构建体pGL3(Promega)的3’UTR中。从OpenBiosystems(ThermoScientific公司)获得的VEGF-AcDNA克隆的区域通过PCR使用本领域中众所周知的方法扩增，以制备侧接XbaI和FseI限制位点的片段；这些扩增的片段接着克隆至pGL3的3’UTR中的XbaI/FseI位点中。VEGF-A的五个不同区域以这种方式扩增以制备可能用于测定miR1–10的报告基因构建体，如表3中所示。这五个区域(A至E，表3)以两种定向克隆，所述定向允许确定RISC装载的链偏好。“有义”报告基因构建体测定过客链的活性，而称作“反义”的报告基因测定效应子链的活性。具有强效应子活性和弱过客活性的ddRNAi构建体强烈地有利于治疗用途，因为如上文所讨论，这些构建体可能产生较低脱靶效应。
为了测定靶向VEGF-A的各miR构建体的活性和链偏好，根据制造商的(Promega)方案执行双重荧光素酶测定。简单地说，根据制造商的(RocheAppliedSciences)方案使用Fugene将特异性ddRNAi构建体连同适当VEGF-A传感器和海肾荧光素酶表达质粒(pRL:Promega)共转染至HEK293T细胞中，所述表达质粒是针对各孔之间的转染效率标准化。细胞培养48小时并且使用TurnerBiosystemsVeritas光度计根据制造商的(Promega)方案执行双重荧光素酶测定。
典型实验的结果显示于图4A中。这些数据显示所有10种ddRNAi构建体均显示所述反义靶标的显著沉默，但针对所述有义靶标的活性显著不同，反映在不同ddRNAi构建体之间过客链的RISC装载的显著差异。基于这些数据，选择miR-2、5以及8用于进一步分析。
为了确认这些构建体针对原生VEGF-A的活性，根据制造商的(RocheAppliedSciences)方案使用Fugene使HEK293T细胞共转染表达VEGF-A蛋白的表达质粒，连同miR-2、5以及8的表达构建体。48小时后，使用经过修改的Trizol方案(Invitrogen)分离RNA。根据制造商的方案(AppliedBiosystemsInc)使用RTQPCRAssayonDemand确定VEGF-AmRNA含量。这些数据(图4B)显示VEGF-AshMiR2、5以及8显著地降低转染的细胞中的稳态VEGF-AmRNA含量。
为了进一步验证shMiR-8针对内源表达的VEGF-A的活性，将自发产生的视网膜色素上皮(RPE)细胞系(称作ARPE-19)用表达miR-8的腺病毒构建体(MOI＝200)转导。RNA和蛋白质在24、48、72以及96小时之时从细胞分离。使用如上文所述的RTQPCR确定VEGF-AmRNA含量。使用根据制造商的(R&DSystems)方案用人VEGFQuantikineELISA试剂盒执行的ELISA测定测定蛋白含量。这些数据(图4C)显示miR-8在蛋白质和mRNA水平上有效地使VEGF-A表达沉默，其中基因敲低的程度随时间增加。
为了定量从miR-8的shRNA表达的水平，开发定制RT-QPCR测定。使用合成RNA标准(SigmaAldrich)和正向DNA引物(SigmaAldrich)来开发这种测定以便定量从miR-8的表达的shRNA加工的效应子RNA的含量。所述合成RNA标准和DNA引物的序列是：
合成RNA标准：UGGGUUAUGUGGGUGGGUGUGUCUACCGCCU(SEQIDNO:130)
正向引物(DNA)：TATGTGGGTGGGTGTGTCTAC(SEQIDNO:131)
反向引物(DNA)：来自试剂盒(Qiagen)的miScript通用引物
根据制造商的方案(Qiagen)使用所述miSCRIPT反向转录试剂盒反向转录RNA。这种试剂盒的组分使RNA聚腺苷酸化并且经由反向转录酶和充当cDNA合成的引物的夹钳寡dT引物的作用合成cDNA拷贝。使用本领域技术人员众所周知的方案，使用SYBR绿色QRTPCR测定扩增并且定量cDNA。对已知量的所述合成RNA标准进行反向转录和QPCR扩增以制备标准曲线。从上述ARPE-19细胞分离RNA并且使用这种测定定量所表达的shRNA的含量。图4B显示经过加工的从miR-8表达的shRNA的含量随时间增加并且与在蛋白质和RNA水平上与VEGF-A基因敲低的程度有关。合起来看，这些数据显示miR-8有效地使VEGF-A沉默。应注意miR-2、5以及8的VEGF-A靶标序列和效应子序列显示在人与临床前测试物种小鼠和猕猴之间核苷酸序列的绝对保守。
3.设计和制备构建体以使VEGFR2沉默
使用上文所述的准则设计表达靶向VEGFR2的shRNA的ddRNAi构建体，以识别VEGFR2mRNA中在人与临床前测试物种小鼠和猕猴之间保守的靶标序列。在大多数情况下，难以发现在人、小鼠以及猴物种之间绝对保守的序列。构建10种ddRNAi构建体(miR-V-1、miR-V-2、miR-V-3、miR-V-4、miR-V-5、miR-V-6、miR-V-7、miR-V-8、miR-V-9以及miR-V-10)。用于制备这些构建体的BamHI/HindIII片段的序列列出为如表2中所概述的SEQIDNO:101-110。如实施例1所述将插入物克隆至pSilencer2.1-U6hygro中。
4.靶向VEGFR2的构建体的活性和链特异性
使用实施例2中所述的方案和表3中所列出的报告基因构建体，如上文所述执行双重荧光素酶测定以确定miR-V-1至miR-V-10的活性和链偏好。
表3：用于测定miR构建体的活性和链特异性的报告基因构建体。
a描述用于双重荧光素酶测定中以测定miR构建体的活性和链特异性的特定luc融合构建体的代码。
b包括于luc融合构建体中的序列。
c用个别报告基因测定的miR构建体。
这些实验的结果显示于图5A中。这些数据显示所有10种构建体均可能实现所述反义报告基因构建体的显著沉默，但针对所述有义报告基因构建体的活性显著不同，反映在不同ddRNAi构建体之间过客链的RISC装载的显著差异和所引起的随之发生的脱靶效应倾向。基于这些数据，选择miR-V-2、miR-V-3、miR-V-7以及miR-V-10用于后续分析。
为了确认这些构建体针对原生VEGFR2mRNA的活性，根据制造商的(RocheAppliedSciences)方案使用Fugene使HEK293T细胞共转染表达VEGFR2miR-V-2、3、7以及10的质粒和表达VEGFR2的全长cDNA的表达质粒。72小时后，如上文所述分离RNA。根据制造商的方案使用RTQPCR“AssayonDemand”测定VEGFR2mRNA含量。这些数据(图5B)显示与对照物相比，miR-V-2、3、7以及10显著降低稳态VEGFR2mRNA含量。图5C显示如通过蛋白质印迹分析所测定，miR-V-2、3、7以及10还强烈地降低转染的细胞的平行孔中的VEGFR2蛋白含量。合起来看，这些数据显示miR-V-2、3、7以及10有效地使VEGFR-2沉默。
5.设计和制备构建体以使PDGFR-β沉默
使用上文所述的准则设计表达靶向PDGFR-B的shRNA的ddRNAi构建体，以识别PDGFR-BmRNA中在人与临床前测试物种小鼠和猕猴之间充分保守的靶标序列。在大多数情况下，在人序列与小鼠和猴模型中的相应序列之间存在单一核苷酸错配。制造10种ddRNAi构建体(miR-P-1、miR-P-2、miR-P-3、miR-P-4、miR-P-5、miR-P-6、miR-P-7、miR-P-8、miR-P-9以及miR-P-10)。用于制备这些构建体的BamHI/HindIII片段的序列列出为如表2中所概述的SEQIDNO:111-120。如实施例1所述将插入物克隆至pSilencer2.1-U6hygro中。
6.靶向PDGFR-β的构建体的活性和链特异性
使用实施例2中所述的方案和表3中所列出的报告基因构建体，如上文所述执行双重荧光素酶测定并且使用所述测定来确定miR-P-1至miR-10的活性和链偏好。这些数据显示所有10种构建体均显示所述反义报告基因构建体的显著沉默。基于这些数据，选择miR-P-4和miR-P-9用于后续分析。
为了确认这些构建体针对原生PDGFR-βmRNA的活性，根据制造商的(RocheAppliedSciences)使用Fugene使HEK293T细胞共转染表达PDGFR-βmiR-P-4或miR-P-9的质粒和表达PDGFR-β的全长cDNA的质粒。48小时后，如上文所述分离RNA。根据制造商的方案使用RTQPCR“AssayonDemand”测定PDGFR-βmRNA含量。这些数据(图6A)显示与对照物相比，miR-P-4和miR-P-9显著降低稳态PDGFR-BmRNA含量。图6B显示如与对照物相比，miR-P-4和miR-P-9还强烈地降低平行的转染细胞孔中的PDGFR-β蛋白含量。合起来看，这些数据显示miR-P-4和miR-P-9有效地使PDGFR-β沉默。
7.设计和制备构建体以使CFB沉默
使用上文所述的准则设计表达靶向CFB的shRNA的ddRNAi构建体，以识别CFBmRNA中在人与临床前测试物种小鼠和猕猴之间保守的靶标序列。在大多数情况下，在人序列与小鼠和猴模型中的相应序列之间存在单一核苷酸错配或多种错配。制造9种ddRNAi构建体(miR-C-1、miR-C-2、miR-C-3、miR-C-4、miR-C-5、miR-C-6、miR-C-7、miR-C-8以及miR-C-9)。用于制备这些构建体的BamHI/HindIII片段的序列列出为如表2中所概述的SEQIDNO:121-129。如实施例1所述将插入物克隆至pSilencer2.1-U6hygro中。
8.靶向CFB的构建体的活性和链特异性
使用实施例2中所述的方案和表3中所列出的报告基因构建体，如上文所述执行双重荧光素酶测定以确定miR-C-1至9的活性和链偏好。这些实验的结果显示于图7A中。这些数据显示所述构建体大多数显示所述反义报告基因构建体的显著沉默，但针对所述有义报告基因构建体的活性显著不同，反映在不同ddRNAi构建体之间过客链的RISC装载的显著差异和随之发生的脱靶效应倾向。基于这些数据，选择miR-C-1、miR-C-8以及miR-C-9用于后续分析。
为了确认这些构建体针对原生CFBmRNA的活性，使用上文所提及的方法使HEK293T细胞共转染表达miR-C-1、miR-C-8或miR-C-9的质粒和表达CFB的全长cDNA的质粒。48小时后，收集RNA并且使用RTQPCR“AssayonDemand”测定CFBmRNA含量。这些数据(图7B)显示与对照处理的细胞相比，miR-C-1、miR-C-8以及miR-C-9显著降低稳态CFBmRNA含量。图7C显示如与对照物相比，miR-C-1、miR-C-8或miR-C-9还强烈地降低平行的转染细胞中的CFB蛋白含量。如通过蛋白质印迹分析所确定。合起来看，这些数据显示miR-C-1、miR-C-8以及miR-C-9有效地使CFB沉默。
9.靶向VEGF-A的构建体
制备设计为表达靶向VEGF-A的治疗性基于miR的shRNA的构建体。这些构建体使用将表达所有细胞中的shRNA的U6启动子，或将在适当细胞中表达治疗性shRNA的四种组织特异性启动子之一。所述四种组织特异性启动子是人VDM2启动子、人ICAM2启动子、人RPE65启动子以及人FLT启动子。
合成(BlueHerron)由融合至图2C中所述的miR-7序列的启动子序列组成的DNA片段。这些片段含有侧接限制位点以允许克隆至AAV载体中；关于使用polII启动子的构建体，所述AAV载体含有最小聚腺苷酸化位点以确保适当转录终止。这些片段的图显示于图9中并且列出为SEQIDNO:132至SEQIDNO:136。
10.靶向VEGF-A和VEGFR2的构建体
制备设计为表达靶向VEGFF-A和VEGFR2的治疗性基于miR的shRNA的构建体。这些构建体使用将表达所有细胞中的shRNA的U6启动子，或实施例9中的四种组织特异性启动子之一。
合成(BlueHerron)由融合至miR-7-miR-V-7序列的启动子序列组成并且如实施例9中所述含有侧接限制位点以允许克隆至AAV载体中的DNA片段。这些片段的图显示于图10中并且作为SEQIDNO:137至SEQIDNO:141列出。
11.靶向VEGFR2、PDGFR-β以及CFB的构建体
制备设计为表达靶向VEGFR2、PDGFR-β以及CFB的治疗性基于miR的shRNA的构建体。这些构建体使用将表达所有细胞中的shRNA的U6启动子，或实施例9中的四种组织特异性启动子之一。使用一系列工程改造至单一载体中的限制酶将来自单一构建体miR-V-7、miR-C-8以及miR-P-9序列的各发夹亚克隆至所述单一载体中(按相同顺序)。所得的表达构建体还如实施例9中所述含有侧接限制位点以允许克隆至AAV载体中。用于表达这些构建体的付诸实践的启动子包括在BlueHeron处独立地合成的人U6启动子、FLT启动子以及ICAM2启动子。所产生的各构建体在使用之前进行序列验证。这些片段的图显示于图11中并且列出为SEQIDNO:142至SEQIDNO:146。
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US2002/162126US6218181
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WO2003/022052

Claims (22)

1.一种用于抑制AMD相关基因中一种或多种靶标序列的表达的DNA指导的RNA干扰(ddRNAi)剂，所述ddRNAi剂按5’至3’方向包含
至少17个核苷酸长的第一效应子序列；
第一效应子补体序列，
其中所述效应子序列与所述一种或多种靶标序列的转录物中的一个或多个靶标区基本上互补。
2.根据权利要求1所述的ddRNAi剂，其包含第二效应子序列和第二效应子补体序列。
3.根据权利要求2所述的ddRNAi剂，其按5’至3’方向包含
至少17个核苷酸长的第一效应子序列；
至少17个核苷酸长的第二效应子序列
第二效应子补体序列；以及
第一效应子补体序列，
其中各效应子序列与所述一种或多种靶标序列的转录物中的一个或多个靶标区基本上互补。
4.根据权利要求2所述的ddRNAi剂，其按5’至3’方向包含
至少17个核苷酸长的第一效应子序列；
第一效应子补体序列；
至少17个核苷酸长的第二效应子序列；以及
第二效应子补体序列
其中各效应子序列与所述一种或多种靶标序列的转录物中的一个或多个靶标区基本上互补。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的ddRNAi剂，其中所述AMD相关基因选自VEGF-A、VEGFR2、PDGFR-β以及CFB中的一者或多者。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的ddRNAi剂，所述靶标序列选自由来自SEQIDNO:1-39中任一者的序列内的任何10个或更多个相邻核苷酸组成的组。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的ddRNAi剂，其中所述AMD相关基因是VEGF-A并且各效应子序列选自SEQIDNO:40-49。
8.根据权利要求1至4中任一项所述的ddRNAi剂，其中所述AMD相关基因是VEGFR2，并且各效应子序列选自SEQIDNO:50-59。
9.根据权利要求1至4中任一项所述的ddRNAi剂，其中所述AMD相关基因是PDGFR-β并且各效应子序列选自SEQIDNO:60-69。
10.根据权利要求1至4中任一项所述的ddRNAi剂，其中所述AMD相关基因是CFB并且各效应子序列选自SEQIDNO:70-78。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的ddRNAi剂，其中所述剂在miRNA结构中表达。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的ddRNAi剂，其中所述AMD是湿性AMD。
13.一种用于表达根据权利要求1至12中任一项所述的ddRNAi剂的ddRNAi表达盒，所述表达盒包含(无特定顺序)
一种或多种启动子序列
编码一种或多种效应子序列的一种或多种DNA序列，
编码一种或多种效应子补体序列的一种或多种DNA序列；
以及任选地
一种或多种终止子序列
编码环序列、间隔区序列或二者的一种或多种DNA序列，
一种或多种增强子序列。
14.一种ddRNAi表达盒，其进一步包含miRNA编码(ME)序列。
15.一种ddRNAi表达构建体，其包含根据权利要求13或14所述的ddRNAi表达盒。
16.根据权利要求15所述的ddRNAi表达构建体，其中所述构建体是病毒递送构建体。
17.一种治疗受试者的AMD的方法，其包括施用治疗有效量的权利要求15或16的ddRNAi表达构建体。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述AMD是湿性AMD。
19.一种治疗受试者的脉络膜新生血管的方法，其包括施用治疗有效量的权利要求15或16的ddRNAi表达构建体。
20.一种减少受试者的玻璃疣沉积物的方法，其包括施用治疗有效量的权利要求15或16的ddRNAi表达构建体。
21.根据权利要求17-20中任一项所述的方法，其中所述ddRNAi表达构建体通过玻璃体内注射施用于所述受试者的眼睛。
22.一种药物组合物，其包含权利要求15或16的ddRNAi表达构建体和药学上可接受的载体或稀释剂。
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