CN110123762A - 一种载药纳米复合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种载药纳米复合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种载药纳米复合物及其制备方法和应用，所述载药纳米复合物具有以内含金属的富勒醇为内核、以两亲性聚合物为外壳的核壳结构，以及负载于所述内含金属的富勒醇内核表面的抗肿瘤药物。本发明提供的载药纳米复合物中的核壳结构可以实现对药物的大量、稳定负载和缓释功能，内含金属的富勒醇具有抗肿瘤活性和减轻化疗药物对机体的毒副作用的功能，因此药物载体和抗肿瘤药物相互协同配合，可以实现对肿瘤的免疫治疗和化疗的联合用药，极大提高了肿瘤治疗的效果；本发明提供的载药纳米药物复合物具有较好的长循环效果和肿瘤靶向性，且制备方法简单、稳定性好。

Description

一种载药纳米复合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于载药材料技术领域，具体涉及一种载药纳米复合物及其制备方法和应用。
背景技术
目前，肿瘤已经成为威胁人类健康的头号杀手，传统的肿瘤治疗方法(例如化疗、放疗等)的基本原理是将肿瘤细胞杀死，这种方法对病人的毒副作用大、易产生耐药，最终导致肿瘤复发率高，临床治疗效果并不理想。近几年，随着生物学技术的突飞猛进和药物靶点的大量发现，肿瘤免疫治疗成为研究的热点，多种肿瘤免疫治疗的药物，如Ipilimumab、Nivolumab、Pembrolizumab 等，已经被FDA批准用于临床研究；但是小分子和抗体药物在使用中依然存在不容忽视的问题，比如药效有限、容易降解、动力学参数不理想等，故而探索新的肿瘤治疗方法，一直是科学界积极攻关并希望取得突破的重大难题。随着纳米科技快速发展，人们发现，纳米材料具有独特的物理化学性质，例如表面效应、尺寸效应等，这些性质使纳米材料与生物界面作用时，表现出超越传统分子之间相互作用所产生的生物学效应和生物医学功能，因此，纳米材料被认为是有望引发生物医学领域变革的基础性物质。
富勒烯是一种新型碳基纳米材料，它是一个由20个六元环和12个五元环组成的球形三十二面体，其外形酷似足球，其中六元环的每个碳原子以双键形式和其他碳原子结合，形成类似苯环的结构。近年来，人们对于富勒烯及其衍生物的毒性效应给予了极大的关注，富勒烯及其衍生物由于独特的结构和物理化学性质，具有抗氧化活性和细胞保护作用、抗菌活性、抗病毒作用以及肿瘤治疗活性，在生物医学领域发挥了重要的作用，
CN108853142A公开了一种水溶性富勒烯纳米颗粒在制备抑制肿瘤生长药物中的应用，该水溶性富勒烯纳米颗粒包括水溶性空心富勒烯纳米颗粒、水溶性空心纳米颗粒的可药用的盐、水溶性空心纳米颗粒的可药用的酯、水溶性金属富勒烯纳米颗粒、水溶性金属富勒烯纳米颗粒的可药用的盐和水溶性金属富勒烯纳米颗粒的可药用的酯中的至少一种，基于所述水溶性富勒烯纳米颗粒的药物对生物体有很好的亲和性，毒性低，对肿瘤的抑制效率高。CN1935812B公开了一种金属富勒醇及其在制备抑制肿瘤生长药物中的应用，其中金属富勒醇的通式为M@C2m(OH)x，M选自La、Gd等稀土金属，m＝41或30，10≤x＜50，羟基基团的存在降低了金属富勒烯的生物毒性，提高了其生物亲和性；与目前临床普遍使用的环磷酰胺、顺铂、紫杉醇相比，金属富勒醇的用量小，毒性低，肿瘤抑制率高。CN108578705A公开了一种叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药及其制备方法与应用，所述前药以水溶性富勒醇为药物载体，结构中引入小分子酰肼基团，与叶酸通过酰胺键相连，与阿霉素通过腙键相连；所述前药到达肿瘤组织后，利用肿瘤细胞膜的叶酸受体介导吞噬，利用细胞内涵体的弱酸性环境使腙键解离，释放出药物和载体，毒副作用小，能实现靶向治疗。
然而在肿瘤治疗技术领域，小分子化疗药物在临床上产生的毒副作用极大限制了化疗药物的使用，而且小分子化疗药物在给药过程中往往有过快释放或突释现象，增加了机体的代谢负担，也加剧了药物对正常器官的损害；基于富勒烯及其衍生物的免疫治疗法虽然通过调控肿瘤微环境来抑制肿瘤生长，但其药效有限，且溶解性问题、代谢毒性以及对肿瘤的作用机理都尚未完全研究清楚。
基于此，开发一种治疗效果好、毒副作用低且易于制备的抗肿瘤药物体系，是本领域亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种载药纳米复合物及其制备方法和应用，所述载药纳米复合物具有以内含金属的富勒醇为内核、以两亲性聚合物为外壳的核壳结构以及负载于内核上的抗肿瘤药物，增大了抗肿瘤药物的载药量，并具有缓释效果；所述载药纳米复合物将化疗和免疫治疗相互协同配合，具有良好的肿瘤治疗效果。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种载药纳米复合物，所述载药纳米复合物具有以内含金属的富勒醇为内核、以两亲性聚合物为外壳的核壳结构，以及负载于所述内含金属的富勒醇内核表面的抗肿瘤药物。
本发明提供的载药纳米复合物中按照其功能可分为药物载体和抗肿瘤药物两部分，其中药物载体为具有核壳结构的纳米粒子，该核壳结构以内含金属的富勒醇为内核，以两亲性大分子为外壳。内含金属的富勒醇是一种新型纳米碳材料，作为富勒烯衍生物，内含金属的富勒醇除具有富勒烯本身的独特结构和生物化学性质外，其表面的大量羟基赋予内含金属的富勒醇良好的水溶性和多个作用位点，内部的金属增强了其对机体的免疫调节功能。
本发明所述载药纳米复合物的载药核壳结构中，内含金属的富勒醇内核通过氢键、π-π相互作用以及静电相互作用等多重分子间作用力实现对抗肿瘤药物的大量负载；并且通过亲水相互作用与两亲性聚合物发生聚集、在乳化剂的作用下形成稳定的W/O/W型复合乳液体系，得到两亲性聚合物外壳。这种核壳结构的药物载体将抗肿瘤药物“锁”在内核和外壳之间，一方面可以提高抗肿瘤药物的负载量以及负载稳定性，另一方面当载药纳米复合物进入机体后，两亲性聚合物外壳在机体内的降解过程与内核表面抗肿瘤药物的解吸附扩散相互协同，实现抗肿瘤药物在机体中平缓、稳定的释放，有效避免了抗肿瘤药物突释或大量释放给机体造成的代谢负担以及对心脏产生的毒副作用。
本发明所述载药纳米复合物创造性地选择内含金属的富勒醇作为载药核壳结构的内核，内含金属的富勒醇一方面具有抗肿瘤活性和机体免疫调节功能，能够通过对肿瘤微环境中特定组分的调控来抑制肿瘤生长；另一方面，抗肿瘤药物、尤其是化疗药物在机体内的代谢中产生的自由基是其具有毒副作用的重要原因，以盐酸阿霉素为例，盐酸阿霉素体内代谢产生的琨自由基具有明显的心脏毒性，内含金属的富勒醇因其独特的理化性质而具有吞噬自由基的功能，从而清除化疗药物代谢产生的毒性自由基，有效减轻化疗药物对机体的毒副作用。
综上所述，本发明提供的载药纳米复合物中，核壳结构的药物载体不仅具有大的药物负载量和对药物的缓释功能，而且作为内核的内含金属的富勒醇具有抗肿瘤活性、机体免疫调节功能以及减缓化疗药物毒副作用的功能；药物载体和抗肿瘤药物相互协同配合，可以实现对肿瘤的免疫治疗和化疗的联合用药，极大提高了肿瘤治疗的效果，并减缓了化疗药物的毒副作用。
优选地，所述内含金属的富勒醇的结构式为M@C82(OH)n，其中M为金属元素，n为10～40的整数，例如11、13、15、18、20、21、22、23、24、25、 27、30、33、35、37或39，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，M选自Gd、Ho、Sc、La或Y中的任意一种，进一步优选为Gd；
优选地，n为20～24的整数，例如20、21、22、23或24。
优选地，所述内含金属的富勒醇的结构式为Gd@C82(OH)22。
本发明中所用的内含金属的富勒醇的化学结构示意性地用通式表示为 M@C82(OH)n，其中M表示金属元素；n表示羟基数目，为10～40的整数。所述内含金属的富勒醇中，金属原子位于富勒醇的碳笼内部。
优选地，所述两亲性聚合物为具有生物相容性的两亲性聚合物；
优选地，所述两亲性聚合物选自聚乳酸、聚乙二醇、聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、丙交酯-己内酯共聚物或聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸嵌段共聚物中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述两亲性聚合物为聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸嵌段共聚物；
优选地，所述聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸嵌段共聚物的数均分子量为 10000～50000，例如11000、13000、15000、18000、20000、23000、25000、28000、 30000、33000、35000、38000、40000、42000、45000、47000或49000，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述两亲性聚合物与内含金属的富勒醇的质量比为(2～1000):1，例如3:1:、5:1、6:1、7:1、8:1、10:1、20:1、30:1、50:1、70:1、80:1、90:1、100:1、 200:1、300:1、400:1、500:1、600:1、800:1、900:1或1000:1，进一步优选为(5～90):1。
本发明限定了所述载药纳米复合物中两亲性聚合物与内含金属的富勒醇的质量比例，若两亲性聚合物的量大于本发明限定的范围，则会影响载药量以及免疫治疗与化疗联合用药的效果；若内含金属的富勒醇的量大于本发明限定的范围，则会影响核壳结构的形成，无法达到抗肿瘤药物平缓释放的效果。
优选地，所述抗肿瘤药物为水溶性抗肿瘤药物；
优选地，所述抗肿瘤药物选自盐酸阿霉素、顺铂或异长春花碱中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述抗肿瘤药物为盐酸阿霉素；
优选地，所述抗肿瘤药物与内含金属的富勒醇的质量比为(0.5～5):1，例如0.51:1:、0.53:1、0.55:1、0.58:1、0.6:1、0.65:1、0.7:1、0.9:1、1:1、1.1:1、1.3:1、 1.5:1、1.8:1、2:1、2.3:1、2.5:1、2.8:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1或4.9:1，进一步优选为(1～3):1。
本发明提供的载药纳米复合物中负载的抗肿瘤药物具有亲水性，因为机体中的组织液等都是水相环境，亲水性药物更有利于肿瘤的治疗。本发明中示例性的优选了盐酸阿霉素为抗肿瘤药物，一方面是因为盐酸阿霉素是一类广谱抗肿瘤抗生素，对多种肿瘤细胞具有杀灭作用，基于盐酸阿霉素的载药纳米复合物更具有代表性和普适性；另一方面，盐酸阿霉素的化学结构中含有苯环、羟基、氨基等，可以和内含金属的富勒醇上的羟基通过氢键结合，也可以和内含金属的富勒醇中的六元环结构发生π-π相互作用，并且可以在水中电离带上电荷与药物载体发生静电相互作用。盐酸阿霉素和内含金属的富勒醇内核之间的多重分子间相互作用增大了载药纳米复合物中的载药量、载药稳定性，并且最大限度保留了药物自身的结构和性能，避免药物与载体之间因进行化学键合而对药物自身化学结构和构象的改变；更为重要的是，由于药物的负载是基于分子间相互作用，因此在载药纳米复合物达到体内治疗位点后，无需额外提供激活物质，药物和内核之间会自发地逐渐解吸附，实现药物的释放。
本发明还限定了所述载药纳米复合物中内含金属的富勒醇与抗肿瘤药物的质量比，由于内含金属的富勒醇分子的抗肿瘤活性与化疗药物的抗肿瘤活性均有其特定的有效浓度范围，若载药纳米复合物中化疗药物比例过高，则会影响联合用药，加剧毒副作用；若化疗药物浓度过低，则对肿瘤的化疗效果不佳，同样无法达到联合用药的治疗效果。将二者比例限定在本发明所述的范围内，一方面能够实现化疗与免疫治疗联合用药的良好疗效，另一方面也能降低化疗药物的毒副作用，避免对机体的正常细胞及组织产生不利影响。
优选地，所述载药纳米复合物的粒径为50～150nm，例如55nm、60nm、 65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、 115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm或145nm，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
本发明限定了载药纳米复合物的粒径，若粒径大于150nm，载药纳米复合物的稳定性将会下降；若粒径小于50nm，载药纳米复合物的载药量将会降低。
另一方面，本发明提供一种如上所述载药纳米复合物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将两亲性聚合物与有机溶剂混合，得到溶液A；
(2)将内含金属的富勒醇与极性溶剂混合，得到溶液B；
(3)将步骤(2)得到的溶液B与抗肿瘤药物混合，得到溶液C；
(4)将步骤(1)得到的溶液A与步骤(3)得到的溶液C混合，进而乳化，得到初乳；
(5)向步骤(4)得到的初乳中加入乳化剂，经过破乳后得到复乳；所述复乳经过后处理，得到所述载药纳米复合物。
本发明所述载药纳米复合物的制备方法为双乳法，通过乳化剂和超声等辅助条件的协同作用，得到符合本发明限定粒径的载药纳米复合物。
优选地，步骤(1)所述有机溶剂选自氯仿、二氯甲烷、四氢呋喃或甲酰胺中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，步骤(1)所述有机溶剂为二氯甲烷；
优选地，步骤(1)所述溶液A中两亲性聚合物的浓度为5～30mg/mL，例如5.3mg/mL、5.5mg/mL、5.8mg/mL、6mg/mL、6.5mg/mL、7mg/mL、9mg/mL、 10mg/mL、13mg/mL、15mg/mL、17mg/mL、19mg/mL、20mg/mL、23mg/mL、 25mg/mL、27mg/mL或29mg/mL，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，步骤(2)所述极性溶剂选自水、乙醇、二甲基亚砜或四氢呋喃中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，步骤(2)所述极性溶剂为水；
优选地，步骤(2)所述溶液B中内含金属的富勒醇的浓度为0.1～10mg/mL，例如0.3mg/mL、0.5mg/mL、0.8mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、1.7mg/mL、 1.9mg/mL、2mg/mL、2.3mg/mL、2.5mg/mL、3mg/mL、3.5mg/mL、4mg/mL、 4.5mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL或9mg/mL，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值，进一步优选为1～5mg/mL；
优选地，步骤(3)所述溶液C中内含金属的富勒醇与抗肿瘤药物的质量比为1:(0.5～5)，例如1:0.51、1:0.53、1:0.55、1:0.58、1:0.6、1:0.65、1:0.7、1:0.9、 1:1、1:1.1、1:1.3、1:1.5、1:1.8、1:2、1:2.3、1:2.5、1:2.8、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5 或1:4.9，进一步优选为1:(1～3)。
优选地，步骤(4)所述溶液A与溶液C的体积比为(1～15):1，例如1.1:1:、 1.3:1、1.5:1、1.8:1、2:1、2.5:1、3:1、4:1、4.5:1、5:1、5.5:1、6:1、7:1、8:1、 9:1、10:1、11:1、12:1、13:1或14:1，进一步优选为5:1。
优选地，步骤(4)所述初乳中内含金属的富勒醇与两亲性聚合物的质量比为1:(2～1000)，例如1:3、1:5、1:7、1:8、1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、 1:70、1:80、1:90、1:100、1:300、1:500、1:800、1:900或1:990，进一步优选为 1:(5～90)。
优选地，步骤(4)所述混合在磁力搅拌条件下进行；
优选地，步骤(4)所述乳化为超声乳化；
优选地，所述超声乳化的超声功率为50～100W，例如51W、53W、55W、 58W、60W、65W、70W、75W、80W、85W、90W或95W，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述超声乳化的时间为1～5min，例如1.3min、1.5min、1.7min、 2min、2.3min、2.5min、2.7min、3min、3.3min、3.5min、3.8min、4min、 4.3min、4.5min、4.7min或4.9min，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，步骤(5)所述乳化剂为聚乙烯醇和普朗尼克的混合物；
优选地，所述聚乙烯醇和普朗尼克的质量比为1:1；
优选地，步骤(5)所述乳化剂的质量为初乳中两亲性聚合物质量的 0.1％～50％，例如0.3％、0.5％、0.7％、0.9％、1％、1.3％、1.5％、1.8％、2％、 3％、3.5％、4％、5％、7％、9％、10％、12％、15％、18％、20％、25％、30％、 35％、40％、45％、47％或49％，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，步骤(5)所述破乳在超声条件下进行；
优选地，所述超声的功率为100～500W，例如110W、130W、150W、170 W、200W、230W、250W、280W、300W、320W、350W、380W、400W、430W、450W、470W或490W，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述超声的时间为5～10min，例如5.3min、5.5min、5.7min、6min、6.3min、6.5min、6.7min、7min、7.3min、7.5min、7.8min、8min、8.3min、 8.5min、8.7min、9min、9.5min或9.9min，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，步骤(5)所述后处理包括减压旋蒸和高速离心；
优选地，所述减压旋蒸的温度为室温；
优选地，所述减压旋蒸的转速为20～60转/分钟，例如21转/分钟、23转/ 分钟、25转/分钟、28转/分钟、30转/分钟、35转/分钟、40转/分钟、45转/分钟、50转/分钟、55转/分钟或59转/分钟，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述减压旋蒸的压力为400～600mmHg，例如410mmHg、430 mmHg、450mmHg、480mmHg、500mmHg、530mmHg、550mmHg、570mmHg 或590mmHg，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述高速离心的转速为10000转/分钟。
优选地，所述制备方法具体包括以下步骤：
(1)将两亲性聚合物与二氯甲烷混合，得到两亲性聚合物浓度为5～30 mg/mL的溶液A；
(2)将内含金属的富勒醇与水混合，得到内含金属的富勒醇浓度为0.1～10 mg/mL的溶液B；
(3)将步骤(2)得到的溶液B与抗肿瘤药物混合，得到内含金属的富勒醇与抗肿瘤药物的质量比为1:(0.5～5)的溶液C；
(4)将步骤(1)得到的溶液A与步骤(3)得到的溶液C以体积比(1～15):1 在磁力搅拌下混合，进而在功率为50～100W条件下超声乳化1～5min，得到初乳，所述初乳中内含金属的富勒醇与两亲性聚合物的质量比为1:(2～1000)；
(5)向步骤(4)得到的初乳中加入乳化剂，所述乳化剂为聚乙烯醇和普朗尼克的质量比为1:1的混合物，所述乳化剂的质量为初乳中两亲性聚合物质量的0.1％～50％；在超声功率100～500W的条件下超声破乳5～10min后得到复乳；所述复乳经过室温减压旋蒸后得到分散液，进而高速离心，得到所述载药纳米复合物。
另一方面，本发明提供一种如上所述的载药纳米复合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供的载药纳米复合物中的药物载体具有内含金属的富勒醇为内核、两亲性聚合物为外壳的核壳结构，所述核壳结构可以实现对药物的大量、稳定负载和缓释功能。
(2)本发明所述载药纳米复合物中内含金属的富勒醇不仅具有抗肿瘤活性和机体免疫调节功能，通过对肿瘤微环境中特定组分的调控来抑制肿瘤生长，而且可以清除化疗药物代谢产生的毒性自由基，有效减轻化疗药物对机体的毒副作用。
(3)本发明所述载药纳米复合物中药物载体和抗肿瘤药物相互协同配合，可以实现对肿瘤的免疫治疗和化疗的联合用药，极大提高了肿瘤治疗的效果，并减缓了化疗药物的毒副作用。
(4)本发明提供的载药纳米药物复合物具有较好的长循环效果和肿瘤靶向性，且制备方法简单、稳定性好。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的载药纳米复合物的透射电镜图；
图2为本发明实施例1提供的载药纳米复合物的水合粒径分布图；
图3为本发明实施例1提供的载药纳米复合物的紫外-可见吸收曲线图；
图4为本发明实施例6中载药纳米复合物中抗肿瘤药物的释放曲线图；
图5为本发明实施例7中载药纳米复合物对肿瘤细胞4T1的细胞毒性结果图；
图6为本发明实施例8中内含金属的富勒醇对巨噬细胞分化的基因表达影响结果图，其中(a)为内含金属的富勒醇对M2型巨噬细胞基因表达水平的影响结果图，(b)为内含金属的富勒醇对M1型巨噬细胞基因表达水平的影响结果图；
图7为本发明实施例9中载药纳米复合物对体内肿瘤生长影响的测试结果图；
图8为本发明实施例10中载药纳米复合物对肿瘤局部粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子含量的影响结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
本发明实施例1～5以及对比例1～3中所用的两亲性聚合物为聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸嵌段共聚物(PEG-co-PLGA，Mn为30000，购自苏州Bankvalley纳米材料技术有限公司)；内含金属的富勒醇的化学结构示意性地表述为Gd@C82(OH)22，购自中科普惠生物科技有限公司；抗肿瘤药物为盐酸阿霉素，购自北京huafeng科技有限公司；乳化剂为聚乙烯醇和普朗尼克的质量百分比均为1％的二氯甲烷溶液，其中聚乙烯醇、普朗尼克和二氯甲烷均购自北京国药集团。
实施例1
本实施例提供一种载药纳米复合物，其制备方法具体包括以下步骤：
(1)将20mg PEG-co-PLGA溶于4mL二氯甲烷中得到溶液A；
(2)将0.4mg的Gd@C82(OH)22溶于400μL二次水中得到溶液B；
(3)将步骤(2)得到的溶液B与0.4mg盐酸阿霉素混合，在室温避光条件下搅拌24小时得到溶液C；
(4)将步骤(1)得到的溶液A与步骤(3)得到的溶液C在磁力搅拌下混合，用超声破碎仪在50W的功率下超声乳化2min得到初乳；
(5)向步骤(4)得到的初乳中加入6mL乳化剂，用超声破碎仪在100W 的功率下超声破乳10min后得到复乳；所述复乳经过室温减压旋蒸后得到分散液，进而高速离心，得到所述载药纳米复合物。
实施例2
本实施例提供一种载药纳米复合物，其制备方法具体包括以下步骤：
(1)将30mg PEG-co-PLGA溶于4mL二氯甲烷中得到溶液A；
(2)将0.6mg的Gd@C82(OH)22溶于400μL二次水中得到溶液B；
(3)将步骤(2)得到的溶液B与0.8mg盐酸阿霉素混合，在室温避光条件下搅拌24小时得到溶液C；
(4)将步骤(1)得到的溶液A与步骤(3)得到的溶液C在磁力搅拌下混合，用超声破碎仪在75W的功率下超声乳化1min得到初乳；
(5)向步骤(4)得到的初乳中加入9mL乳化剂，用超声破碎仪在200W 的功率下超声破乳7min后得到复乳；所述复乳经过室温减压旋蒸后得到分散液，进而高速离心，得到所述载药纳米复合物。
实施例3
本实施例提供一种载药纳米复合物，其制备方法具体包括以下步骤：
(1)将50mg PEG-co-PLGA溶于4mL二氯甲烷中得到溶液A；
(2)将1mg的Gd@C82(OH)22溶于400μL二次水中得到溶液B；
(3)将步骤(2)得到的溶液B与3mg盐酸阿霉素混合，在室温避光条件下搅拌24小时得到溶液C；
(4)将步骤(1)得到的溶液A与步骤(3)得到的溶液C在磁力搅拌下混合，用超声破碎仪在100W的功率下超声乳化5min得到初乳；
(5)向步骤(4)得到的初乳中加入15mL乳化剂，用超声破碎仪在500W 的功率下超声破乳10min后得到复乳；所述复乳经过室温减压旋蒸后得到分散液，进而高速离心，得到所述载药纳米复合物。
实施例4
本实施例提供一种载药纳米复合物，其制备方法具体包括以下步骤：
(1)将20mg PEG-co-PLGA溶于4mL二氯甲烷中得到溶液A；
(2)将0.5mg的Gd@C82(OH)22溶于400μL二次水中得到溶液B；
(3)将步骤(2)得到的溶液B与0.3mg盐酸阿霉素混合，在室温避光条件下搅拌24小时得到溶液C；
(4)将步骤(1)得到的溶液A与步骤(3)得到的溶液C在磁力搅拌下混合，用超声破碎仪在50W的功率下超声乳化1min得到初乳；
(5)向步骤(4)得到的初乳中加入4mL乳化剂，用超声破碎仪在100W 的功率下超声破乳5min后得到复乳；所述复乳经过室温减压旋蒸后得到分散液，进而高速离心，得到所述载药纳米复合物。
实施例5
本实施例提供一种载药纳米复合物，其制备方法具体包括以下步骤：
(1)将80mg PEG-co-PLGA溶于4mL二氯甲烷中得到溶液A；
(2)将4mg的Gd@C82(OH)22溶于800μL二次水中得到溶液B；
(3)将步骤(2)得到的溶液B与8mg盐酸阿霉素混合，在室温避光条件下搅拌24小时得到溶液C；
(4)将步骤(1)得到的溶液A与步骤(3)得到的溶液C在磁力搅拌下混合，用超声破碎仪在100W的功率下超声乳化5min得到初乳；
(5)向步骤(4)得到的初乳中加入16mL乳化剂，用超声破碎仪在500W 的功率下超声破乳10min后得到复乳；所述复乳经过室温减压旋蒸后得到分散液，进而高速离心，得到所述载药纳米复合物。
对比例1
本对比例提供一种载药纳米复合物，其制备方法具体包括以下步骤：
(1)将20mg PEG-co-PLGA溶于4mL二氯甲烷中得到溶液A；
(2)将步骤(1)得到的溶液A与0.4mg盐酸阿霉素混合，在室温避光条件下搅拌24小时得到溶液B；
(3)向步骤(2)得到的溶液B中加入6mL乳化剂，用超声破碎仪在100 W的功率下超声破乳10min后得到乳液；所述乳液经过室温减压旋蒸后得到分散液，进而高速离心，得到所述载药纳米复合物。
对比例2
本对比例提供一种载药纳米复合物，其制备方法具体包括以下步骤：
(1)将0.4mg的Gd@C82(OH)22溶于400μL二次水中得到溶液A；
(2)将步骤(1)得到的溶液A与0.4mg盐酸阿霉素混合，在室温避光条件下搅拌24小时得到溶液B；
(3)向步骤(2)得到的溶液B中加入6mL乳化剂，用超声破碎仪在100 W的功率下超声破乳10min；经过室温减压旋蒸后得到分散液，进而高速离心，得到所述载药纳米复合物。
对比例3
本对比例提供一种纳米复合物，其制备方法具体包括以下步骤：
(1)将20mg PEG-co-PLGA溶于4mL二氯甲烷中得到溶液A；
(2)将0.4mg的Gd@C82(OH)22溶于400μL二次水中得到溶液B；
(3)将步骤(1)得到的溶液A与步骤(2)得到的溶液B在磁力搅拌下混合，用超声破碎仪在50W的功率下超声乳化2min得到初乳；
(4)向步骤(3)得到的初乳中加入6mL乳化剂，用超声破碎仪在100W 的功率下超声破乳10min后得到复乳；所述复乳经过室温减压旋蒸后得到分散液，进而高速离心，得到所述纳米复合物。
载药纳米复合物的形貌及载药量测试：
(1)粒径测试：
采用透射电子显微镜(TEM，美国FEI，Tecnai G2 20S-TWIN)检测本发明实施例1～5、对比例1～3中得到的载药纳米复合物的形貌。将载药纳米复合物水溶液滴于铜网上，待其自然风干后在加速电压200kV、束斑尺寸0.2nm条件下TEM测试其形貌，通过得到的透射电镜图中所示形貌计算得到所述载药纳米复合物的平均粒径；实施例1中提供的载药纳米复合物的透射电镜图如图1所示，从图1中可以看出，实施例1中提供的载药纳米复合物为均匀球形的纳米粒子，平均粒径为50nm。
(2)水合粒径测试：
采用激光粒度仪(英国Malvern，Zetasizer NanoZS)测试实施例1～5、对比例1～3中得到的载药纳米复合物的水合粒径。将载药纳米复合物配成内含金属的富勒醇浓度为20μg/mL的水溶液，在25℃、测试角度90度条件下用激光粒度仪测定样品的水合粒径；实施例1中提供的载药纳米复合物的水合粒径分布图如图2所示，从图2中可以看出，实施例1提供的载药纳米复合物的水合粒径分布均匀，约100nm。
(3)载药量测试：
采用紫外-可见分光光度计测试实施例1～5、对比例1～3中得到的载药纳米复合物的紫外-可见吸收曲线，其中480nm处的吸收峰为盐酸阿霉素的特征吸收峰，480nm处的吸光度值正比于载药纳米复合物中盐酸阿霉素的载药量；实施例1中提供的载药纳米复合物的紫外-可见吸收曲线如图3所示，从图3中可知，实施例1中提供的载药纳米复合物的紫外-可见吸收曲线在480nm处有显著吸收。
按照上述方法测试实施例1～5、对比例1～3提供的载药纳米复合物的平均粒径、水合粒径及抗肿瘤药物盐酸阿霉素的载药量，得到的测试数据如表1所示：
表1
表1中，“--”表示该值不存在。对比例1中仅有PEG-co-PLGA和盐酸阿霉素，在乳化剂作用下自聚集形成胶束，无法得到纳米粒子；对比例2中仅有内含金属的富勒醇和盐酸阿霉素，无法形成稳定的聚集体；对比例3中内含金属的富勒醇和PEG-co-PLGA在乳化剂作用下形成粒径较小的纳米粒子，但由于没有负载阿霉素，因此紫外-可见吸收曲线上没有盐酸阿霉素的特征吸收峰。
从表1的数据可以看出，按照本发明所述载药纳米复合物的制备方法可以得到粒径为50～150nm、水合粒径为60～200nm的载药纳米复合物，所述载药纳米复合物可以实现对抗肿瘤药物盐酸阿霉素的大量负载。若载药纳米复合物中不含有本发明所限定的内含金属的富勒醇为内核、两亲性聚合物为外壳的核壳结构，则无法形成粒径分布均匀的纳米粒子，无法实现对抗肿瘤药物的有效负载。
实施例6
本实施例为实施例1中提供的载药纳米复合物的药物释放实验，具体步骤如下：
(1)将实施例1提供的载药纳米复合物溶于1mL超纯水中得到溶液，利用水浴超声进行助溶；
(2)将步骤(1)得到的溶液转移到截留分子量为3500的半透膜中，分别在pH＝5.2和pH＝7.4的生理盐水中测定抗肿瘤药物盐酸阿霉素的释放情况；
(3)分别于0h、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h、36h和48h时取 500μL缓释液，利用高效液相色谱测定所述缓释液中盐酸阿霉素的含量，该含量即为盐酸阿霉素的释放量；
(4)将步骤(3)得到的盐酸阿霉素释放量除以所述载药纳米复合物中负载的盐酸阿霉素的总量，得到盐酸阿霉素的累计释放率，并以累计释放率为纵坐标、释放时间为横坐标作图，得到的载药纳米复合物中抗肿瘤药物的释放曲线如图4所示。从图4中可以看出，本发明所述载药纳米复合物中的盐酸阿霉素在中性和弱酸性条件下均具有明显的缓释行为，并在弱酸性环境下能够在24 小时内完成50％的药物释放量，可以达到化疗药物的治疗目的；该弱酸性环境模拟了机体内的肿瘤微环境，由此可知，本发明所述载药纳米复合物在机体的肿瘤位置可以实现化疗药物盐酸阿霉素的平缓释放，且其释放量可以满足化疗需求。
实施例7
本实施例为实施例1提供的载药纳米复合物的肿瘤细胞毒性实验，具体步骤如下：
(1)将实施例1提供的载药纳米复合物溶于1mL超纯水中得到溶液，利用水浴超声进行助溶；
(2)将小鼠乳腺癌细胞系4T1以3000细胞/孔的密度接种到96孔板中，在 37℃、5％CO2的条件下孵育过夜，使细胞贴壁；
(3)将步骤(1)得到的溶液加入步骤(2)得到的细胞孔中，使孔中载药纳米复合物的浓度分别为0、0.31μg/mL、0.62μg/mL、1.25μg/mL、2.5μg/mL 和5μg/mL，其中浓度为0的孔为对照组；在37℃、5％CO2的条件下孵育24 小时；对照组和每个实验组设置至少5个平行孔；
(4)吸去各孔中的溶液，然后向各孔中加入110μL含10％(体积比)2-(2- 甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐(CCK-8) 的细胞培养基，在培养箱中继续培养2h；
(5)以600nm作为参比波长、用酶标仪上测定各孔在450nm处的吸光度值。每组吸光度值扣除空白溶液吸光度值得到的数值再除以对照组的吸光度值，即为细胞活力；细胞活力值越小，说明治疗效果越显著。
按照步骤(1)～(5)所述方法分别测试对比例1提供的载药纳米复合物和盐酸阿霉素的肿瘤细胞毒性实验。
以细胞活力值为纵坐标、载药纳米复合物的浓度为横坐标作图，得到本发明实施例1提供的载药纳米复合物、对比例1提供的载药纳米复合物和盐酸阿霉素对肿瘤细胞4T1的细胞毒性关系图如图5所示；从图5中可以看出，本发明实施例1所述载药纳米复合物对肿瘤细胞4T1具有显著的杀伤效果，并且呈现出浓度依赖性，表现出了抗肿瘤活性；与对比例1提供的载药纳米复合物和盐酸阿霉素相比，实施例1所述载药纳米复合物的细胞活力值下降趋势更为平缓，说明本发明所述载药纳米复合物中的药物具有缓释性能。
实施例8
本实施例为内含金属的富勒醇的抑制巨噬细胞(骨髓来源)向M2型分化实验，具体步骤如下：
(1)分离小鼠的股骨和胫骨，用注射器吸取1640培养基将骨髓冲出，收集骨髓细胞；
(2)将骨髓细胞悬液离心后，用添加巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的新鲜培养基重悬，置于培养箱内培养5天；
(3)设置实验组：向步骤(2)得到的细胞中加入肿瘤细胞4T1培养上清收集与新鲜1640培养基1:1混合得到的条件培养基，并加入50μM内含金属的富勒醇Gd@C82(OH)22，继续培养2天；
(4)设置对照组：向步骤(2)得到的细胞中加入肿瘤细胞4T1培养上清收集与新鲜1640培养基1:1混合得到的条件培养基，继续培养2天；
(5)收集步骤(3)中实验组和步骤(4)中对照组的细胞，利用实时荧光定量PCR检测巨噬细胞分化相关基因表达情况。
本发明中内含金属的富勒醇对巨噬细胞分化的基因表达影响结果图如图6 所示，其中(a)为内含金属的富勒醇对M2型巨噬细胞基因表达水平的影响结果图，(b)为内含金属的富勒醇对M1型巨噬细胞基因表达水平的影响结果图；从图6中可以看出，内含金属的富勒醇Gd@C82(OH)22能够显著抑制M2型相关基因的表达，促进M1型相关基因的表达。
实施例9
本实施例为实施例1提供的载药纳米复合物对体内肿瘤生长影响的测试实验，具体步骤如下：
(1)将2×104个肿瘤细胞4T1接种到Balb/c小鼠的腋下，待其生长3天成瘤；
(2)分别对小鼠尾静脉注射0.5mg/kg/次盐酸阿霉素、含有相同盐酸阿霉素含量的实施例1提供的载药纳米复合物、含有相同盐酸阿霉素含量的对比例1 提供的载药纳米复合物、等量生理盐水(对照组)；每两天注射1次，连续注射并观察24天，记录肿瘤的体积变化情况。
以小鼠的肿瘤体积为纵坐标、观察天数为横坐标作图，得到载药纳米复合物对体内肿瘤生长影响的测试结果图如图7所示。从图7中可得，小鼠注射实施例1提供的载药纳米复合物后能够显著抑制肿瘤的生长，与单纯的盐酸阿霉素以及对比例1提供的载药纳米复合物注射相比，通过本发明所述内含金属的富勒醇为内核、两亲性聚合物为外壳的核壳结构药物载体负载盐酸阿霉素得到载药纳米复合物对肿瘤的治疗效果更好。
实施例10
本实施例为实施例1提供的载药纳米复合物对体内肿瘤治疗结果的测试实验，具体为测试用所述载药纳米复合物治疗肿瘤后的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)含量，实验步骤如下：
(1)将2×104个肿瘤细胞4T1接种到Balb/c小鼠的腋下，待其生长3天成瘤；
(2)分别对小鼠尾静脉注射0.5mg/kg/次盐酸阿霉素、含有相同盐酸阿霉素含量的实施例1提供的载药纳米复合物、含有相同盐酸阿霉素含量的对比例1 提供的载药纳米复合物、含有相同盐酸阿霉素含量的对比例2提供的载药纳米复合物、含有相同纳米复合物含量的对比例3提供的纳米复合物、等量生理盐水(对照组)；每两天注射1次，连续注射并观察24天；
(3)将经过步骤(2)处理的小鼠进行解剖，将肿瘤组织迅速取出，剪碎后放在Tris-HCl缓冲液中，充分研磨后取上清检测细胞因子GM-CSF的含量。
GM-CSF在巨噬细胞分化中起到关键的作用，GM-CSF能够刺激巨噬细胞向M1型分化，载药纳米复合物对肿瘤局部粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)的影响结果图如图8所示，从图8中可知，经实施例1提供的载药纳米复合物治疗后小鼠的肿瘤局部细胞因子GM-CSF的含量明显高于对照组、盐酸阿霉素、对比例1、对比例2、对比例3，说明经过本发明提供的载药纳米复合物的治疗，机体的抗肿瘤免疫在一定程度上被激活，抗肿瘤免疫和化疗药物协同配合，增加了肿瘤治疗的疗效。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的载药纳米复合物及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种载药纳米复合物，其特征在于，所述载药纳米复合物具有以内含金属的富勒醇为内核、以两亲性聚合物为外壳的核壳结构，以及负载于所述内含金属的富勒醇内核表面的抗肿瘤药物。
2.根据权利要求1所述的载药纳米复合物，其特征在于，所述内含金属的富勒醇的结构式为M@C82(OH)n，其中M为金属元素，n为10～40的整数；
优选地，M选自Gd、Ho、Sc、La或Y中的任意一种，进一步优选为Gd；
优选地，n为20～24的整数；
优选地，所述内含金属的富勒醇的结构式为Gd@C82(OH)22。
3.根据权利要求1或2所述的载药纳米复合物，其特征在于，所述两亲性聚合物为具有生物相容性的两亲性聚合物；
优选地，所述两亲性聚合物选自聚乳酸、聚乙二醇、聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、丙交酯-己内酯共聚物或聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸嵌段共聚物中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述两亲性聚合物为聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸嵌段共聚物；
优选地，所述聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸嵌段共聚物的数均分子量为10000～50000；
优选地，所述两亲性聚合物与内含金属的富勒醇的质量比为(2～1000):1，进一步优选为(5～90):1。
4.根据权利要求1～3任一项所述的载药纳米复合物，其特征在于，所述抗肿瘤药物为水溶性抗肿瘤药物；
优选地，所述抗肿瘤药物选自盐酸阿霉素、顺铂或异长春花碱中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述抗肿瘤药物为盐酸阿霉素；
优选地，所述抗肿瘤药物与内含金属的富勒醇的质量比为(0.5～5):1，进一步优选为(1～3):1。
5.根据权利要求1～4任一项所述的载药纳米复合物，其特征在于，所述载药纳米复合物的粒径为50～150nm。
6.一种如权利要求1～4任一项所述载药纳米复合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将两亲性聚合物与有机溶剂混合，得到溶液A；
(2)将内含金属的富勒醇与极性溶剂混合，得到溶液B；
(3)将步骤(2)得到的溶液B与抗肿瘤药物混合，得到溶液C；
(4)将步骤(1)得到的溶液A与步骤(3)得到的溶液C混合，进而乳化，得到初乳；
(5)向步骤(4)得到的初乳中加入乳化剂，经过破乳后得到复乳；所述复乳经过后处理，得到所述载药纳米复合物。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述有机溶剂选自氯仿、二氯甲烷、四氢呋喃或甲酰胺中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，步骤(1)所述有机溶剂为二氯甲烷；
优选地，步骤(1)所述溶液A中两亲性聚合物的浓度为5～30mg/mL；
优选地，步骤(2)所述极性溶剂选自水、乙醇、二甲基亚砜或四氢呋喃中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，步骤(2)所述极性溶剂为水；
优选地，步骤(2)所述溶液B中内含金属的富勒醇的浓度为0.1～10mg/mL，进一步优选为1～5mg/mL；
优选地，步骤(3)所述溶液C中内含金属的富勒醇与抗肿瘤药物的质量比为1:(0.5～5)，进一步优选为1:(1～3)。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述溶液A与溶液C的体积比为(1～15):1，优选为5:1；
优选地，步骤(4)所述初乳中内含金属的富勒醇与两亲性聚合物的质量比为1:(2～1000)，进一步优选为1:(5～90)；
优选地，步骤(4)所述混合在磁力搅拌条件下进行；
优选地，步骤(4)所述乳化为超声乳化；
优选地，所述超声乳化的超声功率为50～100W；
优选地，所述超声乳化的时间为1～5min；
优选地，步骤(5)所述乳化剂为聚乙烯醇和普朗尼克的混合物；
优选地，所述聚乙烯醇和普朗尼克的质量比为1:1；
优选地，步骤(5)所述乳化剂的质量为初乳中两亲性聚合物质量的0.1％～50％；
优选地，步骤(5)所述破乳在超声条件下进行；
优选地，所述超声的功率为100～500W；
优选地，所述超声的时间为5～10min；
优选地，步骤(5)所述后处理包括减压旋蒸和高速离心；
优选地，所述减压旋蒸的温度为室温；
优选地，所述减压旋蒸的转速为20～60转/分钟；
优选地，所述减压旋蒸的压力为400～600mmHg；
优选地，所述高速离心的转速为10000转/分钟。
9.根据权利要求6～8任一项所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括以下步骤：
(1)将两亲性聚合物与二氯甲烷混合，得到两亲性聚合物浓度为5～30mg/mL的溶液A；
(2)将内含金属的富勒醇与水混合，得到内含金属的富勒醇浓度为0.1～10mg/mL的溶液B；
(3)将步骤(2)得到的溶液B与抗肿瘤药物混合，得到内含金属的富勒醇与抗肿瘤药物的质量比为1:(0.5～5)的溶液C；
(4)将步骤(1)得到的溶液A与步骤(3)得到的溶液C以体积比(1～15):1在磁力搅拌下混合，进而在功率为50～100W条件下超声乳化1～5min，得到初乳，所述初乳中内含金属的富勒醇与两亲性聚合物的质量比为1:(2～1000)；
(5)向步骤(4)得到的初乳中加入乳化剂，所述乳化剂为聚乙烯醇和普朗尼克的质量比为1:1的混合物，所述乳化剂的质量为初乳中两亲性聚合物质量的0.1％～50％；在超声功率100～500W的条件下超声破乳5～10min后得到复乳；所述复乳经过室温减压旋蒸后得到分散液，进而高速离心，得到所述载药纳米复合物。
10.一种如权利要求1～5任一项所述的载药纳米复合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
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