CN114272211A - 一种td-1修饰的脂质体载药系统、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物制备技术领域，具体涉及一种TD‑1修饰的脂质体载药系统、制备方法及其应用；将马钱子碱作为原料，制备TD‑1修饰的包载马钱子碱的脂质体载药系统，并且可以在超声条件下均匀分散于水中制得透皮治疗剂，该试剂通过透皮给药可以诱导人源性三阴乳腺癌细胞MDA‑MB‑231细胞死亡并抑制该肿瘤细胞的血管生成拟态信号通路，在异种移植瘤小鼠(BALB/C Nude雌性小鼠)模型中，验证了TD‑1修饰的马钱子碱脂质体通过透皮给药之后可以增强治疗效果，且同时具有较低的系统毒性，能够用于抑制三阴乳腺癌血管生成拟态，具有较为明显的对肿瘤细胞的杀伤和抑制效果。

Description

一种TD-1修饰的脂质体载药系统、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及药物制备技术领域，具体涉及一种TD-1修饰的脂质体载药系统、制备方法及其应用。

背景技术

癌症从本质上说是基因病，其发生是一个多因子、多步骤的复杂过程。主要的原因是控制细胞的基因组发生突变，使细胞发生无限制的克隆性转化，最终形成恶性肿瘤。癌症可发生在各类人群、各年龄阶段以及人体的不同器官上，是一组严重威胁人类健康和生命的疾病。

目前对于癌症的治疗，外科手术直接切除病灶仍然是古老的治疗方法之一，同时放疗、化疗以及靶向治疗等方法也被应用到。然而，采用外科手术切除肿瘤组织，很难完全将其切除，尤其是一些难以施行肿瘤切除的部位，或者非实体瘤，手术切除治疗会显得无用武之地。这时临床大夫将会选择放疗和化疗来治疗癌症，但放、化疗剂量较大，也会对人体的正常细胞产生较大的毒副作用，并有可能引起癌症病人较大的毒副反应。因此，在提高癌症治疗效果的情况下、降低化疗药物的使用浓度来减轻对病人的毒副反应，是临床上亟待解决的问题。

近年来随着纳米技术的发展，纳米药物在癌症治疗中的应用逐渐成为热点。由于瘤纳米材料独特的物理化学特性，使其在癌症的诊疗上具有独特的优势。此外，已有很多研究报道纳米材料载药可以协同化疗药物杀伤肿瘤。如脂质体(Liposomes)、聚合物纳米粒(Polymeric nanoparticles)、聚合物胶束(Polymeric micelles)、白蛋白结合纳米粒(Protein-bound nanoparticles)、无机纳米粒(Inorganic nanoparticles)等。有文献表明，血管生成拟态在肿瘤的发生、发展以及转移等多个过程中发挥着重要的调节作用，在很多肿瘤细胞中血管生成拟态信号通路异常激活，导致抗肿瘤血管生成的治疗效果差强人意。因此血管生成拟态信号通路是肿瘤治疗的重要靶点，大量研究表明，血管生成拟态信号通路抑制剂不仅可以抑制肿瘤细胞的生长增殖，而且可以改善抗血管生成的耐药性，为肿瘤的治疗开辟了新的途径。

马钱子碱别名番木鳖，出自《本草纲目》，具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、抗癌镇痛等作用。脂质体具有较高的载药率、良好的稳定性以及生物安全性等优点。包载马钱子碱的脂质体经TD-1的修饰，通过透皮给药有望成为一种新型的适用于难治性及耐药性肿瘤的治疗策略。综上，发明一种TD-1修饰的马钱子碱脂质体载药系统的制备方法及其应用很有必要。

鉴于上述缺陷，本发明创作者经过长时间的研究和实践终于获得了本发明。

发明内容

本发明的目的在于解决如何在提高癌症治疗效果的情况下，降低药物的使用浓度来减轻对病人的毒副反应的问题，提供了一种TD-1修饰的脂质体载药系统、制备方法及其应用。

为了实现上述目的，本发明公开了TD-1修饰的脂质体载药系统的制备方法，包括以下步骤：

S1：取马钱子碱溶解在三氯甲烷中，得到浓度值为2mg/mL的马钱子碱溶液；

S2：将DSPE-PEG2000-NHS(二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇2000-琥珀酰亚胺)、TD-1溶于N-N,二甲基甲酰胺溶液中，再加入三乙胺调制pH为8.0～8.5，磁力搅拌72h后，透析3天得到DSPE-PEG-TD；

S3：将步骤S2中透析好的溶液在-80℃冻存2h，迅速将样品转移至提前预冷好的冻干机，冻干24h，短暂离心EP管后加入三氯甲烷，调整DSPE-PEG-TD浓度为4mg/mL；

S4：向DPPC(二棕榈酰磷脂酰胆碱)、胆固醇、DSPE-PEG-TD中加入三氯甲烷、甲醇以及步骤S1中的马钱子碱溶液，水浴超声5分钟，充分混匀；

S5：将步骤S4中得到的混合溶液在水浴40℃下旋转蒸发，待混合溶液蒸发至原体积的三分之一时，抽真空，形成薄膜后在40℃下水化20分钟

S6：将步骤S5中得到的水化的脂质体在探头超声仪功率为50W下超声8分钟，超声后离心10分钟，离心后弃去沉淀取上清4℃下保存，得到TD-1修饰的脂质体载药系统。

所述步骤S2中DSPE-PEG2000-NHS和TD-1的质量比为5～6：1，用N-N,二甲基甲酰胺溶液和和三乙胺溶液调pH至8.0～8.5。

所述步骤S4中DPPC、胆固醇、DSPE-PEG-TD、马钱子碱的质量比为8：2：2：1，甲醇和三氯甲烷的体积比为1：2，甲醇和三氯甲烷的总体积不超过9mL。

所述步骤S5中旋转蒸发的转速为200r/min，旋转蒸发过程中，真空泵压力≥0.5KPa。

所述步骤S5中真空抽吸在室温条件下进行，持续时间为15min。

所述步骤S5中水化用PBS中添加了0.5％的吐温80作为表面活性剂。

所述PBS的用量为1mL，吐温80的用量为5μL。

所述步骤S6中离心转速为10000r/min。

本发明还公开了一种采用上述制备方法制得的TD-1修饰的脂质体载药系统，以及这种TD-1修饰的脂质体载药系统在制备抑制三阴乳腺癌血管生成拟态药物中的应用。

本发明中使用DPPC和胆固醇制备脂质体，DPPC其属氢化磷脂类，具有性质稳定，抗氧化性强，成品稳定等特点。DPPC和胆固醇在旋转蒸发仪旋转成膜，形成脂质双层的球状结构。一层脂质的疏水性尾部和另一层脂质的疏水性尾部接触，形成疏水性内部，脂溶性药物如马钱子碱等，在合成脂质体的过程中，会包裹在脂质双分子层的脂质膜间疏水性区域(如图1所示)，亲水性药物则会包裹在脂质体的中心亲水性区域。TD-1是一个由11个氨基酸组成的能高效帮助药物透皮的短肽，其可以增加打开皮肤屏障。短肽TD-1本身是无法连接在脂质体上的，因此我们借助了DSPE-PEG2000-NHS，DSPE-PEG2000-NHS作为合成脂质体一种原料，其可以与短肽TD-1偶联，而后制成脂质体，增加脂质体透皮治疗疗效。

与现有技术比较本发明的有益效果在于：

本发明将马钱子碱作为原料，制备TD-1修饰的包载马钱子碱的脂质体载药系统，并且可以在超声条件下均匀分散于水中制得透皮治疗剂，该试剂通过透皮给药可以诱导人源性三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞死亡并抑制该肿瘤细胞的血管生成拟态信号通路，在异种移植瘤小鼠(BALB/C Nude雌性小鼠)模型中，验证了TD-1修饰的马钱子碱脂质体通过透皮给药之后可以增强治疗效果，且同时具有较低的系统毒性，能够治疗或缓解乳腺癌的血管生成拟态现象，具有较为明显的对肿瘤细胞的杀伤和抑制效果，本发明合成短肽TD-1修饰的马钱子碱脂质体，通过透皮给药，不仅增加的了马钱子碱的功效，而且降低了马钱子碱的毒性，使马钱子碱的利用价值得到提升。

附图说明

图1为本发明提出的TD-1修饰的马钱子碱脂质体(Bru-TD-Lip)合成示意图；

图2为Bru-PEG2000-Lip和Bru-TD-Lip的紫外吸收分布图；

图3分别为Bru-PEG2000-Lip和Bru-TD-Lip的冷冻电镜表征示意图；

图4为Bru-PEG2000-Lip和Bru-TD-Lip表面Zeta电位变化示意图；

图5为Bru-PEG2000-Lip和Bru-TD-Lip粒径示意图；

图6为Bru-PEG2000-Lip和Bru-TD-Lip粒径变化示意图

图7为Bru-PEG2000-Lip和Bru-TD-Lip的PDI变化示意图；

图8为Bru-PEG2000-Lip和Bru-TD-Lip包封率变化示意图；

图9为Bru-PEG2000-Lip和Bru-TD-Lip体外透皮差异示意图；

图10为钙黄绿素水溶液、钙黄绿素-Lip及钙黄绿素TD-Lip处理6小时后MDA-MB-231细胞对钙黄绿素的摄取；

图11为各组药物的对MDA-MB-231细胞活力抑制示意图；

图12为各组药物对MDA-MB-231细胞迁移影响的示意图；

图13为各组药物对肿瘤MDA-MB-231细胞侵袭影响的示意图；

图14为各组药物对肿瘤MDA-MB-231细胞血管生成拟态影响的示意图；

图15为各组药物对肿瘤MDA-MB-231细胞血管生成拟态相关蛋白影响的示意图；

图16为各组药物对肿瘤MDA-MB-231细胞细胞骨架影响的示意图；

图17为所有小鼠均被处死后剥离的肿瘤正视图；

图18为单一治疗下各组肿瘤体积变化统计图；

图19为小鼠均被处死后，对剥离的肿瘤称重对比图；

图20为单一治疗下小鼠肿瘤H&E染色结果示意图；

图21为单一治疗下小鼠肿瘤TUNEL染色结果示意图；

图22为使用H&E染色对各组小鼠的切片器官的形态示意图。

具体实施方式

以下结合附图，对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。

实施例1

一种TD-1修饰的脂质体包载马钱子碱载药系统的制备方法，具体制备方法包括以下步骤：

步骤一：取20mg的马钱子碱溶解在10mL三氯甲烷中，调整浓度值为2mg/mL；

步骤二：制备DSPE-PEG-TD：称取50mg DSPE-PEG2000-NHS、10mgTD-1溶于3mL N-N,二甲基甲酰胺溶液中，再加入一定体积的三乙胺调制pH为8.0-8.5。将该溶液转移至小玻璃瓶中，放入磁力搅拌珠，在磁力搅拌器上搅拌72h。72h小时后，将溶液转移至3.5kDa透析袋中，透析3天。

步骤三：提前称量好10个1.5mL的EP管编号并记录重量，将透析好的溶液分装至编好号的1.5mLEP管中，在-80℃冰箱中冻存2h，迅速将样品转移至提前预冷好的冻干机，冻干过夜。短暂离心EP管后称量，计算冻干材料的总重量，加入一定体积三氯甲烷，调整浓度为4mg/mL。

步骤四：称取DPPC 16mg、胆固醇4mg、DSPE-PEG-TD 4mg加入50mL圆底烧瓶中，再加入步骤一中的Brucine溶液1mL、三氯甲烷3mL、甲醇2mL，在水浴超声箱中超声5分钟，充分混匀烧瓶中的所有试剂。

步骤五；将圆底烧瓶转移至旋转蒸发仪上，水浴锅温度40℃，转速200转/分钟，待烧瓶中的有机试剂蒸发至原体积的三分之一时，开始抽真空15分钟，形成薄膜后，加入1mLPBS(含0.5％的吐温80)水化20分钟。

步骤六：水化的脂质体分装在两个1.5mL EP管中，探头超声仪功率调至50W、超声8分钟；超声后离心10分钟，转速10000转，离心后弃去沉淀取上清4℃冰箱保存。

所述Bru-TD-Lip的包封率为92.3％。

实施例2

本发明还提供了TD-1修饰的脂质体包载马钱子碱载药系统的应用，将按照实施例1中的方法制备出一种TD-1修饰的脂质体包载马钱子碱载药系统，即Bru-TD-Lip。

该载药系统的应用，包载马钱子碱的的载药系统具有通过透皮使用，在肿瘤微部位释放的马钱子碱(Brucine)药物递送系统。

TD-1修饰的脂质体包载马钱子碱载药系统在超声条件下均匀分散于水中制得透皮使用制剂，治疗或缓解某一组织或器官的肿瘤。

在对TD-1修饰的脂质体包载马钱子碱载药系统的制备过程中，制备了Bru-TD-Lip，并通过类似的方法合成了Bru-PEG2000-Lip纳米粒子，合成的条件和过程如下：

步骤一：取20mg的马钱子碱溶解在10mL三氯甲烷中，调整浓度值为2mg/mL；

步骤二：称取DPPC 16mg、胆固醇4mg、DSPE-PEG2000-NHS 4mg加入50mL圆底烧瓶中，再加入步骤一中的Brucine溶液1mL、三氯甲烷3mL、甲醇2mL，在水浴超声箱中超声5分钟，充分混匀烧瓶中的所有试剂。

步骤五；将圆底烧瓶转移至旋转蒸发仪上，水浴锅温度42℃，转速200转/分钟，待烧瓶中的有机试剂蒸发至原体积的三分之一时，开始抽真空15分钟，形成薄膜后，加入1mL含有0.5％的吐温80水水化20分钟。

步骤六：水化的脂质体分装在两个1.5mL EP管中，探头超声仪功率调至50W、超声8分钟；超声后离心10分钟，转速10000转，离心后弃去沉淀取上清4℃冰箱保存。

所述Bru-PEG2000-Lip的药物包封率约为82.5％。

Bru-TD-Lip和Bru-PEG2000-Lip纳米粒子的性能表征结果如图1～8所示，使用冷冻电镜表征了Bru-TD-Lip和Bru-PEG2000-Lip的形貌和尺寸，发现这两种纳米颗粒具有非常相似的尺寸和形状，都是均匀的球体，尺寸为100nm左右；

随后对Bru-PEG2000-Lip和Bru-TD-Lip进行Zeta电势测量，Bru-TD-Lip和Bru-PEG2000-Lip测得的表面Zeta电位平均值分别为-1.6mV和-2.1mV；

对Bru-PEG2000-Lip和Bru-TD-Li进行水合粒径(DLS)测量，Bru-PEG2000-Lip和Bru-TD-Li测得的平均粒径约为88nm和100.2nm；

对Bru-PEG2000-Lip和Bru-TD-Li进行包封率测量，Bru-PEG2000-Lip和Bru-TD-Lip测得的平均包封率为82.5％和92.3％；

从图2中可以看出,在紫外吸收光谱中，Bru-PEG2000-Lip和Bru-TD-Lip的吸收峰均位于264nm处,表明TD修饰几乎不影响马钱子碱的包裹。

从图3种可以看出，Bru-PEG2000-Lip和Bru-TD-Lip呈大小均匀的球形，且经过TD-1修饰的马钱子碱脂质体粒径稍大一些，约为100nm。

从图4、图6、图7和图8可以看出，Bru-PEG2000-Lip经TD-1修饰后，Bru-TD-Lip表面Zeta电位、平均粒径、粒径分布指数(PDI)以及药物包封率在一周内无显著变化，表明其具有良好的稳定性。

从图5可以看出，Bru-PEG2000-Lip经过TD-1修饰后，Bru-TD-Lip的粒径分布也很均匀。

Bru-PEG2000-Lip通过透皮使用抑制MDA-MB-231细胞血管生成拟态进行检测。血管生成拟态是由具有多潜能性、干细胞表型的高度恶性的肿瘤细胞所形成的管腔样结构，是实体肿瘤中独立于血管内皮细胞依赖性血管的微循环结构，然而，传统的抗肿瘤血管治疗药物只针对血管内皮细胞，容易诱发肿瘤内部的逃逸机制，使肿瘤细胞的表型发生转化。肿瘤细胞通过自身变形，在无需内皮细胞的参与下，直接形成血管生成拟态。在这种情况下，单纯抗内皮血管治疗可能无意义，应考虑联合抗血管生成拟态治疗。具体检测结果如下：

如图9，体外透皮检测结果显示，纳米材料Bru-PEG2000-Lip和Bru-TD-Lip相对比，Bru-TD-Lip的体外透皮能力明显高于Bru-PEG2000-Lip；

如图10，摄取实验结果显示，经过钙黄绿素、钙黄绿素-Lip及钙黄绿素TD-Lip处理6小时后的MDA-MB-231细胞，对脂质体的摄取效率高于钙黄绿素水溶液；

如图11，通过MTT结果得出，Bru-PEG2000-Lip和Bru-TD-Lip对MDA-MB-231细胞的抑制效率优于马钱子碱裸药，增强了细胞的死亡率。

如图12，迁移实验结果显示，Bru-PEG2000-Lip和Bru-TD-Lip对MDA-MB-23可以明显抑制MDA-MB-231细胞的迁移能力，进而减弱该细胞的血管生成拟态能力；

如图13，侵袭实验结果显示，Bru-PEG2000-Lip和Bru-TD-Lip对MDA-MB-23可以明显抑制MDA-MB-231细胞的迁移能力；

如图14、15，通过基质胶上血管生成拟态能力及蛋白质印迹实验(Westernblot)结果得出，Bru-PEG2000-Lip和Bru-TD-Lip可以显著抑制,DA-MB-231细胞在基质胶上的血管生成拟态，并可以抑制血管生成拟态相关蛋白的表达水平；以上实验重复三次以上，统计结果n＝3,其中*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

如图16，通过细胞骨架荧光染色结果显示，Bru-PEG2000-Lip和Bru-TD-Lip可以显著破坏MDA-MB-231细胞的骨架结构，进而抑制血管生成拟态的发生发展。

综上所述，Bru-PEG2000-Lip和Bru-TD-Lip能够明显抑制MDA-MB-231细胞的血管生成拟态能力，进而达到抗肿瘤的效果，而且Bru-PEG2000-Lip和Bru-TD-Lip抑制MDA-MB-231细胞活力效果最好。Bru-PEG2000-Lip和Bru-TD-Lip通过透皮使用抑制肿瘤的血管生成拟态，克服乳腺癌肿瘤细胞的耐药性。

建立MDA-MB-231细胞异种移植瘤小鼠(BALB/C Nude雌性小鼠)，以评估纳米材料Bru-TD-Lip的体内抗肿瘤作用以及与舒尼替尼的协同抗肿瘤能力，研究了小鼠的肿瘤体积，肿瘤重量。

如图17～20所示，分别使用PBS、Bru-DMSO(Oral)、Bru-DMS0(Transdermal)、Bru-PEG2000-Lip、Bru-TD-Lip、舒尼替尼(Sunitinib)+PBS和Sunitinib+Bru-TD-Lip进行对比检测，其中Sunitinib选用合适使用的低剂量，结果显示，相对于单一治疗，Sunitinib+Bru-TD-Lip的组合使小鼠肿瘤体积显著抑制。

如图21所示，对处理后的小鼠肿瘤进行对比检测，其中图21中小鼠肿瘤TUNEL染色结果，荧光越强说明肿瘤细胞凋亡越多，结果显示，Bru-TD-Lip和Sunitinib+Bru-TD-Lip的组合处理肿瘤组织内细胞凋亡最多；肿瘤组织的H&E染色结果也说明Bru-TD-Lip和Sunitinib+Bru-TD-Lip的组合处理组肿瘤坏死最严重。

以上这些结果表明，本发明制备得到Bru-TD-Lip具有抗肿瘤作用，且与Sunitinib联用有更强的抗肿瘤作用，克服乳腺癌肿瘤细胞的耐药性。

如图22所示，为了比较研究的不同组的系统毒性，进行了组织学评估，对各组小鼠的主要器官进行H&E染色，由图可见，所有组的主要器官(心脏，肝脏、脾脏、肺及肾脏)的细胞完整性和组织形态变化均可以忽略不计；结果表明，本发明制备的Bru-TD-Lip具有显着增强的抗肿瘤作用，并无明显系统毒性；

以上所述仅为本发明的较佳实施例，对本发明而言仅仅是说明性的，而非限制性的。本专业技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效，但都将落入本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种TD-1修饰的脂质体载药系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：取马钱子碱溶解在三氯甲烷中，得到浓度值为2mg/mL的马钱子碱溶液；

S2：将DSPE-PEG2000-NHS、TD-1溶于N-N,二甲基甲酰胺溶液中，再加入三乙胺调制pH为8.0～8.5，磁力搅拌72h后，透析3天得到DSPE-PEG-TD；

S3：将步骤S2中透析好的溶液在-80℃冻存2h，迅速将样品转移至提前预冷好的冻干机，冻干24h，短暂离心后加入三氯甲烷，调整DSPE-PEG-TD的浓度为4mg/mL；

S4：向DPPC、胆固醇、DSPE-PEG-TD中加入三氯甲烷、甲醇以及步骤S1中的马钱子碱溶液，水浴超声5分钟，充分混匀；

S5：将步骤S4中得到的混合溶液在水浴40℃下旋转蒸发，待混合溶液蒸发至原体积的三分之一时，抽真空，形成薄膜后在40℃下水化20分钟；

S6：将步骤S5中得到的水化的脂质体在探头超声仪功率为50W下超声8分钟，超声后离心10分钟，离心后弃去沉淀取上清4℃下保存，得到TD-1修饰的脂质体载药系统。

2.如权利要求1所述的一种TD-1修饰的脂质体载药系统的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中DSPE-PEG2000-NHS和TD-1的质量比为5～6：1，用N-N,二甲基甲酰胺溶液和和三乙胺溶液调pH至8.0～8.5。

3.如权利要求1所述的一种TD-1修饰的脂质体载药系统的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中DPPC、胆固醇、DSPE-PEG-TD、马钱子碱的质量比为8：2：2：1，甲醇和三氯甲烷的体积比为1：2，甲醇和三氯甲烷的总体积不超过9mL。

4.如权利要求1所述的一种TD-1修饰的脂质体载药系统的制备方法，其特征在于，所述步骤S5中旋转蒸发的转速为200r/min，旋转蒸发过程中，真空泵压力≥0.5KPa。

5.如权利要求1所述的一种TD-1修饰的脂质体载药系统的制备方法，其特征在于，所述步骤S5中真空抽吸在室温条件下进行，持续时间为15min。

6.如权利要求1所述的一种TD-1修饰的脂质体载药系统的制备方法，其特征在于，所述步骤S5中水化用PBS中添加了0.5％的吐温80作为表面活性剂。

7.如权利要求1所述的一种TD-1修饰的脂质体载药系统的制备方法，其特征在于，所述PBS的用量为1mL，吐温80的用量为5μL。

8.如权利要求1所述的一种TD-1修饰的脂质体载药系统的制备方法，其特征在于，所述步骤S6中离心转速为10000r/min。

9.一种采用如权利要求1～8任一项所述的制备方法制得的TD-1修饰的脂质体载药系统。

10.一种如权利要求9所述的TD-1修饰的脂质体载药系统在制备抑制三阴乳腺癌血管生成拟态药物中的应用。

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