JP2015522563A - Ｈｂｖ感染及び関連疾患を処置するためのポリペプチド及び抗体 - Google Patents

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Abstract

本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス感染を処置するためのエピトープペプチド（又はその突然変異体）、そのようなエピトープペプチド（又はその突然変異体）と担体タンパク質とを含む組換えタンパク質、並びにそのようなエピトープペプチド（又はその突然変異体）及び組換えタンパク質の使用に関する。本発明はまた、そのようなエピトープペプチドに対する抗体、前記抗体を生成する細胞系、及びその使用にも関する。さらに、本発明は、それぞれ、本発明における組換えタンパク質又は抗体を含む、Ｂ型肝炎ウイルス感染と関連する１つ又は複数の症状を処置又は軽減するためのワクチン又は医薬組成物に関する。

Description

本発明は、分子ウイルス学及び免疫学の分野、特に、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染の処置に関する分野に関する。特に、本発明は、ＨＢＶ感染を処置するためのエピトープペプチド（又はその突然変異体）、前記エピトープペプチド（又はその突然変異体）と担体タンパク質とを含む組換えタンパク質、並びに前記エピトープペプチド（又はその突然変異体）及び前記組換えタンパク質の使用に関する。本発明はまた、前記エピトープペプチドに対する抗体、前記抗体を生成するための細胞系、及びその使用にも関する。本発明はまた、それぞれ、組換えタンパク質又は抗体を含む、ＨＢＶ感染と関連する１つ又は複数の症状を処置又は軽減するためのワクチン又は医薬組成物にも関する。
ＨＢＶ感染、特に、慢性ＨＢＶ感染は、全世界で最も重要な公衆衛生問題の１つである（Ｄｉｅｎｓｔａｇ ＪＬ．「Ｂ型肝炎ウイルス感染（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）」、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００８年１０月２日；３５９（１４）：１４８６〜１５００頁）。慢性ＨＢＶ感染は、慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）、肝硬変（ＬＣ）及び肝細胞がん（ＨＣＣ）などの一連の肝疾患を引き起こし得る（Ｌｉａｗ ＹＦ， Ｃｈｕ ＣＭ． 「Ｂ型肝炎ウイルス感染（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）」、Ｌａｎｃｅｔ ２００９年２月１４日；３７３（９６６３）：５８２〜５９２頁）。現在全世界で、ＨＢＶに感染した人は約２０億人おり、慢性ＨＢＶに感染した人は約３億５０００万人いると報告されている。これらの感染者のうち、ＨＢＶ感染と関連する肝疾患で最終的に死亡する危険性は、最大１５％〜２５％に達し、全世界で毎年、１００万人を超える人々がこれらの疾患で死亡する（Ｄｉｅｎｓｔａｇ ＪＬ．，上掲を参照；及びＬｉａｗ ＹＦら、上掲を参照）。
慢性ＨＢＶ感染のための治療剤は現在、主にインターフェロン（ＩＦＮ）と、ヌクレオシド又はヌクレオチド類似体（ＮＡ）に分けることができる（Ｄｉｅｎｓｔａｇ ＪＬ．，上掲を参照；Ｋｗｏｎ Ｈ， Ｌｏｋ ＡＳ．「Ｂ型肝炎の治療（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｔｈｅｒａｐｙ）」、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ ２０１１年５月；８（５）：２７５〜２８４頁；及びＬｉａｗ ＹＦら、上掲を参照）。前者は、一般的なインターフェロン（ＩＦＮ）及びＰｅｇ−インターフェロン（Ｐｅｇ−ＩＦＮ）を含み、これらは主に患者において全体の免疫能力を増強することによってＨＢＶを阻害し、ＣＨＢを処置する効果を達成する；後者は主に、ラミブジン（ＬＭＶ）、アデフォビルジピボキシル（ＡＤＶ）、エンテカビル（ＥＴＶ）、テルビブジン（ＬｄＴ）及びテノフォビルを含み、これらは主にＨＢＶのポリメラーゼ活性を直接阻害することによってＨＢＶ複製を阻害する。ＨＢＶ感染者（例えば、ＣＨＢ患者）について、前記薬剤は単独で、又は組合せで、ｉｎ ｖｉｖｏでウイルス複製を既に効率的に阻害し、ＨＢＶ ＤＮＡレベルを大きく低下させた；特に、５２週以上にわたるそのような処置の後、ＨＢＶ ＤＮＡレベルが患者における検出限界（ウイルス学的応答）よりも低い応答率は、４０〜８０％に達した（Ｋｗｏｎ Ｈら、上掲を参照）。しかしながら、前記薬剤のみ、又は前記薬剤の組合せを用いる処置は、感染者におけるＨＢＶウイルスを完全に消失させることはできず、ＨＢｓＡｇ又はＨＢｓＡｇ血清変換の陰性変換率の応答率（患者におけるＨＢＶウイルスの完全な消失を示すマーカー）は、一般的には５％より低い（Ｋｗｏｎ Ｈら、上掲を参照）。従って、ＨＢＶウイルスをより効率的に消失させる、特に、ＨＢＶ感染患者のＨＢｓＡｇを消失させることができる新規治療方法及び薬剤を開発することが緊急に必要である。
免疫学的手段に基づいて慢性ＨＢＶ感染を処置するための新規薬剤を開発することは、本分野における重要な研究方針の１つである。慢性ＨＢＶ感染の免疫療法は一般に、２つの様式、すなわち、受動免疫療法（抗体などの形態の医薬品に対応する）及び能動免疫療法（ワクチンなどの形態の医薬品に対応する）で実施される。受動免疫療法（例として抗体を用いる）とは、ＨＢＶ感染患者に治療抗体を投与し、抗体を介するウイルス中和に基づいてナイーブな肝細胞のＨＢＶ感染を防止するか、又は抗体を介する免疫クリアランスに基づいてｉｎ ｖｉｖｏでウイルス及び感染した肝細胞を消失させ、それによって、治療効果を達成する方法を指す。現在、Ｂ型肝炎ワクチンで免疫された応答者又はＨＢＶ感染の回復者の血清／血漿から得られる抗ＨＢｓポリクローナル抗体、すなわち、高力価Ｂ型肝炎免疫グロブリン（ＨＢＩＧ）が、ＨＢＶの母子垂直感染の遮断、慢性ＨＢＶ感染患者の肝臓移植後のＨＢＶ再感染の防止、及びＨＢＶに偶然曝露された人々の感染の防止に広く適用されている。しかしながら、ＨＢＶ感染患者（例えば、ＣＨＢ患者）へのＨＢＩＧの直接投与に関する療法は有意な治療効果を有さず、ＨＢＩＧは高力価血漿の相対的に少ない供給源、高いコスト、不安定な性質、及び潜在的な安全性の問題などの多くの態様において限定される。能動免疫療法とは、治療ワクチン（タンパク質ワクチン、ポリペプチドワクチン、核酸ワクチンなどを含む）を投与し、慢性ＨＢＶ感染生物を刺激して、ＨＢＶに対する細胞性免疫応答（ＣＴＬ効果など）及び／又は体液性免疫応答（抗体など）を上昇させることによって、ＨＢＶを阻害するか、又は消失させる目的を達成する方法を指す。現在のところ、慢性ＨＢＶ感染の処置にとって明確に有効であり、有用である能動免疫療法のための薬剤／ワクチンは未だ存在しない。
従って、ＨＢＶ感染患者のためにＨＢＶ感染をより有効に処置することができる新規治療方法及び薬剤を開発することが緊急に必要である。
ＨＢＶウイルスの様々なタンパク質に対する複数のＢ細胞応答（抗体応答）エピトープが存在するが、任意のエピトープに対する抗体は、ＨＢＶ感染の処置において必ずしも有用であるとは限らない。従って、ＨＢＶ感染の処置において有効な免疫療法剤／方法を開発する鍵は、ｉｎ ｖｉｖｏでのウイルス及びウイルスにより感染した細胞の有効な消失を誘導することができる標的（エピトープ）の同定並びに標的（エピトープ）に対する抗体の取得にある。
本発明は、そのような標的（エピトープ）を同定し、従って、ＨＢＶ感染の処置において有用なエピトープペプチド（又はその突然変異体）、前記エピトープペプチド（又はその突然変異体）と担体タンパク質とを含む組換えタンパク質、並びに前記エピトープペプチド（又はその突然変異体）及び組換えタンパク質の使用を提供する。本発明はまた、そのようなエピトープペプチド／エピトープに対する抗体、前記抗体を生成する細胞系、及びその使用も提供する。本発明はまた、それぞれ、本発明による組換えタンパク質又は抗体を含む、ＨＢＶ感染と関連する１つ又は複数の症状を処置又は緩和するのに有用なワクチン又は医薬組成物も提供する。
本発明において、別途特定しない限り、本明細書で用いられる科学的及び技術的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。さらに、本明細書で用いられる細胞培養、分子遺伝学、核酸化学及び免疫学の実験操作は、対応する分野において広く用いられる日常的な操作である。それと同時に、本発明をより良く理解するために、関連する用語の定義及び説明を以下のように提供する。
本明細書で用いられる用語「ＨＢｓＡｇ」とは、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の表面抗原タンパク質を指し、当業者には周知である（例えば、ＮＣＢＩ ＧＥＮＢＡＮＫデータベース受託番号：ＡＡＦ２４７２９．１を参照されたい）。
本明細書で用いられるように、ＨＢｓＡｇのアミノ酸配列に言及する場合、それは配列番号３９に記載の配列によって記載される。例えば、「ＨＢｓＡｇの位置１１９から１２５のアミノ酸残基」という表現は、配列番号３９に記載のポリペプチドの位置１１９から１２５のアミノ酸残基を指す。しかしながら、当業者であれば、突然変異又は変化（限定されるものではないが、置換、欠失及び／又は付加、例えば、異なる遺伝子型又は異なる遺伝子サブタイプのＨＢｓＡｇを含む）が、その生物学的特性に影響することなく、ＨＢｓＡｇのアミノ酸配列中で自然に生じるか、又はそれらに人工的に導入することができることを理解する。従って、本発明において、用語「ＨＢｓＡｇ」は、例えば、配列番号３９に記載のポリペプチド及びその天然又は人工の突然変異体を含む、全てのそのようなポリペプチドを含むことを意図する。さらに、ＨＢｓＡｇの配列断片が記載される場合、それらは配列番号３９の配列断片だけでなく、その天然又は人工の突然変異体の対応する配列断片も含む。例えば、「ＨＢｓＡｇの位置１１９から１２５のアミノ酸残基」という表現は、配列番号３９の位置１１９から１２５のアミノ酸残基及びその突然変異体（天然又は人工の突然変異体）の対応する断片を含む。本発明によれば、「対応する配列断片」又は「対応する断片」という表現は、配列を最適化されたアラインメントにかけた場合、すなわち、配列を整列させて最も高い割合の同一性を得た場合、配列の同等の位置に位置する断片を指す。
本明細書で用いられる場合、用語「ＨＢｃＡｇ」とは、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のコア抗原タンパク質を指し、当業者には周知である（例えば、ＮＣＢＩ ＧＥＮＢＡＮＫデータベース受託番号：ＡＡＯ６３５１７．１を参照されたい）。
本明細書で用いられるように、ＨＢｃＡｇのアミノ酸配列に言及する場合、それは配列番号４０に記載の配列によって記載される。例えば、「ＨＢｃＡｇの位置７９から８１のアミノ酸残基」という表現は、配列番号４０に記載のポリペプチドの位置７９から８１のアミノ酸残基を指す。しかしながら、当業者であれば、突然変異又は変化（限定されるものではないが、置換、欠失及び／又は付加、例えば、異なる遺伝子型又は異なる遺伝子サブタイプのＨＢｃＡｇを含む）が、その生物学的特性に影響することなく、ＨＢｃＡｇのアミノ酸配列中で自然に生じるか、又はそれらに人工的に導入することができることを理解する。従って、本発明において、用語「ＨＢｃＡｇ」は、例えば、配列番号４０に記載のポリペプチド及びその天然又は人工の突然変異体を含む、全てのそのようなポリペプチドを含むことを意図する。さらに、ＨＢｃＡｇの配列断片が記載される場合、それらは配列番号４０の配列断片だけでなく、その天然又は人工の突然変異体の対応する配列断片も含む。例えば、「ＨＢｃＡｇの位置７９から８１のアミノ酸残基」という表現は、配列番号４０の位置７９から８１のアミノ酸残基及びその突然変異体（天然又は人工の突然変異体）の対応する断片を含む。本発明によれば、「対応する配列断片」又は「対応する断片」という表現は、配列を最適化されたアラインメントにかけた場合、すなわち、配列を整列させて最も高い割合の同一性を得た場合、配列の同等の位置に位置する断片を指す。
本明細書で用いられる用語「ＷＨｃＡｇ」とは、ウッドチャック肝炎ウイルスコア抗原を指し、これは当業者には周知である（例えば、ＮＣＢＩ ＧＥＮＢＡＮＫデータベース受託番号：ＡＤＥ１９０１８．１を参照されたい）。
本明細書で用いられるように、ＷＨｃＡｇのアミノ酸配列に言及する場合、それは配列番号４１に記載の配列によって記載される。例えば、「ＷＨｃＡｇの位置７９から８１のアミノ酸残基」という表現は、配列番号４１に記載のポリペプチドの位置７９から８１のアミノ酸残基を指す。しかしながら、当業者であれば、突然変異又は変化（限定されるものではないが、置換、欠失及び／又は付加、例えば、異なる遺伝子型又は異なる遺伝子サブタイプのＷＨＢｃＡｇを含む）が、その生物学的特性に影響することなく、ＷＨｃＡｇのアミノ酸配列中で自然に生じるか、又はそれらに人工的に導入することができることを理解する。従って、本発明において、用語「ＷＨｃＡｇ」は、例えば、配列番号４１に記載のポリペプチド及びその天然又は人工の突然変異体を含む、全てのそのようなポリペプチドを含むことを意図する。さらに、ＷＨｃＡｇの配列断片が記載される場合、それらは配列番号４１の配列断片だけでなく、その天然又は人工の突然変異体の対応する配列断片も含む。例えば、「ＷＨｃＡｇの位置７９から８１のアミノ酸残基」という表現は、配列番号４１の位置７９から８１のアミノ酸残基及びその突然変異体（天然又は人工の突然変異体）の対応する断片を含む。本発明によれば、「対応する配列断片」又は「対応する断片」という表現は、配列を最適化されたアラインメントにかけた場合、すなわち、配列を整列させて最も高い割合の同一性を得た場合、配列の同等の位置に位置する断片を指す。
本明細書で用いられる用語「ＣＲＭ１９７（交叉反応物質１９７）」とは、ＧｌｙからＧｌｕに変化した位置５２のアミノ酸残基が野生型ジフテリア毒素と異なるジフテリア毒素（ＤＴ）の非毒性突然変異体を指す（Ｇ．Ｇｉａｎｎｉｎｉ、Ｒ．Ｒａｐｐｕｏｌｉ、Ｇ．Ｒａｔｔｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９８４、１２：４０６３〜４０７０頁）。ジフテリア毒素は、当業者には周知であり（例えば、Ｃｈｏｅ Ｓ、Ｂｅｎｎｅｔｔ Ｍ、Ｆｕｊｉｉ Ｇら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９２、３５７：２１６〜２２２頁を参照されたい）、そのアミノ酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋデータベース受託番号ＡＡＶ７０４８６．１を参照することにより見出すことができる。
本明細書で用いられるように、ＣＲＭ１９７のアミノ酸配列に言及する場合、それは配列番号４２に記載の配列によって記載される。例えば、「ＣＲＭ１９７の位置１から１９０のアミノ酸残基」という表現は、配列番号４２に記載のポリペプチドの位置１から１９０のアミノ酸残基を指す。しかしながら、当業者であれば、突然変異又は変化（限定されるものではないが、置換、欠失及び／又は付加を含む）が、ＣＲＭ１９７生物学的特性に影響することなく、配列番号４２中で自然に生じるか、又はそれらに人工的に導入することができることを理解する。従って、本発明において、用語「ＣＲＭ１９７」は、例えば、配列番号４２に記載のポリペプチド及びその天然又は人工の突然変異体を含む、全てのそのようなポリペプチドを含むことを意図する。さらに、ＣＲＭ１９７の配列断片が記載される場合、それらは配列番号４２の配列断片だけでなく、その天然又は人工の突然変異体の対応する配列断片も含む。例えば、「ＣＲＭ１９７の位置１から１９０のアミノ酸残基」という表現は、配列番号４２の位置１から１９０のアミノ酸残基及びその突然変異体（天然又は人工の突然変異体）の対応する断片を含む。本発明によれば、「対応する配列断片」又は「対応する断片」という表現は、配列を最適化されたアラインメントにかけた場合、すなわち、配列を整列させて最も高い割合の同一性を得た場合、配列の同等の位置に位置する断片を指す。
本明細書で用いられる用語「抗体」は一般に、２対のポリペプチド鎖（それぞれ軽鎖（Ｌ）及び重鎖（Ｈ）を有する）からなる免疫グロブリン分子を指す。抗体の軽鎖は、κ及びλ軽鎖に分類することができる。重鎖は、μ、δ、γ、α及びεに分類することができ、それぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥとして抗体のアイソタイプを規定する。軽鎖及び重鎖において、可変領域は約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域を介して定常領域に連結し、重鎖は約３個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域をさらに含む。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）からなる。重鎖定常領域は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）からなる。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。軽鎖定常領域は、ドメインＣＬからなる。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの宿主組織又は因子、例えば、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）への結合を媒介することができる。また、ＶＨ及びＶＬ領域を、相対的に保存的な領域（フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる）により間を空けられた、超可変領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる）に分けることもできる。ＶＨ及びＶＬはそれぞれ、Ｎ末端からＣ末端に向かって以下の順序で３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなる：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。それぞれの重鎖／軽鎖対の可変領域（ＶＨ及びＶＬ）は、それぞれ、抗原結合部位を形成する。様々な領域又はドメイン中でのアミノ酸の分布は、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ． （１９８７及び１９９１））、又はＣｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７頁；Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８〜８８３頁の定義に従う。用語「抗体」は、抗体を生成するための任意の特定の方法によって制限されない。例えば、抗体は、特に、組換え抗体、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を含む。抗体は、異なる抗体アイソタイプのもの、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭ抗体であってもよい。
本明細書で用いられる用語「抗原結合断片」とは、完全長抗体が特異的に結合し、且つ／又は同抗原への結合に関して完全長抗体と競合する抗原に特異的に結合する能力を保持する、完全長抗体の断片を含むポリペプチドを指し、「抗原結合部分」としても知られる。一般に、あらゆる目的で参照により本明細書に組込まれるＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．（編）、第２版、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）を参照されたい。抗体の抗原結合断片を、組換えＤＮＡ技術により、又は無傷の抗体の酵素的若しくは化学的切断により生成することができる。いくつかの条件下では、抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ並びに相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、ダイアボディ及びポリペプチドに対する特異的抗原結合能力を付与するのに十分な抗体の少なくとも一部を含むそのようなポリペプチドを含む。
本明細書で用いられる用語「Ｆｄ断片」とは、ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなる抗体断片を指す；用語「Ｆｖ断片」とは、単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなる抗体断片を指す；用語「ｄＡｂ断片」とは、ＶＨドメインからなる抗体断片を指す（Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４〜５４６頁（１９８９））；用語「Ｆａｂ断片」とは、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる抗体断片を指す；用語「Ｆ（ａｂ’）２断片」とは、ヒンジ領域上のジスルフィド架橋（単数又は複数）により互いに連結した２つのＦａｂ断片を含む抗体断片を指す。
いくつかの条件下では、抗体の抗原結合断片は一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）であり、ここでＶＬ及びＶＨドメインは対形成して、リンカーを介して一価分子を形成し、単一ポリペプチド鎖を生成させることができる（例えば、Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３〜４２６頁（１９８８）及びＨｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９〜５８８３頁（１９８８）を参照されたい）。そのようなｓｃＦｖ分子は、一般的に共通の構造：ＮＨ２−ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＯＯＨ又はＮＨ２−ＶＨ−リンカー−ＶＬ−ＣＯＯＨを有する。先行技術における好適なリンカーは、反復的ＧＧＧＧＳアミノ酸配列又はそのバリアントからなる。例えば、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）４を有するリンカーを用いることができ、またそのバリアントを用いることもできる（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら（１９９３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４〜６４４８頁）。本発明において用いることができる他のリンカーは、Ａｌｆｔｈａｎら（１９９５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ８：７２５〜７３１頁、Ｃｈｏｉら（２００１）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：９４〜１０６頁、Ｈｕら（１９９６）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３０５５〜３０６１頁、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら（１９９９）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：４１〜５６頁及びＲｏｏｖｅｒｓら（２００１）、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．により記載されている。
いくつかの条件下では、抗体の抗原結合断片は、ＶＨ及びＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上で発現されるダイアボディ、すなわち、二価抗体であってもよいが、しかしながら、用いられるリンカーは、同じ鎖上の２つのドメインの対形成を可能にするには短すぎ、これらのドメインは２つの抗原結合部位を生成するためには別の鎖上の相補的ドメインと対形成されなければならない（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：６４４４〜６４４８頁（１９９３）、及びＰｏｌｊａｋ Ｒ．Ｊ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１〜１１２３頁（１９９４）を参照されたい）。
抗体の抗原結合断片（例えば、上記の抗体断片）を、当業者には公知の従来の技術（例えば、組換えＤＮＡ技術又は酵素的若しくは化学的切断方法）により所与の抗体（例えば、本発明で提供されるモノクローナル抗体Ｅ６Ｆ６）から取得することができ、無傷の抗体をスクリーニングするのと同じ様式で特異性についてスクリーニングすることができる。
本発明において、明確に特定しない限り、用語「抗体」に言及する場合、それは無傷の抗体だけでなく、抗体の抗原結合断片も含む。
本明細書で用いられる用語「ＭＡｂ」及び「モノクローナル抗体」とは、高度に均一な抗体分子の集団、すなわち、自然発生的に生じ得る自然突然変異を除いて完全に同一の抗体分子の集団に由来する抗体又は抗体の断片を指す。モノクローナル抗体は、抗原の単一のエピトープに対する高い特異性を有する。ポリクローナル抗体は、モノクローナル抗体と比較して、一般的には抗原上の異なるエピトープを一般に認識する少なくとも２つ以上の異なる抗体を含む。モノクローナル抗体は、一般的には、Ｋｏｈｌｅｒらによって初めて報告されたハイブリドーマ技術（Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５、１９７５）により得られ、組換えＤＮＡ技術（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）によっても得ることができる。
本明細書で用いられる場合、その番号と共に言及されるモノクローナル抗体は、同じ番号を有するハイブリドーマから得られるモノクローナル抗体と同一である。例えば、モノクローナル抗体ＨＢｓ−Ｅ６Ｆ６（略してＥ６Ｆ６）、ＨＢｓ−Ｅ７Ｇ１１（略してＥ７Ｇ１１）、ＨＢｓ−Ｇ１２Ｆ５（略してＧ１２Ｆ５）及びＨＢｓ−Ｅ１３Ｃ５（略してＥ１３Ｃ５）は、それぞれ、ハイブリドーマ細胞系ＨＢｓ−Ｅ６Ｆ６（略してＥ６Ｆ６）又はそのサブクローン若しくは子孫細胞、ＨＢｓ−Ｅ７Ｇ１１（略してＥ７Ｇ１１）又はそのサブクローン若しくは子孫細胞、ＨＢｓ−Ｇ１２Ｆ５（略してＧ１２Ｆ５）又はそのサブクローン若しくは子孫細胞、及びＨＢｓ−Ｅ１３Ｃ５（略してＥ１３Ｃ５）又はそのサブクローン若しくは子孫細胞から得られる抗体と同一である。
本明細書で用いられる用語「キメラ抗体」とは、抗体が対象の抗原に結合する活性を依然として保持するという条件で、その軽鎖及び／又は重鎖の一部がある抗体（特定の種を起源とするか、又は特異的抗体の型若しくはサブタイプに属する）に由来し、その軽鎖及び／又は重鎖の他の部分が別の抗体（同一若しくは異なる種を起源とするか、又は同一若しくは異なる抗体の型若しくはサブタイプに属する）に由来する、そのような抗体を指す（Ｃａｂｉｌｌｙらの米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１〜６８５５頁（１９８４））。
本明細書で用いられる用語「ヒト化抗体」とは、ヒト免疫グロブリン（受容体抗体）の全てのＣＤＲ領域又はＣＤＲ領域の一部が、非ヒト抗体（供与体抗体）のＣＤＲ領域と置き換えられた抗体又は抗体断片を指し、供与体抗体は、予想された特異性、親和性又は反応性を有する非ヒト（例えば、マウス、ラット又はウサギ）抗体であってもよい。さらに、受容体抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）のいくつかのアミノ酸を、非ヒト抗体の対応するアミノ酸残基、又は別の抗体のアミノ酸残基により置き換えて、抗体の特性をさらに改善又は最適化することもできる。ヒト化抗体に関するより詳細な内容については、例えば、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２〜５２５頁（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３〜３２９頁（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３〜５９６頁（１９９２）；及びＣｌａｒｋ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ２１：３９７〜４０２頁（２０００）を参照されたい。
本明細書で用いられる用語「中和抗体」とは、対象のウイルスのビルレンス（例えば、細胞に感染する能力）を除去するか、又は有意に低下させる抗体又は抗体断片を指す。
本明細書で用いられる用語「エピトープ」とは、免疫グロブリン又は抗体が特異的に結合する抗原上の一部を指す。「エピトープ」は、「抗原決定基」としても知られる。エピトープ又は抗原決定基は一般に、アミノ酸、炭水化物又は糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、一般的には特定の三次元構造及び特定の電荷特性を有する。例えば、エピトープは、一般的には、「線状」又は「立体配座」であってもよいユニークな立体配座にある少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個の連続的又は非連続的アミノ酸を含む。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇ．Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ（編）（１９９６）を参照されたい。線状エピトープにおいては、タンパク質と相互作用分子（例えば、抗体）との全ての相互作用部位は、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って線状に存在する。立体配座エピトープにおいては、相互作用部位は、タンパク質中で互いに離れたアミノ酸残基にわたって広がる。
本明細書で用いられる用語「エピトープペプチド」とは、エピトープとして作用する抗原上のペプチド断片を指す。いくつかの条件下では、エピトープペプチドは単独で、エピトープに対する抗体によって特異的に認識／結合され得る。いくつかの他の条件下では、エピトープペプチドを担体タンパク質に融合して、エピトープが抗体により特異的に認識されるのを容易にしなければならない。本明細書で用いられる用語「担体タンパク質」とは、エピトープペプチドの担体として作用することができるそのようなタンパク質を指す、すなわち、エピトープペプチドが提示され、かくして、抗体又は免疫系により認識され得るように、エピトープペプチドを特定の位置（例えば、タンパク質の内部、Ｎ末端又はＣ末端）でタンパク質中に挿入することができる。そのような担体タンパク質は当業者には周知であり、例えば、ＨＰＶ Ｌ１タンパク質（エピトープペプチドを、タンパク質の位置１３０から１３１のアミノ酸又は位置４２６から４２７のアミノ酸の間に挿入することができる、Ｓｌｕｐｅｔｚｋｙ，Ｋ．ら、「キャプシド表面ループ上に外来エピトープを発現するキメラパピローマウイルス様粒子（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａ ｆｏｒｅｉｇｎ ｅｐｉｔｏｐｅ ｏｎ ｃａｐｓｉｄ ｓｕｒｆａｃｅ ｌｏｏｐｓ）」［Ｊ］．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ，２００１，８２：２７９９〜２８０４頁；Ｖａｒｓａｎｉ，Ａ．ら、「ＨＰＶ−６及びＨＰＶ−１６のＬ２マイナーキャプシドタンパク質のための共通の中和エピトープを提示するキメラヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ−１６）Ｌ１粒子（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １６ （ＨＰＶ−１６） Ｌ１ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｍｍｏｎ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｅｐｉｔｏｐｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｌ２ ｍｉｎｏｒ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ＨＰＶ−６ ａｎｄ ＨＰＶ−１６）」［Ｊ］．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２００３，７７：８３８６〜８３９３頁を参照されたい）、ＨＢＶコア抗原（タンパク質の位置７９から８１のアミノ酸をエピトープペプチドと置き換えることができる、Ｋｏｌｅｔｚｋｉ，Ｄ．ら、「ＨＢＶコア粒子は、プーマラハンタウイルスヌクレオキャプシドタンパク質の潜在的保護領域全体の挿入及び表面露出を可能にする（ＨＢＶ ｃｏｒｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｌｌｏｗ ｔｈｅ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｕｒｆａｃｅ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｔｉｒｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ Ｐｕｕｍａｌａ ｈａｎｔａｖｉｒｕｓ ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）」［Ｊ］．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９９９，３８０：３２５〜３３３頁を参照されたい）、ウッドチャック肝炎ウイルスコアタンパク質（タンパク質の位置７９から８１のアミノ酸をエピトープペプチドと置き換えることができる、Ｓａｂｉｎｅ Ｋｏｎｉｇ、Ｇｅｒｔｒｕｄ Ｂｅｔｅｒａｍｓ及びＭｉｃｈａｅｌ Ｎａｓｓａｌ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９８、７２（６）：４９９７頁を参照されたい）、及びＣＲＭ１９７タンパク質（エピトープペプチドを、タンパク質又はその断片のＮ末端又はＣ末端に連結することができる）が挙げられる。場合により、それぞれ、リンカー（例えば、剛性又は可撓性リンカー）を、エピトープペプチドと担体タンパク質との間で使用して、その折畳みを促進することができる。
当業者には公知の従来技術により、同じエピトープへの結合の競合性に応じて抗体をスクリーニングすることができる。例えば、競合又は交叉競合に関する試験を行って、抗原（例えば、ＨＢｓＡｇタンパク質）への結合に関して互いに競合又は交叉競合する抗体を取得することができる。その交叉競合に基づくものである、同じエピトープに結合する抗体を取得するための高効率の方法は、国際特許出願ＷＯ０３／４８７３１に記載されている。従って、ＨＢｓＡｇタンパク質上の同じエピトープへの結合について本発明によるモノクローナル抗体（例えば、モノクローナル抗体Ｅ６Ｆ６）と競合する、抗体及びその抗原結合断片（すなわち、抗原結合部分）を、当業者には公知の従来技術により取得することができる。
本明細書で用いられる用語「単離された」とは、人工的手段によって天然状態から得られた状態を指す。ある特定の「単離された」物質又は成分が天然に存在する場合、その天然環境が変化するか、若しくはその物質が天然環境から単離されるか、又はその両方のため、それが可能である。例えば、ある特定の単離されていないポリヌクレオチド又はポリペプチドはある特定の生きている動物体に天然に存在し、そのような天然状態から単離された高純度の同ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、単離されたポリヌクレオチド又はポリペプチドと呼ばれる。用語「単離された」は、混合された人工又は合成物質も、単離された物質の活性に影響しない他の不純物質も含まない。
本明細書で用いられる用語「大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現系」とは、大腸菌（株）及びベクターからなる発現系を指し、大腸菌（株）は、限定されるものではないが、ＧＩ６９８、ＥＲ２５６６、ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｂ８３４（ＤＥ３）、及びＢＬＲ（ＤＥ３）などの市販の株に由来する。
本明細書で用いられる用語「ベクター」とは、ポリヌクレオチドが挿入されていてもよい核酸ビヒクルを指す。ベクターが、挿入されたポリヌクレオチドによりコードされたタンパク質の発現を可能にする場合、そのベクターは発現ベクターと呼ばれる。ベクターは、宿主細胞中への形質転換、形質導入、又はトランスフェクションにより宿主細胞中で発現される担持された遺伝物質エレメントを有してもよい。限定されるものではないが、プラスミド、ファージ、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）又はＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体、λファージ又はＭ１３ファージなどのファージ及び動物ウイルスなどのベクターが当業者には周知である。ベクターとして用いることができる動物ウイルスとしては、限定されるものではないが、レトロウイルス（レンチウイルスなど）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルスなど）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス（ＳＶ４０など）が挙げられる。ベクターは、限定されるものではないが、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択エレメント及びリポーター遺伝子などの、発現を制御するための複数のエレメントを含んでもよい。さらに、ベクターは、複製起点を含んでもよい。
本明細書で用いられる用語「宿主細胞」とは、限定されるものではないが、大腸菌若しくはバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの原核細胞、及び酵母細胞若しくはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）などの真菌細胞、Ｓ２ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞若しくはＳｆ９などの昆虫細胞、又は線維芽細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞若しくはヒト細胞などの動物細胞などの、ベクターを導入することができる細胞を指す。
本明細書で用いられる用語「同一性」とは、２つのポリペプチド間又は２つの核酸間の一致度を指す。比較のための２つの配列がある特定の部位で同じ塩基又はアミノ酸モノマーサブユニットを有する（例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれがある特定の部位にアデニンを有するか、又は２つのポリペプチドのそれぞれがある特定の部位にリシンを有する）場合、２つの分子はその部位で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、比較のための全部位数にわたって２つの配列により共有される同一の部位の数×１００の関数である。例えば、２つの配列の１０の部位のうちの６が一致する場合、これらの２つの配列は６０％の同一性を有する。例えば、ＤＮＡ配列：ＣＴＧＡＣＴ及びＣＡＧＧＴＴは５０％の同一性を共有する（６の部位のうちの３が一致する）。一般に、２つの配列の比較は、最大の同一性をもたらす様式で行われる。そのようなアラインメントを、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３〜４５３、１９７０）の方法に基づくＡｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）などのコンピュータプログラムを用いることにより行うことができる。２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントを、ＰＡＭ１２０重み残基表（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、ギャップ長ペナルティ１２及びギャップペナルティ４を用いて、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組込まれたＥ．Ｍｅｙｅｒｓ及びＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１〜１７頁（１９８８））のアルゴリズムを用いて決定することができる。さらに、２つのアミノ酸配列間の同一性のパーセンテージを、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、及びギャップ重量１６、１４、１２、１０、８、６、又は４及び長さ重量１、２、３、４、５又は６を用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）中のＧＡＰプログラムに組込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４〜４５３（１９７０））のアルゴリズムにより決定することができる。
本明細書で用いられる用語「保存的置換」とは、アミノ酸配列を含むタンパク質／ポリペプチドの本質的な特性に不利に影響しないか、又はそれを変化させないアミノ酸置換を指す。例えば、部位特異的突然変異誘発及びＰＣＲ媒介性突然変異誘発などの当業界で公知の標準的な技術により、保存的置換を導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、類似する側鎖を有する別のアミノ酸残基、例えば、対応するアミノ酸残基と物理的又は機能的に類似する（例えば、類似するサイズ、形状、電荷、共有結合又は水素結合を形成する能力などの化学的特性などを有する）残基で置換された置換を含む。類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当業界で定義されている。これらのファミリーとしては、アルカリ性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン及びヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β−分枝側鎖を有するアミノ酸（トレオニン、バリン、イソロイシンなど）及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。従って、好ましくは、対応するアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーに由来する別のアミノ酸残基と置換される。アミノ酸保存的置換を同定するための方法は、当業界で周知である（例えば、参照により本明細書に組込まれるＢｒｕｍｍｅｌｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：１１８０〜１１８７頁（１９９３）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１２（１０）：８７９〜８８４頁（１９９９）；及びＢｕｒｋｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｅｔ ＵＳＡ ９４：４１２〜４１７頁（１９９７）を参照されたい）。
本明細書で用いられる用語「免疫原性」とは、生物において特異的抗体又は感作されたリンパ球の形成を刺激する能力を指す。それは活性化、増殖及び分化するように特定の免疫細胞を刺激して、抗体及び感作されたリンパ球などの免疫エフェクター物質を最終的に発生させる抗原の特性を指すだけでなく、抗体又は感作されたＴリンパ球を、抗原で生物を刺激した後に生物の免疫系において形成することができる特異的免疫応答も指す。免疫原性は抗体における最も重要な特性である。抗原が宿主において免疫応答の発生を上手く誘導することができるかどうかは、抗原の特性、宿主の反応性、及び免疫化の手段の３つの因子に依存する。
本明細書で用いられる用語「特異的に結合する」とは、それが指令する抗体と抗原との反応などの、無作為でない様式での２つの分子の結合を指す。いくつかの実施形態においては、抗原に特異的に結合する抗体（又は抗原に対して特異的な抗体）は、約１０−５Ｍ未満、例えば、約１０−６Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満若しくは１０−１０Ｍ未満又はそれ以下の親和性（ＫＤ）で抗原に結合する抗体を指す。
本明細書で用いられる用語「ＫＤ」とは、抗体の抗原への結合親和性を記述するのに用いられる、特異的抗体−抗原相互作用の解離定数を指す。一般に、抗体（例えば、本発明によるモノクローナル抗体Ｅ６Ｆ６）は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥデバイス中で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定された場合、約１０−５Ｍ未満、例えば、約１０−６Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満若しくは１０−１０Ｍ未満又はそれ以下のＫＤで抗原（例えば、ＨＢｓＡｇ）に結合する。
本明細書で用いられる用語「モノクローナル抗体」と用語「ＭＡｂ」は、同じ意味を有し、互換的に用いられる；用語「ポリクローナル抗体」と用語「ＰＡｂ」は同じ意味を有し、互換的に用いられる；用語「ポリペプチド」と「タンパク質」は同じ意味を有し、互換的に用いられる；さらに、本発明において、アミノ酸は一文字コード又は三文字コードにより表される。例えば、アラニンは、Ａ又はＡｌａで表すことができる。
本明細書で用いられる用語「ハイブリドーマ」と用語「ハイブリドーマ細胞系」は互換的に用いることができる。用語「ハイブリドーマ」と用語「ハイブリドーマ細胞系」に言及する場合、それらはハイブリドーマのサブクローン及び子孫細胞も含む。例えば、ハイブリドーマ細胞系Ｅ６Ｆ６に言及する場合、それはハイブリドーマ細胞系Ｅ６Ｆ６のサブクローン及び子孫細胞も指す。
本明細書で用いられる用語「薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤」とは、当業界で周知である、対象及び活性薬剤と薬理学的及び／又は生理学的に適合する担体及び／又は賦形剤を指し（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｅｎｎａｒｏ ＡＲ（編）、第１９版、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９５を参照されたい）、限定されるものではないが、ｐＨ調整剤、界面活性剤、アジュバント及びイオン強度増強剤が挙げられる。例えば、ｐＨ調整剤としては、限定されるものではないが、リン酸バッファーが挙げられる；界面活性剤としては、限定されるものではないが、カチオン性、アニオン性、又は非イオン性界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ−８０が挙げられる；イオン強度増強剤としては、限定されるものではないが、塩化ナトリウムが挙げられる。
本明細書で用いられる用語「アジュバント」とは、それが生物に抗原と一緒に送達された場合、又は前もって生物に送達された場合、抗原に対する免疫応答を増強するか、又は生物における免疫応答の型を変化させることができる非特異的免疫増強剤を指す。限定されるものではないが、アルミニウムアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、Ｆｒｅｕｎｄのアジュバント（例えば、Ｆｒｅｕｎｄの完全アジュバント及びＦｒｅｕｎｄの不完全アジュバント）、コリネバクテリウム・パルヴム（Ｃｏｒｙｎｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）、リポ多糖、サイトカインなどの様々なアジュバントが存在する。Ｆｒｅｕｎｄのアジュバントは、現在動物実験において最も一般的に用いられるアジュバントである。水酸化アルミニウムアジュバントは、臨床試験においてより一般的に用いられている。
本明細書で用いられる用語「タンパク質ワクチン」とは、場合によりアジュバントを含む、ポリペプチドに基づくワクチンを指す。ワクチン中のポリペプチドを、遺伝子工学技術により、又は化学合成の方法により取得することができる。本明細書で用いられる用語「核酸ワクチン」とは、場合によりアジュバントを含む、ＤＮＡ又はＲＮＡに基づくワクチン（プラスミド、例えば、発現プラスミドなど）を指す。
本明細書で用いられる用語「有効量」とは、期待される効果を達成するか、又は少なくとも部分的に達成するのに十分なものである量を指す。例えば、疾患（ＨＢＶ感染又はＨＢＶ感染と関連する疾患など）を防止するために有効な量とは、疾患（ＨＢＶ感染又はＨＢＶ感染と関連する疾患など）の発生を防止する、抑制する、又は遅延させるために有効な量を指す。疾患を処置するための有効量とは、疾患及びその疾患を有する患者におけるその合併症を治癒させるか、又は少なくとも部分的に遮断するために有効な量を指す。そのような有効量の決定は、当業者の能力の範囲内にある。例えば、治療的使用のために有効な量は、処置される疾患の重篤度、患者における免疫系の一般的状態、年齢、体重及び性別などの患者の一般的状態、薬物の投与手段、同時に用いられるさらなる療法などに依存する。
本明細書で用いられる場合、本発明によるエピトープペプチドの生物学的機能としては、限定されるものではないが、
１）抗体Ｅ６Ｆ６、Ｅ７Ｇ１１、Ｇ１２Ｆ５又はＥ１３Ｃ５への特異的結合；
２）対象におけるＨＢＶ ＤＮＡ及び／又はＨＢｓＡｇの血清レベルを低下させる能力（場合により、エピトープペプチドを担体タンパク質に融合した後）；
３）ｉｎ ｖｉｖｏでＨＢＶ及びＨＢＶ感染細胞の効率的な消失の抗体応答を誘導する能力（場合により、エピトープペプチドを担体タンパク質に融合した後）；並びに
４）対象におけるＨＢＶ感染又はＨＢＶ感染と関連する疾患（例えば、Ｂ型肝炎）を処置する能力（場合により、エピトープペプチドを担体タンパク質に融合した後）
のうちの１つ又は複数が挙げられる。
従って、一態様において、本発明は、ＨＢｓＡｇの位置１１９〜１２５のアミノ酸残基からなる単離されたエピトープペプチド、又はその突然変異体を提供し、この突然変異体は１個又は数個（例えば、１、２、３又は４個）のアミノ酸残基の保存的置換によってのみエピトープペプチドと異なり、エピトープペプチドの生物学的機能を保持する。１つの好ましい実施形態においては、ＨＢｓＡｇタンパク質の位置１１９〜１２５のアミノ酸残基は、配列番号１に示される。１つの好ましい実施形態においては、突然変異体のアミノ酸配列は、配列番号２に示される。
別の態様において、本発明は、ＨＢｓＡｇタンパク質の位置１１３〜１３５のアミノ酸残基からなる単離されたエピトープペプチド、又はその突然変異体を提供し、この突然変異体は１個又は数個（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８又は９個）のアミノ酸残基の保存的置換によってのみエピトープペプチドと異なり、エピトープペプチドの生物学的機能を保持する。１つの好ましい実施形態においては、ＨＢｓＡｇタンパク質の位置１１３〜１３５のアミノ酸残基は、配列番号６に示される。
別の態様において、本発明は、ＨＢｓＡｇタンパク質の４〜３８個の連続するアミノ酸残基からなり、ＨＢｓＡｇタンパク質の位置１２１〜１２４のアミノ酸残基を含む単離されたエピトープペプチド、又はその突然変異体を提供し、この突然変異体は１個又は数個（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８又は９個）のアミノ酸残基の保存的置換によってのみエピトープペプチドと異なり、エピトープペプチドの生物学的機能を保持する。１つの好ましい実施形態においては、ＨＢｓＡｇタンパク質の位置１２１〜１２４のアミノ酸残基は、配列番号１０に示される。
１つの好ましい実施形態においては、本発明によるエピトープペプチドは、ＨＢｓＡｇタンパク質の３８個以下、例えば、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５又は４個の連続するアミノ酸残基からなる。例えば、本発明によるエピトープペプチド又はその突然変異体は、配列番号１〜７及び１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
特に、エピトープペプチド又はその突然変異体が生物中の免疫系によって認識され、ｉｎ ｖｉｖｏでウイルス及びウイルス感染細胞の効率的な消失の抗体応答を誘導するように、本発明によるエピトープペプチド又はその突然変異体を担体タンパク質に融合して、エピトープペプチド又はその突然変異体の免疫原性を増強することができる。
従って、一態様において、本発明は、本発明による単離されたエピトープペプチド又はその突然変異体と、担体タンパク質とを含む組換えタンパク質であって、天然に存在するタンパク質又はその断片ではない上記組換えタンパク質も提供する。組換えタンパク質中で、エピトープペプチド又はその突然変異体を、用いられる担体タンパク質に応じて、担体タンパク質のＮ末端若しくはＣ末端に連結し、担体タンパク質中に挿入し、又は担体タンパク質のアミノ酸配列の一部を置き換えるために用いることができる。さらに、場合により、エピトープペプチド又はその突然変異体を、リンカー（剛性又は可撓性リンカー、例えば、（ＧＧＧＧＳ）３）を介して担体タンパク質に連結することができる。本発明の組換えタンパク質を、任意の方法によって、例えば、遺伝子工学的方法（組換え技術）によって、又は化学合成の方法によって生成することができる。
１つの好ましい実施形態においては、前記担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７タンパク質又はその断片、ＨＢｃＡｇ及びＷＨｃＡｇからなる群から選択される。
１つの好ましい実施形態においては、担体タンパク質はＣＲＭ１９７タンパク質又はその断片であり、本発明によるエピトープペプチド又はその突然変異体は、場合によりリンカーを介して、ＣＲＭ１９７タンパク質又はその断片のＮ末端又はＣ末端に連結している。１つの好ましい実施形態においては、ＣＲＭ１９７タンパク質の断片は、ＣＲＭ１９７のａａ１〜１９０（ａａはアミノ酸を表す；ａａがｎの前に置かれる場合、それは位置ｎでのアミノ酸を示す（例えば、ａａ１〜１９０は、位置１〜１９０のアミノ酸を表す）；ａａがｎの後に置かれる場合、それはポリペプチドがｎ個のアミノ酸の長さを有することを示す（以下同じ））を含む、例えば、ＣＲＭ１９７のａａ１〜３８９を含む。別の好ましい実施形態においては、ＣＲＭ１９７タンパク質の断片は、ＣＲＭ１９７のａａ１〜１９０又はａａ１〜３８９からなる（それぞれ、本発明においてはＣＲＭ Ａ 及びＣＲＭ３８９と命名される）。
１つの好ましい実施形態においては、リンカーのアミノ酸配列は、配列番号４６に記載される。１つの好ましい実施形態においては、本発明による組換えタンパク質は、配列番号７４〜９７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
１つの好ましい実施形態においては、担体タンパク質はＨＢｃＡｇ又はその断片であり、ＨＢｃＡｇの位置７９〜８１のアミノ酸は本発明によるエピトープペプチドと置き換えられる。１つの好ましい実施形態においては、エピトープペプチドは、リンカーを介してＨＢｃＡｇ又はその断片に連結している。１つの好ましい実施形態においては、ＨＢｃＡｇの断片は、ＨＢｃＡｇのａａ１〜１４９を含むか、又はそれからなる。１つの好ましい実施形態においては、本発明による組換えタンパク質は、配列番号４７〜５３、５６及び５８〜６５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
１つの好ましい実施形態においては、担体タンパク質はＷＨｃＡｇ又はその断片であり、ＷＨｃＡｇの位置７９〜８１のアミノ酸は本発明によるエピトープペプチドと置き換えられる。１つの好ましい実施形態においては、エピトープペプチドは、リンカーを介してＷＨｃＡｇ又はその断片に連結している。１つの好ましい実施形態においては、ＷＨｃＡｇの断片は、ＷＨｃＡｇのａａ１〜１４９を含むか、又はそれからなる。１つの好ましい実施形態においては、本発明による組換えタンパク質は、配列番号６６〜７３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
別の態様において、本発明は、本発明によるエピトープペプチド若しくはその突然変異体又は本発明による組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子も提供する。別の態様において、本発明は、前記単離された核酸分子を含むベクターも提供する。本発明によるベクターは、クローニングベクター、又は発現ベクターであってもよい。１つの好ましい実施形態においては、本発明によるベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ファージなどであってもよい。１つの好ましい実施形態においては、ベクターは、対象（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）において、本発明によるエピトープペプチド若しくはその突然変異体又は本発明による組換えタンパク質を発現することができる。
別の態様において、本発明は、本発明による単離された核酸分子又はベクターを含む宿主細胞も提供する。そのような宿主細胞としては、限定されるものではないが、大腸菌細胞などの原核細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞及び動物細胞（哺乳動物細胞、例えば、マウス細胞、ヒト細胞など）などの真核細胞が挙げられる。本発明による細胞は、２９３Ｔ細胞などの細胞系であってもよい。
別の態様において、本発明は、好適な条件下で本発明による宿主細胞を培養することと、細胞培養物から本発明による組換えタンパク質を回収することとを含む、本発明による組換えタンパク質を調製するための方法も提供する。
別の態様において、本発明は、本発明によるエピトープペプチド（若しくはその突然変異体）又は本発明による組換えタンパク質と、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤（例えば、アジュバント）とを含むタンパク質ワクチンを提供する。１つの好ましい実施形態においては、タンパク質ワクチンは、本発明による１つ又は複数のエピトープペプチドを含み、前記エピトープペプチドは分離又は直列していてもよく、改変されていても又は改変されていなくてもよく、別のタンパク質にカップリングされていても、又はそうでなくてもよい。
別の態様において、本発明は、対象におけるＨＢＶ感染又はＨＢＶ感染と関連する疾患（例えば、Ｂ型肝炎）を処置するための方法であって、治療有効量の本発明によるエピトープペプチド（若しくはその突然変異体）、組換えタンパク質又はタンパク質ワクチンを、それを必要とする対象に投与することを含む上記方法を提供する。
別の態様において、本発明は、対象におけるＨＢＶ感染又はＨＢＶ感染と関連する疾患（例えば、Ｂ型肝炎）を処置するためのタンパク質ワクチンの製造における、本発明によるエピトープペプチド（若しくはその突然変異体）又は組換えタンパク質の使用を提供する。
別の態様において、本発明は、対象におけるＨＢＶ感染又はＨＢＶ感染と関連する疾患（例えば、Ｂ型肝炎）を処置するための本発明によるエピトープペプチド（若しくはその突然変異体）又は組換えタンパク質を提供する。
別の態様において、本発明は、本発明による単離された核酸分子又はベクターと、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤（例えば、アジュバント）とを含む遺伝子ワクチンを提供する。１つの好ましい実施形態においては、遺伝子ワクチンは、ＤＮＡ又はＲＮＡを含む。そのような実施形態においては、ＤＮＡ又はＲＮＡは裸であってもよく、又は送達及び／若しくは保護機能を有する外殻中に封入されていてもよい。１つのさらなる好ましい実施形態においては、外殻は、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルスなどの外殻であってもよく、又は化学的方法により合成され、類似する機能を発揮することができる別の材料であってもよい。
別の態様において、本発明は、対象におけるＨＢＶ感染又はＨＢＶ感染と関連する疾患（例えば、Ｂ型肝炎）を処置するための方法であって、治療有効量の本発明による遺伝子ワクチン又は単離された核酸分子若しくはベクターを、それを必要とする対象に投与することを含む上記方法を提供する。
別の態様において、本発明は、対象におけるＨＢＶ感染又はＨＢＶ感染と関連する疾患（例えば、Ｂ型肝炎）を処置するための遺伝子ワクチンの製造における、本発明による単離された核酸分子又はベクターの使用を提供する。
別の態様において、本発明は、対象におけるＨＢＶ感染又はＨＢＶ感染と関連する疾患（例えば、Ｂ型肝炎）を処置するための本発明による単離された核酸分子又はベクターを提供する。
別の態様において、本発明は、本発明によるエピトープペプチド（若しくはその突然変異体）、組換えタンパク質、単離された核酸分子、又はベクターと、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤（例えば、アジュバント）とを含む医薬組成物を提供する。１つの好ましい実施形態においては、医薬組成物は、本発明による１つ又は複数のエピトープペプチドを含み、エピトープペプチドは分離又は直列していてもよく、改変されていても又は改変されていなくてもよく、別のタンパク質にカップリングされていても、又はそうでなくてもよい。
別の態様において、本発明は、対象におけるＨＢＶ ＤＮＡ及び／又はＨＢｓＡｇの血清レベルを低下させるための方法であって、有効量の本発明による医薬組成物、エピトープペプチド（若しくはその突然変異体）、組換えタンパク質、単離された核酸分子、又はベクターを、それを必要とする対象に投与することを含む上記方法を提供する。
別の態様において、本発明は、対象におけるＨＢＶ ＤＮＡ及び／又はＨＢｓＡｇの血清レベルを低下させるための医薬組成物の製造における、本発明によるエピトープペプチド（若しくはその突然変異体）、組換えタンパク質、単離された核酸分子、又はベクターの使用を提供する。
別の態様において、本発明は、対象におけるＨＢＶ ＤＮＡ及び／又はＨＢｓＡｇの血清レベルを低下させるための、本発明によるエピトープペプチド（若しくはその突然変異体）、組換えタンパク質、単離された核酸分子、又はベクターを提供する。
一態様において、本発明は、モノクローナル抗体が本発明によるエピトープペプチドに特異的に結合することができる、モノクローナル抗体及びその抗原結合断片を提供する。
１つの好ましい実施形態においては、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、相補性決定領域断片、一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、マウス抗体、ウサギ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、キメラ抗体（例えば、ヒトマウスキメラ抗体）、又は二重特異性若しくは多重特異性抗体からなる群から選択される。
１つの好ましい実施形態においては、モノクローナル抗体は、約１０−５Ｍ未満、例えば、約１０−６Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満若しくは１０−１０Ｍ未満、又はそれ以下のＫＤで本発明によるエピトープペプチド又はＨＢｓＡｇタンパク質に結合する。
１つの好ましい実施形態においては、モノクローナル抗体は非ＣＤＲ領域を含み、非ＣＤＲ領域はマウス種以外の種由来であり、例えば、ヒト抗体由来である。
１つの好ましい実施形態においては、モノクローナル抗体は、対象におけるＨＢＶ ＤＮＡ及び／又はＨＢｓＡｇの血清レベルを低下させることができる。
１つの好ましい実施形態においては、モノクローナル抗体は、以下のモノクローナル抗体に由来するか、又はそれから選択される：
１）Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ）に、ＣＣＴＣＣ寄託番号Ｃ２０１２７０で寄託されているハイブリドーマ細胞系ＨＢｓ−Ｅ６Ｆ６により生成されるモノクローナル抗体；
２）Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ）に、ＣＣＴＣＣ寄託番号Ｃ２０１２７１で寄託されているハイブリドーマ細胞系ＨＢｓ−Ｅ７Ｇ１１により生成されるモノクローナル抗体；
３）Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ）に、ＣＣＴＣＣ寄託番号Ｃ２０１２７２で寄託されているハイブリドーマ細胞系ＨＢｓ−Ｇ１２Ｆ５により生成されるモノクローナル抗体；及び
４）Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ）に、ＣＣＴＣＣ寄託番号Ｃ２０１２７３で寄託されているハイブリドーマ細胞系ＨＢｓ−Ｅ１３Ｃ５により生成されるモノクローナル抗体。
別の態様において、本発明は、本発明によるエピトープペプチド又はＨＢｓＡｇタンパク質の、ハイブリドーマ細胞系ＨＢｓ−Ｅ６Ｆ６、ＨＢｓ−Ｅ７Ｇ１１、ＨＢｓ−Ｇ１２Ｆ５又はＨＢｓ−Ｅ１３Ｃ５により生成される抗体への結合を、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％又は好ましくは少なくとも９９％遮断することができる、モノクローナル抗体及びその抗原結合断片を提供し、ハイブリドーマ細胞系ＨＢｓ−Ｅ６Ｆ６、ＨＢｓ−Ｅ７Ｇ１１、ＨＢｓ−Ｇ１２Ｆ５又はＨＢｓ−Ｅ１３Ｃ５は、それぞれ、Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ）に、ＣＣＴＣＣ寄託番号Ｃ２０１２７０、Ｃ２０１２７１、Ｃ２０１２７２、Ｃ２０１２７３で寄託されている。
そのようなモノクローナル抗体により認識されるエピトープは、そのようなモノクローナル抗体が、モノクローナル抗体Ｅ６Ｆ６、Ｅ７Ｇ１１、Ｇ１２Ｆ５又はＥ１３Ｃ５の、本発明によるエピトープペプチド又はＨＢｓＡｇタンパク質への結合を少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％又は好ましくは少なくとも９９％低下させることができるように、モノクローナル抗体Ｅ６Ｆ６、Ｅ７Ｇ１１、Ｇ１２Ｆ５又はＥ１３Ｃ５により認識されるエピトープと同一であるか、又はそれと空間的に重複する。
試験されるモノクローナル抗体が、ＨＢｓＡｇタンパク質への既知のモノクローナル抗体の結合を低下させる能力を、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｈａｒｌｏｗ及びＤａｖｉｄ Ｌａｎｅ（編）（１９８８）に記載の方法などの従来の方法によって決定することができる。１つの例示的方法は、マイクロウェルプレートに抗原を予め被覆し、試験される未標識抗体の希釈系列を、所与の濃度の既知の標識されたモノクローナル抗体と一緒に、予め被覆されたマイクロウェルプレートに添加し、インキュベーションを行った後、洗浄後に、試験される示差的に希釈された抗体の存在下でプレートに結合した既知の抗体の数を決定することを含む。試験される抗体が、既知の抗体が結合する抗原への結合について既知の抗体と競合する能力が強くなるほど、既知の抗体が抗原に結合する能力は弱くなり、プレートに結合する既知の抗体は少なくなる。一般に、抗原は９６穴マイクロウェルプレート上に被覆され、試験されるモノクローナル抗体を、放射標識法又は酵素標識法により既知の標識されたモノクローナル抗体を遮断するその能力について試験することができる。
モノクローナル抗体を、Ｋｏｈｌｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５））によって報告されたハイブリドーマを調製するための方法により調製することができる。第１に、マウス又は他の好適な宿主動物を、免疫原（必要に応じて、アジュバントを添加する）の注入により免疫する。免疫原又はアジュバントの注入手段は一般に、皮下多点注射又は腹腔内注入である。いくつかの既知のタンパク質（例えば、血清アルブミン）への免疫原の予備コンジュゲーションは、宿主における抗原の免疫原性を促進することができる。アジュバントは、Ｆｒｅｕｎｄのアジュバント又はＭＰＬ−ＴＤＭなどであってもよい。動物の免疫化後、免疫原に特異的に結合する抗体を分泌するリンパ球が動物中で生成される。対象のリンパ球を採取し、好適な融合剤（ＰＥＧなど）を用いてミエローマ細胞に融合し、それによって、ハイブリドーマ細胞を得る（Ｇｏｄｉｎｇ、「モノクローナル抗体：原理と実践（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」、５９〜１０３頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９６）。
上記のように調製されたハイブリドーマ細胞を好適な培養培地に播種し、培地中で増殖させるが、その培養培地は融合しなかった親ミエローマ細胞の増殖を阻害することができる１つ又は複数の物質を含む。例えば、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）が欠損した親ミエローマ細胞の場合、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖は、培養培地へのヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミンなどの物質の添加（ＨＡＴ培養培地）により阻害される。
好ましいミエローマ細胞は、高い融合率を有し、抗体を分泌する安定的な能力を有し、ＨＡＴ培養培地に対して感受性であるべきなどである。ミエローマ細胞の第１選択は、ＭＯＰ−２１及びＭＣ−１１マウス腫瘍由来細胞系（ＴＨＥ Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．ＵＳＡ）、及びＳＰ−２／０又はＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞系（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．ＵＳＡ）などの、マウスミエローマである。さらに、ヒトミエローマ及びヒト−マウス異種ミエローマ細胞系を用いて、ヒトモノクローナル抗体を調製することができる（Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３：３００１頁（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、「モノクローナル抗体の生成技術及び適用（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、５１〜６３頁、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７）。
ハイブリドーマ細胞を増殖させるための培養培地を用いて、特異的抗原に対するモノクローナル抗体の生成を検出する。以下の方法を用いて、ハイブリドーマ細胞中で生成されるモノクローナル抗体の結合特異性を決定することができる：免疫沈降又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などのｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイ。例えば、Ｍｕｎｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２２０（１９８０）に記載されたＳｃａｔｃｈａｒｄアッセイを用いて、モノクローナル抗体の親和性を決定することができる。
ハイブリドーマ中で生成された抗体の特異性、親和性及び反応性を決定した後、対象の細胞系を、Ｇｏｄｉｎｇ、「モノクローナル抗体：原理と実践（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」、５９〜１０３頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９６に記載の限界希釈法によりサブクローニングすることができる。好適な培養培地は、ＤＭＥＭ又はＲＰＭＩ−１６４０などであってもよい。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物体における腹水腫瘍の形態で増殖することができる。
プロテインＡアガロースゲル、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析及びアフィニティクロマトグラフィーなどの免疫グロブリンを精製するための伝統的な方法を用いることにより、サブクローン細胞により分泌されたモノクローナル抗体を細胞培養物、腹水又は血清から単離することができる。
モノクローナル抗体を、遺伝子工学組換え技術により取得することができる。ＭＡｂ重鎖及び軽鎖遺伝子に特異的に結合する核酸プライマーをＰＣＲ増幅にかけることによって、ハイブリドーマ細胞からＭＡｂ重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡ分子を単離する。得られたＤＮＡ分子を発現ベクターに挿入し、宿主細胞（例えば、大腸菌細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、又は免疫グロブリンを生成しない他のミエローマ細胞）にそれらをトランスフェクトし、好適な条件下で培養して、組換え発現により対象の抗体を取得する。
本発明はまた、本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片をコードする、単離された核酸分子も提供する。そのような核酸分子をハイブリドーマ細胞から単離するか、又は遺伝子工学組換え技術若しくは化学合成法により取得することができる。
一態様において、本発明は、本発明によるモノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子を提供する。
別の態様において、本発明は、本発明によるモノクローナル抗体の軽鎖可変領域をコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子を提供する。
別の態様においては、本発明は、本発明による単離された核酸分子を含むベクターを提供する。本発明によるベクターは、クローニングベクター、又は発現ベクターであってもよい。
１つの好ましい実施形態においては、本発明によるベクターは、プラスミド、コスミド、ファージなどである。
別の態様において、本発明は、本発明による単離された核酸分子又はベクターを含む宿主細胞も提供する。そのような宿主細胞としては、限定されるものではないが、大腸菌細胞などの原核細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞及び動物細胞（哺乳動物細胞、例えば、マウス細胞、ヒト細胞など）などの真核細胞が挙げられる。本発明による細胞は、２９３Ｔ細胞などの細胞系であってもよい。
別の態様において、本発明は、好適な条件下で本発明による宿主細胞を培養し、細胞培養物から本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を回収することを含む、本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を調製するための方法も提供する。
別の態様において、本発明は、
１）Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ）に、ＣＣＴＣＣ寄託番号Ｃ２０１２７０で寄託されているハイブリドーマ細胞系ＨＢｓ−Ｅ６Ｆ６；
２）Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ）に、ＣＣＴＣＣ寄託番号Ｃ２０１２７１で寄託されているハイブリドーマ細胞系ＨＢｓ−Ｅ７Ｇ１１；
３）Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ）に、ＣＣＴＣＣ寄託番号Ｃ２０１２７２で寄託されているハイブリドーマ細胞系ＨＢｓ−Ｇ１２Ｆ５；及び
４）Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ）に、ＣＣＴＣＣ寄託番号Ｃ２０１２７３で寄託されているハイブリドーマ細胞系ＨＢｓ−Ｅ１３Ｃ５
から選択されるハイブリドーマ細胞系を提供する。
様々な抗体に含まれる重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖可変領域ＣＤＲ及び軽鎖可変領域ＣＤＲのアミノ酸配列及び／又はヌクレオチド配列を、従来の方法によりモノクローナル抗体Ｅ６Ｆ６、Ｅ７Ｇ１１、Ｇ１２Ｆ５及びＥ１３Ｃ５から決定することができる。
別の態様において、本発明は、本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含むキットを提供する。１つの好ましい実施形態においては、本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片はまた、検出可能なマーカーを含んでもよい。１つの好ましい実施形態においては、キットは、本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片に特異的に結合する第２の抗体をさらに含む。好ましくは、第２の抗体は、検出可能なマーカーをさらに含む。そのような検出可能なマーカーは、当業者には周知であり、限定されるものではないが、放射性同位体、蛍光物質、発光物質、発色物質及び酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）などが挙げられる。
別の態様において、本発明は、試料中のＨＢｓＡｇタンパク質の存在又はレベルを検出するための方法であって、本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を用いることを含む上記方法を提供する。１つの好ましい実施形態においては、本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、検出可能なマーカーをさらに含む。別の好ましい実施形態においては、前記方法は、本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を検出するための検出可能なマーカーを担持する第２の抗体を用いることをさらに含む。前記方法を、診断目的で、又は非診断目的で用いることができる（例えば、前記試料は、患者由来試料よりもむしろ、細胞試料である）。
別の態様において、本発明は、対象がＨＢＶに感染しているかどうかを診断するための方法であって、対象に由来する試料中のＨＢｓＡｇタンパク質の存在を検出するために本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を用いることを含む上記方法を提供する。１つの好ましい実施形態においては、本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片はまた、検出可能なマーカーを含んでもよい。別の好ましい実施形態においては、前記方法は、本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を検出するための検出可能なマーカーを担持する第２の抗体を用いることをさらに含む。
別の態様において、本発明は、試料中のＨＢｓＡｇの存在若しくはレベルを検出するため、又は対象がＨＢＶに感染しているかどうかを診断するためのキットの製造における、本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片の使用を提供する。
別の態様において、本発明は、本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片と、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
別の態様において、本発明は、対象におけるＨＢＶ感染又はＨＢＶ感染と関連する疾患（例えば、Ｂ型肝炎）を防止又は処置するための方法であって、予防又は治療有効量の本発明によるモノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片又は本発明による医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む上記方法を提供する。
別の態様において、本発明は、対象におけるＨＢＶ感染又はＨＢＶ感染と関連する疾患（例えば、Ｂ型肝炎）を防止又は処置するための医薬組成物の製造における、本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片の使用を提供する。
別の態様において、本発明は、対象におけるＨＢＶ感染又はＨＢＶ感染と関連する疾患（例えば、Ｂ型肝炎）を防止又は処置するための本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を提供する。
別の態様において、本発明は、対象におけるＨＢＶ ＤＮＡ及び／又はＨＢｓＡｇの血清レベルを低下させるための方法であって、有効量の本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を、それを必要とする対象に投与することを含む上記方法を提供する。別の態様において、本発明は、対象におけるＨＢＶ ＤＮＡ及び／又はＨＢｓＡｇの血清レベルを低下させるための医薬品の製造における、本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片の使用を提供する。
本発明で提供されるワクチン（タンパク質ワクチン及び遺伝子ワクチン）、医薬品及び医薬組成物を単独で、若しくは組み合わせて用いるか、又は別の薬学的活性剤（例えば、インターフェロン又はＰＥＧ化インターフェロンなどのインターフェロン剤）と組み合わせて用いることができる。
先行技術と比較した場合、本発明によるエピトープペプチド及びエピトープペプチドを含む組換えタンパク質は、有意な利点を有する。特に、本発明によるエピトープペプチド及び組換えタンパク質は、ＨＢＶ及びＨＢＶ感染細胞の効率的な消失に関して抗体応答を誘導することができ、それによって、対象におけるＨＢＶ ＤＮＡ及び／又はＨＢｓＡｇの血清レベルを低下させることができ、対象におけるＨＢＶ感染又はＨＢＶ感染と関連する疾患（例えば、Ｂ型肝炎）の処置において有用であってもよい。
さらに、本発明はまた、本発明によるエピトープペプチドを特異的に認識し、且つ／又はこれに結合することができるモノクローナル抗体及びその抗原結合断片も提供する。そのようなモノクローナル抗体及びその抗原結合断片は、対象におけるＨＢＶ ＤＮＡ及び／又はＨＢｓＡｇの血清レベルを低下させることができ、ｉｎ ｖｉｖｏでＨＢＶ及びＨＢＶ感染細胞を効率的に消失させることができ、従って、対象におけるＨＢＶ感染又はＨＢＶ感染と関連する疾患（例えば、Ｂ型肝炎）を処置するのに有用である。
本発明によるエピトープペプチドはまた、エピトープペプチドに対するモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体が対象（例えば、ＨＢＶトランスジェニックマウス）におけるＨＢｓＡｇレベル及びＨＢＶ ＤＮＡレベルを有意に低下させ、他のエピトープに対する抗体と比較してより長期間にわたって療法の有効性を保持することができるという利点も有する。本発明によるエピトープペプチドはまた、それを活性成分として含むワクチンによる対象（例えば、ＨＢＶトランスジェニックマウス）の免疫化時に、ＨＢｓＡｇレベル及びＨＢＶ ＤＮＡレベルを対象において長時間にわたって低下させることができるという利点も有する。
本発明の実施形態は、図面及び実施例を参照して詳細に説明される。しかしながら、当業者であれば、以下の図面及び実施例が、本発明の範囲を規定するというよりもむしろ、本発明を例示することを意図するに過ぎないことを理解できる。以下の図面及び好ましい実施形態の詳細な説明によれば、本発明の様々な目的及び利点は、当業者にとって明らかである。
ＨＢＶトランスジェニックマウスの処置における様々なマウスモノクローナル抗体の有効性の評価を示す図である。 ＨＢＶトランスジェニックマウスの処置におけるＨＢｓ−Ｅ６Ｆ６、ＨＢｓ−Ｅ７Ｇ１１、ＨＢｓ−Ｇ１２Ｆ５、ＨＢｓ−Ｅ１３Ｃ５、０．９％ＮＳ及びエンテカビル（ＥＴＶ）の有効性の評価を示す図である。そこに示される値は、各実験群における４匹のマウスの平均値である。図２Ａ：それぞれ、マウスモノクローナル抗体及びエンテカビル（ＥＴＶ）を用いてＨＢＶトランスジェニックマウスを処置した後の血清中のＨＢｓＡｇレベルの低下を示す。 ＨＢＶトランスジェニックマウスの処置におけるＨＢｓ−Ｅ６Ｆ６、ＨＢｓ−Ｅ７Ｇ１１、ＨＢｓ−Ｇ１２Ｆ５、ＨＢｓ−Ｅ１３Ｃ５、０．９％ＮＳ及びエンテカビル（ＥＴＶ）の有効性の評価を示す図である。そこに示される値は、各実験群における４匹のマウスの平均値である。図２Ｂ：それぞれ、マウスモノクローナル抗体及びエンテカビル（ＥＴＶ）を用いてＨＢＶトランスジェニックマウスを処置した後の血清中のＨＢＶ ＤＮＡレベルの低下を示す。 ＨＢＶトランスジェニックマウスの処置におけるＨＢｓ−Ｅ６Ｆ６、ＨＢｓ−Ｅ７Ｇ１１、ＨＢｓ−Ｇ１２Ｆ５、ＨＢｓ−Ｅ１３Ｃ５、０．９％ＮＳ及びエンテカビル（ＥＴＶ）の有効性の評価を示す図である。そこに示される値は、各実験群における４匹のマウスの平均値である。図２Ｃ：それぞれ、マウスモノクローナル抗体及びエンテカビル（ＥＴＶ）を用いてＨＢＶトランスジェニックマウスを処置した後の血清中のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルの変化を示す。 ＨＢｓ−Ｅ６Ｆ６の注入後のＨＢＶ ＤＮＡ及びＨＢｓＡｇの動的変化を示す図である。図３Ａ：ＨＢＶトランスジェニックマウスにＨＢｓ−Ｅ６Ｆ６を注入した後の血清中のＨＢｓＡｇレベルの低下を示す。図３Ｂ：ＨＢＶトランスジェニックマウスにＨＢｓ−Ｅ６Ｆ６を注入した後の血清中のＨＢＶ ＤＮＡレベルの低下を示す。 ＨＢＶトランスジェニックマウスの処置におけるキメラ抗体の有効性の評価を示す図である。 ９つの組換えタンパク質の構築、発現、精製及び電子顕微鏡観察を示す図である。図５Ａ：ｐＣ１４９−ＳＥＱクローンの構築のスキームを示す。 ９つの組換えタンパク質の構築、発現、精製及び電子顕微鏡観察を示す図である。図５Ｂ：９つの組換えタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ検出及び電子顕微鏡観察の結果を示す。 ＨＢｓ−Ｅ６Ｆ６、ＨＢｓ−Ｅ７Ｇ１１、ＨＢｓ−Ｇ１２Ｆ５、及びＨＢｓ−Ｅ１３Ｃ５のエピトープに関する分析を示す。 エピトープペプチドＳＥＱ１のアミノ酸突然変異に対するＨＢｓ−Ｅ６Ｆ６／ＨＢｓ−Ｅ７Ｇ１１の感受性に関する分析を示す図であり、「Ｒｅｆ」は、ＨＢｓＡｇが抗体反応性を示す参照抗原として用いられることを意味し、「−」は、反応性がＨＢｓＡｇのものと同一であることを意味し、「＋＋」は、反応性がＨＢｓＡｇのものよりも２桁規模（ｌｏｇ１０）で小さいことを意味し、「＋＋＋＋」は、反応性がＨＢｓＡｇのものよりも４桁規模（ｌｏｇ１０）で小さいことを意味する。 エピトープペプチドを含む５つの組換えタンパク質の調製及びそれらの免疫原性の評価を示す図である。図８Ａ：前記５つの組換えタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ検出及び電子顕微鏡観察の結果を示す。 エピトープペプチドを含む５つの組換えタンパク質の調製及びそれらの免疫原性の評価を示す図である。図８Ｂ：前記５つの組換えタンパク質を用いてＢＡＬＢ／Ｃマウスを免疫した後の血清中の抗体力価の変化を示す。 マウス血液由来ポリクローナル抗体の治療効果の評価を示す図である。 ＨＢＶトランスジェニックマウスの処置における前記５つの組換えタンパク質の効果の評価を示す図である。 エピトープペプチドを含む３つの組換えタンパク質の調製及びそれらの治療効果の評価を示す図である。図１１Ａ：前記３つの組換えタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ検出及び電子顕微鏡観察の結果を示す。 エピトープペプチドを含む３つの組換えタンパク質の調製及びそれらの治療効果の評価を示す図である。図１１Ｂ：前記３つの組換えタンパク質を用いてＨＢＶトランスジェニックマウスを免疫した後のマウスにおける血清ＨＢｓＡｇレベル、血清ＨＢＶ ＤＮＡレベル、抗ＨＢｓＡｇ抗体レベル、及び抗担体タンパク質抗体レベルの変化を示す。 ＣＲＭ１９７−ＳＥＱ６、ＣＲＭ３８９−ＳＥＱ６、ＣＲＭＡ−ＳＥＱ６組換えタンパク質の図である。
配列情報
本発明に含まれる配列に関する情報は、以下の表１に提供される。







生物材料の寄託に関する記述
本発明は、Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ、Ｗｕｈａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｗｕｈａｎ、Ｃｈｉｎａ）に寄託された以下の生物材料に関する：
１）２０１２年６月７日に寄託されている、ＣＣＴＣＣ寄託番号Ｃ２０１２７０のハイブリドーマ細胞系ＨＢｓ−Ｅ６Ｆ６；
２）２０１２年６月７日に寄託されている、ＣＣＴＣＣ寄託番号Ｃ２０１２７１のハイブリドーマ細胞系ＨＢｓ−Ｅ７Ｇ１１；
３）２０１２年６月７日に寄託されている、ＣＣＴＣＣ寄託番号Ｃ２０１２７２のハイブリドーマ細胞系ＨＢｓ−Ｇ１２Ｆ５；
４）２０１２年６月７日に寄託されている、ＣＣＴＣＣ寄託番号Ｃ２０１２７３のハイブリドーマ細胞系ＨＢｓ−Ｅ１３Ｃ５。
発明を実施するための特定の様式
本発明は、以下の実施例は、以下の実施例の参照により例示される（例示のためだけに用いられ、本発明の保護範囲を制限することを意図されるものではない）。
別途指摘しない限り、本発明において用いられる分子生物学的実験方法及び免疫学的アッセイは、実質的にＳａｍｂｒｏｏｋ Ｊら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９、及びＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９５に記載の方法に従って実行される；制限酵素は、製品の製造業者により推奨される条件下で用いられる。製造業者が示されない本発明において用いられる試薬は、当業界における従来の製品であるか、又は商業的に入手可能なものである。当業者であれば、実施例は本発明を例示するために用いられ、本発明の保護範囲を制限することを意図されないことを理解できる。
（例１：マウスモノクローナル抗体の調製及び特性分析）
目的：ＨＢｓＡｇに特異的なマウスモノクローナル抗体の取得
１．１ 抗ＨＢｓＡｇマウスモノクローナル抗体の調製
１．１．１ マウスの免疫化
１．１．１．１ 免疫原の調製：免疫原は、ＣＨＯにより発現された組換えＨＢＶ表面抗原タンパク質（ＢＥＩＪＩＮＧ ＷＡＮＴＡＩ ＢＩＯＬＯＧＹ ＰＨＡＲＭＡＣＹ ＣＯ．，ＬＴＤ．から購入したＨＢｓＡｇ）であった。組換えタンパク質を０．４ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈し、等量のＦｒｅｕｎｄアジュバントと混合して、油中水乳濁液を形成させた（混合溶液が完全に乳化されたかどうかを決定するための方法：１滴の混合溶液を清浄水の液体表面上に滴下し、混合溶液が凝集し、分散しなかった場合、溶液は実質的に均質に混合されたと考えることができる）。Ｆｒｅｕｎｄの完全アジュバントを初回免疫化のために使用し、Ｆｒｅｕｎｄの不完全アジュバントをその後の追加免疫化のために使用し、融合の７２ｈ前に行った最後の追加免疫化についてはアジュバントを添加しなかった。
１．１．１．２ マウスの基礎的な免疫化：６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスを、マウスあたり時間あたり４００μＬの量で前記免疫原の皮下多点注射により免疫し、力価アッセイのために、眼球の静脈血２００μＬをそれぞれの免疫化の前に採取した。追加免疫化を、２週間毎に実施した。間接ＥＬＩＳＡを用いて血清力価を決定し、マウスの血清力価がプラトー期になった時、マウスの免疫化を停止し、２カ月休止させた後に融合を実施した。
１．１．１．３ 融合の７２ｈ前の最後の追加免疫：脾臓の最終追加免疫を、マウス脾臓細胞と、マウスミエローマ細胞との融合の７２ｈ前に実施し、この追加免疫のための免疫原はアジュバントを含まず、０．５ｍｇ／ｍＬの組換えタンパク質１００μｌの注入を実施した。脾臓の免疫化の前に、マウスをエーテルで麻酔し、脾臓を取るために腹壁の皮膚を切開することによって腹腔を開き、脾臓に１００μＬの抗原を垂直に注入し、腹壁の皮膚の切開部を外科的に迅速に縫合した。
１．１．２ 融合したハイブリドーマの調製及びスクリーニング
融合の７２ｈ前に行った最終追加免疫の後、マウス脾臓を取り、細胞懸濁液中に調製し、マウスミエローマ細胞Ｓｐ２／０との細胞融合にかけて、ハイブリドーマ細胞を取得した。これの前に、フィーダー細胞を調製した。ハイブリドーマ細胞の培養中に、多数のミエローマ細胞及び脾細胞は融合後に１６４０−ＨＡＴ培養培地中で次々と死滅し、単一の細胞又は２〜３個の散乱した細胞は容易に生存できず、それらを生存させるために他の細胞を添加しなければならなかった。添加された生きている細胞は、フィーダー細胞として公知であった。実験室は、フィーダー細胞として１３日齢のマウスのマウス腹膜マクロファージ又は胸腺細胞を用いた。
１．１．２．１ マウスマクロファージの調製は、以下のステップを含んでいた。（ｉ）６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを、頸椎脱臼により殺傷した。マウスを流水で洗浄し、７５％エタノール溶液中に５ｍｉｎ入浴させた；マウスを、腹部を上にしてスーパークリーンベンチ上に置いた；マウス腹部の皮膚を、ピンセットで持ち上げた；小さい穴を開けた；皮膚を、より大きいピンセットで上下に引き裂いて、腹部の十分な露出を確保した。（ｉｉ）無菌性眼科用ピンセットを用いて腹膜を持ち上げ、別のハサミを用いて腹膜中央に小さい穴を開け、１ｍＬのピペットを用いて好適な量の培養培地を穴を通して腹腔内に注入し、溶液を腹腔内でピペットを用いて注意深く撹拌し、培養培地を吸い取り、遠心分離管に入れた。（ｉｉｉ）腹腔からの細胞溶液をＨＡＴ培養培地又はＨＴ培養培地に溶解して、２ｘ１０５細胞／ｍＬの濃度のマクロファージフィーダー細胞を得た。（ｉｖ）０．１ｍＬのフィーダー細胞を９６穴細胞培養プレートのそれぞれのウェルに添加し、インキュベータ中で培養した；又は融合細胞と混合した後、９６穴細胞培養プレートに添加した。
１．１．２．２ マウス胸腺細胞の調製は、以下のステップを含んでいた。（ｉ）１３週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを、頸椎脱臼により殺傷した。マウスを流水で洗浄し、７５％エタノール溶液中に５ｍｉｎ入浴させた；マウスを、腹部を上にしてスーパークリーンベンチ上に置いた。（ｉｉ）マウス腹部の皮膚を、ピンセットで持ち上げ、腹部及び胸部の外皮を切断した。（ｉｉｉ）別の清潔なハサミを用いて、胸腔を切断し、象牙色の胸腺をピンセットで取り、すり潰した後、得られた混合物を、２００メッシュの細胞篩いを通過させて、胸腺フィーダー細胞溶液を得た。
１．１．２．３ マウスミエローマ細胞の調製は以下のステップを含む。（ｉ）マウスミエローマ細胞系Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／０）は培養が容易であり、高い融合率を有するため、現在最も理想的な融合細胞であった；しかしながら、Ｓｐ２／０ミエローマ細胞系は、ＮＳ−１と比較して培養条件に対してより感受性が高く、過剰に希釈した場合（３ｘ１０５／ｍＬ未満の密度）及び塩基性ｐＨ（７．３より高いｐＨ）の場合、良好に増殖しなかった。（ｉｉ）対数増殖期の細胞を、融合のために選択した。（ｉｉｉ）融合の前に、ミエローマ細胞を培養フラスコから遠心分離管に取り出し、ＲＰＭＩ−１６４０培養培地で３回洗浄した（１０００ｒｐｍ×５ｍｉｎ）；細胞をＲＰＭＩ−１６４０培養培地中に再懸濁し、細胞を計数した。（ｉｖ）一般に、マウスミエローマ細胞を、融合の５日前に解凍し、それぞれの融合について、約６本のボトルの３５ｃｍ２ Ｓｐ２／０細胞が必要であった。
１．１．２．４ 免疫脾細胞の調製は以下のステップを含んでいた。（ｉ）融合しようとするＢＡＬＢ／Ｃマウスを使用し、眼球を取り出し、マウスを死亡するまで出血させ、採取された血液を用いて抗血清を調製し、これを抗体検出のための陽性対照として用いた。マウスを流水で洗浄し、７５％エタノール溶液中に５ｍｉｎ入浴させた；そしてマウスを、右腕臥位でスーパークリーンベンチ上に置いた。（ｉｉ）無菌操作により腹腔を開き、脾臓を取り、脾臓を小片に切断し、小片を２００メッシュの細胞篩い上に置き、吹管を用いてＲＰＭＩ−１６４０培養培地を滴下添加しながら、破砕棒（プランジャ）によって搾り、粉砕した。（ｉｉｉ）好適な量のＲＰＭＩ−１６４０培養培地を添加し、混合物を３〜５ｍｉｎ静置し、懸濁液の上側２／３を５０ｍＬのプラスチック製遠心分離管に取り出した；この操作を２〜３回繰り返した。（ｉｖ）細胞を、ＲＰＭＩ−１６４０培養培地で３回洗浄した（１０００ｒｐｍ×１０ｍｉｎ）。（ｖ）細胞をＲＰＭＩ−１６４０培養培地中に再懸濁し、細胞数を計数した。
１．１．２．５ ＰＥＧ融合源を用いる融合によるハイブリドーマの調製は以下のステップを含んでいた。（ｉ）融合の前に、１ｍＬのＰＥＧ−１５００及び１０ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０無血清培養培地及び２００ｍＬの完全培地を、３７℃に予め加熱した。（ｉｉ）調製されたミエローマ細胞及び脾細胞を、５０ｍＬの遠心管中で混合し（１×１０８個の脾細胞＋１×１０７個のミエローマ細胞、約１０：１）、１５００ｒｐｍ×８ｍｉｎで遠心分離した；遠心分離後、管を底部でフリックして、細胞を緩め、ペースト状にした。（ｉｉｉ）１ｍＬの吸引ピペットを用いて、わずかに撹拌しながら０．８ｍＬ（１×１０８個の脾細胞＋０．８ｍＬのＰＥＧ）を遠心分離管に取り出し、ＰＥＧの添加を６０ｓ以内に終了した後、穏やかに撹拌しながら、３７℃に予め加熱した１０ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０完全培地を添加した。最後に、ＲＰＭＩ−１６４０培養培地を４０ｍＬまで添加し、１０００ｒｐｍ×５ｍｉｎでの遠心分離を実施した。（ｉｖ）上清を廃棄し、少量のＨＴ培養培地を用いて、細胞を注意深く吹き飛ばし、細胞を、調製されたＨＴ培養培地に取り出し、０．１ｍＬ／ウェルで９６穴細胞培養プレートに添加し、ＣＯ２インキュベータ中で培養した。（ｖ）１２ｈ後、好適な量のＨＡＴ完全培地を調製し、０．１ｍＬの培地をそれぞれのウェルに添加した；５日後、ＨＴ完全培地を用いて、ウェル中の５０〜１００％の細胞上清を置き換えた；約９〜１４日後、上清を検出のために取った。
１．１．２．６ ハイブリドーマのスクリーニング：間接的ＥＬＩＳＡスクリーニングにより、プレートを１００ｎｇ／ウェルの組換え抗原ＨＢｓＡｇで被覆し、５０μＬの細胞上清を添加し、陽性クローンのウェルを拾った。
１．１．２．７ ハイブリドーマ細胞のクローニング：限界希釈アッセイを使用し、細胞を最初に所与の濃度勾配に希釈した後、９６穴細胞培養プレートのそれぞれのウェルに播種したところ、１個の細胞が可能な限りそれぞれのウェル中で増殖した。ハイブリドーマ単クローン陽性細胞系は一般に、２〜３回繰り返してクローニングしなければならず、１００％陽性に達するまで安定なクローン系とみなした。
１．１．３ ＭＡｂ腹水の生成
２〜３匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを使用し、０．５ｍＬのサキソール（ｓａｘｏｌ）を腹腔に注入した。１週間後、対数増殖期のハイブリドーマ細胞を１０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を廃棄した。ハイブリドーマ細胞を無血清培養培地中に懸濁し、細胞数を（１〜２）×１０６個／ｍＬに調整し、０．５ｍＬの懸濁液をそれぞれのマウスの腹腔に注入した。７〜１０日後、マウスを頸椎脱臼により殺傷し、その時に腹腔を明瞭に膨張させた。マウスを流水で洗浄し、浴中に入れ、７５％エタノール中に５ｍｉｎ入浴させた。マウスの腹部を上にし、４本の手足を注射針で解剖台上に固定した。マウス腹部の皮膚をピンセットで持ち上げ、小さい穴を開けた後、皮膚をマウスの背部の両側から切断した。より大きいピンセットで皮膚を上下に引き裂いて、腹部の十分な露出を確保した。無菌性眼科用ピンセットを用いて腹膜を持ち上げ、腹膜中央に小さい穴を開けた後、１ｍＬのピペットを用いて腹腔から全ての腹水を取った。採取された腹水を混合し、遠心管中、３０００ｒｐｍで２０ｍｉｎ遠心分離した。遠心分離後に上清を採取した。
１．１．４ ＭＡｂ腹水の精製
硫酸アンモニウム沈降及びプロテインＡアフィニティクロマトグラフィー（ＵＳ ＧＥ Ｃｏ．から購入）の後、精製されたモノクローナル抗体を取得した。
１．２ 抗ＨＢｓＡｇマウスモノクローナル抗体の特性に関する分析
１．２．１ ポリペプチドの合成
ＨＢＶ配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＡＡＦ２４７２９．１）を参照配列として使用し、２７のポリペプチドを合成した（ＸｉａＭｅｎ Ｊｉｎｇｊｕ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．により合成）。前記２７のポリペプチド（Ｓ１〜Ｓ２７）は同時に、ＨＢｓＡｇの完全長２２６アミノ酸を包含していた。ポリペプチドＳ１〜Ｓ２７に関する情報を、表２に示した。ＨＢｓＡｇの完全長アミノ酸配列を、配列番号４２に記載した。
１．２．２ 抗ＨＢｓＡｇマウスモノクローナル抗体とポリペプチドＳ１〜Ｓ２７との反応性に関するアッセイ
（１．２．２．１）反応プレートの調製
ポリペプチドを、ｐＨ９．６の５０ｍＭ ＣＢバッファー（ＮａＨＣＯ３／Ｎａ２ＣＯ３バッファー、最終濃度５０ｍＭ、ｐＨ９．６）で最終濃度１μｇ／ｍＬに希釈した；９６穴ＥＬＩＳＡプレートのそれぞれのウェルに、１００μＬの被覆バッファーを添加し、２〜８℃で１６〜２４ｈ被覆を実施した後、３７℃で２ｈ実施した。プレートをＰＢＳＴ溶液（２０ｍＭ ＰＢ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で１回洗浄した；次いで、２００μＬのブロッキング溶液（ｐＨ７．４、２０％ウシ胎仔血清及び１％カゼインを含有する２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４バッファー）をそれぞれのウェルに添加し、３７℃で２ｈ、ブロッキングを実施した；ブロッキング溶液を廃棄した。乾燥後、プレートをアルミホイルバッグ中で包装し、さらなる使用のために２〜８℃で貯蔵した。
（１．２．２．２）抗ＨＢｓＡｇマウスモノクローナル抗体のＥＬＩＳＡ
定性的ＥＬＩＳＡのために、１．１で得られた２５の抗ＨＢｓＡｇマウスモノクローナル抗体を、２０％ウシ新生児血清を含有するＰＢＳ溶液で１μｇ／ｍＬの濃度に希釈した。
試料反応：１００μＬの希釈された試料を、ポリペプチドで被覆された２７のＥＬＩＳＡプレートのそれぞれのウェルに添加し、プレートを３７℃で３０ｍｉｎ、インキュベータ中に入れた。
酵素標識反応：試料反応ステップが終了した後、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴ溶液（２０ｍＭ ＰＢ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で５回洗浄し、１００μＬのＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＧＡＭ）（ＢＥＩＪＩＮＧ ＷＡＮＴＡＩ ＢＩＯＬＯＧＹ ＰＨＡＲＭＡＣＹ ＣＯ．，ＬＴＤから購入）をそれぞれのウェルに添加し、プレートを３７℃で３０ｍｉｎ、インキュベータ中に入れた。
発色反応：酵素標識反応の後、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴ溶液（２０ｍＭ ＰＢ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で５回洗浄し、５０μＬのＴＭＢ発色試薬（ＢＥＩＪＩＮＧ ＷＡＮＴＡＩ ＢＩＯＬＯＧＹ ＰＨＡＲＭＡＣＹ ＣＯ．，ＬＴＤから購入）をそれぞれのウェルに添加し、プレートを３７℃で１５ｍｉｎ、インキュベータ中に入れた。
停止反応及び値の読取り：発色反応ステップが終了した後、５０μＬの停止バッファー（ＢＥＩＪＩＮＧ ＷＡＮＴＡＩ ＢＩＯＬＯＧＹ ＰＨＡＲＭＡＣＹ ＣＯ．，ＬＴＤから購入）をＥＬＩＳＡプレートのそれぞれのウェルに添加し、それぞれのウェルについてＯＤ４５０／６３０値をＥＬＩＡＳＡを用いて読取った。
抗ＨＢｓＡｇマウスモノクローナル抗体と２７のポリペプチドとの反応性の決定：反応性を、読取った値により決定した。試験値／バックグラウンド値が５を超えた場合、試料は陽性と見なされた。
（１．２．２．３）抗ＨＢｓＡｇマウスモノクローナル抗体の認識特性の分析
結果を、表３に示した。２５の抗ＨＢｓＡｇマウスモノクローナル抗体により認識される型を、５群（認識特性に応じて）、すなわち、ｓＡ、ｓＢ、ｓＣ、ｓＤ、ｓＥに分割することができ、ここで、ｓＡ群の抗体はポリペプチドＳ１５及びＳ１６を認識した；ｓＢ群の抗体はポリペプチドＳ１６を認識した；ｓＣ群の抗体は前記２７のポリペプチドとの反応において陰性を示した；ｓＤ群の抗体はポリペプチドＳ１８を認識した；ｓＥ群の抗体はポリペプチドＳ８を認識した。
（例２：ＨＢＶトランスジェニックマウスの処置における抗ＨＢｓＡｇマウスモノクローナル抗体の有効性の評価）
目的：ＨＢＶトランスジェニックマウスの処置における抗ＨＢｓＡｇマウスモノクローナル抗体の有効性の評価。
２．１ ＨＢｓＡｇの変性化学発光定量アッセイの確立
処置後、多数の抗体が血清中に存在し、従って、ＨＢｓＡｇの決定は抗原−抗体複合体によって妨害され得る。かくして、抗体からの干渉なしにＨＢｓＡｇを定量的に決定するための方法を確立する必要がある。本発明者らは、変性法によって試料中の抗原−抗体複合体を溶解させて、抗体からの干渉を排除し、ＨＢｓＡｇの正確な定量的アッセイを実行した。
２．１．１ 反応プレートの調製
マウスモノクローナル抗体ＨＢｓ−４５Ｅ９を、ｐＨ７．４の２０ｍＭ ＰＢバッファー（Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４バッファー、最終濃度５０ｍＭ、ｐＨ７．４）で２μｇ／ｍＬの最終濃度に希釈した；９６穴ＥＬＩＳＡプレートのそれぞれのウェルに、１００μＬの被覆溶液を添加し、２〜８℃で１６〜２４ｈ、被覆を実施した後、３７℃で２ｈ実施した。プレートをＰＢＳＴ溶液（２０ｍＭ ＰＢ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で１回洗浄した；次いで、２００μＬのブロッキング溶液（２０％ウシ胎仔血清及び１％カゼインを含有するｐＨ７．４の２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４バッファー）をそれぞれのウェルに添加し、ブロッキングを３７℃で２ｈ実施した；そして、ブロッキング溶液を廃棄した。乾燥後、プレートをアルミホイルバッグ中で包装し、さらなる使用のために２〜８℃で貯蔵した。
２．１．２ ＨＢｓＡｇの変性−化学発光定量アッセイ
試料の希釈：マウス血清を、２０％ウシ新生児血清を含有するＰＢＳ溶液で２つの勾配濃度、すなわち、１：３０及び１：１５０に希釈した。
試料の変性：１５μＬの前記希釈された試料を、７．５μＬの変性バッファー（１５％ＳＤＳ、２０ｍＭ ＰＢ７．４に溶解）と混合し、混合溶液を３７℃で１ｈインキュベートした後、９０μＬの中和バッファー（４％ＣＨＡＰＳ、２０ｍＭ ＰＢ７．４に溶解）を混合溶液に添加し、得られた溶液を均質に混合した。
試料の反応：変性処理によって得られた１００μＬの前記混合溶液試料を反応プレートに添加した。プレートを３７℃で６０ｍｉｎ、インキュベータ中に入れた。
酵素標識反応：試料反応ステップが終了した後、化学発光反応プレートをＰＢＳＴ溶液（２０ｍＭ ＰＢ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で５回洗浄し、１００μＬのＨＢｓ−Ａ６Ａ７−ＨＲＰ溶液（ＢＥＩＪＩＮＧ ＷＡＮＴＡＩ ＢＩＯＬＯＧＹ ＰＨＡＲＭＡＣＹ ＣＯ．，ＬＴＤにより提供）をそれぞれのウェルに添加し、プレートを３７℃で６０ｍｉｎ、インキュベータ中に入れた。
発光反応及び決定：酵素標識反応ステップが終了した後、化学発光反応プレートをＰＢＳＴ溶液（２０ｍＭ ＰＢ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で５回洗浄し、発光溶液（ＢＥＩＪＩＮＧ ＷＡＮＴＡＩ ＢＩＯＬＯＧＹ ＰＨＡＲＭＡＣＹ ＣＯ．，ＬＴＤにより提供）を光強度を決定するために添加した。
試験しようとする試料中でのＨＢｓＡｇ濃度の取得：同じ実験のために標準物質を使用し、標準物質の結果を用いて標準曲線をプロットした（光強度値対濃度値の線形回帰）；標準曲線に従って、試験しようとする試料中のＨＢｓＡｇ濃度が計算によって得られた。
２．２ ＨＢＶ ＤＮＡのリアルタイム蛍光定量アッセイ
ＨＢＶ ＤＮＡのリアルタイム蛍光定量アッセイキットを、ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＫＥＨＵＡ ＢＩＯ−ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＣＯ．，ＬＴＤから購入し、ＨＢＶ ＤＮＡのリアルタイム蛍光定量アッセイを、キットの説明書に従って行った。
２．３ ＨＢＶトランスジェニックマウスの処置における抗ＨＢｓＡｇマウスモノクローナル抗体の有効性
例１で得られた２５種の抗体を、２０ｍｇ／ｋｇの単回用量でＨＢＶトランスジェニックマウスの尾静脈に注入した。通常の塩水（０．９％ＮＳ）を注入したＨＢＶトランスジェニックマウスを、陰性対照群として用いた。各群は４匹のＨＢＶトランスジェニックマウスを含み、２匹は雄であり、他の２匹は雌であった。マウスの血液を眼窩周囲静脈叢から採り、マウス血清中のＨＢｓＡｇ及びＨＢＶ ＤＮＡレベルをモニタリングした。
結果を、図１に示した。この結果は、ＨＢＶトランスジェニックマウスを異なるエピトープに対する５群の抗ＨＢｓＡｇマウスモノクローナル抗体で処置した後、ｓＡ及びｓＤ群の抗体が有意なウイルス消失の効果を示す；ＨＢｓＡｇ及びＨＢＶ ＤＮＡレベルが２群の抗体を用いる処置群からのマウス血清中で有意に低下する；他の３群の抗体を用いる処置後、ＨＢｓＡｇ及びＨＢＶ ＤＮＡレベルがマウス血清中で有意に低下しないことを示していた。ｓＡ及びｓＤ群の抗体のうち、血清中のＨＢｓＡｇ及びＨＢＶ ＤＮＡレベルは、ｓＤ群の抗体を用いる処置と比較してｓＡ群の抗体を用いる処置後により大きい程度で低下し、最も長い阻害の持続時間を示す４つの抗体はｓＡ群の抗体に属し、これはそれぞれＨＢｓ−Ｅ６Ｆ６、ＨＢｓ−Ｅ７Ｇ１１、ＨＢｓ−Ｇ１２Ｆ５、ＨＢｓ−Ｅ１３Ｃ５であった。
（例３：ＨＢＶトランスジェニックマウスの処置におけるｓＡ群のマウスモノクローナル抗体の有効性及び副作用）
目的：ＨＢＶトランスジェニックマウスの処置におけるｓＡ群のマウスモノクローナル抗体の有効性及び副作用の評価、単回用量の抗体を用いる処置後のウイルスの効率的阻害の持続時間のモニタリング、並びにＡＬＴのモニタリング。
例２でスクリーニングされたように、最良の治療効果を有する４種の抗体ＨＢｓ−Ｅ６Ｆ６、ＨＢｓ−Ｅ７Ｇ１１、ＨＢｓ−Ｇ１２Ｆ５、ＨＢｓ−Ｅ１３Ｃ５を実験のために選択し、２０ｍｇ／ｋｇの単回用量でＨＢＶトランスジェニックマウスの尾静脈に注入した。通常の塩水（０．９％ＮＳ）で処置したＨＢＶトランスジェニックマウスを陰性対照群として使用し、胃内経路により投与された３．２ｍｇ／ｋｇ／ｄのエンテカビル（ＥＴＶ）で処置したＨＢＶトランスジェニックマウスを有効薬物対照群として使用した。各群は４匹のＨＢＶトランスジェニックマウスを含み、２匹は雄であり、他の２匹は雌であった。マウスの血液を眼窩周囲静脈叢から採り、マウス血清中のＨＢｓＡｇ、ＨＢＶ ＤＮＡ、ＡＬＴレベルをモニタリングした。
例２に記載の方法に従って、ＨＢｓＡｇ及びＨＢＶ ＤＮＡレベルを決定し、ＡＬＴはＢＥＩＪＩＮＧ ＷＡＮＴＡＩ ＢＩＯＬＯＧＹ ＰＨＡＲＭＡＣＹ ＣＯ．，ＬＴＤにより提供されるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）アッセイキットにより決定した。
ＨＢｓ−Ｅ６Ｆ６、ＨＢｓ−Ｅ７Ｇ１１、ＨＢｓ−Ｇ１２Ｆ５、ＨＢｓ−Ｅ１３Ｃ５、０．９％ＮＳ又はエンテカビル（ＥＴＶ）でＨＢＶトランスジェニックマウスを処置する結果を、図２に示した（示された値は、各実験群の４匹のマウスの平均値であった）。この結果は、単回用量のモノクローナル抗体ＨＢｓ−Ｅ６Ｆ６、ＨＢｓ−Ｅ７Ｇ１１、ＨＢｓ−Ｇ１２Ｆ５又はＨＢｓ−Ｅ１３Ｃ５で処置した後、ＨＢｓＡｇ及びＨＢＶ ＤＮＡレベルはＨＢＶトランスジェニックマウスの血清中で有意に低下するが、この抗体処置群はＨＢＶ ＤＮＡレベルの低下に関してＥＴＶ処置群と同等であることを示していた。対照的に、ＨＢｓＡｇレベルはＥＴＶ処置群のマウスの血清中で有意に低下しなかったが、ＨＢｓＡｇレベルは抗体処置群の血清中では有意に低下した。さらに、任意の抗体で処置する間、ＡＬＴの増加は観察されなかった。
（例４：ＨＢｓ−Ｅ６Ｆ６の注入後のＨＢＶ ＤＮＡ及びＨＢｓＡｇの動的変化）
目的：モノクローナル抗体が最大の有効性を発揮する最短時間に関する研究。
最良の効果を有するマウスモノクローナル抗体ＨＢｓ−Ｅ６Ｆ６を、例３で用いた４種の抗体から選択し、２０ｍｇ／ｋｇの単回用量でＨＢＶトランスジェニックマウスの尾静脈に注入した。この実験においては、４匹の雄マウスを使用し、マウス血清中でのＨＢＶ ＤＮＡ及びＨＢｓＡｇの動的変化をモニタリングした。
例２に記載の方法に従って、血清中のＨＢｓＡｇ及びＨＢＶ ＤＮＡレベルを決定した。その結果を図３に示した。この結果は、マウス血清中でのＨＢｓＡｇ及びＨＢＶ ＤＮＡレベルが注入後１〜２４ｈ以内に最大阻害レベルに低下することを示していた。
（例５：ヒト−マウスキメラ抗体ＨＢｓ−Ｅ６Ｆ６及びＨＢｓ−Ｅ７Ｇ１１の治療効果の評価）
目的：キメラ抗体の治療効果の評価。
ＨＢｓ−Ｅ６Ｆ６及びＨＢｓ−Ｅ７Ｇ１１抗体のＩｇｖ遺伝子を、ヒト抗体定常領域をコードするＩｇｃ遺伝子に連結し、キメラ抗体ＨＢｓ−Ｅ６Ｆ６及びキメラ抗体ＨＢｓ−Ｅ７Ｇ１１をＣＨＯ細胞中での組換え発現及び精製により取得した。キメラ抗体を、１０ｍｇ／ｋｇの単回用量でＨＢＶトランスジェニックマウスの尾静脈に注入した。マウス血清中でのＨＢＶ ＤＮＡ及びＨＢｓＡｇの動的変化をモニタリングした。結果を図４に示した。この結果は、キメラ抗体ＨＢｓ−Ｅ６Ｆ６及びキメラ抗体ＨＢｓ−Ｅ７Ｇ１１が両方ともマウスにおいてＨＢｓＡｇ及びＨＢＶ ＤＮＡを効率的に排除することができることを示していた。
（例６：ｓＡ群の抗体により認識されるエピトープの同定）
目的：ｓＡ群の抗体により認識されるエピトープの同定及び認識されたコアアミノ酸配列の決定。
６．１ ｐＣ１４９−ＳＥＱクローンの構築
ＨＢｃＡｇを担体タンパク質として用いた場合、完全長ＨＢｃＡｇタンパク質又はその断片（例えば、ＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端側ａａ１〜１４９）を用いることができる（Ｙａｎｇ Ｈａｉｊｉｅら、「ＨＢＶコアタンパク質に基づくペプチドディスプレイベクターの構築（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｂａｓｅｄ ｏｎ ＨＢＶ Ｃｏｒｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ）」、ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＸＩＡＭＥＮ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ（ＮＡＴＵＲＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥ）、２００４年５月、第４３巻、４号を参照されたい）。この実験においては、ＨＢｃＡｇタンパク質の断片（ａａ１〜１４９）を担体タンパク質として用いて、一連のクローンを構築した。
ＨＢｃＡｇのａａ７９〜８１をコードする配列を、部位特異的突然変異誘発によってＨＢｃＡｇタンパク質の断片（ａａ１〜１４９）をコードするヌクレオチド配列から欠失させ、２つのリンカーを欠失の２つの末端に別々に導入し、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ消化部位を２つのリンカーの間に設計し、かくして、担体タンパク質Ｃ１４９／ｍｕｔ（Ｃ１４９／ｍｕｔのアミノ酸配列は配列番号４３に記載されており、ＨＢｃ（１〜７８）−Ｇ４ＳＧ４Ｔ−ＧＳ−Ｇ４ＳＧ４−ＨＢｃ（８２〜１４９）の構造を有する；Ｃ１４９／ｍｕｔにおいて、ＨＢｃＡｇの３個のアミノ酸（ａａ７９〜８１）は、Ｇｌｙに富む可撓性リンカー、Ｇ４ＳＧ４Ｔ−ＧＳ−Ｇ４ＳＧ４で置き換えられた）をコードする配列が得られた。Ｃ１４９／ｍｕｔをコードする配列を、ｐＴＯ−Ｔ７原核発現ベクター（Ｌｕｏ Ｗｅｎｘｉｎら、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０００、１６：５３〜５７頁）中にクローニングして、タンパク質Ｃ１４９／ｍｕｔをコードする組換えプラスミドｐＣ１４９／ｍｕｔを得た。後に、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ消化部位を用いることにより、対象のポリペプチドをコードする配列（図５Ａ中でＳＥＱで表される）を可撓性リンカーの間にクローニングして、組換えタンパク質Ｃ１４９−ＳＥＱ（担体タンパク質Ｃ１４９／ｍｕｔと対象のポリペプチドＳＥＱとを含む）をコードする組換えベクターｐＣ１４９−ＳＥＱを得た。クローンの設計及び組換えベクターｐＣ１４９−ＳＥＱの構造を、図５Ａに示した。
表４に示された９のポリペプチドの遺伝子配列を、組換えプラスミドｐＣ１４９／ｍｕｔに別々にライゲートして、それぞれ、組換えタンパク質Ｃ１４９−ＳＥＱ１、３、４、５、６、８、９、１０、１１をコードする９種のｐＣ１４９−ＳＥＱ組換えベクター（ｐＣ１４９−ＳＥＱ１、３、４、５、６、８、９、１０、１１）を得た。
６．２ Ｃ１４９−ＳＥＱタンパク質の発現及び精製
組換えタンパク質の発現及び精製を、例としてＣ１４９−ＳＥＱ６を用いることにより説明した。
（６．２．１）高効率発現株の取得：６．１に記載の方法に従って、対象のベクターｐＣ１４９−ＳＥＱ６を構築し、ＤＮＡ配列決定を用いて同定した後、対象のベクターを大腸菌ＥＲ２５６６株（大腸菌、ＥＲ２５６６）中に形質転換して、発現株を得た。
（６．２．２）Ｃ１４９−ＳＥＱ６タンパク質の発現：発現株を三角フラスコ（５００ｍＬ）に播種し、ＯＤが約１．０になるまで３７℃で振とう台中で培養した。イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を０．５ｍＭの最終濃度まで添加し、２５℃で６ｈ振とうしながら発現を誘導した。
（６．２．３）Ｃ１４９−ＳＥＱ６タンパク質の精製：
（６．２．３．１）細菌の超音波処理：６．２．２の細菌を遠心分離により収集した；細菌を超音波処理にかけた。超音波処理バッファーは以下の成分：２０ｍＭリン酸バッファー（ＰＨ６．０）＋３００ｍＭ ＮａＣｌを含む。
（６．２．３．２）対象のタンパク質の一次精製：対象のタンパク質は耐熱性であったため、超音波処理した混合物を６５℃で３０ｍｉｎ、水浴中に入れ、遠心分離の後、上清を収集した。上清を１：１の体積比で飽和硫酸アンモニウム溶液に添加し、遠心分離後に沈降物を収集した。好適な容量のバッファーを添加して沈降物を再懸濁して、一次精製された対象のタンパク質を得た。バッファーは、２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ＝７．４）＋１５０ｍＭ ＮａＣｌを含んでいた。
（６．２．３．３）対象のタンパク質のクロマトグラフィー精製：６．２．３．２で得られたタンパク質を、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦ（ＧＥ）分子篩カラムクロマトグラフィーによりさらに精製して、精製された対象のタンパク質を得た。精製された対象のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、対象のタンパク質の粒子の集合状態を透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によって観察した。
図５Ｂは、前記９種の組換えタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＴＥＭの結果を示した。この結果は、前記９種の組換えタンパク質が９５％を超える純度を有し、均一なサイズのタンパク質粒子に集合させることができることを示していた。
６．２ 前記９種の組換えタンパク質とｓＡ群の抗体との反応性の評価
６．２．１ 反応プレートの調製
例１−１．２に記載の方法に従って、反応プレートを調製した。被覆抗原は対象のポリペプチドを提示する前記９種の組換えタンパク質である。
６．２．２ ＥＬＩＳＡによるＨＢｓ−Ｅ６Ｆ６、ＨＢｓ−Ｅ７Ｇ１１、ＨＢｓ−Ｇ１２Ｆ５、ＨＢｓ−Ｅ１３Ｃ５と、前記組換えタンパク質の反応性の決定
例１−１．２に記載の方法に従って、ＨＢｓ−Ｅ６Ｆ６、ＨＢｓ−Ｅ７Ｇ１１、ＨＢｓ−Ｇ１２Ｆ５、ＨＢｓ−Ｅ１３Ｃ５と前記組換えタンパク質との反応性を決定した。
６．２．３ ＨＢｓ−Ｅ６Ｆ６、ＨＢｓ−Ｅ７Ｇ１１、ＨＢｓ−Ｇ１２Ｆ５、ＨＢｓ−Ｅ１３Ｃ５により認識されるエピトープに関する分析
６．２．２のＥＬＩＳＡの結果を、図６に示した。この結果は、ＨＢｓ−Ｅ６Ｆ６、ＨＢｓ−Ｅ７Ｇ１１、ＨＢｓ−Ｇ１２Ｆ５、ＨＢｓ−Ｅ１３Ｃ５がポリペプチドＳＥＱ１、ＳＥＱ３、ＳＥＱ４、ＳＥＱ５、ＳＥＱ６、ＳＥＱ１０を提示する組換えタンパク質との良好な反応性を有するが、ポリペプチドＳＥＱ８、ＳＥＱ９、ＳＥＱ１１を提示する組換えタンパク質との反応性を有さないことを示していた。これらのポリペプチドの配列分析は、ポリペプチドＳＥＱ１、ＳＥＱ３、ＳＥＱ４、ＳＥＱ５、ＳＥＱ６、ＳＥＱ１０の共通の特徴が、ＨＢｓＡｇのａａ１２１〜ａａ１２４を含むことにあり、ＳＥＱ８、ＳＥＱ９、ＳＥＱ１１の共通の特徴が、無傷のＨＢｓＡｇのａａ１２４〜１２４を含まないことにあるということを示していた。従って、ＨＢｓ−Ｅ６Ｆ６、ＨＢｓ−Ｅ７Ｇ１１、ＨＢｓ−Ｇ１２Ｆ５、ＨＢｓ−Ｅ１３Ｃ５は同じエピトープを認識し、それらにより認識される最も短いエピトープのアミノ酸配列はＨＢｓＡｇのａａ１２１〜１２４、すなわち、ＣＫＴＣであると結論付けることができた。ＥＬＩＳＡの結果は、組換えタンパク質Ｃ１４９−ＳＥＱ１及びＳＥＱ３〜６が抗体との同等の反応性を有し、Ｃ１４９−ＳＥＱ１０よりも高い反応性を有することを示していた。従って、ポリペプチドＳＥＱ１及びＳＥＱ３〜６は、抗体ＨＢｓ−Ｅ６Ｆ６、ＨＢｓ−Ｅ７Ｇ１１、ＨＢｓ−Ｇ１２Ｆ５、ＨＢｓ−Ｅ１３Ｃ５により認識される好ましいエピトープペプチドであった。さらに、ＳＥＱ１の配列はＳＥＱ３〜６よりも短かったため、ＳＥＱ１は好ましいコアエピトープと見なされた。
（例７：エピトープペプチドＳＥＱ１のアミノ酸突然変異に対するＨＢｓ−Ｅ６Ｆ６及びＨＢｓ−Ｅ７Ｇ１１の感受性に関する分析）
ＳＥＱ１（ＧＰＣＫＴＣＴ）をアミノ酸点突然変異にかけ、７種の突然変異体を調製した。前記７種の突然変異ポリペプチドのアミノ酸配列を、表５に示した。例６に記載された方法に従って、突然変異ポリペプチドとＣ１４９／ｍｕｔとを含む組換えタンパク質を調製し、ＨＢｓ−Ｅ６Ｆ６及びＨＢｓ−Ｅ７Ｇ１１を前記７種の突然変異ポリペプチドとのその反応性について評価した。
結果を図７に示した。この結果は、突然変異体Ｍ１（Ｐ１２０Ｓ）、突然変異体Ｍ２（Ｐ１２０Ｔ）、突然変異体Ｍ４（Ｋ１２２Ｒ）は、抗体ＨＢｓ−Ｅ６Ｆ６及びＨＢｓ−Ｅ７Ｇ１１への結合に関して、エピトープペプチドＳＥＱ１と同等であるが、抗体への他の突然変異体の結合は有意に低下することを示していた。それは、Ｐ１２０Ｓ、Ｐ１２０Ｔ、Ｋ１２２Ｒ突然変異はＨＢｓ−Ｅ６Ｆ６及びＨＢｓ−Ｅ７Ｇ１１とエピトープＳＥＱ１との反応性に対して効果がないが、Ｃ１２１Ｓ、Ｃ１２４Ｓ、Ｃ１２１Ｓ／Ｃ１２４Ｓ、Ｔ１２３Ｉ突然変異はＨＢｓ−Ｅ６Ｆ６及びＨＢｓ−Ｅ７Ｇ１１とエピトープＳＥＱ１との反応性を有意に低下させることを示していた。
（例８：エピトープペプチドを含む組換えタンパク質の調製及びその免疫原性の評価）
８．１ エピトープペプチドを含む組換えタンパク質の調製
例６に記載の方法に従って、Ｃ１４９／ｍｕｔを担体タンパク質として用いて、エピトープペプチドＳＥＱ１、ＳＥＱ３、ＳＥＱ４、ＳＥＱ６、ＳＥＱ７を提供し、ここで、ＳＥＱ３、ＳＥＱ４、ＳＥＱ６、ＳＥＱ７は、好ましいコアエピトープＳＥＱ１（すなわち、コアエピトープＳＥＱ１を含む）のＮ及び／又はＣ末端の伸長により得られたポリペプチドであり、それからヌクレオキャプシド様粒子（ＣＬＰ）を形成することができる５種の組換えタンパク質（免疫化のための抗原として用いた）を調製した。
例６に記載のように、５種の組換えタンパク質Ｃ１４９−ＳＥＱ１、ＳＥＱ３、ＳＥＱ４、ＳＥＱ６、ＳＥＱ７を調製し、前記５種の組換えタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、透過型電子顕微鏡により観察した。その結果を図８Ａに示した。この結果は、前記５種の組換えタンパク質が９５％を超える純度を有し、均一なサイズのタンパク質粒子に集合させることができることを示していた。
８．２ エピトープペプチドを含む組換えタンパク質の免疫原性の評価
８．２．１ マウスの免疫化
ＢＡＬＢ／Ｃマウスを、それぞれ、前記５種の組換えタンパク質及び担体タンパク質Ｃ１４９／ｍｕｔ（対照として）で免疫した。免疫アジュバントは、水酸化アルミニウムアジュバントであり、免疫用量は３μｇ／用量であり、免疫化の経路は大腿側方後部（ｌａｔｅｒａｌ ｈｉｎｄ ｔｈｉｇｈ）の筋肉内注射であり、免疫手順は以下の通りであった：追加免疫化を初回免疫化後２週間毎に実施し、免疫化を４回実施した。
８．２．２ 血清中の抗ＨＢｓ抗体力価の決定
８．２．２．１ 反応プレートの調製
例１−１．２に記載の方法に従って、反応プレートを調製し、被覆抗原はＣＨＯ細胞中で組換え発現されたＢ型肝炎表面抗原タンパク質（ＨＢｓＡｇ）であった。
８．２．２．２ 血清中の抗ＨＢｓ抗体力価のＥＬＩＳＡ
試料の希釈：マウス血清を２０％ウシ新生児血清を含有するＰＢＳ溶液で７つの勾配濃度、すなわち、１：１００、１：５００、１：２５００、１：１２５００、１：６２５００、１：３１２５００、１：１５６２５００に希釈した。
試料の反応：１００μＬの希釈された試料を被覆反応プレートのそれぞれのウェルに添加し、プレートを３７℃で３０ｍｉｎ、インキュベータ中に入れた。
酵素標識反応：試料の反応が終了した後、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴ（２０ｍＭ ＰＢ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で５回洗浄し、１００μＬのＧＡＭ−ＨＲＰ溶液をそれぞれのウェルに添加し、プレートを３７℃で３０ｍｉｎ、インキュベータ中に入れた。
発色反応：酵素標識反応の後、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴ溶液（２０ｍＭ ＰＢ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で５回洗浄し、５０μＬのＴＭＢ発色試薬（ＢＥＩＪＩＮＧ ＷＡＮＴＡＩ ＢＩＯＬＯＧＹ ＰＨＡＲＭＡＣＹ ＣＯ．，ＬＴＤにより提供）をそれぞれのウェルに添加し、プレートを３７℃で１５ｍｉｎ、インキュベータ中に入れた。
停止反応及び値の読取り：発色反応ステップが終了した後、５０μＬの停止バッファー（ＢＥＩＪＩＮＧ ＷＡＮＴＡＩ ＢＩＯＬＯＧＹ ＰＨＡＲＭＡＣＹ ＣＯ．，ＬＴＤにより提供）をＥＬＩＳＡプレートのそれぞれのウェルに添加し、それぞれのウェルについてＯＤ４５０／６３０値をＥＬＩＡＳＡを用いて読取った。
血清中の抗ＨＢｓＡｇ抗体力価の算出：０．２〜２．０の読取り値を有する試料の希釈係数を用いて回帰曲線をプロットし、読取り値、読取り値がバックグラウンド値の２倍である試料の希釈係数を算出し、その希釈係数を血清中の抗ＨＢｓＡｇ抗体力価として用いた。
８．２．３ 血清中の抗Ｃ１４９／ｍｕｔ抗体力価の決定
８．２．３．１ 反応プレートの調製
例１−１．２に記載の方法に従って、反応プレートを調製した。被覆のための抗原は融合担体タンパク質Ｃ１４９／ｍｕｔであった。
８．２．３．２ ＥＬＩＳＡによる血清中の抗Ｃ１４９／ｍｕｔ抗体力価の決定
例８．２．２．２に記載の方法に従って、試料の希釈、試料の反応、酵素標識反応、発色反応、停止反応及び値の読取りを実行し、血清中の抗Ｃ１４９／ｍｕｔ抗体力価を算出した。
８．２．４ エピトープペプチドを含む組換えタンパク質の免疫原性の分析
前記ステップを実行することにより、血清中の抗ＨＢｓＡｇ抗体力価及び抗Ｃ１４９／ｍｕｔ抗体力価が得られた。その結果を図８Ｂに示した。この結果は、エピトープペプチドＳＥＱ１、ＳＥＱ３、ＳＥＱ４、ＳＥＱ６、ＳＥＱ７を含む組換えタンパク質がＢＡＬＢ／Ｃマウスにおいて高力価の抗ＨＢｓＡｇを誘導するが、Ｃ１４９／ｍｕｔ単独では高力価の抗ＨＢｓＡｇを誘導することができないことを示していた。
（例９：マウス血液由来抗ＳＥＱ６ポリクローナル抗体の治療効果の評価）
９．１ マウス血液由来抗ＳＥＱ６ポリクローナル抗体の調製
９．１．１ マウスの免疫化
例８−８．２．１に記載の方法に従って、ＢＡＬＢ／Ｃマウスを、ＳＥＱ６を含む組換えタンパク質（Ｃ１４９−ＳＥＱ６）である免疫原で免疫した。
９．１．２ マウス血液由来抗ＳＥＱ６ポリクローナル抗体の精製
免疫手順が完了した後、マウスの血清中の抗ＨＢｓＡｇ抗体の力価は高レベルに達し、眼窩周囲静脈叢から数回、血液を採った。硫酸アンモニウム沈降及びプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーによる精製後、精製されたポリクローナル抗体が得られた。
９．２ マウス血液由来抗ＳＥＱ６ポリクローナル抗体の治療効果の評価
マウス血液由来抗ＳＥＱ６ポリクローナル抗体をＨＢＶトランスジェニックマウスの尾静脈に注入し、血清中のＨＢＶ ＤＮＡ及びＨＢｓＡｇの変化をモニタリングした。結果を図９に示した。この結果は、Ｃ１４９−ＳＥＱ６を用いるマウスの免疫化により得られたポリクローナル抗体が、ＨＢＶトランスジェニックマウスにおいてＨＢＶ ＤＮＡ及びＨＢｓＡｇレベルを有意に低下させ、ＨＢＶを消失させるのに有効であることを示していた。
（例１０：ＨＢＶトランスジェニックマウスの処置における組換えタンパク質の効果）
１０．１ マウスの免疫化
ＨＢＶトランスジェニックマウスモデルを用いて、例８で得られた前記５種の組換えタンパク質（Ｃ１４９−ＳＥＱ１、Ｃ１４９−ＳＥＱ３、Ｃ１４９−ＳＥＱ４、Ｃ１４９−ＳＥＱ６、Ｃ１４９−ＳＥＱ７）の治療効果を評価し、担体タンパク質Ｃ１４９／ｍｕｔを対照として用いた。免疫アジュバントは水酸化アルミニウムアジュバントであり、免疫用量は１２μｇ／用量であり、免疫化の経路は大腿側方後部の筋肉内注射であり、免疫手順は以下の通りであった：追加免疫化を初回免疫化の２週間後に実施し、次いで、追加免疫化を毎週実施した、すなわち、免疫化を０、２、３、４、５週で実施した、すなわち、免疫化を５回実施した。
１０．２ 血清中の抗体力価の決定
例８−８．２．２及び８．２．３に記載の方法に従って、抗ＨＢｓＡｇ及び抗Ｃ１４９／ｍｕｔの血清抗体力価を決定し、ウイルス学的指標である、マウスの血清中のＨＢＶ ＤＮＡ及びＨＢｓＡｇレベルをモニタリングした。
１０．３ 組換えタンパク質の治療効果に関する分析
結果を図１０に示した。この結果は、組換えタンパク質の免疫療法を受ける群において、マウスの血清中で抗ＨＢｓＡｇ及び抗Ｃ１４９／ｍｕｔが検出され、マウスの血清中のＨＢＶ ＤＮＡ及びＨＢｓＡｇレベルは異なる程度で減少することを示していた。それとは逆に、対照群においては、マウスの血清中で抗ＨＢｓＡｇは生成されず、血清中のＨＢＶ ＤＮＡ及びＨＢｓＡｇレベルは低下しなかった。この例は、本発明により同定されたエピトープ及びエピトープペプチドがＨＢＶ感染の処置のための有効な標的であることを示している。これらのエピトープ及びエピトープペプチドに基づいて生成された組換えタンパク質は、慢性ＨＢＶ感染を処置するための潜在能力を有する。特に、エピトープペプチドＳＥＱ１−ＳＥＱ７を含む組換えタンパク質をタンパク質ワクチンとして用いて、ＨＢＶトランスジェニックマウスにおけるＨＢＶに対する免疫寛容状態を変化させ、有効で特異的で治療的な抗ＨＢＶ免疫応答を誘導することができる。
（例１１：異なる担体タンパク質及びＳＥＱ６に基づく組換えタンパク質の構築及び評価）
１１．１ ３種の融合発現ベクターの構築
例６に記載の方法に従って、それぞれ、Ｃ１４９／ｍｕｔ（配列番号４３）、Ｃ１８３／ｍｕｔ（配列番号４４）、ＷＨＣ１４９／ｍｕｔ（配列番号４５）である３種の担体タンパク質を構築した。Ｃ１４９／ｍｕｔは、ＨＢＶコアタンパク質のＮ末端の１４９アミノ酸残基を操作することにより得られ、Ｃ１８３／ｍｕｔは完全長ＨＢＶコアタンパク質の１８３アミノ酸残基を操作することにより得られ、ＷＨＣ１４９／ｍｕｔはウッドチャック肝炎ウイルスコアタンパク質のＮ末端の１４９アミノ酸残基を操作することにより得られた（操作方法は６．１に記載された）。ＳＥＱ６を３種のベクターにライゲートして、それぞれ組換えタンパク質Ｃ１４９−ＳＥＱ６、Ｃ１８３−ＳＥＱ６、及びＷＨＣ１４９−ＳＥＱ６を得た。
１１．２ ３種の異なる担体組換えＳＥＱ６ワクチンの発現及び精製
６．２に記載の方法に従って、３種の組換えタンパク質（Ｃ１４９−ＳＥＱ６、Ｃ１８３−ＳＥＱ６、ＷＨＣ１４９−ＳＥＱ６）を発現させ、精製した。得られた対象のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、タンパク質粒子の集合状態を透過型電子顕微鏡により同定した。結果を図１１Ａに示した。この結果は、得られた３種の組換えタンパク質が９５％を超える純度を有し、均一なサイズのタンパク質粒子に集合させることができることを示していた。
１１．３ ＨＢＶトランスジェニックマウスの処置における前記３種の組換えタンパク質の効果
ＨＢＶトランスジェニックマウスモデルを用いて、タンパク質ワクチンとしての１１．２で得られた前記３種の組換えタンパク質の治療効果を評価した。免疫アジュバントは水酸化アルミニウムアジュバントであり、免疫用量は１２μｇ／用量であり、免疫手順は以下の通りであった：追加免疫化を初回免疫化の２週間後に実施し、次いで、追加免疫化を毎週実施した、すなわち、免疫化を０、２、３、４、５週で実施した、すなわち、免疫化を５回実施した。
例８−８．２．２及び８．２．３に記載の方法に従って、抗ＨＢｓＡｇ及び抗担体の血清抗体力価を決定し、ウイルス学的指標である、マウスの血清中のＨＢＶ ＤＮＡ及びＨＢｓＡｇレベルをモニタリングした。
結果を図１０に示した。この結果は、組換えタンパク質の免疫療法を受ける群において、マウスの血清中で抗ＨＢｓＡｇ及び抗担体抗体が検出され、マウスの血清中のＨＢＶ ＤＮＡ及びＨＢｓＡｇレベルは異なる程度で低下することを示していた。それとは逆に、対照群においては、マウスの血清中で抗ＨＢｓＡｇは生成されず、血清中のＨＢＶ ＤＮＡ及びＨＢｓＡｇレベルは低下しなかった。この例は、異なる担体タンパク質を用いて本発明により同定されたエピトープ及びエピトープペプチドを提示することができ、それから生成された組換えタンパク質は慢性ＨＢＶ感染を処置するための潜在能力を有することを示していた。そのような組換えタンパク質をタンパク質ワクチンとして用いて、ＨＢＶトランスジェニックマウスにおいてＨＢＶに対する免疫寛容状態を変化させ、有効で特異的で治療的な抗ＨＢＶ免疫応答を誘導することができる。
同様に、Ｃ１４９／ｍｕｔ（配列番号４３）、Ｃ１８３／ｍｕｔ（配列番号４４）又はＷＨＣ１４９／ｍｕｔ（配列番号４５）、並びにＳＥＱ１〜５、７及び１０に基づいて、組換えタンパク質Ｃ１４９−ＳＥＱ１〜５、７、１０；Ｃ１８３−ＳＥＱ１〜５、７、１０；及びＷＨＣ１４９−ＳＥＱ１〜５、７、１０もまた設計及び構築された。これらの組換えタンパク質のアミノ酸配列を、表１に示した。
（例１２：ＣＲＭ１９７又はその断片に基づく組換えタンパク質の構築及び発現）
この例においては、ＣＲＭ１９７又はその断片及びＳＥＱ６に基づいて、一連の組換えタンパク質を設計及び構築した。ＣＲＭ１９７のアミノ酸配列は配列番号４２に記載されており、５３５アミノ酸からなる。ＣＲＭ１９７の例示的断片はＣＲＭ３８９であり、ＣＲＭ１９７のＮ末端の３８９アミノ酸からなる。ＣＲＭ１９７の別の例示的断片はＣＲＭＡであり、ＣＲＭ１９７のＮ末端の１９０アミノ酸からなる。
図１２に示されるように、ＳＥＱ６をリンカーを介してＣＲＭ１９７、ＣＲＭ３８９又はＣＲＭＡのＣ末端に連結し、ここでリンカーのアミノ酸配列はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４６）であった。リンカーの主な機能は、連結した２つのペプチドの相対的に非依存的な折畳みを促進することによって、高い生物学的活性を得ることであった。かくして得られた組換えタンパク質を、それぞれ、ＣＲＭ１９７−ＳＥＱ６、ＣＲＭ３８９−ＳＥＱ６及びＣＲＭＡ−ＳＥＱ６と命名した。
ＣＲＭ１９７−ＳＥＱ６、ＣＲＭ３８９−ＳＥＱ６及びＣＲＭＡ−ＳＥＱ６をコードする対象の遺伝子を構築し、対象の遺伝子をｐＴＯ−Ｔ７原核発現ベクター（Ｌｕｏ Ｗｅｎｘｉｎら、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０００、１６：５３〜５７頁）に別々にライゲートし、ＥＲ２５６６細菌中に形質転換した；プラスミドを抽出し、ＮｄｅＩ／ＳａｌＩ酵素消化による同定後に、対象の遺伝子断片を含む陽性発現クローンを得た。
３種の組換えタンパク質ＣＲＭ１９７−ＳＥＱ６、ＣＲＭ３８９−ＳＥＱ６及びＣＲＭＡ−ＳＥＱ６を、例６−６．２に記載の方法に従って発現させ、精製し、例１１に記載の方法により前記３種の組換えタンパク質の治療効果を評価した。
同様に、ＣＲＭ１９７又はその断片並びにＳＥＱ１〜５、７及び１０に基づいて、組換えタンパク質ＣＲＭ１９７−ＳＥＱ１〜５、７、１０；ＣＲＭ３８９−ＳＥＱ１〜５、７、１０；及びＣＲＭＡ−ＳＥＱ１〜５、７、１０を設計及び構築した。これらの組換えタンパク質のアミノ酸配列を表１に示した。
本発明の特定の実施形態を詳細に説明してきたが、当業者であれば、全ての開示された教示に従って、一般的に記載される本発明の精神又は範囲から逸脱することなく、様々な改変及び変更を加えることができ、そのような改変及び変更が本発明の範囲内にあることを理解できる。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲及びその任意の等価物によって与えられる。

Claims (26)

  1. ＨＢｓＡｇタンパク質の位置１１９から１２５までのアミノ酸残基からなる単離されたエピトープペプチド、又はその突然変異体であって、突然変異体が１個又は数個（例えば、１、２、３又は４個）のアミノ酸残基の保存的置換によってのみエピトープペプチドと異なり、エピトープペプチドの生物学的機能を保持し、
    例えば、ＨＢｓＡｇタンパク質の位置１１９から１２５までのアミノ酸残基が配列番号１に示され、
    例えば、突然変異体のアミノ酸配列が配列番号２に示される、上記単離されたエピトープペプチド、又はその突然変異体。
  2. ＨＢｓＡｇタンパク質の位置１１３から１３５までのアミノ酸残基からなる単離されたエピトープペプチド、又はその突然変異体であって、突然変異体が１個又は数個（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、又は９個）のアミノ酸残基の保存的置換によってのみエピトープペプチドと異なり、エピトープペプチドの生物学的機能を保持し、
    例えば、ＨＢｓＡｇタンパク質の位置１１３から１３５までのアミノ酸残基が配列番号６に示される、上記単離されたエピトープペプチド、又はその突然変異体。
  3. ＨＢｓＡｇタンパク質の４〜３８個（例えば、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５又は４個）の連続するアミノ酸残基からなり、ＨＢｓＡｇタンパク質の位置１２１から１２４までのアミノ酸残基を含む単離されたエピトープペプチド、又はその突然変異体であって、突然変異体が１個又は数個のアミノ酸残基の保存的置換によってのみエピトープペプチドと異なり、エピトープペプチドの生物学的機能を保持し、
    例えば、ＨＢｓＡｇタンパク質の位置１２１から１２４までのアミノ酸残基が配列番号１０に示され、
    例えば、エピトープペプチド又はその突然変異体が配列番号１〜７及び１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、上記単離されたエピトープペプチド、又はその突然変異体。
  4. 請求項１から３までのいずれか一項に記載の単離されたエピトープペプチド又はその突然変異体と、担体タンパク質とを含む組換えタンパク質であって、組換えタンパク質が天然に存在するタンパク質又はその断片ではなく、
    例えば、エピトープペプチド又はその突然変異体が場合によりリンカー（剛性又は可撓性リンカー、例えば、（ＧＧＧＧＳ）３）を介して担体タンパク質に連結し、
    例えば、担体タンパク質がＣＲＭ１９７タンパク質又はその断片、ＨＢｃＡｇ及びＷＨｃＡｇからなる群から選択される、上記組換えタンパク質。
  5. 担体タンパク質がＣＲＭ１９７タンパク質又はその断片であり、エピトープペプチド又はその突然変異体が場合によりリンカーを介してＣＲＭ１９７タンパク質又はその断片のＮ末端又はＣ末端に連結し、
    例えば、ＣＲＭ１９７タンパク質の断片がＣＲＭ１９７のａａ１〜１９０、例えば、ＣＲＭ１９７のａａ１〜３８９を含み、好ましくは、ＣＲＭ１９７タンパク質の断片がＣＲＭ１９７のａａ１〜１９０又はａａ１〜３８９からなり、
    例えば、リンカーのアミノ酸配列が配列番号４６に示され、
    例えば、組換えタンパク質が配列番号７４〜９７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項４に記載の組換えタンパク質。
  6. 担体タンパク質がＨＢｃＡｇ又はその断片であり、ＨＢｃＡｇの位置７９から８１までのアミノ酸がエピトープペプチドで置き換えられ、
    場合により、エピトープペプチドがリンカーを介してＨＢｃＡｇ又はその断片に連結し、
    例えば、ＨＢｃＡｇの断片がＨＢｃＡｇのａａ１〜１４９を含むか、又はそれからなり、
    例えば、組換えタンパク質が配列番号４７〜５３、５６、及び５８〜６５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項４に記載の組換えタンパク質。
  7. 担体タンパク質がＷＨｃＡｇ又はその断片であり、ＷＨｃＡｇの位置７９から８１までのアミノ酸がエピトープペプチドで置き換えられ、
    場合により、エピトープペプチドがリンカーを介してＷＨｃＡｇ又はその断片に連結し、
    例えば、ＷＨｃＡｇの断片がＷＨｃＡｇのａａ１〜１４９を含むか、又はそれからなり、
    例えば、組換えタンパク質が配列番号６６〜７３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項４に記載の組換えタンパク質。
  8. 請求項１から３までのいずれか一項に記載のエピトープペプチド若しくはその突然変異体、又は請求項４から７までのいずれか一項に記載の組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
  9. 請求項８に記載の単離された核酸分子を含むベクター。
  10. 請求項８に記載の核酸分子又は請求項９に記載のベクターを含む宿主細胞。
  11. 請求項１から３までのいずれか一項に記載のエピトープペプチド若しくはその突然変異体又は請求項４から７までのいずれか一項に記載の組換えタンパク質を調製するための方法であって、好適な条件下で請求項１０に記載の宿主細胞を培養することと、細胞培養物からエピトープペプチド若しくはその突然変異体又は組換えタンパク質を回収することとを含む、上記方法。
  12. 請求項１から３までのいずれか一項に記載のエピトープペプチド若しくはその突然変異体又は請求項４から７までのいずれか一項に記載の組換えタンパク質と、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤（例えば、アジュバント）とを含むタンパク質ワクチンであって、
    例えば、タンパク質ワクチンが１つ又は複数の前記エピトープペプチドを含み、前記エピトープペプチドが分離又は直列していてもよく、改変されていても又は改変されていなくてもよく、別のタンパク質にカップリングされていても、又はそうでなくてもよい、上記タンパク質ワクチン。
  13. 対象におけるＨＢＶ感染又はＨＢＶ感染と関連する疾患（例えば、Ｂ型肝炎）を処置するためのタンパク質ワクチンの製造における、請求項１から３までのいずれか一項に記載のエピトープペプチド若しくはその突然変異体又は請求項４から７までのいずれか一項に記載の組換えタンパク質の使用。
  14. 請求項８に記載の核酸分子又は請求項９に記載のベクターと、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤（例えば、アジュバント）とを含む遺伝子ワクチンであって、
    例えば、遺伝子ワクチンがＤＮＡ又はＲＮＡを含み、
    好ましくは、ＤＮＡ又はＲＮＡが裸であるか、又は送達及び／若しくは保護機能を有する外殻中に封入されていてもよく、
    好ましくは、外殻がアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルスなどの外殻であってもよく、又は化学的方法により合成され、類似する機能を発揮することができる別の材料であってもよい、上記遺伝子ワクチン。
  15. 対象におけるＨＢＶ感染又はＨＢＶ感染と関連する疾患（例えば、Ｂ型肝炎）を処置するための遺伝子ワクチンの製造における、請求項８に記載の核酸分子又は請求項９に記載のベクターの使用。
  16. 請求項１から３までのいずれか一項に記載のエピトープペプチド又はその突然変異体、請求項４から７までのいずれか一項に記載の組換えタンパク質、請求項８に記載の単離された核酸分子又は請求項９に記載のベクターと、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤（例えば、アジュバント）とを含む医薬組成物であって、
    例えば、前記医薬組成物が１つ又は複数の前記エピトープペプチドを含み、前記エピトープペプチドが分離又は直列していてもよく、改変されていても又は改変されていなくてもよく、別のタンパク質にカップリングされていても、又はそうでなくてもよい、上記医薬組成物。
  17. 対象におけるＨＢＶ ＤＮＡ及び／又はＨＢｓＡｇの血清レベルを低下させるための医薬組成物の製造における、請求項１から３までのいずれか一項に記載のエピトープペプチド又はその突然変異体、請求項４から７までのいずれか一項に記載の組換えタンパク質、請求項８に記載の核酸分子又は請求項９に記載のベクターの使用。
  18. モノクローナル抗体及びその抗原結合断片であって、モノクローナル抗体が請求項１から３までのいずれか一項に記載のエピトープペプチドに特異的に結合することができ、
    例えば、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片がＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、相補性決定領域断片、一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、マウス抗体、ウサギ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、キメラ抗体（例えば、ヒトマウスキメラ抗体）、又は二重特異性若しくは多重特異性抗体からなる群から選択され、
    例えば、モノクローナル抗体が約１０−５Ｍ未満、例えば、約１０−６Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満又はそれ以下のＫＤでエピトープペプチド又はＨＢｓＡｇタンパク質に結合し、
    例えば、モノクローナル抗体が非ＣＤＲ領域を含み、非ＣＤＲ領域がマウス種以外の種由来であり、例えば、ヒト抗体由来であり、
    例えば、モノクローナル抗体が対象におけるＨＢＶ ＤＮＡ及び／又はＨＢｓＡｇの血清レベルを低下させることができ、
    例えば、モノクローナル抗体が、以下のモノクローナル抗体：
    １）Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ）に、ＣＣＴＣＣ寄託番号Ｃ２０１２７０で寄託されているハイブリドーマ細胞系ＨＢｓ−Ｅ６Ｆ６により生成されるモノクローナル抗体；
    ２）Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ）に、ＣＣＴＣＣ寄託番号Ｃ２０１２７１で寄託されているハイブリドーマ細胞系ＨＢｓ−Ｅ７Ｇ１１により生成されるモノクローナル抗体；
    ３）Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ）に、ＣＣＴＣＣ寄託番号Ｃ２０１２７２で寄託されているハイブリドーマ細胞系ＨＢｓ−Ｇ１２Ｆ５により生成されるモノクローナル抗体；及び
    ４）Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ）に、ＣＣＴＣＣ寄託番号Ｃ２０１２７３で寄託されているハイブリドーマ細胞系ＨＢｓ−Ｅ１３Ｃ５により生成されるモノクローナル抗体
    に由来するか、又はそれから選択される、上記モノクローナル抗体及びその抗原結合断片。
  19. 請求項１から３までのいずれか一項に記載のエピトープペプチド又はＨＢｓＡｇタンパク質の、ハイブリドーマ細胞系ＨＢｓ−Ｅ６Ｆ６、ＨＢｓ−Ｅ７Ｇ１１、ＨＢｓ−Ｇ１２Ｆ５又はＨＢｓ−Ｅ１３Ｃ５により生成される抗体への結合を少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、又は好ましくは少なくとも９９％遮断することができるモノクローナル抗体及びその抗原結合断片であって、ハイブリドーマ細胞系ＨＢｓ−Ｅ６Ｆ６、ＨＢｓ−Ｅ７Ｇ１１、ＨＢｓ−Ｇ１２Ｆ５又はＨＢｓ−Ｅ１３Ｃ５が、それぞれ、Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ）に、ＣＣＴＣＣ寄託番号Ｃ２０１２７０、Ｃ２０１２７１、Ｃ２０１２７２、及びＣ２０１２７３で寄託されている、上記モノクローナル抗体及びその抗原結合断片。
  20. １）Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ）に、ＣＣＴＣＣ寄託番号Ｃ２０１２７０で寄託されているハイブリドーマ細胞系ＨＢｓ−Ｅ６Ｆ６；
    ２）Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ）に、ＣＣＴＣＣ寄託番号Ｃ２０１２７１で寄託されているハイブリドーマ細胞系ＨＢｓ−Ｅ７Ｇ１１；
    ３）Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ）に、ＣＣＴＣＣ寄託番号Ｃ２０１２７２で寄託されているハイブリドーマ細胞系ＨＢｓ−Ｇ１２Ｆ５；及び
    ４）Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ）に、ＣＣＴＣＣ寄託番号Ｃ２０１２７３で寄託されているハイブリドーマ細胞系ＨＢｓ−Ｅ１３Ｃ５
    から選択されるハイブリドーマ細胞系。
  21. 請求項１８又は１９に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含むキットであって、
    例えば、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片が検出可能なマーカー、例えば、放射性同位体、蛍光物質、発光物質、発色物質及び酵素をさらに含み、
    例えば、キットがモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を特異的に認識する第２の抗体をさらに含み、
    場合により、第２の抗体が検出可能なマーカー、例えば、放射性同位体、蛍光物質、発光物質、発色物質及び酵素をさらに含む、上記キット。
  22. 試料中のＨＢｓＡｇタンパク質の存在又はレベルを検出するための方法であって、請求項１８又は１９に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を用いることを含み、
    例えば、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片が検出可能なマーカー、例えば、放射性同位体、蛍光物質、発光物質、発色物質及び酵素をさらに含み、
    例えば、キットがモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を特異的に認識する第２の抗体をさらに含み、
    場合により、第２の抗体が検出可能なマーカー、例えば、放射性同位体、蛍光物質、発光物質、発色物質及び酵素をさらに含む、上記方法。
  23. 試料中のＨＢｓＡｇタンパク質の存在若しくはレベルを検出するため、又は対象がＨＢＶに感染しているかどうかを診断するためのキットの製造における、請求項１８又は１９に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片の使用。
  24. 請求項１８又は１９に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片と、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤とを含む医薬組成物。
  25. 対象におけるＨＢＶ感染又はＨＢＶ感染と関連する疾患（例えば、Ｂ型肝炎）を防止又は処置するための医薬組成物の製造における、請求項１８又は１９に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片の使用。
  26. 対象におけるＨＢＶ ＤＮＡ及び／又はＨＢｓＡｇの血清レベルを低下させるための医薬品の製造における、請求項１８又は１９に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片の使用。
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