CN111879932B - 乙型肝炎病毒(hbv)特异性b细胞表位检测方法及其应用 - Google Patents

乙型肝炎病毒(hbv)特异性b细胞表位检测方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了乙型肝炎病毒(HBV)特异性B细胞检测方法及其应用。本方法首次利用HBV病毒蛋白重叠多肽对HBV感染者血清抗体识别的HBV蛋白B细胞线性表位进行检测，克服了现有技术中无法检测HBV特异性B细胞表位的技术缺陷；本发明使用的单肽检测浓度仅需0.68μg/mL，成本低，操作简单，快速，检测结果相较与现有技术更加准确，尤其是对于常规方法无法检测的慢性HBV感染，本发明在能完全检测到的情况下，还能对表位做出准确的分析，具有极高的市场价值。

Description

乙型肝炎病毒(HBV)特异性B细胞表位检测方法及其应用
技术领域
本发明涉及细胞检测领域，具体涉及乙型肝炎病毒(HBV)特异性B细胞表位检测方法及其应用。
背景技术
HBV感染可导致严重肝病，包括急性和慢性乙型肝炎、肝硬化、肝癌。1990年至2015年之间，世界肝癌的发病率增加了75％，其中42％为HBV继发的相关肝细胞癌(HCC)。最新统计表明，病毒性肝炎已成为全球发病率和死亡率的第七大诱因，每年共计造成全球145万人死亡，其死亡率远超艾滋病毒、疟疾和结核病。
在HBV感染过程中，适应性免疫应答决定了HBV感染的预后。既往研究多聚焦于HBV特异性T细胞免疫应答方面，对HBV特异性B细胞的作用机制研究较少。
目前，现有技术中对于B细胞表位研究方法的方法主要有蛋白质化学技术、分子生物学技术、噬菌体表达肽库法、预测法、X射线晶体衍射以及NMR(核磁共振)技术等。
蛋白质化学技术，主要通过化学试剂或酶处理抗原，将抗原分解成多种小片段，通过分析这些抗原小片段与抗体或者抗血清的作用判定抗原-抗体相互作用的位置。或采用水解抗原-抗体复合物法(即蛋白质足迹分析，protein footprinting)。但蛋白质化学技术也存在着很多缺陷，如析抗原表位过程复杂，分抗原抗体结合条件、酶解条件、酶解片段大小、解离后的片段能否有效分离等因素容易对分析结果产生影响。
分子生物学技术的技术缺陷在于其要求对蛋白质抗原的氨基酸序列或者其基因序列较为清楚，需要不断合成表达新的蛋白来验证，工作量大。
噬菌体表达肽库法需要利用基因工程技术进行多轮构建噬菌体，技术、设备要求高，工作量大、耗时长。而且，表达肽库技术筛选的抗原表位为模拟表位(minotope)，其有可能与实际抗原的氨基酸序列差距很大；其只有模拟表位与抗原氨基酸序列高度同源或者相似度很高，并且其三维构象或者在抗原分子三维结构中的位置一致时才可以称作抗原表位。此外，需要考虑的一点是，表达肽库法受肽库容量大小的限制；一般表达的肽段长度为6到8个氨基酸。
现有技术中对于预测法分析蛋白抗原B细胞表位效率不高，预测准确度一般小于50％。
X射线晶体衍射需要大量高纯度蛋白质形成的晶体；而现有技术中还无法对所有蛋白质进行分离纯化，其中部分蛋白质无法获得有效的结晶，抗原抗体复合物也被证明较难形成结晶。而且，X射线晶体衍射需要特殊仪器设备，成本较高。
NMR(核磁共振)技术对样品的需要量大且不能分析分子量很大的复合物(大于40kD)。另外，需要特殊仪器设备，成本较高。
因此，为了解决上述的技术缺陷，开发一种简单、可行的HBV特异性B细胞线性表位测定方法，对于HBV特异性T细胞免疫应答方面的研究，以及乙型肝炎病毒的防治与治疗，都具有极为重要的研究价值。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种HBV特异性B细胞表位的检测方法；
本发明的另一目的在于提供上述检测方法在HBV特异性B细胞表位肽库筛选与构建中的应用；
本发明的另一目的在于提供上述的检测方法在HBV诊断中的应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供：
一种HBV特异性B细胞表位的检测方法，该检测方法包括如下步骤：
采集血清样品；
用检测肽库包被液对容器包被，洗涤，加入封闭液封闭；
去除封闭液，加入采集的血清样品，孵育；
洗涤，加入山羊抗人IgG-biotin抗体，孵育；
洗涤，加入显色剂，孵育，加入显示终止液，根据反应结果，定性HBV特异性B细胞表位；
其中，所述检测肽库包括构成同一种HBV蛋白的单肽中的一种或多种。
B细胞主要通过产生抗HBV抗体发挥作用，还可以通过提呈HBV抗原和分泌细胞因子调节其他免疫细胞的状态和功能来抗病毒。HBV感染人体后，可在人体产生不同的HBV病毒蛋白，包括表面抗原(S)、E抗原(E)、核心抗原(C)等，这些病毒蛋白抗原都可以诱导机体产生相应的抗体，不同抗体提示HBV感染者的不同疾病状态。血浆中表面(S)抗体阳性提示疾病缓解和病毒控制，而高滴度的核心蛋白(C)抗体往往提示肝损伤。表面蛋白preS1(前S1)区，尤其是aa2-48、loop区(又称α-deerminant)以及aa104-163，诱导的抗体具有中和作用。针对不同氨基酸片段(即表位)的抗体抗HBV感染的作用不一。抗体产生需要B细胞受体(BCR)对抗原的有效识别。抗原与BCR相互识别、发生作用的结构叫做抗原决定簇，又称表位。表位是抗原与抗体发生作用的主要部位，是抗体识别抗原的结构基础。
本发明通过对表达特定抗原的重叠序列的一组重组蛋白进行抗体结合分析，从而避免了现有技术的复杂性。本发明可以通过已知关联序列不断表达更小的蛋白将抗体识别的区域定位于较小的范围内，甚至到数十个氨基酸残基组成的多肽。
本发明的特异性B细胞线性表位的检测体系并不是通用检测体系，由于不同实验对象对不同病原体的特异性差异，使同样的特异性B细胞线性表位的检测体系并不能在不同物种或不同病原体的检测中同样有效。
进一步地，上述检测方法中设置有阴性对照；上述阴性对照的封闭液为HIV P29蛋白包被液10-20μg/mL。
进一步地，通过上述显色反应后的光密度值判断上述样品的反应结果；
若显色反应后的样品光密度值为阴性对照中的光密度值的两倍或以上，则样品中含有检测肽库中的HBV蛋白。
进一步地，上述封闭液为山羊血清。当然，可以根据实际需求，合理的用本领域中其他可替代性的封闭液。
发明人探究了不同封闭剂的封闭效果，包括小牛血清、胎牛血清、脱脂牛奶、山羊血清等，发现山羊血清封闭效果最佳；同时探索了不同公司的抗人IgG-biotin抗体，发现Bethyl公司，货号A80-104P的抗体效果最佳。
进一步地，上述HBV蛋白包括S蛋白、C蛋白、P蛋白、X蛋白。
进一步地，上述检测肽库中的单肽浓度范围为0.34-1.37μg/mL。
本发明的第二个方面，提供：
上述检测方法在HBV特异性B细胞表位肽库筛选与构建中的应用。
发明人发现，本发明的检测方法同样具有识别特定肽段的特异性，因此，可以用来进行特定肽库的筛选与构建。
本发明的第三个方面，提供：
上述的检测方法在HBV诊断中的应用。
其中该检测方法不用于疾病的诊断与治疗。
进一步地，上述HBV包括不同状态的慢性HBV感染。
更进一步地，上述慢性HBV感染的不同状态包括免疫耐受、免疫激活、免疫清除和乙肝表面抗原清除阶段。
本发明的有益效果是：
本方法首次利用HBV病毒蛋白重叠多肽对HBV感染者血清抗体识别的HBV蛋白B细胞线性表位进行检测，检测用的单肽浓度仅需0.68μg/mL，操作简单，快速，检测结果相较与现有技术更加准确，尤其是对于常规方法无法检测的慢性HBV感染，本发明在能完全检测到的情况下，还能对表位做出准确的分析，为HBV的后续治疗以及未来研究带来了新的方向与参考。
附图说明
图1为本发明的表位筛选实验方法示意图(A为表位ELISA筛选法和表位抑制实验的步骤说明；B为不同包被液的OD检测值，CHB1代表编号为1的慢性HBV感染者，HC83代表编号83的健康对照；C为3例分别对S蛋白的S29、S55和S76表位肽有强阳性反应的患者血清的检测结果)，其中sAg表示S蛋白、positive表示S蛋白表位肽、irrelevant表示无关肽(即非S蛋白表位肽)和con表示培养基(空白对照)；
图2为本发明的肽库构成和检测结果(A为7条单肽的肽库构成；B为肽库包被浓度与OD值的关系；C为10条单肽的肽库构成；D为肽库包被浓度与OD值的关系)；
图3为10例接受完整乙肝疫苗接种疗程的健康人表位分布特点；
图4为68例不同临床状态的慢性HBV感染患者表位分布特点。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
山羊血清购自Bioss，货号为G-0005；
山羊抗人IgG-biotin抗体购自Bethyl，货号为A80-104P；
显色A液和B液购自北京万泰，其中A液含过氧化物，不低于0.3g/L，B液含四基联苯胺，不低于0.2g/L；
显色终止液购自北京万泰，为不高于2mol/L的硫酸。
本发明中所使用的S蛋白购自Sigma。
实施例1 HBV特异性B细胞表位检测方法
本发明的检测方法包括以下步骤：
(1)采集血清样品
收集促凝血各10ml，3000rpm离心10min后吸取上清部分，然后再次3000rpm离心10min。同样吸取上清后分装至1.5ml ep管内。取200μL用于后续步骤。
(2)在ELISA板加入100μL/孔的检测肽库包被液(10μg/mL)，阴性孔加入HIV P29蛋白包被液(10μg/mL)，4℃包被过夜。用含有0.05％吐温20的PBS溶液(磷酸缓冲盐溶液)洗板3次后，加入100μL/孔稀释后的山羊血清(1:20倍稀释)，常温封闭1小时。甩去封闭液，加入100μL/孔稀释后的样品血清(1:100倍稀释)，4℃孵育24小时。用洗液洗板5次后，加入稀释后的山羊抗人IgG-biotin抗体(1:30000倍稀释)，37℃孵育1小时。用洗液洗板7次后，各加入50μL显色A液和B液，避光孵育20min后，各加入50μL显色终止液。用酶标仪读取OD值。
检测时设置双孔，若双孔OD值均大于背景2倍以上，则确定为阳性孔，说明样品中含有该检测肽库中的蛋白重叠肽。
实施例2特异性检测
根据线性表位ELISA筛选实验流程(图1A)筛选部分健康人S蛋白B细胞线性表位后，选取3例对S蛋白表位有强阳性反应的患者血清(高OD值)，用S蛋白、S蛋白表位肽(positive)、无关肽(irrelevant，即非S蛋白表位肽)和培养基(con)与该健康人血清(血清1:100倍稀释)预先反应0.5h。进行表位抑制实验(图1A)以验证此方法特异性。
结果如图1B和C所示，各阳性肽与血清预先反应后，OD值下降，而血清与S蛋白或无关肽或培养基预先反应后的OD值没有明显下降(图1B)。证明此实验方法具有识别特定肽段的特异性。
实施例3混合肽库表位的筛选与识别
本发明中的检测方法可以应用于识别特定肽段的特异性。
本实施例以HBV病毒S蛋白单肽为例，但需要理解的是，本发明并不仅限于HBV病毒S蛋白单肽的筛选与识别。
(1)采集血清样品
收集2例HBV感染者促凝血各10ml，3000rpm离心10min后吸取上清部分，然后再次3000rpm离心10min。同样吸取上清后分装至1.5ml ep管内。取200μL用于后续步骤。
(2)肽库浓度探索
将每相邻7或10条单肽混合为一个肽库(图2A和C)，探索使用肽库包板时每条单肽所需浓度。
结果发现，使用肽库包板后，肽库包板浓度越低，原阳性表位OD值越高(图2B)。在此基础上，继续降低10条单肽构成的混合肽库包板浓度，可以发现，随着肽库内每条单肽浓度降低，存在阳性表位的肽库孔实验检测到的OD值升高，在单肽浓度为0.68μg/mL时，OD值达到高峰，继续降低包板浓度OD值会重新下降(图2D)。证明本发明在一定条件下也适用筛选肽库，但如果血清中不存在对肽库内某条或某几条单肽的强阳性抗体时，结果可能存在假阴性。
实施例4验证试验
(1)采集血清样品
收集68例HBV感染者促凝血各10ml，3000rpm离心10min后吸取上清部分后再次3000rpm离心10min。同样吸取上清后分装至1.5ml ep管。取200μL用于后续实验。
(2)在ELISA板中加入100μL/孔的S蛋白单肽(98条单肽)包被液体(10μg/mL)，阴性孔加入HIV P29蛋白包被液(10μg/mL)。4℃包被过夜。用含有0.05％吐温20的PBS溶液(磷酸缓冲盐溶液)洗板3次后，加入100μL/孔稀释后的山羊血清(1:20倍稀释)，常温封闭1小时。甩去封闭液，加入100μL/孔稀释后的待检测患者血清(1:100倍稀释)，4℃孵育24小时。用洗液洗板5次后，加入稀释后的山羊抗人IgG-biotin抗体(1:30000倍稀释)，37℃孵育1小时。用洗液洗板7次后，各加入50μL显色A液和B液，避光孵育20min后，各加入50μL显色终止液。用酶标仪读取OD值。设置双孔。
结果发现，双孔OD值均大于背景2倍以上，可以确定为阳性孔，说明所检测样品中存在有HBV特异性B细胞表位。实施例5临床案例
纳入10例接收过乙肝疫苗完整3针接种流程健康志愿者，留取血清进行B细胞线性表位筛选实验。
试验步骤如实施例1所示。
结果可见，本实验方法可以清楚检测到健康志愿者血清阳性表位。健康志愿者表位个数较少，分布范围较小(图3)。
实施例6对慢性HBV感染患者的检测效果
使用雅培或罗氏定量检测等常用的临床检测手段为对照。操作步骤采用本领域常规操作，严格按照厂商说明书进行。
对慢性HBV感染患者按照本领域常规方式进行临床状态划分，具体如下表所示：
表1慢性HBV感染患者临床状态指标
Figure BDA0002555836200000061
Figure BDA0002555836200000071
纳入不同临床状态的慢性HBV感染患者(IT免疫耐受、IA免疫激活、IC免疫清除)和HBsAg清除患者(SB组)进行表位筛选实验。
结果发现，雅培或罗氏定量检测均检测不到慢性HBV感染患者体内HBsAg特异性抗体(HBsAb)，而本发明可以检测到慢性HBV感染患者体内针对HBsAg不同表位的特异性抗体，同时可见慢性HBV感染患者表位个数更多，且表位分布较健康人广(图4)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.HBV特异性B细胞表位的检测方法在HBV特异性B细胞表位肽库筛选与构建中的应用；
所述检测方法包括如下步骤：
采集血清样品；
用检测肽库包被液对容器包被，洗涤，加入封闭液封闭；
去除封闭液，加入采集的血清样品，孵育；
洗涤，加入山羊抗人IgG-biotin抗体，孵育；
洗涤，加入显色剂，孵育，加入显示终止液，根据反应结果，定性HBV特异性B细胞表位；
其中，所述检测肽库为构成HBV病毒S蛋白的重叠多肽的溶液；
通过所述显色反应后的光密度值判断所述样品的反应结果；
若显色反应后的样品光密度值为阴性对照中的光密度值的两倍或以上，则样品中含有检测肽库中的HBV蛋白；
所述HBV为免疫耐受、免疫激活、免疫清除和乙肝表面抗原清除阶段的慢性HBV感染；
所述检测肽库中的HBV病毒蛋白重叠多肽浓度范围为0.34-1.37μg/mL。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测方法中设置有阴性对照；所述阴性对照的封闭液为HIV P29蛋白包被液10-20μg/mL。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述封闭液为山羊血清。
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