CN114729371B - 能够抑制乙型肝炎病毒(hbv)对人肝细胞的感染的与人ntcp结合的抗体 - Google Patents

Abstract

本发明提供能够抑制乙型肝炎病毒(HBV)粒子对人肝细胞的感染的、与NTCP结合的抗体。另外，本发明提供能够抑制乙型肝炎病毒(HBV)粒子对人肝细胞的感染的、与NTCP结合且降低了NTCP对胆汁酸转运的影响的抗体。

Description

能够抑制乙型肝炎病毒(HBV)对人肝细胞的感染的与人NTCP 结合的抗体

技术领域

本发明涉及能够抑制乙型肝炎病毒(HBV)对人肝细胞的感染的与人牛磺胆酸钠共转运多肽(sodium taurocholate cotransporting polypeptide或NTCP)结合的抗体。另外，本发明涉及能够抑制乙型肝炎病毒(HBV)对人肝细胞的感染的、与人NTCP结合且降低了NTCP对胆汁酸转运的影响的抗体。

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)在人体中建立持续性感染的肝脏指向性的病毒。HBV感染时的年龄在慢性化风险的确定中极为重要。该风险在不满1岁的感染中为90％以上，在1～5岁的感染中为30％，在成人中为0～2％。因此，慢性HBV感染症大多是通过分娩时的母婴传播获得，或者在幼儿期和儿童期获得。而且，对儿童的感染可由其它HBV阳性的近亲属产生。

根据2002年的世界卫生组织(WHO)的推算，乙型肝炎病毒的感染者在全世界为20亿人，乙型肝炎病毒的持续感染者为3.5亿人。病毒感染者大多会恢复，但是～10％的感染者不能清除病毒。HBV感染会引起重症肝衰竭、慢性肝炎、肝硬化和肝癌等各种肝脏疾病。

乙型肝炎病毒介由病毒L蛋白的preS1结构域与细胞膜上的NTCP结合。认为通过抑制乙型肝炎病毒与细胞膜的结合，能够预防乙型肝炎病毒的感染、防止感染在体内的扩大，要求进行开发。但是，NTCP具有作为胆汁酸转运体的重要功能，以前开发的以NTCP为靶的HBV抑制剂虽然能够抑制HBV的细胞感染，但是同时也显著抑制胆汁酸转运，可能给患者带来副作用(非专利文献1～4)。近年来，报道了抑制病毒感染且不大幅抑制胆汁酸转运的环状肽(非专利文献5)。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Hepatology(2014)；59(5):1726-37

非专利文献2：Intervirology(2014)57:151-157

非专利文献3：BMB reports(2008),640-652

非专利文献4：J Virology(2005)79:1613-1622

非专利文献5：Cell Chemical biology(2018)25:906-915

发明内容

本发明提供能够抑制乙型肝炎病毒(HBV)粒子对人肝细胞的感染的、与NTCP结合的抗体。另外，本发明提供能够抑制乙型肝炎病毒(HBV)粒子对人肝细胞的感染的、与NTCP结合且降低了NTCP对胆汁酸转运的影响的抗体。

本发明人确定出能够抑制乙型肝炎病毒(HBV)粒子对人肝细胞的感染的抗体。另外，本发明人鉴定出该抗体不进行结合的NTCP变异体。由此明确了该抗体与NTCP结合所必需的NTCP上的氨基酸残基。另外，该NTCP变异体对HBV对细胞的感染为抵抗性，因此明确了上述氨基酸残基也为HBV对细胞的感染所必需的NTCP上的氨基酸。本发明人进一步发现，与该氨基酸序列结合的抗体对基于NTCP蛋白的胆汁酸转运功能不会造成明显影响。

本发明提供例如以下的发明。

[1]一种抗体，其是与人牛磺胆酸钠共转运多肽(人NTCP)结合的抗体，其中，

所述抗体能够抑制乙型肝炎病毒(HBV)粒子对人肝细胞的感染，并且

在适合于培养肝细胞的培养条件下，在关于上述感染抑制的IC₅₀的浓度下，不会抑制50％以上的基于人NTCP的胆汁酸向肝细胞内的摄入。

[2]一种抗体，其是与人NTCP结合的抗体，其中，

所述抗体能够抑制乙型肝炎病毒(HBV)粒子对人肝细胞的感染，并且

(1)以比对具有选自由序列号12～14记载的氨基酸序列组成的组中的氨基酸序列的人NTCP变异体中的至少一种更强的亲和性对具有序列号11记载的氨基酸序列的人NTCP进行结合；或者

(2)与含有具有序列号3记载的氨基酸序列的重链可变区和具有序列号4记载的氨基酸序列的轻链可变区的抗体竞争对人NTCP的结合。

[3]根据上述[1]或[2]所述的抗体，其含有：

包含具有序列号5记载的氨基酸序列的CDR1、具有序列号6记载的氨基酸序列的CDR2和具有序列号7记载的氨基酸序列的CDR3的重链可变区；以及

包含具有序列号8记载的氨基酸序列的CDR1、具有序列号9记载的氨基酸序列的CDR2和具有序列号10记载的氨基酸序列的CDR3的轻链可变区。

[4]根据上述[1]～[3]中任一项所述的抗体，其含有具有序列号3记载的氨基酸序列的重链可变区和具有序列号4记载的氨基酸序列的轻链可变区。

[5]一种药物组合物，其含有上述[1]～[4]中任一项所述的抗体和医药上可接受的载体。

[6]根据上述[5]所述的药物组合物，其用于对由乙型肝炎病毒引起的感染症进行处置。

附图说明

图1A是对得到的杂交瘤克隆培养上清中的抗体所带来的、对在HBV核心区整合有Promega的NanoLuc基因的重组病毒(HBV/NL)的感染抑制效果(横轴)与细胞存活率(纵轴)的关系作图而得的图。

图1B是示出经纯化的N6HB426-20抗体、N6HB426-s102抗体和preS1所带来的浓度依赖性的活HBV的感染抑制效果的图。

图2A～2C是示出经纯化的N6HB426-20抗体、N6HB426-20抗体和preS1所带来的浓度依赖性的活HBV的感染抑制效果的图。图2A是示出N6HB426-20抗体的浓度依赖性的活HBV的感染抑制作用的图。

图2B是示出经纯化的N6HB426-20-A抗体、N6HB426-20-B抗体和重组N6HB426小鼠IgG2a抗体的浓度依赖性的HBV感染抑制作用的图。作为对照组，用与NTCP结合无关的抗卵清白蛋白抗体(Anti-OVA)进行了试验。

图2C是示出纯化N6HB426-20抗体对基因型C和基因型D的HBV的浓度依赖性的HBV感染抑制作用的图。

图3示出胆汁酸向肝细胞株内的摄入分析的结果。该试验系统中，在1000nM的preS1存在下胆汁酸的摄入被抑制90％，而在相同物质量的纯化N6HB426抗体存在下的抑制最多为2％。

图4是示出HBV不感染具有三重变异的NTCP表达细胞株的图。NTCP氨基酸序列第146位的酪氨酸、以及第149位和第152位的天冬氨酸分别被置换为丙氨酸。该三重变异使病毒感染被抑制，在NTCP非反应性抗OVA抗体、NTCP特异性但无中和活性的抗体(HE1-8-10)、或N6HB426抗体存在下，对病毒感染未产生影响。分析中，利用荧光素酶分析测定了在HBV核心区整合有Promega的NanoLuc基因的重组病毒HBV/NL的感染。

图5A左侧是示出N6HB426-20抗体和作为不显示中和活性的抗NTCP抗体的N3T92-14-34对人NTCP的野生型和Y146A变异体的结合的强度的图。图5A右侧示出病毒对表达具有Y146A的变异体的肝细胞的感染性显著下降、对表达具有D149A和D152A的变异体的肝细胞株的感染性无影响。

图5B是示出N6HB426-20抗体和作为不显示中和活性的抗NTCP抗体的N3T92-14-34对人NTCP的野生型和Y146A、D149A和D152A的三重氨基酸残基变异的结合的强度的图。

图6是汇总了对各NTCP变异体的抗体的结合能力和HBV的感染能力的图。

图7是示出各种抗体存在下和不存在下HBV对其它NTCP变异体的感染能力的图。即，使用NTCP氨基酸序列第274位和第275位的苯丙氨酸和脯氨酸分别被置换为丙氨酸的变异体、第278位和第279位的缬氨酸和异亮氨酸分别被置换为丙氨酸的变异体实施感染实验，暗示了对于表达这些变异体的肝细胞，病毒对宿主的感染得到抑制。另一方面，使用第276和第277位的脯氨酸和谷氨酸分别被置换为丙氨酸的变异体的感染实验中，对于表达该变异体的肝细胞，在病毒感染方面未确认到任何效果。

图8是示出N6HB426-20抗体和作为不显示中和活性的抗NTCP抗体的N3T92-14-34对人NTCP的野生型以及P276A和E277A的二重氨基酸变异体的结合的强度的图。

图9是汇总了对于各NTCP变异体的抗体的结合能力和HBV的感染能力的图。

图10示出体内感染实验中的N6HB426-20抗体的感染抑制效果。

图11示出体内感染实验中的胆汁酸浓度的推移。

图12a示出N6HB426人嵌合IgG4抗体对HBV的细胞感染的抑制效果。

图12b示出与PreS1相比的、各种抗体对HBV的细胞感染的抑制效果。

图12c示出各种抗体对细胞存活的影响。

图13示出关于N6HB426人嵌合IgG4抗体所带来的肝细胞的胆汁酸摄入的抑制能力的实验结果。

图14示出关于N6HB426人嵌合IgG4抗体所带来的ADCC活性的实验的结果。

图15示出关于N6HB426人嵌合IgG4抗体处理后的HBs抗原量的实验的结果。

图16示出关于N6HB426人嵌合IgG4抗体处理后的HBe抗原量的实验的结果。

具体实施方式

本说明书中，“对象”为人。人可以是例如健康人和HBV感染者(例如母婴传播所导致的幼儿或儿童、急性乙型肝炎患者、无症状感染者(即，携带者、具有慢性感染的携带者)、慢性肝炎患者、重症肝炎患者、肝硬化患者和肝癌患者)。另外，人可以是出生后28天以内(新生儿期)的人、出生后29天～1年(婴儿期)的人、出生后1年～6年(幼儿期)的人、出生后6年～12年(学童期)的人、出生后12年～18年(青春期)的人和出生后18年以上(成人)的人。

本说明书中，“处置”以包括治疗性处置和预防性处置的含义使用。本说明书中，“治疗”是指疾病或损伤的治疗、治愈、防止或缓解的改善、或者疾病或损伤的进展速度变慢。本说明书中，“预防”是指降低疾病或病情的发病的可能性、或延迟疾病或病情的发病。

本说明书中，“乙型肝炎病毒”(HBV)为嗜肝DNA病毒科正嗜肝DNA病毒属的成员。已知HBV会引起乙型肝炎。HBV的病毒粒子(billion)具有二十面体的核衣壳的核心和覆盖其外侧的脂质包膜，核心在内部具有病毒DNA和具有逆转录酶活性的DNA聚合酶。HBV的构成因子为乙型肝炎表面抗原(HBsAg或HBs抗原)、HBcAg、乙型肝炎病毒DNA聚合酶和HBX。HbsAg由L蛋白、M蛋白和S蛋白构成。HBV感染细胞时，介由L蛋白的preS1结构域与细胞表面的NTCP结合，被内吞至细胞内而感染细胞。有无HBV感染可通过血中有无HBs抗原来确定。需要说明的是，本说明书中，在无特别声明时，NTCP为蛋白质。

认为HBV本身无细胞杀伤性，或者即使有也是轻度。肝细胞损伤主要是由想要清除HBV感染细胞的宿主的免疫应答导致的。婴幼儿期时宿主的免疫应答不发达，虽然HBV DNA的增殖很活跃但几乎看不到肝炎的症状，婴幼儿期的宿主成为无症状携带者。在此，“宿主”表示已感染了HBV的对象。及至成年时，对HBV的免疫应答变得活跃，宿主成为活动性肝炎。随着HBe抗原消失、HBe抗体出现，HBV DNA的增殖得到抑制则肝炎得到缓和。另一方面，若肝炎持续、HBe抗原阳性的状态长时间持续，则从HBe抗原阳性慢性肝炎发展为肝硬化。一旦发生HBe抗原血清转化，大多情况下肝炎会得到缓和，HBV DNA的量下降到2000IU/mL以下，宿主成为非活动性携带者。与此相对地，发生了血清转化的病例中，有10～20％的病例在HBe抗原阴性的状态下发生HBV的再增殖，再次出现肝炎(称为HBe抗原阴性慢性肝炎)。经过HBe抗原血清转化，在一部分病例存在HBs抗原消失、HBs抗体出现而进入缓解期的情况。HBV持续感染者的自然过程中，HBs抗原消失率以年率计为约1％。需要说明的是，成年后的感染中，感染后早期发生免疫应答，宿主成为急性肝炎。急性肝炎后，病毒被清除，肝炎通常会得到缓和，但是未得到缓和而成为慢性肝炎的宿主增加。HBV对细胞的感染的抑制剂能够预防初次HBV感染以及抑制HBV DNA量的增加、抑制HBV的活化、抑制非活动性携带者向活动性携带者的转变、抑制向活动性肝炎的进展、使肝炎缓和、抑制HBV的再增殖、抑制向慢性肝炎的移行、或者防止慢性感染患者体内的病毒扩散和感染扩大。

本说明书中，“抗体”是指：采取以一对二硫键稳定化的2条重链(H链)和2条轻链(L链)缔合而成的结构的蛋白质。抗体可对抗原具有特异性。具有特异性的结合是指：并非非特异性吸附的结合。特异性可通过用抗原免疫动物来确保。具有特异性可以是指：与对其他的至少一种或几种蛋白质相比，对抗原具有更强的亲和性。另外，例如对特定抗原具有强的结合亲和性(例如KD值为10^-9M以下、10^-10M以下、10^-11M以下或10^-12M以下)的抗体为能够与该抗原特异性结合的抗体。重链由重链可变区VH、重链恒定区CH1、CH2、CH3以及位于CH1与CH2之间的铰链区构成，轻链由轻链可变区VL和轻链恒定区CL构成。其中，由VH和VL构成的可变区片段(Fv)是直接参与抗原结合、对抗体赋予多样性的区域。另外，将由VL、CL、VH、CH1构成的抗原结合区称为Fab区，将由铰链区、CH2、CH3构成的区域称为Fc区。

可变区中与抗原直接接触的区域在抗体间使氨基酸序列富有多样性，被称为互补决定区(complementarity-determining region：CDR)。将CDR以外的在抗体间氨基酸序列基本恒定的区域称为框架区(framework region：FR)。轻链和重链的可变区中分别存在3个CDR，从N末端侧起分别依次称为重链CDR1～3和轻链CDR1～3。

抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。另外，本发明的抗体可以是IgG、IgM、IgA、IgD、IgE中的任一同种型。可以是对小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔子、鸡等非人动物进行免疫而制作的抗体，也可以是重组抗体，可以是嵌合抗体、人源化抗体、全人源化抗体等。嵌合型抗体是指来自不同种属的抗体的片段连接而成的抗体。作为IgG的亚类，人类的情况下可列举IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。本发明的抗体可以是任一亚类，可以为例如选自由IgG1、IgG2、IgG3和IgG4组成的组中的一种以上，可以是例如IgG2，可以是例如IgG3，可以是例如IgG4。

“人源化抗体”是指：用非人源抗体的特征性氨基酸序列置换人抗体的对应位置而成的抗体(即，CDR接枝抗体)，可列举例如：具有免疫小鼠或大鼠而制作的抗体的重链CDR1～3(分别为HCDR1～3)和轻链CDR1～3(分别为LCDR1～3)、并且包括重链和轻链各自的4个框架区(FR)在内的其它全部区域来自人抗体的抗体。所述抗体有时也被称为CDR移植抗体。术语“人源化抗体”可包括人嵌合抗体和CDR接枝人源化抗体。全人源化抗体是来自具有人免疫球蛋白基因座的染色体移植非人动物(例如小鼠)的、具有与人相同的基因序列的抗体。

本说明书中，抗体的“抗原结合片段”是指抗体的、与抗原结合的片段。具体而言，可列举：由VL、VH、CL和CH1区构成的Fab；2个Fab通过铰链区以二硫键连接而成的F(ab’)2；由VL和VH构成的Fv；将VL和VH用人工多肽接头连接而成的单链抗体scFv，以及双抗体型、scDb型、tandem scFv型、亮氨酸拉链型等双特异性抗体等，但不限于这些。

本发明中，抗体可以是经分离的单克隆抗体(例如经分离的人嵌合抗体、经分离的人源化抗体、经分离的人抗体)。

本说明书中，“分离”是指至少与其它成分分开。“分离”以包含从符合医药制品的程度的杂质的分开的含义来使用。

本发明人发现，HBV与人牛磺胆酸钠共转运多肽(sodium taurocholatecotransporting polypeptide或NTCP)NTCP的野生型(例如具有序列号11记载的氨基酸序列的NTCP)结合、但是对人NTCP的具有Y146A的氨基酸变异的变异体(例如具有序列号12记载的氨基酸序列的NTCP变异体)的结合性下降。另外，本发明人发现，与人NTCP的野生型结合且对人NTCP的具有Y146A的氨基酸变异的变异体显示更低亲和性的抗体抑制HBV介由人NTCP感染人细胞。另外，本发明人发现，对人NTCP的具有Y146A、D149A和D152A的氨基酸变异的变异体(例如具有序列号13记载的氨基酸序列的NTCP变异体)的结合性下降。另外，本发明人发现，与人NTCP的野生型结合且对人NTCP的具有Y146A、D149A和D152A的氨基酸变异的变异体显示更低亲和性的抗体抑制HBV介由人NTCP感染人细胞。另外，本发明人发现，与人NTCP的野生型结合且对人NTCP的具有P276A和E277A的氨基酸变异的变异体(例如具有序列号14记载的氨基酸序列的NTCP变异体)显示更低亲和性的抗体抑制HBV介由人NTCP感染人细胞。本发明人发现，该抗体实质上不抑制人NTCP的胆汁酸摄入能力。本发明人进一步发现，人NTCP的第276位、第277位氨基酸虽然看起来与病毒感染无关，但是却形成抗体的表位。

(A)本发明的一个方式提供一种抗体，其是与人NTCP结合的抗体，其中，所述抗体能够抑制乙型肝炎病毒(HBV)粒子对人肝细胞的感染，并且在适合于培养肝细胞的培养条件下，在关于上述感染抑制的IC₅₀的浓度下，不会抑制50％以上的基于人NTCP的胆汁酸向肝细胞内的摄入。该方式中，例如，上述抗体在适合于培养肝细胞的培养条件下、在关于上述感染抑制的IC₅₀的浓度下对于基于人NTCP的胆汁酸向肝细胞内的摄入可以是不会抑制50％以上、45％以上、40％以上、35％以上、30％以上、25％以上、20％以上、15％以上、10％以上或5％以上，或者实质上不抑制。抗体的浓度例如可以设为关于上述感染抑制的IC₅₀的浓度。抑制可通过抗体存在下的胆汁酸摄入量相对于抗体不存在下的胆汁酸摄入量的比来表示。实质上不抑制是指抑制为检测限以下、或技术上无意义的程度的抑制。

乙型肝炎病毒(HBV)粒子对人肝细胞的感染和其抑制可以通过使用HBV粒子和人肝细胞的体外分析系统来确认。更具体而言，可以使强制表达人NTCP的人肝细胞株HepG2与HBV在抗体存在下或不存在下接触，通过培养基交换去除未感染HBV粒子后，基于从细胞释放到培养基中的HBs抗原量对HBV粒子对人肝细胞的感染进行评价。关于感染是否被抗体抑制这一点，可以通过比较抗体不存在下的培养基中的HBs抗原量与抗体存在下的HBs抗原量来确定。可以使用标记HBV粒子，基于被摄入到细胞内的标记量来确认感染量和感染抑制。关于感染抑制的IC₅₀，可以在上述体外分析系统中使用抗体溶液的稀释系列来求出。IC₅₀为抑制50％感染的抗体的浓度。

(A’)本发明的一个方式提供一种抗体，其是与人NTCP结合的抗体，其中，所述抗体能够抑制乙型肝炎病毒(HBV)粒子与人NTCP的结合，并且在适合于培养肝细胞的培养条件下，在关于上述感染抑制的IC₅₀的浓度下，不会抑制50％以上的基于人NTCP的胆汁酸向肝细胞内的摄入。该方式中，例如，上述抗体在适合于培养肝细胞的培养条件下、在关于上述感染抑制的IC₅₀的浓度下对于基于人NTCP的胆汁酸向肝细胞内的摄入可以是不会抑制50％以上、45％以上、40％以上、35％以上、30％以上、25％以上、20％以上、15％以上、10％以上或5％以上，或者实质上不抑制。抗体的浓度例如可以设为关于上述感染抑制的IC₅₀的浓度。抑制可通过抗体存在下的胆汁酸摄入量相对于抗体不存在下的胆汁酸摄入量的比来表示。实质上不抑制是指抑制为检测限以下、或技术上无意义的程度的抑制。

标记乙型肝炎病毒(HBV)粒子与人NTCP的结合和其抑制可以通过常规方法利用使用HBV粒子和人肝细胞的体外分析系统来确认。更具体而言，可以使强制表达人NTCP的人肝细胞株HepG2与标记HBV在抗体存在下或不存在下接触，通过洗涤去除未结合到细胞表面的HBV粒子后，基于标记来检测结合到细胞表面的HBV粒子，由此对结合进行检测。关于结合是否被抗体抑制这一点，可以通过比较抗体不存在下的细胞表面上的标记量和抗体存在下的细胞表面上的标记量来确定。关于结合抑制的IC₅₀可以在上述体外分析系统中使用抗体溶液的稀释系列来求出。IC₅₀为抑制50％结合的抗体的浓度。另外，本领域技术人员可以使用常规方法对结合抑制加以确认。

与人NTCP结合的抗体可通过将人NTCP或其胞外结构域免疫于动物来制作。与人NTCP结合的抗体还可以通过将表达人NTCP的细胞免疫于动物来制作。此时，动物可以是编码NTCP的基因已被破坏的基因改造动物(例如小鼠、大鼠和兔子等)。例如，可以从免疫后的动物的血液中回收与人NTCP结合的多克隆抗体。例如，还可以通过使免疫后的动物脾细胞与骨髓瘤细胞融合而得到杂交瘤，由该杂交瘤得到与人NTCP结合的单克隆抗体。杂交瘤可通过有限稀释来制成单一克隆。在克隆的培养上清中可以包含单克隆抗体。因此，可以根据期望的结合特性或功能特性，对由各克隆得到的抗体进行筛选，得到具有期望的结合特性或功能特性的单克隆抗体。

胆汁酸向肝细胞内的摄入抑制可以在适合于培养肝细胞的培养条件下确认。胆汁酸向肝细胞内的摄入例如可以如下确认：将表达人NTCP的HepG2细胞株用抗体进行预处理(例如37℃下30分钟)后，用含有[³H]-牛磺胆酸的分析溶液例如在37℃下处理15分钟，通过检测细胞内的[³H]量来确认牛磺胆酸向细胞内的摄入。然后，比较在抗体不存在下或在同种型抗体(IgG抗体等)存在下牛磺胆酸向细胞内的摄入(更具体而言，细胞内的[³H]量)，从而可以确认有无胆汁酸向肝细胞内的摄入抑制。

(B)本发明的一个方式提供一种抗体，其是与人NTCP结合的抗体，其中，(1)以比对选自由具有序列号12～14记载的氨基酸序列的人NTCP变异体组成的组中的一种以上更强的亲和性对具有序列号11记载的氨基酸序列的人NTCP进行结合；或者(2)与含有具有序列号3记载的氨基酸序列的重链可变区和具有序列号4记载的氨基酸序列的轻链可变区的抗体进行竞争。并且，本发明的抗体能够抑制HBV粒子与人肝细胞表面上的人NTCP的结合和/或抑制HBV粒子对人肝细胞的感染。

上述(1)中具有序列号11记载的氨基酸序列的人NTCP为野生型的人NTCP的一例。另外，上述(1)中具有序列号12记载的氨基酸序列的人NTCP变异体在序列号11记载的氨基酸序列中具有Y146A的氨基酸变异。另外，上述(1)中具有序列号13记载的氨基酸序列的人NTCP变异体在序列号11记载的氨基酸序列中具有Y146A、D149A和D152A的氨基酸变异。另外，上述(1)中具有序列号14记载的氨基酸序列的人NTCP变异体在序列号11记载的氨基酸序列中具有P276A和P277A的氨基酸变异。即，上述(1)中，具有以比对具有序列号12记载的氨基酸序列的人NTCP变异体更强的亲和性对具有序列号11记载的氨基酸序列的人NTCP进行结合的特性的抗体能够与HBV所结合的人NTCP的氨基酸结合。另外，上述(1)中，具有以比对具有序列号13记载的氨基酸序列的人NTCP变异体更强的亲和性对具有序列号11记载的氨基酸序列的人NTCP进行结合的特性的抗体能够与HBV所结合的人NTCP的氨基酸结合。另外，上述(1)中，具有以比对具有序列号14记载的氨基酸序列的人NTCP变异体更强的亲和性对具有序列号11记载的氨基酸序列的人NTCP进行结合的特性的抗体能够与HBV所结合的人NTCP的氨基酸结合。并且，本发明的抗体能够抑制HBV粒子与人肝细胞表面上的人NTCP的结合和/或抑制HBV粒子对人肝细胞的感染。

上述(1)的抗体例如可以是具有如下特性的抗体：以比对具有序列号12记载的氨基酸序列的人NTCP变异体强1.5倍以上、2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、50倍以上、100倍以上或1000倍以上的亲和性对具有序列号11记载的氨基酸序列的人NTCP进行结合。

上述(1)的抗体例如可以是对具有序列号11记载的氨基酸序列的人NTCP具有10^-7M以下、10^-8M以下、10^-9M以下或10^-10M以下的KD值、而对具有序列号12记载的氨基酸序列的人NTCP变异体具有10^-4M以上、10^-3M以上或10^-2M以上的KD值的抗体。

上述(1)的抗体例如可以是与具有序列号11记载的氨基酸序列的人NTCP结合、但与具有序列号12记载的氨基酸序列的人NTCP变异体实质上不显示结合的抗体。

上述(1)的抗体可以还具有下述特性：以比对具有序列号12记载的氨基酸序列的人NTCP变异体强1.5倍以上、2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、50倍以上、100倍以上或1000倍以上的亲和性对具有序列号11记载的氨基酸序列的人NTCP进行结合。

上述(1)的抗体例如可以是具有如下特性的抗体：以比对具有序列号13记载的氨基酸序列的人NTCP变异体强1.5倍以上、2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、50倍以上、100倍以上或1000倍以上的亲和性对具有序列号11记载的氨基酸序列的人NTCP进行结合。

上述(1)的抗体例如可以是对具有序列号11记载的氨基酸序列的人NTCP显示10^-7M以下、10^-8M以下、10^-9M以下或10^-10M以下的KD值、而对具有序列号13记载的氨基酸序列的人NTCP变异体显示10^-4M以上、10^-3M以上或10^-2M以上的KD值的抗体。

上述(1)的抗体例如可以是与具有序列号11记载的氨基酸序列的人NTCP结合、但与具有序列号13记载的氨基酸序列的人NTCP变异体实质上不显示结合的抗体。

上述(1)的抗体可以还具有下述特性：以比对具有序列号13记载的氨基酸序列的人NTCP变异体强1.5倍以上、2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、50倍以上、100倍以上或1000倍以上的亲和性对具有序列号11记载的氨基酸序列的人NTCP进行结合。

上述(1)的抗体例如可以还具有如下特性：对具有序列号11记载的氨基酸序列的人NTCP显示10^-7M以下、10^-8M以下、10^-9M以下或10^-10M以下的KD值、而对在序列号11的氨基酸序列中具有P276A和E277A的二重氨基酸变异的人NTCP变异体(具有序列号14的氨基酸序列的人NTCP变异体)显示10^-4M以上、10^-3M以上或10^-2M以上的KD值。

上述(1)的抗体例如可以是具有如下特性的抗体：以比对具有序列号14记载的氨基酸序列的人NTCP变异体强1.5倍以上、2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、50倍以上、100倍以上或1000倍以上的亲和性对具有序列号11记载的氨基酸序列的人NTCP进行结合。

上述(1)的抗体例如可以是对具有序列号11记载的氨基酸序列的人NTCP显示10^-7M以下、10^-8M以下、10^-9M以下或10^-10M以下的KD值、而对具有序列号14记载的氨基酸序列的人NTCP变异体显示10^-4M以上、10^-3M以上或10^-2M以上的KD值的抗体。

上述(1)的抗体例如可以是与具有序列号11记载的氨基酸序列的人NTCP结合、但与具有序列号14记载的氨基酸序列的人NTCP变异体实质上不显示结合的抗体。

上述(1)的抗体可以还具有如下特性：以比对具有序列号14记载的氨基酸序列的人NTCP变异体强1.5倍以上、2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、50倍以上、100倍以上或1000倍以上的亲和性对具有序列号11记载的氨基酸序列的人NTCP进行结合。

上述(2)记载的抗体能够与含有具有序列号3记载的氨基酸序列的重链可变区和具有序列号4记载的氨基酸序列的轻链可变区的抗体竞争。在此，抗体的竞争可通过抗体彼此与同一或重复的结合部位进行结合而发生。因此，进行竞争的抗体彼此可与同一或重复的结合部位结合。并且，本发明的抗体能够抑制HBV粒子与人肝细胞表面上的人NTCP的结合和/或抑制HBV粒子对人肝细胞的感染。

抗体的竞争可通过竞争分析在试管内确认。竞争分析中，例如若能够中和至少20％、优选至少20～50％、进一步优选至少50％的期望抗体的结合，则可以在与相同抗原的结合中作为进行竞争的抗体。进行竞争的抗体可以通过交叉阻断分析、优选竞争ELISA分析来确认。交叉阻断分析中，将抗原涂布在例如微滴定板上，向其中添加作为候补的竞争抗体存在，进行温育，形成抗原与候补抗体的结合。然后，将期望抗体标记后进一步添加到孔中，进行温育、洗涤，对期望抗体的结合量进行定量，由此可以判断抗体是否发生了竞争。在发生竞争时，孔中残存的标记量应该会减少。因此，可以将孔中残存的标记量作为指标，来确认抗体彼此是否发生了竞争。竞争包括相互竞争。

本发明的一个方式中，上述(1)或(2)的抗体可以是上述(A)中规定的抗体。即，上述(1)或(2)的抗体可以是在适合于培养肝细胞的培养条件下、在关于上述感染抑制的IC₅₀的浓度下对于基于人NTCP的胆汁酸向肝细胞内的摄入不会抑制50％以上、45％以上、40％以上、35％以上、30％以上、25％以上、20％以上、15％以上或10％以上、或者实质上不抑制的抗体。实质上不抑制是指：为检测限以下，或者，即使检测到，抑制也不显著。

(C)本发明的一个方式提供一种抗体，其是与人NTCP结合的抗体，其含有：包含具有序列号5记载的氨基酸序列的CDR1、具有序列号6记载的氨基酸序列的CDR2和具有序列号7记载的氨基酸序列的CDR3的重链可变区；以及包含具有序列号8记载的氨基酸序列的CDR1、具有序列号9记载的氨基酸序列的CDR2和具有序列号10记载的氨基酸序列的CDR3的轻链可变区。

(D)本发明的一个方式提供一种抗体，其是与人NTCP结合的抗体，其含有具有序列号3记载的氨基酸序列的重链可变区和具有序列号4记载的氨基酸序列的轻链可变区。

本发明的与人NTCP结合的抗体可与对应于序列号11记载的氨基酸序列中的P276和E277的人NTCP的氨基酸结合。换言之，本发明的与人NTCP结合的抗体可以以对应于序列号11记载的氨基酸序列中的P276和E277的人NTCP的氨基酸为表位。

根据本发明，提供含有本发明的与人NTCP结合的抗体的药物组合物。含有本发明的抗体的药物组合物或药剂可通过公知的制剂学方法而制剂化。例如，本发明的药物组合物或药剂可以含有药学上可接受的赋形剂。赋形剂可以是为了对对象给予有效量的作为有效成分的本发明的抗体而可适当给药的赋形剂。一个方式中，本发明的药物组合物或药剂可以是注射剂，注射用的赋形剂可以是无菌水性溶液，例如林格氏溶液、汉克斯溶液或生理盐水等药学上可接受的缓冲液、含有葡萄糖、其它助剂的等渗液。作为助剂，可列举乙醇等醇、聚乙二醇等多元醇、聚山梨酯80等非离子型表面活性剂等，可以在制剂化时添加。作为注射用的油性液，可使用芝麻油、椰子油和大豆油，作为助剂，可使用苯甲酸苄酯或苯甲醇。本发明的药物组合物或药剂可以以注射剂的形态进行非经口给药(例如静脉内给药或胸腔内给药)。

本发明的抗体能够抑制HBV对人肝细胞的感染。因此，根据本发明，含有本发明的与人NTCP结合的抗体的药物组合物可以用于预防HBV感染。根据本发明，本发明的药物组合物还可以用于对HBV感染者进行处置。根据本发明，包含本发明的与人NTCP结合的抗体的药物组合物还可以用于对由HBV引起的感染症进行处置。根据本发明，包含本发明的与人NTCP结合的抗体的药物组合物还可以用于治疗由HBV引起的感染症。根据本发明，包含本发明的与人NTCP结合的抗体的药物组合物还可以用于抑制或减少HBV DNA量的增加。NTCP根据本发明，包含本发明的与人NTCP结合的抗体的药物组合物还可以用于对非活动性携带者进行处置。根据本发明，包含本发明的与人NTCP结合的抗体的药物组合物还可以用于抑制非活动性携带者向活动性携带者的转变。根据本发明，包含本发明的与人NTCP结合的抗体的药物组合物还可以用于抑制活动性肝炎的进展。根据本发明，包含本发明的与人NTCP结合的抗体的药物组合物还可以用于缓和肝炎。根据本发明，包含本发明的与人NTCP结合的抗体的药物组合物还可以用于抑制HBV的再增殖。根据本发明，包含本发明的与人NTCP结合的抗体的药物组合物还可以用于抑制肝炎的慢性化。根据本发明，包含本发明的与人NTCP结合的抗体的药物组合物还可以用于对由HBV引起的肝炎进行处置。一个方式中，肝炎可以选自由急性肝炎和慢性肝炎组成的组。一个方式中，本发明的药物组合物可以不抑制胆汁酸的摄入作用。一个方式中，本发明的药物组合物可以用于抑制HBV与人NTCP的结合。

一个方式中，包含本发明的与人NTCP结合的抗体的药物组合物可给药于选自由HBs抗原和HBe抗原组成的组中的抗原为阳性的对象。一个方式中，包含本发明的与人NTCP结合的抗体的药物组合物可给药于HBV非活动性携带者。一个方式中，包含本发明的与人NTCP结合的抗体的药物组合物可给药于具有由HBV引起的肝炎(例如急性肝炎或慢性肝炎)的对象。一个方式中，包含本发明的与人NTCP结合的抗体的药物组合物可给药于HBV DNA量为20IU/mL以上的对象。

本发明的一个方面提供对有此需要的对象处置由HBV引起的感染的方法，其包括对该对象给药本发明的与人NTCP结合的抗体的步骤。

本发明的一个方面提供本发明的与人NTCP结合的抗体在制造本发明的药物组合物中的应用。

本发明的与人NTCP结合的抗体可以与其它抗HBV治疗药组合使用。即，本发明的药物组合物可以含有本发明的与人NTCP结合的抗体和其它抗HBV治疗药。另外，本发明的药物组合物可以与其它抗HBV治疗药组合使用。作为其它抗HBV治疗药，可列举干扰素制剂和核酸类似物制剂。作为干扰素制剂，可列举干扰素和PEG化干扰素(Peg-IFN)。作为核酸类似物制剂，可列举拉米夫定(LAM)、阿德福韦(ADV)、恩替卡韦(ETV)、富马酸替诺福韦二吡呋酯(TDF)和丙酚替诺福韦(TAF)。本发明的药物组合物也可以与恩曲他滨、齐多夫定、阿巴卡韦、埃替拉韦和可比司他等具有抗HBV作用的抗人类免疫缺陷病毒(HIV)药组合使用。

本发明的药物组合物可以不含担心会引起HBV的再活化的药物(例如免疫抑制剂、肾上腺皮质类固醇药、抗癌剂和抗风湿药)。本发明的药物组合物可以不含司美匹韦钠、达卡他韦盐酸盐、阿舒瑞韦、索非布韦、雷迪帕韦、艾尔巴韦和格拉瑞韦水合物。

实施例

实施例1：能够抑制乙型肝炎病毒(HBV)对人肝细胞的感染的与NTCP结合的抗体的 制作

NTCP敲除小鼠的制作

使用CRISPR/Cas9系统建立了NTCP敲除小鼠。即，将含有T7启动子和引导RNA(#1：GCTCTCGCTTGGCTGCACCA+tracrRNA、#2：CTTTCATCTGACCAGCATTG+tracrRNA)的PCR扩增片段克隆到pUC19中。以来自pX330的Cas9基因PCR产物处于T7启动子的下游的方式进行了亚克隆。通过使用这些构建物和MEGAshortscript T7转录试剂盒(Life Technologies)的体外转录合成单链引导RNA和Cas9 mRNA，接着利用MEGAClear试剂盒(Life Technologies)进行纯化。将两种引导RNA(各10ng/μl)和Cas9 mRNA(10ng/μl)显微注射到C57BL/6N原核期胚(100个)中，将第二天的2细胞期胚移植到假孕小鼠中。始祖(founder)的基因组编辑通过PCR/测序分析来确定。

NTCP的表达和纯化

(1)在人NTCP(SLC10A1，GenBank：NM_003049，UniProt：Q14973)野生型和N5Q/N11Q变异体的N末端，融合依次排列有人流感病毒血凝素(HA)标签(YPYDVPDYA)、Strep-tag II(WSHPQFEK)，bRIL(细胞色素b-562RIL变异体，UniProt：P0ABE7，23-128aa)烟草花叶病毒(TEV)蛋白酶识别序列(ENLYFQG)的构建物，使用杆状病毒表达系统(Bac-to-BacBaculovirus Expression System，ThermoFisher Scientific)在昆虫细胞HighFive(Invitrogen)中进行表达。

(2)使用3L的Express Five SFM培养基(ThermoFisher Scientific)在27℃下将NTCP表达昆虫细胞振荡培养48小时，通过离心分离而使细胞沉淀，去除培养基。

(3)将细胞沉淀物悬浮于含有10mM氯化钾和1mM EDTA的低盐浓度缓冲液中，用匀浆器破碎细胞。将该操作重复2次。进而置换为含有1M氯化钠的高盐浓度缓冲液，再次用匀浆器将细胞破碎。将该操作重复2次。通过100000g、4℃、1小时的超离心分离使膜级分沉淀。

(4)将膜级分沉淀物悬浮于含有150mM氯化钠、5mM二硫苏糖醇、cOmplete miniEDTA-free蛋白酶抑制剂混合物(Roche，Cat.No.4693159001)的缓冲液，添加终浓度为1％的十二烷基麦芽糖苷(DDM，Anatrace，Cat.No.D310)，在4℃下混合3小时，从而对脂质和膜蛋白进行可溶化。

(5)进行100000g、4℃、20分钟的超离心分离，从超离心上清中回收含有NTCP的粗膜蛋白级分。

(6)向粗膜蛋白级分中加入3mL柱床体积的StrepTactin琼脂糖高性能树脂(GEHealthcare)，在4℃下温和搅拌一整夜。

(7)将结合有NTCP的StrepTactin琼脂糖树脂装入柱容器中，去除直接通过级分后，用含有0.05％DDM、0.002％胆固醇半琥珀酸酯(CHS，Anatrace，Cat.No.CH210)、0.5M氯化钠、5mM二硫苏糖醇的Tris缓冲液(pH7.0)洗涤，用向含有0.1M氯化钠的上述缓冲液中添加2.5mM脱硫生物素而成的洗脱液从树脂中洗脱NTCP。

(8)向7.的洗脱级分中添加TEV蛋白酶，在4℃下温和搅拌一整夜，从而进行TEV蛋白酶识别部位的消化反应，将两种标签和bRIL切掉。

(9)将利用TEV蛋白酶消化后的溶液通入阴离子交换柱(HiTrap QHP，GEhealthcare，Cat.No.17115301)，使蛋白质吸附于柱，利用0.1～1M的氯化钠浓度梯度洗脱NTCP。

(10)将9.的洗脱级分添加到凝胶过滤柱(Superose 6Increase 10/300GL，GEhealthcare，Cat.No.29091596)中，回收约10-16mL的洗脱级分。

(11)使用分子量30000截留的超滤膜(Amicon Ultra-15，Merck Millipore，Cat.No.UFC903096)，将10.的洗脱级分的NTCP浓缩。

(12)将脂质A(Lipid A，monophosphoryl from Salmonella enterica serotypeminn，Sigma，Cat.No.L6895)和来自蛋黄卵磷脂的磷脂酰胆碱(Avanti，Cat.No.840051C)以1：5预先混合，悬浮于缓冲液中，添加1.4％胆酸钠，利用超声波分散脂质，将由此制备的10mg/mL的混合脂质与纯化、浓缩后的NTCP混合。

(13)向12.的混合液中添加Bio-Beads(Bio-Beads SM-2 20-50Adsorbents，Bio-Rad，Cat.No.152-3920)，吸附与作为膜蛋白的NTCP的表面结合的表面活性剂，同时进行使NTCP被摄入到脂质体中的脂质体重构。

(14)利用旋转柱去除Bio-Beads，利用超声波分散NTCP重构脂质体后，通过100000g、4℃、1小时的超离心分离使脂质体沉淀，悬浮于磷酸缓冲液(phosphate-bufferdsaline)中。根据小鼠给药量来分注脂质体悬浮液，用液氮快速冷冻，在-80℃下保存至使用时。

乳化免疫原的制备方法

将在100μl的PBS中制备的人NTCP与脂质A的混合物和TiterMax(R)Gold(TiterMaxUSA，Inc)100μl分取到不同的带塞注射器中。以不混入空气的方式与三通旋塞(3-waystopcock)连接，将两者混合，混合至完全乳化为止。

免疫方法

对于3只11-17周龄雌性NTCP KO小鼠，通过以下方法免疫7次人NTCP(hNTCP)抗原。下文的()内记载的天数表示在将首次免疫日设为第0天时在第几天进行了免疫。

首次免疫(第0天)：使用每1只30μg/100μl PBS(-)的包含脂质A的hNTCP的蛋白抗原(富士胶片和光纯药)和每1只100μl作为佐剂的TiterMax(R)Gold(TiterMax USA，Inc)，将两者混合而制备乳化的免疫抗原。在异氟烷的麻醉处理下，将每1只100μl在左右肩后背侧的皮下各1个位置(合计2个位置、200μl)进行给药。

第2次免疫(第28天)：对使小鼠肝细胞株Hepa1-6(ATCC(R)，CRL-1830^TM)表达hNTCP的Hepa1-6-hNTCP株照射10Gly的伽马射线，制备调整为每1只1×10⁷个/100μl PBS(-)的细胞悬浮液和使33.3μg的CpG(ODN 1826VacciGrade，InvivoGen)溶解于100μl的PBS(-)中的溶液，在给药前5分钟混合并静置。5分钟后优选搅拌2次，进行腹腔内给药。

第3次免疫(第48天)：使hNTCP在脂质体膜中构成，与脂质A混合而制作抗原。将每1只50μg的该hNTCP/脂质体抗原和25μg 50℃加热处理后的poly I：C(SIGMA，#P0913)混合，对小鼠的右侧腹股沟皮下给药。

第4次免疫(第61天)：将每1只50μg/100μl PBS(-)的包含脂质A的hNTCP与TiterMax(R)Gold 100μl混合而制备乳化的免疫抗原，在异氟烷麻醉处理下对左右腰部皮下给药各100μl。

第5次免疫(第77天)：对使小鼠淋巴瘤细胞株A20(RIKEN BRC CELL BANK，#CB2745)表达hNTCP的A20-hNTCP细胞株照射10Gly的伽马射线，制备使每1只2×10⁷个悬浮于100μl的PBS中的溶液和使33.3μg的CpG溶解于100μl的PBS中的溶液，在给药前5分钟混合并静置。5分钟后再次优选悬浮2次，进行腹腔内给药。

第6次免疫(第89天)：与第3次免疫同样地制备抗原，给药于左侧腹股沟皮下。

第7次免疫(第105天)：将NTCP以每1只10μg稀释到PBS 200μl中，从尾静脉进行增强免疫。

在第7次免疫起3天后(第108天)进行解剖，摘出脾脏并制作杂交瘤。

杂交瘤制作和抗体产生筛选

B细胞浓缩

将免疫后的小鼠脾脏摘出，溶血后将细胞悬浮于FACS缓冲液(2％FCS，1％BSA，DMEM培养基)。为了阻止染色抗体与Fc受体的结合，对脾细胞进行2.4G2抗体处理。然后，用生物素标记抗体mix在冰上染色30分钟。作为生物素标记抗体mix，使用抗IgM抗体、抗IgD抗体、抗CD3抗体、抗Thy1.2抗体、抗Gr-1抗体、抗F4/80抗体、抗TER119抗体、抗DX5抗体、抗NK1.1抗体、抗CD11b抗体、抗CD11c抗体和抗AA4.1抗体的混合抗体。用MACS缓冲液(添加了2mM EDTA、0.5％BSA的D-PBS)洗涤后，加入链霉亲和素微珠(Miltenyi Biotec，130-048-101)，在冰冷下放置15分钟后，利用使用LS柱(Miltenyi Biotec，130-042-401)的负选择法得到浓缩B细胞。

细胞融合和利用HAT培养基的选择

在B细胞与骨髓瘤细胞(P3U1)的细胞融合中，使用ネッパジーン株式会社制造的ECFG21细胞融合装置。将两种细胞以1：1混合，悬浮于ECF缓冲液(0.3M甘露醇，0.1mMCaCl₂，0.1mM MgCl₂)。关于电融合法的融合条件，在35V 1MHz(固定)10秒、DC：350V 30μ秒间隔0.5秒减少10％、融合后7秒衰减模式下进行。细胞融合结束后的细胞悬浮于HAT培养基(含有18％FCS、10％BM-condimed H1的RPMI1640)，以约1.7×10³个细胞/孔播种于96孔平底板，在37℃、5％CO₂条件下开始培养。

融合后，每隔3～4天将上清的一半量更换为新的HAT培养基，采集在显微镜观察下确认充分生长的杂交瘤(细胞占孔面积80％以上)的上清的一部分。

使用纯化抗体的病毒中和活性的测定

质粒的制备

为了构建编码在C末端带有Myc标签的人NTCP(NTCP-Myc)的慢病毒载体，将编码NTCP-Myc的DNA片段插入到CSII-CMV-MCS(Dr Hiroyuki Miyoshi，由RIKEN提供)的EcoRI和BamHI。用QuikChange定点诱变试剂盒(Agilent，CA，USA)按照制造商手册制作各变异体构建物。

细胞的制备和培养

在添加了10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、100U/mL非必需氨基酸(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)的杜尔贝科改良伊戈尔培养基(DMEM)(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)中培养HepG2细胞或Huh7细胞。

HepAD38细胞在添加了10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、5μg/mL胰岛素、500ng/mL四环素的DMEM-F-12GlutaMAX(Thermo Fisher Scientific，Waltham)中维持。

为了建立NTCP表达细胞，用搭载有编码野生型或各NTCP变异体的核酸的慢病毒载体感染HepG2细胞或Huh7细胞。感染48小时后，将细胞供于免疫荧光分析或病毒感染分析。

PXB细胞购自PhoenixBio,Hiroshima,Japan，按照供应商规程进行培养。

免疫荧光分析

将表达野生型NTCP或各NTCP变异体的Huh7细胞用4％多聚甲醛固定，用0.3％Triton X-100进行透过处理。各NTCP使用N6HB426-20抗体或HE1-9-10抗体(稀释倍率1：200)和Alexa Fluor488-缀合物山羊抗小鼠IgG抗体(二抗)(Thermo Fisher Scientific)(稀释倍率1：1000)来检测。细胞的成像利用使用FLUOVIEW fv1000的激光扫描共聚焦显微镜和使用IX73(OLYMPAS)的荧光显微镜来进行。

HBV的制备和感染

HBV来自HepAD细胞(由Dr Christoph Seeger，Fox Chase Cancer Center提供)的培养上清。将回收的上清用0.45μm过滤器(Merck Millipore，MA，USA)进行过滤器过滤，使用PEG6000(Sigma-Aldrich)浓缩约500倍。将96孔板中的HepG2-NTCP-myc细胞用PreS1、抗OVA抗体、HE1-9-10抗体或N6HB426-20抗体处理1小时，然后，用PBS洗涤。与PreS1或各抗体一起在4％PEG8000和2％DMSO的存在下，使用每细胞为100基因组当量的浓度的HBV感染细胞。感染24小时后，用PBS洗涤细胞。在含有2％DMSO的新鲜培养基中培养HBV感染细胞。感染6天后，使用化学发光酶免疫测定(Lumipulse f，Fujirebio，Tokyo，Japan)测定HBs抗原的量。

作为替代，将PXB细胞用PreS1、抗OVA抗体、HE1-9-10抗体或N6HB426-20抗体处理1小时，然后，用PBS洗涤。与PreS1或各抗体一起在4％PEG8000和2％DMSO的存在下，使用每细胞为100基因组当量的浓度的HBV(来自HBV感染患者的基因型C(Genotype C)或基因型D(Genotype D))感染细胞。感染24小时后，用PBS洗涤细胞。在含有2％DMSO的新鲜培养基中培养HBV感染细胞。感染6天后或12天后，使用化学发光酶免疫测定(Lumipulse f，Fujirebio，Tokyo，Japan)测定HBs抗原的量。

抗体产生的筛选

关于是否从杂交瘤分泌抗NTCP抗体的检索，使用来自杂交瘤的培养上清进行FACS分析，选择将NTCP强制表达细胞株染色、但对母细胞株不显示染色性的样品作为阳性样品。具体如下所述。

具有HBV感染的抑制活性的抗NTCP抗体

使来自61500杂交瘤的培养上清分别与强制表达hNTCP的B淋巴瘤细胞株和母株反应，洗涤后，用荧光标记抗小鼠IgG抗体染色。由使用FACS的筛选得到产生与NTCP结合的抗体的杂交瘤700细胞株。对于阳性杂交瘤培养上清，利用使用假病毒的HBV感染抑制活性试验进行筛选，进行显示出50％以上的活性抑制的9个杂交瘤的亚克隆，使用来自各克隆的培养上清再次实施试验。结果如图1A所示。如图1A所示，得到了产生HBV的感染率低且不会降低细胞存活率的抗体的杂交瘤克隆。另外表明，来自N6HB426杂交瘤株来源的亚克隆N6HB426-20的培养上清(得到的抗体称为“N6HB426-20抗体”或“N6HB426-20单克隆抗体”)和来自N6HB426-s102的培养上清(得到的抗体称为“N6HB426-s102抗体”或“N6HB426-s102单克隆抗体”)显示与preS1肽的抑制活性同等的活性。

对来自所建立的克隆的抗体进行纯化，通过将NanoLuc基因整合于基因组而得的假HBV感染抑制活性试验再次确认了活性。结果如图1B所示。如图1B所示可知，N6HB426-20抗体和N6HB426-s102抗体与preS1同样地浓度依赖性地抑制假HBV感染。这些抗体的IC₅₀分别为0.27μg/mL(1.8nM)和0.25μg/mL(1.7nM)，两克隆为同等。本实验中，NTCP的HBV配体分子preS1的IC₅₀为0.03μg/mL(4.5nM)。

从所建立的抗体中选择N6HB426-20抗体，进行使用活HBV的感染抑制试验。即，研究了不同浓度的抗体对于以强制表达人NTCP的人肝细胞株HepG2/NTCP-myc为靶细胞的HBV感染的抑制活性。该实验中，作为对照组，使用不显示感染抑制的抗NTCP抗体HE1-9-10单克隆抗体和抗卵清白蛋白(OVA)单克隆抗体。结果如图2A所示。如图2A所示，以HBs抗原量为指标评价N6HB426-20单克隆抗体的HBV感染抑制活性的结果是，IC₅₀为20～30nM，得到了与preS1同样的抑制效果。抗OVA抗体和HE1-9-10单克隆抗体的情况下未确认到感染抑制效果，因此可确认，感染抑制对于N6HB426-20抗体对NTCP的识别部位呈特异性。

N6HB426-20抗体对于正常人肝细胞的HBV感染也显示出与preS1同等的抑制效果，另外，在不同的纯化抗体批次间也没有抑制活性差异(参照图2B)。进而，制作了N6HB426-20抗体的基因来源的重组抗体，结果该重组抗体也得到了同等的活性(参照图2B)。另外暗示了，对于所建立的抗体的HBV感染抑制效果而言，不仅对于容易肿瘤化的基因型C的HBV、对于其他的基因型D的HBV也显示出同样的感染抑制效果(参照图2C)。

使用人肝细胞嵌合小鼠的HBV的感染抑制实验

uPA/SCID小鼠的制作和人肝细胞的移植按照现有报道进行(Tateno C.et al.,Am.J.Pathol.,165:901-912,2004)。全部小鼠被移植了由同一供体得到的人肝细胞。将肝组织的90％以上已被移植人肝细胞置换的23只小鼠用于实验。对于这些小鼠，从尾静脉给药含有10³拷贝的HBV的人血清。在接种HBV的1天前和2天后静脉注射2.0mg的纯化N6HB426-20抗体，在7天后、14天后和21天后腹腔内注射1.0mg的上述抗体。另外，作为对照实验，同样地给药等量的正常小鼠IgG抗体(Normal Mouse IgG,Whole Molecule,Purified、富士胶片和光纯药株式会社)。第0天给药后死亡的1只小鼠被排除在实验外。分别使用各10只、总计20只小鼠。HBV接种后每周采集血清。需要说明的是，3只小鼠用于感染的确认，未进行药剂的给药。

HBV-DNA的定量中使用10μL的小鼠血清。用690μL的PBS稀释，提取DNA。血清HBV-DNA量使用cobas 6800系统(Roche Diagnostics KK，Tokyo，Japan)通过实时PCR法来测定。该测定方法的定量下限为3.61log拷贝/mL。另外，将10μL的小鼠血清用PBS稀释30倍，测定胆汁酸。

所有的动物实验均依据实验动物的护理和使用指南(Guide for the Care andUse of Laboratory Animal)和广岛大学动物实验等规则来进行。对小鼠的注射、采血在异氟烷麻醉下进行。采集的小鼠血清分开保存在液氮中直至使用为止。人血清由获得了书面的知情同意的一位患者提供。

其结果是，在所有的给药了正常小鼠IgG抗体的10只小鼠中，HBV-DNA量均在HBV接种后第4周时升高到能定量的范围，在第5周进一步上升(参照表1-2和图10)。但是，在所有的给药了N6HB426-20抗体的10只小鼠中，在第4周血清中HBV-DNA量均未检测到(参照表1-1和图10)。由该结果暗示了，通过给药N6HB426-20抗体而抑制了HBV的感染完成。需要说明的是，在N6HB426-20给药组中观察到一过性的血清中的胆汁酸的上升(参照表2-1和表2-2、以及图11)。血清中的胆汁酸的上升为一过性的，在HBV接种时刻为峰值，第1周以后胆汁酸浓度下降(参照表2-1和图11)。但是，在胆汁酸浓度发生下降的第1周以后，HBV感染的抑制效果也长期持续。该结果意味着，N6HB426-20抗体具有抑制HBV的感染完成的效果，但另一方面，胆汁酸转运的抑制效果足够小。由此表明，与N6HB426-20抗体具有相同的结合特性的抗体同样地具有抑制HBV的感染完成的效果，但另一方面，胆汁酸转运的抑制效果足够小。以下在表中示出10只小鼠各自的测定数据。

[表1-1]

表1-1：HBV给药和N6HB426-20抗体给药小鼠中的血清HBV DNA量的推移(试验组)

	1周后	2周后	3周后	4周后	5周后
						试验1	-	-	-	-	-
试验2	-	-	-	-	ND
						试验3	-	-	-	-	-
试验4	-	-	-	-	-
						试验5	-	-	-	-	-
试验6	-	-	-	-	＜3.61
						试验7	-	-	-	-	-
试验8	-	-	-	-	-
						试验9	-	-	-	-	-
试验10	-	-	-	-	-

※“ND”表示未获得数据。

※“-”表示为检测限以下。

※“＜3.61”表示为定量限以下、但是针对HBV检测到特异性的扩增反应信号。

[表1-2]

表1-2：HBV给药和正常小鼠IgG抗体给药小鼠中的血清HBV DNA量的推移(对照组)

	1周后	2周后	3周后	4周后	5周后
						对照1	-	＜3.61	3.84	4.63	5.6
对照2	-	-	3.64	4.29	4.98
						对照3	＜3.61	＜3.61	4.39	5.15	5.92
对照4	-	-	＜3.61	3.97	4.44
						对照5	-	-	＜3.61	4.21	4.85
对照6	＜3.61	＜3.61	＜3.61	4.06	4.56
						对照7	-	-	3.79	4.4	4.95
对照8	-	-	＜3.61	4.06	4.76
						对照9	-	-	3.83	4.77	5.58
对照10	-	-	3.65	4.54	5.34

※“-”表示为检测限以下。

※“＜3.61”表示为定量限以下、但是针对HBV检测到特异性的扩增反应信号。

[表2-1]

表2-1：HBV给药和N6HB426-20抗体给药小鼠中的胆汁酸浓度的推移(试验组)

	给药前	刚给药后	1周后	2周后	3周后	4周后
							试验1	207	924	642	738	282	285
试验2	147	885	297	582	186	189
							试验3	57	1398	483	684	351	156
试验4	111	1044	267	399	81	87
							试验5	228	900	534	210	426	561
试验6	222	828	531	408	294	183
							试验7	114	774	399	474	480	93
试验8	165	978	765	738	690	312
							试验9	72	969	951	591	114	234
试验10	66	744	264	723	186	330

[表2-2]

表2-2：HBV给药和正常小鼠IgG抗体给药小鼠中的胆汁酸浓度的推移(对照组)

	给药前	刚给药后	1周后	2周后	3周后	4周后
							对照1	123	114	225	183	90	159
对照2	183	180	225	147	234	123
							对照3	108	201	138	114	192	255
对照4	84	147	210	156	75	78
							对照5	126	162	150	114	186	96
对照6	84	48	36	132	132	63
							对照7	108	51	30	33	30	123
对照8	93	87	117	156	30	33
							对照9	138	198	219	174	207	162
对照10	171	225	159	168	168	228

HBV感染受体NTCP在生物体中显示肝细胞的胆汁酸吸收功能，考虑到临床应用的情况下，了解所得抗体的反应是否会抑制该吸收效果已成为重要课题。此前开发的Myrcludex B或Cyclospolin A介由与NTCP结合而发挥HBV的感染抑制效果，但同时观察到抑制胆汁酸摄入的副作用，被避免临床应用。因此以下确认了抗体对于胆汁酸摄入作用的抑制效果。具体而言，在抗体(HB426-20抗体或HB426-s102抗体)、preS1、或不具有NTCP结合活性的异构体preS1 isomer(均为最高浓度1000nM起的10倍稀释系列(4点))存在下或不存在下，对人NTCP表达HepG2进行30分钟处理。然后，在洗涤、置换为牛磺胆酸吸收用分析缓冲液并驯化后，加入[³H]-牛磺胆酸，在37℃、CO₂培养箱中进行15分钟摄入，洗涤细胞后，通过闪烁计数器测定细胞内的[³H]。

通过preS1(吸收抑制)和preS1-isomer(无吸收抑制)确认了分析系统是否工作。其结果是，试管内的胆汁酸吸收试验中，preS1以100nM观察到60％的摄入抑制，在1000nM下观察到96％的摄入抑制。另一方面，在同一实验条件下，N6HB426-20抗体在1000nM浓度下显示3％的胆汁酸摄入抑制，在感染抑制活性所必需的浓度(IC₅₀ 20～30nM)下几乎不显示胆汁酸摄入抑制(参照图3)。由此暗示了，适当给药用量的N6HB426-20抗体抑制HBV的感染完成且胆汁酸摄入抑制作用弱。

N6HB426-20抗体的表位作图

为了明确HBV感染抑制功能，进行了N6HB426-20抗体的NTCP的表位作图，明确了与HBV感染重要区域的关系。使用基于丙氨酸扫描法的NTCP变异体转染子，评价了特定氨基酸残基对于HBV感染的敏感性、基于抗体的抑制活性变化和FACS分析的贡献。该结果明确了人NTCP的276～277氨基酸残基对抗体有影响，但是该氨基酸残基并非对HBV感染有显著影响的部位(参照图9)。但是想到了下述可能性：276～277氨基酸残基的两端(274～275和278～279氨基酸残基)也成为HBV感染的表位，由于因N6HB426抗体结合到276～277氨基酸残基而产生的位阻，抑制HBV与NTCP的274～275和278～279氨基酸残基的结合。另一方面，Y146A、D149A和D152A的三重氨基酸残基变异(YDD146、149、152AAA)的情况下，观察到HBV感染的强烈抑制和抗体结合的减弱，进而详细分析了该现象，结果是第146位的氨基酸被识别为病毒感染的表位，另外被识别为抗体的表位的一部分(图4、图5B)。特别地，Y146A的单独变异体与N6HB426抗体的结合显著降低(参照图5A左侧)。另外，HBV对表达Y146A的单独变异体的人肝细胞的感染受到抑制(参照图5A右侧)。因此明确了，Y146为与病毒对细胞的感染和N6HB426-20抗体的结合有关的氨基酸。将结果总结于图6。另外，YDD146、149、152AAA的三重变异体与N6HB426抗体的结合降低并且使HBV感染降低。因此明确了，Y146、D149、D152是与病毒对细胞的感染和N6HB426-20抗体的结合有关的氨基酸。另外，由这些结果暗示了，N6HB426-20抗体与HBV所结合的NTCP的区域是重叠或靠近的，并且暗示了，该区域(146、149、152氨基酸残基和274～279氨基酸残基)是对基于NTCP的胆汁酸摄入作用小的区域。因此认为，针对该区域的抗体不易抑制胆汁酸摄入，但另一方面，可以防止对HBV的感染。由此，本实施例详细地阐明了HBV的感染完成所必需的NTCP上的氨基酸区域，由此可知与NTCP的野生型结合、但不与上述变异体结合的抗体特性的重要性，基于该抗体特性，期待能够建立将感染抑制与胆汁酸摄入能力的抑制分开的抗体的获得方法以及试验系统。

另外，明确了抗体表位附近的278～279氨基酸残基是HBV感染所必需的氨基酸残基(参照图7)，还明确了276～277氨基酸残基与N6HB426-20抗体的结合有关(参照图8)。如图7所示，PE276、277AA的二重变异体不抑制HBV感染，该感染不能被N6HB426-20抗体抑制。由此暗示了，N6HB426-20抗体并非对HBV感染有显著影响的部位，但是以附近的氨基酸为表位，由此抑制HBV对人肝细胞的感染。将结果总结于图9。

杂交瘤的克隆和抗体纯化

有限稀释法

对于产生具有NTCP依赖性的HBV感染抑制活性的抗体的杂交瘤，复苏后，用HT培养基(含有18％FCS、10％BM-condimed H1的RPMI1640)以达到0.3细胞和1细胞/孔的方式进行稀释，播种于96孔板。每隔3～4天将上清更换为新的HT培养基，对于确认已充分生长的克隆采集上清的一部分，与上述筛选同样地利用FACS分析进行抗体产生的确认和HBV感染抑制活性的评价。对于能够确认到活性的克隆，通过2次有限稀释重复进行杂交瘤的克隆。

无血清培养基中的细胞驯化和单克隆抗体的生产

经过两阶段的步骤来进行无血清培养基中的驯化。作为第一阶段，重复进行从HT培养基中阶段性降低FCS、HT和BM-condimed H1浓度的操作和细胞增殖的确认，最终使其适应于10％FCS、无HT且无BM-condimed H1的RMPI-1640培养基中的培养。然后，利用无血清PFHM-II(GIBCO，23600042)培养基降低FCS浓度并进行培养，确认到处于杂交瘤的增殖期。继续阶段性地降低FCS浓度，最终使其在无血清培养基中驯化。分取5×10⁷个细胞，转移到使用无血清培养基的CELLine烧瓶培养(BD 353137)。在37℃、5％CO₂下培养14天后，从细胞培养室回收细胞和培养基并离心，得到含有抗体的培养上清。

抗体纯化

将回收的培养上清透析到结合用缓冲液(20mM磷酸钠，pH7.0)中后，在4℃下与蛋白G琼脂糖4Fast Flow(GE Healthcare)混合一晚。第二天将蛋白G与培养上清的混合液上样到纯化柱中，用结合用缓冲液洗涤而去除非抗体蛋白。然后，用Arg-抗体洗脱缓冲液(pH4.0，nacalai tesque 17088-15)洗脱抗体，立即用1M Tris-HCl，pH9.0中和。抗体级分用超滤旋转柱浓缩后，透析到PBS中，灭菌过滤后在4℃下保存。

实施例3：编码N6HB426抗体的基因的序列确定

1.从杂交瘤提取总RNA

从产生N6HB426抗体的杂交瘤中提取总RNA时，按照TRIZOL^TM试剂(Thermo FisherCat.No.15596-018)的制造商手册在以下条件下进行。

(1)向10⁷个细胞的颗粒中加入TRIZOL^TM试剂1mL，轻轻地吹打而使其溶解，在室温下静置5分钟。

(2)加入0.2mL的氯仿，剧烈搅拌后在室温下静置5分钟。

(3)进行20400×g、4℃、15分钟的离心后，仅采集上层的水相。

(4)向采集的水相中加入0.5mL的异丙醇并进行混合，在室温下静置10分钟后，通过20400×g的旋转进行4℃、10分钟的离心。

(5)弃掉上清，向残留的沉淀物中加入75％乙醇液1mL，轻轻地颠倒混合后，进行7500×g、4℃、5分钟的离心。

(6)将乙醇完全去除，使沉淀物自然干燥。

(7)向沉淀物中加入50μL的无RNase水，在60℃下加热10分钟，使总RNA溶解。

2.由总RNA合成单链cDNA

以从产生N6HB426抗体的杂交瘤提取的总RNA为模板，RT反应中，按照SMARTer^TMRACE 5’/3’试剂盒(Clontech Cat.No.634859)的制造商手册，合成在5’端添加了SMARTerII A寡核苷酸的单链cDNA。

(1)向总RNA 0.5μg中加入5’-RACE CDS引物A(12μM)1μL和无RNase水并使其达到11μL，进行72℃下3分钟、42℃下2分钟的反应后，立即加入SMARTer II A寡核苷酸(24μM)1μL。

(2)将5×第一链缓冲液4μL、DTT(100mM)0.5μL、dNTP mix(20mM)1μL、RNase抑制剂(40U/l)0.5μL、SMARTScribe反转录酶(100U/μl)2μL与(1)的反应液混合，进行42℃下90分钟、70℃下10分钟的反应。

(3)添加Tricine-EDTA缓冲液50μl使反应停止，在-20℃下保存。

3.小鼠抗体(IgG)序列特异性RACE PCR反应

按照SMARTer^TM RACE 5’/3’试剂盒(Clontech Cat.No.634859)的说明书，进行5’RACE PCR分析。

(1)以上述2中合成的cDNA为模板，将试剂盒中所含的UPM(Universal primermix，通用引物混合物)作为正向引物、另外将小鼠抗体(IgG)重链特异性引物(IgGFab(+39)_Rv(序列号1))作为反向引物，进行RACE PCR反应。同样地，以上述2中合成的cDNA为模板，将UPM(通用引物混合物)作为正向引物、另外将小鼠抗体(IgG)轻链特异性引物(IgKFab_Rv(序列号2))作为反向引物，进行RACE PCR反应。PCR酶使用PrimeSTAR^TM GXL DNA聚合酶(宝生物株式会社Cat.No.R050A)。PCR反应按照上述试剂盒附带的制造商手册来进行。

(2)通过使用琼脂糖凝胶进行电泳，来确认得到了假设大小的PCR产物。将各PCR产物从凝胶中切出并纯化，在分析中使用。

4.克隆和碱基序列分析

(1)将如上纯化后的PCR产物分别连接于克隆质粒pMD20-T(宝生物株式会社)。

(2)通过常规方法进行转化，每个PCR产物得到5个克隆。

(3)按照常规方法分析了所得克隆中所含的插入物的序列。测序反应使用BigDyeTerminators v3.1循环测序试剂盒(ABI公司)并按照制造商手册利用ABI3730测序仪(ABI公司)来进行。

(4)得到了重链、轻链、各5个克隆的碱基序列分析结果以及从其中去除了载体区域和低准确度区域的碱基序列。

5.序列确定

接着，使用上述4-(4)中得到的碱基序列进行以下分析。

(1)获得序列的分类和共有序列的获得

将重链、轻链的碱基序列按照同源性分类。同源性比较利用DNA序列组装软件、SEQUENCHER^TM(Gene Codes：Windows版)进行。该结果是，重链得到了4个重叠群、轻链得到了1个重叠群。由得到的重叠群获得共有序列。

(2)关于目标基因的候补序列

从共有序列中筛选认为是目标基因的候补的序列。在此选择了所有的在抗体恒定区基因的氨基酸序列上游不包括终止密码子且具有甲硫氨酸残基的序列。

(3)氨基酸序列的推定

根据候补序列中形成了重叠群的序列数和认为是获得序列的基因长度，认为重链、轻链各自的主要重叠群为目标序列的可能性高。因此，将各自的主要重叠群的共有序列所编码的氨基酸序列作为重链和轻链的氨基酸序列。

将通过以上方法获得的N6HB426-20抗体的重链和轻链的可变区的氨基酸序列示于以下。将重链可变区的氨基酸序列示于序列号3。将轻链可变区的氨基酸序列示于序列号4。根据Kabat等的编号(Kabat,E.A.et al.,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th ed.,1991,Bethesda:US Dept.of Health and Human Services,PHS,NIH.)，重链可变区的序列号3中，31～35位相当于CDR1(序列号5；HCDR1)、50～66位相当于CDR2(序列号6；HCDR2)、99～115位相当于CDR3(序列号7；HCDR3)。同样地，根据Kabat等的编号，轻链可变区的序列号4中，24～35位相当于CDR1(序列号8；LCDR1)、51～57位相当于CDR2(序列号9；LCDR2)、90～98位相当于CDR3(序列号10；LCDR3)。以下，重链和轻链的CDR1～3分别由下划线粗体字来示出。以下示出基于Kabat的编号推定的CDR区域。

N6HB426-20抗体的重链可变区的氨基酸序列

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N6HB426-20抗体的轻链可变区的氨基酸序列

将所确定的N6HB426抗体的重链可变区和轻链可变区与小鼠IgG2a抗体的恒定区以框内方式连接，制作N6HB426-20-IgG2a抗体。关于N6HB426-20-IgG2a抗体抑制HBV对肝细胞的感染的作用，如上述所说明(参照图2B)。

实施例4：重组小鼠IgG2a抗体和人嵌合IgG4抗体的制作和评价

(1)重组小鼠IgG2a抗体的制作

通过将N6HB426-20抗体的恒定区置换为小鼠的抗体的恒定区而制作。即，在编码N6HB426抗体的重链可变区至作为恒定区的一部分的CH1(序列号15)的基因的3’端，连接编码来自小鼠IgG2a的作为恒定区的一部分的铰链区至CH2和CH3(序列号16)的基因的5’端。在所完成的基因的5’端连接编码小鼠IgK分泌序列(GenBank：AAH80787.1).(序列号17)的基因的3’端，整合到表达载体pcDNA3.4中，从而完成了重组N6HB426-20抗体重链蛋白表达构建物。

另外，在编码N6HB426抗体的轻链可变区至恒定区CL(序列号18)的基因的5’端连接编码小鼠IgK分泌序列(GenBank：AAH80787.1).(序列号17)的基因的3’端，整合到表达载体pcDNA3.4中，从而完成了重组N6HB426-20抗体轻链蛋白表达构建物。

按照ThermoFisher Scientific公司的Expi293^TM表达系统用户指南实施重组抗体的利用细胞的表达。

将7μg的重组N6HB426-20抗体重链蛋白表达构建物和22μg的重组N6HB426-20抗体轻链蛋白表达构建物同时稀释到1.5ml的Opti-MEM中，然后，将添加了80μl的ExpiFectamine^TM 293试剂的1.5ml的Opti-MEM在室温下静置5分钟。将两液混合，在室温下静置20分钟后，添加到在8％CO₂存在下在37℃下在30ml的Expi293^TM表达培养基中培养的2.5×10⁶个Expi293F细胞中。20小时后，添加150μl的ExpiFectamine^TM 293转染增强剂1和1.5ml的ExpiFectamine^TM 293转染增强剂2，6天后回收培养液。将回收的培养液在4℃下以11000xg离心20分钟，将得到的上清用0.45μm过滤器过滤后，从填充有蛋白G琼脂糖4FastFlow(GE Healthcare cat.No.17061805)的柱中通过。使柱容积5倍量的洗涤用缓冲液(20mM Tris-HCl(pH7.5)，1M NaCl)通过柱后，用0.1M甘氨酸-HCl缓冲液(pH 2.7)洗脱与蛋白G琼脂糖结合的抗体，向洗脱液中添加相当于洗脱液量的十分之一的体积的中和液(1MTris-HCl(pH 9))。对于中和后的洗脱液，使用Amicon Ultra-15,Ultracel-50再生纤维素膜，15mL样品体积(Millipore，cat.No.UFC905024)按照用户手册用PBS进行缓冲液置换，同时将抗体浓缩至2mg/ml以上的浓度。通过上述步骤得到重组小鼠IgG2a抗体。

(2)重组N6HB426人嵌合IgG4抗体的制作

通过将N6HB426-20抗体的恒定区置换为人抗体的恒定区而制作。

即，在编码N6HB426-20抗体的重链可变区(序列号19)的基因的3’端，连接编码来自人IgG4抗体的作为恒定区的CH1经铰链区、CH2至CH3(序列号20)的基因的5’端。在所完成的基因的5’端连接编码小鼠Igκ分泌序列(GenBank：AAH80787.1).(序列号17)的基因的3’端，整合到表达载体pcDNA3.4中，从而完成了具有序列号21所示的序列的重组N6HB426人嵌合IgG4抗体重链蛋白的表达构建物。

另外，在编码N6HB426-20抗体的轻链可变区(序列号22)的基因的3’端，连接编码人Igκ型轻链恒定区(UniProtKB/Swiss-Prot：P01834.2)(序列号23)的基因的5’端。在所完成的基因的5’端连接编码小鼠Igκ分泌序列(GenBank：AAH80787.1).(序列号17)的基因的3’端，整合到表达载体pcDNA3.4中，从而完成了具有序列号24所示的序列的重组N6HB426人嵌合抗体轻链蛋白的表达构建物。

按照ThermoFisher Scientific公司的Expi293^TM表达系统用户指南实施重组抗体的利用细胞的表达。

将7μg的重组N6HB426人嵌合IgG4抗体重链蛋白表达构建物和22μg的重组N6HB426人嵌合抗体轻链蛋白表达构建物同时稀释到1.5ml的Opti-MEM中，然后，将添加了80μl的ExpiFectamine^TM 293试剂的1.5ml的Opti-MEM在室温下静置5分钟。将两液混合，在室温下静置20分钟后，添加到在8％CO2存在下在37℃下在30ml的Expi293^TM表达培养基中培养的2.5×10⁶个Expi293F细胞中。20小时后，添加150μl的ExpiFectamine^TM 293转染增强剂1和1.5ml的ExpiFectamine^TM 293转染增强剂2，6天后回收培养液。将回收的培养液在4℃下以11000×g离心20分钟，将得到的上清用0.45μm过滤器过滤后，从填充有蛋白G琼脂糖4FastFlow(GE Healthcare cat.No.17061805)的柱通过。使柱容积的5倍量的洗涤用缓冲液(20mM Tris-HCl(pH7.5)，1M NaCl)通过柱后，用0.1M甘氨酸-HCl缓冲液(pH 2.7)洗脱与蛋白G琼脂糖结合的抗体，向洗脱液中添加相当于洗脱液量的十分之一的体积的中和液(1MTris-HCl(pH 9))。对于中和后的洗脱液，使用Amicon Ultra-15,Ultracel-50再生纤维素膜，15mL样品体积(Millipore，cat.No.UFC905024)按照用户手册用PBS进行缓冲液置换，同时将抗体浓缩到2mg/ml以上的浓度。由此得到重组N6HB426人嵌合IgG4抗体。

(3)得到的抗体的抗原结合亲和性的测定

使用固定有上述(1)和(2)中得到的N6HB426抗体的CM5芯片，通过25℃的BIAcore^TM-2000(BIAcore,Inc.，Piscataway，NJ)进行表面等离子体共振分析，测定缔合速率(Ka)和解离速率(Kd)。简单而言，将羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIAcoreInc.)按照提供者的指示书用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化。将抗小鼠IgG抗体用10mM乙酸钠(pH5.2)稀释至30μg/ml，以5～10μl/分钟的流速注入，使得所结合的蛋白质的反应单位(RU)达到约9000～14000RU。另一方面，将抗人IgG抗体用10mM乙酸钠(pH5.0)稀释至25μg/ml，以5～10μl/分钟的流速注入，使得所结合的蛋白质的反应单位(RU)达到约9000～14000RU。注入各抗IgG抗体后，为了封闭不反应的组而注入1M的乙醇胺。为了动力学测定，将用运行缓冲液(HBS-P：10mM HEPESpH7.5，150mM NaCl，0.005％NP40)稀释至10μg/ml的N6HB426抗体介由抗小鼠IgG抗体预先固定化于CM5芯片，在25℃下向其中以10μl/分钟的流速添加2分钟用运行缓冲液稀释至各种浓度的含有表位区域的肽片段(AFPPEVIGPLFFFPLLYMIFQLGEG-biotin：序列号24)。另一方面，重组N6HB426人嵌合IgG4抗体在用运行缓冲液稀释至10μg/ml后，介由抗人IgG抗体预先固定化于传感器芯片(CM5)，在25℃下以10μl/分钟的流速向其中添加2分钟用运行缓冲液稀释至各种浓度的含有表位区域的肽片段。

实时监测与通过肽片段分子结合于传感器芯片上的N6HB426抗体而产生的芯片表面的质量变化有关的溶液的折射率变化，使用基于同时对抗原-抗体间的缔合和解离的传感图进行拟合的简单一对一朗缪尔结合模型(simple one-to-one Langmuir bindingmodel)(BIAcore Evaluation软件版本3.1)计算缔合速率(Ka)和解离速率(Kd)。计算出平衡解离常数(KD)作为Kd/Ka比。结果如表3所示。

[表3]

表3：所得抗体的缔合速率(Ka)、解离速率(Kd)和平衡解离常数(KD)

N6HB426-20抗体的类型	Ka(1/Ms)	Kd(1/s)	KD(M)
				杂交瘤产生抗体	821.2	3.19×10-8	3.88×10-11
重组小鼠IgG2a抗体	761.7	2.39×10-7	3.13×10-10
				重组N6HB426人嵌合IgG4	1339	1.73×10-7	1.29×10-10

如表3所示，与杂交瘤所产生的抗体的结合亲和性(KD＝38.8pM)相比，虽然稍差，但重组小鼠抗体、人嵌合化抗体依然都保持了显示100pM级别的KD值的强的结合亲和性。

(4)假病毒分析

使用N6HB426-20小鼠IgG(杂交瘤产生抗体)、重组N6HB426人嵌合IgG4抗体或作为阴性对照的抗OVA抗体(各0.03μg/mL至100μg/mL)、作为比较对照的PreS1(0.03ng/mL至3ng/mL)进行抗HBV分析。为了验证抗HBV感染抑制分析系统是否工作，使用了HBV发病预防药人抗HBs免疫球蛋白(HBIG：0.0026U/mL至2.6U/mL)。在96孔培养板中以5×10⁴细胞/孔播种HepG2-人NTCP细胞株，用供试试剂培养2小时。然后，使插入了NanoLuc基因(HBV/NL)的重组假HBV进行感染。感染24小时后，将细胞用PBS洗涤3次，在感染后第8天，将宿主细胞的NanoLuc活性和细胞存活率通过3次重复测定进行平均化而求出。NanoLuc活性使用Nano-Glo荧光素酶分析系统(Promega)来求出，细胞存活率通过CellTiter-Glo 2.0分析系统(Promega)进行评价。关于由添加抗体等带来的假病毒的感染抑制率，从未处理孔中的细胞的NanoLuc活性值减去非感染孔的细胞的NanoLuc活性值，将所得值设为100，以其比率(％)求出。计算出显示供试试剂的最大抑制值的50％效果的浓度作为IC₅₀值。细胞存活率以添加试剂的最大浓度下的细胞存活数相对于对照区的比率来表示。

为了评价将杂交瘤产生抗体的Fc区变更成人IgG4的重组抗体对于HBV的细胞感染的抑制效果而实施比较试验，尝试通过IC₅₀值进行评价。在基于NanoLuc活性的HBV的宿主细胞感染试验中，HBIG的IC₅₀值(0.013±0.001U/mL)满足测定系统的anti-HBV抑制的评价基准。将本试验中得到的抑制曲线和计算出的IC₅₀示于图12(分别为a和b)。如图12a所示，杂交瘤产生抗体和重组N6HB426人嵌合IgG4抗体的抑制曲线为同等，IC₅₀值均为1.7μg/mL。如图12b所示，IC₅₀值低于PreS1添加区，显示出强的抑制效果。如图12c所示，所有试剂添加区的宿主细胞的存活率均与无处理区为同等，因此表明NanoLuc活性的抑制为HBV感染抑制的结果。由以上判明，将Fc区域变更成人IgG4的重组抗体具有与杂交瘤产生抗体同等的HBV感染抑制活性。

实施例5：重组N6HB426人嵌合IgG4抗体对体外胆汁酸转运体活性的影响

将HepG2-人NTCP细胞株以2×10⁵细胞/孔播种于48孔培养板。第二天用不同浓度(1、10、100、1000nM)的PreS1、PreS1-isomer和重组N6HB426人嵌合IgG4抗体处理30分钟后，用Na⁺林格氏溶液(将145mM NaCl、4.8mM KCl、1.2mM MgSO₄、1.2mM KH₂PO₄ 1.5mM CaCl₂、20mM葡萄糖、10mM HEPE溶液用Tris制备为pH 7.4)洗涤细胞，在37℃下再培养10分钟后，以最终浓度1μM添加[³H]-牛磺胆酸(铂金埃尔默，NET322)。[³H]-牛磺胆酸的细胞摄入通过在37℃的温度设定下培养15分钟来进行。用冰冷磷酸缓冲生理盐水(PBS)洗涤后，用100μl的1％Triton X-100水溶液使细胞溶解5分钟，悬浮于900μl的液体闪烁混合物(Ultima GoldXR、铂金埃尔默)。[³H]-牛磺胆酸的细胞内摄入量使用液体闪烁计数器(LSC-6100，アロカ公司)来测量。

结果如图13所示。如图13所示，通过添加1000nM作为人NTCP结合肽的Pre-S1，胆汁酸的摄入被抑制至1/20，而作为阴性对照的pre-S1isomer则未观察到摄入抑制。在添加1000nM作为抗人NTCP抗体的N6HB426人嵌合IgG4抗体时，也未观察到胆汁酸摄入的抑制作用。

实施例6：重组N6HB426人嵌合IgG4抗体的ADCC活性

使用Daudi-人NTCP转染子作为靶细胞。使用自然杀伤细胞株KHYG-1小鼠FcγRIII或人FcγRIIIa转染子作为效应细胞，用于小鼠抗体或人嵌合抗体的ADCC活性的评价。靶细胞在作为荧光色素的钙黄绿素-AM(1μg/ml、ナカライテスク#06735-81)存在下在37℃培养1小时而进行标记。将靶细胞洗涤后以1×10⁴个细胞/孔播种于96孔U底板，加入各种抗体(最终浓度：0.01、0.1、1、10μg/ml)，然后添加效应细胞。效应：靶(E：T)细胞数比为10：1。在37℃、5％CO₂下培养3小时后，回收培养上清，以485nm波长的荧光强度测定从靶细胞漏出的钙黄绿素-AM(ARVO×3，PerkinElmer，Inc.)。背景使用了仅靶细胞的培养上清。最大放出量的测定中，使用通过将细胞用1％Triton X-100溶解而得的上清。各样品的ADCC活性比例通过溶解率＝(实验样品-背景放出)/(最大放出-背景放出)×100来计算。

结果如图14所示。如图14所示，针对人CD20抗原的嵌合抗体(Ritximab)与CD20阳性细胞株反应，KHYG-1-FcγRIII依赖性地显示细胞杀伤活性。但是，在所有浓度下均未检测到重组N6HB426人嵌合IgG4抗体对NTCP表达细胞的ADCC活性。

实施例7：人嵌合抗体和病毒中和能力的验证

向96孔平底板中播种每孔7×10⁴个PXB细胞(PhoenixBio，Hiroshima，Japan)，在65μL的dHCGM培养基(添加有10％FBS、20mM HEPES、44mM NaHCO₃、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、15μg/mL L-脯氨酸、0.25μg/mL胰岛素、50nM地塞米松、5ng/mL EGF、0.1mM Asc-2P、2％DMSO的DMEM)中在37℃、5％CO₂的条件下开始培养(第0天)。在培养开始1天后和3天后进行培养基交换，在8天后(第8天)交换成添加抗体的培养基(60μL)。添加抗体的培养基包含dHCGM培养基54μL、2％DMSO、PBS(-)和作为阴性对照的正常小鼠IgG(富士胶片和光纯药，Tokyo，Japan)或作为试验组的重组N6HB426人嵌合IgG4抗体。正常小鼠IgG以100μg/mL的浓度进行添加，重组N6HB426人嵌合IgG4抗体以0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL的各浓度进行添加。交换成添加抗体的培养基后，在37℃、5％CO₂的条件下温育2小时，接着添加5μL含有每细胞为10基因组当量的浓度的HBV的感染源(dHCGM培养基、2％DMSO)。在该HBV接种的第二天(第9天)和2天后(第10天)进行培养基交换。在HBV接种的9天后(第17天)回收培养上清，测定HBs抗原量和HBe抗原量。

结果如图15(HBs抗原量)和图16(HBe抗原量)所示。如图15所示，HBs抗原量随着抗体量增加而呈用量依赖性地减少。另外，如图16所示，HBe抗原量随着抗体量增加而呈用量依赖性地减少。由这些结果暗示了，本发明的抗体对活HBV病毒的感染具有中和能力。

序列表

序列号1：IgGFab(+39)_Rv引物

序列号2：IgKFab_Rv引物

序列号3：N6HB426-20抗体的重链可变区的氨基酸序列

序列号4：N6HB426-20抗体的轻链可变区的氨基酸序列

序列号5：N6HB426-20抗体的重链CDR1的氨基酸序列

序列号6：N6HB426-20抗体的重链CDR2的氨基酸序列

序列号7：N6HB426-20抗体的重链CDR3的氨基酸序列

序列号8：N6HB426-20抗体的轻链CDR1的氨基酸序列

序列号9：N6HB426-20抗体的轻链CDR2的氨基酸序列

序列号10：N6HB426-20抗体的轻链CDR3的氨基酸序列

序列号11：野生型人NTCP的氨基酸序列的一例

序列号12：具有Y146A的氨基酸变异的人NTCP的氨基酸序列

序列号13：具有Y146A、D149A和D152A的三重氨基酸变异的人NTCP的氨基酸序列

序列号14：具有P276A和E277A的二重氨基酸变异的人NTCP变异体

序列号15：N6HB426-20抗体重链可变区至恒定区CH1的氨基酸序列

序列号16：铰链区至CH2和CH3的氨基酸序列

序列号17：小鼠IgK分泌序列

序列号18：轻链可变区至恒定区CL

序列号19：N6HB426-20抗体重链可变区

序列号20：人IgG4的CH1经铰链区、CH2至CH3

序列号21：N6HB426人嵌合IgG4抗体重链

序列号22：轻链可变区

序列号23：人Igκ型轻链恒定区

序列号24：N6HB426人嵌合抗体轻链

序列表

<110> 国立研究开发法人理化学研究所

国立研究开发法人国立国际医疗研究中心

国立大学法人广岛大学

<120> 能够抑制乙型肝炎病毒(HBV)对人肝细胞的感染的与人NTCP结合的抗体

<130> PR13-9016WO

<150> JP2019-184790

<151> 2019-10-07

<150> JP2020-126445

<151> 2020-07-27

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IgGFab(+39)_Rv

<400> 1

tttgggggga agatgaagac agatg 25

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IgKFab_Rv

<400> 2

acactcattc ctgttgaagc tcttgacga 29

<210> 3

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N6HB426抗体重链可变区

<400> 3

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Asp Phe Thr Phe Thr Glu Tyr

20 25 30

Thr Ile His Trp Ile Lys Gln Met Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Phe Tyr Pro Gly Ser Gly Asp Ile Lys Tyr Ser Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Asn Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg His Met Arg Asp Phe Arg Gly Phe Tyr Tyr Gly Arg Phe Tyr

100 105 110

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 4

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N6HB426抗体轻链可变区

<400> 4

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Val Ser Pro Lys Leu Trp

35 40 45

Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Arg

85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Thr Leu Glu Ile Lys Arg Ala

100 105 110

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N6HB426 HCDR1

<400> 5

Glu Tyr Thr Ile His

1 5

<210> 6

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N6HB426 HCDR2

<400> 6

Trp Phe Tyr Pro Gly Ser Gly Asp Ile Lys Tyr Ser Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 7

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N6HB426 HCDR3

<400> 7

His Met Arg Asp Phe Arg Gly Phe Tyr Tyr Gly Arg Phe Tyr Phe Asp

1 5 10 15

Tyr

<210> 8

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N6HB426 LCDR1

<400> 8

Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu His

1 5 10

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N6HB426 LCDR2

<400> 9

Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N6HB426 LCDR3

<400> 10

Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Arg Trp Thr

1 5

<210> 11

<211> 349

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 11

Met Glu Ala His Asn Ala Ser Ala Pro Phe Asn Phe Thr Leu Pro Pro

1 5 10 15

Asn Phe Gly Lys Arg Pro Thr Asp Leu Ala Leu Ser Val Ile Leu Val

20 25 30

Phe Met Leu Phe Phe Ile Met Leu Ser Leu Gly Cys Thr Met Glu Phe

35 40 45

Ser Lys Ile Lys Ala His Leu Trp Lys Pro Lys Gly Leu Ala Ile Ala

50 55 60

Leu Val Ala Gln Tyr Gly Ile Met Pro Leu Thr Ala Phe Val Leu Gly

65 70 75 80

Lys Val Phe Arg Leu Lys Asn Ile Glu Ala Leu Ala Ile Leu Val Cys

85 90 95

Gly Cys Ser Pro Gly Gly Asn Leu Ser Asn Val Phe Ser Leu Ala Met

100 105 110

Lys Gly Asp Met Asn Leu Ser Ile Val Met Thr Thr Cys Ser Thr Phe

115 120 125

Cys Ala Leu Gly Met Met Pro Leu Leu Leu Tyr Ile Tyr Ser Arg Gly

130 135 140

Ile Tyr Asp Gly Asp Leu Lys Asp Lys Val Pro Tyr Lys Gly Ile Val

145 150 155 160

Ile Ser Leu Val Leu Val Leu Ile Pro Cys Thr Ile Gly Ile Val Leu

165 170 175

Lys Ser Lys Arg Pro Gln Tyr Met Arg Tyr Val Ile Lys Gly Gly Met

180 185 190

Ile Ile Ile Leu Leu Cys Ser Val Ala Val Thr Val Leu Ser Ala Ile

195 200 205

Asn Val Gly Lys Ser Ile Met Phe Ala Met Thr Pro Leu Leu Ile Ala

210 215 220

Thr Ser Ser Leu Met Pro Phe Ile Gly Phe Leu Leu Gly Tyr Val Leu

225 230 235 240

Ser Ala Leu Phe Cys Leu Asn Gly Arg Cys Arg Arg Thr Val Ser Met

245 250 255

Glu Thr Gly Cys Gln Asn Val Gln Leu Cys Ser Thr Ile Leu Asn Val

260 265 270

Ala Phe Pro Pro Glu Val Ile Gly Pro Leu Phe Phe Phe Pro Leu Leu

275 280 285

Tyr Met Ile Phe Gln Leu Gly Glu Gly Leu Leu Leu Ile Ala Ile Phe

290 295 300

Trp Cys Tyr Glu Lys Phe Lys Thr Pro Lys Asp Lys Thr Lys Met Ile

305 310 315 320

Tyr Thr Ala Ala Thr Thr Glu Glu Thr Ile Pro Gly Ala Leu Gly Asn

325 330 335

Gly Thr Tyr Lys Gly Glu Asp Cys Ser Pro Cys Thr Ala

340 345

<210> 12

<211> 349

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人NTCP的Y146A突变体

<400> 12

Met Glu Ala His Asn Ala Ser Ala Pro Phe Asn Phe Thr Leu Pro Pro

1 5 10 15

Asn Phe Gly Lys Arg Pro Thr Asp Leu Ala Leu Ser Val Ile Leu Val

20 25 30

Phe Met Leu Phe Phe Ile Met Leu Ser Leu Gly Cys Thr Met Glu Phe

35 40 45

Ser Lys Ile Lys Ala His Leu Trp Lys Pro Lys Gly Leu Ala Ile Ala

50 55 60

Leu Val Ala Gln Tyr Gly Ile Met Pro Leu Thr Ala Phe Val Leu Gly

65 70 75 80

Lys Val Phe Arg Leu Lys Asn Ile Glu Ala Leu Ala Ile Leu Val Cys

85 90 95

Gly Cys Ser Pro Gly Gly Asn Leu Ser Asn Val Phe Ser Leu Ala Met

100 105 110

Lys Gly Asp Met Asn Leu Ser Ile Val Met Thr Thr Cys Ser Thr Phe

115 120 125

Cys Ala Leu Gly Met Met Pro Leu Leu Leu Tyr Ile Tyr Ser Arg Gly

130 135 140

Ile Ala Asp Gly Asp Leu Lys Asp Lys Val Pro Tyr Lys Gly Ile Val

145 150 155 160

Ile Ser Leu Val Leu Val Leu Ile Pro Cys Thr Ile Gly Ile Val Leu

165 170 175

Lys Ser Lys Arg Pro Gln Tyr Met Arg Tyr Val Ile Lys Gly Gly Met

180 185 190

Ile Ile Ile Leu Leu Cys Ser Val Ala Val Thr Val Leu Ser Ala Ile

195 200 205

Asn Val Gly Lys Ser Ile Met Phe Ala Met Thr Pro Leu Leu Ile Ala

210 215 220

Thr Ser Ser Leu Met Pro Phe Ile Gly Phe Leu Leu Gly Tyr Val Leu

225 230 235 240

Ser Ala Leu Phe Cys Leu Asn Gly Arg Cys Arg Arg Thr Val Ser Met

245 250 255

Glu Thr Gly Cys Gln Asn Val Gln Leu Cys Ser Thr Ile Leu Asn Val

260 265 270

Ala Phe Pro Pro Glu Val Ile Gly Pro Leu Phe Phe Phe Pro Leu Leu

275 280 285

Tyr Met Ile Phe Gln Leu Gly Glu Gly Leu Leu Leu Ile Ala Ile Phe

290 295 300

Trp Cys Tyr Glu Lys Phe Lys Thr Pro Lys Asp Lys Thr Lys Met Ile

305 310 315 320

Tyr Thr Ala Ala Thr Thr Glu Glu Thr Ile Pro Gly Ala Leu Gly Asn

325 330 335

Gly Thr Tyr Lys Gly Glu Asp Cys Ser Pro Cys Thr Ala

340 345

<210> 13

<211> 349

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人NTCP的Y146A、D149A和D152A突变体

<400> 13

Met Glu Ala His Asn Ala Ser Ala Pro Phe Asn Phe Thr Leu Pro Pro

1 5 10 15

Asn Phe Gly Lys Arg Pro Thr Asp Leu Ala Leu Ser Val Ile Leu Val

20 25 30

Phe Met Leu Phe Phe Ile Met Leu Ser Leu Gly Cys Thr Met Glu Phe

35 40 45

Ser Lys Ile Lys Ala His Leu Trp Lys Pro Lys Gly Leu Ala Ile Ala

50 55 60

Leu Val Ala Gln Tyr Gly Ile Met Pro Leu Thr Ala Phe Val Leu Gly

65 70 75 80

Lys Val Phe Arg Leu Lys Asn Ile Glu Ala Leu Ala Ile Leu Val Cys

85 90 95

Gly Cys Ser Pro Gly Gly Asn Leu Ser Asn Val Phe Ser Leu Ala Met

100 105 110

Lys Gly Asp Met Asn Leu Ser Ile Val Met Thr Thr Cys Ser Thr Phe

115 120 125

Cys Ala Leu Gly Met Met Pro Leu Leu Leu Tyr Ile Tyr Ser Arg Gly

130 135 140

Ile Ala Asp Gly Ala Leu Lys Ala Lys Val Pro Tyr Lys Gly Ile Val

145 150 155 160

Ile Ser Leu Val Leu Val Leu Ile Pro Cys Thr Ile Gly Ile Val Leu

165 170 175

Lys Ser Lys Arg Pro Gln Tyr Met Arg Tyr Val Ile Lys Gly Gly Met

180 185 190

Ile Ile Ile Leu Leu Cys Ser Val Ala Val Thr Val Leu Ser Ala Ile

195 200 205

Asn Val Gly Lys Ser Ile Met Phe Ala Met Thr Pro Leu Leu Ile Ala

210 215 220

Thr Ser Ser Leu Met Pro Phe Ile Gly Phe Leu Leu Gly Tyr Val Leu

225 230 235 240

Ser Ala Leu Phe Cys Leu Asn Gly Arg Cys Arg Arg Thr Val Ser Met

245 250 255

Glu Thr Gly Cys Gln Asn Val Gln Leu Cys Ser Thr Ile Leu Asn Val

260 265 270

Ala Phe Pro Pro Glu Val Ile Gly Pro Leu Phe Phe Phe Pro Leu Leu

275 280 285

Tyr Met Ile Phe Gln Leu Gly Glu Gly Leu Leu Leu Ile Ala Ile Phe

290 295 300

Trp Cys Tyr Glu Lys Phe Lys Thr Pro Lys Asp Lys Thr Lys Met Ile

305 310 315 320

Tyr Thr Ala Ala Thr Thr Glu Glu Thr Ile Pro Gly Ala Leu Gly Asn

325 330 335

Gly Thr Tyr Lys Gly Glu Asp Cys Ser Pro Cys Thr Ala

340 345

<210> 14

<211> 349

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人NTCP的P276A、E277A突变体

<400> 14

Met Glu Ala His Asn Ala Ser Ala Pro Phe Asn Phe Thr Leu Pro Pro

1 5 10 15

Asn Phe Gly Lys Arg Pro Thr Asp Leu Ala Leu Ser Val Ile Leu Val

20 25 30

Phe Met Leu Phe Phe Ile Met Leu Ser Leu Gly Cys Thr Met Glu Phe

35 40 45

Ser Lys Ile Lys Ala His Leu Trp Lys Pro Lys Gly Leu Ala Ile Ala

50 55 60

Leu Val Ala Gln Tyr Gly Ile Met Pro Leu Thr Ala Phe Val Leu Gly

65 70 75 80

Lys Val Phe Arg Leu Lys Asn Ile Glu Ala Leu Ala Ile Leu Val Cys

85 90 95

Gly Cys Ser Pro Gly Gly Asn Leu Ser Asn Val Phe Ser Leu Ala Met

100 105 110

Lys Gly Asp Met Asn Leu Ser Ile Val Met Thr Thr Cys Ser Thr Phe

115 120 125

Cys Ala Leu Gly Met Met Pro Leu Leu Leu Tyr Ile Tyr Ser Arg Gly

130 135 140

Ile Tyr Asp Gly Asp Leu Lys Asp Lys Val Pro Tyr Lys Gly Ile Val

145 150 155 160

Ile Ser Leu Val Leu Val Leu Ile Pro Cys Thr Ile Gly Ile Val Leu

165 170 175

Lys Ser Lys Arg Pro Gln Tyr Met Arg Tyr Val Ile Lys Gly Gly Met

180 185 190

Ile Ile Ile Leu Leu Cys Ser Val Ala Val Thr Val Leu Ser Ala Ile

195 200 205

Asn Val Gly Lys Ser Ile Met Phe Ala Met Thr Pro Leu Leu Ile Ala

210 215 220

Thr Ser Ser Leu Met Pro Phe Ile Gly Phe Leu Leu Gly Tyr Val Leu

225 230 235 240

Ser Ala Leu Phe Cys Leu Asn Gly Arg Cys Arg Arg Thr Val Ser Met

245 250 255

Glu Thr Gly Cys Gln Asn Val Gln Leu Cys Ser Thr Ile Leu Asn Val

260 265 270

Ala Phe Pro Ala Ala Val Ile Gly Pro Leu Phe Phe Phe Pro Leu Leu

275 280 285

Tyr Met Ile Phe Gln Leu Gly Glu Gly Leu Leu Leu Ile Ala Ile Phe

290 295 300

Trp Cys Tyr Glu Lys Phe Lys Thr Pro Lys Asp Lys Thr Lys Met Ile

305 310 315 320

Tyr Thr Ala Ala Thr Thr Glu Glu Thr Ile Pro Gly Ala Leu Gly Asn

325 330 335

Gly Thr Tyr Lys Gly Glu Asp Cys Ser Pro Cys Thr Ala

340 345

<210> 15

<211> 224

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N6HB4236-20抗体的VH至CH1

<400> 15

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Asp Phe Thr Phe Thr Glu Tyr

20 25 30

Thr Ile His Trp Ile Lys Gln Met Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Phe Tyr Pro Gly Ser Gly Asp Ile Lys Tyr Ser Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Asn Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg His Met Arg Asp Phe Arg Gly Phe Tyr Tyr Gly Arg Phe Tyr

100 105 110

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys

115 120 125

Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Gly Thr

130 135 140

Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro

145 150 155 160

Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val

165 170 175

His Thr Phe Pro Ala Leu Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Leu Ser Ser

180 185 190

Ser Val Thr Val Thr Ser Asn Thr Trp Pro Ser Gln Thr Ile Thr Cys

195 200 205

Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu

210 215 220

<210> 16

<211> 232

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 16

Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile

20 25 30

Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val

50 55 60

Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln

85 90 95

Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val

115 120 125

Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr

130 135 140

Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu

145 150 155 160

Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr

165 170 175

Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr

195 200 205

Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys

210 215 220

Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys

225 230

<210> 17

<211> 21

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 17

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp

20

<210> 18

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N6HB426抗体的LV至CL

<400> 18

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Val Ser Pro Lys Leu Trp

35 40 45

Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Arg

85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Thr Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala

100 105 110

Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser

115 120 125

Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp

130 135 140

Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val

145 150 155 160

Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser

180 185 190

Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210 215

<210> 19

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N6HB426抗体的VH

<400> 19

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Asp Phe Thr Phe Thr Glu Tyr

20 25 30

Thr Ile His Trp Ile Lys Gln Met Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Phe Tyr Pro Gly Ser Gly Asp Ile Lys Tyr Ser Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Asn Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg His Met Arg Asp Phe Arg Gly Phe Tyr Tyr Gly Arg Phe Tyr

100 105 110

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 20

<211> 327

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人IgG4抗体的CH1至铰链区、CH2和CH3

<400> 20

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

<210> 21

<211> 453

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人嵌合抗体的重链

<400> 21

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Asp Phe Thr Phe Thr Glu Tyr

20 25 30

Thr Ile His Trp Ile Lys Gln Met Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Phe Tyr Pro Gly Ser Gly Asp Ile Lys Tyr Ser Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Asn Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg His Met Arg Asp Phe Arg Gly Phe Tyr Tyr Gly Arg Phe Tyr

100 105 110

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser

115 120 125

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr

130 135 140

Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

145 150 155 160

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

165 170 175

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

180 185 190

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr

195 200 205

Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val

210 215 220

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe

225 230 235 240

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

325 330 335

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

340 345 350

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

355 360 365

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

385 390 395 400

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

405 410 415

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

435 440 445

Leu Ser Leu Gly Lys

450

<210> 22

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链可变区

<400> 22

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Val Ser Pro Lys Leu Trp

35 40 45

Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Arg

85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Thr Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 23

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人Igκ轻链的恒定区

<400> 23

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

1 5 10 15

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

20 25 30

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

35 40 45

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

50 55 60

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

65 70 75 80

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

85 90 95

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 24

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人嵌合抗体的轻链

<400> 24

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Val Ser Pro Lys Leu Trp

35 40 45

Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Arg

85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Thr Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

Claims (4)

1.一种抗体，其是与人牛磺胆酸钠共转运多肽(人NTCP)结合的抗体，其含有：

包含由序列号5记载的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号6记载的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号7记载的氨基酸序列构成的CDR3的重链可变区；以及

包含由序列号8记载的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号9记载的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号10记载的氨基酸序列构成的CDR3的轻链可变区。

2.根据权利要求1所述的抗体，其含有具有序列号3记载的氨基酸序列的重链可变区和具有序列号4记载的氨基酸序列的轻链可变区。

3.一种药物组合物，其含有权利要求1或2所述的抗体和医药上可接受的载体。

4.权利要求1或2所述的抗体在制备用于对由乙型肝炎病毒引起的感染症进行处置的药物组合物中的应用。