ES2234180T3 - Proteinas de fijacion especifica para el tratamiento de la alergia canina. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A PROTEINAS DE UNION QUE SE UNEN ESPECIFICAMENTE A UN PEPTIDO AISLADO Y PURIFICADO QUE COMPRENDE UNA LEUCINA SITUADA A UNA DISTANCIA DE DOS ENLACES PEPTIDICO DE UN PAR TIROSINA - ARGININA. OTRAS PROTEINAS DE UNION DE LA INVENCION INCLUYEN AQUELLAS QUE SE UNEN ESPECIFICAMENTE A UN PEPTIDO AISLADO Y PURIFICADO CON LA SECUENCIA CISTEINA - HUECO HUECO - PROLINA - HISTIDINA - HUECO - HUECO - HUECO - CISTEINA, O CISTEINA - HUECO - PROLINA - HISTIDINA - HUECO - PROLINA HUECO - HUECO - CISTEINA.

Description

Proteínas de fijación específica para el tratamiento de la alergia canina.

Ámbito de la invención

Esta invención se refiere a péptidos. Más en concreto, la invención se refiere a composiciones para la administración a perros, que proporcionan activamente inmunidad a las moléculas de inmunoglobulina E del perro.

Antecedentes de la técnica

Se estima que hasta un 30% del total de perros sufren alergias o trastornos cutáneos relacionados con alergias. En concreto se estima que la dermatitis alérgica afecta entre el 3 y el 15% de la totalidad de la población canina. Dado el predominio de las alergias en los perros, existe la necesidad de desarrollar métodos y composiciones para diagnosticar y tratar correctamente las alergias caninas.

Las sustancias que provocan con mayor probabilidad una reacción alérgica varían de una especie a otra. Los alergenos comunes de los perros incluyen las pulgas, el polen, el moho y el polvo. La alergia a las pulgas se cree que es la alergia canina más frecuente. La saliva de la pulga es un alergeno típico y basta una sola mordedura de pulga para provocar una picazón considerable. Otra forma adicional de alergia canina se denomina atopía. La atopía es un estado patológico en el que el perro es alérgico a determinadas sustancias inhaladas, por ejemplo el polen, el moho y ácaros microscópicos que se hallan en el polvo doméstico.

Las moléculas de anticuerpos desempeñan un papel en las manifestaciones alérgicas. En los mamíferos, las moléculas de anticuerpos se clasifican en diversos isotipos, denominados IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Las moléculas de anticuerpo constan de componentes de cadena larga y corta. Las cadenas largas de las moléculas de un isotipo determinado tienen regiones extensas de homología de secuencia de aminoácidos y, a la inversa, tienen regiones que las diferencian de los anticuerpos pertenecientes a otros isotipos. Las regiones comunes de las cadenas largas proporcionan miembros de cada isotipo con capacidades comunes de fijación sobre ciertos receptores de superficie celular o sobre otras macromoléculas, por ejemplo complementarias. Estas regiones de cadena larga sirven, por tanto, para activar las funciones particulares efectoras inmunes. Por consiguiente, la separación de las moléculas de anticuerpos en isotipos sirve para separar los anticuerpos con arreglo a un conjunto de funciones efectoras que ellos activan habitualmente.

En las personas humanas y en los perros, la inmunoglobulina E (a continuación IgE) interviene en la alergia. La IgE es, pues, el tipo de anticuerpo que se cree que actúa como un mediador importante de las respuestas alérgicas, incluida la hipersensibilidad inmediata de tipo I.

Las moléculas de IgE se fijan sobre mastocitos y basófilos. Esta fijación tiene lugar cuando la región Fc de la molécula IgE se fija sobre receptores Fc de los mastocitos. Cuando tales anticuerpos IgE fijados se unen a un alergeno, entonces el alergeno une y reticula diversos anticuerpos IgE sobre la superficie celular. Esta unión y reticulación provoca (media) reacciones de hipersensibilidad inmediata de tipo I y provoca la liberación de histaminas y otras moléculas que producen los síntomas asociados a la alergia.

Se han identificado anticuerpos monoclonales que tienen diferentes grados de sensibilidad a la IgE y a la IgG caninas (DeBoer y col., Immunology and Immunopathology 37, 183-199, 1993). DeBoer y col. han identificado diversos anticuerpos monoclonales que tienen una reactividad cruzada con la IgG y la IgE (ver p.ej. DeBoer y col., tabla 4 y texto anexo). DeBoer y col. han identificado tres anticuerpos monoclonales (A5, D9 y B3) que tienen cierta afinidad con la IgE canina. De los anticuerpos monoclonales identificados por DeBoer y col., el anticuerpo D9 parece ser el que tiene un mayor grado de neutralización de la reactividad Prausnitz-Kustner del suero canino atópico. En el contexto de la alergia canina, DeBoer y col. proponen el uso de sus anticuerpos monoclonales (MAb) en el ensayo ELISA de IgE específico de antígeno y para cuantificar la IgE canina. Proponen además utilizar sus Mab para la inmunotintura del ensayo Western Blot para evaluar la especificidad molecular de los anticuerpos IgE, así como para los estudios "in vitro" de la desgranulación de mastocitos.

En los humanos, el nivel de IgE total en suero es un diagnóstico de enfermedad alérgica. Se han llevado a cabo diversos estudios para explorar la posibilidad de que el nivel de IgE en suero pueda utilizarse también como diagnóstico en perros (Hill y DeBoer, Am. J. Yet. Res. 55(7), 944-48, julio de 1994). Las publicaciones posteriores al artículo de DeBoer describen el uso de anticuerpo monoclonal, denominado D9, en el ensayo ELISA que tiene la configuración siguiente: el D9 se fija sobre un sustrato, los anticuerpos son capturados por el D9 y entonces se utiliza el D9 provisto de un marcador para señalizar el anticuerpo capturado. Los ensayos ELISA de Hill y de DeBoer se aplican para establecer la cantidad total de IgE existente en el suero canino, en un esfuerzo para diagnosticar la alergia canina. A diferencia de los humanos, la cantidad de IgE determinada como existente en la circulación canina no resulta útil en absoluto para el para el diagnóstico de la alergia en perros (ver, p.ej. las secciones de resumen y de debate de Hill y de DeBoer). Este hallazgo contrasta en gran manera con la situación que se da en la inmunología humana.

Este resultado divergente de diagnóstico, basado en los niveles de la IgE en los humanos frente a los niveles existentes en perros, apunta a la dificultad que deberá superar cualquier intento de correlacionar los datos entre animales pertenecientes a dos géneros distintos. Esta dificultad se agrava además por el hecho de que los perros pueden ser alérgicos a conjuntos de antígenos diferentes de los que provocan alergia en los humanos. Además, en los casos en los que los perros y los humanos parecen ser alérgicos a los mismos extractos alergénicos, los estudios realizados por los doctores Esch y Greer de los Greer Laboratories indican que los alergenos específicos de un extracto alergénico que produce la enfermedad canina no necesariamente son los mismos alergenos que provocan la enfermedad en los humanos. Por ejemplo, se sabe que los componentes inmunodominantes de los extractos de ácaros del polvo son diferentes en los perros y en los humanos.

Se conocen las secuencias genómicas que codifican la región constante de cadena larga de la IgE murina y humana (ver por ejemplo Ishida y col., "The Nucleotide Sequence of the Mouse Immunoglobulin E Gene: Comparison with the Human Epsilon Gene Sequence", EMBO Journal 1, 1117-1123, 1982). La comparación de los genes humano y murino indica que poseen un 60% de homología dentro de los exones y un 45-50% de homología entre los intrones, con varias inserciones y deleciones.

Patel y col. publican la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos previsible de los exones 1-4 de la región constante de cadena larga de la IgE canina en un artículo titulado "Sequence of the Dog Immunoglobulin Alpha and Epsilon Constant Region Genes", Immunogenetics 41, 282-286 (22 de marzo de 1995). La secuencia completa de la región constante de cadena larga de la IgE canina, con porciones fijadas sobre membrana codificadas por los exones 5 y 6, se publica en solicitudes pendientes de número de serie 08/800 698, registrada el 14 de febrero de 1997; 09/146 400, registrada el 3 de setiembre de 1998; y 09/146 617, registrada el 3 de setiembre de 1998.

Se cree que la IgE interviene en los síntomas alérgicos, por lo cual es deseable disminuir los niveles de IgE como mecanismo para aliviar los síntomas alérgicos. Sin embargo, las moléculas de IgE propias de un paciente son autoproteínas y las respuestas inmunes a dichas proteínas están usualmente suprimidas. La supresión de las respuestas inmunes a las autoproteínas, es decir, se supone que tiene lugar una tolerancia a los autoantígenos en un gran número de maneras.

La hipótesis actual de la supresión de células T dirigidas a autoantígenos implica una inducción de la "deleción clónica" de tales células T en el timo, en la cual se eliminan los receptores de células T que pueden reconocer los autopéptidos en asociación con moléculas MHC y solamente se permite la expansión de los que reconocen los péptidos y las moléculas MHC extraños. Además pueden existir también células T supresoras que previenen la inducción de respuestas inmunes frente a las autoproteínas.

A diferencia de la situación de las células T, se cree que existen muchas células B que se expresan en receptores (es decir, inmunoglobulina de superficie) de autoproteínas y que la razón por la que estas células no producen anticuerpos contra las autoproteínas estriba en que normalmente faltan las células T requeridas para la presentación de antígeno de las células B.

Una célula B que reconoce los epítopes (sitios de fijación de antígenos) de los anticuerpos de IgE propios de un paciente es capaz de generar anticuerpos, en general de IgG, dirigidos contra este autoantígeno, es decir, la IgE. Por lo tanto, la existencia de tales células B constituye una oportunidad única de inducir la producción de respuestas de autoanticuerpo. Sigue habiendo necesidad de tales anticuerpos con el fin de tratar una enfermedad alérgica.

La hipótesis relativa a la "presentación de antígeno" supone: el reconocimiento del antígeno por una inmunoglobulina de superficie de la célula B, la interiorización y al procesado de este antígeno, la asociación de péptidos derivados del antígeno con moléculas MHC, expresadas en la superficie de las células B y después el reconocimiento del péptido del antígeno asociado y de las moléculas MHC por una células T concreta. La interacción entre las células T y las células B conduce entonces a una transducción de señales en ambas células y a la síntesis y elaboración de citocinas solubles que se traducen eventualmente en la producción de anticuerpos por parte de las células B.

Por lo tanto, en la mayoría de circunstancias, solamente cuando un antígeno es ajeno tiene lugar una respuesta inmune; en los demás casos, la interiorización y el procesado de las autoproteínas conducirá por lo general a la presentación de complejos de autopéptido-MHC a las células T y se traducirá de este modo en anticuerpos autoinmunes.

Por lo tanto, con el fin de inducir una respuesta de anticuerpo a un autopéptido, por ejemplo la IgE, el sistema inmune tiene que manipularse de modo que permita que una célula B autorreactiva se convierte en una célula B secretora de anticuerpos. Sigue habiendo necesidad de manipular el sistema inmune de esta manera, en particular en el contexto de las enfermedades alérgicas.

Existen, en general, diversos intentos conocidos de generar anticuerpos de antígenos péptidos. Por ejemplo, los péptidos antigénicos múltiples (MAP), introducidos por el Dr. James Tam (Tam, J.P., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 5409-5413, 1998) presentan diversas ventajas en la inducción de anticuerpos antipéptidos. La estrategia de los MAP es un intento alternativo a la técnica convencional de conjugar un antígeno péptido con un soporte proteico. Una de las limitaciones primarias que conlleva el uso de los soportes proteicos estriba en el gran peso del soporte con respecto al antígeno péptido fijado sobre él. Esta disparidad relativa de tamaños puede traducirse en una baja proporción de anticuerpos antipéptido si se comparan con los anticuerpos antisoporte. Los MAP tienen por ejemplo 4 u 8 brazos peptídicos que arranca de un esqueleto central de lisina, tal como se representa en la figura 1 A-B. El antígeno péptido se conjuga con cada uno de los brazos.

Por lo tanto, en un sistema MAP existe una proporción mucho mayor de antígeno de la molécula de soporte que en la conjugación proteica tradicional. Este diseño maximaliza la concentración del antígeno para la respuesta inmunogénica específica. Es más, se ha observado que el núcleo central de lisina del péptido MAP no es inmunogénico (Tam, J.P., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 5409-5413, 1988; Posnett, D.N., McGrath, H. y Tam, J.P., J. Biol. Chem. 263, 1719-1725, 1988). Por lo tanto, los anticuerpos inducidos contra péptidos MAP son una respuesta directa contra el antígeno. El conocimiento preciso de la composición química, de la estructura y de la cantidad de péptido antes de la inmunización es posible por síntesis directa del antígeno sobre el núcleo de ramificación de la lisina. Además, dado que el intento del MAP elimina la necesidad de conjugar péptidos con proteínas de soporte, que pueden alterar los determinantes antigénicos, se elimina también la ambigüedad química. Se cree, pues, que los MAP inducen respuestas de anticuerpos de alta pureza, mayor avidez, definición química precisa y mayor seguridad.

Las resinas de Fmoc MAP (suministradas por Applied Biosystems, Foster City, California) son resinas compatibles con Fmoc, conectadas a una pequeña estructura central de restos lisina de ramificación. La estructura central contiene diversos niveles de restos lisina fijados a la lisina previa en ambos grupos amino N-\alpha y N-\varepsilon, tal como se representa en la figura 1A-B.

Los péptidos MAP empleados en el diseño de vacuna experimental han mostrado concentraciones altas de anticuerpos antipéptido, que reconocen a la proteína nativa (Tam, J.P., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 5409-5413, 1988; Posnett, D.N., McGrath, H. y Tam, J.P., J. Biol. Chem. 263, 1719-1725, 1988; Auriault, C., Wolowczuk, I., Gras-Masse, H., Maguerite, M., Boulanger, D., Capron, A. y Tartar, A., Peptide Res. 4, 6-11, 1991). Además, se ha observado una mayor sensibilidad y fiabilidad de las interacciones anticuerpo-antígeno en inmunoensayos de fase sólida con péptidos MAP, debido a una mayor capacidad y avidez de recubrimiento (Tam, J.P. y Zavala, F., J. Immunol. Meth. 124, 53-61, 1989).

Una estrategia adicional, de la que se sabe que es útil para generar anticuerpos de antígenos péptidos, consiste en colocar copias múltiples de péptidos en la superficie de partículas de virus de plantas. Un ejemplo de ello es la tecnología EPICOAT™ (Axis Genetics plc, Cambridge, Inglaterra). La tecnología EPICOAT™ se basa en la tecnología de las partículas de virus quimérico (CVP) que recurre a la modificación genética recombinante de los virus de las plantas.

La tecnología EPICOAT™ implica la inserción de una pequeña porción de una proteína ajena (un péptido) en un virus de una planta, de tal manera que se generan en la superficie de la partícula del virus múltiples copias del péptido. La tecnología EPICOAT™ se basa actualmente en el virus del mosaico del fríjol de ojo negro (cowpea) (CPMV), un virus de plantas que infecta la planta del fríjol, planta se conoce también con el nombre de "black-eyed bean". La partícula del CPMV sin modificar es un icosahedro y tiene un diámetro de aproximadamente veintiocho nanometros (nm). Las partículas de CPMV se componen de dos proteínas, denominadas proteínas de recubrimiento grande y pequeño. Los estudios indican que dentro de la proteína de recubrimiento pequeño existe un sitio que permite la presentación de un péptido ajeno en una posición prominente de la superficie del virus, con lo cual en cada partícula de virus pueden presentarse hasta sesenta copias de un péptido concreto.

Con la tecnología EPICOAT™ se emplean copias de DNA del material genético del virus de la planta. A las hojas de una planta joven de fríjol de ojo negro se le aplica una cantidad minúscula del DNA que codifica la proteína del virus, incluido el péptido ajeno insertado, junto con un polvo abrasivo. Después de frotar suavemente, el DNA se incorpora a las hojas y utiliza los mecanismos celulares propios de la planta para iniciar la generación de las partículas funcionales del virus. El virus se replica dentro de las hojas inoculadas y se propaga a través de la planta en
crecimiento.

Pasadas dos o tres semanas se recoge material foliar que contiene cantidades considerables del virus. Se aíslan partículas de virus quimérico (CVP) por centrifugación y precipitación selectiva de material vegetal homogeneizado. Por kilogramo de peso de material foliar fresco se obtienen de 1 a 2 gramos de CVP. Se cultivan plantas de fríjol de ojo negro en abundancia en entornos controlados, obteniéndose la producción de una cantidad abundante de
CVP.

Se ha publicado que se han incorporado péptidos de un tamaño de hasta treinta y seis aminoácidos a los CVP. Las partículas resultantes son extraordinariamente robustas, con un punto de inactivación térmica de 65ºC. Se observa que los CVP resisten un pH ácido así como a las enzimas de degradación de proteínas. Se ha publicado que los péptidos expresados son capaces de producir respuestas inmunes específicas en animales. Se ha lanzado la hipótesis de que la presentación superficial de péptidos puede mejorar el reconocimiento por parte del sistema inmune hospedante y puede proporcionar una vía de desarrollo a las vacunas subunitarias recombinantes y a los agentes inmunotera-
péuticos.

DeBoer y col., 1993 (Veterinary Immunology and Immunopathology 37, 183-199, 1993) han preparado una serie de líneas celulares de hibridoma murino que producen anticuerpos monoclonales específicos de las inmunoglobulinas caninas E y G. Se comprueba la capacidad de estos anticuerpos monoclonales por inducir una reacción de anafilaxis cutánea reversible en la piel del perro, para neutralizar la reactividad de Prausnitz-Küstner del suero de perro atópico, para servir de ligando en la cromatografía de inmunoafinidad y para fijar sobre los subgrupos IgE y otros Ig en diversos sistemas ELISA. Algunos de estos anticuerpos monoclonales producidos se observa que son específicos de la IgE canina.

Konieczny y col., 1997 (Immunology 92, 577-586, 1997) publican el aislamiento de cDNA que codifican las principales proteínas alergénicas y presentan sus secuencias de nucleótidos y las secuencias deducidas de aminoácidos. Ambas proteínas (proteínas VEG y MUP) son miembros de la familia de las lipocalinas de proteínas de fijación de ligandos pequeños. Se producen las formas recombinantes de estas proteínas y se comprueba su reactividad con la inmunoglobulina E. Además, ambas proteínas recombinantes son capaces de unir y reticular la IgE y producir histamina liberada "in vitro" por los leucocitos de la sangre periférica.

Burt y col., 1987 (Molecular Immunology, vol. 24, nº 4, pp. 379-389, 1987) describen la producción de antisueros policlonales con especificidades predeterminadas para un abanico de epítopes IgE de rata mediante la inmunización de conjugados KLH de conejo de cinco péptidos sintéticos distintos, que presentan diferentes secuencias en los dominios CH3 y CH4 de la IgE de rata. Se analizan los sueros antipéptidos en ensayos funcionales diseñados para investigar el modo de interacción entre la IgE de rata y su receptor en los mastocitos murinos. Cada suero de anti-péptido es capaz de inhibir la fijación de la IgE a los mastocitos y capaz además de iniciar la secreción de histamina de las células sensibilizadas con la IgE de rata en un modo inducido por el "anti-IgE".

Presta y col., 1993 (Journal of Immunology, vol. 151, 2623-2632, nº 5, 1993) describen la humanización de un anticuerpo murino que es capaz de bloquear la fijación de la IgE a su receptor de alta afinidad, pero que no se fija sobre la IgE después de que esta se haya fijado sobre el receptor, porque esto dispararía la producción de histamina. Se evalúan variantes de anticuerpo humanizado para probar la importancia de los restos de la estructura en la fijación de anticuerpos y para determinar qué restos cargados de los CDR interaccionan con la IgE. Se ha encontrado que solamente se requieren cinco cambios en los restos de la estructura humana para proporcionar una fijación comparable a la del anticuerpo murino original.

Descripción de la invención

Se describe una proteína de fijación específica que se fija de modo específico sobre el exón 3 de la IgE canina nativa libre o fijada sobre las células B y que no se fija sobre el exón 3 de la IgE cuando la IgE está unida al receptor en un mastocito. La IgE unida a la superficie puede ser la IgE expresada en la superficie de una célula B
canina.

Se describe una proteína de fijación específica que se fija de modo específico sobre un péptido aislado y purificado que contiene una leucina posicionada dos enlaces peptídicos más allá del par tirosina-arginina; p.ej., la SEQ ID NO:1 leucina-blanco-blanco-tirosina-arginina, la SEQ ID NO:2 tirosina-arginina-blanco-blanco-leucina o la SEQ ID NO:3 leucina-blanco-blanco-tirosina-arginina-blanco-blanco-leucina. El péptido puede contener de 5 a 71 amino-
ácidos.

Se describe un anticuerpo que se fija sobre un epítope definido y que se cultiva para obtener un péptido aislado y purificado que contiene una secuencia de aminoácidos o una variante conservadora de la misma, que contiene: SEA ID NO:4 Thr-Leu-Leu-Glu-Tyr-Arg-Met; se publica además una molécula recombinante de fijación que se fija específicamente sobre el epítope definido fijado por el anticuerpo.

Se describe un anticuerpo que se fija sobre un epítope definido y que se cultiva para obtener un péptido aislado y purificado que contiene una secuencia de aminoácidos o una variante conservadora de la misma, que contiene: SEA ID NO:5 Gly-Met-Asn-Leu-Thr-Trp-Tyr-Arg-Glu-Ser-Lys; se publica además una molécula recombinante de fijación que se fija específicamente sobre el epítope definido fijado por el anticuerpo.

Se publica además una proteína de fijación específica que se cultiva para obtener un péptido antigénico múltiple que contiene copias múltiples de un péptido aislado y purificado que contiene un resto leucina posicionado dos enlaces peptídicos más allá del par tirosina-arginina; la proteína de fijación específica se fija de modo específico sobre un epítope definido. El péptido aislado y purificado puede tener de 5 a 71 aminoácidos. Se publica además una molécula recombinante de fijación que se fija de modo específico sobre un epítope definido fijado por la proteína de
fijación.

Se publica una proteína de fijación específica que se une de modo específico sobre un péptido aislado y purificado que contiene un grupo cisteína posicionado dos enlaces peptídicos más allá del par prolina-histidina, posicionado tres enlaces peptídicos más allá del resto cisteína. El péptido puede tener la forma: SEQ ID NO:6 cisteína-blanco-blanco-prolina-histidina-blanco-blanco-blanco-cisteína. Las cisteínas pueden formar un enlace covalente mediante una reacción de reducción, la ciclación del péptido y la incorporación de la cistina. El péptido puede contener de 9 a 71 aminoácidos.

Se publica un anticuerpo que se fija a un epítope definido y que se cultiva para obtener un péptido aislado y purificado que tiene la secuencia de aminoácidos, o una variante conservadora de la misma, que consiste en la: SEQ ID NO:7 serina-valina-treonina-leucina-cisteína-prolina-asparagina-prolina-histidina-isoleucina-prolina-metionina-cisteína-glicina-glicina-glicina. Las cisteínas pueden formar un enlace covalente mediante una reacción de reducción, la ciclación del péptido y la incorporación de la cistina. Se describe además una molécula de fijación recombinante que se fija de modo específico al epítope definido fijado por el anticuerpo.

Se publica un anticuerpo que se fija a un epítope definido y que se cultiva para obtener un péptido aislado y purificado que tiene la secuencia de aminoácidos, o una variante conservadora de la misma, que consiste en la: SEQ ID NO:8 serina-alanina-cisteína-prolina-asparagina-prolina-histidina-asparagina-prolina-tirosina-cisteína-glicina-glicina-glicina. Las cisteínas pueden formar un enlace covalente mediante una reacción de reducción, la ciclación del péptido cambiando el aminoácido por cistina. Se describe además una molécula de fijación recombinante que se fija de modo específico al epítope definido fijado por el anticuerpo.

Se publica una proteína de fijación específica que se fija de modo específico a un péptido aislado y purificado que contiene un resto cisteína posicionado un enlace peptídico más allá del par prolina-histidina, posicionado un enlace peptídico más allá de un resto prolina, posicionado dos enlaces peptídicos más allá de un resto cisteína; el péptido puede tener la forma de la SEQ ID NO:9 cisteína-blanco-prolina-histidina-blanco-prolina-blanco-blanco-cisteína. Las cisteínas pueden formar un enlace covalente mediante una reacción de reducción, la ciclación del péptido y la incorporación de la cistina. El péptido puede contener de 9 a 71 aminoácidos.

Se publica un anticuerpo que se fija a un epítope definido y que se cultiva para obtener un péptido aislado y purificado que tiene la secuencia de aminoácidos, o una variante conservadora de la misma, que consiste en la: SEQ ID NO:10 serina-alanina-cisteína-histidina-prolina-histidina-leucina-prolina-lisina-serina-cisteína-glicina-glicina-glicina. Las cisteínas pueden formar un enlace covalente mediante una reacción de reducción, la ciclación del péptido y la incorporación de la cistina. Se describe además una molécula de fijación recombinante que se fija de modo específico al epítope definido fijado por el anticuerpo.

Las proteínas de fijación específica según la invención pueden ser anticuerpos, tanto policlonales como monoclonales. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal puede ser el 8H.8 o el 15A.2. El anticuerpo según la invención puede fijar un epítope definido; se publican también moléculas recombinantes de fijación que se fijan de modo específico sobre el epítope definido fijado por un anticuerpo según la invención.

Se publica además el uso de una proteína específica de fijación según la invención para la fabricación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento y profilaxis de la alergia canina. En un uso preferido, esta composición farmacéutica contiene además un diluyente. Se publica además el uso de una proteína específica de fijación para la fabricación de un kit de composición farmacéutica, dicho kit contiene la primera dosis de dicha proteína de fijación específica y una segunda dosis de dicha proteína de fijación específica.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Tabla pasa a página siguiente)

Definiciones Aminoácidos

1

Clon cDNA: una secuencia dúplex de DNA que representa un RNA, transportado mediante un vector de clonación.

Clonación: la selección y propagación de una especie individual de DNA.

Vector de clonación: un plásmido, DNA fago u otra secuencia de DNA, capaz de replicar en una célula hospedante y capaz de transportar la secuencia de DNA añadida de modo exógeno con fines de amplificación o de expresión de la secuencia de DNA añadida.

Codón: un triplete de nucleótidos que representa un aminoácido o señal de terminación.

Variantes conservadoras: las variantes conservadoras de secuencias de nucleótidos incluyen las sustituciones de nucleótidos que no producen cambios en la secuencia de aminoácidos codificada por dichos nucleótidos, así como las sustituciones de nucleótidos que producen sustituciones conservadoras de aminoácidos, p.ej. sustituciones de aminoácidos que no afectan sustancialmente el carácter de los polipéptidos traducidos de dichos nucleótidos. Por ejemplo, el carácter de un péptido derivado de la IgE no se ve afectado sustancialmente si las sustituciones no excluyen la fijación específica del péptido sobre el receptor de la IgE canina u otros ligandos de fijación de la IgE canina.

Las variantes conservadoras de secuencias de aminoácidos incluyen las sustituciones o las deleciones de aminoácidos que no afectan sustancialmente el carácter del polipéptido de la variante con respecto al péptido de partida. Por ejemplo, el carácter de polipéptido no resulta afectado sustancialmente si las sustituciones o deleciones no excluyen la fijación específica del péptido de la variante sobre un sitio correspondiente de fijación específico del péptido de partida. El término mimotopo se refiere a una variante conservadora de una secuencia de aminoácidos, con respecto a la cual se ha levantado una especificidad de anticuerpo. El mimotopo consta de una variante del epítope del péptido de partida, de modo que sea capaz de fijar anticuerpos que pueden tener una reacción cruzada con el epítope original.

Secuencia de DNA: una serie lineal de nucleótidos conectados uno con otro por enlaces fosfodiéster entre los carbonos 3' y 5' de las pentosas adyacentes.

Expresión: el proceso que sufre un gen estructural para producir un polipéptido. Es una combinación de transcripción y traducción.

Secuencia de control de expresión: una secuencia de DNA de nucleótidos que controla y regula la expresión de genes estructurales cuando se une operativamente a dichos genes.

Exón: una región contigua del DNA que codifica una porción de un polipéptido. Cuando se menciona un exón cualquiera, p.ej. "secuencia de DNA del exón 6", se indica el exón completo o una porción del mismo.

Genoma: el DNA completo de una sustancia. Incluye entre otros los genes estructurales que codifican a los polipéptidos de la sustancia así como las secuencias de fijación del operador, promotor y ribosoma y las secuencias de interacción, por ejemplo las secuencias Shine-Dalgarno.

Nucleótido: una unidad monomérica de DNA o de RNA que consta de un resto azúcar (pentosa), un fosfato y una base heterocíclica nitrogenada. Las cuatro bases del DNA son la adenina ("A"), la guanina ("G"), la citosina ("C") y la timina ("T"). Las cuatro bases del RNA son la A, G, C y el uracilo ("U"). A y G son purinas y C, T y U son pirimidinas.

Fago o bacteriófago: virus bacteriano, muchos de ellos incluyen secuencias de DNA encapsuladas en una forro o recubrimiento proteico ("cápsido").

Plásmido: un DNA circular extracromosómico autorreplicante autónomo.

Reacción en cadena de polimerasa (PCR): un método de amplificación de una secuencia de DNA diana existente en una mezcla de secuencias de DNA, empleando cebadores oligonucleótidos que flanquean la secuencia de DNA diana durante ciclos repetidos de síntesis de DNA de la secuencia de DNA diana.

Polipéptido: una serie lineal de aminoácidos conectados uno con otro mediante enlaces peptídicos entre los grupos a-amino y carboxilo de aminoácidos adyacentes.

Marco de lectura: el agrupamiento de codones durante la traducción del mRNA en secuencias de aminoácidos. Por ejemplo, la secuencia GCTGGTGTAAG puede traducirse en tres marcos de lectura o fases, cada una de las cuales aporta una secuencia distinta de aminoácidos:

GCT GGT TGT AAG-Ala-Gly-Cys-Lys

G CTG GTT GTA AG-Leu-Val-Val

GC TGG TTG TAA A-Trp-Leu-(STOP).

Molécula de DNA recombinante: una secuencia de DNA híbrida que contiene por lo menos dos secuencias de nucleótidos, la primera secuencia normalmente no se encuentra en la naturaleza junto con la segunda.

Fijación específica: la fijación de una sustancia con otra por una afinidad de fijación mayor que la fijación de fondo. Dos sustancias que presentan fijación específica se denominan par de fijación específica. Un anticuerpo y un antígeno son un ejemplo de par de fijación específica.

Molécula de fijación específica: una molécula que presenta una fijación específica con su correspondiente pareja de fijación para formar un par de fijación específica. Tal como se utiliza en esta descripción, esta definición de molécula de fijación específica comprende los anticuerpos monoclonales y policlonales, los fragmentos de fijación de antígeno de dichos anticuerpos, los anticuerpos híbridos, los anticuerpos de cadena simple y las moléculas recombinantes capaces de fijarse de modo específico sobre un ligando.

Gen estructural: una secuencia de DNA que codifica mediante su molde o RNA mensajero ("mRNA") una secuencia de aminoácidos características de un polipéptido específico.

Transcripción: síntesis de RNA sobre un molde de DNA.

Traducción: síntesis de péptidos sobre un molde de mRNA.

Descripción de las figuras

En la figura 1A se representa una estructura de núcleo de una proteína MAP de cuatro brazos, es decir, una proteína 4-MAP; en la figura 1B se representa la estructura de núcleo de una proteína MAP de ocho brazos, es decir, una proteína 8-MAP.

En la figura 2 se representan los datos comparativos de las características de fijación de diversos anticuerpos monoclonales sobre la IgE fijada en superficie (p.ej., similar a la IgE expresada sobre la superficie de las células B); el receptor de IgE (p.ej. similar al receptor de Fc sobre mastocitos); y sobre una combinación de IgE cuando está fijada mediante el receptor de IgE. Cada componente ensayado se inmoviliza, pues, sobre una superficie sólida.

En la figura 3 se presenta la capacidad del exón recombinante 3 de inhibir la fijación del anticuerpo conjugado 8H.8 o del anticuerpo conjugado 15A.2 sobre una fase sólida de IgE. Los datos del 8H.8 se representan mediante gráficos de barras punteadas y los datos del 15A.2 se representan mediante gráficas de barras negras continuas.

En la figura 4 se representa la capacidad de una IgE canina purificada soluble de inhibir la fijación de un anticuerpo monoclonal 8H.8 (2,5 \mug/ml) o de un anticuerpo monoclonal 15A.2 (2,5 \mug/ml) sobre una fase sólida de IgE canina. Los datos del 8H.8 se representan mediante gráficas de barras punteadas; los datos del 15A.2 se representan mediante gráficas de barras negras continuas.

En la figura 5 se representa la capacidad del anticuerpo monoclonal 15A.2 o del anticuerpo monoclonal 8H.8 de inhibir la fijación de la IgE sobre el receptor recombinante de IgE inmovilizado sobre una fase sólida, por ejemplo la detectada por un anticuerpo monoclonal D9.

En la figura 6 se representan las secuencias de aminoácidos de la biblioteca de visualización del fago PhDc7c de la empresa New England Biolabs, que está fijados mediante el anticuerpo monoclonal 15A.2. Estas secuencias se presentan alineadas con la secuencia proteica de la IgE canina.

En la figura 7 se representa el alineamiento de la región de fijación del 15A.2 de siete mamíferos distintos: perro, hombre, mono verde, gato, cerdo, ratón y caballo.

En la figura 8 se representa la capacidad de fago que presenta péptidos mimotopo 15A.2 de inhibir que la IgE canina fije el anticuerpo monoclonal 15A.2 sobre la fase sólida.

En la figura 9 se presenta la capacidad de una secuencia de péptido mimotopo 15A.2 específico, fijada sobre la fase sólida, de fijar el anticuerpo monoclonal mimotopo 15A.2.

En las figuras 10A y 10B se representa la capacidad del péptido mimotopo 15A.2 de impedir que el anticuerpo monoclonal 15A.2 fije la IgE canina sobre la fase sólida.

En la figura 11 se representa la capacidad del anticuerpo monoclonal 8H.8 y del anticuerpo monoclonal 15A.2 de fijarse sobre la IgE canina purificada, inmovilizada sobre la fase sólida.

En la figura 12 se representan los datos de un estudio de evaluación de la capacidad del anticuerpo 15A.2 conjugado con un resto de señal de fijarse sobre las fases sólidas que tienen varios péptidos inmovilizados sobre las mismas.

En la figura 13 se representan los datos de un estudio de evaluación de la capacidad del anticuerpo monoclonal 14K2, conocido por fijarse al exón 4 de la IgE canina, para fijarse sobre varios péptidos inmovilizados sobre la fase sólida.

En la figura 14 se representan los datos de un estudio de evaluación de la capacidad del anticuerpo monoclonal 15A.2, conocido por fijarse sobre el exón 3 de la IgE canina, para fijarse sobre varios péptidos inmovilizados sobre la fase sólida.

En la figura 15 se representan los datos de estudios que comparan la fijación del anticuerpo monoclonal 8H.8 o de un anticuerpo monoclonal obtenido de la IgE recombinante (Re-hu IgE), de fijarse sobre una fase sólida que tiene el péptido E3a.5 o un péptido E3a.5 sustituido (denominado S3a.5) inmovilizado sobre la misma.

En la figura 16 se representan los datos de un estudio de evaluación de la capacidad del anticuerpo 8H.8 conjugado con un resto de señal para fijarse sobre fases sólidas que tienen diversos péptidos inmovilizados sobre ellas.

En la figura 17 se representa la capacidad de anticuerpos policlonales anti-IgE humana para fijarse sobre varios péptidos inmovilizados sobre la fase sólida.

Modos de llevar a la práctica la invención Mecanismo de acción propuesto para los anticuerpos monoclonales anti-IgE para provocar la depleción persistente de la IgE en suero

Una hipótesis con arreglo a la presente invención consiste en que los anticuerpos monoclonales anti-IgE afectan los niveles de IgE fijándose directamente a la IgE circulante residente, después de lo cual se quita de la circulación el complejo fijado.

Además existe la hipótesis de que los anticuerpos monoclonales anti-IgE afectan los niveles de IgE interfiriendo en la producción de nueva IgE en las células B. Las células B de memoria, células que después de interaccionar con el antígeno y las células T se convierte en células productoras de anticuerpos (es decir, "células B de memoria IgE"), intervienen en la reposición de la IgE en el suero y estas células contienen la IgE en calidad de sus receptores celulares superficiales. De este modo es posible que los anticuerpos monoclonales anti-IgE se fijen sobre la IgE en estas células productoras de anticuerpos e interfieran en su funcionamiento, por ejemplo por regulación restrictiva o por uno o varios mecanismos que conducen a la destrucción celular. Dos vías generales se han propuesto para explicar que la fijación de un anticuerpo monoclonal a una célula B de memoria puede interferir en la producción de la IgE.

En primer lugar, la activación de una célula B de memoria puede requerir además la intervención de un factor de fijación de IgE en superficie, denominado CD23. La fijación de ciertos anticuerpos monoclonales sobre la IgE de superficie celular puede excluir la fijación del CD23 y, de este modo, puede conducir a la incapacidad de montar una respuesta a la IgE.

En segundo lugar, la producción de anticuerpo de IgE por parte de una célula B de memoria puede reducirse o eliminarse por la fijación de un anticuerpo monoclonal que esté dirigido directamente contra o que bloquee al receptor de la molécula IgE, que está localizado en la superficie de la célula B de memoria.

Sin embargo, en ausencia de un anticuerpo monoclonal que conduce a la eliminación o inactivación de una célula B de memoria de IgE, sería de esperar que las células B de memoria de IgE se repondrían, conduciendo a una eventual reposición de la IgE circulante.

Los niveles de IgE en suero son elevados en pacientes que sufren una enfermedad alérgica. Tal como se describe en la presente, cuando se generan anticuerpos que se fijan específicamente sobre una IgE de especie y se administran estos anticuerpos a un paciente que es miembro de dicha especie ("inmunización pasiva"), disminuyen los niveles de IgE en el suero del paciente. Tal como podrá apreciar el experto en la materia, las proteínas de fijación específica según la invención se administran en dosis aceptables farmacológicamente y pueden administrarse en diluyentes biocompatibles idóneos. Se describen también en la presente un método y unas composiciones relacionadas que sirven para inducir una respuesta a un autopéptido, por ejemplo una molécula de IgE, para ello se manipula el sistema inmune de modo que permita que una célula B autorreactiva se convierta en una célula B secretora de anticuerpos ("inmunización activa").

Los receptores están presentes en los mastocitos que fijan la IgE en circulación. Cuando la IgE que fijada a los receptores de los mastocitos, las moléculas de IgE pueden quedar fijadas por unión cruzada. Después de la unión cruzada de estas moléculas de IgE, el mastocito está inducido a liberar histamina. La histamina es un agente que induce la manifestación de síntomas alérgicos.

En general, la unión cruzada tiene lugar por fijación de las moléculas de IgE a un antígeno, p.ej. un alergeno. Sin embargo, un anticuerpo monoclonal que se fije sobre la IgE podría servir como medio para la unión cruzada de la IgE que se ha quedado unida a la superficie de los mastocitos.

En el caso de individuos alérgicos, si existen anticuerpos anti-IgE en circulación, es fácil comprender que la fijación de tales moléculas auto-anti-IgE a las IgE de los mastocitos pueda servir para la unión cruzada de las moléculas de IgE sobre tales células y exacerbar una respuesta alérgica continua incluso en ausencia de alergeno. Este acontecimiento es claramente indeseable en el contexto del tratamiento de la alergia. Un anticuerpo que desempeñe esta función no será, por tanto, preferido para el uso como agente terapéutico según la invención. Por consiguiente, un anticuerpo que efectúa tal unión cruzada es desventajoso y no preferido según la invención.

Existen dos estrategias para producir anticuerpos monoclonales que apunten como diana a la IgE, pero que no producen la unión cruzada de las moléculas de IgE, que hayan quedado fijadas a un mastocito. La primera consiste en producir anticuerpos monoclonales dirigidos a un epítope de una molécula de IgE que solamente es accesible cuando la IgE se halla en circulación. Dado que el anticuerpo monoclonal solamente puede fijarse sobre la IgE cuando se halla en circulación, no será capaz de fijarse sobre la IgE que se quedado unida a la superficie de un mastocito.

Una estrategia alternativa para producir anticuerpos anti-IgE se ha propuesto por parte de Stanworth y col., p.ej. la patente US-5 601 821, publicada el 11 de febrero de 1997. Stanworth describe anticuerpos que se provocan la unión cruzada de la IgE sobre los mastocitos, pero de modo que no inducen la liberación de histamina. Stanworth ha descrito un epítope de la molécula de la IgE humana, que tiene que estar disponible o accesible después de que las moléculas de IgE se han quedado unidas por unión cruzada sobre la superficie de un mastocito, con el fin de el mastocito libere histamina. De este modo, Stanworth describe un anticuerpo que se fija sobre un epítope concreto de este tipo. Por consiguiente, los anticuerpos monoclonales que se dirigen a este epítope de IgE servirán para la unión cruzada de la IgE, pero no permitirán que el mastocito libere histamina.

La estrategia seguida según la presente invención es el desarrollo de anticuerpos, ya sean anticuerpos monoclonales "ex vivo", ya sea anti-autoanticuerpos "in vivo", dirigidos contra epítopes que son accesibles en la IgE circulante, pero que no son accesibles cuando la IgE queda fijada a un mastocito.

Inmunidad pasiva Anticuerpos monoclonales 15A.2 y 8H.8

El anticuerpo monoclonal 15A.2 se fija sobre la IgE canina. Se deriva el anticuerpo monoclonal 15A.2 por inmunización de ratones con IgE canina purificada por afinidad. El epítope fijado por el 15A.2 es conformacional, no lineal. Tal como indican los datos representados en la figura 2, el 15A.2 no se fija sobre el receptor de la IgE; tampoco se fija sobre la IgE cuando esta está unida al receptor. Sin embargo, el 15A.2 presenta afinidad con respecto a la IgE libre. Se fija sobre las proteínas de fusión del exón 3 canino recombinante en un ensayo inmunosorbente unido a enzima (ELISA) o en un ensayo Western Blot, pero no sobre otras proteínas de fusión de IgE canina recombinante.

Los ensayos de caracterización del anticuerpo monoclonal 15A.2 indican que el 15A.2 no se fija sobre la IgE que ya está unida al receptor de la IgE de los mastocitos. Por ello pone de manifiesto que está impedido el acceso al epítope fijado por el 15A.2 debido a la unión de la IgE sobre el receptor Fc de los mastocitos. Por consiguiente, el 15A.2 no produce la unión cruzada de la IgE fijada a mastocitos. Este hallazgo se demuestra con los estudios de fijación sobre un receptor recombinante que se describen en la presente.

El anticuerpo monoclonal 8H.8 también se fija sobre la IgE canina. Se deriva el anticuerpo monoclonal 8H.8 por inmunización de ratones con una versión reducida del exón 3 de la molécula de la IgE canina, denominado exón 3a. El exón 3a contiene los 71 aminoácidos terminados en C del exón 3 de longitud completa. Los estudios previos (cuyos datos no se presentan en esta memoria) indican que la inmunización de los ratones con el exón 3 de longitud completa no genera anticuerpos provistos de especificidad, como la que se ha encontrado últimamente en el anticuerpo 8H.8.

Los ensayos de caracterización del anticuerpo monoclonal 8H.8 indican que, a diferencia de los anticuerpos monoclonales derivados por inmunización con todas las demás secuencias de IgE recombinante, el 8H.8 también se fijaría sobre la IgE canina nativa. Además, al igual que el 15A.2 y del modo representado en la figura 2, se ha constatado que el 8H.8 no se fija sobre la IgE que ya está unida al receptor de IgE de los mastocitos. Por tanto, parece que está también impedido el acceso al epítope fijado por el 8H.8 debido a la fijación de la IgE sobre el receptor Fc de los mastocitos. De ello resulta que el 8H.8 no produce la unión cruzada de la IgE unida a los mastocitos. Este hallazgo se confirma por los estudios de fijación con un receptor recombinante que se describen en esta memoria.

Se llevan a cabo ensayos competitivos entre un anticuerpo, el 8H.8 o el 15A.2, y el exón 3 soluble para identificar el nivel de inhibición de la fijación de estos anticuerpos sobre la IgE nativa purificada por afinidad e inmovilizada sobre la fase sólida de un ensayo ELISA. Los resultados de este estudio se reproducen en la figura 3. En la figura 3 se observa que el aumento de la concentración del exón 3 recombinante inhibe la fijación del anticuerpo monoclonal 8H.8, pero no inhibe la del anticuerpo 15A.2.

Se examina además la capacidad de estos anticuerpos monoclonales por inhibir la fijación de la IgE sobre el receptor de la IgE recombinante de la fase sólida del ensayo ELISA.

Se realizan también ensayos competitivos con el anticuerpo 8H.8 y ensayos similares con el 15A.2, en los que el anticuerpo se halla en competición con la IgE canina purificada por afinidad y que se halla en solución y la IgE de la fase sólida del ensayo ELISA. Los datos de estos ensayos se representan en la figura 4.

Estos estudios sugieren que el 15A.2 tiene una gran afinidad con la IgE canina nativa soluble debido a que, cuando aumenta la concentración de la IgE soluble, cae de forma notable la fijación del 15A.2 sobre la inmunoglobulina inmovilizada, indicando que el 15A.2 se halla ahora fijado sobre la IgE soluble. En cambio, se observa que el anticuerpo 8H.8 tiene una afinidad mucho menor con la IgE soluble, debido que las concentraciones crecientes de la IgE soluble no inhiben la capacidad del 8H.8 de fijarse sobre la IgE inmovilizada. Los datos sugieren por tanto que la IgE soluble no es eficaz para inhibir la fijación del 8H.8 sobre la IgE inmovilizada sobre una fase sólida. Por consiguiente, la afinidad del 8H.8 con la IgE canina soluble es menor que la afinidad de este anticuerpo monoclonal con la IgE de la fase sólida.

Estos estudios sugieren además que el 8H.8 tiene poca afinidad con la IgE canina nativa soluble, porque las concentraciones crecientes de la IgE soluble no inhiben la capacidad del 8H.8 de fijarse sobre la IgE inmovilizada. A diferencia de ello, se observa que el anticuerpo 15A.2 tiene una afinidad mucho mayor con la IgE soluble, porque a medida que aumenta la concentración de la IgE soluble, disminuye de modo apreciable la fijación del 15A.2 sobre la inmunoglobulina inmovilizada, indicando de este modo que el 15A.2 está fijado actualmente sobre la IgE soluble. Por lo tanto, los datos sugieren que la IgE soluble no es eficaz en inhibir la fijación del 8H.8 sobre la IgE inmovilizada sobre la fase sólida. Por consiguiente, la afinidad del 8H.8 con la IgE canina soluble es menor que la afinidad de este anticuerpo monoclonal con la IgE de la fase sólida.

Para delimitar mejor el hallazgo de que el 15A.2 tiene mayor afinidad con la IgE nativa soluble y el 8H.8 tiene menos afinidad con la IgE nativa soluble se realizan estudios en los que se emplea el 8H.8 y estudios similares con el 15A.2 para determinar en qué medida cada anticuerpo inhibe la fijación de la IgE soluble sobre una fase sólida de receptor de IgE recombinante. Como medio de detección se emplea en los estudios representados en la figura 5 se emplea un anticuerpo marcado D9. Se sabe que el anticuerpo marcado D9 se fija sobre la IgE cuando esta está unida al receptor. En los estudios representados en la figura 5, la IgE nativa está presente en una concentración de 2,5 microgramos por mililitro. Tal como se indica en la figura 5, el 15A.2 es eficaz para inhibir la fijación de la IgE nativa sobre el receptor de IgE recombinante en concentraciones de anticuerpo muy bajas, del orden de 190 nanogramos por mililitro. A diferencia de ello se requieren 3,125 nanogramos por mililitro del 8H.8 para inhibir la fijación de la IgE nativa sobre el receptor de IgE recombinante. Por lo tanto, dado que se requiere más 8H.8 que 15A.2 para inhibir la fijación de la IgE nativa sobre el receptor recombinante, se deduce que el 8H.8 tiene menor afinidad con la IgE soluble. Se pone de manifiesto por tanto que cuando se aporta una concentración suficiente del anticuerpo 8H.8 o del 15A.2, entonces los anticuerpos perjudican o reducen la fijación de la IgE soluble sobre el receptor de la IgE.

Se observa además, por los datos representados en la figura 2, que la avidez del 8H.8 por fijar la IgE canina nativa se incrementa en gran manera cuando la IgE está inmovilizada. Estos estudios sugieren que el 8H.8 tiene una afinidad baja con la IgE canina nativa soluble, pero que cuando dicha IgE está inmovilizada sobre una superficie, o cuando se ha expresado sobre la superficie de una célula B de memoria, entonces aumenta en gran manera la avidez del 8H.8 por fijarse sobre la IgE canina nativa.

Por consiguiente, en vista de estos hallazgos, se ha lanzado la hipótesis de que la región dentro de la que se reconoce la IgE nativa por parte del 8H.8 podría estar parcialmente oculta, en particular cuando la IgE se halla en el suero. Una secuencia de aminoácidos de la IgE que esté parcialmente secuestrada no puede exponerse fácilmente al sistema inmune canino nativo ni a sus mecanismos normales de protección. Además, dado que el exón 3 de longitud completa no conduce a la generación de anticuerpos que tengan especificidad similar a la del 8H.8, la secuencia de longitud completa puede contener péptidos supresores capaces de regular a la baja o de eliminar una respuesta auto-anti-IgE, que es específica contra el epítope reconocido por el anticuerpo 8H.8. Cualquiera de los dos mecanismos puede servir para evitar la producción de una respuesta autoinmune al auto-antígeno.

Las implicaciones de estos hallazgos son que el anticuerpo 8H.8, cuando se utiliza en terapia de la alergia en perros, se fijará con preferencia sobre la IgE de las células B de memoria, antes de hacerlo con la IgE en solución. Además, el 8H.8 tiene una baja afinidad de fijación con la IgE que se halle fijada por el receptor Fc de los mastocitos.

Para mapear el epítope fijado por el anticuerpo 8H.8 se utiliza la tecnología de visualización de fagos (phage display technology). Un método preferido de llevar a cabo la tecnología de visualización de fagos viene asociado al uso del kit llamado "Ph. D. Phage Display Peptide Library Kit" de la empresa New England Biolabs, Beverly, Mass. Se ha constatado que un péptido de 7 aminoácidos (Thr-Leu-Leu-Glu-Tyr-Arg-Met) inhibe la fijación competitiva del anticuerpo monoclonal 8H.8 tanto sobre la IgE canina nativa como sobre la recombinante. Esta secuencia contiene 6 aminoácidos comunes en la forma y/o espaciado con la región terminada en C del exón 3. Un péptido de 11 aminoácidos sintetizado a partir de esta región (Gly-Met-Asn-Leu-Thr-Trp-Tyr-Arg-Glu-Ser-Lys), denominado E3a.5, inhibe también la fijación competitiva del anticuerpo monoclonal 8H.8 sobre la IgE recombinante o nativa.

Se cree que las respuestas de anticuerpo con especificidad, por ejemplo las del 8H.8, no tienen lugar de modo natural, incluso después de haber ocurrido los acontecimientos que inducen las respuestas auto-anti-IgE a otros epítopes, porque el epítope 8H.8 está disponible solo parcialmente para el reconocimiento. Sin embargo, se ha lanzado la hipótesis de que los anticuerpos de un epítope del tipo 8H.8 generados por la inmunización peptídica según la invención producen la fijación sobre el epítope parcialmente disponible, tal como la produce el anticuerpo monoclonal 8H.8.

Se formula además la hipótesis de que la región de la IgE nativa que es reconocida por el 15A.2 puede servir como inmunógeno para inducir respuestas auto-anti-IgE y puede generar anticuerpos capaces de fijarse sobre la IgE + células B y regular en sentido decreciente la síntesis de la IgE. Las implicaciones de estos hallazgos son que el anticuerpo 15A.2, cuando se utiliza para el tratamiento terapéutico de la alergia canina, impedirá la fijación de la IgE sobre los mastocitos y afectará potencialmente la síntesis de la IgE en las células B.

Para mapear el epítope fijado por el anticuerpo 15A.2 se utiliza la tecnología de visualización de fagos (phage display technology). Tal como se ha indicado antes, un método preferido de llevar a cabo la tecnología de visualización de fagos viene asociado al uso del kit llamado "Ph. D. Phage Display Peptide Library Kit" de la empresa New England Biolabs, Beverly, Mass. En la figura 6 se representan las secuencias de aminoácidos de la biblioteca PhDc7c, que están fijadas por el anticuerpo monoclonal 15A.2. Estas secuencias se muestran alineadas con la secuencia de proteína de la IgE canina. En la figura 7 se representa el alineamiento del epítope 15A.2 de siete mamíferos distintos: perro, hombre, mono verde, gato, cerdo, ratón y caballo.

En la figura 8 se representa la capacidad de péptidos mimotopos 15A.2 que presentan diferentes fagos de inhibir que la IgE canina fije el anticuerpo monoclonal 15A.2 sobre la fase sólida. Se mezclan 466 \mul de anticuerpo 15A.2 biotinilado (10 \mug/ml) con 466 \mul de fago procedentes de un cultivo fresco de una noche. Se introducen en cada hoyo de la placa de microvaloración 100 \mul de la mezcla. Se deja en reposo durante 2,5 horas para que los anticuerpos se unan a los fagos. A continuación se recubren los hoyos con estreptavidina. Se lavan las placas tres veces con tampón de lavado estándar para eliminar el material fijado de forma floja. Se prepara una serie de diluciones de la IgE canina, partiendo de la concentración de 1 \mug/\mul de PBS, 0,1% de Tween. Se añaden 100 \mul de la dilución de IgE a cada hoyo y se deja que se fije durante 10 minutos. Se interrumpe la reacción de competición por lavado de la placa cinco veces con solución de lavado. A continuación se revela la placa con anticuerpo monoclonal D9 unido a HRPO, que se fija sobre el dominio 4 de la IgE, para visualizar la IgE de la fase sólida. La pérdida de señal indica que el fago ha repelido con éxito la competencia de la IgE canina. En la tabla 1 se recogen las concentraciones de los reactivos en los diversos puntos del eje x de la figura 8.

TABLA 1

2

Utilizando la biblioteca de visualización de fagos PhD12 de la empresa New England Biolabs se observa que un péptido de 12 aminoácidos (SEQ ID NO:11, Val-Thr-Leu-Cys-Pro-Asn-Pro-His-Ile-Pro-Met-Cys) inhibe la fijación competitiva del anticuerpo monoclonal 15A.2 tanto sobre la IgE canina nativa como sobre la recombinante. Esta secuencia contiene 4 aminoácidos comunes en la forma y/o espaciado con la región terminada en N del exón 3.

En la figura 9 se representa la capacidad del anticuerpo monoclonal 15A.2 de fijar un péptido sintético. Se sintetiza el péptido de la SEQ ID NO:12, Ser-Val-Thr-Leu-Cys-Pro-Asn-Pro-His-Ile-Pro-Met-Cys-Gly-Gly-Gly-Lys y se biotinila sobre el carbono epsilon del resto Lys. Esta secuencia corresponde al aislado M13-48. Se trata el péptido de manera que promueva la reducción y ciclación de las cisteínas para formar un péptido cíclico. Se prepara una serie de diluciones del péptido y se fija a placas de microvaloración recubiertas con estreptavidina (5 \mug de estreptavidina por hoyo). Se detecta el péptido fijado con el anticuerpo monoclonal 15A.2 conjugado con HRPO. En la figura 9 se recogen los resultados de este ensayo. Este péptido mimotopo de 15A.2 específico de fase sólida se fija sobre el anticuerpo monoclonal 15A.2 de una manera que es dependiente de la concentración.

En las figura 10A y 10B se representa la capacidad del péptido mimotopo de 15A.2 de impedir la fijación del anticuerpo monoclonal 15A.2 sobre la IgE canina de la fase sólida. Se recubren las placas con IgE canina en una concentración de 1 \mug/ml. Se añade una serie de diluciones del péptido sintético al anticuerpo monoclonal 15A.2 conjugado con HRPO (concentración final: 1 \mul/ml) y se deja en reposo para que se unan durante dos horas. Se añaden a los hoyos 100 \mul de la mezcla 15A.2/péptido y se dejan en reposo para que se unan durante 1 hora. Se interrumpe la reacción por lavado de las placas, seis veces, con tampón de lavado. Se revelan las placas con sustrato HRPO, se interrumpen las reacciones con una mezcla al efecto y se miden las densidades ópticas (OD) de las placas con un lector de placas.

Aparte de la inmunización activa con el anticuerpo 15A.2 o 8H.8 para inducir la producción de auto-anti-IgE "in vivo", esta invención se refiere además a una molécula de fijación específica que se une de modo específico a un ligando del tipo fijado por el 15A.2 o por el 8H.8, así como al uso terapéutico o profiláctico de la misma. La invención se refiere además a un anticuerpo monoclonal específico de una variante conservadora de una secuencia fijada por el 15A.2, de una variante conservadora de una secuencia fijada por el 8H.8 o de una secuencia nativa de la IgE canina situada a una distancia de hasta 100 aminoácidos de la porción terminal C' del exón 3. Las moléculas de fijación específica de la invención pueden utilizarse en un método según la invención para el tratamiento o la profilaxis de síntomas de alergia, es decir, para la inmunización pasiva.

Por consiguiente, la administración a un perro ya sea de un anticuerpo según esta invención, por ejemplo el 15A.2 o el 8H.8, o de un péptido según esta invención, por ejemplo el péptido de 7, 11 o 12 aminoácidos, conduce a una disminución de la producción posterior de la IgE. Esto puede llevarse a cabo por ejemplo mediante la fijación del anticuerpo 15A.2 o del 8H.8 a las células B de memoria y mediante la privación de la posterior producción de la IgE. En el caso de un péptido, su administración conducirá a la producción de anticuerpos de especificidad y efecto comparables a los del 15A.2 o del 8H.8.

Ejemplos Ejemplo 1

En la figura 11 se representan los resultados del estudio de fijación en el que el anticuerpo 8H.8 y el anticuerpo 15A.2 se ensayan por separado para determinar su capacidad de fijarse sobre una fase sólida que tenga inmovilizada sobre sí la IgE canina purificada por afinidad. Estos resultados indican que los anticuerpos 8H.8 y 15A.2 se fijan sobre la IgE nativa cuando está inmovilizada sobre una fase sólida. Los resultados de estos estudios sugieren que la fijación de cada uno de estos anticuerpos a la IgE unida a la superficie es de una afinidad similar. Para determinar si la afinidad de fijación de cada anticuerpo es, de hecho, comparable, se llevan a cabo estudios complementarios.

En la figura 12 se representan los resultados del estudio en el que el anticuerpo 8H.8 conjugado con un resto de señal se hace reaccionar en diversas concentraciones con fases sólidas que tienen diversos péptidos inmovilizados sobre ellas. Los datos representados mediante (\blacklozenge) reflejan una fase sólida que tenga la IgE canina inmovilizada sobre ella; los datos representados mediante (\blacksquare) reflejan una fase sólida que tiene el E3a.5 inmovilizado sobre ella; los datos representados con (\Pi) reflejan una fase sólida que tiene un péptido extendido con E3a.5 inmovilizado sobre ella; los datos representados mediante (X) reflejan los datos de una fase sólida que tiene un péptido codificado con E3a.5 inmovilizado sobre ella; los datos representados mediante un (*) reflejan una fase sólida que tiene un péptido de siete aminoácidos, identificado con la tecnología de visualización de fagos, que se fija sobre el SH8, inmovilizado sobre ella. Se observa por tanto que el 8H.8 se fija sobre cada fase sólida, excepto sobre la fase sólida que tiene el péptido codificado con E3a.5 inmovilizado sobre ella.

Se sabe que el anticuerpo monoclonal 14K2 se fija exclusivamente sobre el exón 4 de IgE canina. Se hace reaccionar este anticuerpo con diversas fases sólidas que tienen diversos péptidos inmovilizados sobre ellas. Los datos representados mediante (\blacklozenge) reflejan una fase sólida que tiene la IgE canina inmovilizada sobre ella; los datos representados mediante (\blacksquare) reflejan una fase sólida que tiene el E3a.5 inmovilizado sobre ella; los datos representados con (\Pi) reflejan una fase sólida que tiene un péptido extendido con E3a.5 inmovilizado sobre ella; los datos representados mediante (X) reflejan los datos de una fase sólida que tiene un péptido codificado con E3a.5 inmovilizado sobre ella; los datos representados mediante un (*) reflejan una fase sólida que tiene un péptido de siete aminoácidos, identificado con la tecnología de visualización de fagos, que se fija sobre el 8H.8, inmovilizado sobre ella. Se observa por tanto que el 14K2 se fija solamente sobre una fase sólida, que tenga la molécula de la IgE canina completa inmovilizada sobre ella. Estos datos se representan en la figura 13.

Se cree que el anticuerpo monoclonal 15A.2 se fija solamente sobre el exón 3 de IgE canina. En la figura 14 se representan los datos de los estudios que evalúan la fijación del 15A.2 sobre diversos péptidos. Los datos representados mediante (\blacklozenge) reflejan una fase sólida que tiene la IgE canina inmovilizada sobre ella; los datos representados mediante (\blacksquare) reflejan una fase sólida que tiene el E3a.5 inmovilizado sobre ella; los datos representados con (\Pi) reflejan una fase sólida que tiene un péptido extendido con E3a.5 inmovilizado sobre ella; los datos representados mediante (X) reflejan los datos de una fase sólida que tiene un péptido codificado con E3a.5 inmovilizado sobre ella; los datos representados mediante un (*) reflejan una fase sólida que tiene un péptido de siete aminoácidos, identificado con la tecnología de visualización de fagos, que se fija sobre el 8H.8, inmovilizado sobre ella. Se observa por tanto que el 15A.2 se fija solamente sobre una fase sólida, que tenga la molécula de la IgE canina completa inmovilizada sobre ella. Estos datos indican que el 15A.2 no se fija sobre el mismo epítope, sobre el que se fija el 8H.8.

En la figura 15 se representan los datos de los estudios que comparan la fijación del 8H.8 o de anticuerpos policlonales cultivados para convertirse en IgE humana recombinante, sobre el péptido E3a.5 o sobre el péptido E3a.5 con una sustitución de aminoácido que lo convierte en más análogo de una secuencia del genoma humano que codifica la IgE humana, llamado péptido S3a.5. En la figura 15, los datos representados mediante (\blacklozenge) reflejan el 3a.5 sustituido y comparado con el 8H.8; los datos representados mediante (\blacksquare) reflejan el péptido 3a.5 sustituido y la Re-Hu IgE; los datos representados con (\Pi) reflejan un péptido E3a.5 y un 8H.8 y los datos representados mediante (X) reflejan el péptido E3a.5 y la Re-Hu IgE policlonal. Estos datos indican que solamente el 8H.8 se llega a fijar sobre el E3a.5 en la fase sólida, ninguna de las combinaciones restantes presenta dicha fijación.

En la figura 16 se representan los datos de estudios que comparan la fijación del 8H.8 sobre diversos péptidos inmovilizados sobre una fase sólida. Los datos representados mediante (\blacklozenge) reflejan una fase sólida que tiene la IgE canina inmovilizada sobre ella; los datos representados mediante (\blacksquare) reflejan una fase sólida que tiene el E3a.5 extendido inmovilizado sobre ella; los datos representados con (\Pi) reflejan una fase sólida que tiene la IgE humana inmovilizada sobre ella; los datos representados mediante (X) reflejan los datos de una fase sólida que tiene un péptido 8H.8 inmovilizado sobre ella. Según estos datos, se observa que el 8H.8 se fija sobre la IgE canina, el péptido E3a.5 extendido o el péptido de siete aminoácidos identificado mediante la tecnología de visualización de fagos como epítope de fijación del 8H.8, cuando cada uno de estos péptidos se halla inmovilizado sobre una fase sólida. Se observa además que el 8H.8 no se fija sobre la IgE humana.

En la figura 17 se representan los datos de estudios que comparan la capacidad de los anticuerpos policlonales anti-IgE humana para fijarse sobre fases sólidas que tengan diversos péptidos inmovilizados sobre ellas. Los datos representados mediante (\blacklozenge) reflejan una fase sólida que tiene la IgE canina inmovilizada sobre ella; los datos representados mediante (\blacksquare) reflejan una fase sólida que tiene el E3a.5 extendido inmovilizado sobre ella; los datos representados con (\Pi) reflejan una fase sólida que tiene la IgE humana inmovilizada sobre ella; los datos representados mediante (X) reflejan los datos de una fase sólida que tiene un péptido 8H.8 inmovilizado sobre ella. Según estos datos, se observa que los anticuerpos policlonales anti-IgE humana se fija sobre la IgE humana cuando está inmovilizada sobre una fase sólida. Se observa además que el antisuero policlonal presenta una fijación limitada sobre el péptido E3a.5 extendido cuando los anticuerpos policlonales están presentes en concentraciones muy elevadas; esto se cree que es un artefacto de fijación debido a la concentración elevada de anticuerpos. Por lo tanto, se observa que los anticuerpos de la IgE humana no se fijan específicamente sobre la IgE canina o sobre los péptidos con arreglo a esta invención.

Ejemplo 2

En la tabla 2 se recogen las secuencias de aminoácidos del epítope fijado por el 8H.8, la secuencia de 11 aminoácidos utilizada en los estudios de inmunización presenta en esta descripción así como las secuencias análogas de la IgE felina y humana.

Se prepara además una secuencia canina sustituida que tiene una sustitución de aminoácidos que hace que el péptido sea más parecido al péptido humano.

TABLA 2

3

Cada uno de los péptidos de la tabla 2 se coloca sobre una fase sólida y se realizan estudios para identificar si el 8H.8 se fija sobre el péptido fijado sobre la superficie. Se encuentra que el 8H.8 se fija a una superficie que tenga el péptido mimotopo sobre ella y a una superficie que tenga el péptido de 11 aminoácidos fijado sobre ella. Se observa que el 8H.8 no se fija sobre el péptido humano, el péptido felino ni la secuencia canina que tiene una sustitución de aminoácido que la convierte en más similar a la secuencia humana, cuando uno cualquiera de estos péptidos se halla fijado sobre la superficie.

Conclusiones

A menos que se indique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos que se emplean en esta descripción tienen el mismo significado que se le atribuye habitualmente por parte de los expertos en la materia, al ámbito de la cual pertenece esta invención. Aunque se pueden utilizar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente para la puesta en práctica o para la comprobación de la invención, los métodos y materiales preferidos se describen ahora.

Claims (31)

1. Una proteína de fijación específica, elegida entre el grupo formado por un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un fragmento de anticuerpo monoclonal que se fija sobre un antígeno, un fragmento de un anticuerpo policlonal que se fija sobre un antígeno, un anticuerpo híbrido y un anticuerpo de cadena simple, que se fija específicamente sobre la IgE canina nativa libre o unida a células B mediante la fijación sobre una secuencia de aminoácidos que consta de:

(SEQ ID NO: 1) leucina-blanco-blanco-tirosina-arginina;

(SEQ ID NO: 2) tirosina-arginina-blanco-blanco-leucina;

(SEQ ID NO: 3) leucina-blanco-blanco-tirosina-arginina-blanco-blanco-leucina;

(SEQ ID NO: 4) treonina-leucina-leucina-ácido glutámico-tirosina-arginina-metionina;

(SEQ ID NO: 5) glicina-metionina-asparagina-leucina-treonina-triptófano-tirosina-arginina-ácido glutámico-serina-lisina;

(SEQ ID NO: 6) cisteína-blanco-blanco-prolina-histidina-blanco-blanco-blanco-cisteína;

(SEQ ID NO: 7) serina-valina-treonina-leucina-cisteína-prolina-asparagina-prolina-histidina-isoleucina-prolina-metionina-cisteína-glicina-glicina-glicina;

(SEQ ID NO: 8) serina-alanina-cisteína-prolina-asparagina-prolina-histidina-asparagina-prolina-tirosina-cisteína-glicina-glicina-glicina;

(SEQ ID NO: 9) cisteína-blanco-prolina-histidina-blanco-prolina-blanco-blanco-cisteína;

(SEQ ID NO: 10) serina-alanina-cisteína-histidina-prolina-histidina-leucina-prolina-lisina-serina-cisteína-glicina-glicina-glicina;

(SEQ ID NO: 11) valina-treonina-leucina-cisteína-prolina-asparagina-prolina-histidina-isoleucina-prolina-metionina-cisteína; o

(SEQ ID NO: 12) serina-valina-treonina-leucina-cisteína-prolina-asparagina-prolina-histidina-isoleucina-prolina-metionina-cisteína-glicina-glicina-glicina;

en las que blanco es cualquier aminoácido y que no se fija sobre la IgE cuando la IgE está unida a un receptor existente en un mastocito.

2. La proteína de fijación específica de la reivindicación 1, en la que la IgE fijada sobre la célula B es la IgE expresada sobre la superficie de una célula B canina.

3. La proteína de fijación específica de la reivindicación 1 ó 2, que se fija específicamente sobre un péptido aislado y purificado que contiene una leucina posicionada dos enlaces peptídicos más allá del par tirosina-arginina.

4. La proteína de fijación específica de la reivindicación 3, que se fija específicamente sobre un péptido que tiene la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3.

5. La proteína de fijación específica de la reivindicación 4, en la que por lo menos un blanco es un aminoácido que tiene un anillo aromático.

6. La proteína de fijación específica de una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5, que es un anticuerpo.

7. El anticuerpo de la reivindicación 6, que es un anticuerpo monoclonal.

8. El anticuerpo de la reivindicación 6, que se presenta en forma de péptido aislado y purificado que tiene un grupo leucina posicionado dos enlaces peptídicos más allá del par tirosina-arginina y dicho péptido contiene de 5 a 71 aminoácidos.

9. El anticuerpo de la reivindicación 8, que se presenta en forma de péptido aislado y purificado que contiene una secuencia de aminoácidos, que consiste en la SEQ ID NO: 4 o una variante conservadora de la misma.

10. El anticuerpo de la reivindicación 8, que se presenta en forma de péptido aislado y purificado que contiene una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO: 5 o una variante conservadora de la misma.

11. La proteína de fijación específica según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 10, que se presenta en forma de péptido antigénico múltiple que consta de copias múltiples de un péptido aislado y purificado que contiene un grupo leucina posicionado dos enlaces peptídicos más allá del par tirosina-arginina.

12. La proteína de fijación específica de la reivindicación 11, dicha proteína contiene de 5 a 71 aminoácidos.

13. La proteína de fijación específica de una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 12, que se presenta en forma de partícula de virus de planta recombinante, que contiene por lo menos una copia de un péptido aislado y purificado que contiene un resto leucina posicionado dos enlaces peptídicos más allá del par tirosina-arginina.

14. La proteína de fijación específica de la reivindicación 13, dicho péptido contiene de 5 a 71 aminoácidos.

15. La proteína de fijación específica de una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 14, que se fija específicamente sobre un epítope definido.

16. La proteína de fijación específica de la reivindicación 15, que es una molécula de fijación recombinante.

17. La proteína de fijación específica de la reivindicación 1, en la que la proteína de fijación específica es un anticuerpo monoclonal derivado de ratones inmunizados con el exón 3a de la molécula de la IgE canina, que se fija específicamente sobre la IgE libre o sobre la IgE unida a células B y que no se fija sobre la IgE cuando la IgE está unida al receptor de la IgE.

18. La proteína de fijación específica de la reivindicación 1, en la que la proteína de fijación específica es un anticuerpo monoclonal derivado de ratones inmunizados con la molécula de la IgE canina purificada por afinidad, que se une específicamente a la IgE libre o a la IgE unida a las células B y que no se fija sobre la IgE cuando la IgE está unida al receptor de la IgE.

19. La proteína de fijación específica de una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 3, que se fija específicamente sobre un péptido aislado y purificado que contiene la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 12.

20. La proteína de fijación específica de una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 3, que se fija específicamente sobre un péptido aislado y purificado que contiene la SEQ ID NO: 13 (cisteína-prolina-asparagina-prolina-histidina-isoleucina-prolina-metionina-cisteína) o la SEQ ID NO: 14 (cisteína-prolina-asparagina-prolina-histidina-asparagina-prolina-tirosina-cisteína).

21. La proteína de fijación específica de la reivindicación 20, en la que el péptido contiene la secuencia serina-alanina-cisteína-prolina-asparagina-prolina-histidina-asparagina-prolina-tirosina-cisteína-glicina-glicina-glicina.

22. La proteína de fijación específica de una cualquiera de las reivindicaciones de 19 a 21, que es un anticuerpo.

23. El anticuerpo de la reivindicación 22, que es un anticuerpo monoclonal.

24. El anticuerpo de la reivindicación 22, que se presenta en forma de péptido aislado y purificado, provisto de la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 12 o una variante conservadora de las mismas.

25. El anticuerpo de la reivindicación 22, que se presenta en forma de péptido aislado y purificado, provisto de la SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14 o una variante conservadora de las mismas.

26. El anticuerpo de la reivindicación 25, en el que dicho péptido contiene la secuencia serina-alanina-cisteína-prolina-asparagina-prolina-histidina-asparagina-prolina-tirosina-cisteína-glicina-glicina-glicina.

27. La proteína de fijación específica según una cualquiera de las reivindicaciones de 19 a 26, que se fija específicamente sobre un epítope definido.

28. La proteína de fijación específica de la reivindicación 27, que es una molécula de fijación recombinante.

29. El uso de una proteína de fijación específica según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 28 para la fabricación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento o profilaxis de la alergia canina.

30. El uso de la reivindicación 29, en el que la composición farmacéutica contiene además un diluyente.

31. El uso de la reivindicación 29 ó 30 para la fabricación de un kit de composición farmacéutica, dicho kit contiene una primera dosis de dicha proteína de fijación específica y una segunda dosis de dicha proteína de fijación específica.