DE10306331A1

DE10306331A1 - Verfahren zur Herstellung von BK-RiV-spezifischen Präparaten und deren Anwendung in der Human- und Veterinärmedizin

Info

Publication number: DE10306331A1
Application number: DE2003106331
Authority: DE
Inventors: Herbert Dr.sc.nat.Dr.rer.nat. Liebermann; Willi Wazel
Original assignee: VARICULA LIFE SCIENCE AG
Current assignee: VARICULA LIFE SCIENCE AG
Priority date: 2003-02-11
Filing date: 2003-02-11
Publication date: 2004-09-02

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von BK-RiV-spezifische Komponenten enthaltenden Präparaten, wobei sie die BK-RiV-spezifischen Komponenten in hochgereinigter Form und beliebiger Größe sowohl als BK-RiV-Partikel als auch als Untereinheiten bis herab zu den Polypeptiden aufweisen. Sie werden aus gestressten Zellen bzw. Zellkulturen unter Verwendung eines speziellen BK-RiV-spezifischen Antikörpergemisches gewonnen.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von BK-RiV-spezifische Komponenten enthaltenden Präparaten, wobei sie die BK-RiV-spezifischen Komponenten in hochgereinigter Form und beliebiger Größe sowohl als BK-RiV-Partikel als auch als Untereinheiten bis herab zu den Polypeptiden aufweisen. Sie werden aus gestressten Zellen bzw. Zellkulturen unter Verwendung eines speziellen BK-RiV-spezifischen Antikörpergemisches gewonnen. BK-RiV steht dabei für Biokomplex-Reaktionsmuster in Vertebratenzellen. Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung der Präparate in der Human- und Veterinärmedizin zur Diagnose, Therapie, Metaphylaxe und Prophylaxe, zur Prüfung und Normalisierung des „Allgemein zellulär-sekretorischen Abwehrsystems" (AZSA) und der mit diesem kausal verknüpften Körperzustände. Das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren führt gegenüber bisherigen Verfahren zu einer vielfach höheren Ausbeute an wirksamen BK-RiV-spezifischen Komponenten (BK-RiV-spezifische Polypeptide, BK-RiV-spezifische Proteine und deren Assoziate) und weist nahezu keine nicht-BK-RiV-spezifischen Komponenten auf. Seine Anwendung hat dadurch den großen Vorteil, dass mögliche unerwünschte Nebenwirkungen im Vergleich zu bekannten ähnlichen BK-RiV-Präparaten vermieden bzw. wesentlich reduziert werden können.

BK-RiV-Präparate sowie deren Verwendung zur Therapie von Virusinfektionen wie HIV/AIDS und chronischer Hepatitis C, von Krebserkrankungen, von generalisierten psoriatischer Erythrodermie, gegen extreme Schmerzzustände u.a. Erkrankungen und zur Unterstützung und Vermeidung von Schädigungen bei der Chemo- und Radiotherapie, allgemein zur Diagnose, Therapie und Prophylaxe, zur Prüfung und Normalisierung des AZSA und der mit diesem kausal verknüpften Körperzustände sind bekannt ( DD 228 739 A1 , DE 92 18 127 U1 , EP 0 702 955 A2 , DE 197 28 323 A1 , EP 0 889 053 A2 , DE 101 09 155 A1 ). Diese BK-RiV-Präparate weisen u.a. folgende Proteine, assoziiert mit BK-RiV-Partikeln, auf: Annexin I und V, 14-3-3ζ, 14-3-3ε, Galectin 3, S100A4, S100A2, Glutathion-S-Transferase, Nm 23, Aldolase„gCAP39, Myosin, (leichte Kette), Actin, Vimentin, Nucleolin, α-Actinin, Histon 2A, Histon 2B, ribosomales Protein L7, HSP27, HSP70, Proteasom C6, Proteasom (δ), Proteasom (iota), Ezrin, ER-60, PDI, Enolase, natural killen cell enhancing factor A, zum Pflanzenprotein Hevein (Lectin) homologes Säugerprotein und zu Stratherin homologes Protein und Annexin I-Isoform.

Es ist in Fachkreisen zwischenzeitlich bekannt, dass in der therapeutischen Wirksamkeit von BK-RiV-Präparaten mit unversehrten BK-RiV-Partikeln und solchen Präparaten, bei denen die BK-RiV-Partikeln beispielsweise durch wiederholtes Gefriertauen zerfallen oder morphologisch geschädigt waren, kein signifikanter Unterschied feststellbar ist.

Die Herstellung von BK-RiV-Präparaten ist zahlreich beschrieben (z.B. in DD 228 739 A1 , DE 92 18 127 U1 , EP 0 702 955 A2 , DE 197 28 323 A1 , EP 0 889 053 A2 , DE 101 09 155 A1 ). Sie erfolgt z. B. gemäß dem zitierten Stand der Technik, indem partikuläre Biokomplex-Präparate, die im wesentlichen Teilchen mit einem Durchmesser von ca 50 nm und auch 9 nm enthalten, aus Zellkulturen gewonnen werden ( DE 92 18 127 U1 ). Verfahren zur Herstellung von BK-RiV-Partikelpräparaten umfassen im wesentlichen die Arbeitsschritte:

– Vermehrung von somatischen Zellen in einem serumhaltigen antibiotikafreien Anzuchtmedium,
– Stimulierung der Zellen zur Produktion von BK-RiV (in einem Erhaltungsmedium ohne Serum),
– Zelldestruktion, (Gefriertauen und Ultraschallbehandlung)
– Klarzentrifugation,
- Ultrazentrifugation oder alternative Verfahren,
– Behandlung des resuspendierten Sediments mit einem organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Chloroform oder Ether,
– Gewinnung der wässrigen Phase als Endprodukt und anschließende Prüfung auf Identität und Quantität, Sterilität, Unschädlichkeit etc. gemäß Europäischer Pharmakopöe.

Der Nachteil dieses Aufarbeitungsverfahrens besteht in der geringen Ausbeute an BK-RiV im Endprodukt. Es hat sich gezeigt (bisher nicht bekannt), dass weniger als 10% der im Ausgangsmaterial vorhandenen BK-RiV-spezifischen Komponenten im Endprodukt erhalten werden.

Ein weiteres Verfahren (WO 96130537 A1), nach welchem multifaktorielle Abwehrmodulatorengemische gewonnen werden, die im wesentlichen eine Reihe von immunmodulatorischen Komponenten beinhalten, (Gewinnung von Komponenten im Molekulargewichtsbereich von > 10.000 Dalton und < 9 nm) führt zu Präparaten, die insbesondere bei wiederholter Applikation (Daueranwendung) die erhöhte Gefahr unerwünschter Nebenwirkungen in sich tragen, da sie zahlreiche Begleiteiweiße bzw. weitere Zellbestandteile als „Verunreinigung" aufweisen.

Der Erfindung lag deshalb die Aufgabe zugrunde, BK-RiV-Präparate bereitzustellen, die wirksame BK-RiV-spezifische Bestandteile hochgereinigt enthalten, so dass sie bei mehrfacher Anwendung oder Daueranwendung die Gefahr möglicher allergischer Reaktionen oder anderer Nebenwirkungen vermeiden bzw. wesentlich reduzieren, d.h. dass sie wenig oder keine nicht-BK-RiV-spezifischen Begleitkomponenten aufweisen. Weiterhin lag der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein effektives Verfahren zur Herstellung eines solchen BK-RiV-spezifischen Präparates zu finden, das eine hohe Ausbeute an BK-RiV-spezifischen Komponenten gewährleistet.

Die Lösung der Aufgabe wird gemäß den Patentansprüchen realisiert, die Unteransprüche sind Vorzugsvarianten.

Der Erfindung liegt dabei der überraschende Befund zugrunde, dass bei einer Antigentitration (ELISA) von „Ausgangsmaterial" (gestresste, Zellkultur nach Gefriertauen mit anschließender Ultraschallbehandlung und Klarzentrifugation) gegen BK-RiV-Partikelpräparat-spezifisches Antiserum im Ausgangsmaterial etwa 1,3 mal soviel Aktivität enthalten war als im Endprodukt, einem an sich bekannten BK-RiV-Partikel-Präparat, das gegenüber dem Ausgangsmaterial noch volumenmäßig auf 1/25 reduziert worden war. Das bedeutete, dass im Endprodukt nur ca 3% der Gesamtaktivität enthalten war. (Damit konnte nachgewiesen werden, dass die Ausbeute an BK-RiV-spezifischen Komponenten in einem Produkt, hergestellt nach einem bisherigen bekannten Verfahren, sehr niedrig ist.) Gleichzeitig wurde festgestellt, dass die „spezifische Aktivität" des Ausgangsmaterials, (spezifische Aktivität: Verhältnis der Aktivität zu Gesamteiweißgehalt) nur ca 17 Units(U)/mg im Vergleich zum Endprodukt [BK-RiV-Partikel-Präparat (1)] mit einem Wert von ca 150 U/mg betrug. Daraus konnte eindeutig geschlussfolgert werden, dass im Ausgangsmaterial viel Begleitprotein enthalten ist, das zu unerwünschten Nebenwirkungen führen kann.

Ausgehend von diesen Erkenntnissen ist das erfindungsgemäße Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass ein Präparat (im folgenden als BK-RiV-Präparat (2) bezeichnet), aus primären, begrenzt oder unbegrenzt wachsenden Zellkulturen, welche zuerst einem Stressprozess unterzogen werden, hergestellt wird, das BK-RiV-spezifische Komponenten in hoher Ausbeute und Reinheit enthält. Alternativ werden bereits gestresste Zellkulturen als Ausgangsmaterial venwendet. Nach Zelldestruktion und Klärschritt wird das Zellmaterial weiter aufgearbeitet. Zur Aufarbeitung wurde ein spezielles polyklonales BK-RiV-spezifisches Antikörpergemisch (im folgenden als BK-RiV-spezifisches Antikörpergemisch (AKG) bezeichnet) entwickelt, welches erfindungsgemäß zur Affinitätsseparation und damit zur Reinigung der BK-RiV-Komponenten eingesetzt wird, um damit das Endprodukt, das BK-RiV-Präparates (2) zu gewinnen.

Das erfindungsgemäße BK-RiV-spezifische Komponenten enthaltende Präparat (2) enthält die unspezifische und spezifische Abwehrmechanismen stimulierenden und/oder normalisierenden BK-RiV-spezifischen Komponenten, bestehend aus den oben genannten Proteinen in Form von monomeren Polypeptiden bis zu den ca 50 nm-Partikeln. Nicht-spezifische BK-RiV-Komponenten sind keine oder lediglich in einer vernachlässigbaren Menge enthalten.

Darüber hinaus wurde festgestellt, dass Hauptbestandteile der BK-RiV-spezifischen Präparate (I) Annexin I und Annexin V, S100A2 und S100A4, alpha-Actinin, Ezrin, HSP70, Nm23 („metastasis suppressor gene"), Enolase, Vimentin, Aldolase, gCAP39 und enhancing factor A für NK-Zellen sind.

Bevorzugt werden die als Ausgangsmaterial verwendeten Zellen/Zellkulturen samt Überstand zur Affinitätsseparation zwecks Gewinnung eines BK-RiV-spezifischen Präparates (2) eingesetzt. Am Ende der Stressphase werden sie einem Zellaufschluss sowie einem Klärschritt zur Abtrennung verbliebener gröberer Zelltrümmer unterzogen. Zuvor wurden die Zellen in der Stressphase in einem an sich bekannten Erhaltungsmedium (z.B. Minimal Essential Medium(MEM) ohne Serum) zur Produktion von BK-RiV-Komponenten oder durch Änderung physikalischer, chemischer oder anderer biochemischer Parameter zur Produktion von BK-RiV-Komponenten stimuliert.

Gegenstand der Erfindung ist auch das spezielle polyklonale BK-RiV-spezifische Antikörpergemisch (AKG). Dieses spezielle polyklonale BK-RiV-spezifische Antikörpergemisch (AKG) wird durch Immunisierung einer Mindeststückzahl (vorzugsweise mindestens 5) eines Vertebraten mit mindestens einem nach an sich bekannten Verfahren hergestellten BK-RiV-Partikelpräparat (1) gewonnen. Die Herstellung von solch einem BK-RiV-Partikelpräparat (1) ist dem Fachmann z.B. aus DE 92 18 127 U1 bekannt (Vermehrung von somatischen Zellen in einem serumhaltigen Anzuchtmedium, Stimulierung der Zellen zur Produktion von BK-RiV in einem Erhaltungsmedium ohne Serum, Zelldestruktion, Klarzentrifugation, Ultrazentrifugation oder alternative Verfahren, Behandlung des resuspendierten Sediments mit einem organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Chloroform oder Ether, und Gewinnung der wässrigen Phase).

Zur Immunisierung wird einem Wirtsorganismus zu Beginn ein Immunisierungscocktail verabreicht, der ein solches BK-RiV-Präparat (1) und ein geeignetes Adjuvans enthält. Die Immunisierung wird zum Erreichen eines hohen Antikörpertiters mehrmals wiederholt, wobei abschließend das gebildete BK-RiV-spezifische Antikörpergemisch (AKG) isoliert und gereinigt wird. Die Immunisierung wird sowohl mit dem BK-RiV-Partikel-Präparat (1) als auch mit Untereinheiten (monomeren Polypeptiden, kleineren Polypeptidkomplexen oder/und -assoziaten) des BK-RiV-Präparates (1) durchgeführt und ggf. wiederholt.

Als Wirtsorganismus fungieren sämtliche Vertebraten, vorzugsweise Säuger oder Vögel.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das BK-RiV-spezifische Antikörpergemisch (AKG) dadurch gewonnen, dass die erste Immunisierung mit dem BK-RiV-Partikelpräparat (1) und komplettem Freund'schen Öl-Adjuvans erfolgt, eine erste Boosterung nach ca. 4 Wochen mittels BK-RiV-Partikelpräparat (1) und inkomplettem Freund'schem Adjuvans durchgeführt wird und anschließend eine zweite Boosterung nach einer weiteren ca. 14-tägigen Latenzzeit mittels BK-RiV-Präparat (1) und Aluminiumhydroxid erfolgt. Mindestens eine weitere Boosterung erfolgt dann mit BK-RiV-Untereinheiten. Diese BK-RiV-Untereinheiten werden durch Abbau der ca 50 nm BK-RiV-Partikeln mittels bekannter Methoden (wie Inkubation mit 0,1% Natriumdodecylsulfat oder 0,5 M Harnstoff, oder auch durch mehrfaches Gefriertauen oder 30 min Inkubation bei 56°C) erhalten.

Nach einer anschließenden weiteren Inkubationszeit von ca. 10 Tagen findet dann eine Blutentnahme bzw. ein Entbluten der Tiere mit anschließender Serumgewinnung und Isolierung/Reinigung des speziellen BK-RiV-Antikörpergemisches (AKG) statt.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird für die Isolierung und Reinigung des BK-RiV-spezifischen Antikörpergemisches (AKG) mittels Affinitätsseparation ein Gemisch aus BK-RiV-Partikel-Präparat (1) und BK-RiV-Untereinheiten als Liganden eingesetzt.

Das so gewonnene erfindungsgemäße polyklonale Antikörpergemisch (AKG) enthält auch Antikörper gegen im kompletten BK-RiV-Partikel „versteckte" Epitope. Das polyklonale Antikörpergemisch (AKG) umfasst überwiegend BK-RiV-spezifische Antikörper und ist nahezu frei von nicht- BK-RiV-Komponenten-spezifischen Antikörpern.

Das gereinigte BK-RiV-spezifische Antikörpergemisch (AKG) wird nach Kopplung (Immobilisierung) an eine geeignete Matrix zur Affinitätsseparation von BK-RiV-spezifischen Komponenten aus Zellsediment und Zellkulturüberstand eingesetzt, d.h. es wird zur Herstellung der BK-RiV-spezifischen Immunpräparate (2) verwendet, welche in der Human- und Veterinärmedizin zur Therapie, Metaphylaxe und Prophylaxe von durch chronische Virusinfektionen verursachten Erkrankungen, gegen Krebserkrankungen, zur Prüfung und Normalisierung des „Allgemein zellulär-sekretorischen Abwehrsystems" (AZSA) und der mit diesem kausal verknüpften Körperzustände eingesetzt werden.

Es wird mit der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von BK-RiV-Präparaten mit hoher Ausbeute an BK-RiV-spezifischen Komponenten (ca 70 bis 95% der im „Ausgangsmaterial" enthaltenen BK-RiV-spezifischen Komponenten können erhalten bzw. genutzt werden) zur Verfügung gestellt, durch welches bei Anwendung mögliche Nebenwirkungen im Vergleich zu bekannten anderen ähnlichen bzw. identischen Immunmodulatoren enthaltenden Präparaten vermieden werden können.

Durch Einsatz des erfindungsgemäßen polyklonalen BK-RiV-spezifischen Antikörpergemisches (AKG), zur Affinitätsseparation aller BK-RiV-spezifischen Komponenten (Aufarbeitung zum Präparat (2) aus dem „Ausgangsmaterial" konnte überraschend eine Steigerung der Ausbeute an BK-RiV-spezifischen Komponenten um das etwa 15 bis 32-fache gegenüber bisherigen Verfahren zur Herstellung von bekannten BK-RiV-Partikelpräparaten (1) erzielt werden.

Beispiel 1.
a) Gewinnung eines BK-RiV-spezifischen Antikörpergemisches (AKG)
Nach Aufarbeitung von Zellsedimenten gemäß dem im Gebrauchsmuster DE 92 18 127 U1 entnehmbaren Herstellungsverfahren, das die Schritte Zellaufschluss, Klarzentrifugation, Ultrazentrifugation und kurzzeitige Chloroformbehandlung des resuspendierten Ultrazentrifugationssediments beinhaltet, wird ein BK-RiV-Partikelpräparat (1) (wässrige Phase nach der Chloroformbehandlung) zuerst im Elektronenmikroskop und in der Natriumdodecylsulfat(NaDS)-Polyakrylamid-Gelelektrophorese(PAGE) im 4–20%-Gel und auch im ELISA gegen einen Positivstandard-Patientenserumpool im Vergleich zu einem Negativserumpool analysiert und seine Proteinkonzentration colorimetrisch (nach Lown) bestimmt.
Das Präparat wird zusammen mit komplettem Freund'schem Öl-Adjuvans in einer Dosis pro Tier von etwa 0,5mg Protein (0,5 ml + 0,6 ml Adjuvans) an 6 Kaninchen subkutan appliziert. Nach ca 4 Wochen erfolgt die erste Boosterung i.m. unter Verwendung von inkomplettem Freund'schen Adjuvans. Eine weitere Boosterung mit Aluminiumhydroxid als Adjuvans und mit BK-RiV-Präparat (1) folgt ca 14 Tage später.
Anschließend folgt dann eine Boosterung mit BK-RiV-Präparat nach Abbau der ca 50 nm-Partikeln (durch Zugabe von Natriumdodecylsulfat zum BK-RiV-Partikelpräparat in einer End-Konzentration von 0,1% und Inkubation für 5 min bei 90°C). Nach einer weiteren Applikation von BK-RiV-Untereinheiten ohne Adjuvans wird 10 Tage danach Blut zur Serumgewinnung abgenommen und nach einer „Erhaltungsboosterung" die Tiere entblutet.
Zur Verlaufskontrolle erfolgen Blutabnahmen vor der Erstimmunisierung und nach jeder Boosterung. Dazu werden die gewonnenen Antiseren einzeln im ELISA gegen das BK-RiV-Partikelpräparat (1) titriert. Es erfolgt ebenfalls eine Analyse im Immunoblot mit BK-RiV-Partikel-Präparat (1).
Vom BK-RiV-spezifischen Antiserumgemisch aller gut reagierenden Kaninchenseren werden die BK-RiV-spezifischen Antikörper über Affinitätschromatographie mittels HiTrap NHS-aktivierter HP-Säule (Amersham Bioscience, Freiburg, Germany) mit BK-RiV-Partikelpräparat (1) und dem gleichen Präparat nach Degradation der BK-RiV-Partikel (1:1) als Liganden nach Herstellerinstruktion gereinigt.
Anschließend wird das isolierten BK-RiV-spezifischen Antikörpergemisch (AKG) selbst an eine Hi Trap NHS-aktivierte HP-Säule gebunden.
b) Gewinnung eines BK-RiV-spezifischen Präparates (2)
Eine Reinigung des Ausgangsmaterials (Zellen und Zellkulturüberstand nach der Stressphase und nach Zelldestruktion und Klärschritt) erfolgt über Affinitätschromatograpie mit dieser Säule nach Instruktion des Herstellers.
Die Chromatographie-Säule mit gebundenen BK-RiV-spezifischen Antikörpern (AKG) (oder Magnetobeads mit gebundenen BK-RiV-Antikörpern (AKG)) kann mehrmals für die Reinigung und Isolierung von BK-RiV-Komponenten (2) eingesetzt werden.
Außerdem ist die unter a) erhaltene BK-RiV-Antikörpermenge (AKG) ausreichend, um wiederholt Affinitätsseparationen von BK-RiV-Komponenten (2) direkt aus einer geernteten Zellkultur nach Zelldestruktion und Klärung durchführen zu können und dabei BK-RiV-Komponentenpräparat (2) in hochreiner Form zu erhalten.
Das in einem Reinigungsschritt – die Affinitätschromatographie mit BK-RiV-spezifischen Antikörpern (AKG) – erhaltene BK-RiV-spezifische Präparat wird mittels Diafiltration in gepufferte Kochsalzlösung (oder einen anderen geeigneten Puffer) überführt und gleichzeitig auf eine definierte Gesamtproteinkonzentration (vorzugsweise 200 μg/ml (100 bis 1000 μg/ml) ) eingestellt.
Das so erhaltene BK-RiV-Präparat (2) kann steril ohne Aktivitätsverlust für einige Wochen bei 4°C oder eingefroren bei –20°C, vorzugsweise bei –40 bis –80°C für etwa 4 Jahre gelagert werden. Das Präparat ist vorzugsweise in für Arzneimittel üblicher Weise zu lyophilisieren und kann dann bei 4–7°C für etwa 4 Jahre aufbewahrt werden.
Die Reinheits- und Unschädlichkeitsprüfungen erfolgen nach den vorgeschriebenen Methoden der Europäischen Pharmakopoe bzw. des DAB 10. Geprüft wird auf Sterilität gemäß Europäischer Pharmakopoe und Proteingehalt (nach Lowry), es erfolgt eine Analyse (qualitativ und quantitativ) mittels Polyakrylamidgelelektrophorese unter denaturierenden Bedingungen, vorzugsweise im 4–20%-Gradientengel, Aufnahme des UV-Spektrums, ELISA (Antigentitration mit Standardantiseren und Vergleich mit einem Standardantigen.
Unschädlichkeit:
Prüfung auf Pyrogenfreiheit gemäß Europäischer Pharmakopöe/DAB 10;
Prüfung auf akute Toxizität gemäß Europäischer Pharmakopöe/DAB 10;
Prüfung auf Teratogenität gemäß Europäischer Pharmakopöe/DAB 10.
Eine typische Bk-RiV-spezifische Komponenten enthaltende Präparation (2) ist steril, pyrogenfrei, nicht toxisch und nicht teratogen. Sie enthält an Gesamtprotein etwa 200 μg/ml (100 bis 600 μg/ml je nach vorgesehenem Dosisvolumen) und die spezifische Aktivität im ELISA liegt bei etwa 120 bis 180 U/mg, bezogen auf den oben genannten internen Standard.
Beispiel 2
Während die ersten Schritte wie in Beispiel 1 erfolgen, werden die Antikörper vom Typ IgG aus dem Anti-BK-RiV-Serum mittels HiTrap Protein G HP Column, (Amersham Bioscience, Freiburg) nach Herstellerinstruktion gereinigt. Die weiteren Schritte sind wieder wie in Beispiel 1.
Beispiel 3
Vom BK-RiV-spezifischen Antiserumgemisch aller gut reagierenden Kaninchenseren werden die BK-RiV-spezifischen Antikörper (AKG) über Affinitätschromatographie nicht wie in Beispiel 1 oder 2 gereinigt, sondern mittels CNBr-aktivierter Sepharose 4B gemäß bekannten Protokollen (u.a. Kemeny, D.M., 1994, ELISA: Anwendung des Enzyme Linked Immunosorbent Assay im biologisch/medizinischen Labor, G.-Fischer Verlag, Stuttgart, Jena, New York.)
Beispiel 4
Die aus dem Anti-BK-RiV-Serum gereinigten Antikörper (AKG) werden an CNBr-aktivierte Sepharose 4 Fast Flow anstatt, wie in Beispiel 1 angegeben, an eine HiTrap NHS-aktivierte HP-Säule gebunden.
Beispiel 5
Anstelle von Affinitätschromatographie wird eine Affinitätsseparation (affinity filtration) mit magnetischen Partikeln und Separator mit den in Beispiel 1 genannten Antigenen und Antikörpern nach bekannten Protokollen durchgeführt.

Claims

Verfahren zur Herstellung von BK-RiV-spezifische Komponenten enthaltenden Präparaten (2), die die BK-RiV-spezifischen Komponenten in hochgereinigter Form und beliebiger Größe aufweisen, aus primären, begrenzt oder unbegrenzt wachsenden Zellkulturen von Vertebraten, dadurch gekennzeichnet, dass a. Zellen oder Zellkulturen einem Stressprozess unterzogen werden oder bereits gestresste Zellen oder Zellkulturen eingesetzt werden, b. diese mit einem speziellen polyklonalen BK-RiV-spezifischen Antikörpergemisch (AKG) in Kontakt gebracht werden und c. die BK-RiV-spezifischen Komponenten (2) durch Affinitätsseparation mittels Antikörpergemisch (AKG) aus den gestressten und aufgeschlossenen Zellen/Zellkulturen isoliert, gereinigt und konzentriert werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen oder Zellkulturen samt Überstand eingesetzt werden, nachdem in einem Erhaltungsmedium ohne Serum oder durch Änderung physikalischer, chemischer oder anderer biochemischer Parameter die Zellen zur Produktion von BK-RiV-spezifischen Komponenten stimuliert und einem Zellaufschluss sowie einem Klärschritt zur Abtrennung verbliebener gröberer Zelltrümmer unterzogen wurden.
Verfahren zur Herstellung eines speziellen polyklonalen BK-RiV-spezifischen Antikörpergemisches (AKG) durch Immunisierung von Vertebraten als Wirtsorganismus mit mindestens einem nach an sich bekannten Verfahren hergestellten BK-RiV-Partikelpräparat (1) wobei nachfolgend dem Wirtsorganismus ein Immunisierungcocktail verabreicht wird, der das BK-RiV-Präparat (1) in Form abgebauter Untereinheiten umfasst, die Immunisierung zum Erreichen eines Booster-Effekts ggf. mehrmals wiederholt wird, und abschließend das gebildete BK-RiV-spezifische Antikörpergemisch (AKG) isoliert und gereinigt wird.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Immunisierung sowohl mit dem BK-RiV-Partikel-Präparat (1) als auch mit den Untereinheiten des BK-RiV-Partikel-Präparates wiederholt wird.
Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Immunisierung mit dem BK-RiV-Partikelpräparat (1) in komplettem Freund'schem Öl-Adjuvans erfolgt, eine erste Boosterung nach einer ca. 4-wöchigen Latenzzeit mittels BK-RiV-Partikelpräparat (1) und inkomplettem Freund'schem Adjuvans durchgeführt wird und anschließend eine zweite Boosterung nach einer weiteren ca. 14-tägigen Latenzzeit mittels Aluminiumhydroxid und dem BK-RiV-Präparat (1) erfolgt, eine weitere Boosterung mit BK-RiV-Partikel-Untereinheiten, gewonnen durch Zugabe von Natriumdodecylsulfat zum BK-RiV-Partikelpräparat, durchgeführt wird und die Blutentnahme und Isolierung des speziellen BK-RiV-Antikörpergemisches (AKG) dann nach einer anschließenden weiteren Inkubationszeit von ca. 10 Tagen stattfindet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Reinigung des Antikörpergemischs (AKG) durch Affinitätsseparation mit einem Gemisch aus BK-RiV-Partikelpräparat (1) und BK-RiV-Partikeluntereinheiten als Liganden nach an sich bekannten Techniken erfolgt.
Verwendung eines gereinigten speziellen polyklonalen BK-RiV-spezifischen Antikörpergemisches (AKG) gemäß einem der Ansprüche 3 bis 6 zur Affinitätsseparation von BK-RiV-spezifischen Komponenten aus Zellen und Zellkulturüberstand.
Verwendung eines Präparates, das BK-RiV-spezifische Komponenten in hochgereinigter Form und beliebiger Größe enthält, nach einem der Ansprüche 1 bis 2 in der Human- und Veterinärmedizin zur Diagnose, Therapie, Metaphylaxe und Prophylaxe, zur Prüfung und Normalisierung des „Allgemein zellulär-sekretorischen Abwehrsystems" (AZSA) und der mit diesem kausal verknüpften Körperzustände, vorzugsweise zur Therapie von chronischen Virusinfektionen inklusive virusassoziierten und nicht virusassoziierten Krebserkrankungen.
Verwendung eines Präparates, das BK-RiV-spezifische Komponenten in hochgereinigter Form und beliebiger Größe enthält, nach einem der Ansprüche 1 bis 2 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Human- und Veterinärmedizin zur Diagnose, Therapie, Metaphylaxe und Prophylaxe, zur Prüfung und Normalisierung des „Allgemein zellulär-sekretorischen Abwehrsystems" (AZSA) und der mit diesem kausal verknüpften Körperzustände, vorzugsweise zur Therapie von chronischen Virusinfektionen inklusive virusassoziierten und nicht virusassoziierten Krebserkrankungen.