ES2622562T3 - Vacuna de péptido CH3 de IgE - Google Patents

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David Cameron Pryde
Lee Richard Roberts
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Abstract

Una composición que comprende dos inmunógenos en la que: - el primer inmunógeno consiste en un inmunógeno que comprende al menos un péptido de IgE antigénico unido a un vehículo inmunogénico, en el que dicho péptido de IgE antigénico consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID N.ºs: 311, 312, 313, 314, 326, 327, 328, 340, 341 y 353 y - el segundo inmunógeno consiste en un inmunógeno que comprende al menos un péptido de IgE antigénico unido a un vehículo inmunogénico, en el que dicho péptido de IgE antigénico consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID N.ºs: 220, 221, 222, 233, 234, 235, 245, 246 y 247.

Description

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DESCRIPCION
Vacuna de peptido CH3 de IgE Campo de la invencion
La presente invencion se refiere al suministro de inmunogenos novedosos que comprenden un peptido de IgE antigenico unido a un veldculo inmunogenico para la prevencion, tratamiento o alivio de trastornos mediados por IgE. La invencion se refiere ademas a procedimientos de produccion de estos medicamentos, composiciones inmunogenicas y composicion farmaceutica de los mismos y su uso en medicina.
Antecedentes
Durante las ultimas decadas, las enfermedades alergicas han aumentado hasta proporciones casi epidemicas y las estimaciones sugieren que el 20-30 % de la poblacion total en muchos pafses occidentales esta afectada. El papel clave desempenado por la IgE en el inicio de las respuestas alergicas esta bien documentado. Tras la liberacion de linfocitos B, la IgE se une al receptor de IgE de alta afinidad (FceRl) presente en mastocitos y basofilos. La reticulacion posterior de moleculas de IgE adyacentes en estas celulas por alergenos espedficos da como resultado despues su activacion, conduciendo a la liberacion de varios mediadores proinflamatorios (por ejemplo, histamina, leucotrienos, prostaglandinas), asf como de citocinas y quimiocinas clave. Por consiguiente, las respuestas locales agudas estan seguidas por reclutamiento y activacion de otras celulas inflamatorias (por ejemplo, eosinofilos, linfocitos T) amplificando de este modo la cascada alergica. Las celulas dendnticas, por ejemplo, las presentes en sitios de inflamacion alergica (por ejemplo el pulmon), tambien pueden expresar FceRl y pueden usar este receptor para captar selectiva y eficazmente los alergenos presentes en inmunocomplejos con IgE y procesar estos alergenos selectivamente para su presentacion a celulas T espedficas de alergeno, proporcionando de este modo un mecanismo para la activacion persistente de celulas T y respuestas inflamatorias patologicas.
La mayona de los regfmenes de tratamiento actuales tienen como objetivo aliviar los smtomas mas que tratar la causa de la enfermedad y se basan principalmente en el uso de antihistammicos, antileucotrienos, cromoglicatos, beta-agonistas y en compuestos antiinflamatorios generales tales como corticosteroides. Aunque algunos de los pacientes afectados tienen su enfermedad relativamente bien controlada con estos farmacos, su frecuencia de administracion (con frecuencia diariamente o incluso varias veces al dfa) conduce con frecuencia a una escasa conformidad del paciente y al posterior empeoramiento de la enfermedad. Ademas, en algunos casos tales como asma grave y dermatitis atopica grave, las terapias existentes son insuficientes para controlar la enfermedad.
Muy recientemente, un anticuerpo monoclonal (omalizumab, tambien denominado E25, comercializado con el nombre comercial Xolair®; Presta y col. J Immunol, 1 sep 1993;151 (5): 2623-32) obtuvo la autorizacion de varias agencias alrededor del mundo, principalmente para el tratamiento del asma grave y de la rinitis. A pesar de que muestra eficacia frente al asma grave, este anticuerpo todavfa tiene algunos inconvenientes. En primer lugar es un anticuerpo monoclonal murino humanizado y como tal, no excluye totalmente reacciones inmunologicas en pacientes humanos, dando origen posiblemente por lo tanto a algunas preocupaciones de seguridad. En segundo lugar, la dosis de omalizumab usada en el tratamiento del asma grave se basa tanto en el peso corporal como en el nivel de IgE libre circulante. Se recomienda que los pacientes cuyo peso corporal e IgE libre circulante se desvfan de un intervalo especificado no usen este tratamiento. Los pacientes que pueden tratarse pueden requerir recibir hasta tres inyecciones subcutaneas una vez cada dos semanas. Esto afecta mucho a los costes de tratamiento (que se estima que oscilan entre 15.000-44.000 US$ anualmente por paciente), asf como sobre la calidad de vida de los pacientes, haciendo diffcil usarlo como una estrategia general para el tratamiento de alergias.
Para superar los problemas del alto coste y las administraciones frecuentes, una alternativa es hacer funcionar el propio sistema inmune para producir los anticuerpos terapeuticos por vacunacion.
En el transcurso de sus investigaciones, los trabajadores anteriores en el campo de la alergia han encontrado varias consideraciones y problemas, que deben tenerse en cuenta cuando se disenan nuevas terapias antialergia. Uno de los problemas mas peligrosos gira en torno a la implicacion de la reticulacion de IgE en la senal de liberacion de histamina. El caso mas frecuente es que la generacion de anticuerpos anti-IgE durante la vacunacion activa es capaz de desencadenar la liberacion de histamina por sf misma, mediante la reticulacion de complejos de IgE- receptor vecinos en ausencia de alergeno. Este fenomeno se denomina anafilactogenicidad. De hecho, muchos anticuerpos monoclonales anti-IgE disponibles en el mercado que se usan normalmente para ensayos de deteccion de IgE son anafilactogenicos y por consiguiente inutiles y potencialmente peligrosos si se administran a un paciente. Por lo tanto, para ser seguros y eficaces, los anticuerpos administrados de forma pasiva o inducidos por vacuna, deben unirse en una region de la IgE que sea capaz de, inhibir las actividades de IgE sin ser anafilacticos por sf mismos.
Se ha resuelto la estructura de los dominios constantes CH3-CH4 de la IgE humana que interaccionan con la subunidad alfa del receptor de alta afinidad de IgE FceRI (Wurzburg BA y col. (2000) Immunity 13 (3) 375-85; Garman SC y col., (2000) Nature 20; 406 (6793): 259-66). El trabajo anterior tambien ha identificado varios peptidos de IgE o peptidos derivados o mimotopos que se consideran utiles para inducir anticuerpos anti-IgE no anafilactogenicos (documentos WO 1993/005810; WO99/67293; WO2004/058799, WO9731948, WO2000/25722, WO05/075504, US2002/0645525, US2004/146504 y US2006/062782; WO00/050461, WO02/34288 y
WO2003/092714; Chen y col. (2008) J. Immunologic. Meth. 333: 10-23; Hellman Expert Rev. Vaccines 7 (2): 193208 (2008)). Dichos dominios o peptidos de IgE estan habitualmente unidos a vehfculos para aumentar su inmunogenicidad para romper la autotolerancia a IgE en un individuo.
Por lo tanto es deseable proporcionar una composicion, tal como un peptido de IgE antigenico o la combinacion de varios de los mismos acoplados a un vehfculo inmunogenico y opcionalmente administrado con uno o mas adyuvantes, capaz de inducir anticuerpos anti-IgE potentes no anafilactogenicos en un individuo capaces de reducir
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significativamente los niveles de IgE libre circulante. ^picamente una potencia aumentada dana como resultado los siguientes beneficios: sedan necesarias menores dosis para conseguir beneficios clmicos, sena necesario un menor volumen de inyeccion por ejemplo para administracion subcutanea o intramuscular (en comparacion con terapias de anticuerpos monoclonales, por ejemplo), menor coste de tratamiento, mayores posibilidades de exito del tratamiento, frecuencia de administracion disminuida en el regimen del tratamiento, proporcionando por lo tanto acceso a tratamiento a una poblacion de pacientes mas amplia, incluyendo pacientes con mayor peso corporal y/o niveles elevados de IgE circulante y mejorando la calidad de vida de los pacientes.
Sumario de la divulgacion
La presente divulgacion se refiere a un inmunogeno que comprende un peptido de IgE antigenico preferentemente unido a un veldculo inmunogenico. Dicho peptido antigenico de IgE comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°: 1 a 430, preferentemente del grupo constituido por las SEC ID N.°: 1 a 153 y 220 a 430, aun mas preferentemente del grupo constituido por las SeC ID N.°: 220 a 430. Dicho peptido de IgE antigenico podna estar modificado con fines de conjugacion, preferentemente mediante la adicion de restos de cistema o lisina y/o la adicion de engarces tales como engarces GC/GGC. En realizaciones preferidas, dicho peptido de IgE antigenico esta limitado conformacionalmente, preferentemente limitado de forma simple. Dicho veldculo inmunogenico es una protema heterologa, preferentemente una partfcula similar a virus (VLP), mas preferentemente una VLP de HBcAg, HBsAg o Qbeta. La divulgacion tambien se refiere a procedimientos para producir dicho peptido de IgE antigenico preferentemente unido a un veldculo inmunogenico.
La divulgacion tambien se refiere a composiciones inmunogenicas que comprenden dicho peptido de IgE antigenico preferentemente unido a un vehfculo inmunogenico, preferentemente a composiciones inmunogenicas, que opcionalmente comprenden un adyuvante preferentemente seleccionado del grupo constituido por alumbre; oligonucleotidos que contienen CpG, preferentemente CpG7909 y CpG24555; y adyuvantes basados en saponina, preferentemente Iscomatrix. Preferentemente, dicho acido nucleico que contiene CpG comprende uno o mas enlaces modificados, preferentemente uno o mas enlaces fosforotioato, aun mas preferentemente todos los enlaces internucleotfdicos del oligonucleotido son enlaces fosforotioato.
Otro aspecto de la divulgacion se refiere a composiciones farmaceuticas que comprenden un peptido de IgE antigenico de acuerdo con la divulgacion o una composicion inmunogenica del mismo, asf como a usos medicos de dichas composiciones.
En particular, la divulgacion se refiere a un peptido de IgE antigenico de acuerdo con la divulgacion, o a una composicion inmunogenica o farmaceutica del mismo, para el uso como medicamento, preferentemente en el tratamiento, alivio o profilaxis de trastornos mediados por IgE. La divulgacion tambien se refiere a procedimientos para inducir una respuesta inmune en un individuo contra IgE propia y a procedimientos para tratar, aliviar o prevenir trastornos mediados por IgE que comprenden administrar una cantidad eficaz de dicho peptido de IgE antigenico o composicion inmunogenica o farmaceutica del mismo.
Breve descripcion de los dibujos
Figura 1: presentacion estructural de la interaccion entre la region CH3-CH4 de IgE humana con su receptor de alta afinidad FceRI. Se presentan 4 bucles (azul, morado, naranja y amarillo) que se corresponden con los 4 peptidos de las SEC ID N.°: 165, 312, 1 y 220 respectivamente.
Figura 2. Representaciones graficas de formatos de peptidos para inducir respuestas de anticuerpos contra epitopes definidos estructuralmente de IgE humana.
Descripcion detallada de la invencion
Definiciones y tecnicas generales
A menos que se defina otra cosa en este documento, los terminos cientfficos y tecnicos usados en relacion con la presente invencion tendran los significados que entienden comunmente los especialistas en la tecnica. Generalmente, la nomenclatura usada en relacion con y las tecnicas de cultivo de celulas y tejidos, biologfa molecular, inmunologfa, microbiologfa, genetica y qrnmica de protemas y acidos nucleicos e hibridacion descritas en este documento, es la bien conocida y comunmente usada en la tecnica.
Los procedimientos y tecnicas de la presente invencion se realizan generalmente de acuerdo con procedimientos convencionales bien conocidos en la tecnica y como se describe en diversas referencias generales y mas espedficas que se citan y se analizan por toda la presente memoria descriptiva a menos que se indique otra cosa. Vease, por ejemplo, Sambrook J. y Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2000); Ausubel y col., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002); Harlow y Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1998); y Coligan y col., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003). Las reacciones enzimaticas y tecnicas de purificacion se realizan de acuerdo con las especificaciones del fabricante, como se realiza comunmente en la tecnica o como se describe en este documento.
La nomenclatura usada en relacion con y los procedimientos y tecnicas de laboratorio de, qrnmica analftica, qrnmica organica sintetica y qrnmica medicinal y farmaceutica descritos en este documento son los bien conocidos y usados comunmente en la tecnica.
Por toda esta memoria descriptiva y reivindicaciones, la palabra “comprender” o variaciones tales como “comprende” o “que comprende” se entendera que implican la inclusion de un numero entero indicado o grupo de numeros enteros indicados pero no la exclusion de cualquier otro numero entero o grupo de numeros enteros. Los terminos
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“que comprende”, “constituido por” y “constituido esencialmente por” pretenden usarse indistintamente. Cuando los terminos “un”, “una” o “uno” se usan en esta divulgacion, significan “al menos un” o “uno o mas” a menos que se indique otra cosa. Ademas, a menos que el contexto requiera otra cosa, los terminos en singular incluiran pluralidades y los terminos en plural incluiran el singular a menos que el contexto dicte claramente otra cosa.
Definiciones generales:
El termino “peptido” o “polipeptido” se refiere a un polfmero de aminoacidos independientemente de la longitud del polfmero; por lo tanto, los peptidos, oligopeptidos y protemas se incluyen en la definicion de polipeptido. Este termino tampoco especifica o excluye modificaciones post-expresion de polipeptidos, por ejemplo, polipeptidos que incluyen la union covalente de grupos glucosilo, grupos acetilo, grupos fosfato, grupos lipfdicos y similares se incluyen expresamente en el termino polipeptido. Tambien se incluyen en la definicion polipeptidos que contienen uno o mas analogos de un aminoacido (incluyendo, por ejemplo, aminoacidos de origen no natural, aminoacidos que solo aparecen de forma natural en un sistema biologico no relacionado, aminoacidos modificados de sistemas de mairnferos, etc.), polipeptidos con enlaces sustituidos, asf como otras modificaciones conocidas en la tecnica, tanto de origen natural como de origen no natural.
Las expresiones "protema aislada", “polipeptido aislado” o “peptido aislado” son de una protema, polipeptido o peptido que en virtud de su origen o fuente de obtencion (1) no esta asociada con los componentes con los que se asocia de forma natural que la acompanan en su estado nativo, (2) esta libre de otras protemas de la misma especie, (3) se expresa por una celula de una especie diferente o (4) no se da en la naturaleza. Por lo tanto, un peptido que se sintetiza qmmicamente o se sintetiza en un sistema celular diferente de la celula de la que procede de forma natural estara “aislado” de sus componentes con los que se asocia de forma natural. Una protema tambien puede liberarse sustancialmente de componentes asociados de forma natural por aislamiento, usando procedimientos de purificacion de protemas bien conocidos en la tecnica.
Como se usa en este documento, cuando se usa el termino “purificado” en relacion con una molecula (por ejemplo, un peptido, polipeptido o protema) significa que la concentracion de la molecula que se esta purificando se ha aumentado respecto a moleculas asociadas con ella en su entorno natural, o en el entorno en el que se ha producido, encontrado o sintetizado. Las moleculas asociadas de forma natural incluyen protemas, acidos nucleicos, ifpidos y azucares pero generalmente no incluyen agua, tampones ni reactivos anadidos para mantener la integridad o facilitar la purificacion de la molecula que se esta purificando.
En algunas realizaciones, un compuesto es sustancialmente puro o esta sustancialmente purificado cuando esta al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 % o al menos el 60 % en peso libre de moleculas organicas con las que se asocia de forma natural o con las que se asocia durante la fabricacion. En algunas realizaciones, la preparacion es de al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o al menos el 99 % en peso del compuesto de interes respecto a sus contaminantes.
Un compuesto sustancialmente puro o purificado puede obtenerse, por ejemplo, por extraccion a partir de una fuente natural (por ejemplo, bacterias), por smtesis qmmica de un compuesto, o por una combinacion de purificacion y modificacion qmmica. Un compuesto sustancialmente puro o purificado tambien puede obtenerse, por ejemplo, por enriquecimiento de una muestra que tiene un compuesto que se une a un anticuerpo de interes. La pureza puede medirse por cualquier procedimiento apropiado, por ejemplo, cromatograffa, espectroscopfa de masas, analisis de cromatograffa lfquida de alto rendimiento, etc.
El termino “heterologo”, como se usa en este documento en el contexto de un peptido o polipeptido de IgE, donde una protema de fusion de polipeptido de IgE comprende un peptido o polipeptido de IgE y un polipeptido “heterologo”, se refiere a un polipeptido que es distinto de un peptido o polipeptido de IgE, por ejemplo, un polipeptido que no se asocia normalmente en la naturaleza con un peptido o polipeptido de IgE. Por ejemplo, un polipeptido heterologo no presenta una identidad de secuencia de aminoacidos significativa con el peptido o polipeptido de IgE, por ejemplo, el polipeptido heterologo tiene una identidad de secuencia de aminoacidos menor de aproximadamente el 50 %, menor de aproximadamente el 40 %, menor de aproximadamente el 30 % o menor de aproximadamente el 20 % con el peptido o polipeptido de IgE.
Como se usa en este documento, la expresion “trastorno mediado por IgE” o “trastorno relacionado con IgE“ se refiere a una afeccion o enfermedad que se caracteriza por la superproduccion y/o hipersensibilidad a la inmunoglobulina IgE. En concreto se interpretana que incluye afecciones asociadas con un hipersensibilidad anafilactica y alergias atopicas, incluyendo, por ejemplo: asma, asma alergica, rinitis y conjuntivitis alergica (fiebre del heno), eccema, urticaria, dermatitis atopica y alergias alimentarias incluyendo alergia a cacahuetes. La afeccion fisiologica grave de choque anafilactico causada, por ejemplo, por picaduras de abeja, mordeduras de serpiente, alimentos o medicacion, tambien se incluye en el alcance de este termino. Otros trastornos mediados por IgE incluyen anafilaxia, dermatitis de contacto, gastroenteropatfa alergica, aspergilosis pulmonar alergica, purpura alergica, eccema, smdrome de hiper IgE (de Job), hipersensibilidad anafilactica, mieloma de IgE, enfermedad inflamatoria del intestino (por ejemplo, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, colitis indeterminada y colitis infecciosa), urticaria y psoriasis.
Peptido de IgE antigenico de la invencion
La presente invencion se refiere a peptidos de IgE y peptidos derivados de los mismos que se han identificado como porciones del domino CH3 de IgE capaces de formar bucles que participan en la interaccion de la region CH3-CH4 con su receptor de alta afinidad FceRI (consultese la figura 1). Se demostro que dichos peptidos de IgE eran inmunogenicos y no anafilactogenicos.
Dichos peptidos de IgE antigenicos pueden usarse en solitario o en combinacion, preferentemente cuando se conjugan con un vehmulo inmunogenico, para inducir autoanticuerpos anti-IgE en un sujeto para tratar, prevenir o
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mejorar trastornos relacionados con IgE.
En particular, la presente invencion se refiere a un inmunogeno constituido por, constituido esencialmente por o que comprende un peptido de IgE antigenico preferentemente unido a un vetnculo inmunogenico.
En una realizacion, el peptido de IgE antigenico de la divulgacion esta constituido por, esta constituido esencialmente por o comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1 a 430 y variantes funcionalmente activas de las mismas, preferentemente seleccionadas del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1 a 430. En otra realizacion, dicho peptido de IgE antigenico esta constituido por, esta constituido esencialmente por o comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1 a 153 y variantes funcionalmente activas de las mismas, preferentemente seleccionadas del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1 a 153. En otra realizacion, dicho peptido de IgE antigenico esta constituido por, esta constituido esencialmente por o comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 154 a 219 y variantes funcionalmente activas de las mismas, preferentemente seleccionadas del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 154 a 219. En otra realizacion mas, dicho peptido de IgE antigenico esta constituido por, esta constituido esencialmente por o comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 220 a 310 y variantes funcionalmente activas de las mismas, preferentemente seleccionadas del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 220 a 310. En otra realizacion mas, dicho peptido de IgE antigenico esta constituido por, esta constituido esencialmente por o comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 311 a 430 y variantes funcionalmente activas de las mismas, preferentemente seleccionadas del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 311 a 430.
La expresion “peptido de IgE antigenico”, dentro del significado de la presente divulgacion incluye todos los peptidos derivados de CH3 de IgE, preferentemente de especies de mairnferos, mas preferentemente de seres humanos, asf como sus variantes, analogos, ortologos, homologos y derivados y fragmentos de los mismos que presenten una “actividad biologica de peptido de IgE antigenico”. Preferentemente, la expresion “peptido de IgE antigenico” se refiere a peptidos que comprenden, estan constituidos por o estan constituidos esencialmente por una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1 a 430, asf como a sus variantes, homologos y derivados que presentan esencialmente la misma actividad biologica. Mas preferentemente, la expresion “peptido de IgE antigenico” se refiere a peptidos que comprenden, que estan constituidos por o que estan constituidos esencialmente por una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1 a 430, mas preferentemente a peptidos que comprenden, que estan constituidos por o que estan constituidos esencialmente por una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1 a 153 y 220 a 430, aun mas preferentemente, a peptidos que comprenden, que estan constituidos por o que estan constituidos esencialmente por una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 220 a 430.
En una realizacion, el peptido de IgE antigenico de la invencion esta constituido por, o constituido esencialmente por,
una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,
12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42,
43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73,
74,75,76,
77,78,79,80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 00 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 , 95, CD. O) CD CD OO , 99, 100, 101, 102, 103.
104,
105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126,
127,
128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149,
150,
151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172,
173,
174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195,
196,
197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218
219,
220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241,
242,
243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264
265,
266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287
288,
289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310
311,
312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333
334,
335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356
357,
358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379
380,
381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402
403,
404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425
426,
427, 428, 429 y 430
En otra realizacion, el peptido de IgE antigenico de la invencion esta constituido por, o constituido esencialmente por, una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,

72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101,

102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124,

125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147,
148, 149, 150, 151, 152 y 153.
Preferentemente, dicho peptido de IgE antigenico esta constituido por, o constituido esencialmente por, una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las sEc Id N.°s: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 49,

50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84,

85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 118,

119, 120, 121, 122, 123, 126, 127, 128, 129, 130, 133, 134, 135, 136, 139, 140, 141, 144, 145 y 148. Mas
preferentemente, dicho peptido de IgE antigenico esta constituido por, o esta constituido esencialmente por, una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las sEc ID N.°s: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 63,
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64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 99, 100, 101, 102, 103, 109, 110, 111, 112, 118, 119, 120, 126, 127, 133 y 139. Aun mas preferentemente, dicho peptido de IgE antigenico esta constituido por, o esta constituido esencialmente por, una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 63, 64, 65, 66, 67, 76, 77, 78, 79, 88, 89, 90, 99, 100, 101 y 109. Aun mas preferentemente, dicho peptido de IgE antigenico esta constituido por, o esta constituido esencialmente por, una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 18, 19, 20, 21,22, 34, 35, 36, 37, 49, 50, 51, 63, 64 y 76. Aun mas preferentemente, dicho peptido de IgE antigenico esta constituido por, o constituido esencialmente por, una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1, 2, 3, 18, 19 y 34. Lo mas preferentemente, dicho peptido de IgE antigenico esta constituido por, o constituido esencialmente por, una secuencia de aminoacidos de la SEC ID N.°s: 1 o 18.
En otra realizacion, el peptido de IgE antigenico de la divulgacion esta constituido por, o constituido esencialmente por una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC Id N.°s: 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201,202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218 y 219. Preferentemente, dicho peptido de IgE antigenico esta constituido por, o constituido esencialmente por, una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 192, 193, 194, 195, 196, 199, 200, 201, 202, 205, 206, 207, 210, 211, 214 y 217. Mas preferentemente, dicho peptido de IgE antigenico esta constituido por, o constituido esencialmente por, una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 154, 155, 156, 157, 158, 159, 165, 166, 167, 168, 169, 175, 176, 177, 178, 184, 185, 186, 192, 193, 199 y 200. Aun mas preferentemente, dicho peptido de IgE antigenico esta constituido por, o constituido esencialmente por, una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 154, 155, 156, 165, 166 y 175. Lo mas preferentemente, dicho peptido de IgE antigenico esta constituido por, o constituido esencialmente por, una secuencia de aminoacidos de las SEC ID N.°: 154 o 165.
En otra realizacion, el peptido de IgE antigenico de la invencion esta constituido por, o constituido esencialmente por, una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247,
248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270,
271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293,
294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309 y 310. Preferentemente, dicho peptido de IgE antigenico esta constituido por, o constituido esencialmente por, una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 256, 257, 258, 259, 260,
261, 262, 263, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 283, 284, 285, 286, 287, 290, 291,
292, 293, 296, 297, 298, 301, 302 y 305. Mas preferentemente, dicho peptido de IgE antigenico esta constituido por, o constituido esencialmente por, una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 220, 221,222, 223, 224, 225, 226, 227, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 256, 257, 258, 259, 260, 266, 267, 268, 269, 275, 276, 277, 283, 284 y 290. Aun mas preferentemente, dicho peptido de IgE antigenico esta constituido por, o constituido esencialmente por, una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 220, 221, 222, 223, 224, 233, 234, 235, 236, 245, 246, 247, 256, 257 y 266. Aun mas preferentemente, dicho peptido de IgE antigenico esta constituido por, o constituido esencialmente por, una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 220, 221, 222, 233, 234 y 245. Lo mas preferentemente, dicho peptido de IgE antigenico esta constituido por, o constituido esencialmente por, una secuencia de aminoacidos de la SEC ID N.°: 220 o 233.
En otra realizacion mas, el peptido de IgE antigenico de la invencion esta constituido por, o constituido esencialmente por, una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335,

336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358,

359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381,

382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401,402, 403, 404,
405, 406, 407, 408, 409, 410, 411,412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421,422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429 y 430. Preferentemente, dicho peptido de IgE antigenico esta constituido por, o constituido esencialmente por, una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 311, 312, 313, 314, 315,

316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 340, 341, 342,

343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 365, 366, 367, 368, 369,

370, 371, 372, 373, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 395, 396, 397, 398,
399, 400, 403, 404, 405, 406, 407, 410, 411, 412, 413, 416, 417, 418, 421, 422 y 425. Mas preferentemente, dicho
peptido de IgE antigenico esta constituido por, o constituido esencialmente por, una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 376, 377, 378, 379, 380, 386, 387, 388, 389, 395, 396, 397, 403, 404 y 410. Aun mas preferentemente, dicho peptido de IgE antigenico esta constituido por, o constituido esencialmente por, una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 311, 312, 313, 314, 315, 316,
317, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 340, 341, 342, 343, 344, 353, 354, 355, 356, 365, 366, 367, 376, 377 y 386. Aun mas preferentemente, dicho peptido de IgE antigenico esta constituido por, o constituido esencialmente por, una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las sEc ID N.°s: 311, 312, 313, 314, 326, 327, 328, 340, 341 y 353. Aun mas preferentemente, dicho peptido de IgE antigenico esta constituido por, o constituido esencialmente por, una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 311, 312 y 326. Lo mas preferentemente, dicho peptido de IgE antigenico esta constituido por, o constituido esencialmente por, una secuencia de aminoacidos de las SEC ID N.°: 311 o 312.
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La expresion “actividad biologica de peptido de IgE antigenico”, cuando se usa en este documento, se refiere a la capacidad de los peptidos de IgE antigenicos de la divulgacion para inducir autoanticuerpos anti-IgE en un paciente, con un perfil antagonista, siendo dichos autoanticuerpos capaces de disminuir el nivel de IgE libre circulante sin causar ninguna liberacion significativa de mediadores inflamatorios mediada por IgE y siendo al mismo tiempo sustancialmente incapaces de unirse a IgE unida a su receptor de alta afinidad. Sera evidente para el especialista en la tecnica que tecnicas pueden usarse para confirmar si una construccion espedfica se incluye en el alcance de la presente invencion. Dichas tecnicas incluyen, pero sin limitacion, las tecnicas descritas en la seccion de Ejemplos de la presente solicitud y tambien lo siguiente. El supuesto peptido puede ensayarse para determinar la inmunogenicidad de la construccion, en el sentido de que los antisueros generados por el supuesto peptido presenten reaccion cruzada con la molecula de IgE nativa y tambien sean funcionales en el bloqueo de la liberacion de mediadores alergicos a partir de celulas efectoras alergicas. La especificidad de estas respuestas puede confirmarse mediante ensayos funcionales en los que puede cuantificarse la precipitacion de IgE y/o por inhibicion de la desgranulacion de celulas que expresan el receptor de IgE, o mediante experimentos de competicion por bloqueo de la actividad del antisuero con el propio peptido o la IgE nativa y/o anticuerpos monoclonales espedficos que se sabe que se unen al epitope en el interior de la IgE. Tambien son bien conocidos por los especialistas en la tecnica procedimientos para determinar la union a IgE-FcRI.
En una realizacion los peptidos de IgE antigenicos de la presente invencion son de un tamano tal que mimetizan una region seleccionada del dominio completo de IgE en el que se encuentra el epitope nativo. En una realizacion particular, los peptidos de IgE antigenicos de la invencion, tienen una longitud de menos de 100 aminoacidos, preferentemente mas corta de 75 aminoacidos, mas preferentemente menor de 50 aminoacidos, aun mas preferentemente menor de 40 aminoacidos. Los peptidos de IgE antigenicos de la divulgacion tienen tfpicamente una longitud de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 aminoacidos, preferentemente de 4 a 20 aminoacidos, por ejemplo de 6 a 12 o de 6 a 9 aminoacidos.
Se proporcionan ejemplos espedficos de peptidos de IgE antigenicos de la divulgacion en la lista de secuencias e incluyen peptidos que vanan de 4 a 20 aminoacidos de longitud.
Los peptidos antigenicos de la divulgacion incluyen una secuencia de aminoacidos de una porcion de CH3 de IgE humana, correspondiendose dicha porcion derivada de CH3 humana con la secuencia de aminoacidos de la IgE de origen natural o correspondiendose con una IgE variante, es decir la secuencia de aminoacidos de la IgE de origen natural en la que se han sustituido, anadido o delecionado un pequeno numero de aminoacidos pero que conserva esencialmente las mismas propiedades inmunologicas. Ademas, dicha porcion de CH3 de IgE derivada puede modificarse adicionalmente mediante aminoacidos, especialmente en los extremos N- y C-terminales para permitir que el peptido de IgE antigenico se limite conformacionalmente y/o para permitir el acoplamiento del peptido de IgE antigenico con un vehmulo inmunogenico despues de que se haya realizado una qrnmica apropiada.
Los peptidos de IgE antigenicos de la presente divulgacion incluyen peptidos variantes funcionalmente activos derivados de la secuencia de aminoacidos de CH3 de IgE en la que se han delecionado, insertado o sustituido aminoacidos sin devaluar esencialmente las propiedades inmunologicas de la misma, es decir dichos peptidos variantes funcionalmente activos conservan una actividad biologica de peptido de IgE antigenico sustancial. Tfpicamente, dichos peptidos funcionalmente variantes tienen una secuencia de aminoacidos homologa, preferentemente altamente homologa, con una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1 a 430, mas preferentemente con una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°: 1 a 153 y 220 a 430, aun mas preferentemente con una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 220 a 430.
En una realizacion, dichos peptidos variantes funcionalmente activos presentan una identidad de al menos el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % con una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1 a 430 mas preferentemente con una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1 a 153 y 220 a 430, aun mas preferentemente con una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 220 a 430.
La similitud de secuencia para polipeptidos, que tambien se denomina identidad de secuencia se mide tfpicamente usando un programa informatico de analisis de secuencia. El programa informatico de analisis de protema empareja secuencias similares usando medidas de similitud asignadas a diversas sustituciones, deleciones y otras modificaciones, incluyendo sustituciones de aminoacidos conservativas. Por ejemplo, el GCG contiene programas tales como "Gap" y "Bestfit" que pueden usarse con los parametros por defecto para determinar la homologfa de secuencia o la identidad de secuencia entre polipeptidos estrechamente relacionados, tales como polipeptidos homologos de diferentes especies de organismos o entre una protema de tipo silvestre y una mutema de la misma. Vease, por ejemplo, GCG Version 6.1. Las secuencias polipeptfdicas tambien pueden compararse usando FASTA usando los parametros por defecto o recomendados, un programa en el GCG Version 6.1. El FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineamientos y porcentaje de identidad de secuencia de las regiones del mejor solapamiento entre las secuencias de consulta y de busqueda (Pearson, Methods Enzymol. 183: 63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol, 132: 185-219 (2000)). Un algoritmo alternativo cuando se compara una secuencia de la divulgacion con una base de datos que contiene un gran numero de secuencias de diferentes organismos es el programa informatico BLAST, especialmente blastp o tblastn, usando los parametros por defecto. Veanse, por ejemplo, Altschul y col., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990); Altschul y col., Nucleic Acids Res. 25: 3389-402 (1997).
Las variantes funcionalmente activas comprenden variantes funcionalmente activas de origen natural tales como variantes alelicas y variantes de especies y variantes funcionalmente activas de origen no natural que pueden producirse, por ejemplo, mediante tecnicas de mutagenesis o por smtesis directa.
Una variante funcionalmente activa difiere en aproximadamente, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 restos aminoaddicos de cualquiera de los peptidos mostrados en las SEC ID N.°s: 1 a 430, mas preferentemente en las SEC ID N.°s: 1 a 153 y 220 a 430, aun mas preferentemente en las SEC ID N.°s: 220 a 430 y aun conserva una
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actividad biologica de IgE antigenica. Cuando esta comparacion requiere alineamiento las secuencias se alinean para una homologfa maxima. El lugar de variacion puede darse en cualquier sitio del peptido, siempre que la actividad biologica sea sustancialmente similar a un peptido mostrado en las SEC ID N.°s: 1 a 430, mas preferentemente sustancialmente similar a un peptido mostrado en las SEC ID N.°s: 1 a 153 y 220 a 430, aun mas preferentemente sustancialmente similar a un peptido mostrado en las SEC ID N.°s: 220 a 430.
Se proporcionan orientaciones en relacion con como realizar sustituciones de aminoacidos fenotfpicamente silentes en Bowie y col., Science, 247: 1306-1310 (1990), que muestra que existen dos estrategias principales para estudiar la tolerancia de una secuencia de aminoacidos al cambio.
La primera estrategia aprovecha la tolerancia de sustituciones de aminoacidos por seleccion natural durante el procedimiento de la evolucion. Por comparacion de las secuencias de aminoacidos en diferentes especies, pueden identificarse las posiciones aminoaddicas que se han conservado entre especies. Estos aminoacidos conservados son probablemente importantes para la funcion de la protema. Por el contrario, las posiciones aminoaddicas en las que se han tolerado sustituciones por seleccion natural indican posiciones que no son cnticas para la funcion de la protema. Por lo tanto, las posiciones que toleran la sustitucion de aminoacidos pueden modificarse al tiempo que se mantiene aun una actividad inmunogenica espedfica del peptido modificado.
La segunda estrategia usa ingeniena genetica para introducir cambios de aminoacidos en posiciones espedficas de un gen clonado para identificar regiones cnticas para la funcion de la protema. Por ejemplo, puede usarse mutagenesis dirigida o mutagenesis mediante alanina (Cunningham y col., Science, 244: 1081-1085 (1989)). Los peptidos variantes resultantes pueden ensayarse despues para determinar la actividad biologica de IgE antigenica espedfica.
De acuerdo con Bowie y col., estas dos estrategias han puesto de manifiesto que las protemas son sorprendentemente tolerantes a sustituciones de aminoacidos. Los autores indican ademas que cambios de aminoacidos es posible que se permitan en ciertas posiciones aminoaddicas en la protema. Por ejemplo, los restos aminoaddicos mas enterrados o interiores (en el interior de la estructura terciaria de la protema) requieren cadenas laterales no polares, mientras que generalmente estan conservadas escasas caractensticas de cadenas laterales de superficie o exteriores.
Los especialistas en la tecnica conocen bien procedimientos para introducir una mutacion en aminoacidos de una protema. Veanse, por ejemplo, Ausubel (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1994); T. Maniatis, E. F. Fritsch y J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)).
Tambien pueden introducirse mutaciones usando kits disponibles en el mercado tales como "QuikChangeTM Site- Directed Mutagenesis Kit" (Stratagene) o directamente mediante smtesis peptfdica. La generacion de una variante funcionalmente activa para un peptido de IgE antigenico por sustitucion de un aminoacido que no influya significativamente en la funcion de dicho peptido de IgE antigenico puede efectuarse por un especialista en la tecnica.
Un tipo de sustitucion aminoaddica que puede realizarse en uno de los peptidos de acuerdo con la invencion es una sustitucion de aminoacidos conservativa. Una “sustitucion de aminoacidos conservativa” es una en la que un resto aminoaddico se sustituye por otro resto aminoaddico que tiene un grupo R de cadena lateral) con propiedades qrnmicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitucion de aminoacidos conservativa no cambiara sustancialmente las propiedades funcionales de una protema. En casos en los que dos o mas secuencias de aminoacidos difieren entre sf por sustituciones conservativas, el porcentaje de identidad de secuencia o grado de similitud puede ajustarse al alza para corregir por la naturaleza conservativa de la sustitucion. Los especialistas en la tecnica conocen bien medios para realizar este ajuste. Vease, por ejemplo, Pearson, Methods Mol. Biol. 243: 307-31 (1994).
Los ejemplos de grupos de aminoacidos que tienen cadenas laterales con propiedades qrnmicas similares incluyen 1) cadenas laterales alifaticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadenas laterales hidroxilo-alifaticas: serina y treonina; 3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; 4) cadenas laterales aromaticas: fenilalanina, tirosina y triptofano; 5) cadenas laterales basicas: lisina, arginina e histidina; 6) cadenas laterales acidas: acido aspartico y acido glutamico; y 7) cadenas laterales que contienen azufre: cistema y metionina. Los grupos de sustitucion de aminoacidos conservativa preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina- tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina. Como alternativa, una sustitucion conservativa es cualquier cambio que tenga un valor positivo en la matriz de probabilidad logantmica PAM250 descrita en Gonnet y col., Science 256: 1443-45 (1992). Una sustitucion “moderadamente conservativa” es cualquier cambio que tiene un valor no negativo en la matriz de probabilidad logantmica PAM250.
Un peptido variante funcionalmente activo tambien puede aislarse usando una tecnica de hibridacion. En resumen, se usa ADN que tiene una alta homologfa con la totalidad o parte de una secuencia de acido nucleico que codifica el peptido, polipeptido o protema de interes, por ejemplo, las SEC ID N.°s: 1 a 430, para preparar un peptido funcionalmente activo. Por lo tanto, un peptido de IgE antigenico de la divulgacion tambien incluye peptidos que son funcionalmente equivalentes a uno o mas de los peptidos de las SEC ID N.°s: 1 a 430 y que estan codificados por una molecula de acido nucleico que hibrida con un acido nucleico que codifica una cualquiera de las SEC ID N.°s: 1 a 430 o un complementario del mismo. Un especialista en la tecnica puede determinar facilmente secuencias de acido nucleico que codifican peptidos de la divulgacion usando tablas de codones facilmente disponibles. Como tales, estas secuencias de acido nucleico no se presentan en este documento.
La rigurosidad de hibridacion para un acido nucleico que codifica un peptido, polipeptido o protema que es una variante funcionalmente activa es, por ejemplo, formamida al 10 %, SSPE 5x, solucion de Denhart 1x y ADN de esperma de salmon 1x (condiciones de baja rigurosidad). Son condiciones mas preferibles formamida al 25 %, SSPE
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5x, solucion de Denhart 1x y ADN de esperma de salmon 1x (condiciones de rigurosidad moderada) y condiciones aun mas preferibles son formamida al 50 %, SSPE 5x, solucion de Denhart 1x y ADN de esperma de salmon 1x (condiciones de alta rigurosidad). Sin embargo, varios factores influyen en la rigurosidad de hibridacion distintos de la concentracion de formamida descrita anteriormente y un especialista en la tecnica puede seleccionar convenientemente estos factores para lograr una rigurosidad similar.
Tambien pueden aislarse moleculas de acido nucleico que codifican una variante funcionalmente activa mediante un procedimiento de amplificacion genica tal como PCR usando una porcion de una molecula de acido nucleico de ADN que codifica un peptido, polipeptido o protema de interes, por ejemplo, uno cualquiera de los peptidos que se muestran en las SEC ID N.°s: 1 a 430, como la sonda.
Para los fines de la presente divulgacion, debena considerarse que pueden usarse varios peptidos de IgE antigenicos de la invencion en combinacion. Pueden preverse todos los tipos de combinaciones posibles. Por ejemplo, podna usarse un polipeptido que comprende mas de un peptido de IgE antigenico, preferentemente seleccionado de las SEC ID N.°s: 1 a 430, mas preferentemente de las SEC ID N.°. 1 a 153 y 220 a 430, aun mas preferentemente de las SEC ID N.°s: 220 a 430, en el que se usa el mismo peptido de IgE antigenico en varias copias en la misma molecula polipeptfdica, o en el que se usan peptidos de IgE antigenicos de diferentes secuencias de aminoacidos en la misma molecula polipeptfdica; fusionandose directamente entre sf los diferentes peptidos o copias de IgE antigenicos o separandose mediante engarces apropiados. Como se usa en este documento, la expresion “(poli)peptido de IgE antigenico multimerizado” se refiere a ambos tipos de combinacion en los que estan presentes peptidos de IgE antigenicos de secuencia de aminoacidos bien diferentes o bien iguales en una sola molecula polipeptfdica. Por lo tanto pueden estar presentes de 2 a aproximadamente 20 peptidos de IgE antigenicos identicos y/o diferentes, preferentemente 2, 3, 4, 5, 6 o 7 peptidos de IgE antigenicos en una sola molecula polipeptfdica de IgE antigenica multimerizada.
En un aspecto de la invencion, el inmunogeno esta constituido por, esta constituido esencialmente por, o comprende un peptido de IgE antigenico multimerizado que esta constituido por, constituido esencialmente por o que comprende al menos una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1 a 430 y variantes funcionalmente activas de las mismas, preferentemente seleccionadas del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1 a 430. En una realizacion, dicho peptido de IgE multimerizado comprende un primer peptido de IgE antigenico que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1 a 153 y un segundo peptido de IgE antigenico que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 154 a 219 o las SEC ID N.°s: 220 a 310 o SEC ID N.°s: 311 a 430. En otra realizacion, dicho peptido de IgE multimerizado comprende un primer peptido de IgE antigenico que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.. 154 a 219 y un segundo peptido de IgE antigenico que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1 a 153 o SEC ID N.°s: 220 a 310 o SEC ID N.°s: 311 a 430. En otra realizacion mas, dicho peptido de IgE multimerizado comprende un primer peptido de IgE antigenico que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 220 a 310 y un segundo peptido de IgE antigenico que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1 a 153 o las SEC ID N.°s: 154 a 219 o las SEC ID N.°s: 311 a 430. En otra realizacion mas, dicho peptido de IgE multimerizado comprende un primer peptido de IgE antigenico que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 311 a 430 y un segundo peptido de IgE antigenico que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°. 1 a 153 o SEC ID N.°s: 154 a 219 o SEC ID N.°s: 220 a 310. En otra realizacion mas, dicho peptido de IgE multimerizado comprende un primer peptido de IgE antigenico que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 311 a 430, un segundo peptido de IgE antigenico que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 220 a 310 y un tercer peptido de IgE antigenico que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.. 154 a 219 o las SEC ID N.°s: 1 a 153.
En una realizacion de la invencion, un peptido, polipeptido o protema de la invencion procede de una fuente natural y se afsla de un mairnfero, tal como un ser humano, un primate, un gato, un perro, un caballo, un raton o una rata, preferentemente de una fuente humana. Un peptido, polipeptido o protema de la invencion puede aislarse por lo tanto a partir de fuentes celulares o tisulares usando tecnicas de purificacion de protemas convencionales.
Como alternativa, los peptidos, polipeptidos y protemas de la invencion pueden sintetizarse qmmicamente o producirse usando tecnicas de ADN recombinante.
Por ejemplo, un peptido, polipeptido o protema de la invencion puede sintetizarse mediante procedimientos en fase solida bien conocidos en la tecnica. Pueden realizarse smtesis adecuadas utilizando procedimientos de "T-boc" o "F- moc". Pueden sintetizarse peptidos dclicos mediante el procedimiento en fase solida que emplea el procedimiento "F-moc" bien conocido y resina de poliamida en el aparato totalmente automatizado. Como alternativa, los especialistas en la tecnica conoceran los procedimientos de laboratorio necesarios para realizar el procedimiento manualmente. Se describen tecnicas y procedimientos para smtesis en fase solida en 'Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach' por E. Atherton y R. C. Sheppard, publicado por IRL en Oxford University Press (1989) y 'Methods in Molecular Biology, Vol. 35: Peptide Synthesis Protocols (ed. M. W. Pennington y B. M. Dunn), capftulo 7, pags. 91-171 por D. Andreau y col.
Como alternativa, un polinucleotido que codifica un peptido, polipeptido o protema de la invencion puede introducirse en un vector de expresion que puede expresarse en un sistema de expresion adecuado usando procedimientos bien conocidos en la tecnica, seguido de aislamiento o purificacion del peptido, polipeptido o protema de interes expresada. Una diversidad de sistemas de expresion bacterianos, de levaduras, vegetales, de mamfferos e insectos estan disponibles en la tecnica y puede usarse cualquier sistema de expresion de este tipo. Opcionalmente, un polinucleotido que codifica un peptido, polipeptido o protema de la invencion puede traducirse en un sistema de traduccion sin celulas.
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Los peptidos de IgE antigenicos de la invencion tambien pueden comprender los que surgen como resultado de la existencia de multiples genes, acontecimientos de transcripcion alternativos, acontecimientos de corte y empalme de ARN alternativos y acontecimientos traduccionales y postraduccionales alternativos. Un peptido puede expresarse en sistemas, por ejemplo, celulas cultivadas, que den como resultado sustancialmente las mismas modificaciones postraduccionales presentes que cuando el peptido se expresa en una celula nativa, o en sistemas que den como resultado la alteracion u omision de las modificaciones postraduccionales, por ejemplo, glucosilacion o escision, presentes cuando se expresa en una celula nativa.
Un peptido, polipeptido o protema de la invencion tal como un peptido de IgE antigenico puede producirse como una protema de fusion que contiene otras secuencias de aminoacidos que no son de IgE o no proceden de IgE, tales como engarces aminoaddicos o secuencias senal o vehmulos inmunogenicos segun se definen en este documento, asf como ligandos utiles en la purificacion de protemas, tales como glutation-S-transferasa, marcador de histidina y protema A estafilococica. Puede estar presente mas de un peptido de IgE antigenico de la invencion en una protema de fusion. El polipeptido heterologo puede fusionarse, por ejemplo, en el extremo N-terminal o C-terminal del peptido, polipeptido o protema de la invencion. Un peptido, polipeptido o protema de la invencion tambien puede producirse como protemas de fusion que comprenden secuencias de aminoacidos homologas, es decir, otras secuencias de IgE o derivadas de IgE.
Los peptidos de IgE antigenicos de la invencion podnan ser lineales o estar limitados conformacionalmente. En realizaciones preferidas de la invencion, el peptido de IgE antigenico esta limitado conformacionalmente. Como se usa en este documento en relacion con una molecula, la expresion “limitado conformacionalmente” significa que una molecula, tal como un peptido, polipeptido o protema en la que la estructura tridimensional se mantiene sustancialmente en una disposicion espacial a lo largo del tiempo. Las moleculas limitadas conformacionalmente pueden tener propiedades mejoradas tales como una afinidad, estabilidad metabolica, permeabilidad de membrana o solubilidad aumentadas.
Ademas, se espera que dichas moleculas limitadas conformacionalmente presenten el epitope de IgE antigenico en una conformacion similar a su conformacion de bucle nativo, induciendo de este modo anticuerpos anti-IgE mas susceptibles de reconocer moleculas propias de IgE nativas intactas o con una afinidad aumentada para reconocer moleculas de IgE propias. Se conocen bien en la tecnica procedimientos de limitacion conformacional e incluyen, sin limitacion, formacion de puentes y ciclacion.
Existen varias estrategias conocidas en la tecnica anterior para introducir limitaciones conformacionales en un peptido o cadena polipeptfdica lineal. Por ejemplo, la formacion de puentes entre dos aminoacidos vecinos en un peptido conduce a una modificacion conformacional local, limitandose su flexibilidad en comparacion con la de peptidos normales. Algunas posibilidades para formar dichos puentes incluyen la incorporacion de lactamicos y piperazinonas (para una revision vease Giannis y Koiter, Angew. Chem. Int. Ed., 1993, 32: 1244).
Como se usa en este documento en relacion con un peptido, el termino “dclico” se refiere a una estructura que incluye un enlace intramolecular entre dos aminoacidos o analogos de aminoacidos no adyacentes. La ciclacion puede efectuarse a traves de un enlace covalente o no covalente. Los enlaces intramoleculares incluyen, pero sin limitacion, enlaces de cadena principal con cadena principal, cadena lateral con cadena principal, cadena lateral con cadena lateral, cadena lateral con grupo terminal, grupo terminal con grupo terminal. Los procedimientos de ciclacion incluyen, sin limitacion, la formacion de un enlace disulfuro entre las cadenas laterales de aminoacidos o analogos de aminoacidos no adyacentes; la formacion de un enlace amida entre las cadenas laterales de restos de Lys y Asp/Glu; la formacion de un enlace ester entre restos de serina y restos de Asp/Glu; la formacion de un enlace lactamico, por ejemplo, entre un grupo de cadena lateral de un aminoacido o analogo del mismo con la amina N- terminal del resto amino-terminal; y la formacion de enlaces de lisinanorleucina y ditirosina. Tambien podnan usarse versiones de carbono de un enlace disulfuro, por ejemplo, un enlace etenilo o etilo (J. Peptide Sc, 2008, 14, 898902), asf como reacciones de alquilacion con un reactivo electrofilo apropiadamente polisustituido tal como un di-, trio tetrahaloalcano (PNAS, 2008, 105 (40), 15293-15298; ChemBioChem, 2005, 6, 821-824). Tambien pueden usarse diversos analogos de prolina modificada para incorporar limitaciones conformaciones en peptidos (Zhang y col., J. Med Chem., 1996, 39: 2738-2744; Pfeifer y Robinson, Chem. Comm., 1998,1977-1978). Las qmmicas que pueden usarse para ciclar peptidos de la invencion dan como resultados peptidos ciclados con un enlace incluyendo, pero sin limitacion, los siguientes: enlaces lactamicos, hidrazona, oxima, tiazolidina, tioeter o sulfonio.
Otra estrategia mas en el diseno de peptidos limitados conformacionalmente que se describe en el documento US10/114918 es la union de una secuencia de aminoacidos corta de interes con una plantilla para generar un peptido dclico limitado. Dichos peptidos dclicos no solo estan estructuralmente estabilizados por sus plantillas y por lo tanto ofrecen conformaciones tridimensionales que pueden imitar epitopes conformacionales en protemas nativas tales como virus y parasitos o protemas propias (protemas autologas de mairnferos tales como IgE), sino que tambien son mas resistentes que los peptidos lineales a la degradacion proteolftica en suero. El documento US 10/114918 describe ademas la smtesis de peptidos reticulados limitados conformacionalmente por preparacion de aminoacidos sinteticos para acoplamiento de cadena principal con aminoacidos apropiadamente situados para estabilizar la estructura supersecundaria de los peptidos. La reticulacion puede conseguirse por acoplamiento de amida del grupo amino primario de un resto de (2s,3R)-3-aminoprolina ortogonalmente protegido con un grupo carboxilo de cadena lateral de glutamato convenientemente situado. Esta estrategia se ha seguido en la preparacion de repeticiones tetrapeptfdicas limitadas conformacionalmente de la protema Cs en las que se ha sustituido al menos una prolina por (2S,3R)-3-aminoprolina y para introducir un grupo carboxilo de cadena lateral, se ha incorporado glutamato como sustitucion para alanina.
Las estrategias de reticulacion tambien incluyen la aplicacion de la reaccion de metatesis de cierre de anillo de Grubbs para formar peptidos “grapados” disenados para mimetizar conformaciones alfa-helicoidales (Angew. Int. Ed. Engl., 1998, 37, 3281; JACS, 2000, 122, 5891); uso de sacaridos polifuncionalizados; uso de un enlace triptationina (Chemistry Eu. J., 2008, 24, 3404-3409); uso de reacciones “clic” de azidas y alquinas que podnan incorporarse como restos aminoaddicos de cadena lateral o localizarse en el interior de la cadena principal de la secuencia
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peptidica (Drug Disc. Today, 2003, 8 (24), 1128-1137). Tambien se sabe en la bibliograffa que los iones metalicos pueden estabilizar conformaciones limitadas de peptidos lineales a traves del secuestro de restos espedficos, por ejemplo, histidina, que se coordinan con cationes metalicos (Angew. Int. Ed. Engl., 2003, 42, 421). De una forma similar, puede usarse la funcionalizacion de una secuencia peptidica lineal con una funcionalidad acido y amina no naturales, o con una funcionalidad poliamina y poliacido para permitir el acceso a estructuras cicladas despues de la activacion y de la formacion de un enlace amida.
De acuerdo con una realizacion, el peptido de IgE antigenico esta limitado conformacionalmente por formacion de un enlace covalente intramolecular de dos aminoacidos no adyacentes del peptido de IgE antigenico entre sf, por ejemplo, los aminoacidos N- y C-terminales. De acuerdo con otra realizacion, el peptido de IgE antigenico de la invencion esta limitado conformacionalmente por formacion de enlaces covalentes con una molecula de armazon. De acuerdo con una realizacion adicional, el peptido de IgE antigenico esta limitado de forma simple, es decir, acoplado en un extremo (extremo C o N terminal) o a traves de otro aminoacido no localizado en ningun extremo, a la molecula de armazon. De acuerdo con otra realizacion, el peptido de IgE antigenico esta doblemente limitado, es decir, acoplado tanto en el extremo C como N terminal a la molecula de armazon. De acuerdo con otra realizacion, el peptido antigenico se limita por ciclacion a traves del efecto de plantilla de una unidad de diprolina heteroquiral (D- Pro-L-Pro) (Spath y col, 1998, Helvetica Chimica Acta 81, pags. 1726-1738). Se representan graficamente en la Figura 2 ejemplos ilustrativos pero no limitantes de peptidos limitados conformacionalmente de acuerdo con la invencion.
El armazon (tambien denominado “plataforma”) puede ser cualquier molecula que sea capaz de reducir, por formacion de enlaces covalentes, el numero de conformaciones que puede asumir el peptido de IgE antigenico. Los ejemplos de armazones limitantes de la conformacion incluyen protemas y peptidos, por ejemplo, moleculas relacionadas con lipocalina tales como protemas de tiorredoxina y similares a tiorredoxina que contienen barriles beta, nucleasas (por ejemplo, ARNasaA), proteasas (por ejemplo, tripsina), inhibidores de proteasas (por ejemplo, eglina C), anticuerpos o fragmentos estructuralmente ngidos de los mismos, protemas fluorescentes tales como GFP o YFP, conotoxinas, regiones de bucle de dominio de fibronectina tipo III, CTL-A4 y partfculas similares a virus (VLP).
Otras moleculas de plataforma adecuadas incluyen carbohidratos tales como sefarosa. La plataforma puede ser una molecula lineal o circular, por ejemplo, cerrada para formar un bucle. La plataforma generalmente es heterologa con respecto al peptido de IgE antigenico. Se piensa que dichos peptidos limitados conformacionalmente unidos a una plataforma son mas resistentes a la degradacion proteolftica que el peptido lineal.
De acuerdo con una realizacion preferida, el armazon es un vehmulo inmunogenico segun se define en la presente solicitud, preferentemente una protema de vehmulo heterologa o una VLP. En una realizacion adicional, el peptido de IGE antigenico esta limitado de forma simple sobre el vehmulo inmunogenico. En otra realizacion adicional, el peptido de IgE antigenico esta doblemente limitado sobre el vehmulo inmunogenico. De esta forma, el peptido de IgE antigenico forma una estructura de bucle limitada conformacionalmente que se ha demostrado que es una estructura particularmente adecuada como molecula de reconocimiento intracelular.
Los peptido de IgE antigenicos de la invencion pueden modificarse para facilitar la conjugacion con una plataforma, por ejemplo mediante la adicion de una cistema terminal en uno o ambos extremos y/o mediante la adicion de una secuencia de engarce, tal como una cabeza o cola de doble glicina, un engarce que termine con un resto de lisina o cualquier otro engarce que sepan los especialistas en la tecnica que realiza dicha funcion. Tambien podna usarse qrnmica bioortogonal (tal como la reaccion “clic” descrita anteriormente) para acoplar la secuencia peptfdica completa con el vehmulo, evitando de este modo cualquier cuestion de regioqmmica y quimioselectividad. Se sabe que los engarces rigidificados tales como el descrito en Jones y col. Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41: 4241-4244 generan una respuesta inmunologica mejorada y tambien podnan usarse.
En una realizacion adicional, el peptido de IgE antigenico se une a una plantilla multivalente que por sf mismo se acopla al vehmulo, aumentado de este modo la densidad del antfgeno (vease a continuacion). La plantilla multivalente podna ser un polfmero u oligomero apropiadamente funcionalizado tal como (pero sin limitacion) oligoglutamato y oligoquitosana.
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Dicho engarce podna localizarse en el extremo N-terminal del peptido o en el extremo C-terminal del peptido o en ambos extremos del peptido. Dicho engarce podna tener una longitud de 0 a 10 aminoacidos, preferentemente una longitud de 0 a 6 aminoacidos, aun mas preferentemente una longitud de 2-3 aminoacidos. Como alternativa, la adicion o sustitucion de una forma D-estereoisomerica de uno o mas de los aminoacidos puede realizarse para generar un derivado beneficioso, por ejemplo, para aumentar la estabilidad del peptido.
Se proporcionan a continuacion combinaciones ejemplares de conjugaciones, estando todas dentro del alcance de la presente invencion y constituyendo diversas realizaciones:
Peptido-GGGGGC-armazon
Peptido-GGGGC-armazon
Peptido-GGGC-armazon
Peptido-GGC-armazon
Peptido-GC-armazon
Peptido-C-armazon
Peptido-GGGGGK
Peptido-GGGGK
Peptido-GGGK
Peptido-GGK
Peptido-GK
Peptido-K
Peptido-GGGGSC
Peptido-GGGSC
Peptido-GGSC
Peptido-GSC
Peptido-SC
CSGGGG-Peptido
CSGGG-Peptido
CSGG-Peptido
CSG-Peptido
CS-Peptido
En una realizacion, el peptido esta constituido por cualquiera de los peptidos de IgE antigenicos descritos en este documento y el armazon esta constituido por cualquiera de los vehfculos inmunogenicos descritos en este documento, preferentemente una VLP.
Se proporcionan a continuacion combinaciones ejemplares de conjugaciones usando diversos engarces y peptidos doblemente limitados, en las que el vehfculo puede ser el monomero identico de un vehfculo o un monomero diferencial de un vehfculo. (En el ejemplo a continuacion, el engarce GC puede sustituirse por cualquiera de los engarces GK o GSC ejemplificados anteriormente o cualquier otro conocido por los especialistas en la tecnica):
Vehnculo-CGGGGG-Peptido-GGGGGC-vel'nculo
Vehnculo-CGGGG-Peptido-GGGGC-vel'nculo
Vehnculo-CGGGG-Peptido-GGGGC-vel'nculo
Vehnculo-CGGG-Peptido-GGGC-vel'nculo
Vehnculo-CG-Peptido-GC-vehnculo
Vehnculo-C-Peptido-C-vehnculo
En una realizacion, el peptido esta constituido por cualquiera de los peptidos de IgE antigenicos descritos en este documento y el vehfculo esta constituido por cualquiera de los vehfculos inmunogenicos descritos en este documento, preferentemente una VLP.
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En una realizacion, se anade un resto de cistema terminal, si no esta ya presente en la secuencia de aminoacidos del peptido de IgE antigenico, en uno o ambos extremos de cualquiera de los peptidos de IgE antigenicos de las SEC ID N.°s: 1 a 430 para generar un peptido limitado conformacionalmente. En una realizacion preferida, el peptido de IgE antigenico limitado conformacionalmente de la divulgacion se selecciona del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1 a 430 y variantes funcionalmente activas de las mismas, preferentemente del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1 a 430, mas preferentemente del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1 a 153 y 220 a 430, aun mas preferentemente del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 220 a 430. En una realizacion, dicho resto de cistema terminal se anade en el extremo C-terminal de dicho peptido de IgE antigenico. En otra realizacion, dicho resto de cistema terminal se anade en el extremo N-terminal de dicho peptido de IgE antigenico. En otra realizacion, se anade un resto de cistema terminal tanto en el extremo C-terminal como en el extremo N-terminal de dicho peptido de IgE antigenico.
En otra realizacion, se anade un engarce GC que comprende un numero variable de restos de glicina y un resto de cistema terminal en uno o ambos extremos de cualquiera de los peptidos de IgE antigenicos de las SEC ID N.°s: 1 a 430 para generar un peptido limitado conformacionalmente. Preferentemente, el engarce GC comprende de 1 a 10 restos de glicina, mas preferentemente 1, 2, 3, 4 o 5 restos de glicina. En una realizacion preferida adicional, el peptido de IgE antigenico limitado conformacionalmente de la divulgacion se selecciona del grupo constituido por las SEC ID N.. 1 a 430 y variantes funcionalmente activas de las mismas, preferentemente del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1 a 430, mas preferentemente del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1 a 153 y 220 a 430, aun mas preferentemente del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 220 a 430. En una realizacion, dicho engarce de GC se anade en el extremo C-terminal de dicho peptido de IgE antigenico. En otra realizacion dicho engarce de GC se anade en el extremo N-terminal de dicho peptido de IgE antigenico. En otra realizacion se anade dicho engarce de GC tanto en el extremo C-terminal como en el extremo N-terminal de dicho peptido de IgE antigenico.
En otra realizacion mas, se anade un engarce de GC que comprende un numero variable de restos de glicina y un resto de cistema terminal en un extremo del peptido de IgE antigenico de las SEC ID N.°s: 1 a 430 y se anade un resto de cistema terminal, si no esta ya presente en el otro extremo del peptido de IgE antigenico, en el otro extremo del peptido antigenico. Preferentemente el engarce de GC comprende de 1 a 10 restos de glicina, mas preferentemente 1, 2, 3, 4 o 5 restos de glicina. En una realizacion preferida adicional, el peptido de IgE antigenico limitado conformacionalmente de la invencion se selecciona del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1 a 430 y variantes funcionalmente activas de las mismas, preferentemente del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1 a 430, mas preferentemente del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1 a 153 y 220 a 430, aun mas preferentemente del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 220 a 430. En una realizacion, dicho engarce de GC se anade en el extremo C-terminal de dicho peptido de IgE antigenico y dicho resto de cistema terminal se anade en el extremo N-terminal de dicho peptido de IgE antigenico. En otra realizacion dicho engarce de GC se anade en el extremo N-terminal de dicho peptido de IgE antigenico y dicho resto de cistema terminal se anade en el extremo C-terminal de dicho peptido de IgE antigenico.
En una realizacion preferida adicional, el engarce de GC se modifica, preferentemente por adicion de un resto de lisina, para permitir la conjugacion de dicho engarce acoplado con dicho peptido de IgE antigenico con una molecula de armazon. En una realizacion aun mas preferida, el peptido de IgE antigenico limitado conformacionalmente de la divulgacion se selecciona del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1 a 430 y variantes funcionalmente activas de las mismas, preferentemente del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1 a 430, mas preferentemente del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1 a 153 y 220 a 430, aun mas preferentemente del grupo constituido por las sEc ID N.°s: 220 a 430. En una realizacion, dicho engarce GC modificado se anade en el extremo C-terminal de dicho peptido de IgE antigenico. En otra realizacion, dicho engarce de GC modificado se anade en el extremo N-terminal de dicho peptido de IgE antigenico.
En una realizacion, el peptido de IgE antigenico limitado conformacionalmente de la invencion es cualquiera de los peptidos descritos en la tabla 9.
Vehiculo inmunogenico de la invencion
El peptido o polipeptido de IgE antigenico de la invencion se une a una molecula de vehmulo inmunogenica para formar inmunogenos para protocolos de vacunacion, preferentemente no estando relacionada la molecula de vehmulo con la molecula de IgE nativa.
La expresion “vehmulo inmunogenico” incluye en este documento los materiales que tienen la propiedad de generar de forma independiente una respuesta inmunogenica en un animal huesped y que pueden acoplarse covalentemente a un peptido, polipeptido o protema bien directamente por formacion de enlaces peptfdicos o ester entre grupos carboxilo, amino o hidroxilo libres en el peptido, polipeptido o protema y los grupos correspondientes en el material de vehmulo inmunogenico, bien como alternativa por formacion de enlaces a traves de un grupo de enlace bifuncional convencional, o bien como una protema de fusion.
Los especialistas en la tecnica conoceran facilmente los tipos de vehmulos usados en los inmunogenos de la presente invencion. Son ejemplos de dichos vehmulos inmunogenicos: albuminas sericas tales como albumina serica bovina (BSA); globulinas; tiroglobulinas; hemoglobinas; hemocianinas (particularmente Hemocianina de Lapa Californiana [KLH]); protemas extrafdas de ascarides, toxinas o toxoides bacterianos inactivados tales como toxinas tetanica o difterica (TT y DT) o CRM197, el derivado proteico purificado de tuberculina (PPD); o Protema D de Haemophilus influenzae (documento WO 91/18926) o fragmentos recombinantes de los mismos (por ejemplo, Dominio 1 de Fragmento C de TT, o el dominio de translocacion de DT o 1/3 de Protema D que comprende los 100110 aminoacidos N-terminales de la protema D de Haemophilus influenzae (documento gB 9717953.5); polilisina; acido poliglutamico; copolfmeros de lisina-acido glutamico; copolfmeros que contienen lisina u ornitina; vehmulos liposomales, etc.
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En una realizacion, el vehmulo inmunogenico es KLH. En otra realizacion, el vehmulo inmunogenico es una partmula similar a virus (VLP), preferentemente una partmula similar a virus recombinante.
Como se usa en este documento, la expresion “partmula similar a virus” se refiere a una estructura que se parece a una partmula de virus pero que se ha demostrado que no es patogena. En general, las partmulas similares a virus carecen de al menos parte del genoma viral. Ademas, las partmulas similares a virus pueden producirse con frecuencia en grandes cantidades por expresion heterologa y pueden purificarse facilmente. Una partmula similar a virus de acuerdo con la invencion puede contener un acido nucleico distinto de su genoma. Una realizacion tfpica y preferida de una partmula similar a virus de acuerdo con la presente invencion es una capsida viral tal como la capsida viral del virus, bacteriofago o fago de ARN correspondiente.
Como se usa en este documento, la expresion “partmula similar a virus de un bacteriofago” se refiere a una partmula similar a virus que se parece a la estructura de un bacteriofago, que no es replicante ni infecciosa y que carece de al menos el gen o los genes que codifican la maquinaria de replicacion del bacteriofago y que carece tambien tfpicamente del gen o genes que codifican la protema o protema responsables de la union viral a o de la entrada en el huesped. Sin embargo, esta definicion tambien debena incluir partmulas similares a virus de bacteriofagos en las que el gen o genes mencionados anteriormente esten todavfa presentes pero inactivos y por lo tanto, tambien conduzcan a partmulas similares a virus no replicantes ni infecciosas de un bacteriofago.
La estructura de la capsida formada a partir del autoensamblaje de 180 subunidades de protema de cubierta de fago de ARN y que contiene opcionalmente ARN huesped se denomina en este documento “VLP de protema de cubierta de fago de ARN”. Un ejemplo espedfico es la VLP de la protema de cubierta de Qbeta. En este caso particular, la VLP de la protema de cubierta de Qbeta puede ensamblarse exclusivamente a partir de subunidades CP de Qbeta (generadas por expresion de un gen de CP de Qbeta que contiene, por ejemplo, un codon de terminacion TAA que impide cualquier expresion de la protema A1 mas larga por supresion, vease Kozlovska, T. M. y col., Intervirology 39: 9-15 (1996)), o contiene adicionalmente subunidades de protema A1 en el ensamblaje de la capsida. Generalmente, el porcentaje de protema A1 de Qbeta respecto a CP de Qbeta en el ensamblaje de la capsida estara limitado para asegurar la formacion de la capsida.
Los ejemplos de VLP adecuadas como vehmulos inmunogenicos en el contexto de la presente invencion incluyen, pero sin limitacion, las protemas de las capsida del virus de la Hepatitis B (Ulrich y col., Virus Res. 50: 141-182 (1998)), virus del sarampion (Warnes y col., Gene 160: 173-178 (1995)), virus Sindbis, rotavirus (Patentes de Estados Unidos N.°s: 5.071.651 y 5.374.426), virus de la glosopeda (Twomey y col., Vaccine 13: 1603-1610, (1995)), virus Norwalk (Jiang, X. y col., Science 250: 1580-1583 (1990); Matsui, S. M. y col., J Clin. invest. 87: 1456-1461 (1991)), la protema Gag retroviral (Solicitud de Patente PCT N° WO 96/30523), la protema pl del retrotransposon Ty, la protema de superficie de virus de la Hepatitis B (documento WO 92/11291), papilomavirus humano (documento WO 98/15631), poliomavirus humano (Sasnauskas K. y col., Biol. Chem. 380 (3): 381-386 (1999); Sasnauskas K. y col., Generation of recombinant virus-like particles of different polyomaviruses in yeast. 3rd International Workshop “Virus-like particles as vaccines." Berlin, 26-29 de septiembre (2001)), fagos de ARN, Ty, fago fr, fago GA, fago AP 205 y en particular, fago Qbeta, virus del moteado clorotico de la habichuela, papilomavirus humanos (HPV), papilomavirus bovinos, parvovirus porcino, parvovirus, calicivirus (por ejemplo, virus Norwalk), virus de la enfermedad hemorragica del conejo y VLP de antfgeno de nucleo de hepadnavirus animal.
Como sera facilmente evidente para los especialistas en la tecnica, la VLP que se usara como vehmulo inmunogenico de la invencion no esta limitada a ninguna forma espedfica. La partmula puede sintetizarse qmmicamente o a traves de un procedimiento biologico que puede ser natural o no natural. A modo de ejemplo, este tipo de realizacion incluye una partmula similar a virus o una forma recombinante de la misma. En una realizacion mas espedfica, la VLP puede comprender o como alternativa estar constituida por, polipeptidos recombinantes de cualquiera de los virus que se sabe que forman una VLP. La partmula similar a virus puede comprender ademas, o como alternativa puede estar constituida por, uno o mas fragmentos de dichos polipeptidos, asf como variantes de dichos polipeptidos. Las variantes de polipeptidos pueden compartir, por ejemplo, una identidad de al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 99 % a nivel de aminoacidos con sus homologos de tipo silvestre. Las VLP variantes adecuadas para usar en la presente invencion pueden proceder de cualquier organismo siempre que sean capaces de formar una “partmula similar a virus” y pueden usarse como “vehmulo inmunogenico” segun se define en este documento.
Las VLP preferidas de acuerdo con la invencion incluyen la protema de la capsida o el antfgeno de superficie de HBV (HBcAg y HBsAg respectivamente) o protemas recombinantes o fragmentos de las mismas y las protemas de cubierta de fagos de ARN o protemas recombinantes o fragmentos de las mismas, mas preferentemente la protema de cubierta de Qbeta o protemas recombinantes o fragmentos de la misma.
En una realizacion, el vehmulo inmunogenico usado en combinacion con un peptido o polipeptido de IgE antigenico de la invencion es una protema HBcAg. Los ejemplos de protemas HBcAg que podnan usarse en el contexto de la presente invencion pueden determinarse facilmente por un especialista en la tecnica. Los ejemplos incluyen, pero sin limitacion, protemas del nucleo de HBV descritas en Yuan y col., (J. Virol. 73: 10122-10128 (1999)) y en los documentos WO00/198333, WO 00/177158, WO 00/214478, WO WO00/32227, WO01/85208, WO02/056905, WO03/024480 y WO03/024481. Los HBcAg adecuados para usar en la presente invencion pueden proceder de cualquier organismo siempre que sean capaces de formar una “partmula similar a virus” y pueden usarse como un “vehmulo inmunogenico” segun se define en este documento.
Las variantes de HBcAg de interes particular que podnan usarse en el contexto de la presente invencion son las variantes en las que uno o mas restos de cistema naturalmente presentes se han delecionado o sustituido. Es bien sabido en la tecnica que los restos de cistema libres pueden estar implicados en varias reacciones secundarias qmmicas incluyendo intercambios disulfuro, reaccion con sustancias qmmicas o metabolitos que, por ejemplo, se inyectan o se forman en una terapia de combinacion con otras sustancias u oxidacion directa y reaccion con nucleotidos tras la exposicion a luz Uv. Por lo tanto podnan generarse aductos toxicos, considerando especialmente
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el hecho de que los HBcAg tienen una fuerte tendencia a unirse a acidos nucleicos. Los aductos toxicos se distribuinan por lo tanto entre una multiplicidad de especies, pudiendo estar cada una presente individualmente a baja concentracion, pero alcanzar niveles toxicos en conjunto. En vista de lo anterior, una ventaja al uso de HBcAg en composiciones de vacunas que se han modificado para eliminar restos de cistema naturalmente presentes es que se reducinan en numero o se eliminanan totalmente los sitios con los que pueden unirse especies toxicas cuando se unen antfgenos o determinates antigenicos.
Ademas, la forma procesada de HBcAg que carece de la secuencia lfder N-terminal de la protema precursora del antigeno de nucleo de hepatitis B tambien puede usarse en el contexto de la invencion, especialmente cuando se produce HBcAg en condiciones en las que no se producira el procesamiento (por ejemplo, expresion en sistemas bacterianos).
Otras variantes de HBcAg de acuerdo con la invencion incluyen i) una secuencia polipeptfdica que tiene una identidad de al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 99 % con una de las secuencias de aminoacidos de HBcAg de tipo silvestre o una subporcion de la misma, usando programas informaticos conocidos de uso convencional, ii) mutantes de truncamiento C-terminal que incluyen mutantes en los que se han eliminado 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 34 o 35 aminoacidos del extremo C-terminal, ii) mutantes de truncamiento N-terminal que incluyen mutantes en los que se han eliminado 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15, o 17 aminoacidos del extremo N-terminal, iii) los mutantes truncados tanto en el extremo N-terminal como C-terminal incluyen HBcAg en los que se han eliminado 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15 o 17 aminoacidos del extremo N-terminal y se han eliminado 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 34 o 35 aminoacidos del extremo C-terminal.
Otras protemas variantes de HBcAg mas dentro del alcance de la invencion son las variantes modificadas para aumentar la presentacion inmunogenica de un epitope extrano en las que se han deleccionado una o mas de las cuatro repeticiones de arginina, pero en las que se conserva la cistema C-terminal (vease, por ejemplo, el documento WO01/98333) y HBcAg truncados C-terminalmente quimericos tales como los descritos en los documentos WO02/14478, WO03/102165 y WO04/053091.
En otra realizacion, el vehmulo inmunogenico usado en combinacion con un peptido o polipeptido de IgE antigenico de la invencion es una protema HBsAg. Las protemas HBsAg que podnan usarse en el contexto de la presente invencion pueden determinarse facilmente por un especialista en la tecnica. Los ejemplos incluyen, pero sin limitacion, protemas de superficie de HBV descritas en los documentos US5792463, WO02/10416 y WO08/020331. Los HBsAg adecuados para usar en la presente invencion pueden proceder de cualquier organismo siempre que sean capaces de formar una “partmula similar a virus” y puedan usarse como “vehmulo inmunogenico” segun se define en este documento. Por ejemplo, el subtipo adw (vease la parte de ejemplo del presente documento).
En otra realizacion mas, el vehmulo inmunogenico usado en combinacion con un peptido o polipeptido de IgE antigenico de la invencion es una protema de cubierta de Qbeta.
Se descubrio que la protema de cubierta de Qbeta se autoensambla en capsidas cuando se expresa en E. coli (Kozlovska TM. y col., GENE 137: 133-137 (1993)). Las capsidas o partmulas similares a virus obtenidas mostraban una estructura de capsida similar a fago icosaedrica con un diametro de 25 nm y una cuasi simetna T = 3. Ademas, se ha resuelto la estructura cristalina del fago Qss. La capsida contiene 180 copias de la protema de cubierta que estan unidas en pentameros y hexameros covalentes mediante puentes disulfuro (Golmohammadi, R. y col., Structure 4: 5435554 (1996)) conduciendo a una estabilidad notable de la capsida de la protema de cubierta de Qbeta. La protema de la capsida de Qbeta tambien muestra una resistencia poco habitual a disolventes organicos y agentes desnaturalizantes. La alta estabilidad de la capsida de la protema de cubierta de Qbeta es una
caractenstica ventajosa, en particular, por su uso en la inmunizacion y vacunacion de mairnferos y seres humanos
de acuerdo con la presente invencion.
Los ejemplos de protemas de cubierta de Qbeta que pueden usarse en el contexto de la presente invencion pueden
determinarse facilmente por un especialista en la tecnica. Se han descrito exhaustivamente ejemplos en los
documentos WO02/056905, WO03/024480, WO03/024481 e incluyen, pero sin limitacion, secuencias de aminoacidos descritas en la base de datos PIR, N.° de acceso VCBPGbeta que hace referencia a CP de Qbeta; N.° de acceso AAA16663 que hace referencia a la protema Al de Qbeta; y variantes de las mismas incluyendo protemas variantes en las que se escinde la metionina N-terminal; formas truncadas C-terminales de A1 de Qbeta que carecen de tantos como 100, 150 o 180 aminoacidos; protemas variantes que se han modificado por eliminacion de un resto de lisina por delecion o sustitucion o por la adicion de un resto de lisina por sustitucion o insercion (vease por ejemplo Qbeta-240, Gbeta-243, Qbeta-250, Qbeta-251 y Qbeta-259 divulgadas en el documento WO03/024481) y variantes que presentan una identidad de al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 99 % con cualquiera de las protemas de nucleo de Qbeta descritas anteriormente. Las protemas de cubierta de Qbeta variantes adecuadas para usar en la presente invencion pueden proceder de cualquier organismo siempre que sean capaces de formar una “partmula similar a virus” y puedan usarse como “vehmulos inmunogenicos” segun se definen en este documento.
Los peptidos de IgE antigenicos de la invencion pueden acoplarse con vehmulos inmunogenicos por conjugacion qmmica o por expresion de companeros de fusion modificados por ingeniena genetica. El acoplamiento no tiene que ser necesariamente directo, pero puede producirse a traves de secuencias de engarce. Mas generalmente, en el caso de que los peptidos antigenicos se fusionen, conjuguen o se unan de otro modo a un vehmulo inmunogenico, se anaden tfpicamente secuencias espaciadoras o de engarce en uno o ambos extremos de los peptidos antigenicos. Dichas secuencias de engarce comprenden generalmente secuencias reconocidas por el proteasoma, proteasas de los endosomas u otro compartimento vesicular de la celula.
En una realizacion, los peptidos de la presente invencion se expresan como protemas de fusion con el vehmulo inmunogenico. La fusion del peptido puede efectuarse por insercion en la secuencia primaria del vehmulo inmunogenico, o por fusion con el extremo N- o C-terminal del vehmulo inmunogenico. En lo sucesivo, cuando se hace referencia a protemas de fusion de un peptido con un vehmulo inmunogenico, se incluye la fusion con cualquier
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extremo de la secuencia de subunidad o insercion interna del peptido dentro de la secuencia de vehmulo. La fusion, como se denomina en este documento a continuacion, puede efectuarse por insercion del peptido antigenico en la secuencia de vehmulo, por sustitucion de parte de la secuencia del vehmulo con el peptido antigenico o por combinacion de delecion, sustitucion o inserciones.
Cuando el vehmulo inmunogenico es una VLP, la subunidad de peptido antigenico quimerico-VLP sera generalmente capaz de autoensamblarse en una vLp. Tambien se hace referencia en este documento a VLP que presentan epitopes fusionados con sus subunidades como VLP quimericas. Por ejemplo, el documento EP 0 421 635 B describe el uso de partmulas de antigeno de nucleo de hepadnavirus quimericas para presentar secuencias peptfdicas extranas en una partmula similar a virus.
Pueden anadirse restos de aminoacidos flanqueantes en cualquier extremo de la secuencia del peptido antigenico que se fusionara con cualquier extremo de la subunidad de una VLP o para insercion interna de dicha secuencia peptfdica en la secuencia de la subunidad de una VLP. Los restos de glicina y serina son aminoacidos particularmente preferidos para usarse en las secuencias flanqueantes anadidas al peptido que se va a fusionar. Los restos de glicina confieren una flexibilidad adicional que puede disminuir el efecto potencialmente desestabilizante de la fusion de una secuencia extrana en la secuencia de una subunidad de VLP.
En una realizacion espedfica de la invencion, el vehmulo inmunogenico es una VLP de HBcAg. Se han descrito protemas de fusion del peptido antigenico con el extremo N-terminal de un HBcAg (Neyrinck, S. y col., Nature Med. 5: 11571163 (1999)) o inserciones en la denominada region inmunodominante principal (MIR) (Pumpens, P. y Grens, E. Intervirology 44: 98114 (2001)), documento WO 01/98333) y son realizaciones espedficas de la invencion. Tambien se han descrito variantes de origen natural de HBcAg con deleciones en la MIR (Pumpens, P. y Grens, E., Intervirology 44: 98-114 (2001)) y fusiones con el extremo N- o C-terminal, asf como inserciones en la posicion de la MIR correspondiente al sitio de delecion en comparacion con un HBcAg de tipo silvestre (wt) son realizaciones adicionales de la invencion. Las fusiones en el extremo C-terminal tambien se han descrito (Pumpens, P. y Grens, E., Intervirology 44: 98-114 (2001)). Un especialista en la tecnica encontrara facilmente orientaciones sobre como construir protemas de fusion usando tecnicas de biologfa molecular clasicas. Se han descrito vectores y plasmidos que codifican HBcAg y protemas de fusion de HBcAg y utiles para la expresion de un HBcAg y protemas de fusion de HBcAg (Pumpens, P. y #38; Grens, E. Intervirology 44: 98-114 (2001), Neyrinck, S. y col., Nature Med. 5: 11571163 (1999)) y pueden usarse en la practica de la invencion. Un factor importante para la optimizacion de la eficacia del autoensamblaje y de la presentacion del epitope que se va a insertar en la MIR de HBcAg es la seleccion del sitio de insercion, asf como el numero de aminoacidos que se va a delecionar de la secuencia de HBcAg dentro de la MIR (Pumpens, P. y Grens, E., Intervirology 44: 98-114 (2001); documento EP 0 421 635; Patente de Estados Unidos N° 6.231.864) tras la insercion o, en otras palabras, que aminoacidos de HBcAg se van a sustituir con el nuevo epitope. Por ejemplo, se ha descrito la sustitucion de los aminoacidos de HBcAg 76-80, 79-81, 79-80, 75-85 u 80-81 con epitopes extranos (Pumpens, P. y Grens, E., Intervirology 44: 98-114 (2001); documentos EP0421635; US 6.231.864, WO00/26385). El HBcAg contiene una cola de arginina larga (Pumpens, P. y Grens, E., Intervirology 44: 98-114 (2001)) que es prescindible para el ensamblaje de la capsida y capaz de unirse a acidos nucleicos (Pumpens, P. y Grens, E., Intervirology 44: 98-114 (2001)). Tanto el HBcAg que comprende como que carece de esta cola de arginina son realizaciones de la invencion.
En otra realizacion espedfica de la invencion, el vehmulo inmunogenico es una VLP de un fago de ARN, preferentemente Qbeta. Las protemas de cubierta principales de fagos de ARN se ensamblan espontaneamente en VLP tras la expresion en bacterias y en particular en E. coli. Se han descrito construcciones de protema de fusion en las que se han fusionado peptidos antigenicos con el extremo C-terminal de una forma truncada de la protema A1 de Qbeta, o se han insertado en el interior de la protema A1 (Kozlovska, T. M. y col., Intervirology, 39: 9-15 (1996)). La protema A1 se genera por supresion en el codon de terminacion UGA y tiene una longitud de 329 aa o de 328 aa, si se ha tenido en cuenta la escision de la metionina N-terminal. La escision de la metionina N-terminal antes de una alanina (el segundo aminoacido codificado por el gen de CP de Qbeta) tiene lugar habitualmente en E. coli y tal es el caso para los extremos N-terminales de las protemas de cubierta de Qbeta. La parte del gen de A1 3' del codon ambar UGA codifica la extension de CP, que tiene una longitud de 195 aminoacidos. La insercion del peptido antigenico entre la posicion 72 y 73 de la extension de CP conduce a realizaciones adicionales de la invencion (Kozlovska, T. M. y col., Intervirology 39: 9-15 (1996)). La fusion de un peptido antigenico en el extremo C-terminal de una protema A1 de Qbeta truncada C-terminalmente conduce a realizaciones preferidas adicionales de la invencion. Por ejemplo, Kozlovska y col., (Intervirology, 39: 9-15 (1996)) describen fusiones de protema A1 de Qbeta en las que el epitope se fusiona en el extremo C-terminal de la extension de CP de Qbeta truncada en la posicion 19.
Como se describe por Kozlovska y col. (Intervirology, 39: 9-15 (1996)), el ensamblaje de las partmulas que presentan los epitopes fusionados requiere tipicamente la presencia tanto de la fusion de protema AI-antfgeno como de la CP wt para formar una partmula de mosaico. Sin embargo, tambien se incluyen en el alcance de la presente invencion realizaciones que comprenden partmulas similares a virus y por la presente en particular las VLP de la protema de cubierta de Qbeta de fago de ARN, que estan compuestas exclusivamente por subunidades de VLP que tienen un peptido antigenico fusionado con las mismas.
La produccion de partmulas de mosaico puede efectuarse de varias formas. Kozlovska y col., Intervirology, 39: 9-15 (1996), describen tres procedimientos, pudiendo todos usarse en la practica de la invencion. En la primera estrategia, la presentacion eficaz del epitope fusionado en las VLP esta mediada por la expresion del plasmido que codifica la fusion de protema A1I de Qbeta que tiene un codon de terminacion uGa entre CP y la extension de CP en una cepa de E. coli que alberga un plasmido que codifica un ARNt supresor de UGA clonado que conduce a la traduccion del codon UGA en Trp (plasmido pISM3001 (Smiley B. K y col., Gene 134: 33-40 (1993))). En otra estrategia, el codon de terminacion del gen de CP se modifica en UAA y se cotransforma un segundo plasmido que expresa la fusion de protema A1-antfgeno. El segundo plasmido codifica una resistencia a antibiotico diferente y el origen de replicacion es compatible con el primer plasmido. En una tercera estrategia, el CP y la fusion de protema A1-antfgeno estan codificadas de forma bicistronica, unidas operativamente a un promotor tal como el promotor Trp
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como se describe en la Figura 1 de Kozlovska y col., Intervirology, 39: 9-15 (1996).
Se describen VLP adicionales adecuadas para la fusion de antfgenos o determinates antigenicos en el documento WO03/024481 e incluyen bacteriofago fr, ARN fase MS-2, protema de capsida de papilomavirus, retrotransposon Ty, levaduras y tambien partmulas similares a Retrovirus, Gag de VIH2, Virus del Mosaico de la Habichuela, VLP de VP2 de parvovirus, HBsAg (documentos US 4.722.840, EP0020416B1). Tambien son ejemplos de VLP quimericas adecuadas para la practica de la invencion los descritos en Intervirology 39: 1 (1996). Son ejemplos adicionales de VLP contempladas para usar en la invencion: HPV-1, HPV-6, HPV-11, HPV-16, HPV-18, HPV-33, HPV-45, CRPV, COPV, HIV GAG, Virus del Mosaico del Tabaco. Partmulas similares a virus de SV-40, Poliomavirus, Adenovirus, Virus Herpes Simple, Rotavirus y Virus Norwalk.
Para cualquier peptido o protema expresado de forma recombinante que forma parte de la presente invencion, incluyendo un peptido de IgE antigenico de acuerdo con la invencion acoplado o no a un vehmulo inmunogenico, el acido nucleico que codifica dicho peptido o protema tambien forma un aspecto de la presente divulgacion, asf como un vector de expresion que comprende el acido nucleico y una celula huesped que contiene el vector de expresion (de forma autonoma o insertado cromosomicamente). Un procedimiento para producir de forma recombinante el peptido o protema por expresion del mismo en la celula huesped anterior y aislar el inmunogeno a partir de la misma es un aspecto adicional de la divulgacion. La molecula de IgE nativa de longitud completa o la secuencia de ADN nativa de longitud completa que la codifica no estan cubiertas por la presente divulgacion.
En otra realizacion, el peptido de la invencion se acopla qmmicamente a un vehmulo inmunogenico, usando procedimientos bien conocidos en la tecnica. Puede producirse una conjugacion que permita el libre movimiento de peptidos a traves de conjugacion en un solo punto (por ejemplo, un punto bien N-terminal o bien C-terminal) o como una estructura inmovilizada en la que ambos extremos de peptidos esten conjugados bien con una protema de vehmulo inmunogenica o bien con una estructura de armazon tal como una VLP. Donde la conjugacion se produce por qrnmica de conjugacion conocida por los especialistas en la tecnica tal como a traves de restos de cistema, restos de lisina u otros restos carboxi comunmente conocidos como puntos de conjugacion tales como acido glutamico o acido aspartico. Por lo tanto, por ejemplo, para el acoplamiento covalente directo es posible utilizar una carbodiimida, glutaraldetndo o ester de (N-[y-maleimidobutiriloxi]succinimida, utilizando engarces heterobifuncionales disponibles en el mercado comunes tales como CDAP y SPDP (usando las instrucciones de los fabricantes). Se describen ejemplos de conjugacion de peptidos, particularmente peptidos ciclados, a un vehmulo proteico a traves de derivados peptfdicos de acilhidrazina en el documento WO03/092714. Despues de la reaccion de acoplamiento, el inmunogeno puede aislarse facilmente y purificarse por medio de un procedimiento de dialisis, un procedimiento de filtracion en gel, un procedimiento de fraccionamiento etc. Los peptidos que terminan con un resto de cistema (preferentemente con un engarce fuera de la region ciclada) pueden conjugarse convenientemente con una protema de vehmulo a traves de qrnmica de maleimida. Cuando el vehmulo inmunogenico es una VLP, varios peptidos antigenicos, que tienen bien una secuencia de aminoacidos identica o bien una secuencia de aminoacidos diferente, pueden acoplarse a una sola molecula de VLP, conduciendo preferentemente a una estructura repetitiva y ordenada que presenta varios determinantes antigenicos de una forma orientada como se describe en los documentos WO00/32227, WO03/024481, WO02/056905 y WO04/007538.
En un aspecto de la invencion, el peptido antigenico se une a la VLP por medio de reticulacion qrnmica, tfpicamente y preferentemente mediante el uso de un reticulante heterobifuncional. Se conocen en la tecnica varios reticulantes heterobifuncionales. En algunas realizaciones, el reticulante heterobifuncional contiene un grupo funcional que puede reaccionar con los primeros sitios de union, es decir con el grupo amino de cadena lateral de restos de lisina de la VLP o subunidad de VLP y un grupo funcional adicional que puede reaccionar con un segundo sitio de union preferido, es decir un resto de cistema fusionado con el peptido antigenico y que opcionalmente tambien se hecho disponible para la reaccion mediante reduccion. La primera etapa del procedimiento, tfpicamente denominada derivatizacion, es la reaccion de la VLP con el reticulante. El producto de esta reaccion es una VLP activada, tambien denominada vehmulo activado. En la segunda etapa, se elimina el reticulante sin reaccionar usando procedimientos habituales tales como filtracion en gel o dialisis. En la tercera etapa, el peptido antigenico se hace reaccionar con la VLP activada y esta etapa se denomina tfpicamente la etapa de acoplamiento. Opcionalmente puede eliminarse el peptido antigenico sin reaccionar en una cuarta etapa, por ejemplo mediante dialisis. Se conocen en la tecnica varios reticulantes heterobifuncionales. Estos incluyen los reticulantes preferidos SMPH (succinimidil-6-[p-maleimidopropionamido]hexanoato), Sulfo-MBS, Sulfo-EMCS, Sulfo-GMBS, Sulfo-SIAB, Sulfo- SMPB, Sulfo-SMCC, SVSB, SIA y otros reticulantes disponibles por ejemplo en la Pierce Chemical Company (Rockford, IL, Estados Unidos) y que tienen un grupo funcional reactivo hacia grupos amino y un grupo funcional reactivo hacia restos de cistema. Todos los reticulantes mencionados anteriormente conducen a la formacion de un enlace tioeter.
Otra clase de reticulantes adecuados en la practica de la invencion se caracteriza por la introduccion de un enlace disulfuro entre el peptido antigenico y la VLP tras el acoplamiento. Los reticulantes preferidos que pertenecen a esta clase incluyen por ejemplo SPDP y Sulfo-LC-SPDP (Pierce). Puede influirse en el grado de derivatizacion de la VLP con reticulante variando las condiciones experimentales tales como la concentracion de cada uno de los companeros de reaccion, el exceso de un reactivo sobre el otro, el pH, la temperatura y la fuerza ionica. El grado de acoplamiento, es decir la cantidad de peptido antigenico por subunidades de la VLP puede ajustarse variando las condiciones experimentales descritas anteriormente para que coincidan con las necesidades de la vacuna.
Otro procedimiento de union de peptidos antigenicos a la VLP, es la union de un resto de lisina en la superficie de la VLP con un resto de cistema en el peptido antigenico. En algunas realizaciones, puede ser necesaria la fusion de un engarce aminoacfdico que contiene un resto de cistema, como un segundo sitio de union o como parte del mismo, con el peptido antigenico para el acoplamiento con la VLP. En general, se prefieren engarces aminoacfdicos flexibles. Los ejemplos del engarce aminoacfdico se seleccionan del grupo constituido por: (a) CGG; (b) engarce gamma 1 N-terminal; (c) engarce gamma 3 N-terminal; (d) regiones de bisagra de IgE; (e) engarces de glicina N- terminales; (f) (G)kC(G)n con n = 0-12 y k = 0-5; (g) engarces de glicina-serina N-terminales; (h) (G)kC(G)m(S)i(GGGGS)n con n = 0-3, k = 0-5, m = 0-10, i = 0-2; (i) GGC; (k) GGC-NH2; (l) engarce gamma 1 C-
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terminal; (m) engarce gama 3 C-terminal; (n) engarces de glicina C-terminales; (o) (G)nC(G)k con n = 0-12 y k = 0-5; (p) engarces de glicina-serina C-terminales; (q) (G)m(S)t(GGGGS)n(G)oC(G)k con n = 0-3, k = 0-5, m = 0-10, l = 0-2 y o = 0-8. Son ejemplos adicionales de engarces aminoaddicos la region de bisagra de inmunoglobulinas, engarces de glicina-serina (GGGGS)n y engarces de glicina (G)n conteniendo todos ademas un resto de cistema como segundo sitio de union y opcionalmente restos de glicina adicionales. Son ejemplos tipicamente preferidos de dichos engarces aminoaddicos el gamma 1 N-terminal: CGDKTHTSPP; gamma 1 C-terminal: DKTHT-SPPCG; gamma 3 N- terminal: CGGPKPSTPPGSSGGAP; gamma 3 C-terminal: PKPSTPPGSSGGAPGGCG; engarce de glicina N- terminal: GCGGGG y engarce de glicina C-terminal: GGGGCG.
Otros engarces aminoaddicos particularmente adecuados en la practica de la invencion, cuando se une un peptido antigenico hidrofobo a una VLP son CGKKGG o CGDEGG para engarces N-terminales, o GGKKGC y GGEDGC, para los engarces C-terminales. Para los engarces C-terminales, la cistema terminal esta opcionalmente amidada C- terminalmente.
En algunas realizaciones de la presente invencion, se prefieren engarces GGCG, GGC o GGC-NH2 ("NH2" representa amidacion) en el extremo C-terminal del peptido o CGG en su extremo N-terminal como engarces aminoaddicos. En general, se insertaran restos de glicina entre aminoacidos voluminosos y la cistema que se usara como segundo sitio de union, para evitar un impedimento esterico potencial del aminoacido mas voluminoso en la reaccion de acoplamiento. En una realizacion adicional de la invencion, el engarce aminoaddico GGC-NH2 se fusiona con el extremo C-terminal del peptido antigenico.
El resto de cistema presente en el peptido antigenico tiene que estar en su estado reducido para reaccionar con el reticulante heterobifuncional en la VlP activada, es decir tiene que estar disponible una cistema libre o un resto de cistema con un grupo sulfhidrilo libre. En el caso en el que el resto de cistema que funciona como sitio de union este en una forma oxidada, por ejemplo, si esta formando un puente disulfuro, es necesaria la reduccion de este puente disulfuro con, por ejemplo, dTt, TCEP o p-mercaptoetanol. Bajas concentraciones de agente reductor son compatibles con el acoplamiento como se describe en el documento WO02/05690, concentraciones mayores inhiben la reaccion de acoplamiento, como sabra un especialista, en cuyo caso el agente reductor tiene que eliminarse o su concentracion disminuirse antes del acoplamiento, por ejemplo mediante dialisis, filtracion en gel o HPLC de fase inversa.
La union del peptido antigenico a la VLP usando un reticulante heterobifuncional de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente, permite el acoplamiento del peptido antigenico con la VLP de una forma orientada. Otros procedimientos de union del peptido antigenico con la vLp incluyen procedimientos en los que el peptido antigenico se reticula con la VLP usando la carbodiimida EDC y NHS.
En otros procedimientos, el peptido antigenico se une a la VLP usando un reticulante homobifuncional tal como glutaraldeddo, DSGBM [PEO] 4, BS3, (Pierce Chemical Company, Rockford, IL, Estados Unidos) u otros reticulantes homobifuncionales conocidos con grupos funcionales reactivos hacia grupos amina o grupos carboxilo de la VLP.
Otros procedimientos de union de la VLP a un peptido antigenico incluyen procedimientos en los que la VLP esta biotinilada y el peptido antigenico se expresa como una protema de fusion con estreptavidina, o procedimientos en los que tanto el peptido antigenico como la VLP estan biotinilados, por ejemplo como se describe en el documento WO 00/23955. En este caso, el peptido antigenico puede unirse primero a estreptavidina o avidina por ajuste de la proporcion de peptido antigenico respecto a estreptavidina de modo que los sitios de union libres esten todavfa disponibles para la union de la VLP, que se anade en la siguiente etapa. Como alternativa, todos los componentes pueden mezclarse en una reaccion “en un recipiente”. Otros pares de ligando-receptor, en los que esta disponible una forma soluble del receptor y del ligando y que son capaces de reticularse con la VLP o el peptido antigenico, pueden usarse como agentes de union para la union del peptido antigenico a la VLP. Como alternativa, bien el ligando o bien el receptor pueden fusionarse con el peptido antigenico y de este modo mediar la union con la VLP qdmicamente unida o fusionada al receptor, o al ligando, respectivamente. La fusion tambien puede efectuarse por insercion o sustitucion.
Pueden unirse una o varias moleculas antigenicas a una subunidad de la capsida o VLP de protemas de cubierta de fagos de ARN, preferentemente a traves de los restos de lisina expuestos de la VLP de fagos de ARN, si se puede permitir estericamente. Una caractenstica espedfica de la VLP de la protema de cubierta de fagos de ARN y en particular de la VLP de la protema de cubierta de QP es por lo tanto la posibilidad de acoplar varios antfgenos por subunidad. Esto permite la generacion de una matriz de antfgenos densa.
En una realizacion de la invencion, la union y el acoplamiento, respectivamente, de el al menos un antfgeno o determinante antigenico con la partmula similar a virus es por medio de interaccion y asociacion, respectivamente, entre al menos un primer sitio de union de la partmula similar a virus y al menos una segunda union del peptido antigenico.
Las VLP o capsidas de protema de cubierta Q presentan un numero definido de restos de lisina en su superficie, con una topologfa definida con tres restos de lisina dirigidos hacia el interior de la capsida y que interaccionan con el ARN y otros cuatro restos de lisina expuestos hacia el exterior de la capsida. Estas propiedades definidas favorecen la union de antfgenos al exterior de la partmula, mas que al interior de la partmula, donde los restos de lisina interaccionan con el ARN. Las VLP de otras protemas de cubierta de fago de ARN tambien tienen un numero definido de restos de lisina en su superficie y una topologfa definida de estos restos de lisina.
En una realizacion adicional de la presente invencion, el primer sitio de union es un resto de lisina y/o la segunda union comprende un grupo sulfhidrilo o un resto de cistema. En una realizacion adicional mas de la presente invencion, el primer sitio de union es un resto de lisina y la segunda union es un resto de cistema. En realizaciones adicionales de la invencion, el antfgeno o determinante antigenico se une mediante un resto de cistema a restos de
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lisina de la VLP de una protema de cubierta de fago de ARN y en particular a la VLP de la protema de cubierta de Qbeta.
Otra ventaja de las VLP derivadas de fagos de ARN es su alto rendimiento de expresion en bacterias que permite la produccion de grandes cantidades de material a un coste razonable. Ademas, el uso de las VLP como vehnculos permite la formacion de matrices de antigenos robustas y conjugados de antigenos robustos, respectivamente, con una densidad de antigenos variable. En particular, el uso de las VLP de fagos de ARN y en este documento en particular el uso de la VLP de protema de cubierta de Qbeta de fago de ARN permite conseguir una densidad de epitopes muy elevada.
En algunas realizaciones de la invencion, las composiciones inmunogenicas de la invencion pueden comprender mezclas de conjugados inmunogenicos, es decir, vehnculos inmunogenicos acoplados a uno o varios peptidos de IgE antigenicos de la invencion. Por lo tanto, estas composiciones inmunogenicas pueden estar compuestas de vehnculos inmunogenicos que difieran en la secuencia de aminoacidos. Por ejemplo, podnan prepararse composiciones de vacunas que comprenden una VLP “de tipo silvestre” y una protema VLP modificada en la que se han modificado (por ejemplo, delecionado, insertado o sustituido) uno o mas restos aminoaddicos. Como alternativa, podna usarse el mismo vehmulo inmunogenico pero acoplado a peptidos de IgE antigenicos de secuencias de aminoacidos diferentes.
La divulgacion tambien se refiere por lo tanto a un procedimiento para producir un inmunogeno de acuerdo con la
divulgacion que comprende i) proporcionar un peptido de IgE antigenico de acuerdo con la divulgacion, ii)
proporcionar un vehnculo inmunogenico de acuerdo con la divulgacion, preferentemente una VLP y iii) combinar dicho peptido de IgE antigenico y dicho vehnculo inmunogenico. En una realizacion, dicha etapa de combinacion se produce por reticulacion qmmica, preferentemente a traves de un reticulante heterobifuncional.
En una realizacion, el peptido de IgE antigenico de la divulgacion esta constituido por, o constituido esencialmente por, una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,
72, 73, 74, 75,
76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101
102,
103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124
125,
126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147.
148,
149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170.
171,
172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193.
194,
195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216
217,
218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239
240,
241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262
263,
264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285
286,
287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308
309,
310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331
332,
333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354
355,
356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377
378,
379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400
401,
402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423
424,
425, 426, 427, 428, 429 y 430
En otra realizacion, el peptido de IgE antigenico de la divulgacion esta constituido por, o constituido esencialmente por, una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,

72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101,

102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124,

125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147,
148, 149, 150, 151, 152 y 153.
Preferentemente dicho peptido de IgE antigenico esta constituido por, o constituido esencialmente por, una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las sEc ID N.°s: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 49,

50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84,
85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 126, 127, 128, 129, 130, 133, 134, 135, 136, 139, 140, 141, 144, 145 y 148. Mas
preferentemente, dicho peptido de IgE antigenico esta constituido por, o constituido esencialmente por, una

secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las sEc ID N.°s: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,

18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 63,
64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 99, 100, 101, 102, 103, 109, 110, 111,
112, 118, 119, 120, 126, 127, 133 y 139. Aun mas preferentemente, dicho peptido de IgE antigenico esta constituido por, o constituido esencialmente por, una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 63, 64,
65, 66, 67, 76, 77, 78, 79, 88, 89, 90, 99, 100, 101 y 109. Aun mas preferentemente, dicho peptido de IgE antigenico
esta constituido por, o constituido esencialmente por, una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 18, 19, 20, 21, 22, 34, 35, 36, 37, 49, 50, 51, 63, 64 y 76. Aun mas
preferentemente, dicho peptido de IgE antigenico esta constituido por, o constituido esencialmente por, una
secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1, 2, 3, 18, 19 y 34. Lo mas preferentemente, dicho peptido de IgE antigenico esta constituido por, o constituido esencialmente por, una secuencia de aminoacidos de la SEC ID N.°s: 1 o 18.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
En otra realizacion, el peptido de IgE antigenico de la divulgacion esta constituido por, o constituido esencialmente por, una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181,
182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201,202, 203, 204,
205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218 y 219. Preferentemente, dicho peptido de IgE
antigenico esta constituido por, o constituido esencialmente por, una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 165, 166, 167, 168, 169, 170,
171, 172, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 192, 193, 194, 195, 196, 199, 200, 201,
202, 205, 206, 207, 210, 211, 214 y 217.
Mas preferentemente, dicho peptido de IgE antigenico esta constituido por, o constituido esencialmente por, una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las sEc ID N.°s: 154, 155, 156, 157, 158, 159, 165, 166, 167, 168, 169, 175, 176, 177, 178, 184, 185, 186, 192, 193, 199 y 200. Aun mas preferentemente, dicho peptido de IgE antigenico esta constituido por, o constituido esencialmente por, una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 154, 155, 156, 165, 166 y 175. Lo mas preferentemente, dicho peptido de IgE antigenico esta constituido por, o constituido esencialmente por, una secuencia de aminoacidos de la SEC ID N.°s: 154 o 165.
En otra realizacion, el peptido de IgE antigenico de la divulgacion esta constituido por, o constituido esencialmente por, una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247,
248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261,262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270,
271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293,
294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309 y 310. Preferentemente, dicho peptido de IgE antigenico esta constituido por, o constituido esencialmente por, una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 256, 257, 258, 259, 260,
261, 262, 263, 266, 267, 268, 269, 270, 271,272, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 283, 284, 285, 286, 287, 290, 291,
292, 293, 296, 297, 298, 301, 302 y 305. Mas preferentemente, dicho peptido de IgE antigenico esta constituido por, o constituido esencialmente por, una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 220, 221,222, 223, 224, 225, 226, 227, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 256, 257, 258, 259, 260, 266, 267, 268, 269, 275, 276, 277, 283, 284 y 290. Aun mas preferentemente, dicho peptido de IgE antigenico esta constituido por, o constituido esencialmente por, una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 220, 221, 222, 223, 224, 233, 234, 235, 236, 245, 246, 247, 256, 257 y 266. Aun mas preferentemente, dicho peptido de IgE antigenico esta constituido por, o constituido esencialmente por, una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 220, 221, 222, 233, 234 y 245. Lo mas preferentemente, dicho peptido de IgE antigenico esta constituido por, o constituido esencialmente por, una secuencia de aminoacidos de las SEC ID N.°s: 220 o 233.
En otra realizacion mas, el peptido de IgE antigenico de la invencion esta constituido por, o constituido esencialmente por, una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335,

336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358,

359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381,

382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401,402, 403, 404,

405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421,422, 423, 424, 425, 426, 427,
428, 429 y 430. Preferentemente, dicho peptido de IgE antigenico esta constituido por, o constituido esencialmente por, una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 311, 312, 313, 314, 315,

316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 340, 341, 342,

343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 365, 366, 367, 368, 369,

370, 371, 372, 373, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 395, 396, 397, 398,
399, 400, 403, 404, 405, 406, 407, 410, 411, 412, 413, 416, 417, 418, 421, 422 y 425. Mas preferentemente, dicho
peptido de IgE antigenico esta constituido por, o constituido esencialmente por, una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 376, 377, 378, 379, 380, 386, 387, 388, 389, 395, 396, 397, 403, 404 y 410. Aun mas preferentemente, dicho peptido de IgE antigenico esta constituido por, o constituido esencialmente por, una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 311, 312, 313, 314, 315, 316,
317, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 340, 341, 342, 343, 344, 353, 354, 355, 356, 365, 366, 367, 376, 377 y 386. Aun mas preferentemente, dicho peptido de IgE antigenico esta constituido por, o constituido esencialmente por, una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las sEc ID N.°s: 311, 312, 313, 314, 326, 327, 328, 340, 341 y 353. Aun mas preferentemente, dicho peptido de IgE antigenico esta constituido por, o constituido esencialmente por, una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 311, 312 y 326. Lo mas preferentemente, dicho peptido de IgE antigenico esta constituido por, o constituido esencialmente por, una secuencia de aminoacidos de la SEC ID N.. 311 o 312.
En una realizacion de la presente divulgacion, el peptido de IgE antigenico descrito en este documento se une a una molecula de vetuculo inmunogenica. En una realizacion dicho vetuculo inmunogenico se selecciona del grupo constituido por cualquiera de los vehfculos inmunogenicos descritos en este documento. En otra realizacion, dicho vetuculo inmunogenico se selecciona del grupo constituido por: albuminas sericas tales como albumina serica bovina (BSA); globulinas; tiroglobulinas; hemoglobinas; hemocianinas (particularmente Hemocianina de Lapa Californiana [KlH]) y partfculas similares a virus (VLP). En una realizacion preferida dicho vetuculo inmunogenico es Hemocianina de Lapa Californiana o partfculas similares a virus (VLP). En una realizacion incluso preferida, dicho vetuculo inmunogenico es una VLP seleccionada del grupo constituido por VLP de HBcAg, VLP de HBsAg, VLP de Qbeta o cualquier variante divulgada en este documento. En una realizacion incluso preferida, dicho vehfculo inmunogenico es una VLP de Qbeta seleccionada del grupo constituido por CP de Qbeta; A1 de Qbeta, Qbeta-240,
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Qbeta-243, Qbeta-250, Qbeta-251 y Qbeta-259 (divulgadas en el documento WO03/024481).
En una realizacion, dicho vehmulo inmunogenico se une covalentemente al peptido de IgE antigenico descrito en este documento directamente o mediante un engarce. En una realizacion, dicho vehmulo inmunogenico se une al peptido de IgE antigenico divulgado en este documento por expresion de una protema de fusion como se describe en este documento. En otra realizacion, el peptido de IgE antigenico divulgado en este documento se une al vehmulo inmunogenico, preferentemente una VLP, por medio de una reticulacion qrnmica como se describe en este documento y preferentemente, usando un reticulante heterobifuncional. Se conocen en la tecnica varios reticulantes heterobifuncinales. En algunas realizaciones, el reticulante heterobifuncional contiene un grupo funcional que puede reaccionar con primeros sitios de union, es decir, con el grupo amino de cadena lateral de restos de lisina de la VLP
0 subunidad de VLP y contiene un grupo funcional adicional que puede reaccionar con un segundo sitio de union preferido, es decir un resto de cistema fusionado con el peptido antigenico que se ha hecho disponible para la reaccion mediante reduccion.
Por lo tanto en una realizacion de la presente divulgacion el peptido de IgE antigenico divulgado en este documento comprende ademas bien en su extremo N-terminal, o bien en su extremo C-terminal o en ambos extremos N- terminal y C-terminal un engarce que es capaz de reaccionar con un sitio de union del vehmulo inmunogenico en una reaccion de reticulacion qrnmica. En una realizacion, el peptido de IgE antigenico descrito en este documento comprende ademas en su extremo C-terminal un engarce que tiene la formula (G)nC en la que n es un numero entero seleccionado del grupo constituido por 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10, preferentemente del grupo constituido por 0, 1, 2, 3, 4 y 5, mas preferentemente de los grupos constituidos por 0, 1, 2 y 3, lo mas preferentemente n es 0 o
1 (cuando n es igual a 0 dicha formula representa una cistema). Preferentemente, el peptido de IgE antigenico descrito en este documento comprende ademas en su extremo C-terminal un engarce que tiene la formula GGGC, GGC, GC o C.
En otra realizacion de la presente divulgacion el peptido de IgE antigenico divulgado en este documento comprende ademas en su extremo N-terminal un engarce que tiene la formula C(G)n, en la que n es un numero entero seleccionado del grupo constituido por 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10, preferentemente del grupo constituido por 0, 1, 2, 3, 4 y 5, mas preferentemente de los grupos constituidos por 0, 1, 2 y 3, lo mas preferentemente n es 0 o 1 (cuando n es igual a 0 la formula representa una cistema). Preferentemente, el peptido de IgE antigenico descrito en este documento comprende ademas en su extremo N-terminal un engarce que tiene la formula CGGG, CGG, CG o C.
En otra realizacion el peptido de IgE antigenico divulgado en este documento comprende ademas en su extremo N- terminal un engarce que tiene la formula GGGC, GGC, GC o C.
En otra realizacion el peptido de IgE antigenico divulgado en este documento comprende ademas en su extremo C- terminal un engarce que tiene la formula (G)nC en la que n es un numero entero seleccionado del grupo constituido por 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10, preferentemente del grupo constituido por 0, 1,2, 3, 4 y 5, mas preferentemente de los grupos constituidos por 0, 1, 2 y 3, lo mas preferentemente n es 0 o 1 (cuando n es igual a 0 dicha formula representa una cistema) y en su extremo N-terminal un engarce que tiene la formula C(G)n, en la que n es un numero entero seleccionado del grupo constituido por 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10, preferentemente del grupo constituido por 0, 1, 2, 3, 4 y 5, mas preferentemente de los grupos constituidos por 0, 1, 2 y 3, lo mas preferentemente n es 0 o 1 (cuando n es igual a 0 la formula representa una cistema). Preferentemente el peptido de IgE antigenico divulgado en este documento comprende ademas en su extremo N-terminal un engarce que tiene la formula GGGC, GGC, GC o C y en su extremo C-terminal un engarce que tiene la formula GGGC, GGC, GC o C. Mas preferentemente el peptido de IgE antigenico divulgado en este documento comprende ademas en su extremo N-terminal una cistema y en su extremo C-terminal una cistema.
Se divulgan representantes de dichos peptidos de IgE antigenicos que comprenden ademas dicho engarce en las SEC ID N.°s: 434, 436, 437, 438 y 439. En una realizacion de la divulgacion, el peptido de IgE antigenico que comprende un engarce es cualquiera de los peptidos divulgados en la tabla 9.
El resto de cistema anadido en el extremo N-terminal y/o extremo C-terminal del peptido antigenico de IgE esta disponible para reaccion por reduccion (reticulacion qrnmica) tfpicamente y preferentemente usando un reticulante heterobifuncional. Se conocen en la tecnica varios reticulantes heterobifuncionales. En algunas realizaciones, el peptido antigenico de IgE que comprende ademas un engarce descrito en este documento se reticula con el grupo amino de cadena lateral de restos de lisina de una VLP.
Por lo tanto, en una realizacion, el peptido antigenico de IgE que comprende ademas un engarce descrito anteriormente se reticula con el vehmulo inmunogenico (en particular con una VLP, preferentemente VLP de HBcAg, VLP de HBsAg o VLP de Qbeta). La primera etapa del procedimiento, tfpicamente denominada derivatizacion, es la reaccion de la VLP con el reticulante. El producto de esta reaccion es una VLP activada, tambien denominada vehmulo activado. En la segunda etapa, se elimina el reticulante sin reaccionar usando procedimientos habituales tales como filtracion en gel o dialisis. En la tercera etapa, el peptido antigenico se hace reaccionar con la VLP activada y esta etapa se denomina tfpicamente etapa de acoplamiento. El peptido antigenico sin reaccionar puede eliminarse opcionalmente en una cuarta etapa, por ejemplo mediante dialisis. Se conocen en la tecnica varios reticulantes heterobifuncionales. Estos incluyen los reticulantes preferidos SMPH (succinimidil-6-[p- maleimidopropionamido]hexanoato), Sulfo-MBS, Sulfo-EMCS, Sulfo-GMBS, Sulfo-SIAB, Sulfo-SMPB, Sulfo-SMCC, SVSB, SIA y otros reticulantes disponibles por ejemplo en la Pierce Chemical Company (Rockford, IL, Estados Unidos) y que tienen un grupo funcional reactivo hacia grupos amino y un grupo funcional reactivo hacia restos de cistema. Todos los reticulantes mencionados anteriormente conducen a la formacion de un enlace tioeter.
En una realizacion, la divulgacion se refiere a un inmunogeno que comprende una IgE antigenica constituida por, o constituida esencialmente por, una secuencia de aminoacidos de las SEC ID N.. 1, 2, 3, 18, 19 o 34, lo mas preferentemente de la SEC ID N.°: 1 o 18, en la que dicha IgE antigenica comprende ademas en su extremo C-
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terminal una cistema que se reticula qmmicamente con una partmula similar a virus por medio de un enlace tioeter. En una realizacion preferida, dicha VLP se selecciona del grupo constituido por HBcAg, HBsAg y Qbeta. Preferentemente dicha VLP es Qbeta, aun mas preferentemente la Qbeta de la SEC ID N.°: 435.
En una realizacion, la divulgacion se refiere a un inmunogeno que comprende una IgE antigenica constituida por, o constituida esencialmente por, una secuencia de aminoacidos de las SEC ID N.. 1, 2, 3, 18, 19 o 34, lo mas preferentemente de la SEC ID N.°: 1 o 18, en la que dicha IgE antigenica comprende ademas en su extremo N- terminal una cistema que se reticula qmmicamente con una partmula similar a virus mediante un enlace tioeter. En una realizacion preferida, dicha vLp se selecciona del grupo constituido por HBcAg, HBsAg y Qbeta. Preferentemente dicha VLP es Qbeta, aun mas preferentemente la Qbeta de la SEC ID N.°: 435.
En una realizacion, la divulgacion se refiere a un inmunogeno que comprende una IgE antigenica constituida por, o constituida esencialmente por, una secuencia de aminoacidos de las sEc ID N.°s: 154, 155, 156, 165, 166 y 175, lo mas preferentemente, de las SEC ID N.°: 154 o 165, en la que dicha IgE antigenica comprende ademas en su extremo C-terminal una cistema que se reticula qmmicamente con una partmula similar a virus mediante un enlace tioeter. En una realizacion preferida, dicha VLP se selecciona del grupo constituido por HBcAg, HBsAg y Qbeta. Preferentemente dicha VLP es Qbeta, aun mas preferentemente la Qbeta de la SEC ID N.°: 435.
En una realizacion, la divulgacion se refiere a un inmunogeno que comprende una IgE antigenica constituida por, o constituida esencialmente por, una secuencia de aminoacidos de las sEc ID N.°s: 154, 155, 156, 165, 166 y 175, lo mas preferentemente de la SEC ID N.°: 154 o 165, en la que dicha IgE antigenica comprende ademas en su extremo N-terminal una cistema que se reticula qmmicamente con una partmula similar a virus por medio de un enlace tioeter. En una realizacion preferida, dicha VLP se selecciona del grupo constituido por HBcAg, HBsAg y Qbeta. Preferentemente dicha VLP es Qbeta, aun mas preferentemente la Qbeta de la SEC ID N.°: 435.
En una realizacion, la invencion se refiere a un inmunogeno que comprende una IgE antigenica constituida por, o constituida esencialmente por, una secuencia de aminoacidos de las SEC ID N.°s: 220, 221,222, 233, 234 y 245, lo mas preferentemente de la SEC ID N.°: 220 o 233, en la que dicha IgE antigenica comprende ademas en su extremo C-terminal una cistema que se reticula qmmicamente con una partmula similar a virus por medio de un enlace tioeter. En una realizacion preferida, dicha VLP se selecciona del grupo constituido por HBcAg, HBsAg y Qbeta. Preferentemente, dicha VLP es Qbeta, aun mas preferentemente, la Qbeta de la SEC ID N.°: 435.
En una realizacion, la invencion se refiere a un inmunogeno que comprende una IgE antigenica constituida por, o constituida esencialmente por, una secuencia de aminoacidos de las SEC ID N.°s: 220, 221,222, 233, 234 y 245, lo mas preferentemente de la SEC ID N.°: 220 o 233, en la que dicha IgE antigenica comprende ademas en su extremo N-terminal una cistema que se reticula qmmicamente con una partmula similar a virus por medio de un enlace tioeter. En una realizacion preferida, dicha VLP se selecciona del grupo constituido por HBcAg, HBsAg y Qbeta. Preferentemente, dicha VLP es Qbeta, aun mas preferentemente, la Qbeta de la SEC ID N.°: 435.
En una realizacion, la invencion se refiere a un inmunogeno que comprende una IgE antigenica constituida por, o constituida esencialmente por, una secuencia de aminoacidos de las SEC ID N.°s: 311, 312 y 326, lo mas preferentemente de la SEC ID N.°: 311 o 312, en la que dicha IgE antigenica comprende ademas en su extremo C- terminal una cistema que se reticula qmmicamente con una partmula similar a virus por medio de un enlace tioeter. En una realizacion preferida, dicha VLP se selecciona del grupo constituido por HBcAg, HBsAg y Qbeta. Preferentemente dicha VLP es Qbeta, aun mas preferentemente, la Qbeta de la SEC ID N.°: 435.
En una realizacion, la invencion se refiere a un inmunogeno que comprende una IgE antigenica constituida por, o constituida esencialmente por, una secuencia de aminoacidos de la SEC ID N.°s: 311, 312 y 326, mas preferentemente de la SEC ID N.°: 311 o 312, comprendiendo dicha IgE antigenica ademas en su extremo N- terminal una cistema que se reticula qmmicamente con una partmula similar a virus por medio de un enlace tioeter. En una realizacion preferida, dicha VLP se selecciona del grupo constituido por HBcAg, HBsAg y Qbeta. Preferentemente dicha VLP es Qbeta, aun mas preferentemente, la Qbeta de la SEC ID N.°: 435.
En una realizacion, la invencion se refiere a un inmunogeno que comprende una IgE antigenica constituida por, o constituida esencialmente por, una secuencia de aminoacidos de las SEC ID N.°s: 311, 312 y 326, lo mas preferentemente de la SEC ID N.°: 311 o 312. Preferentemente, dicha IgE antigenica comprende ademas en su extremo C-terminal un engarce GC, preferentemente un engarce que tiene la formula GGC (comprendiendo preferentemente dicho peptido de IgE antigenico en su extremo C-terminal un engarce GC constituido por, o constituido esencialmente por la secuencia de aminoacidos de la SEC ID N.°: 457) que se reticula qmmicamente con una partmula similar a virus por medio de un enlace tioeter usando SMPH (succinimidil-6-[p- maleimidopropionamido]hexanoato) como reticulante, siendo dicho enlace entre un resto de lisina de la VLP y el resto de cistema de dicho engarce C-terminal. En una realizacion preferida, dicha VLP se selecciona del grupo constituido por HBcAg, HBsAg y Qbeta. Preferentemente dicha VLP es Qbeta, aun mas preferentemente, la Qbeta de la SEC ID N.°: 435.
En una realizacion, la invencion se refiere a un inmunogeno que comprende una IgE antigenica constituida por, o constituida esencialmente por, una secuencia de aminoacidos de las SEC ID N.°s: 220, 221,233, 234, 244 y 246, lo mas preferentemente de la SEC ID N.°: 220 o 233, que se reticula qmmicamente con una partmula similar a virus por medio de un enlace tioeter, siendo dicho enlace entre un resto de lisina de la VLP y el resto de cistema de dicho peptido de IgE antigenico. En dicha realizacion, el peptido de IgE antigenico divulgado en este documento se une al vehmulo inmunogenico, preferentemente una VLP, por medio de una reticulacion qmmica como se describe en este documento y preferentemente usando un reticulante heterobifuncional. Se conocen en la tecnica varios reticulantes heterobifuncionales. En algunas realizaciones, el reticulante heterobifuncional contiene un grupo funcional que puede reaccionar con primeros sitios de union, es decir con el grupo amino de cadena lateral de restos de lisina de la VLP o subunidad de VLP y un grupo funcional adicional que puede reaccionar con un segundo sitio de union preferido, es decir el resto de cistema del peptido antigenico que se ha hecho disponible para la reaccion mediante
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reduccion. En una realizacion preferida, dicha VLP se selecciona del grupo constituido por HBcAg, HBsAg y Qbeta. Preferentemente, dicha VLP es Qbeta, aun mas preferentemente Qbeta de la SEC ID N.°: 435.
En una realizacion, la invencion se refiere a un inmunogeno que comprende una IgE antigenica constituida por o constituida esencialmente por una secuencia de aminoacidos de la SEC ID N.°: 220 que se reticula qmmicamente con una partmula similar a virus por medio de un enlace tioeter usando SMPH (succinimidil-6-[p- maleimidopropionamido]hexanoato) como reticulante, siendo dicho enlace entre un resto de lisina de la VLP y el resto de cistema de dicho peptido de IgE antigenico. En una realizacion preferida, dicha VLP se selecciona del grupo constituido por HBcAg, HBsAg y Qbeta. Preferentemente dicha VLP es Qbeta, incluso mas preferentemente la Qbeta de la SEC ID N.°: 435.
En una realizacion particular, cuando la secuencia del peptido de IgE antigenico divulgada en este documento comprende una cistema, dicho peptido de IgE antigenico se une covalentemente al vehmulo inmunogenico directamente por medio de dicha cistema. En dicha realizacion, el peptido de IgE antigenico divulgado en este documento se une al vehmulo inmunogenico, preferentemente una VLP, por medio de reticulacion qmmica como se describe en este documento y preferentemente usando un reticulante heterobifuncional. Se conocen en la tecnica varios reticulantes heterobifuncionales. En algunas realizaciones, el reticulante heterobifuncional contiene un grupo funcional que puede reaccionar con primeros sitios de union, es decir, con el grupo amino de cadena lateral de restos de lisina de la VLP o subunidad de VLP y un grupo funcional adicional que puede reaccionar con un segundo sitio de union preferido, es decir un resto de cistema fusionado con el peptido antigenico que se ha hecho disponible para la reaccion mediante reduccion. Por lo tanto en alguna realizacion, cuando la secuencia del peptido de IgE antigenico divulgada en este documento comprende una cistema, dicho peptido de IgE antigenico se reticula qmmicamente con el vehmulo inmunogenico por medio de un enlace tioeter, siendo dicho enlace entre un resto de lisina del vehmulo inmunogenico y el resto de cistema de dicha IgE antigenica. En una realizacion preferida, dicho vehmulo inmunogenico es una VLP, preferentemente una partmula similar a virus de Qbeta (aun mas preferentemente la Qbeta de la SEC ID N.°: 435).
En un aspecto adicional, la presente invencion se refiere a una composicion que comprende al menos dos inmunogenos descritos en este documento. En una realizacion, la presente invencion se refiere a una composicion que comprende al menos dos inmunogenos comprendiendo cada uno de estos inmunogenos un peptido de IgE antigenico divulgado en este documento unido a un vehmulo inmunogenico. En una realizacion dicha composicion comprende dos, tres, cuatro o cinco inmunogenos de la presente invencion comprendiendo cada uno de estos inmunogenos un peptido de IgE antigenico divulgado en este documento unido a un vehmulo inmunogenico.
Preferentemente, cada peptido de IgE antigenico se une individualmente a diferentes moleculas de vehmulo inmunogenico (teniendo cada molecula de vehmulo inmunogenico solo un tipo de peptido de IgE antigenico conjugado con la misma). En dicha realizacion, se dice que el peptido de IgE antigenico esta conjugado individualmente con el vehmulo inmunogenico.
En una realizacion, la divulgacion se refiere a una composicion que comprende o esta constituida por dos inmunogenos comprendiendo cada uno de estos inmunogenos un peptido de IgE antigenico divulgado en este documento unido a un vehmulo inmunogenico. Preferentemente, cada peptido de IgE antigenico se conjuga individualmente con el vehmulo inmunogenico.
En una realizacion, el peptido de IgE antigenico del primer inmunogeno esta constituido por: una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46,
47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77,

78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105,

106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128,

129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151,
152 y 153, preferentemente del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,
18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 49, 50, 51, 52,
53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 88, 89,
90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 126, 127, 128, 129, 130, 133, 134, 135, 136, 139, 140, 141, 144, 145 y 148, mas preferentemente del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 34,
35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 76, 77, 78, 79, 80,
81, 82, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 99, 100, 101, 102, 103, 109, 110, 111, 112, 118, 119, 120, 126, 127, 133 y 139, aun mas preferentemente del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 63, 64, 65, 66, 67, 76, 77, 78, 79, 88, 89, 90, 99, 100, 101 y 109, aun mas preferentemente del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 18, 19, 20, 21,22, 34, 35, 36, 37, 49, 50, 51, 63, 64 y 76, aun mas preferentemente del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1, 2, 3, 18, 19 y 34, lo mas preferentemente dicho peptido de IgE antigenico esta constituido por una secuencia de aminoacidos de la SEC ID N.°: 1 o 18.
En una realizacion, el peptido de IgE antigenico del segundo inmunogeno esta constituido por una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185,
186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208,

209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218 y 219, preferentemente del grupo constituido por las SEC ID N.°s:

154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 175, 176, 177, 178, 179, 180,

181, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 192, 193, 194, 195, 196, 199, 200, 201, 202, 205, 206, 207, 210, 211, 214 y 217,

mas preferentemente del grupo constituido por las sEc ID N.°s: 154, 155, 156, 157, 158, 159, 165, 166, 167, 168,
169, 175, 176, 177, 178, 184, 185, 186, 192, 193, 199 y 200, aun mas preferentemente del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 154, 155, 156, 165, 166 y 175, lo mas preferentemente dicho peptido de IgE antigenico esta constituido
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
por una secuencia de aminoacidos de la SEC ID N.°: 154 o 165.
En otra realizacion, el peptido de IgE antigenico del segundo inmunogeno esta constituido por una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251,
252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261,262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271,272, 273, 274,
275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291,292, 293, 294, 295, 296, 297,
298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309 y 310, preferentemente del grupo constituido por las SEC
ID N.°s: 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 256, 257, 258, 259, 260, 261,262, 263, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 283, 284, 285, 286, 287, 290, 291, 292, 293, 296, 297, 298, 301, 302 y 305, mas preferentemente del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 256, 257, 258, 259, 260, 266, 267, 268, 269, 275, 276, 277, 283, 284 y 290, aun mas preferentemente del grupo constituido por las sEc ID N.°s: 220, 221, 222, 223, 224, 233, 234, 235, 236, 245, 246, 247, 256, 257 y 266, aun mas preferentemente del grupo constituido por las sEc ID N.°s: 220, 221, 222, 233, 234 y 245, lo mas preferentemente dicho peptido de IgE antigenico esta constituido por una secuencia de aminoacidos de la SEC ID N.°: 220 o 233.
En otra mas el peptido de IgE antigenico del segundo inmunogeno esta constituido por una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342,

343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365,

366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388,

389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411,
412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429 y 430, preferentemente del
grupo constituido por las SEC ID N.°s: 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335 , 336, 337, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 353, 354,

355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 365,366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 376, 377, 378, 379, 380, 381,

382, 383, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 395 , 396, 397, 398, 399, 400, 403, 404, 405, 406, 407, 410, 411, 412,
413, 416, 417, 418, 421, 422 y 425, mas preferentemente del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 311, 312, 313,

314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346,

347, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 376, 377, 378, 379, 380, 386, 387, 388, 389,
395, 396, 397, 403, 404 y 410, aun mas preferentemente del grupo constituido por las sEc ID N.°s: 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 326, 327, 328, 329, 330 , 331, 340, 341, 342, 343, 344, 353, 354, 355, 356, 365, 366, 367, 376, 377 y 386, aun mas preferentemente del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 311, 312, 313, 314, 326, 327, 328, 340, 341 y 353, aun mas preferentemente del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 311, 312 y 326, lo mas preferentemente, dicho peptido de IgE antigenico esta constituido por una secuencia de aminoacidos de la SEC ID N.°: 311 o 312.
En una realizacion, la divulgacion se refiere a una composicion que comprende o esta constituida por dos inmunogenos comprendiendo cada uno de estos inmunogenos un peptido de IgE antigenico unido a un vetuculo inmunogenico en la que, el peptido de IgE antigenico del primer inmunogeno esta constituido por una secuencia de aminoacidos de la sEc ID N.°: 1 y el peptido de IgE antigenico del segundo inmunogeno esta constituido por la 165. En otra realizacion, el peptido de IgE antigenico del primer inmunogeno esta constituido por una secuencia de aminoacidos de la SEC ID N.°: 1 y el peptido de IgE antigenico del segundo inmunogeno esta constituido por una secuencia de aminoacidos de la SEC ID N.°: 220. En otra realizacion, el peptido de IgE antigenico del primer inmunogeno esta constituido por una secuencia de aminoacidos de la sEc ID N.°: 1 y el peptido de IgE antigenico del segundo inmunogeno esta constituido por una secuencia de aminoacidos de la SEC ID N.°: 312. Preferentemente, cada peptido de IgE antigenico se conjuga individualmente con el vetuculo inmunogenico.
En una realizacion, la divulgacion se refiere a una composicion que comprende o esta constituida por dos inmunogenos, comprendiendo cada uno de estos inmunogenos un peptido de IgE antigenico divulgado en este documento unido a un vetuculo inmunogenico. Preferentemente, cada peptido de IgE antigenico se conjuga individualmente con el vetuculo inmunogenico. En una realizacion, el peptido de IgE antigenico del primer inmunogeno esta constituido por: una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198,
199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218 y 219, preferentemente del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 192, 193, 194, 195, 196, 199, 200, 201, 202, 205, 206, 207, 210, 211, 214 y 217, mas preferentemente del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 154, 155, 156, 157, 158, 159, 165, 166, 167, 168, 169, 175, 176, 177, 178, 184, 185, 186, 192, 193, 199 y
200, aun mas preferentemente del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 154, 155, 156, 165, 166 y 175, lo mas preferentemente dicho peptido de IgE antigenico esta constituido por una secuencia de aminoacidos de la SEC ID N.°: 154 o 165.
En una realizacion, el peptido de IgE antigenico del segundo inmunogeno esta constituido por una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251,
252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274,
275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297,
298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309 y 310, preferentemente del grupo constituido por las SEC
ID N.°s: 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 256, 257, 258, 259, 260, 261,262, 263, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 283, 284, 285, 286, 287, 290, 291, 292, 293, 296, 297, 298, 301, 302 y 305, mas preferentemente del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 233, 234, 235,
5
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15
20
25
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35
40
45
50
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70
236, 237, 238, 239, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 256, 257, 258, 259, 260, 266, 267, 268, 269, 275, 276, 277, 283, 284 y 290, aun mas preferentemente del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 220, 221, 222, 223, 224, 233, 234, 235, 236, 245, 246, 247, 256, 257 y 266, aun mas preferentemente del grupo constituido por las sEc ID N.°s: 220, 221, 222, 233, 234 y 245, lo mas preferentemente, dicho peptido de igE antigenico esta constituido por una secuencia de aminoacidos de la SEC ID N.°: 220 o 233.
En otra realizacion, el peptido de IgE antigenico del segundo inmunogeno esta constituido por una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 3l1, 312f313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342,
343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365,
366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388,
389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411,
412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429 y 430, preferentemente del
grupo constituido por las SEC ID N.°s: 311, 312, 313, 314t315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 353, 354,
355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 376, 377, 378, 379, 380, 381,
382, 383, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 403, 404, 405, 406, 407, 410, 411, 412,
413, 416, 417, 418, 421, 422 y 425, mas preferentemente del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 311, 312, 313,
314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346,
347, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 376, 377, 378, 379, 380, 386, 387, 388, 389,
395, 396, 397, 403, 404 y 410, aun mas preferentemente del grupo constituido por las sEc ID N.°s: 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 340, 341, 342, 343, 344, 353, 354, 355, 356, 365, 366, 367, 376, 377 y 386, aun mas preferentemente del grupo constituido por las sEc ID N.°s: 311, 312, 313, 314, 326, 327, 328, 340, 341 y 353, aun mas preferentemente del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 311, 312 y 326, lo mas preferentemente, dicho peptido de IgE antigenico esta constituido por una secuencia de aminoacidos de la SEC ID N.°: 311 o 312.
En una realizacion, la divulgacion se refiere a una composicion que comprende o esta constituida por dos inmunogenos comprendiendo cada uno de estos inmunogenos un peptido de IgE antigenico unido a un vetuculo inmunogenico en la que, el peptido de IgE antigenico del primer inmunogeno esta constituido por una secuencia de aminoacidos de la sEc ID N.°: 165 y el peptido de IgE antigenico del segundo inmunogeno esta constituido por la 220. En otra realizacion, el peptido de IgE antigenico del primer inmunogeno esta constituido por una secuencia de aminoacidos de la SEC ID N.°: 165 y el peptido de IgE antigenico del segundo inmunogeno esta constituido por una secuencia de aminoacidos de la SEC ID N.°: 312. Preferentemente, cada peptido de IgE antigenico se conjuga individualmente con el vetuculo inmunogenico.
En una realizacion, la invencion se refiere a una composicion que comprende o esta constituida por dos inmunogenos, comprendiendo cada uno de estos inmunogenos un peptido de IgE antigenico divulgado en este documento unido a un vetuculo inmunogenico. Preferentemente, cada peptido de IgE antigenico se conjuga individualmente con el vetuculo inmunogenico. En una realizacion, el peptido de IgE antigenico del primer inmunogeno esta constituido por: una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241,
242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261,262, 263, 264,
265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287,
288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309 y 310,
preferentemente del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241,242, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251,252, 253, 256, 257, 258, 259,
260, 261, 262, 263, 266, 267, 268, 269, 270, 271,272, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 283, 284, 285, 286, 287, 290,
291, 292, 293, 296, 297, 298, 301, 302 y 305, mas preferentemente del grupo constituido por las sEc ID N.°s: 220, 221,222, 223, 224, 225, 226, 227, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 245, 246, 247,248, 249, 250, 256, 257, 258,
259, 260, 266, 267, 268, 269, 275, 276, 277, 283, 284 y 290, aun mas preferentemente del grupo constituido por las
SEC ID N°: 220, 221, 222, 223, 224, 233, 234, 235, 236, 245, 246, 247, 256, 257 y 266, aun mas preferentemente del grupo constituido por las sEc ID N.°s: 220, 221, 222, 233, 234 y 245, lo mas preferentemente, dicho peptido de IgE antigenico esta constituido por una secuencia de aminoacidos de la SEC ID N.°: 220 o 233.
En una realizacion, el peptido de IgE antigenico del segundo inmunogeno esta constituido por una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342,
343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365,
366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388,
389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411,
412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429 y 430, preferentemente del
grupo constituido por las SEC ID N.°s: 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 326, 327,
328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 353, 354,
355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 376, 377, 378, 379, 380, 381,
382, 383, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 403, 404, 405, 406, 407, 410, 411, 412,
413, 416, 417, 418, 421, 422 y 425, mas preferentemente del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 311, 312, 313,
314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346,
347, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 376, 377, 378, 379, 380, 386, 387, 388, 389,
395, 396, 397, 403, 404 y 410, aun mas preferentemente del grupo constituido por las sEc ID N.°s: 311, 312, 313,
314, 315, 316, 317, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 340, 341, 342, 343, 344, 353, 354, 355, 356, 365, 366, 367, 376,
377 y 386, aun mas preferentemente del grupo constituido por las sEc ID N.°s: 311, 312, 313, 314, 326, 327, 328, 340, 341 y 353, aun mas preferentemente del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 311, 312 y 326, lo mas preferentemente, dicho peptido de IgE antigenico esta constituido por una secuencia de aminoacidos de la SEC ID
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N.°: 311 o 312.
En una realizacion, la invencion se refiere a una composicion que comprende o esta constituida por dos inmunogenos, comprendiendo cada uno de estos inmunogenos un peptido de IgE antigenico unido a un vehmulo inmunogenico en la que, el peptido de IgE antigenico del primer inmunogeno esta constituido por una secuencia de aminoacidos de la SEC ID N°: 220 y el peptido de IgE antigenico del segundo inmunogeno esta constituido por la 312. Preferentemente, cada peptido de IgE antigenico se conjuga individualmente con el vehmulo inmunogenico.
De acuerdo con una realizacion de la presente invencion, el inmunogeno de la composicion divulgado en este documento anteriormente se une, preferentemente se reticula qmmicamente, con un vehmulo inmunogenico bien directamente o bien por medio de un engarce como se divulga en este documento. En una realizacion, el vehmulo inmunogenico es Hemocianina de Lapa Californiana [KLH] o una partmula similar a virus (VLP). En una realizacion preferida, dicho vehmulo inmunogenico es una VLP seleccionada del grupo constituido por VLP de HBcAg, VLP de HBsAg, VLP de Qbeta o cualquier variante divulgada en este documento. En una realizacion aun preferida, dicho vehmulo inmunogenico es una VLP de Qbeta seleccionada del grupo constituido por CP de Qbeta; A1 de Qbeta, Qbeta-240, Qbeta-243, Qbeta-250, Qbeta-251 y Qbeta-259. En una realizacion, la invencion se refiere a una composicion que comprende o esta constituida por dos inmunogenos comprendiendo cada uno de estos inmunogenos un peptido de IgE antigenico divulgado en este documento unido a un vehmulo inmunogenico. En una realizacion, el primer inmunogeno esta constituido por un inmunogeno que comprende una IgE antigenica que esta constituida por, o constituida esencialmente por, una secuencia de aminoacidos de la SEC ID N.°s: 220, 221, 233, 234, 244 y 246, lo mas preferentemente de la sEc ID N°: 220 o 233, que se reticula qmmicamente con una partmula similar a virus de Qbeta (mas preferentemente, Qbeta de la SEC ID N°: 435) por medio de un enlace tioeter, siendo dicho enlace entre un resto de lisina de la VLP y el resto de cistema de dicho peptido de IgE antigenico y el segundo inmunogeno esta constituido por un inmunogeno que comprende una IgE antigenica constituida por, o constituida esencialmente por, una secuencia de aminoacidos de las SEC ID N.°s: 311, 312 y 326, mas preferentemente de la SEC ID N.°: 311 o 312, comprendiendo dicha IgE antigenica ademas en su extremo C-terminal una cistema que se reticula qmmicamente con una partmula similar a virus de Qbeta, mas preferentemente la Qbeta de la SEC ID N.°: 435. Preferentemente cada peptido de IgE antigenico se conjuga individualmente con el vehmulo inmunogenico.
En una realizacion, la divulgacion se refiere a una composicion que comprende o esta constituida por dos inmunogenos, comprendiendo cada uno de estos inmunogenos un peptido de IgE antigenico divulgado en este documento unido a un vehmulo inmunogenico. En una realizacion, el primer inmunogeno esta constituido por un inmunogeno que comprende una IgE antigenica constituida por, o constituida esencialmente por, una secuencia de aminoacidos de las SEC ID N.°s: 220, 221, 233, 234, 244 y 246, mas preferentemente de la SEC ID N.°: 220 o 233, que se reticula qmmicamente con una partmula similar a virus de Qbeta (mas preferentemente, la Qbeta de la SEC ID N.°: 435) por medio de un enlace tioeter, siendo dicho enlace entre un resto de lisina de la VLP y el resto de cistema de dicho peptido de IgE antigenico, el segundo inmunogeno esta constituido por un inmunogeno que comprende una IgE antigenica constituida por, o constituida esencialmente por, una secuencia de aminoacidos de las SEC ID N.°s: 1, 2, 3, 18, 19 o 34, mas preferentemente de la SEC ID N°: 1 o 18, comprendiendo dicha IgE antigenica ademas en su extremo C-terminal una cistema que se reticula qmmicamente con una partmula similar a virus de Qbeta, mas preferentemente la Qbeta de la SEC ID N.°: 435. Preferentemente, cada peptido de IgE antigenico se conjuga individualmente con el vehmulo inmunogenico.
En una realizacion, la invencion se refiere a una composicion que comprende o esta constituida por tres inmunogenos, comprendiendo cada uno de estos inmunogenos un peptido de IgE antigenico descrito en este documento unido a un vehmulo inmunogenico. En una realizacion, el primer inmunogeno esta constituido por un inmunogeno que comprende una IgE antigenica constituida por, o constituida esencialmente por una secuencia de aminoacidos de las SEC ID N.°s: 220, 221, 233, 234, 244 y 246, lo mas preferentemente de la SEC ID N.°: 220 o 233, que se reticula qmmicamente con una partmula similar a virus de Qbeta (mas particularmente, la Qbeta de la SEC ID N°: 435) por medio de un enlace tioeter, siendo dicho enlace entre un resto de lisina de la VLP y el resto de cistema de dicho peptido de IgE antigenico, el segundo inmunogeno esta constituido por un inmunogeno que comprende una IgE antigenica constituida por, o constituida esencialmente por, una secuencia de aminoacidos de las SEC ID N.°s: 311, 312 y 326, lo mas preferentemente de la SEC ID N.°: 311 o 312, comprendiendo dicha IgE antigenica ademas en su extremo C-terminal una cistema que se reticula qmmicamente con una partmula similar a virus de Qbeta, mas preferentemente la Qbeta de la SEC ID N.°: 435 y el tercer inmunogeno esta constituido por un inmunogeno que comprende una IgE antigenica constituida por, o constituida esencialmente por, una secuencia de aminoacidos de las SEC ID N.°s: 1, 2, 3, 18, 19 o 34, lo mas preferentemente, de la SEC ID N°: 1 o 18, comprendiendo dicha IgE antigenica ademas en su extremo C-terminal una cistema que se reticula qmmicamente con una partmula similar a virus de Qbeta, mas preferentemente, la Qbeta de la SEC Id N°: 435. Preferentemente, cada peptido de IgE antigenico se conjuga individualmente con el vehmulo inmunogenico.
En una realizacion, la invencion se refiere a una composicion que comprende o esta constituida por dos inmunogenos, comprendiendo cada uno de estos inmunogenos un peptido de IgE antigenico divulgado en este documento conjugado individualmente con un vehmulo inmunogenico. En una realizacion el primer inmunogeno esta constituido por un inmunogeno que comprende un peptido de IgE antigenico constituido por, o constituido esencialmente por, una secuencia de aminoacidos de las SEC ID N.°s: 220, 221, 233, 234, 244 y 246, lo mas preferentemente de la SEC ID N.°: 220 o 233. Preferentemente dicho primer peptido de IgE antigenico se reticula qmmicamente con una partmula similar a virus de Qbeta (mas preferentemente, la Qbeta de la SEC ID N.°: 435) por medio de un enlace tioeter usando SMPH (succinimidil-6-[p-maleimidopropionamido]hexanoato) como reticulante, siendo dicho enlace entre un resto de lisina de la VLP y el resto de cistema de dicho peptido de IgE antigenico. Preferentemente, el segundo inmunogeno esta constituido por un inmunogeno que comprende un peptido de IgE antigenico constituido por, o constituido esencialmente por, una secuencia de aminoacidos de las SEC ID N.°s: 311, 312 y 326, lo mas preferentemente de la SEC ID N.°: 311 o 312. Preferentemente, dicho segundo peptido de IgE antigenico comprende ademas en su extremo C-terminal un engarce GC, preferentemente un engarce que tiene la formula GGC (comprendiendo preferentemente dicho segundo peptido de IgE antigenico en su extremo C-terminal un engarce GC constituido por, o constituido esencialmente por la secuencia de aminoacidos de la SEC ID N.°: 457),
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que se reticula qmmicamente con una partmula similar a virus por medio de un enlace tioeter usando SMPH (succinimidil-6-[p-maleimidopropionamido]hexanoato) como reticulante, siendo dicho enlace entre un resto de lisina de la VLP y el resto de cistema de dicho engarce C-terminal. En una realizacion preferida, dicha VLP se selecciona del grupo constituido por HBcAg, HBsAg y Qbeta. Preferentemente, dicha VLP es Qbeta, aun mas preferentemente, la Qbeta de la SEC ID N.°: 435.
En una realizacion, la divulgacion se refiere a una composicion que comprende o esta constituida por dos, tres, cuatro o mas inmunogenos comprendiendo cada uno de estos inmunogenos un peptido de IgE antigenico unido a un vehmulo inmunogenico y estando dicho peptido de IgE antigenico constituido por, o estando esencialmente constituido por una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69,
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71, 72, 73, 74, 75, 76, 77 , 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, CO 88, 89, 90 , 91, 92, 93, 94 , 95, 96, 97, 98, 99,
100,
101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122,
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124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145,
146,
147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168,
169,
170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191,
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216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237,
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239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260,
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308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329,
330,
331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352,
353,
354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375,
376,
377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398,
399,
400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421,
422,
423, 424, 425 , 426 , 427 , 428 , 429 i y 430. En una realizacion, dichos peptidos de IgE antigenicos se unen al
mismo vehmulo inmunogenico. En otra realizacion, dichos peptidos de IgE antigenicos se unen a un vehmulo inmunogenico diferente y despues se mezclan.
Procedimiento de produccion del inmunogeno de la divulgacion
La divulgacion se refiere ademas a un procedimiento para la produccion del inmunogeno divulgado en este documento. En una realizacion dicho inmunogeno comprende al menos un peptido de IgE antigenico divulgado en este documento unido a un vehmulo inmunogenico divulgado en este documento. Por lo tanto la divulgacion se refiere ademas a un procedimiento para la produccion de un inmunogeno que comprende la etapa de unir al menos un peptido de IgE antigenico divulgado en este documento a un vehmulo inmunogenico divulgado en este documento. En una realizacion, dicho enlace se realiza por reticulacion qrnmica, directamente o por medio de un engarce, en particular un engarce GC (por ejemplo, una cistema) como se divulga en este documento. En una realizacion, la invencion se refiere a un procedimiento para la produccion de un inmunogeno que comprende la etapa de unir al menos un peptido de IgE antigenico divulgado en este documento, que comprende opcionalmente ademas un engarce como se divulga en este documento, a una VLP divulgada en este documento, realizandose dicho enlace por reticulacion qrnmica, bien directamente o bien por medio de un engarce, en particular un engarce GC (por ejemplo una cistema) como se divulga en este documento. En una realizacion particular, cuando la secuencia del peptido de IgE antigenico divulgado en este documento comprende una cistema, dicho peptido de IgE antigenico se une covalentemente a la VLP directamente por medio de dicha cistema. En dicha realizacion, el procedimiento incluye una etapa de reticulacion qrnmica como se describe en este documento y preferentemente usando un reticulante heterobifuncional (por ejemplo, ester de W-gamma-maleimido-butiriloxi-succinimida (GMBS) o succinimidil-6-[p-maleimidopropionamido']hexanoato (SMPH)). Por lo tanto en algunas realizaciones, la etapa de reticulacion qrnmica da como resultado que la VLP se entrecruce por medio de un enlace tioeter, siendo dicho enlace entre un resto de lisina de la VLP y el resto de cistema de dicha IgE antigenica. En una realizacion preferida, dicha VLP es preferentemente una partmula similar a virus de Qbeta (aun mas preferentemente, la Qbeta de la SEC ID N.°: 435). Una realizacion adicional de la presente divulgacion se refiere a un inmunogeno que puede obtenerse mediante el procedimiento divulgado en este documento.
Composiciones que comprenden un peptido de IgE antigenico de la invencion
La presente divulgacion se refiere ademas a composiciones, particularmente composiciones inmunogenicas tambien denominadas “composiciones inmunogenicas objeto”, que comprenden un peptido de IgE antigenico de la invencion, preferentemente unido a un vehmulo inmunogenico, mas preferentemente una VLP, aun mas preferentemente una VLP de HBsAg, HbcAg o Qbeta y opcionalmente, al menos un adyuvante. Dichas composiciones inmunogenicas, particularmente cuando se formulan como composiciones farmaceuticas, se consideran utiles para prevenir, tratar o aliviar trastornos relacionados con IgE.
En algunas realizaciones, una composicion inmunogenica objeto de acuerdo con la divulgacion comprende un peptido de IgE antigenico que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada de las SEC ID N.°s: 1 a 430 y variantes funcionalmente activas de las mismas, preferentemente del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1 a 430, mas preferentemente del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1 a 153 y 220 a 430, aun mas preferentemente, del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 220 a 430. En alguna realizacion, dicho peptido de IgE antigenico se une a un vehmulo inmunogenico, preferentemente una VLP, mas preferentemente a una VLP de HBsAg, HbcAg o Qbeta. Una composicion inmunogenica objeto que comprende un peptido de IgE antigenico de acuerdo con la invencion puede formularse de varias formas, como se describe en mas detalle a continuacion.
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En algunas realizaciones, una composicion inmunogenica objeto comprende una sola especie de peptido de IgE antigenico, por ejemplo, la composicion inmunogenica comprende una poblacion de peptidos de IgE antigenicos, teniendo sustancialmente todos la misma secuencia de aminoacidos. En otras realizaciones, una composicion inmunogenica objeto comprende dos o mas peptidos de IgE antigenicos diferentes, por ejemplo, la composicion inmunogenica comprende una poblacion de peptidos de IgE antigenicos, pudiendo los miembros de dicha poblacion diferir en la secuencia de aminoacidos. Una composicion inmunogenica objeto puede comprender de dos a aproximadamente 20 peptidos de IgE antigenicos diferentes, por ejemplo, una composicion inmunogenica objeto puede comprender 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11-15 o 15-20 peptidos de IgE antigenicos diferentes, teniendo cada uno un aminoacido que difiere de las secuencias de aminoacidos de los otros peptidos de IgE antigenicos.
Por ejemplo, en algunas realizaciones, una composicion inmunogenica objeto comprende un primer peptido de IgE antigenico, preferentemente unido a un vetuculo inmunogenico, mas preferentemente a una VLP, aun mas preferentemente a una VLP de HBsAg, HbcAg o Qbeta y que comprende una primera secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1 a 430, mas preferentemente del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1 a 153 y 220 a 430, aun mas preferentemente del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 220 a 430; y al menos un segundo peptido de IgE antigenico, preferentemente unido a un vetuculo inmunogenico, mas preferentemente a una vLp, aun mas preferentemente a una VLP de HBsAg, HbcAg o Qbeta y que comprende una segunda secuencia de aminoacidos, preferentemente seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1 a 430, mas preferentemente del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1 a 153 y 220 a 430, aun mas preferentemente del grupo constituido por las sEc ID N.°s: 220 a 430; difiriendo la segunda secuencia de aminoacidos de la primera secuencia de aminoacidos en al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6 a 10 o 15 aminoacidos. En una realizacion adicional, el primer peptido de IgE antigenico comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N°: 311 a 430 y dicho segundo peptido de IgE antigenico comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1 a 310, preferentemente del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 220 a 310, o de las SEC ID N.°s: 1 a 153 o de las SEC ID N.°s: 154 a 219, mas preferentemente del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 220 a 310. En otra realizacion adicional, el primer peptido de IgE antigenico comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las sEc ID N.. 220 a 310 y dicho segundo peptido de IgE antigenico comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1 a 219 y 311 a 430, mas preferentemente del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 311 a 430 o de las SEC ID N.°s: 1 a 153, o de las SEC ID N.°s: 154 a 219, mas preferentemente del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 311 a 430. En otra realizacion adicional, el primer peptido de IgE antigenico comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1 a 153 y dicho segundo peptido de IgE antigenico comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 154 a 430, preferentemente del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 220 a 310, de las SEC ID N.°s: 311 a 430 o de las SEC ID N.°s: 154 a 219. En otra realizacion adicional, el primer peptido de IgE antigenico comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 154 a 219 y dicho segundo peptido de IgE antigenico comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1 a 153 y 220 a 430, preferentemente del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 220 a 310, o de las SEC ID N.°s: 1 a 153, o de las SEC ID N.°s: 311 a 430.
Como otro ejemplo, una composicion inmunogenica objeto comprende un primer peptido de IgE antigenico, preferentemente unido a un vehfculo inmunogenico, mas preferentemente a una VLP, aun mas preferentemente a una VLP de HBsAg, HbcAg o Qbeta y que comprende una primera secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las sEc ID N.°s: 1 a 430; un segundo peptido de IgE antigenico, preferentemente unido a un vetuculo inmunogenico, mas preferentemente a una VLP, aun mas preferentemente a una VLP de HBsAg, HbcAg o Qbeta y que comprende una segunda secuencia de aminoacidos, preferentemente seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1 a 430, difiriendo la segunda secuencia de aminoacidos de la primera secuencia de aminoacidos en al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6 a 10 o 15 aminoacidos; y al menos un tercer polipeptido de IgE antigenico, preferentemente unido a un vetuculo inmunogenico, mas preferentemente a una VLP, aun mas preferentemente a una VLP de HBsAg, HbcAg o Qbeta y que comprende una tercera secuencia de aminoacidos, preferentemente seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1 a 430, difiriendo la tercera secuencia de aminoacidos tanto de la primera como de la segunda secuencia de aminoacidos en al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6 a 10 o 15 aminoacidos. En una realizacion adicional, el primer peptido de IgE antigenico comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 311 a 430; y dicho segundo y tercer peptidos de IgE antigenicos comprenden una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1 a 310, preferentemente del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 220 a 310 o de las SEC ID N.°s: 1 a 153 o de las SEC ID N.°s: 154 a 219.
En otra realizacion adicional, el primer peptido de IgE antigenico comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s 220 a 310 y dichos segundo y tercer peptidos de IgE antigenicos comprenden una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1 a 219 y 311 a 430, preferentemente del grupo constituido por las SEC ID N.°s 311 a 430 o de las SEC ID N.°s: 1 a 153 o de las SEC ID N.°s: 154 a 219.
En otras realizaciones, una composicion inmunogenica objeto comprende un polipeptido de IgE antigenico multimerizado, como se ha descrito anteriormente. Como se usa en este documento, las expresiones “composicion inmunogenica que comprende un peptido de IgE antigenico” o “composicion inmunogenica de la invencion” o “composicion inmunogenica objeto” se refieren a una composicion inmunogenica que comprende una sola especie (multimerizada o no) o multiples especies de un peptido o peptidos de IgE antigenicos acoplados o no a un vetuculo inmunogenico. Cuando se usan dos o mas peptidos acoplados a un vetuculo, el peptido puede acoplarse a la misma molecula de vetuculo o acoplarse individualmente a moleculas de vetuculo y despues combinarse para producir una composicion inmunogenica. Otro aspecto de la divulgacion se refiere a procedimientos para producir un inmunogeno de acuerdo con la invencion, comprendiendo dicho procedimiento el acoplamiento de un peptido de IgE antigenico a un vehfculo inmunogenico. En una realizacion, dicho acoplamiento es qrnmico.
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En algunas realizaciones, una composicion inmunogenica objeto comprende al menos un adyuvante. Los adyuvantes adecuados incluyen los adecuados para uso en mamnferos, preferentemente en seres humanos. Los ejemplos de adyuvantes adecuados conocidos que pueden usarse en seres humanos incluyen, pero no necesariamente se limitan a, alumbre, fosfato de aluminio, hidroxido de aluminio, MF59 (escualeno al 4,3 % p/v, polisorbato 80 (Tween 80) al 0,5 % p/v, trioleato de sorbitan (Span 85) al 0,5 % p/v, acido nucleico que contiene CpG (en el que la citosina no esta metilada), QS21 (adyuvante de saponina), MPL (Monofosforil Lfpido A), 3DMPL (MPL 3-O-desacilado), extractos de Aquilla, ISCOMS (vease, por ejemplo, Sjolander y col. (1998) J. Leukocyte Biol. 64: 713; documentos WO90/03184, W096/11711, WO 00/48630, W098/36772, WO00/41720, WO06/134423 y WO07/026190), mutantes de LT/CT, micropartfculas de poIi(D,L-lactida-co-glicolida) (PLG), Quil A, interleucinas y similares. Para aplicaciones veterinarias incluyendo, pero sin limitacion, la experimentacion animal, se puede usar adyuvante de Freund, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-nor-muramil-L-alanil-D- isoglutamina (CGP 11637, denominada nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'- dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (CGP 19835A, denominada MTP-PE) y RIBI, que contiene tres componentes extrafdos de bacterias, monofosforil lfpido A, dimicolato de trehalosa y esqueleto de pared celular (MPL + TDM + CWS) en una emulsion de escualeno/Tween 80 al 2 %.
Los adyuvantes ejemplares adicionales para aumentar la eficacia de la composicion incluyen, pero sin limitacion: (1) formulaciones de emulsion de aceite en agua (con o sin otros agentes inmunoestimulantes espedficos tales como peptidos muramilo (vease a continuacion) o componentes de la pared celular bacteriana) tales como, por ejemplo, (a) MF59™ (documento WO90/14837; Capttulo 10 en Vaccine design: the subunit and adjuvant approach, eds. Powell & Newman, Plenum Press 1995), que contiene Escualeno al 5 %, Tween 80 al 0,5 % (monooleato de polioxietilensorbitan) y Span 85 (trioleato de sorbitan) al 0,5 % (que contiene opcionalmente tripeptido muramilo unido covalentemente a dipalmitoil fosfatidiletanolamina (MTP-PE)) formulado en partfculas submicrometricas usando un microfuidficador, (b) SAF, que contiene Escualeno al 10 %, Tween 80 al 0,4 %, polfmero bloqueado con pluronico L121 al 5 % y thr-MDP microfluidizado en una emulsion submicrometrica o agitado vorticialmente para generar una emulsion de mayor tamano de partfcula y (c) sistema adyuvante RIBI™ (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) que contiene Escualeno al 2 %, Tween 80 al 0,2 % y uno o mas componentes de pared celular bacteriana tales como monofosforil lfpido A (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM) y esqueleto de pared celular (CWS), preferentemente MPL + CWS (DETOX™); (2) pueden usarse adyuvantes de saponina, tales como QS21, STIMULON™ (Cambridge Bioscience, Worcester, Ma), Abisco® (Isconova, Suecia) o Iscomatrix® (Commonwealth Serum Laboratories, Australia), o partfculas generadas a partir de los mismos tales como ISCOM (complejos inmunoestimulantes), pudiendo dichos ISCOM estar desprovistos de detergente adicional, por ejemplo, documento WO00/07621; (3) Adyuvante completo de Freund (CFA) y Adyuvante Incompleto de Freund (IFA); (4) citocinas, tales como interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, lL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 (documento WO99/44636), etc.), interferones (por ejemplo, interferon gamma), factor estimulante de colonias de macrofagos (M-CSF), factor de necrosis tumoral (TNF), etc.; (5) monofosforil lfpido A (MPL) o MPL 3-O-desacilado (3dMPL) por ejemplo documentos GB-2220221, EP-A-0689454, opcionalmente en ausencia sustancial de alumbre cuando se usa con sacaridos neumococicos por ejemplo documento WO00/56358; (6) combinaciones de 3dMPL con, por ejemplo, QS21 y/o emulsiones de aceite en agua por ejemplo documentos EP-A-0835318, EP-A-0735898, EP-A-0761231; (7) oligonucleotidos que comprenden motivos CpG [Krieg Vaccine 2000, 19, 618-622; Krieg Curr opin Mol Ther 2001 3: 15-24; Roman y col., Nat Med., 1997, 3, 849-854; Weiner y col., PNAS USA, 1997, 94, 10833-10837; Davis y col., J. Immunol, 1998, 160, 870-876; Chu y col., J. Exp. Med, 1997, 186, 1623-1631; Lipford y col., Ear. J. Immunol., 1997, 27, 2340-2344; Moldoveami y col., Vaccine, 1988, 16, 1216-1224, Krieg y col., Nature, 1995, 374, 546-549; Klinman y col., PNAS USA, 1996, 93, 2879-2883; Ballas y col., J. Immunol, 1996, 157, 1840-1845; Cowdery y col, J. Immunol, 1996, 156, 4570-4575; Halpern y col., Cell Immunol, 1996, 167, 72-78; Yamamoto y col., Jpn. J. Cancer Res., 1988, 79, 866-873; Stacey y col., J. Immunol., 1996, 157, 2116-2122; Messina y col., J. Immunol, 1991, 147, 1759-1764; Yi y col., J. Immunol, 1996, 157,4918-4925; Yi y col., J. Immunol, 1996, 157, 5394-5402; Yi y col., J. Immunol, 1998, 160, 4755-4761; y Yi y col., J. Immunol, 1998, 160, 5898-5906; Solicitudes de Patente Internacional WO96/02555, WO98/16247, WO98/18810, WO98/40100, W098/55495, W098/37919 y W098/52581], es decir que contiene al menos un dinucleotido Cg, en el que la citosina no esta metilada; (8) un eter de polioxietileno o un ester de polioxietileno por ejemplo documento WO99/52549; (9) un tensioactivo de ester de poliexietilensorbitan en combinacion con un octoxinol (documento WO01/21207) o un tensioactivo de eter o ester alqrnlico de polioxietileno en combinacion con al menos un tensioactivo no ionico adicional tal como octoxinol (documento WO01/21152); (10) una saponina y un oligonucleotido inmunoestimulador (por ejemplo un oligonucleotido CpG) (documento WO00/62800); (11) un inmunoestimulante y una partfcula de sal de metal, por ejemplo, documento WO00/23105; (12) una saponina y una emulsion de aceite en agua, por ejemplo, documento WO99/11241; (13) una saponina (por ejemplo, QS21) + 3dMPL + SM2 (opcionalmente + un esterol), por ejemplo, documento W098/57659; (14) otras sustancias que actuan como agentes inmunoestimulantes para aumentar la eficacia de la composicion, tales como peptidos Muramilo incluyen N- acetil-muramil-L-treoniI-D-isoglutamina (thr-MDP), N-25 acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N- acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutarinil-L-alanin-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina MTP-PE),
(15) ligandos para receptores de tipo peaje (toll) (TLR), naturales o sintetizados (por ejemplo, como se describe en Kanzler y col. 2007, Nature Medicine 13, pags. 1552-9), incluyendo ligandos de TLR3 tales como polil: C y compuestos similares tales como Hiltonol y Ampligen.
En una realizacion, la composicion inmunogenica de la presente invencion comprende al menos un adyuvante. En una realizacion particular, dicho adyuvante es un oligonucleotido inmunoestimulador y mas preferentemente un oligonucleotido CpG. En una realizacion, el oligonucleotido CpG tiene la secuencia de acido nucleico 5' TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT 3' (ODN CpG 24555; SEC ID N.°: 431). La secuencia de acido nucleico del oligonucleotido inmunoestimulador de la SEC ID N.°: 431 difiere de un oligonucleotido inmunoestimulador previamente descrito (ODN 10103) 5' TCGTCGTTTTTCGGTCGTTTT 3' (SEC ID N°: 432) por la inversion del dinucleotido CG mas 3'. Las similitudes en la actividad entre estos dos oligonucleotidos inmunoestimuladores es sorprendente porque se ha descrito previamente porque la actividad inmunoestimuladora de oligonucleotidos CpG depende del numero de motivos CpG, de las secuencias que flanquean el dinucleotido CG, de la localizacion del motivo o motivos CpG y de la separacion entre los motivos CpG (Ballas y col., 1996, J. Immunol.; Hartmann y col., 2000, J. Immunol.; Klinman y col., 2003, Clin. Exp. Immunol.). La eliminacion del dinucleotido CG mas 3' en el oligonucleotido inmunoestimulador CpG ODN 24555 (SEC ID N°: 431) no dio como resultado un impacto negativo
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sobre la capacidad de este oligonucleotido inmunoestimulador para aumentar respuestas inmunes espedficas de antigeno como se habna esperado de descripciones anteriores. El CpG ODN 24555 demostro una actividad inmunoestimuladora similar y en algunos casos aumentada cuando se comparaba con el CpG ODN 10103.
El oligonucleotido inmunoestimulador puede ser bicatenario o monocatenario. Generalmente, las moleculas bicatenarias son mas estables in vivo, mientras que las moleculas monocatenarias tienen una actividad inmune aumentada. Por lo tanto, en algunos aspectos de la invencion se prefiere que el acido nucleico sea monocatenario y en otros aspectos se prefiere que el acido nucleico sea bicatenario.
Las expresiones “acido nucleico” y “oligonucleotido” se usan indistintamente en este documento para referirse a multiples nucleotidos (es decir, moleculas que comprenden un azucar (por ejemplo, ribosa o desoxirribosa) unido a un grupo fosfato y a una base organica intercambiable, que es una pirimidina sustituida (por ejemplo, citosina (C), timidina (T) o uracilo (U)) o una purina sustituida (por ejemplo, adenina (A) o guanina (G)). Como se usa en este documento, la expresion se refiere a oligorribonucleotidos (es decir, un polinucleotido menos el fosfato) y cualquier otro polfmero que contiene una base organica. Pueden obtenerse moleculas de acido nucleico de fuentes de acido nucleico existentes (por ejemplo, genomico o ADNc), pero preferentemente son sinteticas (por ejemplo, producidas por smtesis de acidos nucleicos).
En una realizacion, los oligonucleotidos inmunoestimuladores pueden incluir diversas modificaciones y sustituciones qmmicas en comparacion con el ARN y ADN natural, que impliquen un puente internucleosfdico fosfodiester, una unidad de p-D-ribosa y/o una base de nucleosido natural (adenina, guanina, citosina, timina o uracilo). El especialista conoce ejemplos de modificaciones qmmicas y se describen, por ejemplo, en Uhlmann E. y col. (1990), Chem. Rev. 90: 543; “Protocols for Oligonucleotides and Analogs” Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques, S. Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa, USA 1993; Crooke, S.T. y col. (1996) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 36: 107-129; y Hunziker J. y col., (1995), Mod. Synth. Methods 7: 331-417. Un oligonucleotido de acuerdo con la invencion puede tener una o mas modificaciones, encontrandose cada modificacion en un puente internucleosfdico fosfodiester particular y/o en una unidad de p-D-ribosa particular y/o en una posicion de base de nucleosido natural particular en comparacion con un oligonucleotido de la misma secuencia que esta compuesto por ADN o ARN natural.
Por ejemplo, los oligonucleotidos pueden comprender una o mas modificaciones. Dichas modificaciones pueden seleccionarse de: a) la sustitucion de un puente internucleosfdico fosfodiester localizado en el extremo 3' y/o 5' de un nucleosido por un puente internucleosfdico modificado, b) la sustitucion de un puente fosfodiester localizado en el extremo 3' y/o 5' de un nucleosido por un puente desfosfo, c) la sustitucion de una unidad de fosfato de azucar de la estructura de fosfato de azucar por otra unidad, d) la sustitucion de una unidad de p-D-ribosa por una unidad de azucar modificada y e) la sustitucion de una base de nucleosido natural.
Los acidos nucleicos tambien incluyen purinas y pirimidinas sustituidas, tales como bases modificadas de pirimidina con propino C-5 y de purina 7-desaza-7-substituida (Wagner y col., 1996, Nat. Biotechnol. 14: 840-4). Las purinas y pirimidinas incluyen, pero sin limitacion, adenina, citosina, guanina, timidina, 5-metilcitosina, 2-aminopurina, 2-amino- 6-cloropurina, 2,6-diaminopurina, hipoxantina y otras nucleobases de origen natural y no natural y restos aromaticos sustituidos y no sustituidos. Los especialistas en la tecnica conocen bien otras modificaciones de este tipo.
Una base modificada es cualquier base que sea qmmicamente diferente de las bases de origen natural que se encuentran tfpicamente en el ADN y ARN, tales como T, C, G, A y U pero que comparten estructuras qmmicas basicas con estas bases de origen natural. La base de nucleosido modificado puede seleccionarse, por ejemplo, de hipoxantina, dihidrouracilo pseudouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-aminouracilo, 5-alquiluracilo (C-i-Ca), 5- alqueniluracilo (C2-C6), 5-alquiniluracilo (C2-C6), 5-(hidroximetil)uracilo, 5-clorouracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-hidroxicitosina, 5-alquilcitosina (C1-C6), 5-alquenilcitosina (C2-C6), 5-alquinilcitosina (C2-C6), 5-clorocitosina, 5- fluorocitosina, 5-bromocitosina, N2-dimetilguanina, 2,4-diamino-purina, 8-azapurina, una 7-desazapurina sustituida, preferentemente 7-desaza-purina 7-sustituida y/o 7-desaza-purina 8-substituida, 5-hidroximetilcitosina, N4- alquilcitosina (por ejemplo, N4-etilcitosina), 5-hidroxidesoxicitidina, 5-hidroximetildesoxicitidina, N4- alquildesoxicitidina, por ejemplo, N4-etildesoxicitidina, 6-tiodesoxiguanosina y desoxirribonucleosidos de nitropirrol, C5-propinilpirimidina, diaminopurina por ejemplo, 2,6-diaminopurina, inosina, 5-metilcitosina, 2-aminopurina, 2- amino-6-cloropurina, hipoxantina u otras modificaciones de una base de nucleosido natural. Esta lista pretende ser ejemplar y no debe considerarse limitante.
En algunos aspectos de la invencion, el dinucleotido CpG de los oligonucleotidos inmunoestimuladores descritos en este documento esta preferentemente no metilado. Un motivo CpG no metilado es una secuencia dinucleotfdica de citosina-guanina no metilada (es decir, una citosina 5' no metilada seguida de guanosina 3' y unida por un enlace fosfato). En otros aspectos, los motivos CpG estan metilados. Un motivo CpG metilado es una secuencia dinucleotfdica de citosina-guanina metilada (es decir, una citosina 5' metilada seguida de una guanosina 3' y unida por un enlace fosfato).
En algunos aspectos de la invencion, un oligonucleotido inmunoestimulador puede contener una citosina modificada. Una citosina modificada es un analogo de base de pirimidina de origen natural o de origen no natural de citosina que puede sustituir a esta base sin afectar a la actividad inmunoestimuladora del oligonucleotido. Las citosinas modificadas incluyen, pero sin limitacion, citosinas sustituidas en posicion 5 (por ejemplo, 5-metil-citosina, 5-fluoro- citosina, 5-cloro-citosina, 5-bromo-citosina, 5-yodo-citosina, 5-hidroxi-citosina, 5-hidroximetil-citosina, 5-difluorometil- citosina y 5-alquinil-citosina no sustituida o sustituida), citosinas sustituidas en posicion 6, citosinas sustituidas en posicion N4 (por ejemplo N4-etil-citosina), 5-aza-citosina, 2-mercapto-citosina, isocitosina, pseudo-isocitosina, analogos de citosina con sistemas de anillo condensado (por ejemplo, N,N-propilencitosina o fenoxazina) y uracilo y sus derivados (por ejemplo, 5-fluoro-uracilo, 5-bromo-uracilo, 5-bromovinil-uracilo, 4-tio-uracilo, 5-hidroxi-uracilo, 5- propinil-uracilo). Algunas de las citosinas preferidas incluyen 5-metil-citosina, 5-fluoro-citosina, 5-hidroxi-citosina, 5- hidroximetil-citosina y N4-etil-citosina. En otra realizacion de la invencion, la base de citosina esta sustituida por una base universal (por ejemplo 3-nitropirrol, base P), un sistema de anillo aromatico (por ejemplo, fluorobenceno o
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difluorobenceno) o un atomo de hidrogeno (dSpacer).
En algunos aspectos de la invencion, un oligonucleotido inmunoestimulador puede contener una guanina modificada. Una guanina modificada es un analogo de base de purina de origen natural o de origen no natural de guanina que puede sustituir a esta base sin afectar a la actividad inmunoestimuladora del oligonucleotido. Las guaninas modificadas incluyen, pero sin limitacion, 7-desazaguanina, guanina 7-desaza-7-sustituida, hipoxantina, guaninas W2-sustituidas (por ejemplo, W2-metil-guanina), 5-amino-3-metil-3H,6H-tiazol[4,5-d]pirimidin-2,7-diona, 2,6- diaminopurina, 2-aminopurina, purina, indol, adenina, adeninas sustituidas (por ejemplo, W6-metil-adenina, 8-oxo- adenina), guanina 8-sustituida (por ejemplo, 8-hidroxiguanina u 8-bromoguanina) y 6-tioguanina. En otra realizacion de la invencion, la base de guanina esta sustituida por una base universal (por ejemplo, 4-metil-indol, 5-nitro-indol o base K), un sistema de anillo aromatico (por ejemplo, benzimidazol o dicloro-benzimidazol, amida del acido 1-metil- 1H-[1,2,4]triazol-3-carboxflico) o un atomo de hidrogeno (dSpacer)).
En determinados aspectos, los oligonucleotidos pueden incluir enlaces internucleotfdicos modificados. Estos enlaces modificados pueden ser parcialmente resistentes a degradacion (por ejemplo, estan estabilizados). Una “molecula de acido nucleico estabilizada” se referira a una molecula de acido nucleico que es relativamente resistente a degradacion in vivo (por ejemplo, mediante una exo- o endonucleasa). La estabilizacion puede estar en funcion de la longitud o de la estructura secundaria. Los acidos nucleicos que tienen una longitud de decenas a cientos de kilobases son relativamente resistentes a la degradacion in vivo. Para acidos nucleicos mas cortos, la estructura secundaria puede estabilizar y aumentar su efecto. La formacion de una estructura de tallo-bucle puede estabilizar una molecula de acido nucleico. Por ejemplo, si el extremo 3' de un acido nucleico tiene autocomplementariedad con una region cadena arriba de modo que puede plegarse hacia atras y formar una estructura de tallo-bucle, entonces el acido el nucleico puede estabilizarse y presentar mas actividad.
La estabilizacion de acido nucleico tambien puede conseguirse mediante modificaciones de la cadena principal de fosfato. Los oligonucleotidos que tienen enlaces fosforotioato, en algunas realizaciones, pueden proporcionar una actividad maxima y proteger al oligonucleotido de la degradacion por exo- y endonucleasas intracelulares.
Para uso in vivo, los acidos nucleicos son preferentemente relativamente resistentes a degradacion (por ejemplo, mediante endo- y exonucleasas). Se ha demostrado que la modificacion de la cadena principal de acido nucleico proporciona una actividad aumentada de los acidos nucleicos cuando se administran in vivo. Las estructuras secundarias, tales como tallos-bucles, pueden estabilizar a los acidos nucleicos frente a la degradacion. Como alternativa, la estabilizacion de acidos nucleicos puede conseguirse por modificaciones de la cadena principal de fosfato. Un acido nucleico estabilizado preferido tiene al menos una cadena principal modificada con fosforotioato parcial. Los fosforotioatos pueden sintetizarse usando tecnicas automatizadas que emplean bien qmmica de fosforamidato o bien H-fosfonato. Pueden generarse aril- y alquil-fosfonatos por ejemplo, como se describe en la Patente de Estados Unidos N.°: 4.469.863; y pueden generarse alquilfosfotriesteres (en los que el resto oxfgeno cargado esta alquilado como se describe en la Patente de Estados Unidos N.°: 5.023.243 y en la Patente Europea N.°: 092.574) mediante smtesis en fase solida automatizada usando reactivos disponibles en el mercado. Se han descrito procedimientos para generar otras modificaciones y sustituciones de la cadena principal de ADN (Uhlmann, E. y Peyman, A. (1990) Chem. Rev. 90: 544; Goodchild, J. (1990) Bioconjugate Chem. 1: 165). Los acidos nucleicos 2'-O-metilo con motivos CpG tambien causan activacion inmune, asf como los acidos nucleicos CpG modificados con etoxi. De hecho, no se han descubierto modificaciones de la cadena principal que supriman completamente el efecto de CpG, aunque se reduce enormemente por sustitucion de la C con una 5-metil C. Las construcciones que tienen enlaces fosforotioato proporcionan una actividad maxima y protegen al acido nucleico de la degradacion por exo- y endonucleasas intracelulares. Otros acidos nucleicos modificados incluyen acidos nucleicos modificados con fosfodiester, combinaciones de acido nucleico con fosfodiester y fosforotioato, metilfosfonato, metilfosforotioato, fosforoditioato, p-etoxi y combinaciones de los mismos. Cada una de estas combinaciones y sus efectos particulares sobre las celulas inmunes se analizan en mas detalle con respecto a acidos nucleicos CpG en la Solicitudes de Patente PCT Publicadas PCT/US95/01570 (documento WO 96/02555) y PCT/US97/19791 (documento WO 98/18810) y en la Patente de Estados Unidos N.°: 6.194.388 B1 expedida el 27 de febrero de 2001 y la Patente de Estados Unidos N.°: 6.239.116 B1 expedida el 29 de mayo de 2001. Se piensa que estos acidos nucleicos modificados pueden mostrar mas actividad estimuladora debido a la resistencia a nucleasas aumentada, a una captacion celular aumentada y a una union a protemas aumentada y/o una localizacion intracelular alterada.
Para la administracion in vivo, los acidos nucleicos pueden asociarse con una molecula que de como resultado una union con mayor afinidad a una superficie de celula diana (por ejemplo, celula B, celula monodtica o celula asesina natural (NK)) y/o una captacion celular aumentada por celulas diana para formar un "complejo de suministro de acido nucleico". Los acidos nucleicos pueden asociarse ionicamente o covalentemente con moleculas apropiadas usando procedimientos que son bien conocidos en la tecnica. Pueden usarse una diversidad de agentes de acoplamiento o reticulacion tales como protema A, carbodiimida o W-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP). Como alternativa, los acidos nucleicos pueden encapsularse en liposomas o virosomas usando tecnicas bien conocidas.
Otros acidos nucleicos estabilizados incluyen, pero sin limitacion, analogos de ADN no ionicos tales como alquil- y aril-fosfatos (en los que el oxfgeno de fosfonato cargado se sustituye por un grupo alquilo o arilo), fosfodiester y alquilfosfotriesteres, en los que el resto de oxfgeno cargado esta alquilado. Los acidos nucleicos que contienen un diol, tales como tetraetilenglicol o hexaetilenglicol, en cualquiera o ambos extremos terminales tambien han demostrado ser sustancialmente resistentes a la degradacion por nucleasas. En algunas realizaciones, un oligonucleotido inmunoestimulador de la invencion puede incluir al menos un analogo de nucleotido sustituido lipofilo y/o un dinucleotido de pirimidina-purina.
Los oligonucleotidos pueden tener uno o dos extremos 5' accesibles. Es posible generar oligonucleotidos modificados que tengan dos extremos 5' de este tipo, por ejemplo, por union de dos oligonucleotidos a traves de un enlace 3'-3' para generar un oligonucleotido que tenga uno o dos extremos 5' accesibles. El enlace 3'-3' puede ser un fosfodiester, fosforotioato o cualquier otro puente internucleosfdico modificado. Se conocen en la tecnica procedimientos para realizar dichos enlaces. Por ejemplo, dichos enlaces se han descrito en Seliger, H. y col.,
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Oligonucleotide analogs with terminal 3'-3' and 5'-5'-internucleotidic linkages, Nucleosides & Nucleotides (1991), 10 (1-3), 469-77 y Jiang y col., Pseudo-cyclic oligonucleotides: in vitro and in vivo properties, Bioorganic & Medicinal Chemistry (1999), 7 (12), 2727-2735.
Ademas, pueden prepararse ODN con union 3'-3' en los que el enlace entre los nucleosidos terminales 3' no es un fosfodiester, fosforotioato ni otro puente modificado usando un espaciador adicional, tal como un resto tri- o tetraetilenglicol fosfato (Durand, M. y col., Triple-helix formation by an oligonucleotide containing one (dA)12 and two (dT)12 sequences bridged by two hexaethylene glycol chains, Biochemistry (1992), 31 (38), 9197-204, Patente de Estados Unidos N.°: 5.658.738 y Patente de Estados Unidos N.°: 5.668.265). Como alternativa, el engarce no nucleotidico puede proceder de etanodiol, propanodiol o de una unidad de desoxirribosa abasica (dSpacer) (Fontanel, Marie Laurence y col., Sterical Recognition by T4 polynucleotide kinase of non-nucleosidic moieties 5'- attached to oligonucleotides; Nucleic Acids Research (1994), 22 (11), 2022-7) usando qmmica de fosforamidita convencional. Los engarces no nucleotidicos pueden incorporarse una vez o multiples veces o combinarse entre sf dejando cualquier distancia deseable entre los extremos 3' de los dos ODN a unir.
Un puente internucleosfdico fosfodiester localizado en el extremo 3' y/o 5' de un nucleosido puede sustituirse por un puente internucleosfdico modificado, seleccionandose el puente internucleosfdico modificado por ejemplo de puentes fosforotioato, fosforoditioato, NR1R2-fosforamidato, boranofosfato, a-hidroxibencil fosfonato, ester de fosfato-(C1-C21)-O-alquilo, fosfato-[(C6-C12)aril-(C1-C21)-O-alquil]ester, (C1-Cs)alquilfosfonato y/o (C6-C12)arilfosfonato, (C7-C12)-a-hidroximetil-arilo (por ejemplo, divulgado en el documento WO 95/01363), donde el arilo-(C6-C12), arilo- (C6-C20) y arilo-(C6-C14) se sustituyen opcionalmente por halogeno, alquilo, alcoxi, nitro, ciano y donde R1 y R2 son, de forma independiente entre sf, hidrogeno, alquilo-(C1-C1s), arilo-(C6-C20), arilo-(C6-C14), alquilo-(C1-Cs), preferentemente hidrogeno, alquilo-(C1-Cs), preferentemente alquilo-(C1-C4) y/o metoxietilo o R1 y R2 forman, junto con el atomo de nitrogeno que llevan, un anillo heterodclico de 5 o 6 miembros que puede contener adicionalmente un heteroatomo adicional del grupo O, S y N.
La sustitucion de un puente fosfodiester localizado en el extremo 3' y/o 5' de un nucleosido por un puente desfosfo (se describen puentes desfosfo, por ejemplo, en Uhlmann E. y Peyman A. en “Methods in Molecular Biology”, Vol. 20, “Protocols for Oligonucleotides and Analogs”, S. Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa 1993, Capftulo 16, pag. 355 ff), seleccionandose el puente desfosfo por ejemplo de los puentes desfosfo formacetal, 3'-tioformacetal, metilhidroxilamina, oxima, metilendimetil-hidrazo, dimetilensulfona y/o grupos sililo.
Los oligonucleotidos inmunoestimuladores de la invencion pueden tener opcionalmente cadenas principales quimericas. Una cadena principal quimerica es una que comprende mas de un tipo de enlace. En una realizacion, la cadena principal quimerica puede representarse mediante la formula: 5' Y1N1ZN2Y2 3'. Y1 e Y2 son moleculas de acido nucleico que tienen entre 1 y 10 nucleotidos. Y1 e Y2 incluyen cada uno al menos un enlace internucleotfdico modificado. Puesto que al menos dos nucleotidos de los oligonucleotidos quimericos incluyen modificaciones de la cadena principal estos acidos nucleicos son un ejemplo de un tipo de “acidos nucleicos inmunoestimuladores estabilizados”.
Con respecto a los oligonucleotidos quimericos, Y1 e Y2 se consideran independientes entre sf. Esto significa que cada uno de Y1 e Y2 puede o no tener secuencias diferentes y enlaces de cadena principal diferentes entre sf en la misma molecula. En algunas realizaciones, Y1 y/o Y2 tienen entre 3 y 8 nucleotidos. N1 y N2 son moleculas de acido nucleico que tienen entre 0 y 5 nucleotidos siempre que N1ZN2 tengan al menos 6 nucleotidos en total. Los nucleotidos de N1ZN2 tienen una cadena principal fosfodiester y no incluyen acidos nucleicos que tengan una cadena principal modificada. Z es un motivo de acido nucleico inmunoestimulador seleccionado preferentemente de los oligonucleotidos inmunoestimuladores enumerados en este documento.
Los nucleotidos centrales (N1ZN2) de la formula Y1N1ZN2Y2 tienen enlaces internucleotfdicos fosfodiester e Y1 e Y2 tienen al menos uno, pero pueden tener mas de uno o incluso pueden tener todos los enlaces internucleotfdicos modificados. En realizaciones preferidas, Y1 y/o Y2 tienen al menos dos o entre dos y cinco enlaces internucleotfdicos modificados o Y1 tiene cinco enlaces internucleotfdicos modificados e Y2 tiene dos enlaces internucleotfdicos modificados. El enlace internucleotfdico modificado en algunos casos es un enlace modificado fosforotioato, un enlace fosforoditioato o un enlace modificado p-etoxi.
Los acidos nucleicos tambien incluyen acidos nucleicos que tienen azucares de cadena principal que estan unidos covalentemente a grupos organicos de peso molecular bajo distintos de un grupo hidroxilo en la posicion 2' y distintos de un grupo fosfato en la posicion 5'. Por lo tanto, los acidos nucleicos modificados pueden incluir un grupo ribosa 2'-O-alquilado. Ademas, los acidos nucleicos modificados pueden incluir azucares tales como arabinosa o 2'- fluoroarabinosa en lugar de ribosa. Por lo tanto, los acidos nucleicos pueden ser heterogeneos en la composicion de estructura principal conteniendo de este modo cualquier combinacion posible de unidades polimericas unidas entre sf, tales como acidos peptidonucleicos (que tienen una cadena principal de aminoacidos con bases de acido nucleico). En algunas realizaciones, los acidos nucleicos son homogeneos en la composicion de la cadena principal.
Una unidad de fosfato de azucar (es decir, una p-D-ribosa y un puente internucleosfdico fosfodiester que forman conjuntamente una unidad de fosfato de azucar) de la cadena principal de fosfato de azucar (es decir, una cadena principal de fosfato de azucar esta compuesta por unidades de fosfato de azucar) puede sustituirse por otra unidad, donde por ejemplo la otra unidad es adecuada para generar un oligomero “derivado de morfolino” (como se describe, por ejemplo, en Stirchak E. P. y col. (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6129-41), es decir, por ejemplo, la sustitucion por un derivado de morfolino; o para generar un acido nucleico de poliamida (“PNA”; como se describe, por ejemplo, en Nielsen P. E. y col. (1994) Bioconjug. Chem. 5: 3-7), es decir por ejemplo, la sustitucion de una unidad de cadena principal de PNA, por ejemplo, por 2-aminoetilglicina. El oligonucleotido puede tener otras modificaciones y sustituciones de cadena principal de carbohidrato, tales como acidos peptidonucleicos con grupos fosfatos (PHONA), acidos nucleicos bloqueados (LNA) y oligonucleotidos que tienen secciones de cadena principal con engarces alquilo o engarces amino. El engarce alquilo puede estar ramificado o no ramificado, sustituido o no sustituido y ser quiralmente puro o una mezcla racemica.
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Una unidad de p-ribosa o una unidad de p-D-2'-desoxirribosa puede sustituirse por una unidad de azucar modificado, seleccionandose la unidad de azucar modificado por ejemplo de p-D-ribosa, a-D-2'-desoxirribosa, L-2'-desoxirribosa, 2'-F-2'-desoxirribosa, 2'-F-arabinosa, 2'-O-(C1-C6)alquil-ribosa, preferentemente 2'-O-(C1-C6)alquil-ribosa es 2'-O- metilrribosa, 2'-O-(C1-C6)alquenil-ribosa, 2'-[O-(C1-C6)alquil-O-(C1-C6)alquil]-ribosa, 2'-NH2-2'-desoxirribosa, p-D- xilo-furanosa, a-arabinofuranosa, 2,4-didesoxi-p-D-eritro-hexo-piranosa, un carbodclico (descrito, por ejemplo, en Froehler J. (1992) Am. Chem. Soc. 1l4: 8320) y/o analogos de azucar de cadena abierta (descritos, por ejemplo, en Vandendriessche y col. (1993) Tetrahedron 49: 7223) y/o analogos de bicicloazucar (descritos, por ejemplo, en Tarkoy M. y col. (1993) Helv. Chim. Acta. 76: 481).
En algunas realizaciones, el azucar es 2'-O-metilrribosa, particularmente para uno o ambos nucleotidos unidos por un enlace internucleosfdico fosfodiester o de tipo fosfodiester.
Los oligonucleotidos de la invencion pueden sintetizarse de novo usando cualquiera de varios procedimientos bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, el procedimiento de b-cianoetil fosforamidita (Beaucage, S. L. y Caruthers, M. H., (1981) Tet. Let. 22: 1859); procedimiento de nucleosido H-fosfonato (Garegg y col., (1986) Tet. Let. 27: 40514054; Froehler y col., (1986) Nucl. Acid Res.14: 5399-5407; Garegg y col., (1986) 27: 4055-4058; Gaffney y col., (1988) Tet. Let. 29: 2619-2622). Estas qmmicas pueden realizarse mediante una diversidad de sintetizadores de acido nucleico automatizados disponibles en el mercado. Estos oligonucleotidos se denominan oligonucleotidos sinteticos. Como alternativa, pueden producirse dinucleotidos ricos en T y/o TG a gran escala en plasmidos (vease Sambrook T. y col., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor laboratory Press, Nueva York, 1989) y separarse en trozos mas pequenos o administrarse completos. Pueden prepararse acidos nucleicos a partir de secuencias de acidos nucleicos existentes (por ejemplo, genomico o ADNc) usando tecnicas conocidas, tales como las que emplean enzimas de restriccion, exonucleasas o endonucleasas. Pueden sintetizarse cadenas principales modificadas tales como fosforotioatos usando tecnicas automatizadas que emplean qmmica de fosforamidato o H-fosfonato. Pueden generarse aril- y alquil-fosfonatos, por ejemplo, como se describe en la Patente de Estados Unidos N.°: 4.469.863 y pueden generarse alquilfosfotriesteres (en los que el resto oxfgeno cargado esta alquilado, como se describen en la Patente de Estados Unidos N.°: 5.023.243) mediante smtesis en fase solida automatizada usando reactivos disponibles en el mercado. Se han descrito procedimientos para generar otras modificaciones y sustituciones de cadena principal de ADN (por ejemplo, Uhlmann, E. y Peyman, A., Chem. Rev. 90: 544, 1990; Goodchild, J., Bioconjugate Chem. 1: 165, 1990).
Los acidos nucleicos preparados de esta forma se denominan acido nucleico aislado. Un “acido nucleico aislado” se refiere generalmente a un acido nucleico que esta separado de componentes, con lo que esta separado de una celula, de un nucleo, de mitocondrias o de cromatina y de cualesquiera otros componentes que puedan considerarse como contaminantes.
En una realizacion, la composicion inmunogenica de la presente invencion comprende al menos un adyuvante que es un oligonucleotido CpG. Se han descrito oligonucleotidos CpG en varias patentes expedidas, solicitudes de patente publicadas y otras publicaciones incluyendo las Patentes de Estados Unidos N.°s: 6.194.388; 6.207.646; 6.214.806; 6.218.371; 6.239.116; y 6.339.068.
Se han identificado diferentes clases de oligonucleotidos inmunoestimuladores CpG. Se denominan clase A, B, C y P y se describen con mas detalle a continuacion. Los procedimientos y composiciones de la invencion incluyen el uso de estas clases diferentes de oligonucleotidos inmunoestimuladores CpG.
Cualquiera de las clases puede someterse a una modificacion E que aumente su potencia. Una modificacion E puede ser una sustitucion con halogeno para el nucleotido 5' terminal; los ejemplos de dichas sustituciones incluyen, pero sin limitacion, sustituciones con bromo-uridina o yodo-uridina. Una modificacion E tambien puede incluir una sustitucion con etil-uridina para el nucleotido 5' terminal.
Los oligonucleotidos inmunoestimuladores CpG de “clase A” se caracterizan funcionalmente por la capacidad para inducir altos niveles de interferon-alfa (IFN-a) a partir de celulas dendnticas plasmocitoides (pDC) e inducir la activacion de celulas NK al tiempo que tienen efectos mmimos sobre la activacion de celulas B. Estructuralmente, esta clase tiene tipicamente secuencias poli-G estabilizadas en los extremos 5' y 3'. Tambien tiene una secuencia que contiene dinucleotido CpG fosfodiester palindromica de al menos 6 nucleotidos, por ejemplo pero no necesariamente, ella contiene uno de los siguientes palmdromos hexamericos: GACGTC, AGCGCT o AACGTT, descritos por Yamamoto y colaboradores. Yamamoto S y col. J. Immunol 148: 4072-6 (1992). Se ha descrito una clase de oligonucleotidos inmunoestimuladores CpG y secuencias ejemplares de esta clase en la Solicitud de Patente no provisional de Estados Unidos de N.° de Serie 09/672.126 y la solicitud PCT publicada PCT/US00/26527 (documento WO 01/22990), ambas presentadas el 27 de septiembre de 2000.
En una realizacion, el oligonucleotido CpG de “clase A” de la invencion tiene la siguiente secuencia de acido nucleico: 5' GGGGACGACGTCGTGGGGGGG 3' (SEC ID N.°: 440).
Algunos ejemplos no limitantes de oligonucleotidos de clase A incluyen:
5' G*G*G_G_A_C_G_A_C_G_T_C_G_T_G_G*G*G*G*G*G 3'; donde el * se refiere a un enlace fosforotioato y _ se refiere a un enlace fosfodiester.
Los oligonucleotidos inmunoestimuladores CpG de “clase B” se caracterizan funcionalmente por la capacidad para activar celulas B y pDC excepto porque son relativamente debiles para inducir activacion de celulas IFN-a y NK. Estructuralmente, esta clase tipicamente puede estabilizarse totalmente con enlaces fosforotioato, pero tambien puede tener uno o mas enlaces fosfodiester, preferentemente entre la citosina y la guanina del motivo o motivos CpG, en cuyo caso la molecula se denomina semiblanda. En una realizacion, el oligonucleotido CpG de la presente invencion es un oligonucleotido CpG de clase B representado por al menos la formula:
5' X1X2CGX3X4 3', en la que X1, X2, X3 y X4 son nucleotidos. En una realizacion, X2 es adenina, guanina o timina. En otra realizacion, X3 es citosina, adenina o timina.
En otra realizacion, el oligonucleotido CpG de la presente invencion es un oligonucleotido CpG de clase B representado por al menos la formula:
5 5' N1X1X2CGX3X4N2 3',
en la que Xi, X2, X3 y X4 son nucleotidos y N es cualquier nucleotido y Ni y N2 son secuencias de acido nucleico compuestas por aproximadamente 0-25 N cada una. En una realizacion, X1X2 es un dinucleotido seleccionado del grupo constituido por GpT, GpG, GpA, ApA, ApT, ApG, CpT, CpA, CpG, TpA, TpT y TpG; y X3X4 es un dinucleotido seleccionado del grupo constituido por TpT, ApT, TpG, ApG, CpG, TpC, ApC, CpC, TpA, ApA y CpA. 10 Preferentemente X1X2 es GpA o GpT y X3X4 es TpT. En otras realizaciones, X1 o X2 o ambos son purinas y X3 o X4
o ambos son pirimidinas o X1X2 es GpA y X3 o X4 o ambos son pirimidinas. En una realizacion preferida, X1X2 es un dinucleotido seleccionado del grupo constituido por TpA, ApA, ApC, ApG y GpG. En otra realizacion mas, X3X4 es un dinucleotido seleccionado del grupo constituido por TpT, TpA, TpG, ApA, ApG, GpA y CpA. X1X2, en otra realizacion, es un dinucleotido seleccionado del grupo constituido por TpT, TpG, ApT, GpC, CpC, CpT, TpC, GpT y CpG; X3 es 15 un nucleotido seleccionado del grupo constituido por A y T y X4 es un nucleotido, pero cuando X1X2 es TpC, GpT o CpG, X3X4 no es TpC, ApT o ApC.
En otra realizacion preferida, el oligonucleotido CpG tiene la secuencia 5' TCN1TX1X2CGX3X4 3'. Los oligonucleotidos CpG de la invencion, en algunas realizaciones, incluyen X1X2 seleccionados del grupo constituido por GpT, GpG, GpA y ApA y X3X4 seleccionados del grupo constituido por TpT, CpT y TpC.
20 Las secuencias oligonucleotidicas CpG de clase B de la invencion son las ampliamente descritas anteriormente, asf como las descritas en las Solicitudes de Patente PCT publicadas PCT/US95/01570 y PCT/US97/19791 y en las Patentes de Estados Unidos 6.194.388, 6.207.646, 6.214.806, 6.218.371, 6.239.116 y 6.339.068. Las secuencias ejemplares incluyen, pero sin limitacion, las descritas en estas ultimas solicitudes y patentes.
En una realizacion, el oligonucleotido CpG de “clase B” de la invencion tiene la siguiente secuencia de acido 25 nucleico:
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5' TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT 3' (SEC ID N.°: 431), o 5' TCGTCGTTTTTCGGTCGTTTT 3' (SEC ID N.°: 432), o 5' TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 3' (SEC ID N.°: 433), o 5' TCGTCGTTTCGTCGTTTTGTCGTT 3' (SEC ID N.°: 441), o 5' TCGTCGTTTTGTCGTTTTTTTCGA 3' (SEC ID N.°: 442).
En cualquiera de estas secuencias, todos los enlaces pueden ser enlaces fosforotioato. En otra realizacion, en cualquiera de estas secuencias, uno o mas de los enlaces pueden ser fosfodiester, preferentemente entre la “C” y la “G” del motivo CpG generando un oligonucleotido CpG semiblando. En cualquiera de estas secuencias, una etil- uridina o un halogeno pueden sustituir a la T 5'; los ejemplos de sustituciones con halogeno incluyen, pero sin limitacion, sustituciones con bromo-uridina o yodo-uridina.
Algunos ejemplos no limitantes de oligonucleotidos de clase B incluyen:
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o
5' t*0*0*t*0*0*t*t*t*t*t*0*0*0*t*0*0*t*t*t*j 3’
o
5' t*0*0*t*0*0*t*t*t*t*0*t*0*0*t*t*t*t*0*t*0*0*t*j 3’
o
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5' t*0*0*t*0*0*t*t*t*0*0*t*0*0*t*t*t*t*0*t*0*0*t*j 3’
o
5' ~[~*0*0*~[~*0*0*~[~*~[~*~[~*~[~*0*~[~*0*0*~[~*~[~*~[~*~[~*~[~*~[~*0*0*a 3’
en los que el * se refiere a un enlace fosforotioato.
La “clase C" de oligonucleotidos inmunoestimuladores CpG se caracteriza funcionalmente por la capacidad para activar celulas B y celulas NK e inducir IFN-a. Estructuralmente, esta clase incluye tfpicamente una region con uno o 45 mas motivos CpG inmunoestimuladores de tipo de clase B y una region palindromica o casi palindromica rica en GC que permite que las moleculas formen estructuras de tipo secundario (por ejemplo, tallo-bucle) o terciario (por ejemplo, dfmeros). Algunos de estos oligonucleotidos tienen tanto una secuencia CpG “estimuladora” tradicional como un motivo “rico en GC” o “neutralizante de celulas B”. Estos oligonucleotidos de motivo de combinacion tienen efectos inmunoestimulantes que se encuentran en algun lugar entre los efectos asociados con los oligonucleotidos 50 CpG de clase B tradicionales (es decir, induccion fuerte de la activacion de celulas B y activacion de celulas dendnticas (DC)) y los efectos asociados con CpG ODN de clase A (es decir, induccion fuerte de IFN-a y activacion de celulas Nk pero induccion relativamente escasa de la activacion de celulas B y DC). Krieg AM y col. (1995) Nature 374: 546-9; Ballas ZK y col. (1996) J Immunol 157: 1840-5; Yamamoto S y col. (1992) J Immunol 148: 40726.
55 La clase C de oligonucleotidos inmunoestimuladores de motivo de combinacion puede tener cadenas principales totalmente estabilizadas (por ejemplo, todas fosforotioato), quimericas (region central fosfodiester) o semiblandas
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(por ejemplo, fosfodiester dentro de un motivo CpG). Esta clase se ha descrito en la solicitud de patente de Estados Unidos US 10/224.523 presentada el 19 de agosto de 2002.
Un dominio o motivo estimulador del oligonucleotido CpG de clase C se define mediante la formula: 5' X1DCGHX2 3'. D es un nucleotido distinto de C. C es citosina. G es guanina. H es un nucleotido distinto de G. X1 y X2 son cualquier secuencia de acido nucleico de 0 a 10 nucleotidos de longitud. X1 puede incluir una CG, en cuyo caso existe preferentemente una T inmediatamente antes de esta CG. En algunas realizaciones, dCg es TCG. X1 tiene preferentemente de 0 a 6 nucleotidos de longitud. En algunas realizaciones, X2 no contiene ningun motivo poli G o poli A. En otras realizaciones, el oligonucleotido inmunoestimulador tiene una secuencia poli T en el extremo 5' o en el extremo 3'. Como se usa en este documento, “poli A” o “poli-T” se referiran a una extension de cuatro o mas A o T consecutivas, respectivamente, por ejemplo, 5' AAAA 3' o 5' TTTT 3'. Como se usa en este documento, el “extremo poli G” se referira a una extension de cuatro o mas G consecutivas, por ejemplo, 5' GGGG 3', que aparece en el extremo 5' o el extremo 3' de un acido nucleico. Como se usa en este documento, un “oligonucleotido poli G” se referira a un oligonucleotido que tiene la formula 5' X1X2GGGX3X4 3' en la que X1, X2, X3 y X4 son nucleotidos y preferentemente al menos uno de X3 y X4 es una G. Algunos disenos preferidos para el dominio estimulador de celulas B con esta formula comprenden TTTTTCG, TCG, TTCG, TTTCG, TTTTCG, TCGT, TTCGT, TTTCGT, TCGTCGT.
El segundo motivo del oligonucleotido CpG de clase C se denomina P o N y se situa inmediatamente 5' a X1 e inmediatamente 3' a X2.
N es una secuencia neutralizante de celulas B que comienza con un trinucleotido CGG y tiene una longitud de al menos 10 nucleotidos. Un motivo neutralizante de celulas B incluye al menos una secuencia CpG en la que la CG esta precedida por una C o seguida de una G (Krieg AM y col. (1998) Proc Natl Acad Sd USA 95: 12631-12636) o es una secuencia de ADN que contiene CG en la que la C de la CG esta metilada. Los motivos o secuencias neutralizantes tienen cierto grado de capacidad inmunoestimuladora cuando estan presentes en un motivo de otro modo no estimulador, pero cuando estan presentes en el contexto de otros motivos inmunoestimuladores sirven para reducir el potencial inmunoestimulador de los otros motivos.
P es una secuencia que contiene un palmdromo rico en GC de al menos 10 nucleotidos de longitud.
Como se usa en este documento, “palmdromo” y de forma equivalente “secuencia palindromica” se referiran a una repeticion invertida, es decir, una secuencia tal como ABCDEE'D'C'B'A' en la que A y A', B y B', etc. son bases capaces de formar los pares de bases de Watson-Crick habituales.
Como se usa en este documento, la expresion "palmdromo rico en GC" se referira a un palmdromo que tiene una composicion de bases de al menos dos tercios de G y C. En algunas realizaciones, el dominio rico en GC esta preferentemente 3' respecto al “dominio estimulador de celulas B”. En el caso de un palmdromo rico en GC de 10 bases de longitud, el palmdromo contiene por lo tanto al menos 8 G y C. En el caso de un palmdromo rico en GC de 12 bases de longitud, el palmdromo tambien contiene al menos 8 G y C. En el caso de un palmdromo rico en GC de 14 nucleotidos, al menos 10 bases del palmdromo son G y C. En algunas realizaciones, el palmdromo rico en GC esta compuesto exclusivamente por G y C.
En algunas realizaciones el palmdromo rico en GC tiene una composicion de bases de al menos el 81 % de G y C. En el caso de dicho palmdromo rico en GC de 10 bases de longitud, el palmdromo esta compuesto por lo tanto exclusivamente por G y C. En el caso de dicho palmdromo rico en GC de 12 bases de longitud, se prefiere que al menos diez bases (83 %) del palmdromo sean G y C. En algunas realizaciones preferidas, un palmdromo rico en GC de 12 bases de longitud esta compuesto exclusivamente por G y C. En el caso de un palmdromo rico en GC de 14 nucleotidos, al menos doce bases (86 %) del palmdromo son G y C. En algunas realizaciones preferidas, un palmdromo rico en GC de 14 bases de longitud esta compuesto exclusivamente por G y C. Las C de un palmdromo rico en GC pueden no estar metiladas o pueden estar metiladas.
En general este dominio tiene al menos 3 C y G, mas preferentemente 4 de cada y mas preferentemente, 5 o mas de cada. El numero de C y G en este dominio no tiene que ser identico. Se prefiere que las C y G se dispongan de modo que sean capaces de formar un duplex autocomplementario, o palmdromo, tal como CCGCGCGG. Este puede interrumpirse por A o T pero se prefiere que la autocomplementariedad este al menos parcialmente conservada, como por ejemplo en los motivos CGACGTTCGTCG o CGGCGCCGTGCCG. Cuando la complementariedad no esta conservada, se prefiere que los pares de bases no complementarias sean TG. En una realizacion preferida no hay mas de 3 bases consecutivas que no son parte del palmdromo, preferentemente no mas de 2 y mas preferentemente solo 1. En algunas realizaciones, el palmdromo rico en GC incluye al menos un tnmero CGG, al menos un tnmero CCG, o al menos un tetramero cGcG. En otras realizaciones, el palmdromo rico en GC no es CCCCCCGGGGGG o GGGGGGCCCCCC, CCCCCGGGGG o GGGGGCCCCC.
Al menos una de las G de la region rica en GC puede sustituirse con una inosina (I). En algunas realizaciones, P incluye mas de una I.
En ciertas realizaciones, el oligonucleotido inmunoestimulador tiene una de las siguientes formulas 5' NX1DCGHX2 3', 5' X1DCGHX2N 3', 5' PX1DCGHX2 3', 5' X1DCGHX2P 3', 5' X1CGHX2PX3 3', 5' X1DCGHPX3 3', 5' DCGHX2PX3 3', 5' TCGHX2PX3 3', 5' DCGHPX3 3' o 5'DCGHP 3'.
La invencion proporciona otros oligonucleotidos inmunoestimuladores definidos mediante una formula 5' N-iPyGN^P 3'. N1 es cualquier secuencia de 1 a 6 nucleotidos de longitud. Py es una pirimidina. G es guanina. N2 es cualquier secuencia de 0 a 30 nucleotidos de longitud. P es un palmdromo rico en GC que contiene una secuencia de al menos 10 nucleotidos de longitud.
N1 y N2 pueden contener mas del 50 % de pirimidinas y mas preferentemente, mas del 50 % de T. N1 puede incluir una CG, en cuyo caso existe preferentemente una T inmediatamente antes de esta CG. En algunas realizaciones,
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NIPyG es TCG y mas preferentemente, una TCGN2, donde N2 no es G.
NiPyGN2P puede incluir uno o mas nucleotidos de inosina (I). Bien la C o bien la G en N1 pueden sustituirse por inosina, pero se prefiere la CpI a la IpG. Para sustituciones con inosina tales como IpG, la actividad optima puede conseguirse con el uso de una cadena principal “semiblanda” o quimerica en la que el enlace entre la IG o la CI es fosfodiester. N1 puede incluir al menos un motivo CI, TCI, IG o TIG.
En ciertas realizaciones, NiPyGN2 es una secuencia seleccionada del grupo constituido por TTTTTCG, TCG, TTCG, TTTCG, TTTTCG, TCGT, TTCGT, TTTCGT y TCGTCGT.
En una realizacion, los oligonucleotidos CpG de “clase C” de la invencion tienen la siguiente secuencia de acido nucleico:
5' TCGCGTCGTTCGGCGCGCGCCG 3' (SEC ID N°: 443), o 5' TCGTCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3' (SEC ID N°: 444), o 5' TCGGACGTTCGGCGCGCGCCG 3' (SEC ID N°: 445), o 5' TCGGACGTTCGGCGCGCCG 3' (SEC ID N°: 446), o 5' TCGCGTCGTTCGGCGCGCCG 3' (SEC ID N°: 447), o 5' TCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3' (SEC ID N°: 448), o 5' TCGACGTTCGGCGCGCCG 3' (SEC ID N°: 449), o 5' TCGCGTCGTTCGGCGCCG 3' (SEC ID N°: 450), o 5' TCGCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3' (SEC ID N°: 451), o 5' TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG 3' (SEC ID N°: 452), o 5' TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG 3' (SEC ID N°: 453), o 5' TCGTCGTTTTACGGCGCCGTGCCG 3' (SEC ID N°: 454), o 5' TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCGT 3' (SEC ID N°: 455).
En cualquiera de estas secuencias, todos los enlaces pueden ser enlaces fosforotioato. En otra realizacion, en cualquiera de estas secuencias, uno o mas de los enlaces pueden ser fosfodiester, preferentemente entre la “C” y la “G” del motivo CpG, generando un oligonucleotido CpG semiblando.
Algunos ejemplos no limitantes de oligonucleotidos de clase C incluyen:
5' T*C_G*C_G*T*C_G*T*TC*_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3', o
5' T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3', o
5' T*C_G*G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3', o
5' T*C_G*G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3', o
5' T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3', o
5' T*C G*A*C g*T*T*C G*G*C*G*C G*C*G*C*C*G 3', o
5' T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3', o 5' T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*C*G 3', o 5' T*C_G*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3', o 5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 3', o 5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G 3', o 5' t*C*G*T*C g*T*T*T*T*A*C G*G*C*G*C*C G*T*G*C*C*G 3'
o
5' T*C G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T 3'
en los que el * se refiere a un enlace fosforotioato y el _ se refiere a un enlace fosfodiester.
En cualquiera de estas secuencias, una etil-uridina o un halogeno pueden sustituir a la T 5'; los ejemplos de sustituciones con halogeno incluyen pero sin limitacion sustituciones con bromo-uridina o yodo-uridina.
Los oligonucleotidos inmunoestimuladores CpG de “clase P” se han descrito en el documento WO2007/095316 y se caracterizan por el hecho de que contienen regiones formadoras de duplex tales como, por ejemplo, palmdromos
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perfectos o imperfectos en o proximos a ambos extremos 5' y 3', proporcionandoles el potencial de formar estructuras de orden superior tales como concatameros. Estos oligonucleotidos denominados oligonucleotidos de clase P tienen la capacidad en algunos casos de inducir niveles mucho mayores de secrecion de IFN-a que la clase C. Los oligonucleotidos de clase P tienen la capacidad de autoensamblarse espontaneamente en concatameros in vitro y/o in vivo. Sin ligarse a teona particular alguna para el procedimiento de accion de estas moleculas, una hipotesis potencial es que esta propiedad dota a los oligonucleotidos de clase P de la capacidad de reticularse mas con TLR9 en el interior de ciertas celulas inmunes, induciendo un patron diferente de activacion inmune en comparacion con las clases descritas anteriormente de oligonucleotidos CpG.
En una realizacion, el oligonucleotido CpG es un oligonucleotido CpG de clase P que contiene un dominio de activacion TLR 5' y al menos dos regiones palindromicas, siendo una region palindromica una region palindromica 5' de al menos 6 nucleotidos de longitud y estando conectada con una region palindromica 3' de al menos 8 nucleotidos de longitud directamente o a traves de un espaciador, incluyendo el oligonucleotido al menos un dinucleotido YpR. En una realizacion, dicho oligonucleotido no es T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G*. En una realizacion, el oligonucleotido CpG de clase P incluye al menos un dinucleotido CpG no metilado. En otra realizacion, el dominio de activacion TLR es TCG, TTCG, TTTCG, TYpR, TTYpR, TTTYpR, UCG, UUCG, UUUCG, TTT o TTTT. En otra realizacion mas el dominio de activacion TLR esta en el interior de la region palindromica 5'. En otra realizacion el dominio de activacion TLR esta inmediatamente 5' a la region palindromica 5'. En otra realizacion mas la region palindromica 5' tiene al menos 8 nucleotidos de longitud. En otra realizacion la region palindromica 3' tiene al menos 10 nucleotidos de longitud. En otra realizacion la region palindromica 5' tiene al menos 10 nucleotidos de longitud. En otra realizacion mas la region palindromica 3' incluye un dinucleotido CpG no metilado. En otra realizacion la region palindromica 3' incluye dos dinucleotidos CpG no metilados. En otra realizacion la region palindromica 5' incluye un dinucleotido CpG no metilado. En otra realizacion mas la region palindromica 5' incluye dos dinucleotidos CpG no metilados. En otra realizacion las regiones palindromicas 5' y 3' tienen un valor de estabilidad de duplex de al menos 25. En otra
realizacion las regiones palindromicas 5' y 3' tienen un valor de estabilidad de duplex de al menos 30. En otra
realizacion las regiones palindromicas 5' y 3' tienen un valor de estabilidad de duplex de al menos 35. En otra
realizacion las regiones palindromicas 5' y 3' tienen un valor de estabilidad de duplex de al menos 40. En otra
realizacion las regiones palindromicas 5' y 3' tienen un valor de estabilidad de duplex de al menos 45. En otra
realizacion las regiones palindromicas 5' y 3' tienen un valor de estabilidad de duplex de al menos 50. En otra
realizacion las regiones palindromicas 5' y 3' tienen un valor de estabilidad de duplex de al menos 55. En otra
realizacion las regiones palindromicas 5' y 3' tienen un valor de estabilidad de duplex de al menos 60. En otra
realizacion las regiones palindromicas 5' y 3' tienen un valor de estabilidad de duplex de al menos 65.
En una realizacion las dos regiones palindromicas estan conectadas directamente. En otra realizacion las dos regiones palindromicas estan conectadas por medio de un enlace 3'-3'. En otra realizacion las dos regiones palindromicas solapan en un nucleotido. En otra realizacion mas las dos regiones palindromicas solapan en dos nucleotidos. En otra realizacion las dos regiones palindromicas no solapan. En otra realizacion las dos regiones palindromicas estan conectadas por un espaciador. En una realizacion el espaciador es un acido nucleico que tiene una longitud de 1-50 nucleotidos. En otra realizacion el espaciador es un acido nucleico que tiene una longitud de 1 nucleotido. En otra realizacion el espaciador es un espaciador no nucleotfdico. En otra realizacion el espaciador no nucleotfdico es un espaciador D. En otra realizacion el espaciador no nucleotfdico es un engarce. En una realizacion el oligonucleotido tiene la formula 5' XP1SP2T 3', en la que X es el dominio de activacion TLR, P1 es un palmdromo, S es un espaciador, P2 es un palmdromo y T es una cola 3' de 0-100 nucleotidos de longitud. En una realizacion X es TCG, TTCG o TTTCG. En otra realizacion T tiene una longitud de 5-50 nucleotidos. En otra realizacion mas T tiene una longitud de 5-10 nucleotidos. En una realizacion S es un acido nucleico que tiene una longitud de 1-50 nucleotidos. En otra realizacion S es un acido nucleico que tiene una longitud de 1 nucleotido. En otra realizacion S es un espaciador no nucleotidico. En una realizacion el espaciador no nucleotidico es un espaciador D. En otra realizacion el espaciador no nucleotidico es un engarce. En otra realizacion, el oligonucleotido no es un oligonucleotido antisentido o ribozima. En una realizacion P1 es rico en A y T. En otra realizacion P1 incluye al menos 4 T. En otra realizacion P2 es un palmdromo perfecto. En otra realizacion P2 es rico en G-C. En otra realizacion mas P2 es CGGCGCX1GCGCCG, en la que X1 es T o nada.
En una realizacion el oligonucleotido incluye al menos un enlace fosforotioato. En otra realizacion todos los enlaces internucleotidicos del oligonucleotido son enlaces fosforotioato. En otra realizacion el oligonucleotido incluye al menos un enlace similar a fosfodiester. En otra realizacion el enlace similar a fosfodiester es un enlace fosfodiester. En otra realizacion un grupo lipofilo se conjuga con el oligonucleotido. En una realizacion el grupo lipofilo es colesterol.
En una realizacion, el oligonucleotido CpG para uso en la presente invencion es un oligonucleotido CpG de clase P con un dominio de activacion TLR 5' y al menos dos regiones que contienen complementariedad, una region que contiene complementariedad 5' y 3', teniendo cada region que contiene complementariedad al menos 8 nucleotidos de longitud y conectandose entre sf bien directamente o bien a traves de un espaciador, incluyendo el oligonucleotido al menos un dinucleotido de pirimidina-purina (YpR) y en el que al menos una de las regiones que contienen complementariedad no es un palmdromo perfecto. En una realizacion el oligonucleotido incluye al menos un dinucleotido CpG no metilado. En otra realizacion el dominio de activacion TLR es TCG, TTCG, TTTCG, TYpR, TTYpR, TTTYpR, UCG, UUCG, UUUCG, TTT o TTTT. En otra realizacion el dominio de activacion TLR esta dentro de la region que contiene complementariedad 5'. En otra realizacion el dominio de activacion TLR esta inmediatamente 5' a la region que contiene complementariedad 5'. En otra realizacion la region que contiene complementariedad 3' tiene una longitud de al menos 10 nucleotidos. En otra realizacion mas la region que contiene complementariedad 5' tiene al menos 10 nucleotidos de longitud. En una realizacion la region que contiene complementariedad 3' incluye un dinucleotido CpG no metilado. En otra realizacion la region que contiene complementariedad 3' incluye dos dinucleotidos CpG no metilados. En otra realizacion mas la region que contiene complementariedad 5' incluye un dinucleotido CpG no metilado. En otra realizacion la region que contiene complementariedad 5' incluye dos dinucleotidos CpG no metilados. En otra realizacion las regiones que contienen complementariedad incluyen al menos un analogo de nucleotido. En otra realizacion las regiones que contienen
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complementariedad forman un duplex intramolecular. En una realizacion el duplex intramolecular incluye al menos un par de bases que no son de Watson-Crick. En otra realizacion el par de bases que no es de Watson-Crick es G-T, G-A, G-G o C-A. En una realizacion las regiones que contienen complementariedad forman duplex intermoleculares. En otra realizacion al menos uno de los duplex intermoleculares incluye al menos un par de bases que no es de Watson-Crick. En otra realizacion el par de bases que no es de Watson-Crick es G-T, G-A, G-G o C-A. En otra realizacion mas las regiones que contienen complementariedad contienen un emparejamiento erroneo. En otra realizacion mas las regiones que contienen complementariedad contienen dos emparejamientos erroneos. En otra realizacion, las regiones que contienen complementariedad contienen un nucleotido intermedio. En otra realizacion, las regiones que contienen complementariedad contienen dos nucleotidos intermedios.
En una realizacion las regiones que contienen complementariedad 5' y 3' tienen un valor de estabilidad de duplex de al menos 25. En otra realizacion las regiones que contienen complementariedad 5' y 3' tienen un valor de estabilidad de duplex de al menos 30. En otra realizacion las regiones que contienen complementariedad 5' y 3' tienen un valor de estabilidad de duplex de al menos 35. En otra realizacion las regiones que contienen complementariedad tienen un valor de estabilidad de duplex de al menos 40. En otra realizacion las regiones que contienen complementariedad tienen un valor de estabilidad de duplex de al menos 45. En otra realizacion las regiones que contienen complementariedad tienen un valor de estabilidad de duplex de al menos 50. En otra realizacion las regiones que contienen complementariedad tienen un valor de estabilidad de duplex de al menos 55. En otra realizacion las regiones que contienen complementariedad tienen un valor de estabilidad de duplex de al menos 60. En otra realizacion las regiones que contienen complementariedad tienen un valor de estabilidad de duplex de al menos 65.
En otra realizacion las dos regiones que contienen complementariedad estan conectadas directamente. En otra realizacion las dos regiones palindromicas estan conectadas mediante un enlace 3'-3'. En otra realizacion mas las dos regiones que contienen complementariedad solapan en un nucleotido. En otra realizacion las dos regiones que contienen complementariedad solapan en dos nucleotidos. En otra realizacion las dos regiones que contienen complementariedad no solapan. En otra realizacion las dos regiones que contienen complementariedad estan conectadas por un espaciador. En otra realizacion el espaciador es un acido nucleico que tiene una longitud de 1-50 nucleotidos. En otra realizacion el espaciador es un acido nucleico que tiene una longitud de 1 nucleotido. En una realizacion el espaciador es un espaciador no nucleotfdico. En otra realizacion el espaciador no nucleotidico es un espaciador D. En otra realizacion mas el espaciador no nucleotidico es un engarce.
En una realizacion el oligonucleotido de clase P tiene la formula 5' XNSPT 3', en la que X es el dominio de activacion TLR, N es un palmdromo imperfecto, P es un palmdromo, S es un espaciador y T es una cola 3' de 0-100 nucleotidos de longitud. En otra realizacion X es tCg, TTCG o TTTCG. En otra realizacion T es de 5-50 nucleotidos de longitud. En otra realizacion T es de 5-10 nucleotidos de longitud. En otra realizacion S es un acido nucleico que tiene una longitud de 1-50 nucleotidos. En otra realizacion S es un acido nucleico que tiene una longitud de 1 nucleotido. En otra realizacion S es un espaciador no nucleotidico. En otra realizacion el espaciador no nucleotidico es un espaciador D. En otra realizacion el espaciador no nucleotidico es un engarce. En otra realizacion el oligonucleotido no es un oligonucleotido antisentido ni una ribozima. En otra realizacion N es rico en A y T. En otra realizacion N incluye al menos 4 T. En otra realizacion P es un palmdromo perfecto. En otra realizacion P es rico en G-C. En otra realizacion P es CGGCGCX1GCGCCG, donde X1 es T o nada. En otra realizacion el oligonucleotido incluye al menos un enlace fosforotioato. En otra realizacion todos los enlaces internucleotfdicos del oligonucleotido son enlaces fosforotioato. En otra realizacion el oligonucleotido incluye al menos un enlace tipo fosfodiester. En otra realizacion el enlace tipo fosfodiester es un enlace fosfodiester. En otra realizacion un grupo lipofilo se conjuga con el oligonucleotido. En una realizacion el grupo lipofilo es colesterol.
En una realizacion los oligonucleotidos CpG de “clase P” de la invencion tienen la siguiente secuencia de acido nucleico: 5' TCGTCGACGATCGGCGCGCGCCG 3' (SEC ID N.°: 456).
En dichas secuencias, todos los enlaces pueden ser enlaces fosforotioato. En otra realizacion, uno o mas de los enlaces pueden ser fosfodiester, preferentemente entre la “C” y la “G” del motivo CpG generando un oligonucleotido CpG semiblando. En cualquiera de estas secuencias, una etil-uridina o un halogeno pueden sustituir a la T 5'; los ejemplos de sustituciones con halogeno incluyen pero sin limitacion sustituciones con bromo-uridina o yodo-uridina.
Un ejemplo no limitante de oligonucleotidos de Clase P incluye: 5'
*C_G*T*C_G*A*C_G*A*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3'
en el que el * se refiere a un enlace fosforotioato y el _ se refiere a un enlace fosfodiester.
En una realizacion, todos los enlaces internucleotidicos de los oligonucleotidos CpG descritos en este documento son enlaces fosfodiester (oligonucleotidos “blandos”, como se describen en la solicitud PCT WO2007/026190). En otra realizacion, los oligonucleotidos CpG de la invencion se vuelven resistentes a la degradacion (por ejemplo, se estabilizan). Un “oligonucleotido estabilizado” se refiere a un oligonucleotido que es relativamente resistente a la degradacion in vivo (por ejemplo, mediante una exo- o endonucleasa). La estabilizacion de acidos nucleicos puede lograrse mediante modificaciones de la cadena principal. Los oligonucleotidos que tienen enlaces fosforotioato proporcionan una actividad maxima y protegen al oligonucleotido de la degradacion por exo- y endonucleasas intracelulares.
Los oligonucleotidos inmunoestimuladores pueden tener una cadena principal quimerica, que tiene combinaciones de enlaces fosfodiester y fosforotioato. Para los fines de la presente invencion, una cadena principal quimerica se refiere a una cadena principal parcialmente estabilizada, en la que al menos un enlace internucleotfdico es fosfodiester o de tipo fosfodiester y en la que al menos otro enlace internucleotfdico es un enlace internucleotfdico estabilizado, en la que el al menos un enlace fosfodiester o de tipo fosfodiester y el al menos un enlace estabilizado son diferentes. Cuando el enlace fosfodiester se localiza preferentemente en el interior del motivo CpG, dichas moleculas se denominan “semiblandas”, como se describe en la solicitud PCT WO2007/026190.
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Otros oligonucleotidos modificados incluyen combinaciones de enlaces fosfodiester, fosforotioato, metilfosfonato, metilfosforotioato, fosforoditioato y/o p-etoxi.
Puesto que se ha descrito que los enlaces boranofosfonato estan estabilizados respecto a los enlaces fosfodiester, para los fines de la naturaleza quimerica de la cadena principal, los enlaces boranofosfonato pueden clasificarse como de tipo fosfodiester o como estabilizados, dependiendo del contexto. Por ejemplo, una cadena principal quimerica de acuerdo con la presente invencion podna incluir, en algunas realizaciones, al menos un enlace fosfodiester (fosfodiester o de tipo fosfodiester) y al menos un enlace boranofosfonato (estabilizado). En otras realizaciones, una cadena principal quimerica de acuerdo con la presente invencion podna incluir enlaces boranofosfonato (fosfodiester o de tipo fosfodiester) y fosforotioato (estabilizado). Un “enlace internucleotfdico estabilizado” se referira a un enlace internucleotfdico que es relativamente resistente a la degradacion in vivo (por ejemplo, por medio de una exo- o endonucleasa), en comparacion con un enlace internucleotfdico fosfodiester. Los enlaces internucleotfdicos estabilizados preferidos incluyen, sin limitacion, fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato y metilfosforotioato. Otros enlaces internucleotfdicos estabilizados incluyen, sin limitacion, peptfdico, alquilo, desfosfo y otros, como se han descrito anteriormente.
Pueden sintetizarse cadenas principales modificadas tales como fosforotioatos usando tecnicas automatizadas que emplean qmmicas de fosforamidato o H-fosfonato. Pueden generarse aril- y alquil-fosfonatos, por ejemplo, como se describe en la Patente de Estados Unidos N.°: 4.469.863; y pueden prepararse alquilfosfotriesteres (en los que el resto oxfgeno cargado esta alquilado, como se describe en la Patente de Estados Unidos N.°: 5.023.243 y en la Patente Europea N.°: 092.574) mediante smtesis en fase solida automatica usando reactivos disponibles en el mercado. Se han descrito procedimientos para generar otras modificaciones y sustituciones de la cadena principal de ADN. Uhlmann E y col. (1990) Chem Rev 90: 544; Goodchild J (1990) Bioconjugate Chem 1: 165. Tambien se conocen procedimientos para preparar oligonucleotidos quimericos. Por ejemplo, las patentes expedidas a Uhlmann y col. han descrito dichas tecnicas.
Pueden sintetizarse ODN modificados de cadena principal mixta como se describe en la solicitud PCT WO2007/026190.
Los oligonucleotidos de la invencion tambien pueden incluir otras modificaciones. Estas incluyen analogos de ADN no ionicos tales como alquil- y aril-fosfatos (en los que el oxfgeno de fosfonato cargado se sustituye por un grupo alquilo o arilo), fosfodiester y alquilfosfotriesteres, en los que el resto oxfgeno cargado esta alquilado. Los acidos nucleicos que contienen diol, tales como tetraetilenglicol o hexaetilenglicol, en cualquier o ambos extremos terminales tambien se ha demostrado que son sustancialmente resistentes a la degradacion por nucleasas.
El tamano del oligonucleotido CpG (es decir, el numero de restos nucleotfdicos a lo largo de la longitud del oligonucleotido) tambien pueden contribuir a la actividad estimuladora del oligonucleotido. Para facilitar la captacion en celulas, el oligonucleotido CpG de la invencion tiene preferentemente una longitud minima de 6 restos nucleotfdicos. Los oligonucleotidos de cualquier tamano superior a 6 nucleotidos (incluso de muchas kb de longitud) son capaces de inducir una respuesta inmune si estan presentes suficientes motivos inmunoestimuladores, debido a que los oligonucleotidos de mayor tamano se degradan en el interior de las celulas. En ciertas realizaciones, los oligonucleotidos CpG tienen una longitud de 6 a 100 nucleotidos, preferentemente una longitud de 8 a 30 nucleotidos. En realizaciones importantes, los acidos nucleicos y oligonucleotidos de la invencion no son plasmidos o vectores de expresion.
En una realizacion, el oligonucleotido CpG descrito en este documento comprende sustituciones o modificaciones, tales como en las bases y/o azucares que se describen en los parrafos 134 a 147 del documento WO2007/026190.
En una realizacion, el oligonucleotido CpG de la presente invencion esta qmmicamente modificado. Los especialistas en la tecnica conocen ejemplos de modificaciones qmmicas y se describen, por ejemplo, en Uhlmann E. y col. (1990), Chem. Rev. 90: 543, S. Agrawai, Ed., Humana Press, Totowa, Estados Unidos 1993; Crooke, S. T. y col. (1996) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 36: 107-129; y Hunziker J. y col., (1995), Mod. Synth. Methods 7: 331417. Un oligonucleotido de acuerdo con la invencion puede tener una o mas modificaciones, localizandose cada modificacion en un puente internucleosfdico fosfodiester particular y/o en una unidad de p-D-ribosa particular y/o en una posicion de base nucleosfdica natural particular en comparacion con un oligonucleotido de la misma secuencia que esta compuesto por ADN o ARN natural.
En algunas realizaciones de la invencion, los acidos nucleicos que contienen CpG pueden mezclarse simplemente con vehfculos inmunogenicos de acuerdo con procedimientos conocidos por los especialistas en la tecnica (vease, por ejemplo, el documento WO03/024480).
En una realizacion particular de la presente invencion, cualquiera de las vacunas descritas en este documento comprende de 2 |ig a 100 mg de oligonucleotido CpG, preferentemente de 0,1 mg a 50 mg de oligonucleotido CpG, preferentemente de 0,2 mg a 10 mg de oligonucleotido CpG, preferentemente de 0,3 mg a 5 mg de oligonucleotido CpG, preferentemente de 0,3 mg a 5 mg de oligonucleotido CpG, aun preferentemente de 0,5 a 2 mg de oligonucleotido CpG, incluso preferentemente de 0,75 a 1,5 mg de oligonucleotido CpG. En una realizacion preferida, cualquiera de las vacunas descritas en este documento comprende aproximadamente 1 mg de oligonucleotido CpG.
En algunas realizaciones de la invencion, los acidos nucleicos que contienen CpG pueden mezclarse simplemente con vehfculos inmunogenicos de acuerdo con procedimientos bien conocidos por los especialistas en la tecnica (vease por ejemplo el documento WO03/024480). En otras realizaciones de la invencion, los acidos nucleicos que contienen CpG podnan incluirse en el interior de VLP (vease, por ejemplo, el documento WO03/024481).
Los adyuvantes preferidos en el contexto de la presente invencion incluyen alumbre; oligonucleotidos que contienen CpG, preferentemente CpG 7909 (SEC ID N.°: 433) y CpG24555 (SEC ID N.°: 431); y adyuvantes basados en
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saponina, preferentemente Iscomatrix, que podnan usarse en solitario o en combinacion. Preferentemente, dicho acido nucleico que contiene CpG comprende uno o mas enlaces modificados, preferentemente uno o mas enlaces fosforotioato, aun mas preferentemente todos los enlaces internucleotfdicos del oligonucleotido son enlaces fosforotioato.
La divulgacion proporciona por lo tanto una composicion inmunogenica que comprende un peptido de IgE antigenico, que comprende preferentemente una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC iD N.°s: 1 a 430, mas preferentemente una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°s: 1 a 153 y 220 a 430, aun mas preferentemente una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.°: 220 a 430 y al menos un adyuvante. Dicho peptido de IgE antigenico se une preferentemente a un vehmulo inmunogenico como se describe en este documento, preferentemente una VLP, mas preferentemente una VLP de HBsAg, HBcAg o Qbeta. En una realizacion, dicho adyuvante es un adyuvante basado en saponina, preferentemente Iscomatrix. En otra realizacion, dicho adyuvante es alumbre. En otra realizacion mas, dicho adyuvante es un acido nucleico que contiene CpG. Preferentemente dicho adyuvante es CpG7909. Mas
preferentemente dicho adyuvante es CpG24555. Preferentemente, dicho acido nucleico que contiene CpG
comprende uno o mas enlaces modificados, preferentemente uno o mas enlaces fosforotioato, aun mas
preferentemente todos los enlaces internucleotfdicos del oligonucleotido son enlaces fosforotioato.
En otra realizacion mas, dicho al menos un adyuvante comprende dos adyuvantes, preferentemente seleccionados del grupo constituido por alumbre, adyuvantes basados en saponina y acidos nucleicos que contienen CpG. En una realizacion preferida, dichos adyuvantes son alumbre y un acido nucleico que contiene CpG, preferentemente CpG7909 o CpG24555, mas preferentemente CpG24555. Preferentemente, dicho acido nucleico que contiene CpG comprende uno o mas enlaces modificados, preferentemente uno o mas enlaces fosforotioato, aun mas
preferentemente todos los enlaces internucleotfdicos de los oligonucleotidos son enlaces fosforotioato. En otra realizacion preferida, dichos adyuvantes son un adyuvante basado en saponina, preferentemente Iscomatrix y un acido nucleico que contiene CpG, preferentemente CpG7909, mas preferentemente CpG24555. Preferentemente, dicho acido nucleico que contiene CpG comprende uno o mas enlaces modificados, preferentemente uno o mas enlaces fosforotioato, aun mas preferentemente todos los enlaces internucleotfdicos del oligonucleotido son enlaces fosforotioato. En otra realizacion preferida, dichos adyuvantes son alumbre y un adyuvante basado en saponina, preferentemente Iscomatrix.
En otra realizacion mas, dicho al menos un adyuvante comprende tres adyuvantes, preferentemente seleccionados del grupo constituido por alumbre, un adyuvante basado en saponina, preferentemente Iscomatrix y acidos nucleicos que contienen CpG, mas preferentemente CpG7909 o CpG24555. Preferentemente, dicho acido nucleico que contiene CpG comprende uno o mas enlaces modificados, preferentemente uno o mas enlaces fosforotioato, aun mas preferentemente todos los enlaces internucleotfdicos del oligonucleotido son enlaces fosforotioato.
Composiciones farmaceuticas de la invencion
La invencion tambien proporciona composiciones farmaceuticas que comprenden un peptido de IgE antigenico de la invencion o una composicion inmunogenica del mismo en una formulacion en asociacion con uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables y opcionalmente combinado con uno o mas adyuvantes (como los adyuvantes descritos anteriormente). El termino “excipiente” se usa en este documento para describir cualquier ingrediente distinto del ingrediente activo, es decir el peptido de IgE antigenico de la invencion en ultima instancia acoplado a un vehmulo inmunogenico y opcionalmente combinado con uno o mas adyuvantes. La seleccion del excipiente o excipientes dependera en gran medida de factores tales como el modo de administracion particular, el efecto del excipiente sobre la solubilidad y la estabilidad y la naturaleza de la forma farmaceutica. Como se usa en este documento, la expresion “excipiente farmaceuticamente aceptable” incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersion, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos y retardantes de la absorcion y similares que sean fisiologicamente compatibles. Algunos ejemplos de excipientes farmaceuticamente aceptables son agua, solucion salina, solucion salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, asf como combinaciones de los mismos. En muchos casos sera preferible incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro sodico en la composicion. Los ejemplos adicionales de sustancias farmaceuticamente aceptables son agentes humectantes o cantidades minoritarias de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones que aumentan la vida util o eficacia del ingrediente activo. Las composiciones farmaceuticas de la presente invencion y procedimientos para su preparacion seran facilmente evidentes para los especialistas en la tecnica. Dichas composiciones y procedimientos para su preparacion pueden encontrarse, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 19a Edicion (Mack Publishing Company, 1995). Las composiciones farmaceuticas se fabrican preferentemente en condiciones de GMP.
Una composicion farmaceutica de la invencion puede prepararse, envasarse o comercializarse a granel como una dosis unitaria individual, o como una pluralidad de dosis unitarias individuales. Como se usa en este documento, una “dosis unitaria” es una cantidad discreta de la composicion farmaceutica que comprende una cantidad predeterminada del ingrediente activo. La cantidad del ingrediente activo generalmente es igual a la dosificacion del ingrediente activo que se administrana a un sujeto o a una fraccion conveniente de dicha dosificacion tal como, por ejemplo, la mitad o un tercio de dicha dosificacion.
Puede emplearse convenientemente cualquier procedimiento para administrar peptidos o protemas aceptado en la tecnica para los peptidos o protemas de la invencion.
Las composiciones farmaceuticas de la invencion son tfpicamente adecuadas para administracion parenteral. Como se usa en este documento, la expresion “administracion parenteral” de una composicion farmaceutica incluye cualquier via de administracion caracterizada por la ruptura ffsica de un tejido de un sujeto y la administracion de la composicion farmaceutica a traves de la ruptura en el tejido, dando como resultado generalmente la administracion directa en el torrente sangumeo, en el musculo o en un organo interno. La administracion parenteral incluye por lo tanto, pero sin limitacion, la administracion de una composicion farmaceutica por inyeccion de la composicion, por
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aplicacion de la composicion a traves de una incision quirurgica, por aplicacion de la composicion a traves de una herida no quirurgica penetrante en el tejido y similares. En particular, se contempla que la administracion parenteral incluye, pero sin limitacion, inyeccion o infusiones subcutaneas, intraperitoneales, intramusculares, intraesternales, intravenosas, intraarteriales, intratecales, intraventriculares, intrauretrales, intracraneales, intrasinoviales; y tecnicas de infusion por dialisis renal. Las realizaciones preferidas incluyen las v^as intravenosa, subcutanea, intradermica, intramuscular, siendo realizaciones aun mas preferidas las v^as intramuscular o subcutanea.
Las formulaciones de una composicion farmaceutica adecuadas para administracion parenteral comprenden tipicamente generalmente el ingrediente activo combinado con un vehnculo farmaceuticamente aceptable, tal como agua esteril o solucion salina isotonica esteril. Dichas formulaciones pueden prepararse, envasarse o comercializarse en una forma adecuada para administracion embolada o para administracion continua. Las formulaciones inyectables pueden prepararse, envasarse o comercializarse en forma farmaceutica unitaria, tal como en ampollas o en recipientes multidosis que contienen un conservante. Las formulaciones para administracion parenteral incluyen, pero sin limitacion, suspensiones, soluciones, emulsiones en vehnculos aceitosos o acuosos, pastas y similares. Dichas formulaciones pueden comprender ademas uno o mas ingredientes adicionales incluyendo, pero sin limitacion, agentes de suspension, estabilizacion o dispersion. En una realizacion de una formulacion para administracion parenteral, el ingrediente activo se proporciona en forma seca (es decir en polvo o granular) para reconstitucion con un vehnculo adecuado (por ejemplo agua apirogena esteril) antes de la administracion parenteral de la composicion reconstituida. Las formulaciones parenterales tambien incluyen soluciones acuosas que pueden contener excipientes tales como sales, carbohidratos y agentes tamponantes (preferentemente a un pH de 3 a 9) pero, para algunas aplicaciones, pueden formularse mas convenientemente como una solucion no acuosa esteril o como una forma seca que se usara junto con un vetnculo adecuado tal como agua apirogena esteril. Las formas de administracion parenteral ejemplares incluyen soluciones o suspensiones en soluciones acuosas esteriles, por ejemplo, soluciones de propilenglicol o dextrosa acuosas. Dichas formas farmaceuticas pueden tamponarse convenientemente, si se desea. Otras formulaciones que pueden administrarse por via parenteral que son utiles incluyen las que comprenden el ingrediente activo en forma microcristalina, o en una preparacion liposomal. Las formulaciones para administracion parenteral pueden formularse para que sean de liberacion inmediata y/o modificada. Las formulaciones de liberacion modificada incluyen liberacion retrasada, sostenida, pulsada, controlada, dirigida y programada.
Por ejemplo, en un aspecto, pueden prepararse soluciones inyectables esteriles por incorporacion del peptido anti- IgE, preferentemente acoplado a un vehfculo inmunogenico, en ultima instancia en combinacion con uno o mas adyuvantes, en la cantidad necesaria en un disolvente apropiado con uno o una combinacion de ingredientes enumerados anteriormente, segun sea necesario, seguido de esterilizacion por filtracion. Generalmente, se preparan dispersiones por incorporacion del compuesto activo en un vehnculo esteril que contiene un medio de dispersion basico y los otros ingredientes necesarios de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos esteriles para la preparacion de soluciones inyectables esteriles, los procedimientos preferidos de preparacion son secado al vacfo y secado por congelacion que dan un polvo del ingrediente activo mas cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solucion previamente esterilizada por filtracion del mismo. La fluidez apropiada de una solucion puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lectina, por mantenimiento del tamano de partfcula necesario en el caso de una dispersion y por el uso de tensioactivos. La absorcion prolongada de composiciones inyectables puede provocarse incluyendo en la composicion un agente que retrase la absorcion, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.
Una composicion farmaceutica no limitante ejemplar de la invencion es una formulacion como una solucion acuosa esteril que tiene un pH que vana de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,5 y que comprende de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml de un peptido de la invencion, de aproximadamente 1 milimolar a aproximadamente 100 milimolar de tampon de histidina, de aproximadamente 0,01 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml de polisorbato 80, de aproximadamente 100 milimolar a aproximadamente 400 milimolar de trehalosa y de aproximadamente 0,01 milimolar a aproximadamente 1,0 milimolar de EDTA disodico dihidrato.
Los peptidos de IgE antigenicos de la invencion tambien pueden administrarse por via intranasal o por inhalacion, tfpicamente en forma de un polvo seco (bien en solitario, bien como una mezcla o bien como una partfcula de componente mixto, por ejemplo, mezclada con un excipiente farmaceuticamente aceptable adecuado) a partir de un inhalador de polvo seco, como una pulverizacion en aerosol a partir de un recipiente presurizado, bomba, pulverizador, atomizador (preferentemente un atomizador que use la electrohidrodinamica para producir una neblina fina) o nebulizador con o sin el uso de un propulsor adecuado, o como gotas nasales.
El recipiente presurizado, bomba, pulverizador, atomizador o nebulizador contiene generalmente una solucion o suspension de un anticuerpo de la invencion que comprende, por ejemplo, un agente adecuado para dispersion, solubilizacion o prolongacion de la liberacion del ingrediente activo, un propulsor o propulsores como disolvente.
Antes del uso en una formulacion de polvo seco o suspension, el producto farmacologico se microniza generalmente hasta un tamano adecuado para el suministro por inhalacion (tfpicamente menor de 5 micrometros). Esto puede conseguirse por cualquier procedimiento de trituracion apropiado, tal como molienda de chorro en espiral, molienda de chorro en lecho fluido, procesamiento en fluido supercntico para formar nanopartfculas, homogeneizacion a alta presion o secado por pulverizacion.
Pueden formularse capsulas, blfsteres y cartuchos para uso en un inhalador o insuflador para que contengan una mezcla en polvo del compuesto de la invencion, una base de polvo adecuada y un modificador del rendimiento.
Una formulacion de solucion adecuada para usar en un atomizador que usa la electrohidrodinamica para producir una neblina fina puede contener una dosis adecuada del peptido de IgE antigenico de la invencion por accionamiento y el volumen de accionamiento puede variar por ejemplo de 1 pl a 100 pl.
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Pueden anadirse sapoffferos adecuados tales como mentol y levomentol o edulcorantes tales como sacarina o sacarina sodica a las formulaciones de la invencion destinadas para administracion inhalada/intranasal.
Las formulaciones para administracion inhalada/intranasal pueden formularse para que sean de liberacion inmediata y/o modificada. Las formulaciones de liberacion modificada incluyen liberacion retrasada, sostenida, pulsada, controlada, dirigida y programada.
En el caso de inhaladores y aerosoles de polvo seco, la unidad de dosificacion se determina por medio de una valvula que suministra una cantidad medida. Las unidades de acuerdo con la invencion se disponen ffpicamente para administrar una dosis medida o “descarga” de un anticuerpo de la invencion. La dosis diaria total se administrara ffpicamente en una sola dosis o, mas habitualmente, como dosis divididas a lo largo del dfa.
Una composicion farmaceutica que comprende un peptido de IgE antigenico tambien puede formularse para una administracion por via oral. La administracion oral puede implicar deglucion, de modo que el compuesto entra en el tracto gastrointestinal y/o administracion bucal, lingual o sublingual, por las que el compuesto entra directamente en el torrente sangumeo desde la boca.
Las formulaciones adecuadas para administracion oral incluyen sistemas solidos, semisolidos y lfquidos tales como comprimidos; capsulas blandas o duras que contienen multi o nanoparticulados, lfquidos o polvos; grageas (incluyendo rellenas de lfquido); masticables, geles, formas farmaceuticas de dispersion rapida; pelmulas; ovulos, pulverizaciones; y parches bucales/mucoadhesivos.
Las formulaciones lfquidas incluyen suspensiones, soluciones, jarabes y elixires. Dichas formulaciones pueden emplearse como cargas en capsulas blandas o duras (hechas, por ejemplo, de gelatina o hidroxipropilmetilcelulosa) y ffpicamente comprenden un vehmulo, por ejemplo, agua, etanol, polietilenglicol, propilenglicol, metilcelulosa o un aceite adecuado y uno o mas agentes emulsionantes y/o agentes de suspension. Las formulaciones lfquidas tambien pueden prepararse por reconstitucion de un solido, por ejemplo, a partir de un sobrecito.
Las composiciones de la invencion pueden usarse para tratar, aliviar o prevenir trastornos o smtomas mediados por IgE en un sujeto en riesgo o que padece dicho trastorno o smtoma por estimulacion de una respuesta inmune en dicho sujeto por inmunoterapia. La inmunoterapia puede comprender una inmunizacion inicial seguida de, por ejemplo, uno, dos, tres o mas refuerzos adicionales.
Una “cantidad inmunologicamente eficaz” de un peptido de IgE antigenico de la invencion, o composicion del mismo es una cantidad que se suministra a un sujeto mairnfero, en una sola dosis o como parte de una serie, que es eficaz para inducir una respuesta inmune contra IgE en dicho sujeto. Esta cantidad vaffa dependiendo del estado de salud y ffsico del individuo a tratarse, del grupo taxonomico del individuo a tratarse, de la capacidad del sistema inmune del individuo para sintetizar anticuerpos, de la formulacion de la vacuna y de otros factores pertinentes. Se espera que la cantidad este dentro de un intervalo relativamente amplio que puede determinarse a traves de ensayos de rutina.
Una “dosis farmaceuticamente eficaz” o “dosis terapeuticamente eficaz” es esa dosis necesaria para tratar o prevenir o aliviar uno o mas trastornos o smtomas relacionados con IgE en un sujeto. La dosis farmaceuticamente eficaz depende entre otras cosas del compuesto espedfico a administrar, la gravedad de los smtomas, la susceptibilidad del sujeto a efectos secundarios, el tipo de enfermedad, la composicion usada, la via de administracion, el tipo de mairnfero que se trata, las caracteffsticas ffsicas del mairnfero espedfico en consideracion tal como estado de salud y ffsico, la medicacion concurrente, la capacidad del sistema inmune del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de proteccion deseado y otros factores que reconoceran los especialistas en la tecnica medica. Para fines de profilaxis, la cantidad de peptido en cada dosis se selecciona como una cantidad que induce una respuesta inmunoprotectora sin efectos secundarios adversos significativos en vacunas ffpicas. Despues de una vacunacion inicial, los sujetos pueden recibir una o varias inmunizaciones de refuerzo separadas adecuadamente.
Se entiende que el nivel de dosis espedfico para cualquier paciente particular depende de una diversidad de factores que incluyen la actividad del compuesto espedfico empleado, la edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta, momento de administracion, via de administracion y velocidad de excrecion, combinacion farmacologica y la gravedad de la enfermedad particular que se somete a terapia.
Por ejemplo, peptidos de IgE antigenicos o composicion farmaceutica de la invencion pueden administrarse a un sujeto a una dosis de aproximadamente 0,1 |ig a aproximadamente 200 mg, por ejemplo, de aproximadamente 0,1 |ig a aproximadamente 5 |ig, de aproximadamente 5 |ig a aproximadamente 10 |ig, de aproximadamente 10 |ig a aproximadamente 25 |ig, de aproximadamente 25 |ig a aproximadamente 50 |ig, de aproximadamente 50 |ig a aproximadamente 100 |ig, de aproximadamente 100 |ig a aproximadamente 500 |ig, de aproximadamente 500 |ig a aproximadamente 1 mg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 2 mg, con refuerzos opcionales administrados, por ejemplo, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, dos meses, tres meses, 6 meses y/o un ano despues.
En algunas realizaciones, se administra una sola dosis de un peptido de IgE antigenico o composicion farmaceutica de acuerdo con la invencion. En otras realizaciones, se administran multiples dosis de un peptido de IgE antigenico o composicion farmaceutica de acuerdo con la invencion. La frecuencia de administracion puede variar dependiendo de cualquiera de una diversidad de factores, por ejemplo, gravedad de los smtomas, grado de inmunoproteccion deseado, de si la composicion se usa para fines profilacticos o curativos, etc. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un peptido de IgE antigenico o composicion farmaceutica de acuerdo con la invencion se administra una vez al mes, dos veces al mes, tres veces al mes, cada dos semanas (qow), una vez por semana (qw), dos veces por semana (biw), tres veces por semana (tiw), cuatro veces por semana, cinco veces por semana, seis veces por semana, dfa sf dfa no (qod), diariamente (qd), dos veces al dfa (qid) o tres veces al dfa (tid). Cuando la composicion de la invencion se usa para fines de profilaxis, generalmente se administrara tanto para las dosis de sensibilizacion como para las
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de refuerzo. Se espera que las dosis de refuerzo esten separadas adecuadamente o se administraran preferentemente anualmente o en los momentos en los que los niveles de anticuerpo circulante caigan por debajo de un nivel deseado. Las dosis de refuerzo pueden estar constituidas por el peptido de IgE antigenico en ausencia de la molecula de vehmulo inmunogenica original. Dichas construcciones de refuerzo pueden comprender un vehmulo inmunogenico alternativo o pueden carecer de cualquier vehmulo. Dichas composiciones de refuerzo pueden formularse con o sin adyuvante.
La duracion de la administracion de un peptido de IgE antigenico de acuerdo con la invencion, por ejemplo, el periodo de tiempo durante el que se administra un peptido de IgE antigenico, puede variar dependiendo de cualquiera de una diversidad de factores, por ejemplo, la respuesta del paciente, etc. Por ejemplo, un peptido de IgE antigenico puede administrarse a lo largo de un periodo de tiempo que vana de aproximadamente un dfa a aproximadamente una semana, de aproximadamente dos semanas a aproximadamente cuatro semanas, de aproximadamente un mes a aproximadamente dos meses, de aproximadamente dos meses a aproximadamente cuatro meses, de aproximadamente cuatro meses a aproximadamente seis meses, de aproximadamente seis meses a aproximadamente ocho meses, de aproximadamente ocho meses a aproximadamente 1 ano, de aproximadamente 1 ano a aproximadamente 2 anos o de aproximadamente 2 anos a aproximadamente 4 anos o mas.
Tambien se contemplan una diversidad de procedimientos de tratamiento en la presente divulgacion, comprendiendo dichos procedimientos administrar un peptido de IgE antigenico de acuerdo con la invencion. Los presentes procedimientos de tratamiento incluyen procedimientos de induccion de una respuesta inmune en un individuo contra IgE propia y procedimientos para prevenir, aliviar o tratar un trastorno o smtoma mediado por IgE en un individuo.
En un aspecto, la presente divulgacion proporciona un procedimiento para tratar, prevenir o aliviar un trastorno o smtoma relacionado con IgE en un sujeto, que comprende administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de un peptido de IgE antigenico de la divulgacion, o composicion inmunogenica o farmaceutica del mismo, a dicho sujeto.
En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona un procedimiento para inducir una respuesta inmune contra IgE propia en un sujeto, que comprende administrar una cantidad terapeuticamente o inmunologicamente eficaz de un peptido de IgE antigenico de la divulgacion, o una composicion inmunogenica o farmaceutica del mismo a dicho sujeto.
Los terminos “tratar”, “que trata” y “tratamiento” se refieren a un procedimiento para aliviar o suprimir un trastorno biologico y/o al menos uno de sus smtomas relacionados. Como se usa en este documento, “aliviar” una enfermedad, trastorno o afeccion significa reducir la gravedad y/o frecuencia de aparicion de los smtomas de la enfermedad, trastorno o afeccion. Ademas, las referencias en este documento a “tratamiento” incluyen referencias a tratamiento curativo, paliativo y profilactico. Dicho sujeto es preferentemente un ser humano y puede ser masculino o femenino de cualquier edad.
Otros aspectos de la invencion se refieren a un peptido de IgE antigenico de acuerdo con la invencion o a una composicion inmunogenica o una composicion farmaceutica del mismo, para uso como un medicamento, preferentemente en tratamiento, alivio o profilaxis de trastornos relacionados con IgE.
En otra realizacion mas, la presente invencion proporciona el uso de un peptido de IgE antigenico de la invencion o de una composicion inmunogenica o una composicion farmaceutica del mismo en la fabricacion de un medicamento, preferentemente para tratar un trastorno mediado por IgE.
En algunos aspectos de los usos o procedimientos de la invencion, dicho trastorno mediado por IgE se selecciona del grupo constituido por conjuntivitis, asma alergica, rinitis alergica, dermatitis atopica, anafilaxia, asma, dermatitis de contacto, gastroenteropatia alergica, aspergilosis pulmonar alergica, purpura alergica, eccema, smdrome de hiper IgE (de Job), hipersensibilidad anafilactica, mieloma de IgE, enfermedad inflamatoria del intestino (por ejemplo, enfermedad de Crohn, alergias alimentarias, colitis ulcerosa, colitis indeterminada y colitis infecciosa), urticaria, soriasis, preferentemente del grupo constituido por asma, asma alergica, rinitis alergica y alergias alimentarias.
El asma es un trastorno inflamatorio cronico de las vfas respiratorias que causa episodios recurrentes de sibilancias, dificultades para respirar, opresion en el pecho y/o tos en individuos susceptibles. Los especialistas en la tecnica distinguen diversos tipos de asma incluyendo: asma alergica, que se piensa que surge en pacientes que han desarrollado una hipersensibilidad a alergenos ambientales; asma inducida por farmacos, tfpicamente desencadenada por sensibilidad a aspirina u otros inhibidores de la COX; asma inducida por el ejercicio; asma casi mortal o hiperaguda; asma nocturna; asma ocupacional, generalmente causada por exposicion a ciertos compuestos qrnmicos en el lugar de trabajo. Por lo tanto, el asma puede desencadenarse por diversos estfmulos incluyendo: alergenos del aire tales como acaros del polvo, polen, caspa animal, esporas fungicas, plumas... (asma extrmseca); irritantes inespedficos tales como humo del tabaco, vapores qrnmicos, polucion, dioxido de azufre... (asma intrmseca).
La rinitis alergica implica generalmente un grupo de smtomas, incluyendo smtomas inflamatorios, predeterminantemente en la nariz, los senos y los ojos que aparecen despues de la exposicion a partmulas del aire. Los smtomas incluyen estornudos; obstruccion nasal; moqueo (y ocasionalmente sangrados nasales); tos; cefalea; picor de nariz, boca, ojos, garganta, piel o cualquier area expuesta al alergeno; olfato alterado (y por lo tanto sensibilidad a sabores); nariz taponada (congestion nasal); conjuntivitis; ojos llorosos; garganta dolorida; y sibilancias.
La rinitis alergica puede ser perenne y/o estacional. La rinitis alergica perenne es una rinitis alergica que dura todo el ano. Tfpicamente esta causada por una exposicion continua a alergenos tales como caspa animal, esporas de mohos de interior o acaros del polvo domesticos. La rinitis alergica estacional es una rinitis alergica que se produce
solamente durante ciertos momentos del ano. Esta comunmente causada por alergias a polen de arboles, cesped y malas hierbas que se producen estacionalmente.
Una alergia alimentaria es una respuesta inmune exagerada desencadenada por huevos, cacahuetes, leche o algun otro alimento espedfico. Cualquier alimento puede causar una reaccion alergica pero unos pocos alimentos son los 5 principales culpables. En ninos las alergias alimentarias mas comunes son a huevos, cacahuetes, leche, soja, avellanas, trigo, marisco (camarones, cangrejos, langosta, caracoles, almejas). En ninos mayores y adultos, las alergias alimentarias mas comunes son: cacahuetes, avellanas, marisco, peces. Los smtomas pueden limitarse principalmente al estomago y los intestinos o pueden implicar a muchas partes del cuerpo despues de que se digiera o absorba el alimento. Los smtomas pueden incluir: picor de garganta, anafilaxia (una reaccion alergica corporal 10 completa grave que puede resultar mortal); dolor abdominal; diarrea; nauseas; vomitos; calambres estomacales; picor de la boca, garganta, ojos, piel o de cualquier area; urticaria; angioedema (hinchazon, especialmente de los parpados, cara, labios y lengua); aturdimiento ligero o desmayo; congestion nasal; moqueo; falta de aliento; sibilancias; dificultades para tragar; smdrome de alergia oral. El smdrome de alergia oral comprende generalmente picor en los labios, lengua y garganta y a veces labios hinchados.
15 En otros aspectos de los usos o procedimientos de la invencion, dicho sujeto es un mairnfero, preferentemente un sujeto humano.
En aun otros aspectos de los usos o procedimientos de la invencion, dicho sujeto padece dicho trastorno mediado por IgE. Como alternativa, dicho sujeto esta en riesgo de padecer dicho trastorno mediado por IgE.
Ejemplos
20 Los siguientes ejemplos se exponen para proporcionar a los especialistas en la tecnica una divulgacion completa y una descripcion de como realizar y usar la presente invencion y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invencion ni pretenden representar que los experimentos a continuacion son todos y los unicos experimentos realizados. Se han realizado esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los numeros usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero debenan explicarse algunos errores y desviaciones 25 experimentales. A menos que se indique otra cosa, las partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular promedio en peso, la temperatura esta en grados Celsius y la presion es la o esta proxima a la atmosferica. Pueden usarse abreviaturas convencionales, por ejemplo, pb, par(es) de bases; kb, kilobase(s); pl, picolitro(s); s o seg segundo(s); min, minuto(s); h, hora(s); aa, aminoacido(s); kb, kilobase(s), pb, par(es) de bases; nt, nucleotido(s); i.m. intramuscular/por via intramuscular; i.p., intraperitoneal/por via intraperitoneal; s.c., 30 subcutanea/por via subcutanea; y similares.
Ejemplo 1. Seleccion de peptidos de IgE antigenicos
La estructura de los dominios constantes CH3-CH4 de la IgE humana que interaccionan con la subunidad alfa del receptor de alta afinidad de IgE FceRI se ha resuelto y publicado (Wurzburg BA y col., (2000) Immunity, 13 (3), 37585; Garman SC y col., (2000) Nature 20, 406 (6793), 259-66). Esta informacion estructural se uso junto con la 35 bibliograffa que sugiere que hay dos regiones en las que se produce la union para identificar 4 bucles potenciales
como puntos de interaccion clave y para disenar los siguientes 4 peptidos que se correspondenan con areas de importancia para la interaccion de IgE-FceRI (vease la figura 1).
Morado: ADSNPRGVSAYLSRPSP (SEC ID N.°: 312)
Azul: LWDLAPSKGTVN (SEC ID N.°: 165)
40 Naranja: STRKEEKQRNGTLTVTSTLP (SEC ID N.°: 1)
Amarillo: QCRVTHPHLPRALMRS (SEC ID N.°: 220).
Ejemplo 2 - Preparacion de conjugados de Morado-VLP
El peptido morado (SEC ID N°: 312) en el que se anadio un resto de cistema terminal para fines de conjugacion (secuencia ADSNPRGVSAYLSRPSPC (SEC ID N.°: 434)) se sintetizo usando un protocolo de Fmoc convencional 45 en resina de amida CLEAR. Las reacciones de acoplamiento de aminoacidos se realizaron usando un exceso de 5 veces de aminoacido protegido con Fmoc activado con 1 eq de HBTU (hexafluorofosfato de (2-(1H-benzotriazol-1-il)- 1,1,3,3-tetrametiluronio) en presencia de HOBt (hidroxibenzotriazol) y NMM (N-metilmorfolina). La desproteccion del grupo Fmoc se consiguio con piperidina al 20 %/DMF. Despues se escindio el peptido unido a resina y se eliminaron los grupos protectores de cadena lateral simultaneamente con Reactivo D (TFA/H20/DODT: 89/3/8). El peptido se 50 genero con un extremo N-terminal libre y un extremo C-terminal amidado. El peptido bruto se purifico hasta la homogeneicidad por HPLC usando una columna BEH 130 C18 y un gradiente de agua/acetonitrilo en presencia de TFA al 0,1 %. El peptido purificado se seco al vacm usando un liofilizador. El peptido se analizo usando espectrometna de masas (CL-EM) y dio datos satisfactorios (veanse a continuacion).
Tabla 1
Peptido
Pureza Masa Esperada (Da) Masa Observada (Da)
Morado + Cistema (SEC ID N°: 434)
95 % 1877,1 1878,1
El peptido Morado + Cistema (SEC ID N°: 434) se conjugo con las partmulas similares a virus (VLP) Qp y Antfgeno de Superficie de Hepatitis B (HBsAg) en dos experimentos de conjugacion separados. El Qp usado en este estudio
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se produjo por fermentacion bacteriana de E. coli en una cepa BL21 (DE3) que incorporaba un plasmido pET28 que codifica la protema monomerica de 14 kD:
MAKLETVTLGNIGKDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVPALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTA NGSCDPSVTRQAYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY (SEC ID N°: 435). La
fermentacion se induce a una DO600 de 0,8 con IPTG y se deja que se desarrolle durante una noche en caldo Terrific (TB) con kanamicina. La VLP, que se autoensambla en la celula huesped, se purifico despues a partir del sedimento celular de fermentacion usando el procedimiento descrito en la solicitud de patente EP20050105513 con las siguientes diferencias: despues de la ruptura de las celulas, el homogeneizado aclarado se trato con sulfato de amonio a una saturacion del 50 % y el sedimento celular se recupero por centrifugacion. Despues, el sedimento se volvio a disolver en tampon HEPES y se dializo contra tampon HEPEs antes de proceder a la primera etapa de columna en el procedimiento publicado. Despues de las etapas de columna de intercambio ionico y de columna de hidroxilapatita, el material se purifico usando una etapa de columna de intercambio anionico adicional y se esterilizo por filtracion para generar el material a granel de VLP final que se analizo por cromatograffa de exclusion por tamano, SDS-PAGE y microscopfa electronica con resultados aceptables.
El HBsAg (subtipo adw) usado en este estudio se adquirio en Aldevron (ND, Estados Unidos). El HBsAg existe como parffculas esfericas de aproximadamente 22 nm de diametro que estan constituidas por multiples copias de una protema monomerica de 24 kD embebida en una vesmula de bicapa lipfdica. Tambien esta disponible una cepa de S. cerevisiae para la produccion de HBsAg de este tipo en la coleccion de cultivos ATCC.
Las VLP (tanto de Qp como de HBsAg) se activaron usando reactivo de enlace de ester de W-gamma-maleimido- butiriloxi-succinimida (GMBS). El reactivo GMBS se disolvio en dimetilsulfoxido (DMSO) y se anadio a la solucion de VLP a un exceso molar de >10 veces. Se dejo que la reaccion de activacion se desarrollara durante >30 minutos y despues la solucion se desalinizo usando una columna de desalinizacion NAP-25 en Solucion Salina Tamponada con Fosfato de Dulbecco (DPBS) con EDTA 5 mM. Si era necesario, la solucion de protema se concentro ligeramente usando microconcentradores de centnfuga de 10 kD antes de la siguiente reaccion de conjugacion.
Antes de la reaccion de conjugacion, el peptido morado se disolvio en una affcuota de DPBS pH 7,4 con EDTA 5 mM como aditivo. La concentracion del peptido en la solucion era de 10 mg/ml. El peptido solubilizado se anadio a una affcuota de agente reductor inmovilizado TCEP (Pierce Chemical) que se habfa lavado en DPBS que contema EDTA 5 mM. La affcuota de peptidos se incubo con mezcla en presencia del gel TCEP durante aproximadamente 1 hora, tiempo despues del que la affcuota se precipito por centrifugacion en una microfuga y se desecho el sedimento solido. El sobrenadante que contema peptido reducido se anadio directamente a la VLP activada que se habfa preparado anteriormente.
Se dejo que la reaccion entre las VLP y los peptidos reducidos se desarrollara durante al menos treinta minutos con mezcla muy suave. Al final del tiempo de reaccion cada muestra se desalinizo en PBS de Dulbecco (DPBS) usando columnas de desalinizacion NAP-10 o NAP-25 (GE Healthcare). Los peptidos conjugados desalinizados se analizaron para determinar el contenido de protema usando el ensayo de Bradford (Azul Brillante de Coomassie, Pierce Chemical), asf como mediante SDS-PAGE y cromatograffa de exclusion por tamano. Los productos conjugados se esterilizaron por filtracion usando un filtro de 0,22 |im y se almacenaron a 2-8°C hasta el uso. Se presto especial atencion a estas muestras durante el almacenamiento para prevenir la congelacion o exposicion a temperaturas extremas.
El grado de la conjugacion para las dos muestras de VLP-peptido se midio usando SDS-PAGE y se observo un aumento de peso molecular para ambas muestras que concordaba con la adicion del peptido al monomero de protema VLP. Ademas, la muestra de Qp-peptido se ensayo en el ensayo de cromatograffa de exclusion por tamano por HPLC (usando una columna de HPLC Tosoh PWXL5000) y se descubrio que contema VLP ensamblada en comparacion con muestras de VLP no conjugadas. Ademas, la muestra de Qp-peptido se observo usando microscopfa electronica usando un JEOL 1230 TEM con haz de 80 kV y se descubrio que contema parffculas uniformes, ensambladas. La integridad de la partmula de conjugado de HBsAg-peptido se ensayo usando un SDS- PAGE no reducido y puesto que la protema no se introduda en el gel, se considero que la muestra contema especies de alta masa molecular y que era adecuada para el uso in vivo.
Ejemplo 3. Preparacion de conjugados de Naranja, Morado, Amarillo y Azul-VLP, asi como de conjugados de VLP con Morado Limitado y Azul Mejorado
Los peptidos Amarillo, Azul + Cistema, Morado + Cistema y Naranja + Cistema cuyas secuencias de aminoacidos se indican en la Tabla 2 se sintetizaron de acuerdo con procedimientos conocidos en la tecnica y principalmente de acuerdo con el protocolo del Ejemplo 2 de la forma siguiente. Los peptidos se sintetizaron en un sintetizador de peptidos Symphony con un protocolo de Fmoc convencional en resina de amida CLEAR, excepto por el peptido Amarillo que se genero en una resina Fmoc-Ser(tBU)-Wang precargada. Vease el Ejemplo 2 para detalles acerca de las reacciones de acoplamiento y la desproteccion. Todos los peptidos se generaron con un extremo N-terminal libre y un extremo C-terminal amidado, excepto por el peptido Amarillo, que se genero con un extremo N-terminal acetilado y un extremo C-terminal carboxilado. Los peptidos en bruto se purificaron en un sistema de HPLC con una columna BEH 130 C18 como en el Ejemplo 2. Los peptidos purificados se secaron al vacm usando un liofilizador. Por ultimo, los peptidos se analizaron con CL-EM y todos los peptidos dieron datos satisfactorios (vease la Tabla 3 a continuacion).
Los peptidos Azul Mejorado y Morado Limitado se fabricaron por CEM Corporation (Matthews, NC, Estados Unidos). Los peptidos se fabricaron usando tecnicas de qmmica de peptidos convencionales y se purificaron usando cromatograffa. Los peptidos purificados se analizaron usando CL-EM y se descubrio que teman una alta pureza (>95 %) (vease la Tabla 3 a continuacion).
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Tabla 2. Secuencias peptidicas
Nombre
Secuencia SEC ID N.°
Naranja + Cistema
STRKEEKQRNGTLTVTSTLPC 436
Amarillo
QCRVTHPHLPRALMRS 220
Azul + Cistema
LVVDLAPSKGTVNC 437
Morado + Cistema
ADSNPRGVSAYLSRPSPC 434
Azul Mejorado
CLVVDLAPSKGTVNGGGGGC 438
Morado Limitado
CADSNPRGVSAYLSRPSPC 439
El subrayado indica restos de cistema anadidos con fines de conjugacion y el doble subrayado indica un engarce GC.
Tabla 3. Datos de CL-EM de Peptidos.
Peptido
Pureza Masa Esperada (Da) Masa Observada (Da)
Naranja + Cistema
97 % 2349,6 2352
Amarillo
98,7 % 1944,3 1944
Morado + Cistema
95 % 1877,1 1878,1
Azul + Cistema
96,6 % 1415,7 1416
Morado Limitado
>95 % 1979,0 1979,4
Azul Mejorado
>95 % 1803,8 1803,2
Cada peptido se conjugo con la partmula similar a virus (VLP) Qp en lotes separados. La Qp usada en este estudio se produjo por fermentacion bacteriana de E. coli y purificacion exhaustiva como en el Ejemplo 2.
La VLP (concentracion de protema >1 mg/ml mediante ensayo de Bradford) se activo usando reactivo de enlace de ester de N-gamma-maleimidobutiriloxi-succinimida (GMBS) de Pierce Chemical como se ha descrito en el Ejemplo 2 anteriormente.
Antes de la reaccion de conjugacion, cada peptido se disolvio en una almuota de Solucion Salina Tamponada con Fosfato de Dulbecco (DPBS) pH 7,4 con EDTA 5 mM como aditivo. La concentracion de cada peptido en solucion estaba en el intervalo de 8-12 mg/ml, vease la tabla 4 a continuacion para datos exactos. El peptido solubilizado se anadio a una almuota de agente reductor inmovilizado TCEP como se ha descrito en el Ejemplo 2 anteriormente. El sobrenadante que contema peptido reducido se anadio directamente a la VLP activada que se habfa preparado anteriormente. Se dejo que se desarrollara la reaccion entre las VLP y los peptidos reducidos durante al menos treinta minutos con mezcla muy suave. Al final del tiempo de reaccion cada muestra se desalinizo en PBS de Dulbecco (DPBS) usando columnas de desalinizacion NAP-10 o NAP-25 (GE Healthcare). Los peptidos conjugados desalinizados se concentraron despues usando concentradores de centnfuga MWCO de 10 kD y se analizaron para determinar el contenido de protema usando el ensayo de Bradford (Azul Brillante de Coomassie, Pierce Chemical), asf como mediante SDS-PAGE y cromatograffa de exclusion por tamano, vease a continuacion para detalles adicionales. Los productos conjugados se esterilizaron por filtracion usando un filtro de 0,22 pm y se almacenaron a 2-8°C hasta el uso. Se presto especial atencion a estas muestras durante el almacenamiento para evitar la congelacion o exposicion a temperaturas extremas. Los conjugados de VLP-peptido se analizaron para determinar el grado de conjugacion y el ensamblaje de partmulas como se ha descrito en el Ejemplo 2 anteriormente (SDS-PAGE incluyendo densitometna, microscopfa electronica y HPLC de exclusion por tamano).
Tabla 4. Conjugados de VLP-Peptido
Peptido
Cantidad de Peptido (mg) Concentracion de Peptido en DPBS (mg/ml) Cantidad aprox. de VLP activada anadida (mg) Rendimiento final (mg) Sustitucion* (pg de peptido por mg de protema)
Amarillo
4,5 11,3 5 3,2 54
Naranja + Cistema
4,5 11,3 5 2,8 70
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Azul + Cistema
3,5 8,8 4 1,9 47
Morado + Cistema
3,5 8,8 4 2,3 60
Morado Limitado
3 10 3 1,3 62
Azul Mejorado
3 10 3 1,5 48
*Como se determino mediante SDS-PAGE y calculos de densitometna
Ejemplo 4: preparacion de conjugados de KLH con Naranja, Morado, Amarillo y Azul, asi como de conjugados de KLH con Morado Limitado y Azul Mejorado
Los peptidos de la Tabla 2 se conjugaron con KLH adquirido en Pierce Chemical (Rockford, Illinois, Estados Unidos) y se purificaron de la forma siguiente. Los peptidos se prepararon como se ha detallado en los Ejemplos 2 y 3 anteriormente. La KLH usada era KLH activada por maleimida Imject suministrada por Pierce Chemical como un solido liofilizado. Se reconstituyeron viales de esta KLH con agua de calidad de cultivo tisular antes de la adicion de los peptidos. Los peptidos se trataron con gel TCEP como se ha descrito en los Ejemplos 2 y 3 anteriormente y los sobrenadantes que conteman peptidos reducidos se anadieron directamente a aftcuotas de la solucion de KLH activada y se incubaron con mezcla suave. Se dejo que la reaccion de acoplamiento se desarrollara durante dos horas, momento en el que las soluciones se centrifugaron para eliminar los solidos y se desalinizaron usando columnas de desalinizacion de goteo por gravedad como anteriormente. Los conjugados desalinizados se analizaron mediante SDS-PAGE, ensayo de protema de Bradford y digestion con tripsina, seguida de analisis de EM-MALDI. Los conjugados se esterilizaron por filtracion usando un filtro de 0,22 pm y se mantuvieron a 2-8°C hasta el uso, puesto que no se recomienda congelar las soluciones de KLH.
Ejemplo 5. Identificacion de peptidos de IgE
Este estudio tema como objetivo evaluar como eran de eficaces los peptidos conjugados con una VLP de Qbeta (como se ha detallado en los Ejemplos 2 y 3 anteriores) en la induccion de una respuesta de anticuerpos que puedan unirse a IgE humana. Se inyecto a Balb/c hembra (6-8 semanas) por via intramuscular (volumen inyectado de 50 microlitros en cada musculo Tibialis anterior) los dfas 0, 19 y 34. La necropsia tuvo lugar el dfa 46. En la necropsia se extrajo una muestra de sangre de 400-600 microlitros a partir de ratones eutanasiados por puncion cardiaca. Se dejo que la sangre coagulara durante una noche y al dfa siguiente se recogio el suero.
Se investigaron las respuestas de anticuerpos de animales inmunizados para algunos o todos los siguientes ensayos: a) determinacion del tftulo de IgG, b) union a IgE libre en suero, c) union a IgE unida a FceRI d) ensayo de desgranulacion y e) ensayos de cuantificacion de IgE.
a) Determinacion del tftulo de IgG total
Sumario: un ELISA colorimetrico que genera un tftulo redproco (RT) que representa los niveles de moleculas de IgG total que son espedficas para la vacuna. Se prepararon diluciones seriadas de muestras de sueros y se ensayaron en el ensayo. Se uso como control positivo una muestra de suero preparada a partir de muestras de sueros de ratones vacunados con Ce3 combinadas. Se uso como control negativo un suero negativo de Balb/c de Harlan Labs (combinado a partir de 400 animales de Harlan laboratories N.° de Codigo R-0131D). Recubrimiento de placas de ensayo: se recubrieron placas de ensayo de alta union de 384 pocillos (Corning International N.° de Cat. 3700) con 25 pl/pocillo de reserva de protema Ce3Ce4 humana diluida a 1 pg/ml con PBS 0,01 M pH 7,4 y se incubaron en un agitador a temperatura ambiente durante 3 horas. Despues de lavar x2 con PBS pH 7,4, las placas se bloquearon usando 80 pl/pocillo de PBS 0,01 M/BSA al 1 %, se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora antes de un lavado final x3 con PBS 0,01 M pH 7,4/Tween 20 al 0,05 %. Preparacion y ensayo de muestras: al dfa siguiente, se preparo una dilucion seriada semilogarftmica de 8 puntos de cada muestra partiendo de la dilucion 1:100 (diluyente PBS/BSA al 1 %), se transfirieron 25 pl/pocillo de la dilucion seriada por duplicado a la placa recubierta con Ce3Ce4 humana despues se incubaron en agitacion a temperatura ambiente durante 1,5 horas. Despues de lavar x3 con PBS 0,01 M pH 7,4/Tween 20 al 0,05 %, se anadieron 25 pl/pocillo de anticuerpo de deteccion de IgG total (Fc de conejo anti-IgG de raton, N.° de Cat. A90-130A Bethyl Laboratories) 1:6000 con PBS 0,01 M pH 7,4/BSA al 1 %, despues se incubaron en agitacion a temperatura ambiente durante 1 hora. Despues de lavar x5 con PBS 0,01 M pH 7,4 Tween 20 al 0,05 %, se anadieron 25 pl/pocillo de anticuerpo de cabra anti-conejo conjugado con peroxidasa de rabano picante del kit de Bio-Rad (Bio-Rad N.° de Cat. 172-1019) 1:3000 con PBS 0,01 M pH 7,4/Tween 20 al 0,05 % pH 7,4, despues se incubaron en agitacion a temperatura ambiente durante 1 hora. Despues de lavar x4 con PBS 0,01 M pH 7,4/Tween 20 al 0,05 % luego x1 con pBs 0,01 M pH 7,4 solamente, se anadieron 25 pl/pocillo de Sustrato Typer hRp de Raton (Bio-Rad N.° de Cat.172-1064), luego se incubaron a temperatura ambiente durante 30 min. Se anadieron 25 pl/pocillo de acido oxalico al 2 %, se leyo la Abs 405 nm. Analisis de datos: se calculo un valor de corte (Abs 405 nm) tomando la media de las lecturas por duplicado generadas por la concentracion mas baja del grupo de estudio de control negativo apropiado y multiplicando este valor por 2,5. Se representaron las curvas de titulacion para cada muestra de ensayo (tftulo de muestra frente a Abs 405 nm) y se predijo el tftulo de la muestra (que se transformo posteriormente en tftulo redproco) a partir del valor de corte calculado.
b) Tftulo de union a IgE libre
Sumario: un ensayo de electroquimioluminiscencia (ECL) que genera un tftulo redproco (RT) y un valor maximo
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para representar los niveles de complejos de IgG de raton:IgE humana formados despues de la incubacion de diluciones seriadas de sueros de ensayo durante una noche con una alta concentracion de IgE humana. Se usaron muestras de suero preparadas a partir de muestras de sueros de ratones vacunados con Ce3 combinadas como control positivo, junto con un anticuerpo de raton contra una region del dominio Ce3 de IgE humana (AbD Serotec 0100-0413 (E411 (5H2)) anadido a 50 pg/ml y a 1 mg/ml en suero negativo de Balb/c de Harlan Labs (combinado a partir de 400 animales de Harlan laboratories N.° de Codigo R-0131D), que tambien se uso en solitario como control negativo. Incubacion de muestras con IgE humana: se preparo una dilucion seriada semilogantmica de 8 puntos de cada muestra, incluyendo los controles, comenzando a una dilucion 1:3 (diluyente PBS 0,01 M pH 7,4/bSa al 1 %). Se mezclaron volumenes de 10 pl de cada concentracion de muestra con 10 pl de IgE humana 100 pg/ml (diluida a partir de una reserva usando PBS 0,01 M pH 7,4/BSA al 1 %), despues las placas se sellaron y se incubaron durante una noche a 4°C. Recubrimiento de placas de ensayo: al dfa siguiente, se recubrieron placas de ensayo de 384 pocillos (union convencional Meso-Scale Diagnostics (MSD) N.° de Cat. L11XA-1, 0370PA) con 12 pl/pocillo de pAb de oveja contra IgE humana (Gentaur, ICL (Immunology Consultants Lab) N.° de Cat. SE-80A) diluido a 1 pg/ml con pBs 0,01 M pH 7,4, despues se incubo en un agitador a temperatura ambiente durante 2 horas. Despues de lavar x3 con PBS 0,01 M pH 7,4 las placas se bloquearon usando 25 pl/pocillo de tampon de bloqueo de partida de Pierce (Pierce Biotech. N.° de Cat. 37538) y se incubaron en un agitador a temperatura ambiente durante 40 min, antes de un lavado final x3 con PBS 0,01 M pH 7,4. Preparacion y ensayo de muestras: se diluyeron volumenes de 20 pl de la mezcla de incubacion durante una noche de sueros con IgE humana 1:5 con 80 pl/pocillo de PBS 0,01 M pH 7,4/BSA al 1 % y despues se transfirieron 12 pl/pocillo por duplicado a las placas de ensayo MSD recubiertas. Despues de incubar en un agitador a temperatura ambiente durante 2 horas, las placas se lavaron x3 con PBS 0,01 M pH 7,4/Tween 20 al 0,05 %. Se anadieron 12 pl/pocillo de anticuerpo de deteccion (pAb de burro contra IgG de raton H+L Abcam N.° de Cat. ab6707, MSD SULFO-marcado usando MSD N.° de Cat. R91AN-1) 1:5000 con PBS 0,01 M pH 7,4/BSA al 1 %, despues se incubaron en agitacion a temperatura ambiente durante 1 hora. Despues de lavar x3 con PBS 0,01 M pH 7,4/Tween 20 al 0,05 % se anadieron 50 pl/pocillo de tampon T de lectura MSD (4x) con tensioactivo (MSD N.° de Cat. R92TC) 1:2 con agua MQ. Las placas se leyeron usando un MSD Sector Imager 6000.
Analisis de datos: se calculo un valor de corte (pfxeles) tomando la media de las lecturas por duplicado generadas por la concentracion mas baja del grupo de control negativo de estudio apropiado y multiplicando este valor por 5. Se representaron las curvas de titulacion para cada muestra de ensayo (tftulo de muestra frente a pfxeles) y se predijo el tftulo de la muestra (que se transformo posteriormente en tftulo redproco) a partir del valor de corte calculado. El valor de pico maximo de las curvas de titulacion tambien se registro.
c) Union a IgE unida a receptor
Este ensayo mide si los anticuerpos en suero de ratones vacunados pueden unirse a cierta IgE humana unida al receptor FceRI en la superficie de celulas RBL-THE, los anticuerpos se detectan despues mediante un anticuerpo espedfico anti-Fc de raton conjugado con ficoeritrina y la fluorescencia se mide mediante citometna de flujo. Se ha usado un anticuerpo anti-IgE humana de Biodesign diluido en suero de BALBc no vacunado como control positivo. Ensayo: se descongelaron celulas RBL-THE congeladas (p12 10 x 106 celulas/ml) y se lavaron una vez con tampon de ensayo (PBS-suero de cabra al 5 %). Se sembraron 2 x 105 celulas/pocillo en tampon de bloqueo (PBS-suero de cabra al 5 %-Fab de raton 0,1 mg/ml (ChromPure IgG de Raton, fragmento Fab - Jackson Immunoresearch)) en placas de 96 pocillos y se incubaron en un agitador a 4°C durante 1 h 30. Se anadieron 50 pl de IgE humana a 4 pg/ml por pocillo (diluida en tampon de ensayo) (excepto los pocillos de control Biodesign sin IgE, celulas solamente y aMo-PE) y las placas se incubaron durante 1 h en el agitador a 4°C. Las celulas se lavaron una vez con tampon de ensayo y se resuspendieron en 30 pl de anti-IgE humana (Biodesign 10 pg/ml, 5 pg/ml, 2,5 pg/ml - control positivo) diluida en suero de BALBc al 5 % o con muestras de suero de ratones vacunados diluidas 1:20, 1:40 y 1:80 en tampon de ensayo. Las muestras de suero se sembraron en placas por triplicado y los controles por duplicado. Las placas se incubaron en el agitador a 4°C durante 1 h 30 despues se lavaron con tampon de ensayo, se resuspendieron en 100 pl de anticuerpo de cabra espedfico de PE anti-Fc de raton (1:200 en tampon de ensayo, cabra Jackson Immunoresearch) y se incubaron durante 45 min en un agitador a 4°C. Las celulas se lavaron 3 veces con tampon de ensayo, se resuspendieron en 80 pl de paraformaldehudo al 2 % en PBS y se incubaron durante una noche a 4°C. Se midio la intensidad de fluorescencia mediante citometna de flujo. Analisis de datos: se uso la intensidad de fluorescencia media de cada muestra para analisis. Se calculo el promedio del control negativo (aMo- PE en solitario) y su valor se resto de cada pocillo. Se calculo el promedio del control positivo y cada muestra se expreso como porcentaje de control positivo (Biodesign) a su dilucion de suero respectiva. La dilucion de suero 1:40 se extrajo despues y se realizo un ANOVA.
d) Ensayo de desgranulacion
Este ensayo mide si el suero de ratones vacunados induce la desgranulacion de celulas RBL-THE por medicion de la actividad de la enzima p-hexosaminidasa liberada por celulas RBL-THE en medios. Se uso E25 (Xolair) diluido en suero de BALBc no vacunado como control negativo (40 pg/ml) y se uso anticuerpo policlonal de cabra de Sigma diluido en suero de BALBc no vacunado como control positivo. Siembra de celulas: se descongelaron RBL-THE p12 congeladas (10 x 106 celulas/vial; celulas de leucemia basofila de rata transfectadas de forma estable con FceRI humano), se lavaron en medios RBL-P (MEM-Earles complementado con FCS al 15 % y L-Glutamina 2 mM) y se resuspendieron en medios RBL-P a 8 x 105 celulas/ml con IgE humana a 0,25 pg/ml. Se sembraron 8 x 104 celulas/pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo plano y se incubaron durante 48 horas a 37°C/CO2 al 5 %. Preparacion de muestras y tampones: el dfa 3, se preparo tampon de Tyrode 1X (NaCI 135 mM, KCI 5mM, CaCI2 1,8 mM, MgCI2 1 mM, Glucosa 5,6 mM, BSA 1 mg/ml, Hepes 20 mM, pH 7,4). Tambien se prepararon tampon de Tyrode-suero de BALBc al 5 %, tampon de Tyrode-suero de BALBc al 2,5 % y Triton al 1 % en tampon de Tyrode- suero de BALBc al 5 %. El control positivo (anticuerpo policlonal de cabra anti-IgE (82 mg/ml en PBS) - Sigma, I0632) se diluyo de forma seriada en tampon de Tyrode-suero de BALBc al 5 % (1er pocillo en tampon de Tyrode- suero de BALBc al 5 % y despues en tampon de Tyrode) de 10 pg/ml a 2,5 pg/ml. El control negativo (E25) se mantuvo constante a 40 pg/ml en suero de BALBc diluido (dilucion de suero 1:20, 1:40 y 1:80). Las muestras de suero de ensayo de ratones vacunados se ensayaron a una dilucion de suero 1:20, 1:40 y 1:80. Todos los controles
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y muestras de suero de ensayo se ensayaron por triplicado en cada placa. Ensayo agonista: el dfa 3, las placas de celulas se retiraron de la incubadora. Se retiraron 95 pl de medios de los pocillos y las celulas se lavaron con 200 pl de tampon de Tyrode 1X, se retiro el tampon de lavado y se anadieron 70 pl de anticuerpos diluidos (control positivo, control negativo o muestra de suero de ensayo). Se incubaron las celulas a 37°C/CO2 al 5 % durante 1 hora. Al final de la incubacion, las placas se retiraron de la incubadora y se centrifugaron a 1200 rpm durante 5 minutos para sedimentar cualquier celula despegada. Se retiraron 65 pl de sobrenadante y se pusieron en placas de 96 pocillos esteriles. Se ensayaron 25 pl del sobrenadante para determinar la actividad de p-hexosaminidasa. Actividad de P- hexosaminidasa: se anadieron 25 pl de sobrenadante a una placa de 96 pocillos. Se anadieron 25 pl de NAGA 4 mM en tampon citrato (W-acetil-p-D-glucosaminida 4 mM (NAGA) (Sigma, N9376) en tampon citrato 50 mM pH 4,5) a todos los pocillos (recien preparada), las placas se incubaron durante 1 h a 37°C y se anadieron 150 pl de glicina 0,2 M para interrumpir la reaccion. Las placas se leyeron a 405 nM con Envision. Analisis de datos: se expreso la desgranulacion como porcentaje de la actividad p-hexosaminidasa total a partir de valores para pocillos totales (tratados con Triton X-100 al 1 %). El % de desgranulacion a la dilucion 1:40 se extrajo despues para analisis y se realizo un ANOVA en las muestras de suero.
e) Ensayo de reduccion de IgE humana libre
Sumario: un ensayo de electroquimioluminiscencia (ECL) que cuantifica los niveles de IgE humana libre que permanecen despues de una incubacion de una noche de almuotas de sueros de ensayo con una dilucion seriada de IgE humana, tiempo durante el que se forman complejos de IgG de raton:IgE humana. Para asegurar la exactitud del ensayo de cuantificacion de IgE humana, es esencial retirar primero cualquier complejo de IgG de raton:IgE humana usando Dynabeads magneticas recubiertas de protema G, que retiran por union cualesquiera complejos a traves de la region Fc de IgG de raton. Puede calcularse para cada muestra un valor para el % de disminucion en los niveles de IgE humana de los grupos de control negativo apropiados. Como control positivo, se anadio Xolair/E25 a 40 pg/ml (dosis de terapia convencional) en suero negativo de Balb/c de Harlan Labs (combinado a partir de 400 animales de Harlan laboratories N.° de Codigo R-0131D), que tambien se uso en solitario como control negativo. Incubacion de muestras con IgE humana: se anadieron volumenes de 2 pl de cada concentracion de una dilucion seriada semilogantmica de 8 puntos de IgE humana (diluyente PBS 0,01 M pH 7,4/BSA al 1 %) a cada uno de 8 x volumenes de 10 pl de muestras de sueros de ensayo, incluyendo control positivo Xolair/E25 (40 pg/ml), comenzando la IgE a una concentracion final de 30 pg/ml. Las placas se sellaron y se incubaron durante una noche a 4°C. Recubrimiento de placas de ensayo: al dfa siguiente, se recubrieron placas de ensayo de 384 pocillos (union convencional Meso-Scale Diagnostics (MSD) N.° de Cat. L11XA-1, 0370PA) con 12 pl/pocillo de pAb de oveja contra IgE humana (Gentaur, ICL (Immunology Consultants Lab) N.° de Cat. SE-80A) diluido a 5 pg/ml con PBS 0,01 M pH 7,4, despues se incubaron en un agitador a temperatura ambiente durante 2 horas. Despues de lavar x3 con PBS 0,01 M pH 7,4, las placas se bloquearon usando 25 pl/pocillo de tampon de bloqueo de partida de Pierce (Pierce Biotech. N.° de Cat. 37538) y se incubaron en un agitador a temperatura ambiente durante 40 min, antes de un lavado final x3 con PBS 0,01 M pH 7,4. Preparacion de muestra y Dynabead: se diluyeron volumenes de 5 pl de la mezcla de sueros de incubacion de una noche con IgE humana 1:20 con 95 pl/pocillo de PBS 0,01 M pH 7,4/BSA al 1 % [nota: tambien se diluyeron 10 pl de la dilucion 1:20 adicionalmente 1:2 con PBS 0,01 M pH 7,4/BSA al 1 % para ensayar en el ensayo de union a IgE libre para obtener una medicion de los complejos de IgG mu:IgE hu antes de la incubacion con perlas de Protema G]. El volumen necesario de concentracion 1x de Dynabeads de Protema G (Invitrogen N.° de Cat. 10004D) se lavo y se preparo como en el prospecto, despues se concentro x4 por resuspension en 0,25 x el volumen de perlas inicial. Incubacion de muestra con Dynabeads: se mezclaron 30 pl de cada muestra 1:20 con perlas 4x 15 pl/pocillo, se incubaron en agitacion a temperatura ambiente durante 1 hora. Se eliminaron las perlas de las muestras usando una placa con barra magnetica Dynal (Invitrogen N.° de Cat. 12027) y se mezclaron 40 pl de la muestra restante con 20 pl de mezcla de perlas 4x recien preparada, se incubaron en agitacion a temperatura ambiente durante 1 hora. Se transfirieron 45 pl/pocillo de la muestra restante en pocillos recien preparados y se centrifugaron 1 min a 1000 rpm, se devolvieron las placas a la placa con barra magnetica y se transfirieron 40 pl/pocillo a pocillos recien preparados. [Nota: se usaron 30 pl de muestra restante para ensayar en el ensayo de union a IgE libre para obtener una medicion de los complejos de IgG mu:IgE hu despues de la incubacion con perlas de Protema G para asegurar que se habfan eliminado todos los complejos]. Ensayo de cuantificacion: se preparo una curva patron de dilucion seriada semilogantmica de 12 puntos de IgE humana en diluyente de ensayo de suero de raton MSD al 80 %/PBS 0,01 M al 20 % pH 7,4/BSA al 1 % partiendo de una concentracion de 5 pg/ml. Se diluyo la muestra restante de la incubacion con perlas 1:5 usando diluyente de ensayo de suero de raton MSD (MSD N.° de Cat. R52BB-2). Se transfirieron diluciones seriadas de curva patron y muestras por triplicado a 12 pl/pocillo en pocillos de MSD recubiertos y se incubaron en agitacion a temperatura ambiente durante 2 horas. Despues de lavar las placas x3 con PBS 0,01 M pH 7,4/Tween 20 al 0,05 %, se anadieron 12 pl/pocillo de anticuerpo de deteccion (anticuerpo de conejo anti-IgE humana espedfico de cadena epsilon Bethyl N.° de Cat. A80-109A, MSD SULFO-marcado usando MSD N.° de Cat. R91AN-1) 1:300 con PBS 0,01 M pH 7,4/BSA al 1 %, despues se incubaron en agitacion a temperatura ambiente durante 1 hora.
Despues de lavar x3 con PBS 0,01 M pH 7,4/Tween 20 al 0,05 % se anadieron 50 pl/pocillo de tampon T de lectura MSD (4x) con tensioactivo (MSD N.° de Cat. R92TC) 1:2 con Agua MQ. Las placas se leyeron usando un MSD Sector Imager 6000. [Nota: se proceso un ensayo de union a IgE libre en tandem con este ensayo de cuantificacion para ensayar muestras de antes y de despues de la incubacion con perlas usando el mismo protocolo que se ha descrito anteriormente, excepto por el uso del anticuerpo de deteccion de burro a 1: 2000 con PBS 0,01 M pH 7,4/BSA al 1 % y el uso de un anticuerpo de deteccion anti-humano para el control positivo E25/Xolair solamente (de cabra anti-IgG humana SULFO-marcado MSD N.° de Cat. R32AJ-5) 1:4000 con PBS 0,01 M pH 7,4/BSA al 1 %]. Analisis de datos: se calculo el logaritmo de los datos sin procesar (Pfxeles), se represento la curva patron (ng/ml de concentracion logantmica de IgE humana frente a pfxeles logantmicos) y se aplico un ajuste de curva de 5 parametros asimetrico. Se predijeron las concentraciones logantmicas de IgE de las muestras de ensayo a partir de la curva patron y posteriormente se calculo el antilogaritmo y se multiplico por 200 para obtener las concentraciones de IgE libre restantes reales en ng/ml. Para cada muestra y control se calculo el % de disminucion en los niveles de IgE humana en comparacion con el grupo de control apropiado y se represento frente a IgE humana (ng/ml) anadida originariamente a la muestra de suero, ambos ejes en escala logantmica para generar una curva de titulacion.
Resultados
Los resultados se resumen en la tabla 5 a continuacion. Mas espedficamente y sorprendentemente, este estudio mostraba que una combinacion de conjugaciones de Qbeta con Amarillo y Morado, cuando se administran por la via intramuscular a una dosis total de 25 microgramos de conjugado (es decir, 12,5 microgramos de conjugado 5 individual) es la mas eficaz y era mas eficaz que usar el conjugado de cualquier peptido como solo antfgeno a dosis doble. Los presentes inventores han demostrado en este estudio que esta combinacion induce una respuesta de anticuerpos con una alta capacidad para unirse a IgE libre asf como que estos anticuerpos son capaces de reducir los niveles de IgE hasta el 80 % dependiendo de la dosis de exposicion a IgE. Estas respuestas de anticuerpos no eran capaces de unirse a IgE unida a receptor y no causaban la desgranulacion de celulas diana que expresaban 10 receptor. Las combinaciones de Qbeta con los adyuvantes alumbre y CPG24555 (en las que todos los enlaces internucleotfdicos del oligonucleotido son enlaces fosforotioato) eran altamente eficaces para inducir estas respuestas de anticuerpos. En conjunto, puede concluirse que en terminos de inducir anticuerpos de IgE de raton con una fuerte capacidad para unirse a IgE humana libre, el peptido Amarillo es el peptido mas prometedor cuando se administra individualmente o en combinacion con conjugados de peptido Morado o Naranja, o con conjugados 15 tanto de peptido Morado como de peptido Naranja inoculados en vacunas a alta dosis y alto volumen.

Claims (20)

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    1. Una composicion que comprende dos inmunogenos en la que:
    - el primer inmunogeno consiste en un inmunogeno que comprende al menos un peptido de IgE antigenico unido a un vehmulo inmunogenico, en el que dicho peptido de IgE antigenico consiste en una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID N.°s: 311, 312, 313, 314, 326, 327, 328, 340, 341 y 353 y
    - el segundo inmunogeno consiste en un inmunogeno que comprende al menos un peptido de IgE antigenico unido a un vehmulo inmunogenico, en el que dicho peptido de IgE antigenico consiste en una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID N.°s: 220, 221, 222, 233, 234, 235, 245, 246 y 247.
  2. 2. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que dicho peptido antigenico de IgE del primer inmunogeno comprende ademas cualquiera de:
    - en su extremo C-terminal un engarce que tiene la formula (G)nC en la que n es un numero entero seleccionado del grupo que consiste en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10 (cuando n es igual a 0 dicha formula representa una cistema) o;
    - en su extremo N-terminal un engarce que tiene la formula C(G)n, en la que n es un numero entero seleccionado del grupo que consiste en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10 (cuando n es igual a 0, la formula representa una cistema) o;
    - en su extremo C-terminal un engarce que tiene la formula (G)nC, en la que n es un numero entero seleccionado del grupo que consiste en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10 (cuando n es igual a 0 dicha formula representa una cistema) y en su extremo N-terminal un engarce que tiene la formula C(G)n, en la que n es un numero entero seleccionado del grupo que consiste en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10 (cuando n es igual a 0, la formula representa una cistema).
  3. 3. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que dicho peptido antigenico de IgE del primer inmunogeno comprende ademas cualquiera de:
    - en su extremo C-terminal un engarce que tiene la formula (G)nC en la que n es un numero entero
    seleccionado del grupo que consiste en 0, 1, 2 y 3 (cuando n es igual a 0 dicha formula representa una
    cistema) o;
    - en su extremo N-terminal un engarce que tiene la formula C(G)n en la que n es un numero entero seleccionado del grupo que consiste en 0, 1, 2 y 3 (cuando n es igual a 0, la formula representa una cistema) o;
    - en su extremo C-terminal un engarce que tiene la formula (G)nC en la que n es un numero entero
    seleccionado del grupo que consiste en 0, 1, 2 y 3 (cuando n es igual a 0 dicha formula representa una
    cistema) y en su extremo N-terminal un engarce que tiene la formula C(G)n, en la que n es un numero entero seleccionado del grupo que consiste en 0, 1, 2 y 3 (cuando n es igual a 0, la formula representa una cistema).
  4. 4. La composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dichos peptidos de IgE antigenicos estan unidos a un vehmulo inmunogeno seleccionado del grupo que consiste en albuminas sericas, albumina serica bovina (BSA); globulinas; tiroglobulinas; hemoglobinas; hemocianinas, hemocianina de lapa Californiana, protemas extrafdas de ascarides, toxinas o toxoides bacterianos inactivados, toxina tetanica, toxina difterica, CRM197, el derivado proteico purificado de tuberculina (PPD), Protema D de Haemophilus influenzae o fragmentos recombinantes de la misma, polilisina; acido poliglutamico; copolfmeros de lisina-acido glutamico; copolfmeros que contienen lisina u ornitina y vehmulos liposomales.
  5. 5. La composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dichos peptidos de IgE antigenicos estan unidos a un vehmulo inmunogenico seleccionado del grupo que consiste en VLP de HBcAg, HBsAg y Qbeta.
  6. 6. La composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5, en la que dichos peptidos de IgE antigenicos estan qmmicamente reticulados con dichos vehmulos inmunogenicos.
  7. 7. La composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la que dichos peptidos de IgE antigenicos estan conformacionalmente limitados.
  8. 8. La composicion de la reivindicacion 1, en la que el primer inmunogeno consiste en un polipeptido de SEC ID N.°: 457 qmmicamente reticulado con dicha partmula similar a virus de Qbeta de SEC ID N.°: 435 por medio de un enlace tioeter usando SMPH (succinimidil-6-[p-maleimidopropionamido]hexanoato) como reticulante, siendo dicho enlace entre un resto de lisina de la partmula similar a virus y el resto de cistema de dicho polipeptido.
  9. 9. La composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en la que el peptido de IgE antigenico del primer inmunogeno consiste en una secuencia de aminoacidos de SEC ID N.°: 312.
  10. 10. La composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en la que el peptido de IgE antigenico del primer inmunogeno consiste en una secuencia de aminoacidos de SEC ID N.°: 312 y el peptido de IgE antigenico del segundo inmunogeno consiste en una secuencia de aminoacidos de SEC ID N.°: 220.
  11. 11. Una composicion que comprende dos inmunogenos en la que cada uno de estos inmunogenos consisten
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    en un peptido de IgE antigenico conjugado individualmente a una partmula similar a virus de Qbeta en la que:
    - el primer inmunogeno comprende un peptido de IgE antigenico de la SEC ID N.°: 220 reticulado qmmicamente con una partmula similar a virus de Qbeta de la SEC ID N.°: 435 mediante un enlace tioeter usando SMPH (succinimidil-6-[p-maleimidopropionamido]hexanoato) como reticulante, siendo dicho enlace entre un resto de lisina de la partmula similar a virus y el resto de cistema de dicho peptido de IgE antigenico y;
    - el segundo inmunogeno comprende un polipeptido de la SEC ID N.°: 457 reticulado qmmicamente con una partmula similar a virus de Qbeta de la SEC ID N.°: 435 mediante un enlace tioeter usando SMPH (succinimidil- 6-[p-maleimidopropionamido]hexanoato) como reticulante, siendo dicho enlace entre un resto de lisina de la partmula similar a virus y el resto de cistema de dicho polipeptido.
  12. 12. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende adicionalmente al menos un adyuvante seleccionado del grupo que consiste en alumbre, oligonucleotidos que contienen CpG y adyuvantes basados en saponina.
  13. 13. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 12, en la que al menos un adyuvante es un oligonucleotido que contiene CpG seleccionado del grupo que consiste en CpG7909 (SEC ID N.°: 433), CpG 10103 (SEC ID N.°: 432) y CpG24555 (SEC ID N.°: 431).
  14. 14. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 12, en la que dicho al menos un adyuvante es un adyuvante basado en saponina.
  15. 15. La composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende adicionalmente al menos dos adyuvantes seleccionados del grupo que consiste en alumbre, oligonucleotidos que contienen CpG y adyuvantes basados en saponina.
  16. 16. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 15, en la que dichos dos adyuvantes son alumbre y CpG24555 (SEC ID N.°: 431).
  17. 17. Una composicion farmaceutica que comprende la composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 y un excipiente farmaceuticamente aceptable.
  18. 18. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, o la composicion farmaceutica de la reivindicacion 17 para su uso como un medicamento.
  19. 19. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, o la composicion farmaceutica de la reivindicacion 17 para su uso en un procedimiento para prevenir, aliviar o tratar un trastorno mediado por IgE.
  20. 20. La composicion o composicion farmaceutica para el uso de la reivindicacion 19, en el que dicho trastorno mediado por IgE es asma.
    FIG. 1
    Interaccion de C3C4 de IgE con FCER1
    imagen1
    FIG. 2
    Representaciones graficas lie formatos de peptides para inducir respuestas de anticuerpos contra epitopes estructurafmente definidos de IgE humana quo pueden bloquear la union al receptor de IgE de alta afinidad. Veanse las distintas listas para detalles de epitopes peptidicos, engarces, acopladores, reticulantes, etc. potenciales que pueden usarse.
    oo
    -q
    <s>
    &
    ^-tenn
    N-tara
    4$rm
    imagen2
    I
    Oi
    I N-term % |
    1 111
    R—|—R R—|—R
    ® (S3
    = secuencia diana de epitope peptidico (aa 5-20) - (vease la tabia para peptides especificos)
    Leyenda
    £j) = resto para reaccionar con resto reticulante o "grapadora" (por ejemplo. Cys)
    = resto para acoplamiento con proteina de vehiculo (por ejemplo, Cys, Lys, Glu, etc)
    "■ = aminoacidos de engarce (0-6 aminoScidos, p>- ejamplos GG, GGS, GGGGS etc
    = resto para union o "grapado" del peptido para for mar un bucla (por ejemplo, disulfuro). Pueden usarse entidades de grapado de dist ntas longitudes.
    = "amazon" molecular para un enlace de dos puntos del peptido para formar un bucle, para acoplamiento de un solo punto al vehiculo por medio de @ Por ejemplo, pueden usarse reactivos de acoptemiento trifuncionales
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