TWI387463B

TWI387463B - Ｉｇｅｃｈ３肽疫苗

Info

Publication number: TWI387463B
Application number: TW098141914A
Authority: TW
Inventors: Alan Daniel Brown; Brian Robert Champion; Clare Christy; David Paul Gervais; Lyn Howard Jones; Anne Maria Kristina Kjerrstrom; David Cameron Pryde; Lee Richard Roberts; David Michael Wyatt
Original assignee: Pfizer Vaccines Llc
Priority date: 2008-12-09
Filing date: 2009-12-08
Publication date: 2013-03-01
Also published as: AR074505A1; SG10201400388QA; DK2376108T3; WO2010067286A3; RU2011121043A; EP2376108A2; AU2009325950A1; JP2012255006A; US9216229B2; KR101413844B1; ES2622562T3; KR101634058B1; HK1163511A1; AU2009325950B2; MX337723B; JP5964280B2; JP2016164156A; KR20110094134A; PE20142330A1; US20120294848A1

Description

IGE CH3肽疫苗

本發明係關於提供新穎免疫原，其包含用於預防、治療或減輕IgE介導性病症之較佳連接於免疫原性載體的抗原性IgE肽。本發明進一步係關於製造此等藥劑、其免疫原性組合物及醫藥組合物之方法及其於醫學中之用途。

在過去幾十年間，過敏性疾病已增加至幾乎流行的程度且估計顯示許多西方國家之總人口的20-30%受到影響。IgE在引發過敏性反應中之關鍵作用得到充分文獻證明。IgE自B淋巴細胞釋放後結合於肥大細胞及嗜鹼性球上存在之高親和力IgE受體(FceRI)。隨後特異性過敏原與此等細胞上之相鄰IgE分子交聯，接著導致其活化，使得釋放多種促發炎性介體(例如組織胺、白三烯、前列腺素)以及關鍵細胞激素及趨化因子。因此，在急性局部反應之後募集及活化其他發炎細胞(例如嗜伊紅血球、T淋巴細胞)，從而擴大過敏性級聯反應。樹突狀細胞，例如存在於過敏性發炎部位(例如肺)之彼等細胞亦可表現FceR1且可使用此受體來選擇性及有效地佔據與IgE形成之免疫複合物中存在之過敏原且選擇性地加工此等過敏原以呈遞至過敏原特異性T細胞，由此提供持續性T細胞活化及病理性發炎性反應之機制。

大部分當前治療方案之目的在於緩解症狀而非治療病因且主要基於使用抗組織胺、抗白三烯、色甘酸鹽、β-促效劑及基於普通消炎化合物(諸如皮質類固醇)。儘管一些受侵襲患者使其疾病處於此等藥物之相對良好控制下，但其投藥頻率(通常每日一次或甚至每日若干次)通常導致不良患者順應性及隨後疾病惡化。另外，在諸如重度哮喘及重度異位性皮膚炎之一些情況下，現有療法不足以控制疾病。

最近，單株抗體(奧瑪利珠單抗(omalizumab)，亦稱為E25，以商品名稱Xolair銷售；Presta等人J Immunol . 1993 Sep 1;151(5):2623-32。)獲得全世界若干機構批准，其主要用於治療重度哮喘及鼻炎。儘管顯示針對重度哮喘之功效，但此抗體仍具有一些缺點。第一，此為人類化鼠類單株抗體，且因此並不完全排除人類患者之免疫反應，由此可能要提出一些安全性考慮。第二，用於治療重度哮喘之奧瑪利珠單抗的劑量係基於體重與循環游離IgE之含量。不推薦體重及循環游離IgE偏離特定範圍之患者使用此療法。彼等可治療之患者可能需要接受多達三次皮下注射，每兩週一次。此嚴重影響了治療成本(估計每位患者的治療成本在每年US$ 15,000-44,000範圍內)，以及患者之生活品質，使得難以用作治療過敏之普通策略。

為克服高成本及頻繁投藥之問題，替代方法為藉由疫苗接種來觸發吾等自身免疫系統產生治療性抗體。

在其研究期間，過敏領域之先前工作者已遇到許多在設計新抗過敏療法時必須考慮之考慮因素及問題。最危險問題之一圍繞IgE交聯與組織胺釋放信號有關。最通常情況為，在主動疫苗接種期間，抗IgE抗體之產生能夠藉由在過敏原不存在下使相鄰IgE-受體複合物交聯而觸發自身組織胺釋放。此現象被稱為過敏原性(anaphylactogenicity)。實際上，許多通常用於IgE偵測檢定之市售抗IgE單株抗體具有過敏原性，且因此無效，若向患者投與，則可能會有危險。因此，為了安全且有效，被動投與或疫苗誘導之抗體必須在IgE中能夠抑制IgE活性而自身不具過敏性之區域內結合。

人類IgE之與IgE高親和力受體FceRI α次單元相互作用之恆定域CH3-CH4的結構已解出(Wurzburg BA等人(2000)Immunity 13(3) 375-85；Garman SC等人，(2000)Nature 20;406(6793):259-66)。先前工作亦已鑑別出許多IgE肽或衍生之肽或擬抗原決定基(mimotope)，其被視為適用於誘導非過敏原性抗IgE抗體(WO 1993/005810；WO 99/67293；WO 2004/058799、WO 9731948、WO 2000/25722、WO 05/075504、US 2002/0645525、US 2004/146504及US 2006/062782；WO 00/050461、WO 02/34288及WO 2003/092714；Chen等人(2008)J. Immunologic. Meth . 333:10-23；HellmanExpert Rev. Vaccines 7(2):193-208(2008))。該等IgE域或肽通常連接於載體以增加其免疫原性，以便破壞個體對IgE之自體耐受性。

因此，需要提供一種組合物，諸如與免疫原性載體偶合之抗原性IgE肽或其若干組合，且其視情況與一或多種佐劑一起投與，能夠誘導個體之有效非過敏原性抗IgE抗體，能夠顯著減少循環游離IgE之含量。效能增加通常將產生以下益處：達成臨床益處所需之劑量更低、例如用於皮下或肌肉內投藥所需之注射體積更低(例如與單株抗體療法相比)、治療成本更低、治療成功之可能性增加、治療方案中之投藥頻率降低，由此使得能夠治療更廣泛的患者群體(包括具有更高體重及/或高循環IgE含量之患者)且改善患者之生活品質。

本發明係關於一種免疫原，其包含較佳連接於免疫原性載體之抗原性IgE肽。該IgE抗原性肽包含選自由SEQ ID No: 1至430組成之群、較佳選自由SEQ ID NO: 1至153及220至430組成之群、甚至更佳選自由SEQ ID NO: 220至430組成之群的胺基酸序列。該抗原性IgE肽可經修飾用於結合目的，較佳藉由添加半胱胺酸或離胺酸殘基及/或添加連接子(諸如GC/GGC連接子)來達成。在較佳實施例中，該抗原性IgE肽之構形受限制，較佳受簡單限制。該免疫原性載體為異源蛋白，較佳為病毒樣粒子(virus-like particle，VLP)，更佳為HBcAg、HBsAg或Qβ VLP。本發明亦關於製造該較佳連接於免疫原性載體之抗原性IgE肽的方法。

本發明亦關於包含該較佳連接於免疫原性載體之抗原性IgE肽的免疫原性組合物，較佳關於視情況包含較佳選自由以下組成之群的佐劑之免疫原性組合物：明礬；含有CpG之寡核苷酸，較佳為CpG7909及CpG24555；及基於皂苷之佐劑，較佳為Iscomatrix。較佳地，該含有CpG之核酸包含一或多個經修飾之鍵，較佳為一或多個硫代磷酸酯鍵，甚至更佳地，寡核苷酸之所有核苷酸間鍵均為硫代磷酸酯鍵。

本發明之另一態樣係關於包含本發明之抗原性IgE肽或其免疫原性組合物的醫藥組合物，以及該等組合物之醫學用途。

詳言之，本發明係關於本發明之抗原性IgE肽或其免疫原性或醫藥組合物，其用作藥劑，較佳用於治療、減輕或預防IgE介導性病症。本發明亦關於誘導個體對自體IgE之免疫反應的方法及治療、減輕或預防IgE介導性病症之方法，其包含投與有效量之該抗原性IgE肽或其免疫原性或醫藥組合物。

定義及通用技術

除非另有定義，否則與本發明關聯使用之科學及技術術語應具有一般熟習此項技術者通常所瞭解之含義。通常，本文所述之與細胞及組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學及蛋白質與核酸化學及雜交關聯使用之術語及其技術為熟知且此項技術中常用者。

除非另有指示，否則本發明之方法及技術一般根據此項技術中熟知之習知方法來執行且如整個本說明書中所引用及論述之各種一般及更特定之參考文獻中所述來執行。例如參見Sambrook J.及Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2000)；Ausubel等人，Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Wiley,John ＆ Sons,Inc.(2002)；Harlow及Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1998)；及Coligan等人，Short Protocols in Protein Science,Wiley,John ＆ Sons,Inc.(2003)。根據製造商之說明書執行酶促反應及純化技術，如此項技術中或如本文所述通常所完成。

本文所述與分析化學、合成有機化學及醫學及藥物化學關聯使用之術語及實驗步驟及技術為此項技術中熟知且常用者。

在本說明書及申請專利範圍中，詞語「包含」應理解為意指包括所述整體或整群，而不排除任何其他整體或整群。術語「包含」、「由...組成」及「基本上由...組成」意思可互換。除非另有指示，否則當本案使用術語「一」、「一個」或「一種」時，其意謂「至少一個(種)」或「一或多個(種)」。此外，除非另外要求，否則單數術語應包括複數，且除非內容另外明確規定，否則複數術語應包括單數。

本文中所引用之所有公開案、專利及專利申請案(無論上文或下文)均以全文引用的方式併入本文中。

一般定義：

術語「肽」或「多肽」係指胺基酸之聚合物而不論該聚合物之長度；因此，肽、寡肽及蛋白質包括在多肽定義中。此術語亦不指定或排除多肽之表現後修飾，例如包括糖基、乙醯基、磷酸酯基、脂質基團及其類似基團共價連接的多肽明確地涵蓋於術語多肽。該定義亦包括含有一或多種胺基酸類似物(包括例如非天然存在之胺基酸、僅天然存在於不相關生物系統中之胺基酸、經修飾之哺乳動物系統的胺基酸等)的多肽，具有經取代之鍵聯以及此項技術中已知之其他修飾(天然存在與非天然存在)之多肽。

術語「經分離之蛋白質」、「經分離之多肽」或「經分離之肽」為根據其衍生起源或來源如下之蛋白質、多肽或肽：(1)不與其天然狀態下伴隨之天然締合組份締合；(2)不含相同物種之其他蛋白質；(3)由不同物種之細胞表現；或(4)不存在於自然界中。因此，以化學方式合成或在不同於其天然起源之細胞的細胞系統中合成之肽將與其天然締合組份「分離」。蛋白質亦可藉由使用此項技術中熟知之蛋白質純化技術分離而實質上不含天然締合組份。

如本文中所使用，當關於分子(例如肽、多肽或蛋白質)使用術語「經純化」時，其意謂該經純化之分子的濃度已相對於其天然環境或其產生、發現或合成環境中與其締合之分子增加。天然締合之分子包括蛋白質、核酸、脂質及糖類，但一般不包括添加用於維持經純化分子的完整性或有助於純化之水、緩衝液及試劑。

在一些實施例中，當化合物至少20重量%、至少30重量%、至少40重量%、至少50%或至少60重量%不含與其天然締合或在製造期間與其締合之有機分子時，該化合物為實質上純或經純化。在一些實施例中，製劑為至少70重量%、至少75重量%、至少90重量%、至少95重量%或至少99重量%之所需化合物(相對於其污染物)。

實質上純或經純化之化合物可例如藉由自天然來源(例如細菌)萃取，藉由以化學方式合成化合物，或藉由純化及化學修飾之組合來獲得。實質上純或經純化之化合物亦可藉由例如富集具有結合所需抗體之化合物的樣品來獲得。純度可藉由任何適當方法來量測，例如層析法、質譜法、高效液相層析分析等。

如本文在IgE肽或多肽之情形下所使用，當IgE多肽融合蛋白包含IgE肽或多肽及「異源」多肽時，術語「異源」係指不為IgE肽或多肽之多肽，例如在自然界中通常不與IgE肽或多肽締合之多肽。舉例而言，異源多肽與IgE肽或多肽不具有顯著胺基酸序列一致性，例如該異源多肽與IgE肽或多肽具有小於約50%、小於約40%、小於約30%或小於約20%之胺基酸序列一致性。

如本文中所使用，術語「IgE介導性病症」或「IgE相關病症」意謂特徵為免疫球蛋白IgE之過量產生及/或對免疫球蛋白IgE之過敏反應的病狀或疾病。具體言之，其應解釋為包括與過敏性過敏反應(anaphylactic hypersensitivity)及異位性過敏相關之病狀，包括例如：哮喘、過敏性哮喘、過敏性鼻炎及結膜炎(枯草熱)、濕疹、蕁麻疹、異位性皮膚炎及食物過敏(包括花生過敏)。由例如蜂螫傷、蛇咬傷、食物或藥物引起之過敏性休克的嚴重生理學病狀亦涵蓋於此術語之範疇內。其他IgE介導性病症包括重度過敏、接觸性皮膚炎、過敏性胃腸病、過敏性肺麴菌病、過敏性紫癜、濕疹、高IgE(喬布氏(Job's))症候群、過敏性過敏反應、IgE骨髓瘤、發炎性腸病(例如克羅恩氏病(Crohn's disease)、潰瘍性結腸炎、未定型結腸炎及傳染性結腸炎)、蕁麻疹及牛皮癬。

本發明之抗原性IgE肽

本發明係關於IgE肽及其衍生之肽，其已鑑別為IgE CH3域之能夠形成參與CH3-CH4區與其高親和力受體FceRI之相互作用的環之部分(參看圖1)。展示該等IgE肽具有免疫原性且為非過敏原性的。

該等抗原性IgE肽可單獨使用或組合使用，較佳為與免疫原性載體結合使用，以誘導個體之自體抗IgE抗體以便治療、預防或改善IgE相關病症。

詳言之，本發明係關於一種免疫原，其由較佳連接於免疫原性載體之抗原性IgE肽組成、基本上由該抗原性IgE肽組成或包含該抗原性IgE肽。

在一實施例中，本發明之抗原性IgE肽由選自由SEQ ID No: 1至430及其功能活性變異體組成之群、較佳選自由SEQ ID No: 1至430組成之群的胺基酸序列組成、基本上由該胺基酸序列組成或包含該胺基酸序列。在另一實施例中，該抗原性IgE肽由選自由SEQ ID No: 1至153及其功能活性變異體組成之群、較佳選自由SEQ ID No:1至153組成之群的胺基酸序列組成、基本上由該胺基酸序列組成或包含該胺基酸序列。在另一實施例中，該抗原性IgE肽由選自由SEQ ID No: 154至219及其功能活性變異體組成之群、較佳選自由SEQ ID No: 154至219組成之群的胺基酸序列組成、基本上由該胺基酸序列組成或包含該胺基酸序列。在又一實施例中，該抗原性IgE肽由選自由SEQ ID No: 220至310及其功能活性變異體組成之群、較佳選自由SEQ ID No: 220至310組成之群的胺基酸序列組成、基本上由該胺基酸序列組成或包含該胺基酸序列。在又一實施例中，該抗原性IgE肽由選自由SEQ ID No: 311至430及其功能活性變異體組成之群、較佳選自由SEQ ID No: 311至430組成之群的胺基酸序列組成、基本上由該胺基酸序列組成或包含該胺基酸序列。

在本發明之含義中，術語「抗原性IgE肽」包括所有IgE CH3衍生之肽，較佳來自哺乳動物物種，更佳來自人類，以及其展現「抗原性IgE肽生物活性」之變異體、類似物、直系同源物、同系物及衍生物以及其片段。較佳地，術語「抗原性IgE肽」係指包含選自由SEQ ID No: 1至430組成之群的胺基酸序列、由該胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成之肽，以及其展現基本上相同生物活性之變異體、同系物及衍生物。更佳地，術語「抗原性IgE肽」係指包含選自由SEQ ID 1至430組成之群的胺基酸序列、由該胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成之肽，更佳為包含選自由SEQ ID No: 1至153及220至430組成之群的胺基酸序列、由該胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成之肽，甚至更佳為包含選自由SEQ ID No: 220至430組成之群的胺基酸序列、由該胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成之肽。

在一實施例中，本發明之抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成：SEQ ID No: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429及430。

在另一實施例中，本發明之抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成：SEQ ID No: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152及153。較佳地，該抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成：SEQ ID No: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、88、89、90、91、92、93、94、95、96、99、100、101、102、103、104、105、106、109、110、111、112、113、114、115、118、119、120、121、122、123、126、127、128、129、130、133、134、135、136、139、140、141、144、145及148。更佳地，該抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成：SEQ ID No: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、49、50、51、52、53、54、55、56、57、63、64、65、66、67、68、69、70、76、77、78、79、80、81、82、88、89、90、91、92、93、99、100、101、102、103、109、110、111、112、118、119、120、126、127、133及139。甚至更佳地，該抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成：SEQ ID No: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、18、19、20、21、22、23、24、25、34、35、36、37、38、39、40、49、50、51、52、53、54、63、64、65、66、67、76、77、78、79、88、89、90、99、100、101及109。甚至更佳地，該抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成：SEQ ID No: 1、2、3、4、5、6、18、19、20、21、22、34、35、36、37、49、50、51、63、64及76。甚至更佳地，該抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成：SEQ ID No: 1、2、3、18、19及34。最佳地，該抗原性IgE肽由SEQ ID No: 1或18之胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成。

在另一實施例中，本發明之抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成：SEQ ID No: 154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218及219。較佳地，該抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成：SEQ ID No: 154、155、156、157、158、159、160、161、162、165、166、167、168、169、170、171、172、175、176、177、178、179、180、181、184、185、186、187、188、189、192、193、194、195、196、199、200、201、202、205、206、207、210、211、214及217。更佳地，該抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成：SEQ ID No: 154、155、156、157、158、159、165、166、167、168、169、175、176、177、178、184、185、186、192、193、199及200。甚至更佳地，該抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成：SEQ ID No: 154、155、156、165、166及175。最佳地，該抗原性IgE肽由SEQ ID No: 154或165之胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成。

在另一實施例中，本發明之抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成：SEQ ID No: 220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309及310。較佳地，該抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成：SEQ ID No: 220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、245、246、247、248、249、250、251、252、253、256、257、258、259、260、261、262、263、266、267、268、269、270、271、272、275、276、277、278、279、280、283、284、285、286、287、290、291、292、293、296、297、298、301、302及305。更佳地，該抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成：SEQ ID No: 220、221、222、223、224、225、226、227、233、234、235、236、237、238、239、245、246、247、248、249、250、256、257、258、259、260、266、267、268、269、275、276、277、283、284及290。甚至更佳地，該抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成：SEQ ID No: 220、221、222、223、224、233、234、235、236、245、246、247、256、257及266。甚至更佳地，該抗原性IgE肽由選自由SEQ ID No: 220、221、222、233、234及245組成之群的胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成。最佳地，該抗原性IgE肽由SEQ ID No: 220或233之胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成。

在又一實施例中，本發明之抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成：SEQ ID No: 311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429及430。較佳地，該抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成：SEQ ID No: 311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、365、366、367、368、369、370、371、372、373、376、377、378、379、380、381、382、383、386、387、388、389、390、391、392、395、396、397、398、399、400、403、404、405、406、407、410、411、412、413、416、417、418、421、422及425。更佳地，該抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成：SEQ ID No: 311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、326、327、328、329、330、331、332、333、334、340、341、342、343、344、345、346、347、353、354、355、356、357、358、359、365、366、367、368、369、370、376、377、378、379、380、386、387、388、389、395、396、397、403、404及410。甚至更佳地，該抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成：SEQ ID No: 311、312、313、314、315、316、317、326、327、328、329、330、331、340、341、342、343、344、353、354、355、356、365、366、367、376、377及386。甚至更佳地，該抗原性IgE肽由選自由SEQ ID No: 311、312、313、314、326、327、328、340、341及353組成之群的胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成。甚至更佳地，該抗原性IgE肽由選自由SEQ ID No: 311、312及326組成之群的胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成。最佳地，該抗原性IgE肽由SEQ ID No: 311或312之胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成。

當本文中使用時，術語「抗原性IgE肽生物活性」係指本發明之抗原性IgE肽誘導患者之具有拮抗概況之自體抗IgE抗體的能力，該等自體抗體能夠減少循環游離IgE之含量，同時不會引起任何顯著IgE介導之發炎性介體釋放且同時實質上不會與結合其高親和力受體之IgE結合。對於熟習此項技術者將顯而易見，何技術可用於證實特定構築體是否屬於本發明之範疇內。該等技術包括(但不限於)本申請案之實例部分中所述之技術以及以下技術。可檢定假定肽以確定構築體之免疫原性，因為由假定肽引起之抗血清與天然IgE分子交叉反應，且亦具有阻斷過敏性介體自過敏性效應細胞釋放之功能。

此等反應之特異性可藉由IgE之牽出(pulldown)可藉由抑制脫除表現IgE受體之細胞的顆粒來定量的功能性檢定，或藉由競爭實驗，藉由用肽自身或天然IgE及/或已知結合IgE中之抗原決定基的特異性單株抗體阻斷抗血清之活性來證實。確定結合於IgE-FcRI之技術亦為熟習此項技術者所熟知。

在一實施例中，本發明之抗原性IgE肽具有使其模擬選自存在天然抗原決定基之整個IgE域之區域的尺寸。在一特定實施例中，本發明之抗原性IgE肽的長度小於100個胺基酸，較佳短於75個胺基酸，更佳小於50個胺基酸，甚至更佳小於40個胺基酸。本發明之抗原性IgE肽的長度通常為4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個胺基酸，較佳為4至20個胺基酸，例如6至12個或6至9個胺基酸。

在序列表中提供本發明之抗原性IgE肽的特定實例且其包括長度在4至20個胺基酸範圍內之肽。

本發明之抗原性肽包括衍生自人類IgE CH3之一部分的胺基酸序列，人類CH3之該衍生部分對應於天然存在之IgE的胺基酸序列或對應於變異IgE，亦即少量胺基酸已經取代、添加或缺失但保留基本上相同免疫性質之天然存在之IgE的胺基酸序列。另外，該衍生之IgE CH3部分可進一步由胺基酸修飾，尤其在N及C末端，使得抗原性IgE肽之構形受限制及/或使得在進行適當化學作用後抗原性IgE肽與免疫原性載體偶合。

本發明之抗原性IgE肽包涵衍生自胺基酸缺失、插入或經取代但基本上不降低其免疫性質之IgE CH3之胺基酸序列的功能活性變異肽，亦即該等功能活性變異肽保留實質上抗原性IgE肽生物活性。通常，該等功能變異肽具有與選自由SEQ ID No: 1至430組成之群的胺基酸序列、更佳選自由SEQ ID No: 1至153及220至430組成之群的胺基酸序列、甚至更佳選自由SEQ ID No: 220至430組成之群的胺基酸序列同源、較佳高度同源之胺基酸序列。

在一實施例中，該等功能活性變異肽與選自由SEQ ID No: 1至430組成之群的胺基酸序列、更佳選自由SEQ ID No: 1至153及220至430組成之群的胺基酸序列、甚至更佳選自由SEQ ID No: 220至430組成之群的胺基酸序列展現至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%一致性。

多肽之序列相似性(亦稱為序列一致性)通常使用序列分析軟體來量測。蛋白質分析軟體使用歸因於各種取代、缺失及其他修飾(包括保守性胺基酸取代)之相似性的度量來匹配類似序列。舉例而言，GCG含有諸如「間隙」及「Bestfit」之程式，其在預設參數下用於測定密切相關多肽(諸如來自不同生物物種之同源多肽)之間或野生型蛋白質與其突變蛋白質之間的的序列同源性或序列一致性。例如參見6.1版GCG。多肽序列亦可使用FASTA(6.1版GCG中之程式)，使用預設或推薦參數來比較。FASTA(例如FASTA2及FASTA3)提供查詢及搜尋序列之間的最佳重疊區域的比對及序列一致性百分比(Pearson,Methods Enzymol . 183:63-98(1990)；Pearson,Methods Mol. Biol . 132:185-219(2000))。當將本發明之序列與含有大量來自不同生物之序列的資料庫作比較時，替代算法為使用預設參數之電腦程式BLAST，尤其為blastp或tblastn。例如參見Altschul等人，J. Mol. Biol . 215:403-410(1990)；Altschul等人，Nucleic Acids Res . 25:3389-402(1997)。

功能活性變異體包含天然存在之功能活性變異體(諸如對偶基因變異體及物種變異體)及可藉由例如突變誘發技術或藉由直接合成而產生之非天然存在之功能活性變異體。

功能活性變異體與SEQ ID No: 1至430、更佳SEQ ID No: 1至153及220至430、甚至更佳SEQ ID No: 220至430所示之任一肽的不同之處為約例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸殘基，但仍保留抗原性IgE生物活性。當此比較需要比對時，比對序列之最大同源性。變異位點可出現於肽之任何地方，只要生物活性實質上類似於SEQ ID No: 1至430中所示之肽，更佳地實質上類似於SEQ ID No: 1至153及220至430中所示之肽，甚至更佳地實質上類似於SEQ ID No: 220至430中所示之肽即可。

關於如何產生表型沉默胺基酸取代之指導係提供於Bowie等人，Science,247: 1306-1310(1990)中，該文獻教示存在兩種研究胺基酸序列對改變之容許度的主要策略。

第一種策略利用在進化過程期間藉由自然選擇來容許胺基酸取代。藉由比較不同物種之胺基酸序列，可鑑別物種間保留之胺基酸位置。此等保留之胺基酸可能對於蛋白質功能很重要。相反，自然選擇所容許之取代所在的胺基酸位置表示對於蛋白質功能不重要之位置。因此，可修飾容許胺基酸取代之位置，同時仍維持經修飾肽之特異性免疫原性活性。

第二種策略利用遺傳工程改造在經選殖基因之特定位置處引入胺基酸變化以鑑別對於蛋白質功能重要之區域。舉例而言，可使用定點突變誘發或丙胺酸掃描突變誘發(Cunningham等人，Science,244: 1081-1085(1989))。接著可測試所得變異肽之特異性抗原性IgE生物活性。

根據Bowie等人，此兩種策略已揭露蛋白質驚人地容許胺基酸取代。作者進一步指出在蛋白質中之某些胺基酸位置處可能容許何胺基酸變化。舉例而言，大部分內埋或內部(在蛋白質之三級結構內)胺基酸殘基需要非極性側鏈，而一般保留表面或外部側鏈之極少特徵。

將突變引入蛋白質之胺基酸中的方法為熟習此項技術者所熟知。例如參見Ausubel(編),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Inc.(1994)；T. Maniatis,E. F. Fritsch及J. Sambrook,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor laboratory,Cold Spring Harbor,N. Y.(1989)。

亦可使用市售套組(諸如「QuikChangeTM定點突變誘發套組」(Stratagene))或直接藉由肽合成來引入突變。藉由置換不顯著影響抗原性IgE肽之功能的胺基酸來產生該抗原性IgE肽之功能活性變異體可由熟習此項技術者來完成。

一類可在本發明之一種肽中進行的胺基酸取代為保守性胺基酸取代。「保守性胺基酸取代」係胺基酸殘基經另一具有側鏈R基團及類似化學性質(例如電荷或疏水性)之胺基酸殘基取代的胺基酸取代。一般而言，保守性胺基酸取代不會實質上改變蛋白質之功能性質。在兩個或兩個以上胺基酸序列互不相同之處為保守性取代之情況下，可調高序列一致性或相似度百分比以校正該取代之保守性質。進行此調節之方式為熟習此項技術者所熟知。例如參見Pearson,Methods Mol. Biol . 243:307-31(1994)。

具有側鏈及類似化學性質之胺基酸組的實例包括：1)脂族側鏈：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸；2)脂族羥基側鏈：絲胺酸及蘇胺酸；3)含有醯胺之側鏈：天冬醯胺及麩醯胺酸；4)芳族側鏈：苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸；5)鹼性側鏈：離胺酸、精胺酸及組胺酸；6)酸性側鏈：天冬胺酸及麩胺酸；及7)含硫側鏈：半胱胺酸及甲硫胺酸。較佳保守性胺基酸取代組為：纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸、麩胺酸-天冬胺酸及天冬醯胺-麩醯胺酸。

或者，保守性置換係Gonnet等人，Science 256:1443-45(1992)中所揭示之PAM250對數概似矩陣具有正值之任何改變。「中度保守性」置換為PAM250對數概似矩陣具有非負值之任何改變。

功能活性變異肽亦可使用雜交技術來分離。簡言之，使用與編碼所需肽、多肽或蛋白質(例如SEQ ID No: 1至430)之核酸序列的全部或一部分具有高同源性之DNA來製備功能活性肽。因此，本發明之抗原性IgE肽亦包括功能上等效於SEQ ID No: 1至430之一或多種肽且由與編碼SEQ ID No: 1至430中之任一者之核酸或其互補序列雜交的核酸分子編碼之肽。熟習此項技術者可容易地使用易於得到之密碼子表來確定編碼本發明之肽的核酸序列。因此，本文中不提供此等核酸序列。

編碼呈功能活性變異體之肽、多肽或蛋白質之核酸的雜交嚴格度為例如10%甲醯胺、5×SSPE、1×登氏溶液(Denhart's solution)及1×鮭魚精子DNA(低嚴格度條件)。更佳條件為25%甲醯胺、5×SSPE、1×登氏溶液及1×鮭魚精子DNA(中等嚴格度條件)，且甚至更佳條件為50%甲醯胺、5×SSPE、1×登氏溶液及1×鮭魚精子DNA(高嚴格度條件)。然而，除上述甲醯胺濃度外，若干種因素可影響雜交嚴格度，且熟習此項技術者可適當地選擇此等因素以達到類似嚴格度。

編碼功能活性變異體之核酸分子亦可藉由基因擴增方法來分離，諸如使用編碼所需肽、多肽或蛋白質(例如SEQ ID No: 1至430所示之任一肽)之核酸分子DNA之一部分作為探針的PCR。

出於本發明之目的，應認為本發明之若干種抗原性IgE肽可組合使用。可預想各種可能組合。舉例而言，可使用包含一種以上較佳選自SEQ ID No: 1至430、更佳選自SEQ ID No: 1至153及220至430、甚至更佳選自SEQ ID No: 220至430之抗原性IgE肽的多肽，其中同一多肽分子上使用相同抗原性IgE肽之若干複本，或其中同一多肽分子上使用具有不同胺基酸序列之抗原性IgE肽；該等不同抗原性IgE肽或複本直接彼此融合或由適當連接子隔開。如本文中所使用，術語「多聚化抗原性IgE(多)肽」係指兩種類型之組合，其中具有不同或相同胺基酸序列之抗原性IgE肽存在於單個多肽分子上。2至約20個相同及/或不同抗原性IgE肽，較佳2、3、4、5、6或7個抗原性IgE肽可因此存在於單個多聚化抗原性IgE多肽分子上。

在本發明之一態樣中，免疫原由多聚化抗原性IgE肽組成、基本上由該肽組成或包含該肽，該多聚化IgE肽由至少一個選自由SEQ ID No: 1至430及其功能活性變異體組成之群、較佳選自由SEQ ID No: 1至430組成之群的胺基酸序列組成、基本上由該胺基酸序列組成或包含該胺基酸序列。在一實施例中，該多聚化IgE肽包含含有選自由SEQ ID No: 1至153組成之群的胺基酸序列之第一抗原性IgE肽及含有選自由SEQ ID No: 154至219或SEQ ID No: 220至310或SEQ ID No: 311至430組成之群的胺基酸序列之第二抗原性IgE肽。在另一實施例中，該多聚化IgE肽包含含有選自由SEQ ID No: 154至219組成之群的胺基酸序列之第一抗原性IgE肽及含有選自由SEQ ID No: 1至153或SEQ ID No: 220至310或SEQ ID No: 311至430組成之群的胺基酸序列之第二抗原性IgE肽。在又一實施例中，該多聚化IgE肽包含含有選自由SEQ ID No: 220至310組成之群的胺基酸序列之第一抗原性IgE肽及含有選自由SEQ ID No: 1至153或SEQ ID No: 154至219或SEQ ID No: 311至430組成之群的胺基酸序列之第二抗原性IgE肽。在又一實施例中，該多聚化IgE肽包含含有選自由SEQ ID No: 311至430組成之群的胺基酸序列之第一抗原性IgE肽及含有選自由SEQ ID No: 1至153或SEQ ID No: 154至219或SEQ ID No: 220至310組成之群的胺基酸序列之第二抗原性IgE肽。在又一實施例中，該多聚化IgE肽包含含有選自由SEQ ID No: 311至430組成之群的胺基酸序列之第一抗原性IgE肽、含有選自由SEQ ID No: 220至310組成之群的胺基酸序列之第二抗原性IgE肽及含有選自由SEQ ID No: 154至219或SEQ ID NO: 1至153組成之群的胺基酸序列之第三抗原性IgE肽。

在本發明之一實施例中，本發明之肽、多肽或蛋白質係來源於天然來源且自諸如人類、靈長類動物、貓、狗、馬、小鼠或大鼠之哺乳動物，較佳自人類來源分離。因此，本發明之肽、多肽或蛋白質可使用標準蛋白質純化技術自細胞或組織來源分離。

或者，本發明之肽、多肽及蛋白質可以化學方式合成或使用重組DNA技術產生。

舉例而言，本發明之肽、多肽或蛋白質可藉由此項技術中熟知之固相程序來合成。合適之合成可藉由使用「T-boc」或「F-moc」程序來執行。環狀肽可藉由固相程序，使用熟知之「F-moc」程序及聚醯胺樹脂，在完全自動裝置中合成。或者，熟習此項技術者將知曉手動執行製程之必要實驗步驟。用於固相合成之技術及程序係描述於E. Atherton及R. C. Sheppard之「Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach」，由Oxford University Press之IRL出版(1989)及D. Andreau等人之「Methods in Molecular Biology」，第35卷：Peptide Synthesis Protocols(M. W. Pennington及B. M. Dunn編)，第7章，第91-171頁中。

或者，可使用此項技術中熟知之技術將編碼本發明之肽、多肽或蛋白質的聚核苷酸引入可在合適之表現系統中表現之表現載體中，隨後分離或純化所表現之所需肽、多肽或蛋白質。各種細菌、酵母、植物、哺乳動物及昆蟲表現系統可用於此項技術且可使用任何該種表現系統。編碼本發明之肽、多肽或蛋白質的聚核苷酸視情況可在無細胞轉譯系統中轉譯。

本發明之抗原性IgE肽亦可包含由存在多個基因、替代性轉錄事件、替代性RNA拼接事件及替代性轉譯與轉譯後事件所產生之彼等肽。肽可在引起與該肽在天然細胞中表現時所存在之實質上相同的轉譯後修飾之系統(例如培養細胞)中表現，或在引起在天然細胞中表現時所存在之轉譯後修飾(例如糖基化或裂解)之改變或省略的系統中表現。

本發明之肽、多肽或蛋白質(諸如抗原性IgE肽)可以融合蛋白形式產生，該融合蛋白含有其他非IgE或非IgE衍生之胺基酸序列，諸如胺基酸連接子或信號序列或如本文所定義之免疫原性載體，以及適用於蛋白質純化之配位體，諸如麩胱甘肽-S-轉移酶、組胺酸標籤及葡萄球菌蛋白A。一種以上本發明之抗原性IgE肽可以融合蛋白形式存在。異源多肽可例如與本發明之肽、多肽或蛋白質的N端或C端融合。本發明之肽、多肽或蛋白質亦可以包含同源胺基酸序列(亦即其他IgE或IgE衍生之序列)的融合蛋白形式產生。

本發明之抗原性IgE肽可呈線性或構形受限制。在本發明之較佳實施例中，抗原性IgE肽之構形受限制。如本文中關於分子所使用，術語「構形受限制」意謂三維結構隨時間實質上維持一種空間排列之分子(諸如肽、多肽或蛋白質)。構形受限制之分子可具有改良之性質，諸如親和力、代謝穩定性、膜滲透性或溶解性增加。

另外，預期該等構形受限制之分子以類似於其天然環構形之構形提供抗原性IgE抗原決定基，從而誘導抗IgE抗體更易識別完整之天然自體IgE分子或以增加之親和力識別自體IgE分子。構形限制之方法為此項技術所熟知且包括(但不限於)橋接及環化。

先前技術中已知存在若干種將構形限制引入線性肽或多肽鏈中之方法。舉例而言，肽中兩個相鄰胺基酸之間的橋接引起局部構形改變，與規則肽之可撓性相比，其可撓性受限制。形成該等橋鍵之一些可能性包括併入內醯胺及哌嗪酮(關於評論，請參見Giannis and. Kolter,Angew. Chem. Int. Ed.,1993,32: 1244)。

如本文中關於肽所使用，術語「環狀」係指在兩個非相鄰胺基酸或胺基酸類似物之間包括分子內鍵之結構。環化可經由共價或非共價鍵來實現。分子內鍵包括(但不限於)主鏈與主鏈、側鏈與主鏈、側鏈與側鏈、側鏈與端基、端基與端基之間的鍵。環化方法包括(但不限於)在非相鄰胺基酸或胺基酸類似物之側鏈之間形成二硫鍵；在Lys與Asp/Glu殘基之間形成醯胺鍵；在絲胺酸殘基與Asp/Glu殘基之間形成酯鍵；例如在一個胺基酸或其類似物之側鏈基團與胺基端殘基之N端胺之間形成內醯胺鍵；及形成離胺酸正白胺酸及二酪胺酸鍵。亦可使用二硫鍵之碳形式(例如乙烯基或乙基鍵)(J. Peptide Sc .,2008,14 ,898-902)，以及與適當經多取代之親電子試劑(諸如二鹵烷烴、三鹵烷烴或四鹵烷烴)的烷基化反應(PNAS ,2008,105 (40),15293-15298;ChemBioChem ,2005,6 ,821-824)。各種經修飾之脯胺酸類似物亦可用於將構形限制併入肽中(Zhang等人，J. Med Chem.,1996,39: 2738-2744；Pfeifer及Robinson,Chem. Comm.,1998,1977-1978)。可用於環化本發明之肽的化學作用產生經包括(但不限於)以下之鍵環化的肽：內醯胺、腙、肟、噻唑烷、硫醚或鋶鍵。

US 10/114918中所述之設計構形受限制之肽的另一種方法在於將所需短胺基酸序列連接於模板，產生環狀受限制之肽。該等環狀肽不僅藉由其模板使得結構穩定，且藉此提供可模擬天然蛋白質上(諸如病毒及寄生蟲上)或自身蛋白質(自體性哺乳動物蛋白質，諸如IgE)上之構形抗原決定基的三維構形，而且在血清中其比線性肽更抗蛋白水解降解。US 10/114918進一步揭示藉由製備合成胺基酸以與適當位置處之胺基酸進行主鏈偶合以便使肽之超二級結構穩定來合成構形受限制之交聯肽。交聯可藉由正交保護之(2S,3R)-3-胺基脯胺酸殘基之一級胺基與適當位置處之麩胺酸之側鏈羧基進行醯胺偶合來達成。在製備CS蛋白之構形受限制之四肽重複時按照此方法，其中至少一個脯胺酸由(2S,3R)-3-胺基脯胺酸置換且為了引入側鏈羧基，併有麩胺酸以置換丙胺酸。

交聯策略亦包括應用格羅布斯閉環複分解反應(Grubbs ring-closing metathesis reaction)以形成設計成模擬α螺旋構形之「卡釘型(stapled)」肽(Angew. Int. Ed. Engl .,1998,37 ,3281;JACS ,2000,122 ,5891)；使用多官能化醣；使用胺基羧乙基硫色胺酸鍵(Chemistry Eu. J .,2008,24 ,3404-3409)；使用疊氮化物與炔烴的「點擊(click)」反應，其可以側鏈胺基酸殘基形式併入或位於肽序列之主鏈中(Drug Disc. Today ,2003,8 (24),1128-1137)。文獻中亦已知金屬離子可經由螯合與金屬陽離子配位之特定殘基(例如組胺酸)而使線性肽之受限制構形穩定(Angew. Int. Ed. Engl .,2003,42 ,421)。類似地，用非天然酸及胺官能基或多元胺及多元酸官能基使線性肽序列官能化可用於在活化及醯胺鍵形成後得到環化結構。

根據一實施例，抗原性IgE肽因抗原性IgE肽之兩個非相鄰胺基酸(例如N及C端胺基酸)的彼此分子內共價鍵結而構形受限制。根據另一實施例，本發明之抗原性IgE肽因共價結合於骨架分子而構形受限制。根據另一實施例，抗原性IgE肽受簡單限制，亦即在一端(C或N端)或經由不位於任一端之另一胺基酸與骨架分子偶合。根據另一實施例，抗原性IgE肽受雙重限制，亦即在C端與N端與骨架分子偶合。根據另一實施例，抗原性肽藉由經由異對掌性雙脯胺酸(Diproline)單元(D-Pro-L-Pro)之模板作用進行環化而受限制(Spath等人，1998,Helvetica Chimica Acta 81，第1726-1738頁)。本發明之說明性但非限制性構形受限制之肽的實例在圖2中圖示描述。

骨架(亦稱為「平台」)可為能夠經由共價鍵結減少抗原性IgE肽可採用之構形數的任何分子。構形限制性骨架之實例包括蛋白質及肽，例如脂質運載蛋白相關分子(諸如含有β桶之硫氧還原蛋白及硫氧還原蛋白樣蛋白)、核酸酶(例如RNaseA)、蛋白酶(例如胰蛋白酶)、蛋白酶抑制劑(例如水蛭蛋白酶抑制劑(eglin)C)、抗體或其結構剛性片段、螢光蛋白(諸如GFP或YFP)、芋螺毒素(conotoxin)、纖維結合蛋白III型域之環區、CTL-A4及病毒樣粒子(VLP)。

其他合適之平台分子包括碳水化合物，諸如瓊脂糖。該平台可為線性或環狀分子，例如接近形成環。平台一般對於抗原性IgE肽為異源性的。認為該等連接於平台之構形受限制之肽比線性肽對蛋白水解降解更具抗性。

根據一較佳實施例，該骨架為如本申請案中所定義之免疫原性載體，較佳為異源載體蛋白或VLP。在另一實施例中，抗原性IgE肽簡單限制於免疫原性載體上。在另一實施例中，抗原性IgE肽雙重限制於免疫原性載體上。以此方式，抗原性IgE肽形成構形受限制之環結構，其經證明為尤其適合作為細胞內識別分子之結構。

本發明之抗原性IgE肽可經修飾以易於與平台結合，例如藉由在一端或兩端添加末端半胱胺酸及/或藉由添加連接序列(諸如雙甘胺酸頭或尾、以離胺酸殘基封端之連接子或熟習此項技術者已知執行該功能之任何其他連接子)來達成。亦可使用使完整肽序列與載體偶合之生物正交化學作用(諸如上述點擊反應)，由此避免任何區域化學及化學選擇性問題。已知剛化連接子(Rigidified linker)(諸如Jones等人Angew. Chem. Int. Ed. 2002,41:4241-4244中所述之連接子)引起改良之免疫反應且亦可使用該等連接子。

在另一實施例中，抗原性IgE肽連接於自身與載體偶合之多價模板，由此增加抗原密度(參見下文)。該多價模板可為經適當官能化之聚合物或寡聚物，諸如(但不限於)寡聚麩胺酸(oligoglutamate)或寡聚聚葡萄胺糖。

該連接子可位於肽之N端，或肽之C端，或肽之兩端。該連接子之長度可為0至10個胺基酸，較佳長度為0至6個胺基酸，甚至更佳長度為2-3個胺基酸。或者，可執行一或多種胺基酸之D-立體異構體形式的添加或取代以形成有益衍生物，例如增強肽之穩定性。

以下提供使用各種連接子的例示性結合組合，其全部均在本發明之範疇內且構成多種實施例：肽-GGGGGC-骨架、肽-GGGGC-骨架、肽-GGGC-骨架、肽-GGC-骨架、肽-GC-骨架、肽-C-骨架、肽-GGGGGK、肽-GGGGK、肽-GGGK、肽-GGK、肽-GK、肽-K、肽-GGGGSC、肽-GGGSC、肽-GGSC、肽-GSC、肽-SC、CSGGGG-肽、CSGGG-肽、CSGG-肽、CSG-肽、CS-肽。

在一實施例中，該肽由本文所揭示之任一抗原性IgE肽組成且該骨架由本文所揭示之任一免疫原性載體(較佳為VLP)組成。

以下提供使用各種連接子及雙重受限制之肽的例示性結合組合，其中該載體可為載體之相同單體或載體之相異單體。(在以下實例中，GC連接子可經上文例示之任一GK連接子或GSC連接子或熟習此項技術者已知之任何其他連接子取代)：載體-CGGGGG-肽-GGGGGC-載體、載體-CGGGG-肽-GGGGC-載體、載體-CGGGG-肽-GGGGC-載體、載體-CGGG-肽-GGGC-載體、載體-CG-肽-GC-載體、載體-C-肽-C-載體。

在一實施例中，若末端半胱胺酸殘基不存在於抗原性IgE肽之胺基酸序列中，則將其添加至SEQ ID No: 1至430之任一抗原性IgE肽的一端或兩端以產生構形受限制之肽。在一較佳實施例中，本發明之構形受限制之抗原性IgE肽係選自由SEQ ID No: 1至430及其功能活性變異體組成之群，較佳選自由SEQ ID No: 1至430組成之群，更佳選自由SEQ ID No: 1至153及220至430組成之群，甚至更佳選自由SEQ ID No: 220至430組成之群。在一實施例中，在該抗原性IgE肽之C端添加該末端半胱胺酸殘基。在另一實施例中，在該抗原性IgE肽之N端添加該末端半胱胺酸殘基。在另一實施例中，在該抗原性IgE肽之C端與N端皆添加末端半胱胺酸殘基。

在另一實施例中，GC連接子包含可變數目之甘胺酸殘基且將一個末端半胱胺酸殘基添加至SEQ ID No: 1至430之任一抗原性IgE肽的一端或兩端以產生構形受限制之肽。該GC連接子較佳包含1至10個甘胺酸殘基，更佳1、2、3、4或5個甘胺酸殘基。在另一較佳實施例中，本發明之構形受限制之抗原性IgE肽係選自由SEQ ID No: 1至430及其功能活性變異體組成之群，較佳選自由SEQ ID No: 1至430組成之群，更佳選自由SEQ ID No: 1至153及220至430組成之群，甚至更佳選自由SEQ ID No: 220至430組成之群。在一實施例中，在該抗原性IgE肽之C端添加該GC連接子。在另一實施例中，在該抗原性IgE肽之N端添加該GC連接子。在另一實施例中，在該抗原性IgE肽之C端與N端皆添加該GC連接子。

在又一實施例中，GC連接子包含可變數目之甘胺酸殘基且將一個末端半胱胺酸殘基添加至SEQ ID No: 1至430之抗原性IgE肽的一端且若末端半胱胺酸殘基不存在於抗原性IgE肽之另一端，則將其添加至抗原性肽之另一端。GC連接子較佳包含1至10個甘胺酸殘基，更佳1、2、3、4或5個甘胺酸殘基。在另一較佳實施例中，本發明之構形受限制之抗原性IgE肽係選自由SEQ ID No: 1至430及其功能活性變異體組成之群，較佳選自由SEQ ID No: 1至430組成之群，更佳選自由SEQ ID No: 1至153及220至430組成之群，甚至更佳選自由SEQ ID No: 220至430組成之群。在一實施例中，在該抗原性IgE肽之C端添加該GC連接子且在該抗原性IgE肽之N端添加該末端半胱胺酸殘基。在一實施例中，在該抗原性IgE肽之N端添加該GC連接子且在該抗原性IgE肽之C端添加該末端半胱胺酸殘基。

在另一較佳實施例中，較佳藉由添加離胺酸殘基來修飾GC連接子，以便使該與該抗原性IgE肽偶合之連接子與骨架分子結合。在一甚至更佳實施例中，本發明之構形受限制之抗原性IgE肽係選自由SEQ ID No: 1至430及其功能活性變異體組成之群，較佳選自由SEQ ID No: 1至430組成之群，更佳選自由SEQ ID No: 1至153及220至430組成之群，甚至更佳選自由SEQ ID No: 220至430組成之群。在一實施例中，在該抗原性IgE肽之C端添加該經修飾之GC連接子。在另一實施例中，在該抗原性IgE肽之N端添加該經修飾之GC連接子。

在一實施例中，本發明之構形受限制之抗原性IgE肽為表9中所揭示之任一肽。

本發明之免疫原性載體

在本發明之一實施例中，本發明之抗原性IgE肽或多肽係連接於免疫原性載體分子以形成用於疫苗接種方案之免疫原，較佳地其中該載體分子與天然IgE分子無關。

本文中之術語「免疫原性載體」包括如下彼等物質:具有獨立地引起宿主動物之免疫原性反應的特性且可直接經由在肽、多肽或蛋白質中之游離羧基、胺基或羥基與免疫原性載體物質上之相應基團之間形成肽或酯鍵，或者藉由經由習知雙官能鍵聯基團鍵結，或以融合蛋白形式與該肽、多肽或蛋白質共價偶合。

用於本發明之免疫原中的載體類型將容易為熟習此項技術者所已知。該等免疫原性載體之實例為：血清白蛋白，諸如牛血清白蛋白(BSA)；球蛋白；甲狀腺球蛋白；血紅素；血氰蛋白(尤其為匙孔螺血氰蛋白[Keyhole Limpet Hemocyanin/KLH])；自蛔蟲萃取之蛋白質；不活化細菌毒素或類毒素，諸如破傷風或白喉毒素(TT及DT)或CRM197、結核菌素純蛋白衍生物(purified protein derivative of tuberculin，PPD)；或來自流行性感冒桿菌(Haemophilus influenzae)之蛋白質D(WO 91/18926)或其重組片段(例如TT之片段C的域1，或DT之移位域或包含流行性感冒桿菌蛋白質D之N端100-110個胺基酸的蛋白質D 1/3rd(GB 9717953. 5))；聚離胺酸；聚麩胺酸；離胺酸-麩胺酸共聚物；含有離胺酸或鳥胺酸之共聚物；脂質體載體等。

在一實施例中，免疫原性載體為KLH。在另一實施例中，免疫原性載體為病毒樣粒子(VLP)，較佳為重組病毒樣粒子。

如本文中所使用，術語「病毒樣粒子」係指類似於病毒粒子但顯示非病原性之結構。一般而言，病毒樣粒子缺乏病毒基因組之至少一部分。又，病毒樣粒子通常可藉由異源表現大量產生且可容易地經純化。本發明之病毒樣粒子可含有不同於其基因組之核酸。本發明之病毒樣粒子之一典型及較佳實施例為病毒衣殼，諸如相應病毒、噬菌體或RNA-噬菌體之病毒衣殼。

如本文中所使用，術語「噬菌體之病毒樣粒子」係指類似於噬菌體結構、非複製性及非傳染性、且至少缺乏編碼噬菌體之複製機構之基因、且通常亦缺乏編碼負責病毒連接於宿主或進入宿主體內之蛋白質之基因的病毒樣粒子。然而，此定義亦應涵蓋噬菌體之病毒樣粒子，其中上述基因仍存在，但不活化，且因此，亦產生噬菌體之非複製性及非傳染性病毒樣粒子。

由RNA噬菌體鞘蛋白之180個次單元的自組裝所形成且視情況含有宿主RNA之衣殼結構在本文中被稱為「RNA噬菌體鞘蛋白之VLP」。一特定實例為Qβ鞘蛋白之VLP。在此特定情況下，Qβ鞘蛋白之VLP可僅僅由Qβ CP次單元(藉由表現含有例如TAA終止密碼子之Qβ CP基因，經由抑制來阻止較長A1蛋白之任何表現所產生，參見Kozlovska,T. M.等人，Intervirology 39: 9-15(1996))組裝，或另外在衣殼組件中含有A1蛋白次單元。衣殼組件中Qβ A1蛋白相對於Qβ CP之百分比一般將受限制，以便確保衣殼形成。

在本發明之情形下，適合用作免疫原性載體之VLP的實例包括(但不限於)B型肝炎病毒之衣殼蛋白(Ulrich等人，Virus Res. 50: 141-182(1998))、麻疹病毒(Warnes等人，Gene 160: 173-178(1995))、辛德比病毒(Sindbis virus)、輪狀病毒(美國專利第5,071,651號及第5,374,426號)、口蹄疫病毒(Twomey等人，Vaccine 13: 1603-1610,(1995))、諾沃克病毒(Norwalk virus)(Jiang,X.等人，Science 250: 1580-1583(1990)；Matsui,S. M.等人，J Clin. Invest. 87: 1456-1461(1991))、反轉錄病毒GAG蛋白(PCT專利申請案第WO 96/30523號)、反轉錄轉座子Ty蛋白pl、B型肝炎病毒之表面蛋白質(WO 92/11291)、人類乳頭狀瘤病毒(WO 98/15631)、人類多瘤病毒(Sasnauskas K.等人，Biol. Chem. 380(3): 381-386(1999)；Sasnauskas K.等人，Generation of recombinant virus-like particles of different polyomaviruses in yeast.第三屆國際會議「Virus-like particles as vaccines.」Berlin,9月26-29(2001))、RNA噬菌體、Ty、frphage、GA-噬菌體、AP 205-噬菌體及尤其Qβ-噬菌體、豇豆褪綠斑駁病病毒(Cowpea chlorotic mottle virus)、人類乳頭狀瘤病毒(HPV)、牛乳頭狀瘤病毒、豬小病毒、小病毒、杯狀病毒(例如諾沃克病毒)、兔出血病病毒、動物嗜肝DNA病毒核心抗原VLP。

如對於熟習此項技術者將顯而易見，欲用作本發明之免疫原性載體的VLP不限於任何特定形式。該粒子可以化學方式或經由可為自然或非自然之生物過程合成。舉例而言，此種類型之實施例包括病毒樣粒子或其重組形式。在一更特定實施例中，VLP可包含已知形成VLP之任一病毒的重組多肽或者由該等重組多肽組成。病毒樣粒子可進一步包含該等多肽之一或多個片段以及該等多肽之變異體或者由其組成。在胺基酸層面上，多肽之變異體可與其野生型對應物共有例如至少80%、85%、90%、95%、97%或99%一致性。適合用於本發明之變異VLP可來源於任何生物，只要其能夠形成「病毒樣粒子」且可用作如本文所定義之「免疫原性載體」即可。

本發明之較佳VLP包括HBV之衣殼蛋白或表面抗原(分別為HBcAg及HBsAg)或其重組蛋白或片段，及RNA-噬菌體之鞘蛋白或其重組蛋白或片段，更佳為Qβ之鞘蛋白或其重組蛋白或片段。

在一實施例中，與本發明之抗原性IgE肽或多肽組合使用的免疫原性載體為HBcAg蛋白。在本發明之情形下可使用之HBcAg蛋白的實例可容易由熟習此項技術者判定。實例包括(但不限於)Yuan等人(J. Virol. 73: 10122-10128(1999))及WO 00/198333、WO 00/177158、WO 00/214478、WO 00/32227、WO 01/85208、WO 02/056905、WO 03/024480及WO 03/024481中所述之HBV核心蛋白。適合用於本發明之HBcAg可來源於任何生物，只要其能夠形成「病毒樣粒子」且可用作如本文所定義之「免疫原性載體」即可。

在本發明之情形下可使用之備受關注的HBcAg變異體為一或多個天然固有半胱胺酸殘基缺失或經取代之變異體。此項技術中熟知，游離半胱胺酸殘基可與許多化學副反應有關，包括二硫鍵交換、與例如在與其他物質之組合療法中注射或形成的化學物質或代謝物反應、或在曝露於UV光後直接氧化及與核苷酸反應。尤其考慮到HBcAg強烈趨向於結合核酸，因此可產生有毒加合物。該等有毒加合物將因此分布於許多物質之間，其個別地可各自以低濃度存在，但合起來達到毒性水準。鑒於上文，經修飾以移除天然固有半胱胺酸殘基之疫苗組合物中使用HBcAg之一個優點在於當連接抗原或抗原決定子時有毒物質可結合之位點數目將減少或全部消除。

另外，在本發明之情形下亦可使用缺乏B型肝炎核心抗原前體蛋白之N端前導序列的HBcAg之經加工形式，尤其當在不會進行加工(例如在細菌系統中表現)之條件下產生HBcAg時。

本發明之其他HBcAg變異體包括：i)與一種野生型HBcAg胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、97%或99%一致性之多肽序列或其亞部分，通常使用已知電腦程式；ii)C端截短之突變體，包括自C端移除1、5、10、15、20、25、30、34或35個胺基酸之突變體；ii)N端截短之突變體，包括自N端移除1、2、5、7、9、10、12、14、15或17個胺基酸之突變體；iii)在N端與C端皆截短之突變體，包括自N端移除1、2、5、7、9、10、12、14、15或17個胺基酸及自C端移除1、5、10、15、20、25、30、34或35個胺基酸之HBcAg。

在本發明之範疇內的其他HBcAg變異蛋白為經修飾以增強外來抗原決定基之免疫原性呈遞的變異體，其中四個精胺酸重複中之一或多個缺失，但其中C端半胱胺酸得到保留(例如參見WO01/98333)；及嵌合C端截短之HBcAg，諸如WO 02/14478、WO 03/102165及WO 04/053091中所述之蛋白。

在另一實施例中，與本發明之抗原性IgE肽或多肽組合使用的免疫原性載體為HBsAg蛋白。在本發明之情形下可使用的HBsAg蛋白可容易由熟習此項技術者判定。實例包括(但不限於)US 5792463、WO 02/10416及WO 08/020331中所述之HBV表面蛋白。適合用於本發明之HBsAg可來源於任何生物，只要其能夠形成「病毒樣粒子」且可用作如本文所定義之「免疫原性載體」即可。舉例而言，亞型adw(參見本文件之實例部分)。

在又一實施例中，與本發明之抗原性IgE肽或多肽組合使用的免疫原性載體為Qβ鞘蛋白。

發現Qβ鞘蛋白在大腸桿菌中表現時會自組裝成衣殼(Kozlovska TM.等人，GENE 137: 133-137(1993))。所獲得之衣殼或病毒樣粒子顯示直徑為25 nm且具有T=3準對稱性之二十面體噬菌體樣衣殼結構。此外，噬菌體Qss之晶體結構已解出。衣殼含有180個鞘蛋白複本，其以共價五聚體及六聚體形式由二硫橋鍵連接(Golmohammadi,R.等人，Structure 4: 5435554(1996))，引起Qβ鞘蛋白之衣殼的顯著穩定性。Qβ衣殼蛋白亦顯示對有機溶劑及變性劑之異常抗性。Qβ鞘蛋白之衣殼的高穩定性為有利特徵，根據本發明其尤其適用於在哺乳動物及人類之免疫及疫苗接種中。

在本發明之情形下可使用之Qβ鞘蛋白的實例可容易由熟習此項技術者判定。實例已充分描述於WO 02/056905、WO 03/024480、WO 03/024481(以全文引用的方式併入本文中)中且包括(但不限於)PIR資料庫中所揭示之胺基酸序列，關於Qβ CP為登錄號VCBPQβ；關於Qβ A1蛋白為登錄號AAA16663；及其變異體，包括N端甲硫胺酸經裂解之變異蛋白；失去多達100、150或180個胺基酸之Qβ A1的C端截短形式；藉由缺失或取代來移除離胺酸殘基或藉由取代或插入來添加離胺酸殘基而修飾之變異蛋白(例如參見WO 03/024481中所揭示之Qβ-240、Qβ-243、Qβ-250、Qβ-251及Qβ-259，該案以全文引用的方式併入本文中)，及與上述任一Qβ核心蛋白展現至少80%、85%、90%、95%、97%或99%一致性之變異體。適合用於本發明之變異Qβ鞘蛋白可來源於任何生物，只要其能夠形成「病毒樣粒子」且可用作如本文所定義之「免疫原性載體」即可。

可經由化學結合或藉由表現經遺傳工程改造之融合搭配物，使本發明之抗原性IgE肽與免疫原性載體偶合。該偶合不一定需要為直接偶合，而可經由連接序列進行。一般而言，在抗原性肽與免疫原性載體融合、結合或以其他方式連接的情況下，通常在抗原性肽之一端或兩端添加間隔或連接序列。該等連接序列一般包含由蛋白酶體、內體蛋白酶或細胞之其他泡狀區室識別之序列。

在一實施例中，本發明之肽係以與免疫原性載體形成之融合蛋白形式表現。肽之融合可藉由插入免疫原性載體一級序列中或藉由與免疫原性載體之N或C端融合來實現。下文中，當提及肽與免疫原性載體之融合蛋白時，涵蓋與次單元序列之任一端融合或肽內插入載體序列中。如下文所提及之融合可藉由將抗原性肽插入載體序列中，藉由用抗原性肽取代載體序列之一部分，或藉由組合缺失、取代或插入來實現。

當免疫原性載體為VLP時，嵌合抗原性肽-VLP次單元一般將能夠自組裝成VLP。呈現與次單元融合之抗原決定基的VLP在本文中亦稱為嵌合VLP。舉例而言，EP 0 421 635 B描述使用嵌合嗜肝DNA病毒核心抗原粒子來呈遞病毒樣粒子中之外來肽序列。

可將側接胺基酸殘基添加至抗原性肽序列之任一端以與VLP次單元序列之任一端融合，或將該肽序列內插入VLP次單元之序列中。甘胺酸及絲胺酸殘基為欲用於添加至欲融合之肽中的側接序列中之尤其有利的胺基酸。甘胺酸殘基賦予額外可撓性，其可減弱將外來序列融合至VLP次單元序列中之潛在不穩定作用。

在本發明之一特定實施例中，免疫原性載體為HBcAg VLP。抗原性肽與HBcAg之N端形成的融合蛋白(Neyrinck,S.等人，Nature Med. 5: 11571163(1999))或在所謂的主要免疫優勢區(major immunodominant region，MIR)中的插入物已有所描述(Pumpens,P.及Grens,E.,Intervirology 44: 98114(2001),WO 01/98333)，且為本發明之特定實施例。MIR中有缺失之天然存在之HBcAg變異體亦有所描述(Pumpens,P.及Grens,E.,Intervirology 44: 98-114(2001))，且與N或C端形成的融合物以及在MIR中對應於與wt HBcAg相比為缺失位點之位置處的插入物為本發明之其他實施例。與C端形成的融合物亦有所描述(Pumpens,P.及Grens,E.,Intervirology 44: 98-114(2001))。熟習此項技術者將容易獲得如何使用典型分子生物學技術構築融合蛋白之指導。編碼HBcAg及HBcAg融合蛋白且適用於表現HBcAg及HBcAg融合蛋白之載體及質體已有所描述(Pumpens,P.及#38;Grens,E. Intervirology 44: 98-114(2001)，Neyrinck,S.等人，Nature Med. 5: 1157-1163(1999))且可用於本發明之實踐中。優化自組裝之效率及呈現插入HBcAg之MIR中的抗原決定基之一重要因素係選擇插入位點，以及插入後HBcAg序列之MIR中之缺失的胺基酸數目(Pumpens,P.及Grens,E.,Intervirology 44: 98-114(2001)；EP 0 421 635；美國專利第6,231,864號)，或換言之，來自HBcAg之胺基酸將由新抗原決定基取代。舉例而言，用外來抗原決定基取代HBcAg胺基酸76-80、79-81、79-80、75-85或80-81已有所描述(Pumpens,P.及Grens,E.,Intervirology 44: 98-114(2001)；EP0421635；US 6,231,864、WO 00/26385)。HBcAg含有長精胺酸尾(Pumpens,P.及Grens,E.,Intervirology 44: 98-114(2001))，其對於衣殼組件為非必需的且能夠結合核酸(Pumpens,P.及Grens,E.,Intervirology 44: 98-114(2001))。包含或缺乏此精胺酸尾之HBcAg皆為本發明之實施例。

在本發明之另一特定實施例中，免疫原性載體為RNA噬菌體之VLP，較佳為Qβ。RNA噬菌體之主要鞘蛋白在細菌中及尤其在大腸桿菌中表現後自發地組裝成VLP。抗原性肽與Qβ之A1蛋白之截短形式的C端融合或插入A1蛋白中之融合蛋白構築體已有所描述(Kozlovska,T. M.等人，Intervirology,39: 9-15(1996))。該A1蛋白係藉由在UGA終止密碼子處抑制而產生且若考慮N端甲硫胺酸之裂解，則長度為329 aa或328 aa。丙胺酸(由Qβ CP基因編碼之第二個胺基酸)前之N端甲硫胺酸的裂解通常在大腸桿菌中進行，且Qβ鞘蛋白之N端亦為此情況。A1基因之一部分，UGA琥珀型密碼子之3'端編碼CP延長部分，其長度為195個胺基酸。在CP延長部分之位置72與73之間插入抗原性肽形成本發明之其他實施例(Kozlovska,T. M.等人，Intervirology 39: 9-15(1996))。抗原性肽融合於C端截短之Qβ A1蛋白的C端形成本發明之其他較佳實施例。舉例而言，Kozlovska等人(Intervirology,39: 9-15(1996))描述Qβ A1蛋白融合物，其中抗原決定基融合於在位置19處截短之Qβ CP延長部分的C端。

如由Kozlovska等人(Intervirology,39: 9-15(1996))所述，呈現融合之抗原決定基之粒子的組裝通常需要存在A1蛋白-抗原融合物與wt CP以形成嵌合粒子。然而，包含病毒樣粒子及由此尤其RNA噬菌體Qβ鞘蛋白之VLP(僅由與抗原性肽融合之VLP次單元構成)的實施例亦在本發明之範疇內。

嵌合粒子之製造可以多種方法實現。Kozlovska等人，Intervirology,39: 9-15(1996)描述三種方法，全部均可用於本發明之實踐中。在第一種方法中，在VLP上有效呈現融合之抗原決定基係藉由在具有編碼經選殖之UGA抑制型tRNA且使得UGA密碼子轉譯為Trp的質體(pISM3001質體(Smiley B. K.等人，Gene 134: 33-40(1993)))之大腸桿菌菌株中表現編碼在CP與CP延長部分之間具有UGA終止密碼子的Qβ A11蛋白融合物之質體來介導。在另一種方法中，CP基因終止密碼子經修飾成UAA，且表現A1蛋白-抗原融合物之第二質體經共轉型。該第二質體編碼不同抗生素抗性且複製起點與第一質體相容。在第三種方法中，CP及A1蛋白-抗原融合物係以雙順反子方式編碼，可操作地連接於啟動子(諸如Trp啟動子)，如Kozlovska等人，Intervirology,39: 9-15(1996)之圖1中所述。

此外，適合於抗原或抗原決定子融合之VLP描述於WO 03/024481中且包括噬菌體fr、RNA噬菌體MS-2、乳頭狀瘤病毒之衣殼蛋白、反轉錄轉座子Ty、酵母以及反轉錄病毒樣粒子、HIV2 Gag、豇豆花葉病毒、小病毒VP2 VLP、HBsAg(US 4,722,840、EP0020416B1)。適合於本發明之實踐之嵌合VLP的實例亦為Intervirology 39: 1(1996)中所述之VLP。此外，涵蓋用於本發明中之VLP的其他實例為：HPV-1、HPV-6、HPV-11、HPV-16、HPV-18、HPV-33、HPV-45、CRPV、COPV、HIV GAG、菸草花葉病毒，SV-40、多瘤病毒、腺病毒、疱疹單純型病毒、輪狀病毒及諾沃克病毒之病毒樣粒子。

對於形成本發明之一部分的任何重組表現之肽或蛋白質，包括與免疫原性載體偶合或不與免疫原性載體偶合之本發明之抗原性IgE肽，編碼該肽或蛋白質之核酸亦形成本發明之態樣，包含核酸之表現載體及含有該表現載體(自主插入或插入染色體中)之宿主細胞亦形成本發明之態樣。藉由使肽或蛋白質在上述宿主細胞中表現來重組產生該肽或蛋白質及自其分離免疫原之方法為本發明之另一態樣。本發明不涵蓋全長天然IgE分子或編碼其之全長天然DNA序列。

在另一實施例中，使用此項技術中熟知之技術，使本發明之肽以化學方式與免疫原性載體偶合。可進行結合以使肽經由單點結合(例如N端或C端點)或以肽之兩端皆與免疫原性載體蛋白或骨架結構(諸如VLP)結合之鎖定結構形式自由移動。此時經由熟習此項技術者已知之結合化學作用，諸如經由半胱胺酸殘基、離胺酸殘基或通常稱為結合點之其他羧基部分(諸如麩胺酸或天冬胺酸)進行結合。因此，舉例而言，直接共價偶合有可能利用碳化二亞胺、戊二醛或N-[y-順丁烯二醯亞胺基丁醯氧基]丁二醯亞胺酯，使用常見市售之異雙官能連接子(諸如CDAP及SPDP)(使用製造商之說明書)。肽(尤其環化肽)經由醯肼肽衍生物與蛋白質載體結合之實例描述於WO 03/092714中。偶合反應後，免疫原可容易藉助於透析方法、凝膠過濾方法、分餾方法等來分離及純化。以半胱胺酸殘基(較佳在環化區外以連接子)封端之肽宜經由順丁烯二醯亞胺化學作用與載體蛋白結合。

當免疫原性載體為VLP時，可使具有相同胺基酸序列或不同胺基酸序列之若干個抗原性肽與單個VLP分子偶合，如WO 00/32227、WO 03/024481、WO 02/056905及WO 04/007538中所述，較佳產生以定向方式呈現若干抗原決定子之重複及有序結構。

在本發明之一態樣中，經由化學交聯，通常且較佳藉由使用異雙官能交聯劑，使抗原性肽結合於VLP。若干種異雙官能交聯劑為此項技術所已知。在一些實施例中，該異雙官能交聯劑含有可與第一連接位點(亦即與VLP或VLP次單元之離胺酸殘基的側鏈胺基)反應之官能基，及可與較佳第二連接位點(亦即與抗原性肽融合且視情況亦可用於還原反應之半胱胺酸殘基)反應之另一官能基。程序之第一步驟(通常稱為衍生)為VLP與交聯劑之反應。此反應之產物為活化VLP，亦稱為活化載體。在第二步驟中，使用常用方法(諸如凝膠過濾或透析)移除未反應之交聯劑。在第三步驟中，使抗原性肽與活化VLP反應，且此步驟通常稱為偶合步驟。可視情況在第四步驟中移除未反應之抗原性肽，例如藉由透析達成。若干種異雙官能交聯劑為此項技術所已知。此等交聯劑包括較佳交聯劑SMPH(丁二醯亞胺基-6-[β-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺基]己酸酯)、磺酸基-MBS、磺酸基-EMCS、磺酸基-GMBS、磺酸基-SIAB、磺酸基-SMPB、磺酸基-SMCC、SVSB、SIA及例如可得自Pierce Chemical Company(Rockford,IL,USA)且具有一個針對胺基具反應性之官能基及一個針對半胱胺酸殘基具反應性之官能基的其他交聯劑。上述交聯劑均形成硫醚鍵。

另一類適合於本發明之實踐中的交聯劑之特徵為在偶合後在抗原性肽與VLP之間引入二硫鍵。屬於此類之較佳交聯劑包括例如SPDP及磺酸基-LC-SPDP(Pierce)。用交聯劑衍生VLP之程度可受不同實驗條件影響，諸如各反應搭配物之濃度、一種試劑相對於另一種試劑之過量、pH值、溫度及離子強度。偶合度(亦即每VLP次單元之抗原性肽量)可藉由改變上述實驗條件來調整以符合疫苗要求。

另一種使抗原性肽結合於VLP之方法為將VLP表面上的離胺酸殘基與抗原性肽上之半胱胺酸殘基連接。在一些實施例中，可能需要作為第二連接位點或作為其一部分之含有半胱胺酸殘基之胺基酸連接子與抗原性肽融合以與VLP偶合。一般而言，可撓性胺基酸連接子為有利的。胺基酸連接子之實例係選自由以下組成之群：(a) CGG；(b)N端γ1-連接子；(c) N端γ3-連接子；(d) Ig鉸鏈區；(e) N端甘胺酸連接子；(f)(G) kC(G) n，其中n=0-12且k=0-5；(g) N端甘胺酸-絲胺酸連接子；(h)(G) kC(G) m(S) i(GGGGS) n，其中n=0-3，k=0-5，m=0-10，i=0-2；(i) GGC；(k) GGC-NH₂ ；(l) C端γ1-連接子；(m) C端γ3-連接子；(n) C端甘胺酸連接子；(o)(G) nC(G) k，其中n=0-12且k=0-5；(p) C端甘胺酸-絲胺酸連接子；(q)(G) m(S) t(GGGGS) n(G) oC(G) k，其中n=0-3，k=0-5，m=0-10，t=0-2，且o=0-8。胺基酸連接子之其他實例為免疫球蛋白之鉸鏈區、甘胺酸絲胺酸連接子(GGGGS)n及甘胺酸連接子(G)n，全部均進一步含有半胱胺酸殘基作為第二連接位點且視情況含有其他甘胺酸殘基。通常，該等胺基酸連接子之較佳實例為N端γ1：CGDKTHTSPP；C端γ1：DKTHTSPPCG；N端γ3：CGGPKPSTPPGSSGGAP；C端γ3：PKPSTPPGSSGGAPGGCG；N端甘胺酸連接子：GCGGGG；及C端甘胺酸連接子：GGGGCG。

當疏水性抗原性肽結合於VLP時，尤其適合於本發明之實踐中的其他胺基酸連接子為CGKKGG或CGDEGG(用於N端連接子)，或GGKKGC及GGEDGC(用於C端連接子)。對於C端連接子，末端半胱胺酸視情況C端經醯胺化。

在本發明之一些實施例中，肽之C端處的GGCG、GGC或GGC-NH₂ (「NH₂ 」表示醯胺化)連接子或其N端處之CGG作為胺基酸連接子較佳。一般而言，甘胺酸殘基將插入龐大胺基酸與欲用作第二連接位點的半胱胺酸之間，以避免龐大胺基酸在偶合反應中之潛在位阻。在本發明之另一實施例中，胺基酸連接子GGC-NH₂ 與抗原性肽之C端融合。

抗原性肽上存在之半胱胺酸殘基必須呈其還原態以與活化VLP上之異雙官能交聯劑反應，亦即游離半胱胺酸或具有游離氫硫基之半胱胺酸殘基必須為可用的。在充當結合位點之半胱胺酸殘基呈氧化形式的情況下，例如，若其形成二硫橋，則需要用例如DTT、TCEP或對巰基乙醇還原此二硫橋。如WO 02/05690中所述，低濃度之還原劑與偶合相容，較高濃度抑制偶合反應，如熟習此項技術者所已知，在該情況下在偶合之前必須例如藉由透析、凝膠過濾或逆相HPLC移除還原劑或降低其濃度。

根據上述方法藉由使用異雙官能交聯劑使抗原性肽結合於VLP使得抗原性肽以定向方式與VLP偶合。其他使抗原性肽結合於VLP之方法包括使用碳化二亞胺EDC及NHS使抗原性肽與VLP交聯之方法。

在其他方法中，使用諸如戊二醛、DSGBM[PEO]4、BS3(Pierce Chemical Company,Rockford,IL,USA)之同雙官能交聯劑或具有針對VLP之胺基或羧基具反應性的官能基之其他已知同雙官能交聯劑使抗原性肽連接於VLP。

其他使VLP結合於抗原性肽之方法包括VLP經生物素標記且抗原性肽表現為抗生蛋白鏈菌素-融合蛋白之方法，或抗原性肽與VLP兩者皆經生物素標記之方法，例如如WO 00/23955中所述。在此情況下，可首先藉由調整抗原性肽與抗生蛋白鏈菌素之比率而使抗原性肽結合於抗生蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白，以致游離結合位點仍可用於結合VLP，其在下一步驟中添加。或者，所有組份均可在「一鍋」反應中混合。可使用其他配位體-受體對作為結合劑以使抗原性肽結合於VLP，在該等配位體-受體對中可用可溶形式之受體及配位體。或者，該配位體或該受體可與抗原性肽融合，且因此分別介導以化學方式結合或融合於受體或配位體之VLP的結合。融合亦可藉由插入或取代來實現。

一個或若干個抗原分子可連接於RNA噬菌體鞘蛋白之衣殼或VLP的一個次單元，若空間上允許，則較佳經由RNA噬菌體之VLP的暴露離胺酸殘基來連接。因此，RNA噬菌體之鞘蛋白的VLP及尤其QP鞘蛋白VLP之一特定特徵可能每個次單元偶合若干個抗原。此使得產生緻密抗原陣列。

在本發明之一實施例中，至少一個抗原或或抗原決定子分別結合及連接於病毒樣粒子係分別經由病毒樣粒子之至少一個第一連接位點與抗原性肽之至少一個第二連接之間的相互作用及締合來進行。

Q鞘蛋白之VLP或衣殼在其表面上呈現確定數目之離胺酸殘基，其中三個離胺酸殘基之確定拓撲結構對著衣殼內部且與RNA相互作用，而其他四個離胺酸殘基暴露於衣殼外部。此等確定性質有利於使抗原連接於粒子外部，而非離胺酸殘基與RNA相互作用之粒子內部。其他RNA噬菌體鞘蛋白之VLP亦在其表面上具有確定數目之離胺酸殘基及此等離胺酸殘基之確定拓撲結構。

在本發明之另一實施例中，該第一連接位點為離胺酸殘基且/或該第二連接包含氫硫基或半胱胺酸殘基。在本發明之另一實施例中，第一連接位點為離胺酸殘基且/或第二連接為半胱胺酸殘基。在本發明之其他實施例中，抗原或抗原決定子經由半胱胺酸殘基結合於RNA噬菌體鞘蛋白之VLP的離胺酸殘基，及尤其結合於Qβ鞘蛋白之VLP。

來源於RNA噬菌體之VLP的另一優點為其在細菌中之高表現產量，此使得在可承受之成本下產生大量物質。此外，使用VLP作為載體使得分別形成具有可變抗原密度之穩固抗原陣列及結合物。詳言之，使用RNA噬菌體之VLP及由此尤其使用RNA噬菌體Qβ鞘蛋白之VLP可達到極高抗原決定基密度。

在本發明之一些實施例中，本發明之免疫原性組合物可包含免疫原性結合物之混合物，亦即與本發明之一個或若干個抗原性IgE肽偶合的免疫原性載體。因此，此等免疫原性組合物可由胺基酸序列不同之免疫原性載體構成。舉例而言，可製備包含「野生型」VLP及經修飾之VLP蛋白的疫苗組合物，其中一或多個胺基酸殘基已改變(例如缺失、插入或取代)。或者，可使用相同但與不同胺基酸序列之抗原性IgE肽偶合的免疫原性載體。

因此，本發明亦關於製造本發明之免疫原的方法，其包含i)提供本發明之抗原性IgE肽、ii)提供本發明之免疫原性載體(較佳為VLP)及iii)組合該抗原性IgE肽與該免疫原性載體。在一實施例中，該組合步驟經由化學交聯，較佳經由異雙官能交聯劑進行。

在另一實施例中，本發明之抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成：SEQ ID No: 220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309及310。較佳地，該抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成：SEQ ID No: 220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、245、246、247、248、249、250、251、252、253、256、257、258、259、260、261、262、263、266、267、268、269、270、271、272、275、276、277、278、279、280、283、284、285、286、287、290、291、292、293、296、297、298、301、302及305。更佳地，該抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成：SEQ ID No: 220、221、222、223、224、225、226、227、233、234、235、236、237、238、239、245、246、247、248、249、250、256、257、258、259、260、266、267、268、269、275、276、277、283、284及290。甚至更佳地，該抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成:SEQ ID No: 220、221、222、223、224、233、234、235、236、245、246、247、256、257及266。甚至更佳地，該抗原性IgE肽由選自由SEQ ID No: 220、221、222、233、234及245組成之群的胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成。最佳地，該抗原性IgE肽由SEQ ID No: 220或233之胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成。

在另一實施例中，本發明之抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成:SEQ ID No: 311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429及430。較佳地，該抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成：SEQ ID No: 311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、365、366、367、368、369、370、371、372、373、376、377、378、379、380、381、382、383、386、387、388、389、390、391、392、395、396、397、398、399、400、403、404、405、406、407、410、411、412、413、416、417、418、421、422及425。更佳地，該抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成：SEQ ID No: 311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、326、327、328、329、330、331、332、333、334、340、341、342、343、344、345、346、347、353、354、355、356、357、358、359、365、366、367、368、369、370、376、377、378、379、380、386、387、388、389、395、396、397、403、404及410。甚至更佳地，該抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成：SEQ ID No: 311、312、313、314、315、316、317、326、327、328、329、330、331、340、341、342、343、344、353、354、355、356、365、366、367、376、377及386。甚至更佳地，該抗原性IgE肽由選自由SEQ ID No: 311、312、313、314、326、327、328、340、341及353組成之群的胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成。甚至更佳地，該抗原性IgE肽由選自由SEQ ID No: 311、312及326組成之群的胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成。最佳地，該抗原性IgE肽由SEQ ID No: 311或312之胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成。

在本發明之一實施例中，本文所揭示之抗原性IgE肽連接於免疫原性載體分子。在一實施例中，該免疫原性載體係選自由本文所述之任一免疫原性載體組成之群。在另一實施例中，該免疫原性載體係選自由以下組成之群：血清白蛋白，諸如牛血清白蛋白(BSA)；球蛋白；甲狀腺球蛋白；血紅素；血氰蛋白(尤其匙孔螺血氰蛋白[KLH])及病毒樣粒子(VLP)。在一較佳實施例中，該免疫原性載體為匙孔螺血氰蛋白或病毒樣粒子(VLP)。在一甚至較佳實施例中，該免疫原性載體為選自由HBcAg VLP、HBsAg VLP、Qβ VLP或本文所揭示之任何變異體組成之群的VLP。在一甚至較佳實施例中，該免疫原性載體為選自由Qβ CP、Qβ A1、Qβ-240、Qβ-243、Qβ-250、Qβ-251及Qβ-259(WO 03/024481中揭示)組成之群的Qβ VLP。

在一實施例中，該免疫原性載體直接或經由連接子共價連接於本文所揭示之抗原性IgE肽。在一實施例中，藉由表現如本文所述之融合蛋白，使該免疫原性載體連接於本文所揭示之抗原性IgE肽。在另一實施例中，經由如本文所述之化學交聯及較佳藉由使用異雙官能交聯劑，使本文所揭示之抗原性IgE肽連接於免疫原性載體(較佳為VLP)。若干種異雙官能交聯劑為此項技術所已知。在一些實施例中，該異雙官能交聯劑含有可與第一連接位點(亦即與VLP或VLP次單元之離胺酸殘基的側鏈胺基)反應之官能基，及可與較佳第二連接位點(亦即與抗原性肽融合且可用於還原反應之半胱胺酸殘基)反應之另一官能基。

因此，在本發明之一實施例中，本文所揭示之抗原性IgE肽在其N端或在其C端或在N端與C端進一步包含能夠在化學交聯反應中與免疫原性載體之連接位點反應的連接子。在一實施例中，本文所揭示之抗原性IgE肽在其C端進一步包含具有式(G)_n C之連接子，其中n為選自由0、1、2、3、4、5、6、7、8、9及10組成之群，較佳選自由0、1、2、3、4及5組成之群，更佳選自由0、1、2及3組成之群的整數，n最佳為0或1(當n等於0時，該式表示半胱胺酸)。較佳地，本文所揭示之抗原性IgE肽在其C端進一步包含具有式GGGC、GGC、GC或C之連接子。

在本發明之另一具體實例中，本文所揭示之抗原性IgE肽在其N端進一步包含具有式C(G)_n 之連接子，其中n為選自由0、1、2、3、4、5、6、7、8、9及10組成之群，較佳選自由0、1、2、3、4及5組成之群，更佳選自由0、1、2及3組成之群的整數，n最佳為0或1(當n等於0時，該式表示半胱胺酸)。較佳地，本文所揭示之抗原性IgE肽在其N端進一步包含具有式CGGG、CGG、CG或C之連接子。

在另一實施例中，本文所揭示之抗原性IgE肽在其N端進一步包含具有式GGGC、GGC、GC或C之連接子。

在另一實施例中，本文所揭示之抗原性IgE肽在其C端進一步包含具有式(G)_n C之連接子，其中n為選自由0、1、2、3、4、5、6、7、8、9及10組成之群，較佳選自由0、1、2、3、4及5組成之群、更佳選自由0、1、2及3組成之群的整數，n最佳為0或1(當n等於0時，該式表示半胱胺酸)，且在其N端進一步包含具有式C(G)_n 之連接子，其中n為選自由0、1、2、3、4、5、6、7、8、9及10組成之群，較佳選自由0、1、2、3、4及5組成之群，更佳選自由0、1、2及3組成之群的整數，n最佳為0或1(當n等於0時，該式表示半胱胺酸)。較佳地，本文所揭示之抗原性IgE肽在其N端進一步包含具有式GGGC、GGC、GC或C之連接子且在其C端進一步包含具有式GGGC、GGC、GC或C之連接子。更佳地，本文所揭示之抗原性IgE肽在其N端進一步包含半胱胺酸且在其C端進一步包含半胱胺酸。

進一步包含該連接子之該等抗原性IgE肽的代表係以SEQ ID NO: 434、436、437、438及439揭示。在本發明之一實施例中，包含連接子之抗原性IgE肽為表9中所揭示之任一肽。

在IgE抗原性肽之N端及/或C端添加之半胱胺酸殘基可用於通常且較佳使用異雙官能交聯劑進行之還原反應(化學交聯)。若干種異雙官能交聯劑為此項技術所已知。在一些實施例中，進一步包含本文所述之連接子的IgE抗原性肽與VLP之離胺酸殘基的側鏈胺基交聯。

因此，在一實施例中，進一步包含上述連接子之IgE抗原性肽與免疫原性載體(尤其與VLP，較佳為HBcAg VLP、HBsAg VLP或Qβ VLP)交聯。程序之第一步驟(通常稱為衍生)為VLP與交聯劑之反應。此反應之產物為活化VLP，亦稱為活化載體。在第二步驟中，使用常用方法(諸如凝膠過濾或透析)移除未反應之交聯劑。在第三步驟中，使抗原性肽與活化VLP反應，且此步驟通常稱為偶合步驟。可視情況在第四步驟中移除未反應之抗原性肽，例如藉由透析達成。若干種異雙官能交聯劑為此項技術所已知。此等交聯劑包括較佳交聯劑SMPH(丁二醯亞胺基-6-[β-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺基]己酸酯)、磺酸基-MBS、磺酸基-EMCS、磺酸基-GMBS、磺酸基-SIAB、磺酸基-SMPB、磺酸基-SMCC、SVSB、SIA及例如可得自Pierce Chemical Company(Rockford,IL,USA)且具有一個針對胺基具反應性之官能基及一個針對半胱胺酸殘基具反應性之官能基的其他交聯劑。上述交聯劑均形成硫醚鍵。

在一實施例中，本發明係關於包含抗原性IgE之免疫原，該抗原性IgE由SEQ ID No: 1、2、3、18、19或34、最佳SEQ ID No: 1或18之胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成，其中該抗原性IgE在其C端進一步包含半胱胺酸，該抗原性IgE經由硫醚鍵以化學方式與病毒樣粒子交聯。在一較佳實施例中，該VLP係選自由HBcAg、HBsAg及Qβ組成之群。該VLP較佳為Qβ，甚至更佳為SEQ ID NO:4 35之Qβ。

在一實施例中，本發明係關於包含抗原性IgE之免疫原，該抗原性IgE由SEQ ID No: 1、2、3、18、19或34、最佳SEQ ID No: 1或18之胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成，其中該抗原性IgE在其N端進一步包含半胱胺酸，該抗原性IgE經由硫醚鍵以化學方式與病毒樣粒子交聯。在一較佳實施例中，該VLP係選自由HBcAg、HBsAg及Qβ組成之群。該VLP較佳為Qβ，甚至更佳為SEQ ID NO: 435之Qβ。

在一實施例中，本發明係關於包含抗原性IgE之免疫原，該抗原性IgE由SEQ ID No: 154、155、156、165、166及175、最佳SEQ ID No: 154或165之胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成，其中該抗原性IgE在其C端進一步包含半胱胺酸，該抗原性IgE經由硫醚鍵以化學方式與病毒樣粒子交聯。在一較佳實施例中，該VLP係選自由HBcAg、HBsAg及Qβ組成之群。該VLP較佳為Qβ，甚至更佳為SEQ ID NO: 435之Qβ。

在一實施例中，本發明係關於包含抗原性IgE之免疫原，該抗原性IgE由SEQ ID No: 154、155、156、165、166及175、最佳SEQ ID No: 154或165之胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成，其中該抗原性IgE在其N端進一步包含半胱胺酸，該抗原性IgE經由硫醚鍵以化學方式與病毒樣粒子交聯。在一較佳實施例中，該VLP係選自由HBcAg、HBsAg及Qβ組成之群。該VLP較佳為Qβ，甚至更佳為SEQ ID NO: 435之Qβ。

在一實施例中，本發明係關於包含抗原性IgE之免疫原，該抗原性IgE由SEQ ID No: 220、221、222、233、234及245、最佳SEQ ID No: 220或233之胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成，其中該抗原性IgE在其C端進一步包含半胱胺酸，該抗原性IgE經由硫醚鍵以化學方式與病毒樣粒子交聯。在一較佳實施例中，該VLP係選自由HBcAg、HBsAg及Qβ組成之群。該VLP較佳為Qβ，甚至更佳為SEQ ID NO: 435之Qβ。

在一實施例中，本發明係關於包含抗原性IgE之免疫原，該抗原性IgE由SEQ ID No: 220、221、222、233、234及245、最佳SEQ ID No: 220或233之胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成，其中該抗原性IgE在其N端進一步包含半胱胺酸，該抗原性IgE經由硫醚鍵以化學方式與病毒樣粒子交聯。在一較佳實施例中，該VLP係選自由HBcAg、HBsAg及Qβ組成之群。該VLP較佳為Qβ，甚至更佳為SEQ ID NO: 435之Qβ。

在一實施例中，本發明係關於包含抗原性IgE之免疫原，該抗原性IgE由SEQ ID No: 311、312及326、最佳SEQ ID No: 311或312之胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成，其中該抗原性IgE在其C端進一步包含半胱胺酸，該抗原性IgE經由硫醚鍵以化學方式與病毒樣粒子交聯。在一較佳實施例中，該VLP係選自由HBcAg、HBsAg及Qβ組成之群。該VLP較佳為Qβ，甚至更佳為SEQ ID NO: 435之Qβ。

在一實施例中，本發明係關於包含抗原性IgE之免疫原，該抗原性IgE由SEQ ID No: 311、312及326、最佳SEQ ID No:311或312之胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成，其中該抗原性IgE在其N端進一步包含半胱胺酸，該抗原性IgE經由硫醚鍵以化學方式與病毒樣粒子交聯。在一較佳實施例中，該VLP係選自由HBcAg、HBsAg及Qβ組成之群。該VLP較佳為Qβ，甚至更佳為SEQ ID NO: 435之Qβ。

在一實施例中，本發明係關於包含抗原性IgE之免疫原，該抗原性IgE由SEQ ID No: 311、312及326、最佳SEQ ID No:311或312之胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成。較佳地，該抗原性IgE在其C端進一步包含GC連接子，較佳為具有式GGC之連接子(較佳地，該在其C端包含GC連接子之抗原性IgE肽由SEQ ID No:457之胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成)，使用SMPH(丁二醯亞胺基-6-[β-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺基]己酸酯)作為交聯劑，該抗原性IgE經由硫醚鍵以化學方式與病毒樣粒子交聯，該鍵位於VLP之離胺酸殘基與該C端連接子之半胱胺酸殘基之間。在一較佳實施例中，該VLP係選自由HBcAg、HBsAg及Qβ組成之群。該VLP較佳為Qβ，甚至更佳為SEQ ID NO: 435之Qβ。

在一實施例中，本發明係關於包含抗原性IgE之免疫原，該抗原性IgE由SEQ ID No: 220、221、233、234、244及246、最佳SEQ ID No: 220或233之胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成，該抗原性IgE經由硫醚鍵以化學方式與病毒樣粒子交聯，該鍵位於VLP之離胺酸殘基與該抗原性IgE肽之半胱胺酸殘基之間。在該實施例中，經由如本文所述之化學交聯及較佳藉由使用異雙官能交聯劑，使本文所揭示之抗原性IgE肽連接於免疫原性載體(較佳為VLP)。若干種異雙官能交聯劑為此項技術所已知。在一些實施例中，該異雙官能交聯劑含有可與第一連接位點(亦即VLP或VLP次單元之離胺酸殘基的側鏈胺基)反應之官能基，及可與較佳第二連接位點(亦即可用於還原反應之抗原性肽的半胱胺酸殘基)反應之另一官能基。在一較佳實施例中，該VLP係選自由HBcAg、HBsAg及Qβ組成之群。該VLP較佳為Qβ，甚至更佳為SEQ ID NO: 435之Qβ。

在一實施例中，本發明係關於包含抗原性IgE之免疫原，該抗原性IgE由SEQ ID No: 220之胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成，使用SMPH(丁二醯亞胺基-6-[β-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺基]己酸酯)作為交聯劑，該抗原性IgE經由硫醚鍵以化學方式與病毒樣粒子交聯，該鍵位於VLP之離胺酸殘基與該抗原性IgE肽之半胱胺酸殘基之間。在一較佳實施例中，該VLP係選自由HBcAg、HBsAg及Qβ組成之群。該VLP較佳為Qβ，甚至更佳為SEQ ID NO: 435之Qβ。

在一特定實施例中，當本文所揭示之抗原性IgE肽的序列包含半胱胺酸時，該抗原性IgE肽直接經由該半胱胺酸共價連接於免疫原性載體。在該實施例中，經由如本文所述之化學交聯及較佳藉由使用異雙官能交聯劑，使本文所揭示之抗原性IgE肽連接於免疫原性載體(較佳為VLP)。若干種異雙官能交聯劑為此項技術所已知。在一些實施例中，該異雙官能交聯劑含有可與第一連接位點(亦即VLP或VLP次單元之離胺酸殘基的側鏈胺基)反應之官能基，及可與較佳第二連接位點(亦即與抗原性肽融合且可用於還原反應之半胱胺酸殘基)反應之另一官能基。因此，在一些實施例中，當本文所揭示之抗原性IgE肽的序列包含半胱胺酸時，該抗原性IgE肽經由硫醚鍵以化學方式與免疫原性載體交聯，該鍵位於免疫原性載體之離胺酸殘基與該抗原性IgE之半胱胺酸殘基之間。在一較佳實施例中，該免疫原性載體為VLP，較佳為Qβ病毒樣粒子(甚至更佳為SEQ ID NO: 435之Qβ)。

在另一態樣中，本發明係關於一種包含至少兩種本文所述之免疫原的組合物。在一實施例中，本發明係關於一種包含至少兩種免疫原之組合物，其中此等免疫原各包含連接於免疫原性載體之本文所揭示之抗原性IgE肽。在一實施例中，該組合物包含兩種、三種、四種或五種本發明之免疫原，其中此等免疫原各包含連接於免疫原性載體之本文所揭示之抗原性IgE肽。

較佳地，各抗原性IgE肽個別地連接於免疫原性載體之不同分子(各免疫原性載體分子僅結合有一種類型之抗原性IgE肽)。在該實施例中，認為抗原性IgE肽個別地與該免疫原性載體結合。

在一實施例中，本發明係關於一種包含兩種免疫原或由其組成之組合物，此等免疫原各包含連接於免疫原性載體之本文所揭示之抗原性IgE肽。各抗原性IgE肽較佳個別地與該免疫原性載體結合。

在一實施例中，第一免疫原之抗原性IgE肽由選自由以下組成之群：SEQ ID No: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152及153；較佳選自由以下組成之群：SEQ ID No: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、88、89、90、91、92、93、94、95、96、99、100、101、102、103、104、105、106、109、110、111、112、113、114、115、118、119、120、121、122、123、126、127、128、129、130、133、134、135、136、139、140、141、144、145及148；更佳選自由以下組成之群：SEQ ID No: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、49、50、51、52、53、54、55、56、57、63、64、65、66、67、68、69、70、76、77、78、79、80、81、82、88、89、90、91、92、93、99、100、101、102、103、109、110、111、112、118、119、120、126、127、133及139；甚至更佳選自由以下組成之群：SEQ ID No: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、18、19、20、21、22、23、24、25、34、35、36、37、38、39、40、49、50、51、52、53、54、63、64、65、66、67、76、77、78、79、88、89、90、99、100、101及109；甚至更佳選自由以下組成之群：SEQ ID No: 1、2、3、4、5、6、18、19、20、21、22、34、35、36、37、49、50、51、63、64及76；甚至更佳選自由以下組成之群：SEQ ID No: 1、2、3、18、19及34的胺基酸序列組成；該抗原性IgE肽最佳由SEQ ID NO: 1或18之胺基酸序列組成。

在一實施例中，第二免疫原之抗原性IgE肽由選自由以下組成之群：SEQ ID No: 154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218及219；較佳選自由以下組成之群：SEQ ID No: 154、155、156、157、158、159、160、161、162、165、166、167、168、169、170、171、172、175、176、177、178、179、180、181、184、185、186、187、188、189、192、193、194、195、196、199、200、201、202、205、206、207、210、211、214及217；更佳選自由以下組成之群：SEQ ID No: 154、155、156、157、158、159、165、166、167、168、169、175、176、177、178、184、185、186、192、193、199及200；甚至更佳選自由以下組成之群：SEQ ID No: 154、155、156、165、166及175的胺基酸序列組成；該抗原性IgE肽最佳由SEQ ID No: 154或165之胺基酸序列組成。

在另一實施例中，第二免疫原之抗原性IgE肽由選自由以下組成之群：SEQ ID No: 220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309及310；較佳選自由以下組成之群：SEQ ID No: 220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、245、246、247、248、249、250、251、252、253、256、257、258、259、260、261、262、263、266、267、268、269、270、271、272、275、276、277、278、279、280、283、284、285、286、287、290、291、292、293、296、297、298、301、302及305；更佳選自由以下組成之群：SEQ ID No: 220、221、222、223、224、225、226、227、233、234、235、236、237、238、239、245、246、247、248、249、250、256、257、258、259、260、266、267、268、269、275、276、277、283、284及290；甚至更佳選自由以下組成之群：SEQ ID No: 220、221、222、223、224、233、234、235、236、245、246、247、256、257及266；甚至更佳選自由以下組成之群：SEQ ID No: 220、221、222、233、234及245的胺基酸序列組成；該抗原性IgE肽最佳由SEQ ID No: 220或233之胺基酸序列組成。

在另一實施例中，第二免疫原之抗原性IgE肽由選自由以下組成之群：SEQ ID No: 311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384，385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429及430；較佳選自由以下組成之群：SEQ ID No: 311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、365、366、367、368、369、370、371、372、373、376、377、378、379、380、381、382、383、386、387、388、389、390、391、392、395、396、397、398、399、400、403、404、405、406、407、410、411、412、413、416、417、418、421、422及425；更佳選自由以下組成之群：SEQ ID No: 311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、326、327、328、329、330、331、332、333、334、340、341、342、343、344、345、346、347、353、354、355、356、357、358、359、365、366、367、368、369、370、376、377、378、379、380、386、387、388、389、395、396、397、403、404及410；甚至更佳選自由以下組成之群:SEQ ID No: 311、312、313、314、315、316、317、326、327、328、329、330、331、340、341、342、343、344、353、354、355、356、365、366、367、376、377及386；甚至更佳選自由以下組成之群：SEQ ID No: 311、312、313、314、326、327、328、340、341及353；甚至更佳選自由以下組成之群：SEQ ID No: 311、312及326的胺基酸序列組成；該抗原性IgE肽最佳由SEQ ID No: 311或312之胺基酸序列組成。

在一實施例中，本發明係關於一種包含兩種免疫原或由其組成之組合物，此等免疫原各包含連接於免疫原性載體之抗原性IgE肽，其中第一免疫原之抗原性IgE肽由SEQ ID No: 1之胺基酸序列組成且第二免疫原之抗原性IgE肽由SEQ ID No: 165組成。在另一實施例中，第一免疫原之抗原性IgE肽由SEQ ID No: 1之胺基酸序列組成且第二免疫原之抗原性IgE肽由SEQ ID No: 220之胺基酸序列組成。在另一實施例中，第一免疫原之抗原性IgE肽由SEQ ID No: 1之胺基酸序列組成且第二免疫原之抗原性IgE肽由SEQ ID No: 312之胺基酸序列組成。各抗原性IgE肽較佳個別地與該免疫原性載體結合。

在一實施例中，本發明係關於一種包含兩種免疫原或由其組成之組合物，此等免疫原各包含連接於免疫原性載體之本文所揭示之抗原性IgE肽。各抗原性IgE肽較佳個別地與該免疫原性載體結合。在一實施例中，第一免疫原之抗原性IgE肽由選自由以下組成之群：SEQ ID No: 154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218及219；較佳選自由以下組成之群：SEQ ID No: 154、155、156、157、158、159、160、161、162、165、166、167、168、169、170、171、172、175、176、177、178、179、180、181、184、185、186、187、188、189、192、193、194、195、196、199、200、201、202、205、206、207、210、211、214及217；更佳選自由以下組成之群：SEQ ID No: 154、155、156、157、158、159、165、166、167、168、169、175、176、177、178、184、185、186、192、193、199及200；甚至更佳選自由以下組成之群：SEQ ID No: 154、155、156、165、166及175的胺基酸序列組成；該抗原性IgE肽最佳由SEQ ID No: 154或165之胺基酸序列組成。

在一實施例中，第二免疫原之抗原性IgE肽由選自由以下組成之群：SEQ ID No: 220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309及310；較佳選自由以下組成之群：SEQ ID No: 220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、245、246、247、248、249、250、251、252、253、256、257、258、259、260、261、262、263、266、267、268、269、270、271、272、275、276、277、278、279、280、283、284、285、286、287、290、291、292、293、296、297、298、301、302及305；更佳選自由以下組成之群：SEQ ID No: 220、221、222、223、224、225、226、227、233、234、235、236、237、238、239、245、246、247、248、249、250、256、257、258、259、260、266、267、268、269、275、276、277、283、284及290；甚至更佳選自由以下組成之群：SEQ ID No: 220、221、222、223、224、233、234、235、236、245、246、247、256、257及266；甚至更佳選自由以下組成之群：SEQ ID No: 220、221、222、233、234及245的胺基酸序列組成；該抗原性IgE肽最佳由SEQ ID No: 220或233之胺基酸序列組成。

在另一實施例中，第二免疫原之抗原性IgE肽由選自由以下組成之群：SEQ ID No: 311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375，376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429及430；較佳選自由以下組成之群：SEQ ID No: 311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、365、366、367、368、369、370、371、372、373、376、377、378、379、380、381、382、383、386、387、388、389、390、391、392、395、396、397、398、399、400、403、404、405、406、407、410、411、412、413、416、417、418、421、422及425；更佳選自由以下組成之群：SEQ ID No: 311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、326、327、328、329、330、331、332、333、334、340、341、342、343、344、345、346、347、353、354、355、356、357、358、359、365、366、367、368、369、370、376、377、378、379、380、386、387、388、389、395、396、397、403、404及410；甚至更佳選自由以下組成之群：SEQ ID No: 311、312、313、314、315、316、317、326、327、328、329、330、331、340、341、342、343、344、353、354、355、356、365、366、367、376、377及386；甚至更佳選自由以下組成之群：SEQ ID No: 311、312、313、314、326、327、328、340、341及353；甚至更佳選自由以下組成之群：SEQ ID No: 311、312及326的胺基酸序列組成；該抗原性IgE肽最佳由SEQ ID No: 311或312之胺基酸序列組成。

在一實施例中，本發明係關於一種包含兩種免疫原或由其組成之組合物，此等免疫原各包含連接於免疫原性載體之抗原性IgE肽，其中第一免疫原之抗原性IgE肽由SEQ ID No: 165之胺基酸序列組成且第二免疫原之抗原性IgE肽由SEQ ID No: 220組成。在另一實施例中，第一免疫原之抗原性IgE肽由SEQ ID No: 165之胺基酸序列組成且第二免疫原之抗原性IgE肽由SEQ ID No: 312之胺基酸序列組成。各抗原性IgE肽較佳個別地與該免疫原性載體結合。

在一實施例中，本發明係關於一種包含兩種免疫原或由其組成之組合物，此等免疫原各包含連接於免疫原性載體之本文所揭示之抗原性IgE肽。各抗原性IgE肽較佳個別地與該免疫原性載體結合。在一實施例中，第一免疫原之抗原性IgE肽由選自由以下組成之群:SEQ ID No: 220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309及310；較佳選自由以下組成之群：SEQ ID No: 220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、245、246、247、248、249、250、251、252、253、256、257、258、259、260、261、262、263、266、267、268、269、270、271、272、275、276、277、278、279、280、283、284、285、286、287、290、291、292、293、296、297、298、301、302及305；更佳選自由以下組成之群：SEQ ID No: 220、221、222、223、224、225、226、227、233、234、235、236、237、238、239、245、246、247、248、249、250、256、257、258、259、260、266、267、268、269、275、276、277、283、284及290；甚至更佳選自由以下組成之群:SEQ IDNo:220、221、222、223、224、233、234、235、236、245、246、247、256、257及266；甚至更佳選自由以下組成之群：SEQ ID No: 220、221、222、233、234及245的胺基酸序列組成；該抗原性IgE肽最佳由SEQ ID No: 220或233之胺基酸序列組成。

在一實施例中，第二免疫原之抗原性IgE肽由選自由以下組成之群:SEQ ID No: 311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429及430；較佳選自由以下組成之群：SEQ ID No: 311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、365、366、367、368、369、370、371、372、373、376、377、378、379、380、381、382、383、386、387、388、389、390、391、392、395、396、397、398、399、400、403、404、405、406、407、410、411、412、413、416、417、418、421、422及425；更佳選自由以下組成之群：SEQ ID No: 311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、326、327、328、329、330、331、332、333、334、340、341、342、343、344、345、346、347、353、354、355、356、357、358、359、365、366、367、368、369、370、376、377、378、379、380、386、387、388、389、395、396、397、403、404及410；甚至更佳選自由以下組成之群：SEQ ID No: 311、312、313、314、315、316、317、326、327、328、329、330、331、340、341、342、343、344、353、354、355、356、365、366、367、376、377及386；甚至更佳選自由以下組成之群：SEQ ID No: 311、312、313、314、326、327、328、340、341及353；甚至更佳選自由以下組成之群：SEQ ID No: 311、312及326的胺基酸序列組成；該抗原性IgE肽最佳由SEQ ID No: 311或312之胺基酸序列組成。

在一實施例中，本發明係關於一種包含兩種免疫原或由其組成之組合物，此等免疫原各包含連接於免疫原性載體之抗原性IgE肽，其中第一免疫原之抗原性IgE肽由SEQ ID No: 220之胺基酸序列組成且第二免疫原之抗原性IgE肽由SEQ ID No: 312組成。各抗原性IgE肽較佳個別地與該免疫原性載體結合。

根據本發明之一實施例，以上本文所揭示之組合物的免疫原直接或經由本文所揭示之連接子連接於免疫原性載體(較佳以化學方式交聯)。在一實施例中，該免疫原性載體為匙孔螺血氰蛋白[KLH]或病毒樣粒子(VLP)。在一較佳實施例中，該免疫原性載體為選自由HBcAg VLP、HBsAg VLP、Qβ VLP或本文所揭示之任何變異體組成之群的VLP。在一甚至較佳實施例中，該免疫原性載體為選自由Qβ CP、Qβ A1、Qβ-240、Qβ-243、Qβ-250、Qβ-251及Qβ-259組成之群的Qβ VLP。

在一實施例中，本發明係關於一種包含兩種免疫原或由其組成之組合物，此等免疫原各包含連接於免疫原性載體之本文所揭示之抗原性IgE肽。在一實施例中，第一免疫原由包含抗原性IgE之免疫原組成，該抗原性IgE由SEQ ID No: 220、221、233、234、244及246、最佳SEQ ID No: 220或233之胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成，該抗原性IgE經由硫醚鍵以化學方式與Qβ病毒樣粒子(更佳為SEQ ID NO: 435之Qβ)交聯，該鍵位於VLP之離胺酸殘基與該抗原性IgE肽之半胱胺酸殘基之間，且第二免疫原由包含抗原性IgE之免疫原組成，該抗原性IgE由SEQ ID No: 311、312及326、最佳SEQ ID No: 311或312之胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成，其中該抗原性IgE在其C端進一步包含半胱胺酸，該抗原性IgE以化學方式與Qβ病毒樣粒子(更佳為SEQ ID NO: 435之Qβ)交聯。各抗原性IgE肽較佳個別地與該免疫原性載體結合。

在一實施例中，本發明係關於一種包含兩種免疫原或由其組成之組合物，此等免疫原各包含連接於免疫原性載體之本文所揭示之抗原性IgE肽。在一實施例中，第一免疫原由包含抗原性IgE之免疫原組成，該抗原性IgE由SEQ ID No: 220、221、233、234、244及246、最佳SEQ ID No: 220或233之胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成，該抗原性IgE經由硫醚鍵以化學方式與Qβ病毒樣粒子(更佳為SEQ ID NO: 435之Qβ)交聯，該鍵位於VLP之離胺酸殘基與該抗原性IgE肽之半胱胺酸殘基之間，第二免疫原由包含抗原性IgE之免疫原組成，該抗原性IgE由SEQ ID No: 1、2、3、18、19或34、最佳SEQ ID No: 1或18之胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成，其中該抗原性IgE在其C端進一步包含半胱胺酸，該抗原性IgE以化學方式與Qβ病毒樣粒子(更佳為SEQ ID NO: 435之Qβ)交聯。各抗原性IgE肽較佳個別地與該免疫原性載體結合。

在一實施例中，本發明係關於一種包含三種免疫原或由其組成之組合物，此等免疫原各包含連接於免疫原性載體之本文所揭示之抗原性IgE肽。在一實施例中，第一免疫原由包含抗原性IgE之免疫原組成，該抗原性IgE由SEQ ID No: 220、221、233、234、244及246、最佳SEQ ID No: 220或233之胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成，該抗原性IgE經由硫醚鍵以化學方式與Qβ病毒樣粒子(更佳為SEQ ID NO: 435之Qβ)交聯，該鍵位於VLP之離胺酸殘基與該抗原性IgE肽之半胱胺酸殘基之間，第二免疫原由包含抗原性IgE之免疫原組成，該抗原性IgE由SEQ ID No: 311、312及326、最佳SEQ ID No: 311或312之胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成，其中該抗原性IgE在其C端進一步包含半胱胺酸，該抗原性IgE以化學方式與Qβ病毒樣粒子(更佳為SEQ ID NO: 435之Qβ)交聯，且第三免疫原由包含抗原性IgE之免疫原組成，該抗原性IgE由SEQ ID No: 1、2、3、18、19或34、最佳SEQ ID No: 1或18之胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成，其中該抗原性IgE在其C端進一步包含半胱胺酸，該抗原性IgE以化學方式與Qβ病毒樣粒子(更佳為SEQ ID NO: 435之Qβ)交聯。各抗原性IgE肽較佳個別地與該免疫原性載體結合。

在一實施例中，本發明係關於一種包含兩種免疫原或由其組成之組合物，此等免疫原各包含個別地與免疫原性載體結合之本文所揭示之抗原性IgE肽。在一實施例中，第一免疫原由包含抗原性IgE肽之免疫原組成，該抗原性IgE肽由SEQ ID No: 220、221、233、234、244及246、最佳SEQ ID No: 220或233之胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成。使用SMPH(丁二醯亞胺基-6-[β-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺基]己酸酯)作為交聯劑，該第一抗原性IgE肽較佳經由硫醚鍵以化學方式與Qβ病毒樣粒子(更佳為SEQ ID NO: 435之Qβ)交聯，該鍵位於VLP之離胺酸殘基與該抗原性IgE肽之半胱胺酸殘基之間。較佳地，第二免疫原由包含抗原性IgE肽之免疫原組成，該抗原性IgE肽由SEQ ID No: 311、312或326、最佳SEQ ID No: 311或312之胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成。較佳地，該第二抗原性IgE肽在其C端進一步包含GC連接子，較佳為具有式GGC之連接子(較佳地，該在其C端包含GC連接子之第二抗原性IgE肽由SEQ ID No: 457之胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成)，使用SMPH(丁二醯亞胺基-6-[β-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺基]己酸酯)作為交聯劑，該肽經由硫醚鍵以化學方式與病毒樣粒子交聯，該鍵位於VLP之離胺酸殘基與該C端連接子之半胱胺酸殘基之間。在一較佳實施例中，該VLP係選自由HBcAg、HBsAg及Qβ組成之群。該VLP較佳為Qβ，甚至更佳為SEQ ID NO: 435之Qβ。

在一實施例中，本發明係關於一種包含兩種、三種、四種或四種以上免疫原或由其組成之組合物，其中此等免疫原各包含連接於免疫原性載體之抗原性IgE肽且其中該抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成：SEQ ID No: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429及430。在一實施例中，該抗原性IgE肽連接於同一免疫原性載體。在另一實施例中，該抗原性IgE肽連接於不同免疫原性載體且接著混合。

製造本發明之免疫原的方法

本發明進一步係關於一種製造本文所揭示之免疫原的方法。在一實施例中，該免疫原包含至少一種連接於本文所揭示之免疫原性載體的本文所揭示之抗原性IgE肽。因此，本發明進一步係關於一種製造免疫原之方法，其包含使至少一種本文所揭示之抗原性IgE肽連接於本文所揭示之免疫原性載體的步驟。在一實施例中，該連接係藉由直接或經由如本文所揭示之連接子(尤其GC連接子(例如半胱胺酸))之化學交聯來進行。在一實施例中，本發明係關於一種製造免疫原之方法，其包含使至少一種本文所揭示之抗原性IgE肽(視情況進一步包含如本文所揭示之連接子)連接於本文所揭示之VLP的步驟，該連接係藉由直接或經由如本文所揭示之連接子(尤其GC連接子(例如半胱胺酸))之化學交聯來進行。在一特定實施例中，當本文所揭示之抗原性IgE肽的序列包含半胱胺酸時，該抗原性IgE肽直接經由該半胱胺酸共價連接於VLP。在該實施例中，該方法包括如本文所述且較佳使用異雙官能交聯劑(例如N-γ-順丁烯二醯亞胺基-丁醯氧基-丁二醯亞胺酯(GMBS)或丁二醯亞胺基-6-[β-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺基]己酸酯(SMPH))之化學交聯步驟。因此，在一些實施例中，該化學交聯步驟使得VLP經由硫醚鍵交聯，該鍵位於VLP之離胺酸殘基與該抗原性IgE之半胱胺酸殘基之間。在一較佳實施例中，該VLP較佳為Qβ病毒樣粒子(甚至更佳為SEQ ID NO: 435之Qβ)。本發明之另一實施例係關於一種可藉由本文所揭示之方法獲得的免疫原。

包含本發明之抗原性IgE肽的組合物

本發明進一步係關於組合物，尤其亦稱為「標的免疫原性組合物」之免疫原性組合物，其包含較佳連接於免疫原性載體(更佳為VLP、甚至更佳為HBsAg、HBcAg或QβVLP)之本發明之抗原性IgE肽，及視情況存在之至少一種佐劑。該等免疫原性組合物(尤其當調配為醫藥組合物時)被認為適用於預防、治療或減輕IgE相關病症。

在一些實施例中，本發明之標的免疫原性組合物包含抗原性IgE肽，其包含選自SEQ ID No: 1至430及其功能活性變異體、較佳選自由SEQ ID No: 1至430組成之群、更佳選自由SEQ ID No: 1至153及220至430組成之群、甚至更佳選自由SEQ ID No: 220至430組成之群的胺基酸序列。在一些實施例中，該抗原性IgE肽連接於免疫原性載體，較佳為VLP，更佳為HBsAg、HBcAg或QβVLP。

如下文更詳細地描述，包含本發明之抗原性IgE肽的標的免疫原性組合物可以多種方式調配。

在一些實施例中，標的免疫原性組合物包含單種抗原性IgE肽，例如該免疫原性組合物包含一群抗原性IgE肽，其實質上全部均具有相同胺基酸序列。在其他實施例中，標的免疫原性組合物包含兩種或兩種以上不同抗原性IgE肽，例如該免疫原性組合物包含一群抗原性IgE肽，該群之成員的胺基酸序列可不同。標的免疫原性組合物可包含2至約20種不同抗原性IgE肽，例如標的免疫原性組合物可包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11-15或15-20種不同抗原性IgE肽，該等肽各自具有之胺基酸不同於其他抗原性IgE肽之胺基酸序列。

舉例而言，在一些實施例中，標的免疫原性組合物包含第一抗原性IgE肽，該第一抗原性IgE肽較佳連接於免疫原性載體，更佳連接於VLP，甚至更佳連接於HBsAg、HBcAg或Qβ VLP，且包含選自由SEQ ID No: 1至430組成之群、更佳選自由SEQ ID No: 1至153及220至430組成之群、甚至更佳選自由SEQ ID No: 220至430組成之群的第一胺基酸序列；及至少一種第二抗原性IgE肽，該第二抗原性IgE肽較佳連接於免疫原性載體，更佳連接於VLP，甚至更佳連接於HBsAg、HBcAg或Qβ VLP，且包含較佳選自由SEQ ID No: 1至430組成之群、更佳選自由SEQ ID No: 1至153及220至430組成之群、甚至更佳選自由SEQ ID No: 220至430組成之群的第二胺基酸序列；其中該第二胺基酸序列與該第一胺基酸序列有至少1、2、3、4、5、6至10個或15個胺基酸不同。在另一實施例中，該第一抗原性IgE肽包含選自由SEQ ID NO: 311至430組成之群的胺基酸序列且該第二抗原性IgE肽包含選自由SEQ ID NO: 1至310組成之群、較佳選自由SEQ ID NO: 220至310或SEQ ID NO: 1至153或SEQ ID NO: 154至219組成之群、更佳選自由SEQ ID NO: 220至310組成之群的胺基酸序列。在另一實施例中，該第一抗原性IgE肽包含選自由SEQ ID NO: 220至310組成之群的胺基酸序列且該第二抗原性IgE肽包含選自由SEQ ID NO: 1至219及311至430組成之群、較佳選自由SEQ ID NO: 311至430或SEQ ID NO: 1至153或SEQ ID NO: 154至219組成之群、更佳選自由SEQ ID NO: 311至430組成之群的胺基酸序列。在另一實施例中，該第一抗原性IgE肽包含選自由SEQ ID NO: 1至153組成之群的胺基酸序列且該第二抗原性IgE肽包含選自由SEQ ID NO: 154至430組成之群、較佳選自由SEQ ID NO: 220至310或SEQ ID NO: 311至430或SEQ ID NO: 154至219組成之群的胺基酸序列。在另一實施例中，該第一抗原性IgE肽包含選自由SEQ ID NO: 154至219組成之群的胺基酸序列且該第二抗原性IgE肽包含選自由SEQ ID NO: 1至153及220至430組成之群、較佳選自由SEQ ID NO: 220至310或SEQ ID NO: 1至153或SEQ ID NO: 311至430組成之群的胺基酸序列。

另舉例而言，標的免疫原性組合物包含第一抗原性IgE肽，該第一抗原性IgE肽較佳連接於免疫原性載體，更佳連接於VLP，甚至更佳連接於HBsAg、HBcAg或Qβ VLP，且包含選自由SEQ ID No: 1至430組成之群的第一胺基酸序列；第二抗原性IgE肽，該第二抗原性IgE肽較佳連接於免疫原性載體，更佳連接於VLP，甚至更佳連接於HBsAg、HBcAg或Qβ VLP，且包含較佳選自由SEQ ID No: 1至430組成之群的第二胺基酸序列，其中該第二胺基酸序列與該第一胺基酸序列有至少1、2、3、4、5、6至10個或15個胺基酸不同；及至少一種第三抗原性IgE多肽，該第三抗原性IgE多肽較佳連接於免疫原性載體，更佳連接於VLP，甚至更佳連接於HBsAg、HBcAg或Qβ VLP，且包含較佳選自由SEQ ID No: 1至430組成之群的第三胺基酸序列，其中該第三胺基酸序列與第一及第二胺基酸序列皆有至少1、2、3、4、5、6至10個或15個胺基酸不同。在另一實施例中，該第一抗原性IgE肽包含選自由SEQ ID NO: 311至430組成之群的胺基酸序列；且該第二及第三抗原性IgE肽包含選自由SEQ ID NO: 1至310組成之群、較佳選自由SEQ ID NO: 220至310或SEQ ID NO: 1至153或SEQ ID NO: 154至219組成之群的胺基酸序列。

在另一實施例中，該第一抗原性IgE肽包含選自由SEQ ID NO: 220至310組成之群的胺基酸序列且該第二及第三抗原性IgE肽包含選自由SEQ ID NO: 1至219及311至430組成之群、較佳選自由SEQ ID NO: 311至430或SEQ ID NO: 1至153或SEQ ID NO: 154至219組成之群的胺基酸序列。

在其他實施例中，標的免疫原性組合物包含如上文所述之多聚化抗原性IgE多肽。如本文中所使用，術語「包含抗原性IgE肽之免疫原性組合物」或「本發明之免疫原性組合物」或「標的免疫原性組合物」係指包含與免疫原性載體偶合或不與免疫原性載體偶合之單種(多聚化或不多聚化)或多種抗原性IgE肽的免疫原性組合物。當使用兩種或兩種以上肽與載體偶合時，該等肽可與同一載體分子偶合或個別地與載體分子偶合且接著組合產生免疫原性組合物。

本發明之另一態樣係關於製造本發明之免疫原的方法，該方法包含使抗原性IgE肽與免疫原性載體偶合。在一實施例中，該偶合為化學偶合。

在一些實施例中，標的免疫原性組合物包含至少一種佐劑。合適之佐劑包括適合用於哺乳動物(較佳為人類)之佐劑。可用於人類之已知合適佐劑的實例包括(但不一定限於)明礬、磷酸鋁、氫氧化鋁、MF59(4.3% w/v角鯊烯、0.5% w/v聚山梨醇酯80(吐溫80(Tween 80))、0.5% w/v脫水山梨糖醇三油酸酯(斯潘85(Span 85))、含有CpG之核酸(其中胞嘧啶未經甲基化)、QS21(皂苷佐劑)、MPL(單磷醯基脂質A)、3DMPL(脫除3-O上之醯基的MPL)、來自Aquilla之萃取物、ISCOMS(例如參見Sjlander等人(1998)J. Leukocyte Biol . 64:713；WO 90/03184、WO 96/11711、WO 00/48630、WO 98/36772、WO 00/41720、WO 06/134423及WO 07/026190)、LT/CT突變體、聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒、Quil A、介白素及其類似物。對於包括(但不限於)動物實驗之獸醫應用，吾人可使用弗氏佐劑(Freund's)、N-乙醯基-胞壁醯基-L-羥丁胺醯基-D-異麩醯胺酸(thr-MDP)、N-乙醯基-降-胞壁醯基-L-丙胺醯基-D-異麩醯胺酸(CGP 11637，稱為nor-MDP)、N-乙醯基胞壁醯基-L-丙胺醯基-D-異麩醯胺醯基-L-丙胺酸-2-(1'-2'-二軟脂醯基-sn-甘油-3-羥基磷醯氧基)-乙胺(CGP 19835A，稱為MTP-PE)及RIBI，其含有存於2%角鯊烯/吐溫80乳液中之三種自細菌萃取的組份，單磷醯基脂質A、海藻糖二黴菌酸酯及細胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。

其他用於增強組合物之有效性的例示性佐劑包括(但不限於)：(1)水包油乳液調配物(存在或不存在其他特定免疫刺激劑，諸如胞壁醯肽(參見下文)或細菌細胞壁組份)，例如(a) MF59^TM (WO 90/14837；Vaccine design 中之第10章：the subunit and adjuvant approach, Powell及Newman編，Plenum Press 1995)，其含有5%角鯊烯、0.5%吐溫80(聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯)及0.5%斯潘85(脫水山梨糖醇三油酸酯)(視情況含有共價連接於二軟脂醯基磷脂醯乙醇胺(MTP-PE)之胞壁醯三肽)且使用微流化劑調配成次微粒子；(b) SAF，其含有10%角鯊烷、0.4%吐溫80、5%泊洛尼克(pluronic)嵌段共聚物L121及thr-MDP且微流體化為次微乳液或經渦旋產生較大粒徑乳液；及(c) RIBI^TM 佐劑系統(RAS)(Ribi Immunochem,Hamilton,MT)，其含有2%角鯊烯、0.2%吐溫80及一或多種細菌細胞壁組份，諸如單磷醯基脂質A(MPL)、海藻糖二黴菌酸酯(TDM)及細胞壁骨架(CWS)，較佳為MPL+CWS(DETOX^TM )；(2)可使用皂苷佐劑，諸如QS21、STIMULON^TM (Cambridge Bioscience,Worcester,MA)、Abisco(Isconova,Sweden)或Iscomatrix(Commonwealth Serum Laboratories,Australia)，或自其產生之粒子，諸如ISCOM(免疫刺激性複合物)，該等ISCOM可無其他去污劑，例如WO 00/07621；(3)完全弗氏佐劑(Complete Freund's Adjuvant，CFA)及不完全弗氏佐劑(Incomplete Freund's Adjuvant，IFA)；(4)細胞激素，諸如介白素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12(WO 99/44636)等)、干擾素(例如γ干擾素)、巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF)、腫瘤壞死因子(TNF)等；(5)單磷醯基脂質A(MPL)或脫除3-O上之醯基的MPL(3dMPL)，例如GB-220221、EP-A-0689454，當與肺炎球菌醣一起使用時，視情況實質上不存在明礬，例如WO 00/56358；(6) 3dMPL與例如QS21及/或水包油乳液之組合，例如EP-A-0835318、EP-A-0735898、EP-A-0761231；(7)包含CpG基元之寡核苷酸[KriegVaccine 2000,19,618-622；KriegCurr opin Mol Ther2001 3:15-24；Roman等人，Nat. Med., 1997,3,849-854；Weiner等人，PNAS USA, 1997,94,10833-10837；Davis等人，J. Immunol ,1998,160,870-876；Chu等人，J. Exp. Med, 1997,186,1623-1631；Lipford等人，Ear. J. Immunol., 1997,27,2340-2344；Moldoveami等人，Vaccine, 1988,16,1216-1224,Krieg等人，Nature, 1995,374,546-549；Klinman等人，PNAS USA, 1996,93,2879-2883；Ballas等人，J. Immunol, 1996,157,1840-1845；Cowdery等人，J. Immunol, 1996,156,4570-4575；Halpern等人，Cell Immunol ,1996,167,72-78；Yamamoto等人，Jpn. J. Cancer Res., 1988,79,866-873；Stacey等人，J. Immunol., 1996,157,2116-2122；Messina等人，J. Immunol, 1991,147,1759-1764；Yi等人，J. Immunol, 1996,157,4918-4925；Yi等人，J. Immunol, 1996,157,5394-5402；Yi等人，J. Immunol, 1998,160,4755-4761；及Yi等人，J. Immunol, 1998,160,5898-5906；國際專利申請案WO 96/02555、WO 98/16247、WO 98/18810、WO 98/40100、WO 98/55495、WO 98/37919及WO 98/52581]，亦即含有至少一種CG二核苷酸，其中胞嘧啶未經甲基化；(8)聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯，例如WO 99/52549；(9)聚氧乙烯脫水山梨糖醇酯界面活性劑與辛苯聚醇之組合(WO 01/21207)，或聚氧乙烯烷基醚或酯界面活性劑與至少一種其他非離子性界面活性劑(諸如辛苯聚醇)之組合(WO 01/21152)；(10)皂苷及免疫刺激性寡核苷酸(例如CpG寡核苷酸)(WO 00/62800)；(11)免疫刺激劑及金屬鹽粒子，例如WO 00/23105；(12)皂苷及水包油乳液，例如WO 99/11241；(13)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IM2(視情況+固醇)，例如WO 98/57659；(14)充當免疫刺激劑以增強組合物功效之其他物質，諸如胞壁醯肽，包括N-乙醯基-胞壁醯基-L-羥丁胺醯基-D-異麩醯胺酸(thr-MDP)、N-25乙醯基-降胞壁醯基-L-丙胺醯基-D-異麩醯胺酸(nor-MDP)、N-乙醯基胞壁醯基-L-丙胺醯基-D-異麩醯胺醯基-L-丙胺酸-2-(1'-2'-二軟脂醯基-sn -甘油-3-羥基磷醯氧基)-乙胺(MTP-PE)；(15)天然或合成之鐸樣受體(toll-like receptor，TLR)的配位體(例如如Kanzler等人2007,Nature Medicine 13，第1552-9頁中所述)，包括TLR3配位體，諸如polyI:C及類似化合物，諸如Hiltonol及Ampligen。

在一實施例中，本發明之免疫原性組合物包含至少一種佐劑。在一特定實施例中，該佐劑為免疫刺激性寡核苷酸且更佳為CpG寡核苷酸。在一實施例中，該CpG寡核苷酸具有核酸序列5' TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT 3'(ODNCpG 24555；SEQ ID NO: 431)。SEQ ID NO: 431之免疫刺激性寡核苷酸核酸序列與先前報導之免疫刺激性寡核苷酸(ODN 10103)5' TCGTCGTTTTTCGGTCGTTTT 3'(SEQ ID NO: 432)之不同為反轉最接近3'端之CG二核苷酸。此兩種免疫刺激性寡核苷酸之間活性的相似性令人驚訝，因為先前報導CpG寡核苷酸之免疫刺激活性視CpG基元之數目、CG二核苷酸兩側之序列、CpG基元之位置及CpG基元之間的間距而定(Ballas等人，1996,J. Immunol.；Hartmann等人，2000, J. Immunol.；Klinman等人，2003,Clin. Exp. Immunol.)。如先前揭示案所預期的，移除免疫刺激性寡核苷酸CpG ODN 24555(SEQ ID NO: 431)中最接近3'端之CG二核苷酸不會對此免疫刺激性寡核苷酸加強抗原特異性免疫反應之能力產生負面影響。CpG ODN 24555顯示類似情況且在一些情況下與CpG ODN 10103相比增強免疫刺激活性。

免疫刺激性寡核苷酸可為雙股或單股。雙股分子一般在活體內更穩定，而單股分子具有增加之免疫活性。因此，在本發明之一些態樣中核酸較佳為單股且在其他態樣中核酸較佳為雙股。

術語「核酸」及「寡核苷酸」在本文中可互換使用，意謂多個核苷酸(亦即糖(例如核糖或脫氧核糖)連接於磷酸酯基及可更換之有機鹼基之分子，該鹼基為經取代之嘧啶(例如胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))或經取代之嘌呤(例如腺嘌呤(A)或鳥嘌呤(G))。如本文中所使用，術語係指寡核糖核苷酸(亦即聚核苷酸減去磷酸酯)及任何其他含有有機鹼基之聚合物。核酸分子可自現有核酸來源獲得(例如基因組或cDNA)，但較佳為合成的(例如藉由核酸合成製造)。

在一實施例中，與天然RNA及DNA相比，免疫刺激性寡核苷酸可包涵各種化學修飾及取代，包括磷酸二酯核苷間橋、β-D-核糖單元及/或天然核苷鹼基(腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶)。化學修飾之實例為熟習此項技術者所已知且例如描述於Uhlmann E.等人(1990),Chem. Rev. 90:543；「Protocols for Oligonucleotides and Analogs」 Synthesis and Properties ＆ Synthesis and Analytical Techniques,S. Agrawal編，Humana Press,Totowa,USA 1993；Crooke,S.T.等人(1996) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 36:107-129；及Hunziker J.等人，(1995),Mod. Synth. Methods 7:331-417中。本發明之寡核苷酸可具有一或多種修飾，其中與由天然DNA或RNA構成之具有相同序列的寡核苷酸相比，各修飾位於特定磷酸二酯核苷間橋及/或特定β-D-核糖單元及/或特定天然核苷鹼基位置。

舉例而言，寡核苷酸可包含一或多種修飾。該等修飾可選自：a)由經修飾之核苷間橋置換位於核苷之3'及/或5'端的磷酸二酯核苷間橋、b)由脫除磷之橋置換位於核苷之3'及/或5'端的磷酸二酯橋、c)由另一單元置換糖磷酸酯主鏈之糖磷酸酯單元、d)由經修飾之糖單元置換β-D-核糖單元及e)置換天然核苷鹼基。

核酸亦包括經取代之嘌呤及嘧啶，諸如C-5丙炔嘧啶及7-去氮-7-經取代之經嘌呤修飾之鹼基(Wagner等人，1996,Nat. Biotechnol. 14:840-4)。嘌呤及嘧啶包括(但不限於)腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸苷、5-甲基胞嘧啶、2-胺基嘌呤、2-胺基-6-氯嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、次黃嘌呤及其他天然及非天然存在之核苷鹼基、經取代及未經取代之芳族部分。其他該等修飾為熟習此項技術者所熟知。

經修飾之鹼基為化學性質不同於DNA及RNA中所見之天然存在之鹼基(諸如T、C、G、A及U)、但與此等天然存在之鹼基共有基本化學結構的任何鹼基。經修飾之核苷鹼基可例如選自次黃嘌呤、尿嘧啶、二氫尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-胺基尿嘧啶、5-(C1-C6)烷基尿嘧啶、5-(C2-C6)烯基尿嘧啶、5-(C2-C6)炔基尿嘧啶、5-(羥甲基)尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羥基胞嘧啶、5-(C1-C6)烷基胞嘧啶、5-(C2-C6)烯基胞嘧啶、5-(C2-C6)炔基胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、N2-二甲基鳥嘌呤、2,4-二胺基-嘌呤、8-氮雜嘌呤、經取代之7-去氮嘌呤(較佳為7-去氮-7-經取代之嘌呤及/或7-去氮-8-經取代之嘌呤)、5-羥甲基胞嘧啶、N4-烷基胞嘧啶(例如N4-乙基胞嘧啶)、5-羥基去氧胞嘧啶、5-羥甲基去氧胞嘧啶、N4-烷基去氧胞嘧啶(例如N4-乙基去氧胞嘧啶)、6-硫去氧鳥苷及硝基吡咯之去氧核糖核苷、C5-丙炔基嘧啶及二胺基嘌呤(例如2,6-二胺基嘌呤)、肌苷、5-甲基胞嘧啶、2-胺基嘌呤、2-胺基-6-氯嘌呤、次黃嘌呤或天然核苷鹼基之其他修飾。此清單欲為例示性的且不應解釋為限制性的。

在本發明之一些態樣中，本文所述之免疫刺激性寡核苷酸的CpG二核苷酸較佳未經甲基化。未經甲基化之CpG基元為未經甲基化之胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸序列(亦即在未經甲基化之5'胞嘧啶後為3'鳥苷且由磷酸鍵連接)。在其他態樣中，CpG基元經甲基化。經甲基化之CpG基元為經甲基化之胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸序列(亦即在經甲基化之5'胞嘧啶後為3'鳥苷且由磷酸鍵連接)。

在本發明之一些態樣中，免疫刺激性寡核苷酸可含有經修飾之胞嘧啶。經修飾之胞嘧啶為胞嘧啶之天然存在或非天然存在之嘧啶鹼基類似物，其可置換此鹼基而不減弱寡核苷酸之免疫刺激活性。經修飾之胞嘧啶包括(但不限於)5-經取代之胞嘧啶(例如5-甲基-胞嘧啶、5-氟-胞嘧啶、5-氯-胞嘧啶、5-溴-胞嘧啶、5-碘-胞嘧啶、5-羥基-胞嘧啶、5-羥甲基-胞嘧啶、5-二氟甲基-胞嘧啶及未經取代或經取代之5-炔基-胞嘧啶)、6-經取代之胞嘧啶、N4-經取代之胞嘧啶(例如N4-乙基-胞嘧啶)、5-氮雜-胞嘧啶、2-巰基-胞嘧啶、異胞嘧啶、假異胞嘧啶、具有稠環系統之胞嘧啶類似物(例如N,N'-伸丙基胞嘧啶或啡噁嗪)及尿嘧啶與其衍生物(例如5-氟-尿嘧啶、5-溴-尿嘧啶、5-溴乙烯基-尿嘧啶、4-硫基-尿嘧啶、5-羥基-尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶)。一些較佳胞嘧啶包括5-甲基-胞嘧啶、5-氟-胞嘧啶、5-羥基-胞嘧啶、5-羥甲基-胞嘧啶及N4-乙基-胞嘧啶。在本發明之另一實施例中，胞嘧啶鹼基經普通鹼基(例如3-硝基吡咯、P-鹼基)、芳族環系統(例如氟苯或二氟苯)或氫原子(dSpacer)取代。

在本發明之一些態樣中，免疫刺激性寡核苷酸可含有經修飾之鳥嘌呤。經修飾之鳥嘌呤為鳥嘌呤之天然存在或非天然存在之嘌呤鹼基類似物，其可置換此鹼基而不減弱寡核苷酸之免疫刺激活性。經修飾之鳥嘌呤包括(但不限於)7-去氮鳥嘌呤、7-去氮-7-經取代之鳥嘌呤、次黃嘌呤、N2-經取代之鳥嘌呤(例如N2-甲基-鳥嘌呤)、5-胺基-3-甲基-3H,6H-噻唑幷[4,5-d]嘧啶-2,7-二酮、2,6-二胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、嘌呤、吲哚、腺嘌呤、經取代之腺嘌呤(例如N6-甲基-腺嘌呤、8-側氧基-腺嘌呤)、8-經取代之鳥嘌呤(例如8-羥基鳥嘌呤及8-溴鳥嘌呤)及6-硫鳥嘌呤。在本發明之另一實施例中，鳥嘌呤鹼基經普通鹼基(例如4-甲基-吲哚、5-硝基-吲哚及K-鹼基)、芳族環系統(例如苯并咪唑或二氯-苯并咪唑、1-甲基-1H-[1,2,4]三唑-3-甲酸醯胺)或氫原子(dSpacer)取代。

在某些態樣中，寡核苷酸可包括經修飾之核苷酸間鍵。此等經修飾之鍵可部分抗降解(例如穩定化)。「穩定之核酸分子」應意謂相對地抗活體內降解(例如經由核酸外切酶或核酸內切酶)之核酸分子。穩定可與長度或二級結構有關。長度為數萬至數十萬鹼基之核酸相對地抗活體內降解。對於較短核酸，二級結構可使其作用穩定及增加。莖環(stem loop)結構之形成可使核酸分子穩定。舉例而言，若核酸之3'端與上游區域具有自體互補性以致其可向後摺疊且形成莖環結構，則核酸可變得穩定且展現更多活性。

核酸穩定亦可經由磷酸酯主鏈修飾來實現。在一些實施例中，具有硫代磷酸酯鍵之寡核苷酸可提供最大活性且保護寡核苷酸不被細胞內核酸外切酶及核酸內切酶降解。

對於活體內使用，核酸較佳相對地抗降解(例如經由核酸內切酶及核酸外切酶)。已顯示當活體內投藥時，核酸主鏈之修飾提供增強之核酸活性。諸如莖環之二級結構可使核酸穩定抗降解。或者，核酸穩定亦可經由磷酸酯主鏈修飾來實現。較佳穩定之核酸至少具有部分經硫代磷酸酯修飾之主鏈。可使用自動化技術，使用胺基磷酸酯或H-膦酸酯化學作用來合成硫代磷酸酯。芳基-膦酸酯及烷基-膦酸酯可例如如美國專利第4,469,863號中所述製備；且烷基磷酸三酯(其中帶電氧部分經烷基化，如美國專利第5,023,243號及歐洲專利第092,574號中所述)可藉由自動化固相合成，使用市售試劑來製備。進行其他DNA主鏈修飾及取代之方法已有所描述(Uhlmann,E.及Peyman,A.(1990)Chem. Rev. 90:544；Goodchild,J.(1990)Bioconjugate Chem. 1:165)。具有CpG基元之2'-O-甲基核酸亦引起免疫活化，經乙氧基修飾之CpG核酸亦如此。事實上，已發現無完全消除CpG作用之主鏈修飾，儘管該作用藉由用5-甲基C置換C而大大降低。具有硫代磷酸酯鍵之構築體提供最大活性且保護核酸不被細胞內核酸外切酶及核酸內切酶降解。其他經修飾之核酸包括經磷酸二酯修飾之核酸、磷酸二酯與硫代磷酸酯核酸之組合、甲基膦酸酯、甲基硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、p-乙氧基及其組合。關於CpG核酸，此等組合及其對免疫細胞之特定作用更詳細地各論述於PCT公開專利申請案PCT/US 95/01570(WO 96/02555)及PCT/US 97/19791(WO 98/18810)及2001年2月27日頒布之美國專利US 6,194,388 B1及2001年5月29日頒布之美國專利US 6,239,116 B1中，該等專利之全部內容引用的方式併入本文中。咸信此等經修飾之核酸可顯示更多刺激活性，此歸因於增強之核酸酶抗性、增加之細胞吸收、增加之蛋白質結合及/或改變之細胞內定位。

對於活體內投藥，核酸可與使得結合於標靶細胞(例如樹突狀細胞、B細胞、單核細胞及自然殺手(NK)細胞)表面的親和力較高及/或標靶細胞之細胞吸收增加的分子締合，以形成「核酸傳遞複合物」。可使用此項技術所熟知之技術，使核酸與適當分子離子性或共價締合。可使用各種偶合劑或交聯劑，例如蛋白A、碳化二亞胺及N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)。或者，可使用熟知技術將核酸囊封於脂質體或病毒體中。

其他穩定之核酸包括(但不限於)非離子性DNA類似物，諸如烷基-磷酸酯及芳基-磷酸酯(其中帶電膦酸酯氧經烷基或芳基置換)、磷酸二酯及烷基磷酸三酯(其中帶電氧部分經烷基化)。在任一端或兩端含有二醇(諸如四乙二醇或六乙二醇)之核酸亦顯示實質上抗核酸酶降解。在一些實施例中，本發明之免疫刺激性寡核苷酸可包括至少一種經取代之親脂性核苷酸類似物及/或嘧啶-嘌呤二核苷酸。

寡核苷酸可具有一或兩個可接近之5'端。有可能形成具有兩個該等5'端之經修飾之寡核苷酸，例如藉由經由3'-3'鍵連接兩個寡核苷酸，產生具有一或兩個可接近之5'端的寡核苷酸。該3'3'鍵可為磷酸二酯、硫代磷酸酯或任何其他經修飾之核苷間橋。實現該等連接之方法為此項技術中所已知。舉例而言，該等連接已描述於Seliger,H.等人，Oligonucleotide analogs with terminal 3'-3'-and5'-5'-internucleotidic linkages as antisense inhibitors of viral gene expression,Nucleosides ＆ Nucleotides(1991),10(1-3),469-77及Jiang等人，Pseudo-cyclic oligonucleotides: in vitro and in vivo properties,Bioorganic ＆ Medicinal Chemistry(1999),7(12),2727-2735中。

另外，3'端核苷之間的鍵不為磷酸二酯、硫代磷酸酯或其他經修飾之橋的3'3'連接之ODN可使用另一間隔基製備，諸如三乙二醇或四乙二醇磷酸酯部分(Durand,M.等人，Triple-helix formation by an oligonucleotide containing one(dA)12 and two(dT)12 sequences bridged by two hexaethylene glycol chains,Biochemistry(1992),31(38),9197-204，美國專利第5,658,738號及美國專利第5,668,265號)。或者，利用標準胺基磷酸酯化學作用，非核苷酸性連接子可衍生自乙二醇、丙二醇或無鹼基去氧核糖(dSpacer)單元(Fontanel,Marie Laurence等人，StericalRecognition by T4 polynucleotide kinase of non-nucleosidic moieties 5'-attached to oligonucleotides;Nucleic Acids Research(1994),22(11),2022-7)。非核苷酸性連接子可合併一次或多次，或彼此組合，允許欲連接之兩個ODN的3'端之間的任何所需距離。

位於核苷之3'及/或5'端的磷酸二酯核苷間橋可由經修飾之核苷間橋置換，其中該經修飾之核苷間橋例如選自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、NR1R2-胺基磷酸酯、硼烷磷酸酯、α-羥基苯甲基膦酸酯、磷酸酯-(C1-C21)-O-烷基酯、磷酸酯-[(C6-C12)芳基-(C1-C21)-O-烷基]酯、(C1-C8)烷基膦酸酯及/或(C6-C12)芳基磷酸酯橋、(C7-C12)-α-羥甲基-芳基(例如WO 95/01363中所揭示)，其中(C6-C12)芳基、(C6-C20)芳基及(C6-C14)芳基視情況經鹵素、烷基、烷氧基、硝基、氰基取代，且其中R1及R2彼此獨立地為氫、(C1-C18)烷基、(C6-C20)芳基、(C6-C14)芳基、(C1-C8)烷基，較佳為氫、(C1-C8)烷基，較佳為(C1-C4)烷基及/或甲氧基乙基，或R1及R2連同帶有其之氮原子形成5-6員雜環，其可另外含有另一來自O、S及N之群的雜原子。

可由去磷橋(去磷橋例如描述於Uhlmann E.及Peyman A.「Methods in Molecular Biology」，第20卷，「Protocols for Oligonucleotides and Analogs」，S. Agrawal編，Humana Press,Totowa 1993，第16章，第355頁以下中)置換位於核苷之3'及/或5'端的磷酸二酯橋，其中去磷橋例如選自去磷橋甲縮醛、3'-硫甲縮醛、甲基羥胺、肟、亞甲基二甲基-伸肼基、二亞甲碸及/或矽烷基。

本發明之免疫刺激性寡核苷酸可視情況具有嵌合主鏈。嵌合主鏈為包含一種以上類型之鍵的主鏈。在一實施例中，該嵌合主鏈可由下式表示：5' Y1N1ZN2Y2 3'。Y1及Y2為具有介於1與10之間個核苷酸的核酸分子。Y1及Y2各包括至少一個經修飾之核苷酸間鍵。因為嵌合寡核苷酸之至少2個核苷酸包括主鏈修飾，所以此等核酸為一類「穩定之免疫刺激性核酸」之實例。

關於嵌合寡核苷酸，認為Y1與Y2彼此無關。此意謂Y1及Y2各在同一分子中可能或可能不具有互不相同之序列及互不相同之主鏈鍵。在一些實施例中，Y1及/或Y2具有介於3與8之間個核苷酸。N1及N2為具有介於0與5之間個核苷酸的核酸分子，只要N1ZN2具有總共至少6個核苷酸即可。N1ZN2之核苷酸具有磷酸二酯主鏈且不包括具有經修飾之主鏈的核酸。Z為免疫刺激性核酸基元，較佳選自本文所述之彼等基元。

式Y1N1ZN2Y2之中心核苷酸(N1ZN2)具有磷酸二酯核苷酸間鍵且Y1及Y2具有至少一個、但可具有一個以上或甚至可具有所有經修飾之核苷酸間鍵。在較佳實施例中，Y1及/或Y2具有至少2個或介於2與5之間個經修飾之核苷酸間鍵或Y1具有5個經修飾之核苷酸間鍵且Y2具有2個經修飾之核苷酸間鍵。在一些實施例中，經修飾之核苷酸間鍵為經硫代磷酸酯修飾之鍵、二硫代磷酸酯鍵或經p-乙氧基修飾之鍵。

核酸亦包括具有主鏈糖之核酸，該等糖共價連接於除2'位置之羥基外及除5'位置之磷酸酯基外的低分子量有機基團。因此，經修飾之核酸可包括2'-O-經烷基化之核糖基團。另外，經修飾之核酸可包括諸如阿拉伯糖或2'-氟阿拉伯糖之糖以替代核糖。因此，核酸之主鏈組成可為異質的，從而含有連接在一起之聚合物單元的任何可能組合，諸如肽-核酸(其具有胺基酸主鏈及核酸鹼基)。在一些實施例中，核酸之主鏈組成為均質的。

來自糖磷酸酯主鏈之糖磷酸酯單元(亦即共同形成糖磷酸酯單元之β-D-核糖及磷酸二酯核苷間橋)(亦即糖磷酸酯主鏈由糖磷酸酯單元構成)可由另一單元置換，其中該另一單元例如適合於建構「N-嗎啉基-衍生物」寡聚物(如例如Stirchak E. P.等人(1989) Nucleic Acid Res. 17:6129-41中所述)，亦即例如由N-嗎啉基-衍生物置換；或建構聚醯胺核酸(「PNA」；如例如Nielsen P. E.等人(1994) Bioconjug. Chem. 5:3-7中所述)，亦即例如由PNA主鏈單元(例如由2-胺基乙基甘胺酸)置換。寡核苷酸可具有其他碳水化合物主鏈修飾及置換，諸如具有磷酸酯基之肽核酸(PHONA)、鎖核酸(locked nucleic acid，LNA)及主鏈部分具有烷基連接基團或胺基連接基團之寡核苷酸。烷基連接基團可為分支鏈或非分支鏈的，經取代或未經取代的，及對掌性純的或外消旋混合物。

β-核糖單元或β-D-2'去氧核糖單元可由經修飾之糖單元置換，其中該經修飾之糖單元例如選自β-D-核糖、α-D-2'-去氧核糖、L-2'-去氧核糖、2'-F-2'-去氧核糖、2'-F-阿拉伯糖、2'-O-(C1-C6)烷基-核糖(2'-O-(C1-C6)烷基-核糖較佳為2'-O-甲基核糖)、2'-O-(C1-C6)烯基-核糖、2'-[O-(C1-C6)烷基-O-(C1-C6)烷基]-核糖、2'-NH₂ -2'-去氧核糖、β-D-木-呋喃糖、α-阿拉伯呋喃糖、2,4-二去氧-β-D-赤-己-哌喃醣及碳環(例如描述於Froehler J.(1992) Am. Chem. Soc. 114:8320中)及/或開鏈糖類似物(例如描述於Vandendriessche等人(1993) Tetrahedron 49:7223中)及/或雙環糖類似物(例如描述於Tarkov M.等人(1993) Helv. Chim. Acta. 76:481中)。

在一些實施例中，該糖為2'-O-甲基核糖，尤其對於由磷酸二酯或磷酸二酯樣核苷間鍵連接的一個或兩個核苷酸。

本發明之寡核苷酸可使用此項技術中熟知之許多程序中之任一者來重新合成。舉例而言，胺基磷酸b-氰基乙酯方法(Beaucage,S. L.及Caruthers,M. H.,(1981) Tet. Let. 22:1589)；核苷H-膦酸酯方法(Garegg等人，(1986) Tet. Let. 27:4051-4054；Froehler等人，(1986) Nucl. Acid Res. 14:5399-5407；Garegg等人，(1986) 27:4055-4058；Gaffney等人，(1988) Tet. Let. 29:2619-2622)。此等化學法可藉由市場有售之各種自動化核酸合成器來執行。此等寡核苷酸被稱為合成寡核苷酸。或者，富含T之二核苷酸及/或TG二核苷酸可大規模地以質體形式製造(參見Sambrook T.等人，「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」，Cold Spring Harbor laboratory Press,New York,1989)且分離成較小片段或整個投與。核酸可使用已知技術(諸如使用限制酶、核酸外切酶或核酸內切酶之彼等技術)，由現有核酸序列(例如基因組或cDNA)製備。

可使用自動化技術，採用胺基磷酸酯或H-膦酸酯化學法來合成經修飾之主鏈(諸如硫代磷酸酯)。芳基-磷酸酯及烷基-磷酸酯可例如如美國專利第4,469,863號中所述製備，且烷基磷酸三酯(其中帶電氧部分經烷基化，如美國專利第5,023,243號中所述)可藉由自動化固相合成，使用市售試劑來製備。進行其他DNA主鏈修飾及取代之方法已有所描述(例如Uhlmann,E.及Peyman,A.,Chem. Rev. 90:544,1990；Goodchild,J.,Bioconjugate Chem. 1:165,1990)。

以此方式製備之核酸被稱為經分離之核酸。「經分離之核酸」通常係指與與其一起自細胞、自細胞核、自線粒體或自染色質分離之組份及可視為污染物之任何其他組份分離之核酸。

在一實施例中，本發明之免疫原性組合物包含至少一種為CpG寡核苷酸之佐劑。CpG寡核苷酸已描述於許多頒布專利、公開專利申請案及其他公開案中，包括美國專利第6,194,388號；第6,207,646號；第6,214,806號；第6,218,371號；第6,239,116號；及第6,339,068號。

已鑑別出不同種類之CpG免疫刺激性寡核苷酸。此等種類被稱為A、B、C及P類，且更詳細地描述於下文中。本發明之方法及組合物包含使用此等不同種類之CpG免疫刺激性寡核苷酸。

可使任一種類進行增強其效能之E修飾。E修飾可為用於5'端核苷酸之鹵素取代；該等取代之實例包括(但不限於)溴-尿苷或碘-尿苷取代。E修飾亦可包括用於5'端核苷酸之乙基-尿苷取代。

「A類」CpG免疫刺激性寡核苷酸在功能上之特徵為自漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)誘導高含量之干擾素-α(IFN-α)及誘導NK細胞活化，同時對B細胞活化具有極小作用的能力。在結構上，此類通常在5'及3'端具有穩定之poly-G序列。其亦具有至少6個核苷酸之含有迴文磷酸二酯CpG二核苷酸的序列，例如(但不一定)，其含有由Yamamoto及同事描述之以下六聚體迴文中之一者：GACGTC、AGCGCT或AACGTT。Yamamoto S等人J. Immunol 148:4072-6(1992)。A類CpG免疫刺激性寡核苷酸及此類之例示性序列已描述於美國非臨時專利申請案第09/672,126號及公開PCT申請案PCT/USOO/26527(WO 01/22990)中，兩者皆於2000年9月27日申請。

在一實施例中，本發明之「A類」CpG寡核苷酸具有以下核酸序列：5' GGGGACGACGTCGTGGGGGGG 3'(SEQ ID NO: 440)。

A類寡核苷酸之一些非限制性實例包括：5' G*G*G_G_A_C_G_A_C_G_T_C_G_T_G_G*G*G*G*G*G 3'；其中*係指硫代磷酸酯鍵且_係指磷酸二酯鍵。

「B類」CpG免疫刺激性寡核苷酸在功能上之特徵為活化B細胞及pDC之能力，但在誘導IFN-α及NK細胞活化方面相對較弱。在結構上，此類通常可由硫代磷酸酯鍵完全穩定，但其亦可具有一或多個磷酸二酯鍵，較佳位於CpG基元之胞嘧啶與鳥嘌呤之間，在該情況下該分子被稱為半軟的(semi-soft)。在一實施例中，本發明之CpG寡核苷酸為至少由下式表示之B類CpG寡核苷酸：5' X₁ X₂ CGX₃ X₄ 3'，其中X₁ 、X₂ 、X₃ 及X₄ 為核苷酸。在一實施例中，X₂ 為腺嘌呤、鳥嘌呤或胸腺嘧啶。在另一實施例中，X₃ 為胞嘧啶、腺嘌呤或胸腺嘧啶。

在另一實施例中，本發明之CpG寡核苷酸為至少由下式表示之B類CpG寡核苷酸：5' N₁ X₁ X₂ CGX₃ X₄ N₂ 3'，其中X₁ 、X₂ 、X₃ 及X₄ 為核苷酸且N為任何核苷酸且N₁ 及N₂ 各為由約0-25個N構成之核酸序列。在一實施例中，X₁ X₂ 為選自由GpT、GpG、GpA、ApA、ApT、ApG、CpT、CpA、CpG、TpA、TpT及TpG組成之群的二核苷酸；且X₃ X₄ 為選自由TpT、ApT、TpG、ApG、CpG、TpC、ApC、CpC、TpA、ApA及CpA組成之群的二核苷酸。較佳地，X₁ X₂ 為GpA或GpT且X₃ X₄ 為TpT。在其他實施例中，X₁ 或X₂ 或兩者為嘌呤且X₃ 或X₄ 或兩者為嘧啶或X₁ X₂ 為GpA且X₃ 或X₄ 或兩者為嘧啶。在一較佳實施例中，X₁ X₂ 為選自由TpA、ApA、ApC、ApG及GpG組成之群的二核苷酸。在又一實施例中，X₃ X₄ 為選自由TpT、TpA、TpG、ApA、ApG、GpA及CpA組成之群的二核苷酸。在另一實施例中，X₁ X₂ 為選自由TpT、TpG、ApT、GpC、CpC、CpT、TpC、GpT及CpG組成之群的二核苷酸；X₃ 為選自由A及T組成之群的核苷酸，且X₄ 為核苷酸，但當X₁ X₂ 為TpC、GpT或CpG時，X₃ X₄ 不為TpC、ApT或ApC。

在另一較佳實施例中，CpG寡核苷酸具有序列5' TCN₁ TX₁ X₂ CGX₃ X₄ 3'。在一些實施例中，本發明之CpG寡核苷酸包括選自由GpT、GpG、GpA及ApA組成之群的X₁ X₂ 及選自由TpT、CpT及TpC組成之群的X₃ X₄ 。

本發明之B類CpG寡核苷酸序列為以上所概述以及公開PCT專利申請案PCT/US95/01570及PCT/US97/19791及USP 6,194,388、6,207,646、6,214,806、6,218,371、6,239,116及6,339,068中所揭示之序列。例示性序列包括(但不限於)此等靠後之申請案及專利中所揭示之序列。

在一實施例中，本發明之「B類」CpG寡核苷酸具有以下核酸序列：5' TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT 3'(SEQ ID NO: 431)或5' TCGTCGTTTTTCGGTCGTTTT 3'(SEQ ID NO: 432)或5' TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 3'(SEQ ID NO: 433)或5' TCGTCGTTTCGTCGTTTTGTCGTT 3'(SEQ ID NO: 441)或5' TCGTCGTTTTGTCGTTTTTTTCGA 3'(SEQ ID NO: 442)。

在任何此等序列中，所有鍵可全部均為硫代磷酸酯鍵。在另一實施例中，在任何此等序列中，一或多個鍵可為磷酸二酯，較佳位於CpG基元之「C」與「G」之間，從而產生半軟CpG寡核苷酸。在任何此等序列中，乙基-尿苷或鹵素可取代5' T；鹵素取代之實例包括(但不限於)溴-尿苷或碘-尿苷取代。

B類寡核苷酸之一些非限制性實例包括：5'T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*G*C*T*T*T*T3'或5'T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T3'或5'T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T3'或5'T*C*G*T*C*G*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T3'或5'T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*T*T*T*C*G*A3'，其中*係指硫代磷酸酯鍵。

「C類」CpG免疫刺激性寡核苷酸在功能上之特徵為活化B細胞及NK細胞且誘導IFN-α之能力。在結構上，此類通常包括具有一或多個B類免疫刺激性CpG基元之區域，及使得分子形成二級(例如莖環)或三級(例如二聚體)類型結構之富含GC迴文之區域或近似迴文區域。一些此等寡核苷酸具有傳統「刺激性」CpG序列與「富含GC」或「B細胞中和」基元。此等組合基元寡核苷酸具有免疫刺激作用，其介於與傳統B類CpG寡核苷酸相關之作用(亦即B細胞活化及樹突狀細胞(DC)活化之強誘導)與與A類CpG ODN相關之作用(亦即IFN-α及NK細胞活化之強誘導，但B細胞及DC活化之相對弱誘導)之間。Krieg AM等人(1995)Nature 374:546-9；Ballas ZK等人(1996)J Immunol 157:1840-5；Yamamoto S等人(1992) J Immunol 148:4072-6。

C類組合基元免疫刺激性寡核苷酸可具有完全穩定(例如所有硫代磷酸酯)、嵌合(磷酸二酯中心區域)或半軟(例如CpG基元中之磷酸二酯)之主鏈。此類已描述於2002年8月19日申請之美國專利申請案US 10/224,523中。

C類CpG寡核苷酸之一個刺激性域或基元由下式定義：5' X₁ DCGHX₂ 3'。D為除C外之核苷酸。C為胞嘧啶。G為鳥嘌呤。H為除G外之核苷酸。X₁ 及X₂ 為長度為0至10個核苷酸之任何核酸序列。X₁ 可包括CG，在該情況下較佳在緊鄰此CG之前存在T。在一些實施例中，DCG為TCG。X₁ 之長度較佳為0至6個核苷酸。在一些實施例中，X₂ 不含有任何poly G或poly A基元。在其他實施例中，免疫刺激性寡核苷酸在5'端或在3'端具有poly-T序列。如本文中所使用，「poly-A」或「poly-T」應分別指連續四個或四個以上A或T之延伸段，例如5' AAAA 3'或5' TTTT 3'。如本文中所使用，「poly-G端」應係指連續四個或四個以上G之延伸段，例如5' GGGG 3'，其存在於核酸之5'端或3'端。如本文中所使用，「poly-G寡核苷酸」應係指具有式5' X₁ X₂ GGGX₃ X₄ 3'之寡核苷酸，其中X₁ 、X₂ 、X₃ 及X₄ 為核苷酸且X₃ 及X₄ 中之至少一者較佳為G。根據此式，B細胞刺激性域之一些較佳設計包含TTTTTCG、TCG、TTCG、TTTCG、TTTTCG、TCGT、TTCGT、TTTCGT、TCGTCGT。

C類CpG寡核苷酸之第二基元被稱為P或N且緊鄰X₁ 之5'端或X₂ 之3'端。

N為以CGG三核苷酸開始且長度為至少10個核苷酸之B細胞中和序列。B細胞中和基元包括至少一個CpG序列，其中C在CG之前或G在CG之後(Krieg AM等人(1998) ProcNatl Acad Sd USA 95:12631-12636)；或為含有CG之DNA序列，其中CG之C經甲基化。中和基元或序列在存在於另外非刺激性基元中時具有一定程度之免疫刺激能力，但當存在於其他免疫刺激性基元之範圍內時用以降低其他基元之免疫刺激潛在性。

P為含有富含GC之迴文的序列，其長度為至少10個核苷酸。

如本文中所使用，「迴文」及同等地「迴文序列」應係指反向重複，亦即諸如ABCDEE'D'C'B'A'之序列，其中A及A'、B及B'等為能夠形成常見瓦生克立克鹼基對(Watson-Crick base pair)之鹼基。

如本文中所使用，「富含GC之迴文」應係指具有至少三分之二的G及C之鹼基組成的迴文。在一些實施例中，富含GC之域較佳在「B細胞刺激性域」之3'端。在長度為10個鹼基之富含GC之迴文的情況下，該迴文由此含有至少8個G及C。在長度為12個鹼基之富含GC之迴文的情況下，該迴文亦含有至少8個G及C。在富含GC之14-mer迴文的情況下，該迴文之至少10個鹼基為G及C。在一些實施例中，富含GC之迴文僅由G及C構成。

在一些實施例中，富含GC之迴文具有至少81% G及C之鹼基組成。在該長度為10個鹼基之富含GC之迴文的情況下，該迴文由此僅由G及C構成。在該長度為12個鹼基之富含GC之迴文的情況下，較佳該迴文之至少10個鹼基(83%)為G及C。在一些較佳實施例中，長度為12個鹼基之富含GC的迴文僅由G及C構成。在富含GC之14-mer迴文的情況下，該迴文之至少12個鹼基(86%)為G及C。在一些較佳實施例中，長度為14個鹼基之富含GC的迴文僅由G及C構成。富含GC之迴文的C可未經甲基化或其可經甲基化。

一般而言，此域具有至少3個C及G，更佳各為4個，且最佳各為5個或5個以上。此域中C及G之數目無需相同。較佳排列C及G使得其能夠形成自體互補雙鏈體或迴文，諸如CCGCGCGG。此可穿插有A或T，但較佳至少部分保留自體互補性，如例如基元CGACGTTCGTCG或CGGCGCCGTGCCG中。當不保留互補性時，較佳非互補鹼基對為TG。在一較佳實施例中，不存在超過連續3個不為迴文之一部分的鹼基，較佳不超過2個且最佳僅為1個。在一些實施例中，富含GC之迴文包括至少一個CGG三聚體、至少一個CCG三聚體或至少一個CGCG四聚體。在其他實施例中，富含GC之迴文不為CCCCCCGGGGGG或GGGGGGCCCCCC、CCCCCGGGGG或GGGGGCCCCC。

富含GC之區域的至少一個G可經肌苷(I)取代。在一些實施例中，P包括一個以上I。

在某些實施例中，免疫刺激性寡核苷酸具有以下各式中之一者：5' NX₁ DCGHX₂ 3'、5'X₁ DCGHX₂ N 3'、5'PX₁ DCGHX₂ 3'、5' X₁ DCGHX₂ P 3'、5' X₁ DCGHX₂ PX₃ 3'、5' X₁ DCGHPX₃ 3'、5' DCGHX₂ PX₃ 3'、5' TCGHX₂ PX₃ 3'、5' DCGHPX₃ 3'或5'DCGHP 3'。

本發明提供其他由式5' N₁ PyGN₂ P 3'定義之免疫刺激性寡核苷酸。N₁ 為長度為1至6個核苷酸之任何序列。Py為嘧啶。G為鳥嘌呤。N₂ 為長度為0至30個核苷酸之任何序列。P為含有長度為至少10個核苷酸之序列的富含GC之迴文。

N₁ 及N₂ 可含有大於50%嘧啶且更佳大於50% T。N₁ 可包括CG，在該情況下較佳在緊鄰此CG之前存在T。在一些實施例中，N₁ PyG為TCG，且最佳為TCGN₂ ，其中N₂ 不為G。

N₁ PyGN₂ P可包括一或多個肌苷(I)核苷酸。N₁ 中之C或G可由肌苷置換，但CpI更優於IpG。對於諸如IpG之肌苷取代，最佳活性可藉助於「半軟」或嵌合主鏈來達成，其中IG或CI之間的鍵為磷酸二酯。N₁ 可包括至少一個CI、TCI、IG或TIG基元。

在某些實施例中，N₁ PyGN₂ 為選自由TTTTTCG、TCG、TTCG、TTTCG、TTTTCG、TCGT、TTCGT、TTTCGT及TCGTCGT組成之群的序列。

在一實施例中，本發明之「C類」CpG寡核苷酸具有以下核酸序列：5' TCGCGTCGTTCGGCGCGCGCCG 3'(SEQ ID NO: 443)或5' TCGTCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3'(SEQ ID NO: 444)或5' TCGGACGTTCGGCGCGCGCCG 3'(SEQ ID NO: 445)或5' TCGGACGTTCGGCGCGCCG 3'(SEQ ID NO: 446)或5' TCGCGTCGTTCGGCGCGCCG 3'(SEQ ID NO: 447)或5' TCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3'(SEQ ID NO: 448)或5' TCGACGTTCGGCGCGCCG 3'(SEQ ID NO: 449)或5' TCGCGTCGTTCGGCGCCG 3'(SEQ ID NO: 450)或5' TCGCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3'(SEQ ID NO: 451)或5' TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG 3'(SEQ ID NO: 452)或5' TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG 3'(SEQ ID NO: 453)或5' TCGTCGTTTTACGGCGCCGTGCCG 3'(SEQ ID NO: 454)或5' TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCGT 3'(SEQ ID NO: 455)。

在任何此等序列中，所有鍵可全部均為硫代磷酸酯鍵。在另一實施例中，在任何此等序列中，一或多個鍵可為磷酸二酯，較佳位於CpG基元之「C」與「G」之間，從而產生半軟CpG寡核苷酸。

C類寡核苷酸之一些非限制性實例包括：5' T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3'或5' T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3'或5' T*C_G*G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3'或5' T*C_G*G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3'或5' T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3'或5' T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3'或5' T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3'或5' T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*C*G 3'或5' T*C_G*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3'或5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 3'或5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G 3'或5' T*C*G*T*C_G*T*T*T*T*A*C_G*G*C*G*C*C_G*T*G*C*C*G 3'或5' T*C_G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T 3'，其中*係指硫代磷酸酯鍵且_係指磷酸二酯鍵。

在任何此等序列中，乙基-尿苷或鹵素可取代5'T；鹵素取代之實例包括(但不限於)溴-尿苷或碘-尿苷取代。

「P類」CpG免疫刺激性寡核苷酸已描述於WO 2007/095316中且特徵為其含有形成雙鏈體之區域，例如在5'與3'端處或附近之完全或不完全迴文，從而使其具有形成高級結構(諸如多聯體)之可能。在一些情況下，此等稱為P類寡核苷酸之寡核苷酸具有誘導比C類高很多含量之IFN-α分泌的能力。P類寡核苷酸具有在活體外及/或活體內自發地自組裝成多聯體之能力。在不受關於此等分子之作用方法之任何特定理論束縛的情況下，一種潛在假說係，與先前所述種類之CpG寡核苷酸相比，此性質賦予P類寡核苷酸在某些免疫細胞內更高度交聯TLR9之能力，從而誘導不同之免疫活化模式。

在一實施例中，本發明之CpG寡核苷酸為含有5' TLR活化域及至少2個迴文區域之P類CpG寡核苷酸，一個迴文區域為長度為至少6個核苷酸之5'迴文區域且直接或經由間隔基連接於長度為至少8個核苷酸之3'迴文區域，其中該寡核苷酸包括至少一個YpR二核苷酸。在一實施例中，該寡核苷酸不為T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G。在一實施例中，P類CpG寡核苷酸包括至少一個未經甲基化之CpG二核苷酸。在另一實施例中，TLR活化域為TCG、TTCG、TTTCG、TYpR、TTYpR、TTTYpR、UCG、UUCG、UUUCG、TTT或TTTT。在又一實施例中，TLR活化域在5'迴文區域內。在另一實施例中，TLR活化域緊鄰5'迴文區域之5'端。在又一實施例中，5'迴文區域之長度為至少8個核苷酸。在另一實施例中，3'迴文區域之長度為至少10個核苷酸。在另一實施例中，5'迴文區域之長度為至少10個核苷酸。在又一實施例中，3'迴文區域包括未經甲基化之CpG二核苷酸。在另一實施例中，3'迴文區域包括兩個未經甲基化之CpG二核苷酸。在另一實施例中，5'迴文區域包括未經甲基化之CpG二核苷酸。在又一實施例中，5'迴文區域包括兩個未經甲基化之CpG二核苷酸。在另一實施例中，5'及3'迴文區域的雙鏈體穩定性值為至少25。在另一實施例中，5'及3'迴文區域的雙鏈體穩定性值為至少30。在另一實施例中，5'及3'迴文區域的雙鏈體穩定性值為至少35。在另一實施例中，5'及3'迴文區域的雙鏈體穩定性值為至少40。在另一實施例中，5'及3'迴文區域的雙鏈體穩定性值為至少45。在另一實施例中，5'及3'迴文區域的雙鏈體穩定性值為至少50。在另一實施例中，5'及3'迴文區域的雙鏈體穩定性值為至少55。在另一實施例中，5'及3'迴文區域的雙鏈體穩定性值為至少60。在另一實施例中，5'及3'迴文區域的雙鏈體穩定性值為至少65。

在一實施例中，兩個迴文區域直接連接。在另一實施例中，兩個迴文區域經由3'-3'鍵連接。在另一實施例中，兩個迴文區域有一個核苷酸重疊。在又一實施例中，兩個迴文區域有兩個核苷酸重疊。在另一實施例中，兩個迴文區域不重疊。在另一實施例中，兩個迴文區域由間隔基連接。在一實施例中，該間隔基為長度為1-50個核苷酸之核酸。在另一實施例中，間隔基為長度為1個核苷酸之核酸。在另一實施例中，間隔基為非核苷酸間隔基。在一實施例中，該非核苷酸間隔基為D-間隔基。在另一實施例中，非核苷酸間隔基為連接子。在一實施例中，寡核苷酸具有式5' XP₁ SP₂ T 3'，其中X為TLR活化域，P₁ 為迴文，S為間隔基，P₂ 為迴文，且T為長度為0-100個核苷酸之3'尾。在一實施例中，X為TCG、TTCG或TTTCG。在另一實施例中，T之長度為5-50個核苷酸。在又一實施例中，T之長度為5-10個核苷酸。在一實施例中，S為長度為1-50個核苷酸之核酸。在另一實施例中，S為長度為1個核苷酸之核酸。在另一實施例中，S為非核苷酸間隔基。在一實施例中，該非核苷酸間隔基為D-間隔基。在另一實施例中，非核苷酸間隔基為連接子。在另一實施例中，寡核苷酸不為反義寡核苷酸或核糖核酸酶。在一實施例中，P₁ 富含A及T。在另一實施例中，P₁ 包括至少4個T。在另一實施例中，P₂ 為完全迴文。在另一實施例中，P₂ 富含G-C。在又一實施例中，P₂ 為CGGCGCX₁ GCGCCG，其中X₁ 為T或不存在。

在一實施例中，寡核苷酸包括至少一個硫代磷酸酯鍵。在另一實施例中，寡核苷酸之所有核苷酸間鍵均為硫代磷酸酯鍵。在另一實施例中，寡核苷酸包括至少一個磷酸二酯樣鍵。在另一實施例中，該磷酸二酯樣鍵為磷酸二酯鍵。在另一實施例中，親脂性基團與寡核苷酸結合。在一實施例中，該親脂性基團為膽固醇。

在一實施例中，用於本發明之CpG寡核苷酸為P類CpG寡核苷酸，其具有5' TLR活化域及至少兩個含有互補性之區域，即5'及3'含有互補性之區域，含有互補性之區域的長度各為至少8個核苷酸且直接或經由間隔基彼此連接，其中該寡核苷酸包括至少一個嘧啶-嘌呤(YpR)二核苷酸，且其中至少一個含有互補性之區域不為完全迴文。在一實施例中，寡核苷酸包括至少一個未經甲基化之CpG二核苷酸。在另一實施例中，TLR活化域為TCG、TTCG、TTTCG、TYpR、TTYpR、TTTYpR、UCG、UUCG、UUUCG、TTT或TTTT。在另一實施例中，TLR活化域在5'含有互補性之區域內。在另一實施例中，TLR活化域緊鄰5'含有互補性之區域的5'端。在另一實施例中，3'含有互補性之區域的長度為至少10個核苷酸。在又一實施例中，5'含有互補性之區域的長度為至少10個核苷酸。在一實施例中，3'含有互補性之區域包括一個未經甲基化之CpG二核苷酸。在另一實施例中，3'含有互補性之區域包括兩個未經甲基化之CpG二核苷酸。在又一實施例中，5'含有互補性之區域包括一個未經甲基化之CpG二核苷酸。在另一實施例中，5'含有互補性之區域包括兩個未經甲基化之CpG二核苷酸。在另一實施例中，含有互補性之區域包括至少一個核苷酸類似物。在另一實施例中，含有互補性之區域形成分子內雙鏈體。在一實施例中，該分子內雙鏈體包括至少一個非瓦生克立克鹼基對。在另一實施例中，該非瓦生克立克鹼基對為G-T、G-A、G-G或C-A。在一實施例中，含有互補性之區域形成分子間雙鏈體。在另一實施例中，至少一個分子間雙鏈體包括至少一個非瓦生克立克鹼基對。在另一實施例中，該非瓦生克立克鹼基對為G-T、G-A、G-G或C-A。在又一實施例中，含有互補性之區域含有一個錯配。在又一實施例中，含有互補性之區域含有兩個錯配。在另一實施例中，含有互補性之區域含有一個間插核苷酸。在另一實施例中，含有互補性之區域含有兩個間插核苷酸。

在一實施例中，5'及3'含有互補性之區域的雙鏈體穩定性值為至少25。在另一實施例中，5'及3'含有互補性之區域的雙鏈體穩定性值為至少30。在另一實施例中，5'及3'含有互補性之區域的雙鏈體穩定性值為至少35。在另一實施例中，含有互補性之區域的雙鏈體穩定性值為至少40。在另一實施例中，含有互補性之區域的雙鏈體穩定性值為至少45。在另一實施例中，含有互補性之區域的雙鏈體穩定性值為至少50。在另一實施例中，含有互補性之區域的雙鏈體穩定性值為至少55。在另一實施例中，含有互補性之區域的雙鏈體穩定性值為至少60。在另一實施例中，含有互補性之區域的雙鏈體穩定性值為至少65。

在另一實施例中，兩個含有互補性之區域直接連接。在另一實施例中，兩個迴文區域經由3'-3'鍵連接。在又一實施例中，兩個含有互補性之區域有一個核苷酸重疊。在另一實施例中，兩個含有互補性之區域有兩個核苷酸重疊。在另一實施例中，兩個含有互補性之區域不重疊。在另一實施例中，兩個含有互補性之區域由間隔基連接。在另一實施例中，該間隔基為長度為1-50個核苷酸之核酸。在另一實施例中，間隔基為長度為1個核苷酸之核酸。在一實施例中，間隔基為非核苷酸間隔基。在另一實施例中，該非核苷酸間隔基為D-間隔基。在又一實施例中，非核苷酸間隔基為連接子。

在一實施例中，P類寡核苷酸具有式5' XNSPT 3'，其中X為TLR活化域，N為不完全迴文，P為迴文，S為間隔基，且T為長度為0-100個核苷酸之3'尾。在另一實施例中，X為TCG、TTCG或TTTCG。在另一實施例中，T之長度為5-50個核苷酸。在另一實施例中，T之長度為5-10個核苷酸。在另一實施例中，S為長度為1-50個核苷酸之核酸。在另一實施例中，S為長度為1個核苷酸之核酸。在另一實施例中，S為非核苷酸間隔基。在另一實施例中，該非核苷酸間隔基為D-間隔基。在另一實施例中，非核苷酸間隔基為連接子。在另一實施例中，寡核苷酸不為反義寡核苷酸或核糖核酸酶。在另一實施例中，N富含A及T。在另一實施例中，N包括至少4個T。在另一實施例中，P為完全迴文。在另一實施例中，P富含G-C。在另一實施例中，P為CGGCGCX₁ GCGCCG，其中X₁ 為T或不存在。在另一實施例中，寡核苷酸包括至少一個硫代磷酸酯鍵。在另一實施例中，寡核苷酸之所有核苷酸間鍵均為硫代磷酸酯鍵。在另一實施例中，寡核苷酸包括至少一個磷酸二酯樣鍵。在另一實施例中，該磷酸二酯樣鍵為磷酸二酯鍵。在另一實施例中，親脂性基團與寡核苷酸結合。在一實施例中，該親脂性基團為膽固醇。

在一實施例中，本發明之「P類」CpG寡核苷酸具有以下核酸序列：5' TCGTCGACGATCGGCGCGCGCCG 3'(SEQ ID NO: 456)。

在該等序列中，所有鍵均可為硫代磷酸酯鍵。在另一實施例中，一或多個鍵可為磷酸二酯，較佳位於CpG基元之「C」與「G」之間，從而產生半軟CpG寡核苷酸。在任何此等序列中，乙基-尿苷或鹵素可取代5' T；鹵素取代之實例包括(但不限於)溴-尿苷或碘-尿苷取代。

P類寡核苷酸之一非限制性實例包括：5' T*C_G*T*C_G*A*C_G*A*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3'，其中*係指硫代磷酸酯鍵且_係指磷酸二酯鍵。

在一實施例中，本文所揭示之CpG寡核苷酸的所有核苷酸間鍵均為磷酸二酯鍵(「軟」寡核苷酸，如PCT申請案WO 2007/026190中所述)。在另一實施例中，使得本發明之CpG寡核苷酸抗降解(例如穩定化)。「穩定之寡核苷酸」係指相對地抗活體內降解(例如經由核酸外切酶或核酸內切酶)之寡核苷酸。核酸穩定亦可經由主鏈修飾來實現。具有硫代磷酸酯鍵之寡核苷酸提供最大活性且保護寡核苷酸不被細胞內核酸外切酶及核酸內切酶降解。

免疫刺激性寡核苷酸可具有嵌合主鏈，其具有磷酸二酯鍵與硫代磷酸酯鍵之組合。出於本發明之目的，嵌合主鏈係指部分穩定之主鏈，其中至少一個核苷酸間鍵為磷酸二酯或磷酸二酯樣鍵，且其中至少一個其他核苷酸間鍵為穩定之核苷酸間鍵，其中該至少一個磷酸二酯或磷酸二酯樣鍵與該至少一個穩定之鍵不同。如PCT申請案WO 2007/026190中所述，當磷酸二酯鍵優先位於CpG基元中時，該等分子被稱為「半軟」。

其他經修飾之寡核苷酸包括磷酸二酯鍵、硫代磷酸酯鍵、甲基膦酸酯鍵、甲基硫代磷酸酯鍵、二硫代磷酸酯鍵及/或p-乙氧基鍵之組合。

因為已報導硼烷膦酸酯鍵相對於磷酸二酯鍵為穩定的，所以出於主鏈之嵌合性質之目的，硼烷膦酸酯鍵可視上下文而分類為磷酸二酯樣鍵或穩定之鍵。舉例而言，在一些實施例中，本發明之嵌合主鏈可包括至少一個磷酸二酯(磷酸二酯或磷酸二酯樣)鍵及至少一個硼烷膦酸酯(穩定之)鍵。在其他實施例中，本發明之嵌合主鏈可包括硼烷膦酸酯(磷酸二酯或磷酸二酯樣)及硫代磷酸酯(穩定之)鍵。「穩定之核苷酸間鍵」應意謂與磷酸二酯核苷酸間鍵相比相對地抗活體內降解(例如經由核酸外切酶或核酸內切酶)之核苷酸間鍵。較佳穩定之核苷酸間鍵包括(但不限於)硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯及甲基硫代磷酸酯。其他穩定之核苷酸間鍵包括(但不限於)肽、烷基、去磷及如上文所述之其他鍵。

可使用自動化技術，採用胺基磷酸酯或H-膦酸酯化學法來合成經修飾之主鏈(諸如硫代磷酸酯)。芳基-膦酸酯及烷基-膦酸酯可例如如美國專利第4,469,863號中所述製備；且烷基磷酸三酯(其中帶電氧部分經烷基化，如美國專利第5,023,243號及歐洲專利第092,574號中所述)可藉由自動化固相合成，使用市售試劑來製備。進行其他DNA主鏈修飾及取代之方法已有所描述。Uhlmann E等人(1990)Chem Rev 90:544；Goodchild J(1990)Bioconjugate Chem 1:165。製備嵌合寡核苷酸之方法亦為已知。舉例而言，頒予Uhlmann等人之專利已描述該等技術。

混合型主鏈經修飾之ODN可如PCT申請案WO 2007/026190中所述合成。

本發明之寡核苷酸亦可包括其他修飾。此等修飾包括(但不限於)非離子性DNA類似物，諸如烷基-磷酸酯及芳基-磷酸酯(其中帶電膦酸酯氧由烷基或芳基置換)、磷酸二酯及烷基磷酸三酯(其中帶電氧部分經烷基化)。在任一端或兩端含有二醇(諸如四乙二醇或六乙二醇)之核酸亦顯示實質上抗核酸酶降解。

CpG寡核苷酸之尺寸(亦即沿寡核苷酸之長度的核苷酸殘基數目)亦可有助於寡核苷酸之刺激活性。為促進吸收至細胞中，本發明之CpG寡核苷酸的最小長度較佳為6個核苷酸殘基。若存在足夠免疫刺激性基元，則任何尺寸大於6個核苷酸(甚至許多個kb長)之寡核苷酸均能夠誘導免疫反應，因為較大寡核苷酸在細胞內降解。在某些實施例中，CpG寡核苷酸之長度為6至100個核苷酸，較佳長度為8至30個核苷酸。在重要實施例中，本發明之核酸及寡核苷酸不為質體或表現載體。

在一實施例中，本文所揭示之CpG寡核苷酸包含取代或修飾，諸如如WO 2007/026190之第134至147段中所述的鹼基及/或糖中之取代或修飾。

在一實施例中，本發明之CpG寡核苷酸以化學方式經修飾。化學修飾之實例為熟習此項技術者所已知且例如描述於Uhlmann E.等人(1990),Chem. Rev. 90:543,S. Agrawal編，Humana Press,Totowa,USA 1993；Crooke,S.T.等人(1996) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 36:107-129；及Hunziker J.等人，(1995),Mod. Synth. Methods 7:331-417中。本發明之寡核苷酸可具有一或多種修飾，其中與由天然DNA或RNA構成之具有相同序列的寡核苷酸相比，修飾各位於特定磷酸二酯核苷間橋及/或特定β-D-核糖單元及/或特定天然核苷鹼基位置。

在本發明之一些實施例中，可根據熟習此項技術者已知之方法，使含有CpG之核酸僅與免疫原性載體混合(例如參見WO 03/024480)。

在本發明之一特定實施例中，本文所揭示之任一疫苗包含2 μg至100 mg CpG寡核苷酸，較佳0.1 mg至50 mg CpG寡核苷酸，較佳0.2 mg至10 mg CpG寡核苷酸，較佳0.3 mg至5 mg CpG寡核苷酸，較佳0.3 mg至5 mg CpG寡核苷酸，甚至較佳0.5 mg至2 mg CpG寡核苷酸，甚至較佳0.75 mg至1.5 mg CpG寡核苷酸。在一較佳實施例中，本文所揭示之任一疫苗包含約1 mg CpG寡核苷酸。

在本發明之一些實施例中，可根據熟習此項技術者已知之方法，使含有CpG之核酸僅與免疫原性載體混合(例如參見WO 03/024480)。在本發明之其他實施例中，含有CpG之核酸可封閉於VLP中(例如參見WO 03/024481)。

在本發明之情形下，較佳佐劑包括明礬；含有CpG之寡核苷酸，較佳為CpG 7909(SEQ ID NO: 433)及CpG24555(SEQ ID NO: 431)；及基於皂苷之佐劑，較佳為Iscomatrix，其可單獨使用或組合使用。較佳地，該含有CpG之核酸包含一或多個經修飾之鍵，較佳為一或多個硫代磷酸酯鍵，甚至更佳地，寡核苷酸之所有核苷酸間鍵均為硫代磷酸酯鍵。

因此，本發明提供一種免疫原性組合物，其包含抗原性IgE肽，該抗原性IgE肽較佳包含選自由SEQ ID No: 1至430組成之群的胺基酸序列，更佳選自由SEQ ID No: 1至153及220至430組成之群的胺基酸序列，甚至更佳選自由SEQ ID No: 220至430組成之群的胺基酸序列；及至少一種佐劑。該抗原性IgE肽較佳連接於如本文所揭示之免疫原性載體，較佳為VLP，更佳為HBsAg、HBcAg或Qβ VLP。在一實施例中，該佐劑為基於皂苷之佐劑，較佳為Iscomatrix。在另一實施例中，該佐劑為明礬。在又一實施例中，該佐劑為含有CpG之核酸。該佐劑較佳為CpG7909。該佐劑更佳為CpG24555。較佳地，該含有CpG之核酸包含一或多個經修飾之鍵，較佳為一或多個硫代磷酸酯鍵，甚至更佳地，寡核苷酸之所有核苷酸間鍵均為硫代磷酸酯鍵。

在又一實施例中，該至少一種佐劑包含兩種佐劑，較佳選自由明礬、基於皂苷之佐劑及含有CpG之核酸組成之群。在一較佳實施例中，該等佐劑為明礬及含有CpG之核酸(較佳為CpG7909或CpG24555，更佳為CpG24555)。較佳地，該含有CpG之核酸包含一或多個經修飾之鍵，較佳為一或多個硫代磷酸酯鍵，甚至更佳地，寡核苷酸之所有核苷酸間鍵均為硫代磷酸酯鍵。在另一較佳實施例中，該等佐劑為基於皂苷之佐劑(較佳為Iscomatrix)及含有CpG之核酸(較佳為CpG7909，更佳為CpG24555)。較佳地，該含有CpG之核酸包含一或多個經修飾之鍵，較佳為一或多個硫代磷酸酯鍵，甚至更佳地，寡核苷酸之所有核苷酸間鍵均為硫代磷酸酯鍵。在另一較佳實施例中，該等佐劑為明礬及基於皂苷之佐劑(較佳為Iscomatrix)。

在又一實施例中，該至少一種佐劑包含三種佐劑，較佳選自由明礬、基於皂苷之佐劑(較佳為Iscomatrix)及含有CpG之核酸(更佳為CpG7909，甚至更佳為CpG24555)組成之群。較佳地，該含有CpG之核酸包含一或多個經修飾之鍵，較佳為一或多個硫代磷酸酯鍵，甚至更佳地，寡核苷酸之所有核苷酸間鍵均為硫代磷酸酯鍵。

本發明之醫藥組合物

本發明亦提供醫藥組合物，其包含本發明之抗原性IgE肽或其免疫原性組合物，該肽在與一或多種醫藥學上可接受之賦形劑締合及視情況與一或多種佐劑(如上文所述之佐劑)組合之調配物中。術語「賦形劑」在本文中用於描述除活性成份(亦即最後與免疫原性載體偶合及視情況與一或多種佐劑組合之本發明之抗原性IgE肽)外之任何成份。賦形劑之選擇將在很大程度上視諸如特定投藥方式、賦形劑對溶解性及穩定性之作用及劑型之性質的因素而定。如本文中所使用，「醫藥學上可接受之賦形劑」包括任何及所有溶劑、分散介質、塗料、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延緩劑及生理學上相容之類似物。醫藥學上可接受之賦形劑的一些實例為水、生理食鹽水、磷酸鹽緩衝生理食鹽水、右旋糖、甘油、乙醇及其類似物以及其組合。在多數情況下，較佳該組合物中包括等張劑，例如糖、多元醇(諸如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化鈉。醫藥學上可接受之物質的其他實例為濕潤劑或少量助劑物質，諸如濕潤劑或乳化劑、防腐劑或緩衝液，其增加活性成份之存放期或增強活性成份之有效性。

本發明之醫藥組合物及其製備方法對於熟習此項技術者為顯而易知。該等組合物及其製備方法可見於例如Remington’s Pharmaceutical Sciences ，第19版(Mack Publishing Company,1995)中。醫藥組合物較佳在GMP條件下製造。

本發明之醫藥組合物可以單一單位劑量形式或以多數單一單位劑量形式整批製備、包裝或出售。如本文中所使用，「單位劑量」為包含預定量活性成份之醫藥組合物的個別量。活性成份之量一般等於向個體投與之活性成份的劑量或該劑量之合適部分(例如該劑量之一半或三分之一)。

此項技術所接受之任何投與肽或蛋白質的方法均可適當地用於本發明之肽或蛋白質。

本發明之醫藥組合物通常適於非經腸投與。如本文中所使用，醫藥組合物之「非經腸投與」包括任何特徵在於物理破壞個體之組織及經由該組織之破口投與醫藥組合物，由此一般導致直接投入血流、肌肉或內臟器官中之投藥途徑。因此，非經腸投藥包括(但不限於)藉由注射組合物、經由手術切口施用組合物、經由組織刺穿非手術創口施用組合物及其類似方式投與醫藥組合物。非經腸投藥特別包括(但不限於)皮下、腹膜內、肌肉內、胸骨內、靜脈內、動脈內、鞘內、室內、尿道內、顱內、滑膜內注射或輸注；及腎滲析輸注技術。較佳實施例包括靜脈內、皮下、皮內及肌肉內途徑，甚至更佳實施例為肌肉內或皮下途徑。

適於非經腸投與之醫藥組合物的調配物通常一般包含活性成份與醫藥學上可接受之載劑(諸如滅菌水或滅菌等張鹽水)組合。該等調配物可以適於大丸劑(bolus)投藥或連續投藥之形式製備、包裝或出售。可注射調配物可以單位劑型製備、包裝或出售，諸如安甄或含有防腐劑之多劑量容器。用於非經腸投與之調配物包括(但不限於)懸浮液、溶液、於油性或水性媒劑中之乳液、糊劑及其類似物。該等調配物可進一步包含一或多種其他成份，包括(但不限於)懸浮劑、穩定劑或分散劑。在用於非經腸投與之調配物的一個實施例中，活性成份以乾燥(亦即粉末或顆粒)形式提供以在用適合媒劑(例如滅菌無熱原質水)復原之後非經腸投與復原組合物。非經腸調配物亦包括可含有諸如鹽、碳水化合物及緩衝劑之賦形劑的水溶液(較佳pH 3至9)，但對於一些應用，可更適當地調配為滅菌非水溶液或乾燥形式以與適合媒劑(諸如滅菌無熱原質水)結合使用。例示性非經腸投藥形式包括於滅菌水溶液(例如丙二醇水溶液或右旋糖水溶液)中之溶液或懸浮液。必要時，該等劑型可適當地緩衝處理。其他適用之可非經腸投與調配物包括呈微晶形式或脂質體製劑形式之包含活性成份的調配物。用於非經腸投與之調配物可調配成立即釋放及/或修飾釋放。修飾釋放調配物包括延遲釋放、持續釋放、脈衝釋放、控制釋放、靶向釋放及程控釋放(programmed release)。

舉例而言，在一態樣中，無菌可注射溶液可藉由將所需量之抗IgE肽(較佳與免疫原性載體偶合，最後與一或多種佐劑組合)併入具有一種上文所列舉之成份或上文所列舉之成份組合的適當溶劑中，根據需要隨後過濾滅菌來製備。一般藉由將活性化合物併入含有基礎分散介質及來自彼等上文所列舉之所需其他成份的無菌媒劑中來製備分散液。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉末的情況下，較佳製備方法為真空乾燥及凍乾，此自其先前無菌濾液得到活性成份加上任何其他所需成份之粉末。可例如藉由使用塗料(諸如卵磷脂)，藉由在分散液情況下維持所需粒徑及藉由使用界面活性劑來維持溶液之適當流動性。可注射組合物之長時期吸收可藉由在該組合物中包括延緩吸收之藥劑(例如單硬脂酸鹽及明膠)來實現。

本發明之例示性、非限制性醫藥組合物為呈無菌水溶液之調配物，其pH值在約5.0至約6.5之範圍內且包含約0.1 mg/mL至約20 mg/mL本發明之肽、約1毫莫耳至約100毫莫耳組胺酸緩衝液、約0.01 mg/mL至約10 mg/mL聚山梨醇酯80、約100毫莫耳至約400毫莫耳海藻糖及約0.01毫莫耳至約1.0毫莫耳二水合乙二胺四乙酸二鈉。

本發明之抗原性IgE肽亦可經鼻內投與或藉由吸入來投與，通常以乾粉形式(單獨，以混合物形式，或以混合組份粒子形式，例如與合適之醫藥學上可接受之賦形劑混合)自乾粉吸入器來投與，在使用或不使用合適之推進劑的情況下以氣溶膠噴霧形式自加壓容器、泵、噴霧器、霧化器(較佳為利用電流體動力學來產生細霧之霧化器)或噴灑器來投與，或以滴鼻劑形式投與。

該加壓容器、泵、噴霧器、霧化器或噴灑器一般含有本發明之抗體的溶液或懸浮液，其包含例如適合於分散、溶解活性物質或延長活性物質釋放之藥劑，作為溶劑之推進劑。

在以乾粉或懸浮液調配物形式使用之前，一般將藥品微米尺寸化至適合於藉由吸入傳遞之尺寸(通常小於5微米)。此可藉由任何適當磨碎方法來達成，諸如螺旋噴射研磨、流體床噴射研磨、形成奈米粒子之超臨界流體處理、高壓均質化或噴霧乾燥。

用於吸入器或吹入器之膠囊、發泡藥及藥筒可調配成含有本發明之化合物、合適之粉末基劑及效能調節劑的粉末混合物。

適合用於利用電流體動力學來產生細霧之霧化器的溶液調配物可含有適合每次致動劑量之本發明之抗原性IgE肽且致動體積可例如在1 μL至100 μL之範圍內變化。

可將合適之芳香劑(諸如薄荷腦及左旋薄荷腦)或甜味劑(諸如糖精或糖精鈉)添加至欲用於吸入/鼻內投與之本發明之調配物中。

用於吸入/鼻內投與之調配物可調配成立即釋放及/或修飾釋放。修飾釋放調配物包括延緩釋放、持續釋放、脈衝釋放、控制釋放、靶向釋放及經規劃釋放。

在乾粉吸入器及氣溶膠之情況下，藉助於傳遞計量之量的閥門來確定劑量單位。本發明之單位通常配置成投與定劑量或「噴一次劑量」之本發明之抗體。總日劑量通常將以單次劑量投與或更通常以分次劑量全天投與。

包含抗原性IgE肽之醫藥組合物亦可經調配用於經口途徑投藥。經口投藥可包括吞咽，以致化合物進入胃腸道中；及/或頰內、經舌或舌下投藥，藉此化合物直接自口腔進入血流中。

適合於經口投與之調配物包括固體、半固體及液體系統，諸如錠劑；含有多微粒或奈米微粒、液體或粉末之軟膠囊或硬膠囊；口含錠(填有液體)；咀嚼片；凝膠；快速分散劑型；薄膜；卵形栓劑(ovule)；噴霧劑；及頰內/黏膜黏附貼片。

液體調配物包括懸浮液、溶液、糖漿及酏劑。該等調配物可以軟膠囊或硬膠囊(例如由明膠或羥丙基甲基纖維素製成)中之填充劑形式使用且通常包含載劑(例如水、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、甲基纖維素或合適之油)及一或多種乳化劑及/或懸浮劑。液體調配物亦可藉由復原固體(例如來自藥囊)來製備。

本發明之組合物可用於藉由用免疫療法刺激處於罹患IgE介導性病症或症狀之風險中的個體免疫反應來治療、減輕或預防該個體之該等病症或症狀。免疫療法可包含初始免疫，隨後為另外(例如一次、兩次、三次或三次以上)加強免疫。

本發明之抗原性IgE肽或其組合物的「免疫有效量」為以單次劑量形式或以一系列之一部分形式傳遞至哺乳動物個體之量，該量可有效誘導該個體針對IgE之免疫反應。此量視欲治療個體之健康及身體狀況、欲治療個體之分類群、個體免疫系統合成抗體之能力、疫苗之調配物及其他相關因素而變化。預期該量將在相對寬之範圍內，此可經由常規試驗來測定。

「醫藥學上有效之劑量」或「治療有效劑量」為治療或預防或減輕個體之一或多種IgE相關病症或症狀所需的劑量。該醫藥學上有效之劑量視欲投與之特定化合物、症狀之嚴重程度、個體對副作用之敏感性、疾病類型、所用組合物、投藥途徑、所治療哺乳動物之類型、值得考慮的特定哺乳動物之身體特徵(諸如健康及身體狀況)、共存藥物療法、個體免疫系統合成抗體之能力、所需預防程度及熟習醫學技術者將認識到之其他因素而定。出於預防目的，選擇各劑量中之肽量為誘導典型接種疫苗者之免疫保護反應而無顯著不良副作用之量。在初始接種疫苗後，個體可接受一或若干次適當間隔之加強免疫作用。

應瞭解用於任何特定患者之特定劑量視多種因素而定，包括所用特定化合物之活性、年齡、體重、一般健康狀況、性別、飲食、投藥時間、投藥途徑及排泄率、藥物組合及進行治療之特定疾病的嚴重程度。

舉例而言，本發明之抗原性IgE肽或醫藥組合物可以約0.1 μg至約200 mg之劑量向個體投與，例如約0.1 μg至約5 μg、約5 μg至約10 μg、約10 μg至約25 μg、約25 μg至約50 μg、約50 μg至約100 μg、約100 μg至約500 μg、約500 μg至約1 mg、約 1mg至約2 mg，其中視情況在隨後例如1週、2週、3週、4週、2個月、3個月、6個月及/或1年給與加強免疫。

在一些實施例中，投與單次劑量之本發明之抗原性IgE肽或醫藥組合物。在其他實施例中，投與多次劑量之本發明之抗原性IgE肽或醫藥組合物。投藥頻率可視多種因素中之任一者而變化，例如症狀之嚴重程度、所需免疫保護程度、組合物用於預防性目的或是治癒性目的等。舉例而言，在一些實施例中，如下投與本發明之抗原性IgE肽或醫藥組合物：每月一次、每月兩次、每月三次、每隔一週(qow)、每週一次(qw)、每週兩次(biw)、每週三次(tiw)、每週四次、每週五次、每週六次、每隔一日(qod)、每日(qd)、每日兩次(qid)或每日三次(tid)。當本發明之組合物用於預防目的時，其一般將以初次劑量與加強劑量投與。預期加強劑量將適當地間隔，或較佳每年給與或以使得循環抗體之含量降至所需含量之下的次數給與。加強劑量可由抗原性IgE肽組成而無原始免疫原性載體分子。該等加強構築體可包含替代性免疫原性載體或可無任何載劑。該等加強組合物可在佐劑存在或不存在下進行調配。

投與本發明之抗原性IgE肽的持續時間(例如投與抗原性IgE肽所經時段)可視多種因素(例如患者反應等)中之任一者而變化。舉例而言，抗原性IgE肽可經如下範圍之時段投與：約1日至約1週、約2週至約4週、約1個月至約2個月、約2個月至約4個月、約4個月至約6個月、約6個月至約8個月、約8個月至約1年、約1年至約2年、或約2年至約4年或更長時間。

本發明亦涵蓋各種治療方法，該等方法包含投與本發明之抗原性IgE肽。本發明治療方法包括誘導個體對自體IgE之免疫反應的方法，及預防、減輕或治療個體之IgE介導性病症或症狀的方法。

在一態樣中，本發明提供一種治療、預防或減輕個體之IgE相關病症或症狀的方法，其包含向該個體投與治療有效量之本發明之抗原性IgE肽或其免疫原性或醫藥組合物。

在另一態樣中，本發明提供一種針對自體IgE誘導個體之免疫反應的方法，其包含向該個體投與治療有效或免疫有效量之本發明之抗原性IgE肽或其免疫原性或醫藥組合物。

「治療」係指減輕或消除生物學病症及/或其至少一種伴隨症狀之方法。如本文中所使用，「減輕」疾病、病症或病狀意謂降低該疾病、病症或病狀之症狀的嚴重程度及/或出現頻率。此外，本文中提及「治療」包括提及治癒性、緩解性及預防性處理。該個體較佳為人類且可為任何年齡之男性或女性。

本發明之其他態樣係關於本發明之抗原性IgE肽或其免疫原性組合物或醫藥組合物，其用作藥劑，較佳用於治療、減輕或預防IgE相關病症。

在另一態樣中，本發明提供本發明之抗原性IgE肽或其免疫原性組合物或醫藥組合物的用途，其用於製造較佳用於治療IgE介導性病症的藥劑。

在本發明之用途或方法的一些態樣中，該IgE介導性病症係選自由以下組成之群：結膜炎、過敏性哮喘、過敏性鼻炎、異位性皮膚炎、重度過敏、哮喘、接觸性皮膚炎、過敏性胃腸病、過敏性肺麴菌病、過敏性紫癜、濕疹、高IgE(喬布氏)症候群、過敏性過敏反應、IgE骨髓瘤、發炎性腸病(例如克羅恩氏病(Crohn's disease)、食物過敏、潰瘍性結腸炎、未定型結腸炎且傳染性結腸炎)、蕁麻疹、牛皮癬，較佳選自由哮喘、過敏性哮喘、過敏性鼻炎及食物過敏組成之群。

哮喘係氣管之慢性發炎性病症，其引起敏感性個體之喘鳴、氣喘(breathlessness)、胸悶及/或咳嗽的復發性事件。熟習此項技術者可區分出各種類型之哮喘，包括：過敏性哮喘，其被認為出現在已對環境過敏原產生過敏反應之患者中；藥物誘發性哮喘，通常由對阿司匹靈(aspirin)或其他COX抑制劑之敏感性而引發；運動誘發性哮喘；瀕死性及超急性哮喘；夜間哮喘；職業性哮喘，一般由在工作場所接觸某些化學品引起。因此，哮喘可由多種刺激引發，包括：空浮過敏原，諸如塵蟎、花粉、動物皮屑、真菌孢子、羽毛...(外因性哮喘)；非特定刺激，諸如菸草煙霧、化學燃料、污染、二氧化硫...(內因性哮喘)。

過敏性鼻炎一般包括許多症狀，包括主要位於鼻、鼻竇及眼睛處之發炎性症狀，其在接觸空浮粒子後出現。症狀包括打噴嚏；鼻塞；流涕(及有時流鼻血)；咳嗽；頭痛；接觸過敏原之鼻、口、眼睛、喉嚨、皮膚或任何區域發癢；嗅覺功能受損(及因此對芳香劑敏感)；鼻子不通氣(鼻充血)；結膜炎；流眼淚(watering eye)；喉嚨痛；及喘鳴。

過敏性鼻炎可為常年性及/或季節性的。常年性過敏性鼻炎為持續一整年之過敏性鼻炎。其通常由連續接觸諸如動物皮屑、室內黴菌孢子或室內塵蟎之過敏原引起。季節性過敏性鼻炎為僅出現在一年之某些時間內的過敏性鼻炎。其通常由對季節性產生之樹、草及野草花粉的過敏引起。

食物過敏為由雞蛋、花生、牛奶或一些其他特定食物引發之過度免疫反應。任何食物均可引起過敏反應，但少數食物為罪魁禍首。在兒童中，最常見食物過敏為雞蛋、花生、牛奶、大豆、堅果(tree nuts)、小麥、貝類(蝦、蟹、龍蝦、蝸牛、蛤蜊)。在大齡兒童及成人中，最常見食物過敏為：花生、堅果、貝類、魚類。症狀可主要限於胃及腸道，或在消化或吸收食物後可涉及身體許多部分。症狀可包括：喉嚨沙啞、重度過敏(會導致死亡之重度全身過敏反應)；腹痛；腹瀉；噁心；嘔吐；胃痙攣；口、喉嚨、眼睛、皮膚或任何區域發癢；蕁麻疹；血管性水腫(腫脹，尤其眼瞼、面部、唇及舌)；頭暈目眩或昏厥；鼻充血；流涕；呼吸急促；喘鳴；吞咽困難；口腔過敏症候群。該口腔過敏症候群一般包含唇、舌及喉嚨發癢，及有時唇腫。

在本發明之用途或方法的其他態樣中，該個體為哺乳動物，較佳為人類個體。

在本發明之用途或方法的其他態樣中，該個體罹患該IgE介導性病症。或者，該個體處於罹患該IgE介導性病症之風險中。

實例

提出以下實例以便提供一般熟習此項技術者如何進行及使用本發明之完整的揭示及描述，且不欲限制發明者視為其發明之範疇，其亦不欲表示以下實驗為所執行之全部或唯一實驗。已努力確保所用數字(例如量、溫度等)之準確度，但應考慮一些實驗誤差及偏差。除非另外指示，否則份數為重量份，分子量為重量平均分子量，溫度以℃計，且壓力為大氣壓或接近大氣壓。可使用標準縮寫，例如：bp，鹼基對；kb，千鹼基；pl，皮升；s或sec，秒；min，分鐘；h或hr，小時；aa，胺基酸；kb，千鹼基；bp，鹼基對；nt，核苷酸；i.m.，肌肉內(經肌肉內)；i.p.，腹膜內(經腹膜內)；s.c.，皮下(經皮下)；及其類似縮寫。

實例1.選擇抗原性IgE肽

人類IgE之與IgE高親和力受體FceRI α次單元相互作用之恆定域CH3-CH4的結構已解出及公開(Wurzburg BA等人，(2000) Immunity,I3(3),375-85；Garman SC等人，(2000)Nature 20,406(6793),259-66)。此結構資訊與提出兩個區域發生結合之文獻一起使用以將4個潛在環鑑別為關鍵相互作用點且設計以下4種對應於對於IgE-FceRI相互作用為重要之區域的肽(參見圖1)。

紫色肽：ADSNPRGVSAYLSRPSP(SEQ ID No: 312)、藍色肽：LVVDLAPSKGTVN(SEQ ID No: 165)、橙色肽：STRKEEKQRNGTLTVTSTLP(SEQ ID No: 1)、黃色肽：QCRVTHPHLPRALMRS(SEQ ID No: 220)。

實例2-製備紫色肽-VLP結合物

使用標準Fmoc方案，在CLEAR醯胺樹脂上合成出於結合目的而添加末端半胱胺酸殘基之紫色肽(SEQ ID No: 312)(序列ADSNPRGVSAYLSRPSPC(SEQ ID No: 434))。在HOBt(羥基苯并三唑)及NMM(N-甲基嗎啉)存在下使用5倍過量之經1當量HBTU(六氟磷酸2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基)活化的受Fmoc保護之胺基酸進行胺基酸偶合反應。用20%哌啶/DMF脫除Fmoc基團。接著裂解結合樹脂之肽且同時用試劑D(TFA/H₂ O/DODT：89/3/8)移除側鏈保護基。該肽製備成具有游離N端及醯胺化C端。藉由HPLC，使用BEH 130 C18管柱及水/乙腈梯度，在0.1% TFA存在下純化粗肽至均質。使用凍乾器真空乾燥經純化之肽。使用質譜分析法(LC-MS)分析該肽且得到令人滿意的數據(參見下文)。

在兩個獨立結合實驗中使紫色肽+半胱胺酸(SEQ ID NO: 434)與病毒樣粒子(VLP)Qβ及B型肝炎表面抗原(HBsAg)結合。用於此研究中之Qβ係藉由在併有編碼14 kD單體蛋白質之pET28質體的BL21(DE3)菌株中細菌大腸桿菌醱酵來製造：MAKLETVTLGNIGKDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVPALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQAYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY(SEQ ID NO: 435)。在0.8之OD600下用IPTG誘導該醱酵且使其在具有卡那黴素(kanamycin)之極品肉湯(terrific broth，TB)中繼續下去隔夜。接著使用專利申請案EP20050105513中所述之方法，自醱酵細胞顆粒純化在宿主細胞中自組裝之VLP，以下為不同之處：在細胞破碎後，用50%飽和硫酸銨處理澄清之勻漿且藉由離心回收細胞顆粒。接著將該顆粒再溶解於HEPES緩衝液中且相對於HEPES緩衝液進行透析，隨後進行公開方法中之第一管柱步驟。在離子交換柱及羥磷灰石管柱步驟後，使用另一陰離子交換柱步驟純化物質且無菌過濾，產生最終VLP塊狀物質，藉由尺寸排阻層析、SDS-PAGE及電子顯微術進行分析，得到可接受之結果。

用於此研究中之HBsAg(亞類adw)係購自Aldevron(ND,USA)。HBsAg以直徑約22 nm之球狀粒子形式存在，其由包埋於脂質雙層小泡中之24 kD單體蛋白質之多個複本組成。用於製造此類型之HBsAg的釀酒酵母(S. Cerevisiae )菌株亦購自ATCC菌種保藏中心。

使用N-γ-順丁烯二醯亞胺基-丁醯氧基-丁二醯亞胺酯(GMBS)連接試劑活化VLP(Qβ與HBsAg)。將GMBS試劑溶解於二甲亞碸(DMSO)中且以10倍莫耳過量添加至VLP溶液中。使活化反應進行30分鐘且接著使用NAP-25除鹽管柱，於具有5 mM EDTA之杜爾貝科磷酸鹽緩衝生理食鹽水(Dulbeccos Phosphate Buffered Saline，DPBS)中使溶液除鹽。必要時，在下一結合反應之前，使用10 kD旋轉微量濃縮器略微濃縮蛋白質溶液。

在結合反應之前，將紫色肽溶解於具有5 mM EDTA作為添加劑之pH 7.4 DPBS的等分試樣中。該呈溶液狀態之肽的濃度為10 mg/ml。將溶解之肽添加至已用含有5 mM EDTA之DPBS洗滌的經TCEP固定之還原劑(Pierce Chemical)之等分試樣中。藉由在TCEP凝膠存在下混合，將肽之等分試樣培育約1小時，此後在microfuge中離心該等分試樣且丟棄固體顆粒。將經還原之含肽上清液直接添加至早已製備好之活化VLP中。

在極平緩混合下，使VLP與經還原之肽之間的反應進行至少30分鐘。在反應時間結束時，使用NAP-10或NAP-25除鹽管柱(GE Healthcare)，於杜爾貝科PBS(DPBS)中使各樣品除鹽。使用Bradford(庫馬斯亮藍(Coomassie Brilliant Blue)，Pierce Chemical)檢定以及藉由SDS-PAGE及尺寸排阻層析來分析經除鹽之結合肽的蛋白質含量。使用0.22 μm過濾器對結合產物進行無菌過濾且儲存於2-8℃下直至使用之時。在儲存期間小心注意此等樣品以防止冷凍或暴露於極端溫度。

使用SDS-PAGE量測兩種VLP-肽樣品之結合程度，且觀察到兩種樣品之分子量增加，此與將肽添加至VLP蛋白單體中一致。另外，在HPLC尺寸排阻層析檢定(使用Tosoh PWXL5000 HPLC管柱)中測試Qβ-肽樣品且當與未結合之VLP樣品相比時發現其含有經組裝之VLP。此外，利用電子顯微術，使用JEOL 1230 TEM，以80 kV光束觀察Qβ-肽樣品，且發現其含有經組裝之均勻粒子。使用非還原SDS-PAGE測試HBsAg-肽結合物粒子之完整性且因為蛋白質不進入凝膠中，所以認為樣品含有高分子質量物質且適合活體內使用。

實例3.製備橙色肽、紫色肽、黃色肽及藍色肽-VLP結合物以及紫色限制肽及藍色改良肽-VLP結合物

根據此項技術中已知之方法及主要根據如下實例2中之方案來合成黃色肽、藍色肽+半胱胺酸、紫色肽+半胱胺酸及橙色肽+半胱胺酸，其胺基酸序列在表2中指示。在Symphony肽合成器上，使用標準Fmoc方案，在CLEAR醯胺樹脂上合成該等肽，除了在預裝填之Fmoc-Ser(tBU)-王氏樹脂(Wang resin)上製備黃色肽。關於偶合反應及脫除保護基之詳情，請參見實例2。所有肽均製備成具有游離N端及醯胺化C端，除了黃色肽製備成具有乙醯化N端及羧化C端。如實例2中，在HPLC系統上，用BEH 130 C18管柱純化粗肽。使用凍乾器真空乾燥經純化之肽。最後，用LC-MS分析肽且所有肽均得到令人滿意的數據(參見下表3)。

由CEM Corporation(Matthews,NC,USA)製造藍色改良肽及紫色限制肽。使用標準肽化學技術製造該等肽且使用層析進行純化。使用LC-MS分析經純化之肽且發現具有高純度(>95%)(參見下表3)。

下劃線表示用於結合目的之半胱胺酸殘基且雙下劃線表示GC連接子。

分批使各肽與病毒樣粒子(VLP)Qβ結合。如實例2中，用於此研究中之Qβ係藉由細菌大腸桿菌醱酵及大批純化來製造。

如以上實例2中所述，使用來自Pierce Chemical之N-γ-順丁烯二醯亞胺基丁醯氧基-丁二醯亞胺酯(GMBS)連接試劑活化VLP(根據Bradford檢定，蛋白質濃度>1 mg/ml)。

在結合反應之前，將各肽溶解於具有5 mM EDTA作為添加劑之pH 7.4杜爾貝科磷酸鹽緩衝生理食鹽水(DPBS)的等分試樣中。呈溶液狀態之各肽的濃度在8-12 mg/ml範圍內，關於精確數據請參見下表4。如以上實例2中所述，將溶解了的肽添加至經TCEP固定之還原劑的等分試樣中。將經還原之含肽上清液直接添加至早已製備好之活化VLP中。

在極平緩混合下，使VLP與經還原之肽之間的反應進行至少30分鐘。在反應時間結束時，使用NAP-10或NAP-25除鹽管柱(GE Healthcare)，於杜爾貝科PBS(DPBS)中使各樣品除鹽。接著使用10 kD MWCO旋轉濃縮器來濃縮經除鹽之結合肽，且使用Bradford(庫馬斯亮藍，Pierce Chemical)檢定以及藉由SDS-PAGE及尺寸排阻層析來分析蛋白質含量，欲知詳情參見下文。使用0.22 μm過濾器對結合產物進行無菌過濾且儲存於2-8℃下直至使用之時。在儲存期間小心注意此等樣品以防止冷凍或暴露於極端溫度。如以上實例2中所述，分析VLP-肽結合物之結合及粒子組裝的程度(SDS-PAGE，包括密度測定法、電子顯微術及尺寸排除HPLC)。

*如藉由SDS-PAGE及密度測定計算所測定

實例4：製備橙色肽、紫色肽、黃色肽及藍色肽-KLH結合物以及紫色限制肽及藍色改良肽-KLH結合物

如下使表2之肽與購自Pierce Chemical(Rockford,Illinois,USA)之KLH結合且純化。如以上實例2及3中所詳述製備該等肽。所用KLH為由Pierce Chemical以凍乾固體形式供應之Imject經順丁烯二醯亞胺活化之KLH。在添加肽之前，用組織培養級水復原具有此KLH之小瓶。如以上實例2及3中所述，用TCEP凝膠處理肽且將經還原之含肽上清液直接添加至活化KLH溶液之等分試樣中並在平緩混合下培育。使偶合反應進行2小時，此時離心溶液以移除固體且如前述使用重力滴液除鹽管柱進行除鹽。藉由SDS-PAGE、Bradford蛋白質檢定及胰蛋白酶消化、隨後MS-MALDI分析來分析經除鹽之結合物。使用0.22 μm過濾器對結合物進行無菌過濾且保持於2-8℃下直至使用之時，不推薦冷凍KLH溶液。

實例5. IgE肽鑑別

此研究之目的在於評估與Qβ VLP結合之肽(如以上實例2及3中所詳述)如何有效誘導可結合於人類IgE之抗體反應。在第0、19及34天，藉由肌肉內途徑注射雌性Balb/c(6-8週)(將50微升體積注入各脛前肌中)。在第46天進行屍檢。屍檢時，藉由心臟穿刺，自安樂死之小鼠取得400-600微升血液樣品。使血液凝結隔夜且次日收集血清。

針對一些或所有以下檢定研究免疫動物之抗體反應：a)IgG效價測定、b)與血清游離IgE結合、c)與結合FceRI之IgE結合、d)去顆粒檢定及e)IgE定量檢定。

a)總IgG效價測定

概述： 比色ELISA，其產生用來表示對疫苗具有特異性之總IgG分子含量的倒數效價(reciprocal titer，RT)。由血清樣品製備連續稀釋液且在檢定中測試。使用由混合之接種Ce3的小鼠血清樣品製備之血清樣品作為陽性對照組。使用來自Harlan Labs之Balb/c陰性血清作為陰性對照組(自400隻動物混合，Harlan laboratories編號R-0131D)。塗布檢定板： 用每孔25 μL以0.01 M PBS(pH 7.4)稀釋至1μg/mL之人類Ce3Ce4蛋白儲備液塗布384孔高結合檢定板(Corning International，目錄號3700)且於室溫下在震盪器上培育3小時。用PBS(pH 7.4)洗滌板2次後，使用每孔80 μL 0.01 M PBS/1% BSA阻斷板，於室溫下培育1小時，隨後最後用0.01 M PBS(pH 7.4)/0.05%吐溫20洗滌3次。樣品製備及檢定： 第二天，以1:100稀釋液(PBS/1% BSA稀釋劑)開始製備各樣品之8點對數連續稀釋液，將每孔25 μL連續稀釋液一式兩份轉移至塗有人類Ce3Ce4之板中，接著於室溫下震盪培育1.5小時。用0.01 M PBS(pH 7.4)/0.05%吐溫20洗滌3次後，每孔添加25 μL以0.01 M PBS(pH 7.4)/1% BSA 1:6000稀釋之總IgG偵測抗體(兔抗mu IgG-Fc，目錄號A90-130A，Bethyl Laboratories)，接著於室溫下震盪培育1小時。用0.01 M PBS(pH 7.4)/0.05%吐溫20洗滌5次後，每孔添加25 μL以0.01 M PBS(pH 7.4)/0.05%吐溫20(pH 7.4)1:3000稀釋之Bio-Rad套組山羊抗兔辣根過氧化酶結合物(Bio-Rad，目錄號172-1019)，接著於室溫下震盪培育1小時。用0.01 M PBS(pH 7.4)/0.05%吐溫20洗滌4次，接著用0.01 M PBS(pH 7.4)僅洗滌1次後，每孔添加25 μL小鼠Typer HRP受質(Bio-Rad，目錄號172-1064)，接著於室溫下培育30分鐘。每孔添加25 μL 2%乙二酸，於吸光度405 nm下讀取。數據分析： 藉由獲得由適當研究陰性對照組之最低濃度產生之重複讀數的平均值且將此值乘以2.5來計算截斷值(吸光度405 nm)。繪製各試樣之滴定曲線(樣品效價相對於吸光度405 nm)且自計算出之截斷值預測樣品效價(隨後轉化為倒數效價)。

b)游離IgE結合效價

概述： 電化學發光(ECL)檢定，其產生用來表示在測試血清之連續稀釋液與高濃度之人類IgE一起培育隔夜後所形成之小鼠IgG：人類IgE複合物含量的倒數效價(RT)及最大值。使用由混合之接種Ce3的小鼠血清樣品製備之血清樣品以及以50 μg/mL及1 mg/mL加入來自Harlan Labs之Balb/c陰性血清(自400隻動物混合，Harlan laboratories編號R-0131D)中之針對人類IgE Ce3域之區域的小鼠抗體(AbDserotec 0100-0413(E411(5H2))作為陽性對照組，該抗體亦單獨用作陰性對照組。將樣品與人類IgE一起培育： 以1:3稀釋液(0.01 M PBS(pH 7.4)/1% BSA稀釋劑)開始製備各樣品(包括對照組)之8點對數連續稀釋液。將10 μL體積之各樣品濃縮物與10 μL之100 μg/mL人類IgE(使用0.01 M PBS(pH 7.4)/1% BSA自儲備液稀釋)混合，接著密封板且於4℃下培育隔夜。塗布檢定板： 第二天，用每孔12 μL以0.01 M PBS(pH 7.4)稀釋至1 μg/mL之針對人類IgE之綿羊pAb(Gentaur,ICL(Immunology Consultants Lab)，目錄號SE-80A)塗布384孔檢定板(Meso-Scale Diagnostics(MSD)標準結合，目錄號L11XA-1、0370PA)，接著於室溫下在震盪器上培育2小時。用0.01 M PBS(pH 7.4)洗滌板3次，每孔使用25 μL Pierce起始阻斷緩衝液(Pierce Biotech.目錄號37538)阻斷板且於室溫下在震盪器上培育40分鐘，隨後最後用0.01 M PBS(pH 7.4)洗滌3次。樣品製備及檢定： 用每孔80 μL 0.01 M PBS(pH 7.4)/1% BSA以1:5稀釋20 μL體積之血清與人類IgE的隔夜培育混合物且接著將每孔12 μL一式兩份轉移至經塗布之MSD檢定板中。於室溫下在震盪器上培育2小時後，用0.01 M PBS(pH 7.4)/0.05%吐溫20洗滌板3次。每孔添加12 μL用0.01 M PBS(pH 7.4)/1% BSA以1:5000稀釋之偵測抗體(針對小鼠IgG H+L之驢pAb，Abcam目錄號ab6707，MSD標記磺酸基之抗體，使用MSD目錄號R91AN-1)，接著於室溫下震盪培育1小時。用0.01 M PBS(pH 7.4)/0.05%吐溫20洗滌3次後，每孔添加50 μL用MQ水以1:2稀釋之具有界面活性劑的MSD讀取緩衝液T(4×)(MSD目錄號R92TC)。使用MSD Sector成像器6000對板進行讀取。

數據分析： 藉由獲得由適當研究陰性對照組之最低濃度產生之重複讀數的平均值且將此值乘以5來計算截斷值(像素)。繪製各試樣之滴定曲線(樣品效價相對於像素)且自計算出之截斷值預測樣品效價(隨後轉化為倒數效價)。亦記錄滴定曲線之最大峰值。

c)與結合受體之IgE結合

此檢定量測來自疫苗接種之小鼠之血清中的抗體是否可結合於一些結合於RBL-THE細胞之表面上之FceRI受體的人類IgE，接著由與藻紅素結合之抗小鼠Fc特異性抗體偵測彼等抗體且由流動式細胞測量術量測螢光。使用用未疫苗接種之BALBc血清稀釋的來自Biodesign之抗人類IgE抗體作為陽性對照組。檢定： 將冷凍之RBL-THE細胞(p12，每毫升10×10⁶ 個細胞)解凍且用檢定緩衝液(PBS-5%山羊血清)洗滌一次。將阻斷緩衝液(PBS-5%山羊血清-0.1 mg/ml小鼠Fab(ChromPure小鼠IgG，Fab片段-Jackson Immunoresearch))中之每孔2×10⁵ 個細胞接種於96孔板中且在4℃震盪器上培育1小時30分鐘。每孔添加50 μl之4 μg/ml人類IgE(用檢定緩衝液稀釋)(除了對照孔Biodesign無IgE、僅細胞及aMo-PE)且在4℃震盪器上培育各板1小時。用檢定緩衝液洗滌細胞一次且再懸浮於30 μl用5% BALBc血清稀釋或具有用檢定緩衝液以1:20、1:40及1:80稀釋之來自疫苗接種小鼠的血清樣品之抗人類IgE(Biodesign 10 μg/ml、5 μg/ml、2.5 μg/ml-陽性對照組)中。一式三份塗血清樣品且對照組為一式兩份。在4℃震盪器上培育板1小時30分鐘，接著用檢定緩衝液洗滌，再懸浮於100 μl山羊抗小鼠Fc特異性PE抗體(用檢定緩衝液以1:200稀釋，山羊，Jackson Immunoresearch)且在4℃震盪器上培育45分鐘。用檢定緩衝液洗滌細胞3次，再懸浮於80 μl 2%三聚甲醛之PBS溶液中且於4℃下培育隔夜。藉由流動式細胞測量術量測螢光強度。數據分析： 使用各樣品之平均螢光強度進行分析。對陰性對照組(僅aMo-PE)求平均值且自各孔減去其值。對陽性對照組求平均值且將各樣品表示為各血清稀釋度下之陽性對照組(Biodesign)的百分比。接著萃取1:40血清稀釋液且執行ANOVA。

d)去顆粒檢定

此檢定藉由量測由培養基中之RBL-THE細胞釋放之b-己醣胺酶的活性來量測來自疫苗接種小鼠的血清是否會誘導RBL-THE細胞之去顆粒。使用用未疫苗接種之BALBc血清稀釋的E25(Xolair)作為陰性對照組(40 μg/ml)且使用用未疫苗接種之BALBc血清稀釋之來自Sigma的山羊多株抗體作為陽性對照組。細胞接種： 將冷凍之RBL-THE p12(每小瓶10×10⁶ 個細胞；經人類FceRI穩定轉染之大鼠嗜鹼性球白血病細胞)解凍，用RBL-P培養基(具有15% FCS及2 mM L-麩醯胺酸之MEM-厄爾氏(Earles)補充劑)洗滌且以每毫升8×10⁵ 個細胞再懸浮於具有0.25 μg/ml人類IgE之RBL-P培養基中。將每孔8×10⁴ 個細胞接種於平底96孔板中且於37℃/5% CO₂ 下培育48小時。樣品及緩衝液製備： 在第3天，製備台氏緩衝液(Tyrode's buffer)1×(NaCl 135 mM、KCl 5 mM、CaCl₂ 1.8 mM、MgCl₂ 1 mM、葡萄糖5.6 mM、BSA 1 mg/ml、Hepes 20 mM(pH 7.4))。亦製備台氏緩衝液-5% BALBc血清、台氏緩衝液-2.5% BALBc血清及1%Triton之台氏溶液-5% BALBc血清。以10 μg/ml至2.5 μg/ml用台氏緩衝液-5% BALBc血清連續稀釋陽性對照組(山羊多株抗IgE抗體(82 mg/ml，PBS溶液)-Sigma，I0632)(第一孔用台氏緩衝液-5% BALBc血清及接著用台氏緩衝液)。使陰性對照組(E25)在稀釋之Balbc血清(1:20、1:40及1:80血清稀釋液)中保持恆定於40 μg/ml。以1:20、1:40及1:80血清稀釋度測試來自疫苗接種小鼠的測試血清樣品。所有對照組及測試血清樣品在各板上均一式三份測試。促效劑檢定： 在第3天，自恆溫箱移除細胞培養板。自各孔中移除95 μl培養基且用200 μl台氏緩衝液洗滌細胞一次，移除洗滌緩衝液且添加70 μl稀釋之抗體(陽性對照組、陰性對照組或測試血清樣品)。於37℃/5% CO₂ 下培育細胞1小時。在培育結束時，自恆溫箱移除板且於1200 rpm下離心5分鐘以沈降任何脫離之細胞。移除65 μl上清液且置於無菌96孔板中。測試25 μl上清液之β-己糖胺酶活性。β-己糖胺酶活性： 將25 μl上清液添加至96孔板中。將25 μl於檸檬酸鹽緩衝液中之4 mM NAGA(於50 mM檸檬酸鹽緩衝液(pH 4.5)中之4 mM N-乙醯基-β-D-葡萄胺糖(NAGA)(Sigma，N9376))添加至所有孔(新鮮製備)中，於37℃下培育該等板1小時且添加150 μl 0.2 M甘胺酸(pH 10.7)以中止反應。使用Envision，在405 nm下對板進行讀取。數據分析： 所有孔(經1% Triton X-100處理)之去顆粒值表示為總β-己糖胺酶活性之百分比。接著選取稀釋度1:40下之去顆粒%進行分析且對血清樣品執行ANOVA。

e)還原游離人類IgE檢定

概述：電化學發光(ECL)檢定，其定量在測試血清之等分試樣與人類IgE之連續稀釋液一起培育隔夜(在此期間形成小鼠IgG：人類IgE複合物)後保持之游離人類IgE的含量。為確保人類IgE定量檢定之準確度，有必要首先使用塗有蛋白G之磁性Dynabead移除任何小鼠IgG：人類IgE複合物，該等Dynabead經由小鼠IgG Fc區結合任何複合物。相對於適當陰性對照組之含量，可計算各樣品之人類IgE含量之減少%的值。

作為陽性對照組，將Xolair/E25以40 μg/mL(標準治療劑量)加入來自Harlan Labs之Balb/c陰性血清(自400隻動物混合，Harlan laboratories編號R-0131D)中，其亦僅用作陰性對照組。將樣品與人類IgE一起培育： 將2 μL體積之各濃度之人類IgE的8點對數連續稀釋液(0.01 M PBS(pH 7.4)/1% BSA稀釋劑)添加至各8×10 μL體積之測試血清樣品(包括陽性對照組Xolair/E25(40 μg/mL))中，IgE以30 μg/mL之最終濃度開始。密封板且於4℃下培育隔夜。塗布檢定板： 第二天，用每孔12 μL用0.01 M PBS(pH 7.4)稀釋至5 μg/mL之針對人類IgE之綿羊pAb(Gentaur,ICL(Immunology Consultants Lab)，目錄號SE-80A)塗布384孔檢定板(Meso-Scale Diagnostics(MSD)標準結合，目錄號L11XA-1、0370PA)，接著於室溫下在震盪器上培育2小時。用0.01 M PBS(pH 7.4)洗滌3次後，每孔使用25 μLPierce起始阻斷緩衝液(Pierce Biotech.目錄號37538)阻斷板且於室溫下在震盪器上培育40分鐘，隨後最後用0.01 M PBS(pH 7.4)洗滌3次。樣品及Dynabead製備： 用每孔95 μL 0.01 M PBS(pH 7.4)/1% BSA以1:20稀釋5 μL體積之血清與人類IgE的隔夜培育混合物。[注意：在游離IgE結合檢定中亦另外用0.01 PBS(pH 7.4)/1% BSA以1:2稀釋10 μL 1:20稀釋液以進行測試，從而得到mu IgG:hu IgE複合物之量測值，隨後培育蛋白G珠粒]。洗滌所需體積之1倍濃度的蛋白G Dynabead(Invitrogen，目錄號10004D)且製備為包裝內插入物(in pack insert)，接著藉由再懸浮於0.25倍初始珠粒體積中來濃縮4倍。將樣品與Dynabead一起培育： 將各30 μL之1: 20樣品與每孔15 μL 4倍珠粒混合，於室溫下震盪培育1小時。使用Dynal磁棒板(Invitrogen，目錄號12027)自樣品移除珠粒且將40 μL殘餘樣品與20 μL新鮮4倍珠粒之混合物混合，於室溫下震盪培育1小時。將每孔45 μL殘餘樣品轉移至新鮮孔中且於1000 rpm下離心1分鐘，將板放回磁棒板上且將每孔40 μL轉移至新鮮孔中。[注意：在游離IgE結合檢定中使用30 μL殘餘樣品進行測試，從而在蛋白G珠粒培育後得到mu IgG:hu IgE複合物之量測值，確保所有複合物均已移除]。定量檢定： 以5 μg/mL之濃度開始，製備人類IgE於80% MSD小鼠血清檢定稀釋劑/20% 0.01 M PBS(pH 7.4)/1% BSA中之12點對數連續稀釋液標準曲線。使用MSD小鼠血清檢定稀釋劑(MSD，目錄號R52BB-2)以1:5稀釋來自珠粒培育之殘餘樣品。將標準曲線及樣品之連續稀釋液以每孔12 μL一式三份轉移至經塗布之MSD孔中且於室溫下震盪培育2小時。用0.01 M PBS(pH 7.4)/0.05%吐溫20洗滌板3次後，每孔添加12 μL用0.01 M PBS(pH 7.4)/1% BSA以1:300稀釋之偵測抗體(特異性兔抗人類IgE抗體ε鏈，Bethyl目錄號A80-109A，MSD標記磺酸基抗體，使用MSD目錄號R91AN-1)，接著於室溫下震盪培育1小時。用0.01 M PBS(pH 7.4)/0.05%吐溫20洗滌3次後，每孔添加50 μL用MQ水以1:2稀釋之具有界面活性劑的MSD讀取緩衝液T(4×)(MSD目錄號R92TC)。使用MSD Sector成像器6000對板進行讀取。[注意：將游離IgE結合檢定與此定量檢定串聯操作以使用與先前所述之相同方案測試在珠粒培育之前及之後的樣品，除了使用用0.01 M PBS(pH 7.4)/1% BSA以1:2000稀釋之驢偵測抗體且僅對於E25/Xolair陽性對照組使用用0.01 M PBS(pH 7.4)/1%BSA以1:4000稀釋之抗人類偵測抗體(標記磺酸基之山羊抗人類IgG，MSD目錄號R32AJ-5)]。數據分析： 計算原始數據(像素)之對數，繪製標準曲線(人類IgE濃度(ng/mL)之對數相對於像素之對數)且應用不對稱5參數曲線擬合。自標準曲線預測試樣之IgE濃度的對數且隨後計算反對數並乘以200，得到以ng/mL計之實際殘餘游離IgE濃度。對於各樣品及對照組，與適當對照組相比，計算人類IgE含量之減少%且相對於最初添加至血清樣品中之人類IgE(ng/mL)進行繪圖，兩個軸皆為對數標尺，產生滴定曲線。

結果

結果概括於下表5中。更特定言之且令人驚訝的是，此研究顯示黃色肽及紫色肽Qβ結合之組合在以25微克結合物之總劑量(亦即12.5微克個別結合物)經由肌肉內途徑投與時為最有效，且比使用加倍劑量之任一肽結合物作為單一抗原更有效。吾等已在此研究中顯示，此組合誘導具有強結合游離IgE能力之抗體反應，且此等抗體能夠使IgE含量減少至直到80%，此視IgE攻毒之劑量而定。此等抗體反應不能結合嚙合受體之IgE且不會引起表現受體之標靶細胞的去顆粒。將Qβ與佐劑明礬及CPG24555組合(其中寡核苷酸之所有核苷酸間鍵均為硫代磷酸酯鍵)高度有效誘導此等抗體反應。總體而言，可得出結論，在誘導具有強結合游離人類IgE能力之小鼠IgG抗體方面，當個別地或與紫色肽或橙色肽結合物組合或與以高劑量及體積接種之紫色肽與橙色肽結合物組合投與時，黃色肽為最有前途之肽。

實例6.高免疫研究

此研究之目的在於評估快速免疫進程對誘導針對IgE之高親和力抗體的作用。在第0、3、8及11天，給具有8隻雌性Balb/c小鼠(6-8週齡)之組腹膜內及皮下注射肽KLH-結合物(如以上實例4中所詳述)。使用CPG7909及Alhydrogel(20% v/v之1.3%明礬)與不完全弗氏佐劑(IFA)之組合作為此研究中之佐劑。所有肽均與KLH結合。在第22天執行屍檢且如實例5中收集血液。

使用所有或一些以下檢定研究免疫動物之抗體反應：a)IgG效價測定、b)與血清游離IgE結合、c)與結合FceRI之IgE結合、d)去顆粒檢定及e)IgE定量檢定。所有檢定均在實例5中詳述。

結果

表6概括來自實例6之數據。此研究中之總效價為VRS-IgE-008-003中的約1/10。來自此研究之數據顯示紫色肽、紫色限制肽、黃色肽及橙色肽具有免疫原性。令人驚訝的是，藍色肽為極弱抗原，且限制該肽及增加溶解性顯示免疫原性增加，從而顯示此肽可能需要進行限制以顯示可接受之免疫原性。

實例7.與KLH、HBsAg及Qβ結合之肽誘導可結合於人類IgE之抗體反應的功效

此研究之目的在於評估與KLH、HBsAg及Qβ結合之肽(如以上實例2、3及4中所詳述)如何有效誘導可結合於人類IgE之抗體反應。在第0、19及34天，藉由肌肉內途徑給雌性Balb/c(6-8週)進行注射(將50微升體積注入各脛前肌中)。在第46天進行屍檢。屍檢時，藉由心臟穿刺，自安樂死之小鼠取得400-600微升血液樣品。使血液凝結隔夜且次日收集血清。

結果

此研究顯示紫色肽及黃色肽具有高免疫原性。紫色肽與KLH、Qβ及HBsAg結合使得可誘導能夠在極高程度上結合於游離IgE之高抗體反應。此等抗體反應不能結合嚙合受體之IgE且不會引起表現受體之標靶細胞的去顆粒。兩種佐劑(AbiSCO及CPG 7909與明礬之組合)有效誘導高程度之抗體反應。

實例8：肽免疫原與KLH之組合

此研究之目的在於評估與KLH結合之肽組合(如以上實例4中所詳述)如何有效誘導可結合於人類IgE之抗體反應。在第0、19及34天，藉由肌肉內途徑給雌性Balb/c(6-8週)進行注射(將50微升體積注入各脛前肌)。在第46天進行屍檢。屍檢時，藉由心臟穿刺，自安樂死之小鼠取得400-600微升血液樣品。使血液凝結隔夜且次日收集血清。

結果

此研究顯示，儘管歸因於可得到有限量之肽在此研究中使用低劑量，但黃色肽與橙色肽、藍色肽與紫色肽、黃色肽與紫色肽之組合具有高免疫原性且誘導可有效結合游離IgE之抗體反應。此等抗體反應不能結合嚙合受體之IgE且不會引起表現受體之標靶細胞的去顆粒。

實例9：結合物疫苗在活體內破壞耐受性之功效(動物模型)

在動物模型中，使用天然表現高IgE含量(例如經由過敏)或以實驗方式使用模型或真實過敏原使動物免疫來誘導高IgE含量之物種，評估IgE肽疫苗在活體內減少IgE含量之能力。舉例而言，用無內毒素之卵白蛋白(OVA)作為與明礬一起調配之模型抗原以誘導對OVA之IgE反應而使小鼠免疫(實例參考Lloyd C等人，J. Immunol 2001,166，第2033-2040頁)。誘導IgE反應後，給小鼠接種與載體偶合且與佐劑一起調配之抗原性肽。可使用來自小鼠IgE之同源區域的肽(小鼠中)，各別動物物種中其他物種之同源區域，以及對於非人類靈長類動物可使用人類IgE肽。接著可藉由在疫苗接種之前及之後量測血清中IgE之含量來監測疫苗接種在降低IgE含量方面之功效。另外，可藉由用鼻內或氣管內OVA對小鼠進行攻毒(例如經連續2-5天)且藉由對肺灌洗樣品中之白血球亞群浸潤計數及藉由組織學評估肺薄壁組織中之嗜伊紅血球募集以及杯狀細胞化生及黏液產生來評估肺中之過敏性發炎性反應而監測肽減少過敏性發炎性反應之能力(例如Coyle A.等人，1996 J. Exp. Med. 183,1303-1310。)。

實例10：與Qβ或HBsAg結合之線性及化學限制肽在誘導可結合於人類IgE之抗體方面的功效及適合性

使用短的線性肽作為免疫原來誘導抗IgE反應之挑戰之一為準確地呈現IgE之二級結構，由此確保藉由疫苗接種產生之抗體有效地識別游離循環IgE。將合適之二級結構引入線性親本胺基酸序列中的化學限制可供替代性免疫原誘導對IgE之抗體反應。

對PDB 1F6A中所存在之IgE之Cε3Cε4域的三維結構之分析(Garman等人，2000 Nature 406：第259-266頁)揭露Cε3Cε4與FCεRI受體之間界面處的一些標靶序列採用非線性排列，其可能未由表9中所詳述之線性序列充分呈現。因此，鑑別為化學限制之候選物的序列以試圖評估限制肽(在活體內投藥後)誘導可在游離IgE結合檢定中偵測出之抗IgE抗體的能力。

分別藉由兩種不同方法限制黃色肽序列(SEQ ID NO: 220)與橙色肽+半胱胺酸序列(SEQ ID NO: 436)之變異體：一種方法包含使用點擊化學(Click chemistry)橫跨肽序列之兩個相鄰原子引入三唑部分。藉由此方法對肽序列施加之限制程度可藉由將亞甲基添加至三唑部分中來調節(藉由此方法製造橙色046肽、橙色047肽、黃色043肽、黃色044肽)。第二種方法包含經由在文獻中指出具有β轉折(β-turn)誘導潛在性之異對掌性雙脯胺酸單元(D-Pro-L-Pro)的模板作用進行環化(Spath等人，1998,Helvetica Chimica Acta 81，第1726-1738頁)；(藉由此方法製造橙色044肽、橙色045肽、黃色040肽、黃色041肽、黃色042肽)。此等限制肽之化學結構在表9中顯示。

執行若干研究以評估與HBsAg及Qβ結合(結合如實例2及3中所詳述)之具有不同長度的線性肽或限制肽所誘導之抗人類IgE免疫反應。

使用1.5倍莫耳過量之丁二醯亞胺基-6-[β-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺基]己酸酯(SMPH)化學試劑，使限制肽橙色肽+半胱胺酸(SEQ ID No: 436)、黃色肽(SEQ ID No: 220)、橙色044肽、橙色045肽、橙色046肽、橙色047肽、黃色040肽、黃色041肽、黃色042肽、黃色043肽及黃色044肽與Qβ病毒樣粒子結合且在小鼠中將該等肽用作免疫原。在如下文表9所述之日，藉由肌肉內途徑(將50 μl注入各脛前肌中)給雌性Balb/c(6-8週)注射抗原及Alhydrogel加CpG-24555(所有核苷酸間鍵均為硫代磷酸酯鍵)佐劑。如實例5中所述，在IgE結合檢定中測試最後加強後1週製備之血清的抗IgE抗體活性。

結果

表9中所概括之研究顯示與Qβ及HBsAg結合且與合併之佐劑Alhydrogel及CpG24555一起傳遞之衍生自紫色肽、橙色肽及黃色肽之線性肽誘導能夠結合於游離IgE之抗體反應。

另外，大部分限制肽免疫原誘導能夠結合游離人類IgE之抗血清。藍色003肽、藍色004肽及藍色005肽驚人地僅誘導弱抗IgE反應。橙色047肽及橙色048肽不會誘導抗IgE抗體超過本底水準。

在第0及14天，在雌性BALB/c小鼠中，總結合物劑量為每次注射25微克，每肌肉內途徑投與兩次，除了由*標記之組係以50微克之結合劑量給藥及由^標記之組係在第0、14及28天給藥3次。限制肽及由^^標記之組係在第0、21及42天給藥3次。

結合搭配物=Qβ或HBsAg VLP(由**標記)

佐劑：20 μg CPG 24555(所有核苷酸間鍵均為硫代磷酸酯鍵)+20% v/v之ALhydrogel^TM

ND=未進行

注意-c、cgg、gcc、cdddd 及kgg 為出於結合目的而添加至IgE肽序列中之連接子

實例11：與Qβ、HBsAg及DT結合之肽在誘導可結合於人類IgE之抗體反應方面的功效

此研究之目的在於評估與各種載體(諸如DT、CRM197、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A、HBsAg及Qβ)結合之肽(如以上實例中所詳述)如何有效誘導可結合於人類IgE之抗體反應。為產生DT結合物，用10倍莫耳過量之丁二醯亞胺基-6-[β-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺基]己酸酯(SMPH，Thermo Fisher Scientific Inc)衍生出白喉(Diptheria)類毒素(濃度為3mg/ml)。此活化步驟後，藉由使用NAP-25除鹽管柱(GE Healthcare)，於具有5 mM EDTA之杜爾貝科磷酸鹽緩衝生理食鹽水(DPBS)中移除過量SMPH試劑。接著將凍乾肽固體直接添加至順丁烯二醯亞胺活化之白喉類毒素中且在平緩混合下培育90分鐘。隨後將樣品施加於NAP-25除鹽管柱(GE Healthcare)上且於杜爾貝科磷酸鹽緩衝生理食鹽水(DPBS)中溶離以移除游離肽。此後，使用10 kD旋轉微量濃縮器濃縮蛋白質溶液且使用0.22 μm過濾器滅菌並保持於-80℃下直至使用之時。如下製造Qb-肽及HbsAg-肽結合物：使用N-γ-順丁烯二醯亞胺基-丁醯氧基-丁二醯亞胺酯(GMBS)連接試劑或丁二醯亞胺基-6-[β-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺基]己酸酯(SMPH)活化VLP(Qβ與HBsAg)，該兩種試劑皆得自Thermo Fisher Scientific Inc。將GMBS或SMPH試劑溶解於二甲亞碸(DMSO)中且以5倍莫耳過量添加至VLP溶液中。使活化反應進行30分鐘且接著使用NAP-25除鹽管柱(GE Healthcare)，於具有5 mM EDTA之杜爾貝科磷酸鹽緩衝生理食鹽水(DPBS)中使溶液除鹽。此後，將適當量之固體凍乾肽直接添加至順丁烯二醯亞胺活化之VLP中且在極平緩混合下使VLP與肽之間的反應進行至少30分鐘。在反應時間結束時，使用NAP-25除鹽管柱(GE Healthcare)，於杜爾貝科PBS(DPBS)中使各樣品除鹽。使用Bradford(庫馬斯亮藍，Thermo Fisher Scientific Inc.)檢定或BCA蛋白質檢定(二喹啉甲酸，Thermo Fisher Scientific Inc.)以及藉由SDS-PAGE及尺寸排阻層析來分析經除鹽之結合肽的蛋白質含量。

如下文表10所述，在第0、19及34天，藉由肌肉內途徑(將50 μl注入各脛前肌中)給雌性Balb/c(6-8週)注射與Qβ、B型肝炎表面抗原(HBsAg)或白喉類毒素(DT)結合之肽及Alhydrogel加CpG佐劑。如實例5中所述，在IgE結合檢定中測試最後加強後1週製備之血清的抗IgE抗體活性。在表10中展示反應。

結果

此研究(表10)顯示紫色001肽及黃色001肽(在表9中顯示序列)在與DT、Qβ或HBsAg結合時可誘導抗人類IgE抗體。使用GMBS連接子或SMPH連接子可誘導抗人類IgE抗體。

在第0及14天使雌性BALB/c小鼠免疫。在第21天收集及分析血清。

結合搭配物=Qβ、DT或HBsAg VLP(按照以上表格)，如以上表格中所概述，使用SMPH及GMBS。

實例12：肽組合在誘導可結合於人類IgE之抗體反應方面之功效大於使用與Qβ結合之單一肽

執行若干目的在於評估與Qβ結合之肽(如以上實例中所詳述)如何誘導可結合於人類IgE之抗體反應的研究。如實例5中所述，藉由肌肉內途徑使雌性Balb/c(6-8週)免疫，其中特定時序詳情如表格中所示。如實例5中所詳述量測抗IgE反應、誘導去顆粒之活性及IgE耗盡活性。

結果

如表11中所示，肽(參見表9中之序列)與Qβ之結合誘導能夠結合於游離IgE而不引起超過對照組值之去顆粒作用的抗體反應。使用Alhydrogel作為單一佐劑為有效的且紫色肽與黃色肽之組合誘導較高IgE結合抗體反應。此外，肽組合誘導更有效地結合及耗盡IgE之抗體反應。將CPG 24555添加至Alhydrogel調配物中可進一步增加抗IgE抗體反應而不誘導去顆粒活性。

實例13：由紫色001肽及黃色001肽之鼠類同源物誘導抗自體IgE反應

在具有高IgE含量(藉由用無內毒素之卵白蛋白(OVA)作為與明礬一起調配之模型抗原進行預先免疫而誘導-實例參考Lloyd C等人，J. Immunol 2001,166，第2033-2040頁)之小鼠中評估IgE肽疫苗活體內誘導IgG抗自體IgE抗體及減少IgE含量之能力。誘導IgE抗OVA反應後，給小鼠接種與Qβ載體偶合且與佐劑一起調配之抗原性肽。使用來自小鼠IgE之同源區域的肽(鼠類黃色001肽=QCIVDHPDFPKPIVRS(SEQ ID NO: 458)；鼠類紫色001肽=PDHEPRGVITYLIPPSPC(SEQ ID NO: 459))。藉由在疫苗接種之前及之後量測血清中IgE抗OVA之含量來監測疫苗接種在降低IgE含量方面之功效。

a)卵白蛋白特異性IgE定量檢定

概述： 電化學發光(ECL)檢定，其測定OVA特異性鼠類IgE之濃度。使用OVA特異性IgE單株抗體(AbD Serotec，目錄號PMP68)作為陽性對照組，其中在各檢定中測試此標準物之定量12點對數稀釋液(以30 μg/mL之最高濃度加入來自Harlan Labs之Balb/c陰性血清(自400隻動物混合，Harlan laboratories編號R-0131D)中)。亦僅使用此混合正常血清作為陰性對照組。塗布檢定板： 每孔用12 μL用0.01 M PBS(pH 7.4)稀釋至15 μg/mL之針對小鼠IgE之大鼠pAb(Invitrogen，目錄號04700)塗布384孔檢定板(Meso-Scale Diagnostics(MSD)標準結合，目錄號L11XA-1、0370PA)，接著於室溫下在震盪器上培育2小時。用0.01 M PBS(pH 7.4)洗滌3次後，每孔使用25μL Pierce起始阻斷緩衝液(Pierce Biotech.目錄號37538)阻斷板且於室溫下在震盪器上培育40分鐘，隨後最後用0.01 M PBS(pH 7.4)洗滌3次。樣品製備及檢定： 以1:200及1:500稀釋(0.01 M PBS(pH 7.4)/1% BSA稀釋劑)各血清樣品且將12 μL各稀釋液一式三份添加至經塗布之MSD板中，同時測試標準物之稀釋液。於室溫下在震盪器上培育2小時後，用0.01 M PBS(pH 7.4)/0.05%吐溫20洗滌板3次。每孔添加12 μL用0.01 M PBS(pH 7.4)/1% BSA以1:300稀釋之偵測、標記磺酸基之卵白蛋白，接著於室溫下震盪培育1小時。用0.01 M PBS(pH 7.4)/0.05%吐溫20洗滌3次後，每孔添加50 μL用MQ水以1:2稀釋之具有界面活性劑的MSD讀取緩衝液T(4×)(MSD目錄號R92TC)。使用MSD Sector成像器6000對板進行讀取。數據分析： 計算原始數據(像素)之對數，繪製標準曲線(小鼠IgE抗OVA濃度(ng/mL)之對數相對於像素之對數)且應用不對稱5參數曲線擬合。自標準曲線預測試樣之IgE濃度的對數且隨後計算反對數並乘以200或500，得到以ng/mL計之實際IgE濃度。

b)抗鼠類IgE之總IgG效價測定

概述：比色ELISA，其產生用來表示對鼠類IgE具有特異性之總IgG分子含量的倒數效價(RT)。由血清樣品製備連續稀釋液且在檢定中測試。使用以10 μg/mL加入來自Harlan Labs之Balb/c陰性血清中且以8點半對數連續稀釋液滴定的針對小鼠IgE之大鼠pAb(Invitrogen，目錄號04700)作為陽性對照組。使用來自Harlan Labs之Balb/c陰性血清以及來自研究陰性組(與樣品同樣處理)之混合樣品作為陰性對照組(自400隻動物混合，Harlan laboratories編號R-0131D)。塗布檢定板： 每孔用25 μL用0.01 M PBS(pH 7.4)稀釋至5 μg/mL之針對OVA之小鼠IgE(AbD Serotec，目錄號PMP68)儲備液塗布384孔高結合檢定板(Corning International，目錄號3700)且於室溫下在震盪器上培育2小時。用PBS(pH 7.4)洗滌2次後，每孔使用80 μL 0.01 M PBS/1% BSA阻斷板，於室溫下培育1小時，隨後最後用0.01 M PBS(pH 7.4)/0.05%吐溫20洗滌3次。樣品製備及檢定： 以1:100稀釋液(PBS/1% BSA稀釋劑)開始製備各樣品之8點1/10連續稀釋液，將每孔25 μL連續稀釋液一式兩份轉移至塗有小鼠IgE之板中，接著於室溫下震盪培育1.5小時。用0.01 M PBS(pH 7.4)/0.05%吐溫20洗滌3次後，每孔添加25 μL用0.01 M PBS(pH 7.4)/1% BSA以1:6000稀釋之總IgG偵測抗體(兔抗mu IgG-Fc，目錄號A90-130A，Bethyl Laboratories)，接著於室溫下震盪培育1小時。用0.01 M PBS(pH 7.4)/0.05%吐溫20洗滌5次後，每孔添加25 μL用0.01 M PBS(pH 7.4)/0.05%吐溫20(pH 7.4)以1:3000稀釋之Bio-Rad套組山羊抗兔辣根過氧化酶結合物(Bio-Rad，目錄號172-1019)，接著於室溫下震盪培育1小時。用0.01 M PBS(pH 7.4)/0.05%吐溫20洗滌4次，接著僅用0.01 M PBS(pH 7.4)洗滌1次後，每孔添加25 μL小鼠Typer HRP受質(Bio-Rad，目錄號172-1064)，接著於室溫下培育30分鐘，隨後每孔添加25 μL 2%乙二酸以中止反應且於405 nm下讀取吸光度。數據分析： 繪製各試樣之滴定曲線(樣品效價相對於吸光度405 nm)且自OD 1之截斷值預測樣品效價(隨後轉化為倒數效價)。

結果

兩項研究(表12)顯示黃色001肽之鼠類同源物(鼠類黃色-001肽=QCIVDHPDFPKPIVRS(SEQ ID NO: 458))與紫色001肽之鼠類同源物(鼠類紫色-001肽=PDHEPRGVITYLIPPSPC(SEQ ID NO: 459)之組合可誘導可有效地降低內源性IgE含量(與Qβ VLP免疫對照組之含量相比)的抗自體IgE抗體反應。因此，藉由顯示IgE肽結合可破壞B細胞對內源性IgE分子之耐受性且此與內源性IgE含量減少有關來證明該機制。

實例14：給長尾獼猴(Cynomolgus macaque)接種紫色014肽及黃色001肽或黃色014肽

在接種與載體(Qβ VLP)偶合且與佐劑一起調配之抗原性肽的長尾獼猴中評估人類IgE肽疫苗活體內破壞對自體IgE之耐受性的能力。使用來自人類IgE之肽。接著藉由量測在疫苗接種之前及之後血清中IgG抗IgE之含量來監測疫苗接種在誘導抗自體IgE免疫反應方面之功效。

長尾獼猴檢定 a)對以下抗原/VLP具有特異性之IgG的總IgG效價測定：長尾獼猴IgE Cε2-Cε4域、人類IgE Cε3Cε4域、與KLH結合之個別肽(黃色肽及紫色肽)，及與Qβ結合之個別肽(黃色肽及紫色肽)。

概述： 電化學發光(ECL)檢定，其產生用來表示對疫苗或VLP具有特異性之總IgG分子含量的倒數效價(RT)。由血清樣品製備連續稀釋液且在檢定中測試。使用40 μg/mL之外加人類化抗IgE單株抗體(E25，Xolair)之長尾獼猴血清作為陽性對照組。使用未經外加之長尾獼猴血清作為陰性對照組。塗布檢定板： 每孔用12 μL用0.01 M PBS(pH 7.4)/1% BSA稀釋至1 μg/mL之生物素標記的長尾獼猴IgECε2-Cε4或人類IgECε3Cε4塗布384孔檢定板(Meso-Scale Diagnostics(MSD)，塗有抗生蛋白鏈菌素，目錄號L21SA-1)。每孔用12 μL用0.01 M PBS(pH 7.4)(無BSA)稀釋至1 μg/mL之個別肽(與KLH結合)或稀釋至2-5 μg/mL之個別肽(與Qβ結合)塗布384孔檢定板(Meso-Scale Diagnostics(MSD)標準結合，目錄號L11XA-1、0370PA)。接著於室溫下在震盪器上培育板1小時。用0.01 M PBS(pH 7.4)洗滌3次後，每孔使用25 μL Pierce起始阻斷緩衝液(Pierce Biotech.目錄號37538)阻斷板且於室溫下在震盪器上培育40分鐘，隨後最後用0.01 M PBS(pH 7.4)洗滌3次。樣品製備及檢定： 以1:20稀釋液(PBS/1% BSA稀釋劑)開始製備各樣品(包括對照組)之8點對數連續稀釋液，將每孔12 μL連續稀釋液轉移至塗有測試抗原/VLP之板的孔中，接著於室溫下震盪培育1小時。用0.01 M PBS(pH 7.4)/0.05%吐溫20洗滌3次後，將稀釋至0.02 μg/mL(PBS/1% BSA稀釋劑)之標記磺酸基的蛋白G添加至該等板中(每孔12 μL)。於室溫下震盪培育板1小時，接著用0.01 M PBS(pH 7.4)/0.05%吐溫20洗滌3次。每孔添加50 μL用MQ水以1:2稀釋之具有界面活性劑之MSD讀取緩衝液T(4×)(MSD，目錄號R92TC)。使用MSD Sector成像器6000對板進行讀取。數據分析： 繪製各試樣之滴定曲線(樣品效價相對於像素)且自截斷值(像素)預測樣品效價(隨後轉化為倒數效價)。

b)長尾獼猴抗體結合力檢定

概述： 比色ELISA，其產生用來表示對人類Cε3Cε4具有特異性之總IgG分子之結合強度的親和力指數(AI)。將人類化抗IgE抗體Xolair(E25)加入40 μg/mL及4 μg/mL之混合長尾獼猴血清(由此研究之Qb-VLP對照組製備)中且以12點半對數連續稀釋液滴定，作為陽性對照組。使用來自研究Qb-VLP組之長尾獼猴血清以及商業長尾獼猴血清作為陰性對照組。塗布檢定板： 每孔用12 μL用在0.01 M PBS(pH 7.4)中濃度為1 μg/mL之生物素標記人類Cε3Cε4塗布具有SuperBlock阻斷緩衝液(Fisher Scientific Co Ltd，PI15504)之Reacti-Bind^TM 塗有抗生蛋白鏈菌素之HBC透明384孔板且於室溫下在震盪器上培育1小時。用PBS(pH 7.4)洗滌3次後，每孔使用25 μL 0.01 M PBS/1% BSA阻斷板，於室溫下培育40分鐘，隨後最後用0.01 M PBS(pH 7.4)/0.05%吐溫20洗滌3次。樣品製備及檢定： 用0.01 M PBS/1% BSA稀釋樣品。產生各樣品之滴定曲線且自此曲線使用180,000之像素值計算用於各樣品之個別倒數效價(RT)稀釋度。使用此RT稀釋各樣品以確保親和力檢定中使用類似含量之來自各樣品的抗體。將12 μL各稀釋樣品添加至經塗布之384孔板之24孔中且於室溫下震盪培育1小時。用0.01 M PBS(pH 7.4)/0.05%吐溫20洗滌5次後，將不同濃度之硫氰酸銨以每孔12 μL添加至該板中，接著於室溫下震盪培育15分鐘。(使用12種濃度之硫氰酸銨：12、10、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5及0 M，將其添加至雙份樣品中)。用0.01 M PBS(pH 7.4)/0.05%吐溫20洗滌4次後，每孔添加12 μL具有0.01 M PBS/1% BSA之經HRP標記之小鼠抗人類IgG(Southern Biotech 9042-05)，接著於室溫下震盪培育1小時。用0.01 M PBS(pH 7.4)/0.05%吐溫20洗滌5次後，每孔添加25 μL TMB受質(Sigma P-8665)，接著於室溫下避光培育30分鐘。為中止反應，每孔添加25 μL 2%乙二酸且於吸光度450 nm下對板進行讀取。數據分析： 使用平均吸光度405 nm計算各硫氰酸銨濃度之各樣品的減少%，其中0 M硫氰酸銨樣品作為0%減少。接著繪製各試樣之滴定曲線(減少%相對於吸光度450 nm)且自50%減少之截斷值預測AI。

結果：

此研究(表13)顯示黃色001肽或黃色014肽與紫色014肽(參見表9中之序列)之組合具有免疫原性且誘導與對特異性肽之反應有關的抗自體(長尾獼猴)IgE及抗人類IgE抗體反應。此外，其顯示抗體反應之親和力可藉由對長尾獼猴重複給藥來增加。

圖1：人類IgE之CH3-CH4區域與其高親和力受體FceRI之間的相互作用之結構顯示。顯示4個環(藍色、紫色、橙色及黃色)，其分別對應於SEQ ID No: 165、312、1及220之4種肽。

圖2：用於誘導針對人類IgE之結構確定之抗原決定基的抗體反應之肽形式之圖解。

(無元件符號說明)

Claims

一種包含至少一種抗原性IgE肽連接於免疫原性載體之免疫原，其中該抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成：SEQ ID No：312、311、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、 88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、 307、308、309及310。
如請求項1之免疫原，其中該抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成：SEQ ID No：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152及153。
如請求項1之免疫原，其中該抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成：SEQ ID No：154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、 201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218及219。
如請求項1之免疫原，其中該抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成：SEQ ID No：220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309及310。
如請求項1之免疫原，其中該抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成：SEQ ID No：311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、 376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429及430。
如請求項2之免疫原，其中該抗原性IgE肽由選自由以下組成之群：SEQ ID No：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、88、89、90、91、92、93、94、95、96、99、100、101、102、103、104、105、106、109、110、111、112、113、114、115、118、119、120、121、122、123、126、127、128、129、130、133、134、135、136、139、140、141、144、145及148。
如請求項6之免疫原，其中該抗原性IgE肽由SEQ ID No：1或18之胺基酸序列組成。
如請求項3之免疫原，其中該抗原性IgE肽由選自由以下組成之群：SEQ ID No：154、155、156、157、158、 159、160、161、162、165、166、167、168、169、170、171、172、175、176、177、178、179、180、181、184、185、186、187、188、189、192、193、194、195、196、199、200、201、202、205、206、207、210、211、214及217。
如請求項8之免疫原，其中該抗原性IgE肽由SEQ ID No：154或165之胺基酸序列組成。
如請求項4之免疫原，其中該抗原性IgE肽由選自由以下組成之群：SEQ ID No：220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、245、246、247、248、249、250、251、252、253、256、257、258、259、260、261、262、263、266、267、268、269、270、271、272、275、276、277、278、279、280、283、284、285、286、287、290、291、292、293、296、297、298、301、302及305。
如請求項10之免疫原，其中該抗原性IgE肽由SEQ ID No：220或233之胺基酸序列組成。
如請求項5之免疫原，其中該抗原性IgE肽由選自由以下組成之群：SEQ ID No：311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、353、354、355、356、357、 358、359、360、361、362、365、366、367、368、369、370、371、372、373、376、377、378、379、380、381、382、383、386、387、388、389、390、391、392、395、396、397、398、399、400、403、404、405、406、407、410、411、412、413、416、417、418、421、422及425。
如請求項12之免疫原，其中該抗原性IgE肽由SEQ ID No：311或312之胺基酸序列組成。
如請求項1至13中任一項之免疫原，其中該抗原性IgE肽另包含：在其C端，一種具有式(G)_n C之連接子，其中n為一個選自由0、1、2、3、4、5、6、7、8、9及10組成之群(當n等於0時，該式表示半胱胺酸)或；在其N端，一種具有式C(G)_n 之連接子，其中n為一個選自由0、1、2、3、4、5、6、7、8、9及10組成之群(當n等於0時，該式表示半胱胺酸)或；在其C端，一種具有式(G)_n C之連接子，其中n為一個選自由0、1、2、3、4、5、6、7、8、9及10組成之群(當n等於0時，該式表示半胱胺酸)，及在其N端，一種具有式C(G)_n 之連接子，其中n為一個選自由0、1、2、3、4、5、6、7、8、9及10組成之群(當n等於0時，該式表示半胱胺酸)。
如請求項14之免疫原，其中該抗原性IgE肽另包含：在其C端，一種具有式(G)_n C之連接子，其中n為0或 1(當n等於0時，該式表示半胱胺酸)或；在其N端，一種具有式C(G)_n 之連接子，其中n為0或1(當n等於0時，該式表示半胱胺酸)或；在其C端，一種具有式(G)_n C之連接子，其中n為0或1(當n等於0時，該式表示半胱胺酸)，及在其N端，一種具有式C(G)_n 之連接子，其中n為0或1(當n等於0時，該式表示半胱胺酸)。
如請求項1至13中任一項之免疫原，其中該免疫原性載體為選自由HBcAg、HBsAg及Qβ VLP組成之群的病毒樣粒子。
如請求項16之免疫原，其中該抗原性IgE肽以化學方式與該病毒樣粒子交聯。
如請求項1至13中任一項之免疫原，其中該抗原性IgE肽之構形受限制。
一種組合物，其包含至少兩種如請求項1至18中任一項之免疫原。
如請求項19之組合物，其中該組合物包含兩種免疫原且其中該第一免疫原之抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成：SEQ ID No：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、 67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152及153。
如請求項19之組合物，其中該組合物包含兩種免疫原且其中該第一免疫原之抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成：SEQ ID No：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、88、89、90、91、92、93、94、95、96、99、100、101、102、103、104、105、106、109、110、111、112、113、114、115、118、119、120、121、122、123、126、127、128、129、130、133、134、135、136、139、140、141、144、145及148。
如請求項19之組合物，其中該組合物包含兩種免疫原且其中該第一免疫原之抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成：SEQ ID No：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、49、50、51、52、53、54、55、56、57、63、64、65、66、67、68、69、70、76、77、78、79、80、81、82、88、89、90、91、92、93、99、100、101、102、103、109、110、111、112、118、119、120、126、127、133及139。
如請求項19之組合物，其中該組合物包含兩種免疫原且其中該第一免疫原之抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成：SEQ ID No：1、2、3、4、5、6、7、8、9、18、19、20、21、22、23、24、25、34、35、36、37、38、39、40、49、50、51、52、53、54、63、64、65、66、67、76、77、78、79、88、89、90、99、100、101及109。
如請求項19之組合物，其中該組合物包含兩種免疫原且其中該第一免疫原之抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成：SEQ ID No：1、2、3、4、5、6、18、19、20、21、22、34、35、36、37、49、50、51、63、64及76。
如請求項19之組合物，其中該組合物包含兩種免疫原且其中該第一免疫原之抗原性IgE肽由選自由SEQ ID No：1、2、3、18、19及34組成之群的胺基酸序列組成。
如請求項19之組合物，其中該組合物包含兩種免疫原且其中該第一免疫原之抗原性IgE肽由選自由SEQ ID No：1及18組成之群的胺基酸序列組成。
如請求項19之組合物，其中該組合物包含兩種免疫原且其中該第一免疫原之抗原性IgE肽由SEQ ID No：1之胺基酸序列組成。
如請求項20至27中任一項之組合物，其中該第二免疫原之抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成：SEQ ID No：154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218及219。
如請求項20至27中任一項之組合物，其中該第二免疫原之抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成：SEQ ID No：154、155、156、157、158、159、160、161、162、165、166、167、168、169、170、171、172、175、176、177、178、179、180、181、184、185、186、187、188、189、192、193、194、195、196、199、200、201、202、205、206、207、210、211、214及217。
如請求項20至27中任一項之組合物，其中該第二免疫原之抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成：SEQ ID No：154、155、156、157、158、159、165、166、167、168、169、175、176、177、178、184、185、186、192、193、199及200。
如請求項20至27中任一項之組合物，其中該第二免疫原之抗原性IgE肽由選自由SEQ ID No：154、155、156、165、166及175組成之群的胺基酸序列組成。
如請求項20至27中任一項之組合物，其中該第二免疫原之抗原性IgE肽由選自由SEQ ID No：154及165組成之群的胺基酸序列組成。
如請求項20至27中任一項之組合物，其中該第二免疫原之抗原性IgE肽由選自SEQ ID No：165之胺基酸序列組成。
如請求項20至27中任一項之組合物，其中該第二免疫原之抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成：SEQ ID No：220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、 289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309及310。
如請求項20至27中任一項之組合物，其中該第二免疫原之抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成：SEQ ID No：220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、245、246、247、248、249、250、251、252、253、256、257、258、259、260、261、262、263、266、267、268、269、270、271、272、275、276、277、278、279、280、283、284、285、286、287、290、291、292、293、296、297、298、301、302及305。
如請求項20至27中任一項之組合物，其中該第二免疫原之抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成：SEQ ID No：220、221、222、223、224、225、226、227、233、234、235、236、237、238、239、245、246、247、248、249、250、256、257、258、259、260、266、267、268、269、275、276、277、283、284及290。
如請求項20至27中任一項之組合物，其中該第二免疫原之抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成：SEQ ID No：220、221、222、223、224、233、234、235、236、245、246、247、256、257及266。
如請求項20至27中任一項之組合物，其中該第二免疫原之抗原性IgE肽由選自由SEQ ID No：220、221、222、233、234及245組成之群的胺基酸序列組成。
如請求項20至27中任一項之組合物，其中該第二免疫原之抗原性IgE肽由選自由SEQ ID No：220或233組成之群的胺基酸序列組成。
如請求項20至27中任一項之組合物，其中該第二免疫原之抗原性IgE肽由SEQ ID No：220之胺基酸序列組成。
如請求項20至27中任一項之組合物，其中該第二免疫原之抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成：SEQ ID No：311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429及430。
如請求項20至27中任一項之組合物，其中該第二免疫原之抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成：SEQ ID No：311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、365、366、367、368、369、370、371、372、373、376、377、378、379、380、381、382、383、386、387、388、389、390、391、392、395、396、397、398、399、400、403、404、405、406、407、410、411、412、413、416、417、418、421、422及425。
如請求項20至27中任一項之組合物，其中該第二免疫原之抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成：SEQ ID No：311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、326、327、328、329、330、331、332、333、334、340、341、342、343、344、345、346、347、353、354、355、356、357、358、359、365、366、367、368、369、370、376、377、378、379、380、386、387、388、389、395、396、397、403、404及410。
如請求項20至27中任一項之組合物，其中該第二免疫原之抗原性IgE肽由選自由以下組成之群：SEQ ID No： 311、312、313、314、315、316、317、326、327、328、329、330、331、340、341、342、343、344、353、354、355、356、365、366、367、376、377及386。
如請求項44之組合物，其中該抗原性IgE肽由SEQ ID No：311或312之胺基酸序列組成。
如請求項20至27中任一項之組合物，其中該第二免疫原之抗原性IgE肽由選自SEQ ID No：312之胺基酸序列組成。
如請求項19之組合物，其中該組合物包含兩種免疫原且其中該第一免疫原之抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成：SEQ ID No：154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218及219。
如請求項19之組合物，其中該組合物包含兩種免疫原且其中該第一免疫原之抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成：SEQ ID No：154、155、156、157、158、159、160、161、162、165、166、167、168、169、170、171、172、175、176、177、178、 179、180、181、184、185、186、187、188、189、192、193、194、195、196、199、200、201、202、205、206、207、210、211、214及217。
如請求項19之組合物，其中該組合物包含兩種免疫原且其中該第一免疫原之抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成：SEQ ID No：154、155、156、157、158、159、165、166、167、168、169、175、176、177、178、184、185、186、192、193、199及200。
如請求項19之組合物，其中該組合物包含兩種免疫原且其中該第一免疫原之抗原性IgE肽由選自由SEQ ID No：154、155、156、165、166及175組成之群的胺基酸序列組成。
如請求項19之組合物，其中該組合物包含兩種免疫原且其中該第一免疫原之抗原性IgE肽由選自由SEQ ID No：154及165組成之群的胺基酸序列組成。
如請求項19之組合物，其中該組合物包含兩種免疫原且其中該第一免疫原之抗原性IgE肽由SEQ ID No：165之胺基酸序列組成。
如請求項47至52中任一項之組合物，其中該第二免疫原之抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成：SEQ ID No：220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、 244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309及310。
如請求項47至52中任一項之組合物，其中該第二免疫原之抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成：SEQ ID No：220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、245、246、247、248、249、250、251、252、253、256、257、258、259、260、261、262、263、266、267、268、269、270、271、272、275、276、277、278、279、280、283、284、285、286、287、290、291、292、293、296、297、298、301、302及305。
如請求項47至52中任一項之組合物，其中該第二免疫原之抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成：SEQ ID No：220、221、222、223、224、225、226、227、233、234、235、236、237、238、239、245、246、247、248、249、250、256、257、258、259、260、266、267、268、269、275、276、277、 283、284及290。
如請求項47至52中任一項之組合物，其中該第二免疫原之抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成：SEQ ID No：220、221、222、223、224、233、234、235、236、245、246、247、256、257及266。
如請求項47至52中任一項之組合物，其中該第二免疫原之抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成：SEQ ID No：220、221、222、223、224、233、234、235、236、245、246、247、256、257及266。
如請求項47至52中任一項之組合物，其中該第二免疫原之抗原性IgE肽由選自由SEQ ID No：220、221、222、233、234及245組成之群的胺基酸序列組成。
如請求項47至52中任一項之組合物，其中該第二免疫原之抗原性IgE肽由選自由SEQ ID No：220及233組成之群的胺基酸序列組成。
如請求項47至52中任一項之組合物，其中該第二免疫原之抗原性IgE肽由SEQ ID No：220之胺基酸序列組成。
如請求項47至52中任一項之組合物，其中該第二免疫原之抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成：SEQ ID No：311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、 353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429及430。
如請求項47至52中任一項之組合物，其中該第二免疫原之抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成：SEQ ID No：311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、365、366、367、368、369、370、371、372、373、376、377、378、379、380、381、382、383、386、387、388、389、390、391、392、395、396、397、398、399、400、403、404、405、406、407、410、411、412、413、416、417、418、421、422及425。
如請求項47至52中任一項之組合物，其中該第二免疫原之抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成：SEQ ID No：311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、326、327、328、329、330、331、332、333、334、340、341、342、343、344、345、346、347、353、354、355、356、357、358、359、365、366、367、368、369、370、376、377、378、379、380、386、387、388、389、395、396、397、403、404及410。
如請求項47至52中任一項之組合物，其中該第二免疫原之抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成：SEQ ID No：311、312、313、314、315、316、317、326、327、328、329、330、331、340、341、342、343、344、353、354、355、356、365、366、367、376、377及386。
如請求項47至52中任一項之組合物，其中該第二免疫原之抗原性IgE肽由選自由SEQ ID No：311、312、313、314、326、327、328、340、341及353組成之群的胺基酸序列組成。
如請求項47至52中任一項之組合物，其中該第二免疫原之抗原性IgE肽由選自由SEQ ID No：311、312及326組成之群的胺基酸序列組成。
如請求項47至52中任一項之組合物，其中該第二免疫原之抗原性IgE肽由選自由SEQ ID No：311及312組成之群的胺基酸序列組成。
如請求項47至52中任一項之組合物，其中該第二免疫原之抗原性IgE肽由SEQ ID No：312之胺基酸序列組成。
如請求項19之組合物，其中該組合物包含兩種免疫原且其中該第一免疫原之抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成：SEQ ID No：220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309及310。
如請求項19之組合物，其中該組合物包含兩種免疫原且其中該第一免疫原之抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成：SEQ ID No：220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、245、246、247、248、249、250、251、252、253、256、257、258、259、260、261、262、263、266、267、268、269、270、271、272、275、276、277、278、279、280、283、284、285、286、287、290、291、292、293、296、297、298、301、302及305。
如請求項19之組合物，其中該組合物包含兩種免疫原且其中該第一免疫原之抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成：SEQ ID No：220、221、222、223、224、225、226、227、233、234、235、236、237、238、239、245、246、247、248、249、250、256、257、258、259、260、266、267、268、269、275、276、277、283、284及290。
如請求項19之組合物，其中該組合物包含兩種免疫原且其中該第一免疫原之抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成：SEQ ID No：220、221、222、223、224、233、234、235、236、245、246、247、256、257及266。
如請求項19之組合物，其中該組合物包含兩種免疫原且其中該第一免疫原之抗原性IgE肽由選自由SEQ ID No：220、221、222、233、234及245組成之群的胺基酸序列組成。
如請求項19之組合物，其中該組合物包含兩種免疫原且其中該第一免疫原之抗原性IgE肽由選自由SEQ ID No：220及233組成之群的胺基酸序列組成。
如請求項19之組合物，其中該組合物包含兩種免疫原且其中該第一免疫原之抗原性IgE肽由SEQ ID No：220之胺基酸序列組成。
如請求項69至75中任一項之組合物，其中該第二免疫原之抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成：SEQ ID No：311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429及430。
如請求項69至75中任一項之組合物，其中該第二免疫原之抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成：SEQ ID No：311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、365、366、367、368、369、370、371、372、373、376、377、378、379、380、381、382、383、386、387、388、389、390、391、 392、395、396、397、398、399、400、403、404、405、406、407、410、411、412、413、416、417、418、421、422及425。
如請求項69至75中任一項之組合物，其中該第二免疫原之抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成：SEQ ID No：311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、326、327、328、329、330、331、332、333、334、340、341、342、343、344、345、346、347、353、354、355、356、357、358、359、365、366、367、368、369、370、376、377、378、379、380、386、387、388、389、395、396、397、403、404及410。
如請求項69至75中任一項之組合物，其中該第二免疫原之抗原性IgE肽由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成：SEQ ID No：311、312、313、314、315、316、317、326、327、328、329、330、331、340、341、342、343、344、353、354、355、356、365、366、367、376、377及386。
如請求項69至75中任一項之組合物，其中該第二免疫原之抗原性IgE肽由選自由SEQ ID No：311、312、313、314、326、327、328、340、341及353組成之群的胺基酸序列組成。
如請求項69至75中任一項之組合物，其中該第二免疫原之抗原性IgE肽由選自由SEQ ID No：311、312及326組成之群的胺基酸序列組成。
如請求項69至75中任一項之組合物，其中該第二免疫原之抗原性IgE肽由選自由SEQ ID No：311及312組成之群的胺基酸序列組成。
如請求項69至75中任一項之組合物，其中該第二免疫原之抗原性IgE肽由SEQ ID No：312之胺基酸序列組成。
如請求項19至27、47至52及69至75中任一項之組合物，其中該等抗原性IgE肽係連接於選自由HBcAg VLP、HBsAg VLP及Qβ VLP組成之群的免疫原性載體。
如請求項19至27、47至52及69至75中任一項之組合物，其中該等抗原性IgE肽係個別地與該等免疫原性載體結合。
一種包含兩種免疫原之組合物，此等免疫原各由如請求項1之抗原性IgE肽個別地與免疫原性載體結合組成。
如請求項86之組合物，其中該第一免疫原係由或基本上由SEQ ID No：220、221、233、234、244及246之一個胺基酸序列組成之抗原性IgE肽連接於免疫原性載體組成。
如請求項87之組合物，其中該抗原性IgE肽由或基本上由SEQ ID No：220或233之胺基酸序列組成。
如請求項88之組合物，其中該抗原性IgE肽由或基本上由SEQ ID No：220之胺基酸序列組成。
如請求項87至89中任一項之組合物，其中該免疫原性載體係選自由HBcAg VLP、HBsAg VLP及Qβ VLP組成之群。
如請求項90之組合物，其中該免疫原性載體為Qβ VLP。
如請求項91之組合物，其中該Qβ病毒樣粒子由SEQ ID NO：435之Qβ病毒樣粒子組成。
如請求項91之組合物，其中該抗原性IgE肽係使用SMPH(丁二醯亞胺基-6-[β-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺基]己酸酯)作為交聯劑經由硫醚鍵聯以化學方式與該Qβ病毒樣粒子交聯，該鍵聯位於該病毒樣粒子之離胺酸殘基與該抗原性IgE肽之半胱胺酸殘基之間。
如請求項87至89中任一項之組合物，其中該第二免疫原係由或基本上由SEQ ID No：311、312或326之一個胺基酸序列組成之第二抗原性IgE肽連接於第二免疫原性載體組成。
如請求項94之組合物，其中該第二抗原性IgE肽由或基本上由SEQ ID No：311或312之胺基酸序列組成。
如請求項95之組合物，其中該第二抗原性IgE肽由或基本上由SEQ ID No：312之胺基酸序列組成。
如請求項94之組合物，其中該第二抗原性IgE肽在其C端進一步包含GC連接子。
如請求項97之組合物，其中在C端包含GC連接子之該第二抗原性IgE肽由或基本上由SEQ ID No：457之胺基酸序列組成。
如請求項94之組合物，其中該第二免疫原性載體係選自由HBcAg VLP、HBsAg VLP及Qβ VLP組成之群。
如請求項99之組合物，其中該免疫原性載體為Qβ VLP。
如請求項100之組合物，其中該Qβ病毒樣粒子由SEQ ID NO：435之Qβ病毒樣粒子組成。
如請求項100之組合物，其中在C端包含GC連接子之該第二抗原性IgE肽係使用SMPH(丁二醯亞胺基-6-[β-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺基]己酸酯)作為交聯劑經由硫醚鍵聯以化學方式與該Qβ病毒樣粒子交聯，該鍵聯位於該病毒樣粒子之離胺酸殘基與該C端連接子之半胱胺酸殘基之間。
一種包含兩種免疫原之組合物，其中此等免疫原各由抗原性IgE肽個別地與Qβ病毒樣粒子結合組成，其中：第一免疫原係由SEQ ID No：220之抗原性IgE肽使用SMPH(丁二醯亞胺基-6-[β-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺基]己酸酯)作為交聯劑經由硫醚鍵聯以化學方式與SEQ ID NO：435之Qβ病毒樣粒子交聯組成，該鍵聯位於該病毒樣粒子之離胺酸殘基與該抗原性IgE肽之半胱胺酸殘基之間，及第二免疫原係由SEQ ID No：457之多肽使用SMPH(丁二醯亞胺基-6-[β-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺基]己酸酯)作為交聯劑經由硫醚鍵聯以化學方式與SEQ ID NO：435之Qβ病毒樣粒子交聯組成，該鍵聯位於該病毒樣粒子之離胺酸殘基與該多肽之半胱胺酸殘基之間。
一種免疫原性組合物，其包含如請求項1至18中任一項之免疫原或如請求項19至103中任一項之免疫原組合物，其進一步包含至少一種選自由明礬、含有CpG之寡核苷酸、及基於皂苷之佐劑組成之群的佐劑。
如請求項104之免疫原性組合物，其中該至少一種佐劑為選自由CpG7909(SEQ ID NO：433)、CpG 10103(SEQ ID NO：432)及CpG24555(SEQ ID NO：431)組成之群的含有CpG之寡核苷酸。
如請求項104之免疫原性組合物，其中該至少一種佐劑為基於皂苷之佐劑。
一種免疫原性組合物，其包含如請求項1至18中任一項之免疫原或如請求項19至103中任一項之免疫原組合物，其進一步包含至少兩種選自由明礬、含有CpG之寡核苷酸、及基於皂苷之佐劑組成之群的佐劑。
如請求項107之免疫原性組合物，其中該等佐劑為明礬及CpG24555(SEQ ID NO：431)。
一種醫藥組合物，其包含如請求項1至18中任一項之免疫原，或如請求項19至103中任一項之免疫原組合物，或如請求項104至108中任一項之免疫原性組合物，及醫藥學上可接受之賦形劑。
如請求項1至13中任一項之免疫原，其用作藥劑。
如請求項1至13中任一項之免疫原，其用於預防、減輕或治療IgE介導之病症。
如請求項111之免疫原，其中該IgE介導之病症為哮喘。
一種如請求項1至18中任一項之免疫原或如請求項19至103中任一項之免疫原組合物或如請求項104至108中任一項之免疫原性組合物或如請求項109之醫藥組合物的用途，其用於製造供預防、減輕或治療個體之IgE相關病症的藥劑。
如請求項113之用途，其中該IgE介導之病症為哮喘。
一種核酸，其編碼如請求項1至18中任一項之免疫原。
一種表現載體，其包含如請求項115之核酸。
一種宿主細胞，其包含如請求項116之表現載體。