TWI400085B - Ｐｃｓｋ９疫苗 - Google Patents
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Description
本發明係關於提供新穎免疫原，其包含抗原性PCSK9肽，較佳連接於免疫原性載體，用於預防、治療或減輕PCSK9相關病症。本發明另外關於製造此等藥劑之方法，其免疫原性組合物及醫藥組合物，及其在醫學中之用途。
kexin型前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白9(下文稱為「PCSK9」)，亦稱為神經細胞凋亡調控轉化酶1(「NARC-1」)，為一種鑑別為哺乳動物PCSK家族之第9個成員的蛋白酶K樣枯草桿菌酶(subtilase)；參見Seidah等人，2003 PNAS 100:928-933。PCSK9之基因位於人類染色體1p33-p34.3。PCSK9表現於能夠增殖及分化之細胞內，包括例如肝細胞、腎臟間充質細胞、迴腸及結腸上皮細胞以及胚胎終腦神經元。
PCSK9之初始合成呈約72 kDa之非活性酶前驅體或酶原形式，其在內質網(「ER」)中發生自催化分子內加工以使其官能基活化。長約22 kb且具有12個編碼含692個胺基酸之蛋白質的外顯子的人類PCSK9之基因序列可以例如寄存編號NP_777596.2獲得。人類、小鼠及大鼠PCSK9核酸序列已寄存；分別參見例如GenBank寄存編號：AX127530(亦為AX207686)、AX207688及AX207690。
人類PCSK9為主要表現於腎臟、肝臟及腸中之分泌蛋白質。其具有三個域：抑制前域(胺基酸1-152；包括胺基酸1-30之信號序列)、催化域(胺基酸153-448)、及富含半胱胺酸殘基之長度為210個殘基之C端域(胺基酸449-692)。PCSK9經合成為酶原，其在內質網中在前域與催化域之間發生自催化裂解。前域在裂解後仍結合於成熟蛋白質，且分泌出複合物。富含半胱胺酸之域可發揮類似於對活化蛋白酶之摺疊及調控而言似乎必不可少的其他Furin/Kexin/枯草桿菌蛋白樣絲胺酸蛋白酶之P(加工)域之作用。PCSK9之突變可導致血漿中低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c)之含量異常(Horton等人，2006 Trends. Biochem. Sci. 32(2):71-77)。
PCSK9在肝臟及神經元細胞分化中發揮作用(Seidah等人，同上)，高度表現於胚胎肝臟中，且與膽固醇動態平衡密切相關。
極需鑑別有效治療心血管病痛之化合物及/或藥劑。臨床試驗中已證明LDL膽固醇含量之降低與冠狀動脈事件率直接相關；Law等人，2003 BMJ 326: 1423-1427。另外，最近血漿LDL膽固醇含量之終生適度降低已顯示實質上與冠狀動脈事件之發生率大幅降低相關；Cohen等人，同上。即使在非脂質相關心血管風險因子發生率高之群體中，情況亦如此；同上。
因此，鑑別可控制LDL膽固醇含量之治療劑十分重要。
因此，製造抑制或拮抗PCSK9之活性及PCSK9在各種治療病狀中發揮之相應作用的藥劑十分重要。
PCSK9之表現或上調與LDL膽固醇血漿含量之增加相關，且PCSK9之表現的抑制或缺乏與低LDL膽固醇血漿含量相關。顯著地，與PCSK9序列變化相關之較低LDL膽固醇含量能夠預防冠心病；Cohen,2006 N. Engl. J. Med. 354: 1264-1272。
本發明係關於免疫原，其包含抗原性PCSK9肽及視情況存在之免疫原性載體。
本發明亦關於製造該抗原性PCSK9肽，視情況連接於免疫原性載體之方法。
本發明亦關於免疫原性組合物，其包含該抗原性PCSK9肽視情況連接於免疫原性載體，視情況包含一種或數種佐劑，較佳一或兩種佐劑。
本發明之另一態樣係關於包含本發明之抗原性PCSK9肽或其免疫原性組合物之醫藥組合物，以及該等組合物之醫學用途。
詳言之，本發明係關於本發明之抗原性PCSK9肽或其免疫原性或醫藥組合物，其用作藥劑，較佳用於治療、減輕或預防PCSK9相關病症。
詳言之，本發明係關於本發明之抗原性PCSK9肽或其免疫原性或醫藥組合物，其用作藥劑，較佳用於治療、減輕或預防與高膽固醇含量相關之疾病。
本發明之抗原性PCSK9肽特別適於治療罹患以下疾病或處於罹患以下疾病之風險中的人類患者：高LDL-膽固醇或與高LDL-膽固醇相關之病狀，例如脂質病症(例如高脂血症，第I型、第II型、第III型、第IV型或第V型高脂血症、繼發性高甘油三酸酯血症、高膽固醇血症、家族性高膽固醇血症、黃瘤病、膽固醇乙醯基轉移酶缺乏)。本發明之抗原性PCSK9肽亦適於治療罹患動脈硬化病狀(例如動脈粥樣硬化症)、冠狀動脈疾病、心血管疾病之人類患者及處於罹患此等病症風險中之患者，例如歸因於存在一或多個風險因子(例如高血壓、吸菸、糖尿病、肥胖症或高同半胱胺酸血症(hyperhomocysteinemia))。
在又一態樣中，本發明提供本發明之抗原性PCSK9肽或其免疫原性組合物或醫藥組合物之用途，其用於製造治療阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)之藥劑。
在一實施例中，抗原性PCSK9肽或其免疫原性組合物或醫藥組合物與另一藥劑一起投與。
本發明係關於免疫原，其包含抗原性PCSK9肽視情況連接於免疫原性載體。
在一實施例中，抗原性PCSK9肽為PCSK9中包含4至20個胺基酸之部分，且在投與個體時能夠降低該個體血液中之LDL-膽固醇含量。較佳地，該個體為哺乳動物，較佳為人類。該抗原性PCSK9肽較佳能夠使LDL-膽固醇含量降低至少2%、5%、10%、20%、30%或50%。
在一實施例中，該抗原性PCSK9肽為PCSK9中參與PCSK9與LDL受體相互作用之部分。
在一實施例中，抗原性PCSK9肽為PCSK9中參與PCSK9與LDL受體相互作用且包含4至20個胺基酸之部分，且在投與個體時能夠降低該個體血液中之LDL-膽固醇含量。較佳地，該個體為哺乳動物，較佳為人類。該抗原性PCSK9肽較佳能夠使LDL-膽固醇含量降低至少2%、5%、10%、20%、30%或50%。
在一實施例中，抗原性PCSK9肽係選自由以下組成之群：SEQ ID No 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587及588。
在一實施例中，抗原性PCSK9肽係選自由以下組成之群：SEQ ID No 1至312、330至398、421、423、424、426及428至588。
在一實施例中，抗原性PCSK9肽係選自由以下組成之群：SEQ ID No 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397及398。
在一實施例中，抗原性PCSK9肽為PCSK9中可參與與LDL受體之EGF-A域相互作用之部分。該等部分之實例呈示於圖1上。
在一實施例中，抗原性PCSK9肽為PCSK9中可參與與LDL受體之EGF-A域相互作用且包含4至20個胺基酸之部分，且在投與個體時能夠降低該個體血液中之LDL-膽固醇含量。較佳地，該個體為哺乳動物，較佳為人類。該抗原性PCSK9肽較佳能夠使LDL-膽固醇含量降低至少2%、5%、10%、20%、30%或50%。
在一實施例中，抗原性PCSK9肽為包含SEQ ID No 1之PCSK9片段之5至13、較佳6至8個連續胺基酸的肽。
在一實施例中，抗原性PCSK9肽係選自由以下組成之群：SEQ ID No 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44及45。
在一實施例中，抗原性PCSK9肽為包含SEQ ID No 46之PCSK9片段之5至15、較佳6至8個連續胺基酸的肽。
在一實施例中，抗原性PCSK9肽係選自由以下組成之群：SEQ ID No 46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100及101。
在一實施例中，抗原性PCSK9肽為包含SEQ ID No 102之PCSK9片段之5至14、較佳6至8個連續胺基酸的肽。
在一實施例中，抗原性PCSK9肽係選自由以下組成之群：SEQ ID No 102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145及146。
在一實施例中，抗原性PCSK9肽為包含SEQ ID No 147之PCSK9片段之5至13、較佳6至8個連續胺基酸的肽。
在一實施例中，抗原性PCSK9肽係選自由以下組成之群：SEQ ID No 147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180及181。
在一實施例中，抗原性PCSK9肽為包含SEQ ID No 182之PCSK9片段之5至13、較佳6至8個連續胺基酸的肽。
在一實施例中，抗原性PCSK9肽係選自由以下組成之群：SEQ ID No 182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225及226。
在一實施例中，抗原性PCSK9肽為包含SEQ ID No 330之PCSK9片段之5至13、較佳6至8個連續胺基酸的肽。
在一實施例中，抗原性PCSK9肽係選自由以下組成之群：SEQ ID No 330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358及359。
在一較佳實施例中，抗原性PCSK9肽係選自由以下組成之群：SEQ ID No 19、56、63、109、153、165、184、186、187、188、332及424。
在一較佳實施例中，抗原性PCSK9肽係選自由以下組成之群：SEQ ID No 19、56、63、109、153及184。
在一較佳實施例中，抗原性PCSK9肽係選自由以下組成之群：SEQ ID No 56、184、186、187、188及332。
在一最佳實施例中，抗原性PCSK9肽為序列SEQ ID No 56之肽。
在一更佳實施例中，抗原性PCSK9肽為序列SEQ ID No 184或187之肽。
在一最佳實施例中，抗原性PCSK9肽為序列SEQ ID No 184之肽。
在一最佳實施例中，抗原性PCSK9肽為序列SEQ ID No 332之肽。
在一實施例中，抗原性PCSK9肽係選自PCSK9中可參與與LDL受體除EGF-A域以外之區相互作用的區。該等部分之實例呈示於圖7及8上。
在一實施例中，抗原性PCSK9肽為PCSK9中可參與與LDL受體除EGF-A域以外的區相互作用且包含4至20個胺基酸的部分，且在投與個體時能夠降低該個體血液中之LDL-膽固醇含量。較佳地，該個體為哺乳動物，較佳為人類。該抗原性PCSK9肽較佳能夠使LDL-膽固醇含量降低至少2%、5%、10%、20%、30%或50%。
在一實施例中，抗原性PCSK9肽為包含SEQ ID No 227之PCSK9片段之5至12、較佳6至8個連續胺基酸的肽。
在一實施例中，抗原性PCSK9肽係選自由以下組成之群：SEQ ID No 227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261及262。
在一實施例中，抗原性PCSK9肽為包含SEQ ID No 263之PCSK9片段之5至13、較佳6至8個連續胺基酸的肽。
在一實施例中，抗原性PCSK9肽係選自由以下組成之群：SEQ ID No 263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306及307。
在一實施例中，抗原性PCSK9肽為包含SEQ ID No 360之PCSK9片段之5至13、較佳6至8個連續胺基酸的肽。
在一實施例中，抗原性PCSK9肽係選自由以下組成之群：SEQ ID No 360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397及398。
在一實施例中，抗原性PCSK9肽係選自PCSK9前域(SEQ ID No 329)之區。
在一實施例中，抗原性PCSK9肽為PCSK9前域中包含4至20個胺基酸之部分，且在投與個體時能夠降低該個體血液中之LDL-膽固醇含量。較佳地，該個體為哺乳動物，較佳為人類。該抗原性PCSK9肽較佳能夠使LDL-膽固醇含量降低至少2%、5%、10%、20%、30%或50%。
在一實施例中，抗原性PCSK9肽係選自由以下組成之群：SEQ ID No 308、309、310、311及312。
在一實施例中，抗原性PCSK9肽為包含SEQ ID No 309之PCSK9片段之5至12、較佳6至8個連續胺基酸的肽。
在一實施例中，抗原性PCSK9肽係選自由以下組成之群：SEQ ID No 309、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462及463。
在一實施例中，抗原性PCSK9肽為包含SEQ ID No 508之PCSK9片段之5至12、較佳6至8個連續胺基酸的肽。
在一實施例中，抗原性PCSK9肽係選自由以下組成之群：SEQ ID No 508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542及543。
在一實施例中，抗原性PCSK9肽為包含SEQ ID No 310之PCSK9片段之5至13、較佳6至8個連續胺基酸的肽。
在一實施例中，抗原性PCSK9肽係選自由以下組成之群：SEQ ID No 310、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506及507。
在一實施例中，抗原性PCSK9肽為包含SEQ ID No 544之PCSK9片段之5至13、較佳6至8個連續胺基酸的肽。
在一實施例中，抗原性PCSK9肽係選自由以下組成之群：SEQ ID No 544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587及588。
在一較佳實施例中，抗原性PCSK9肽係選自由以下組成之群：SEQ ID No 312、421、422、423、426、427、428、445、482、525及563。
在一更佳實施例中，抗原性PCSK9肽係選自由以下組成之群：SEQ ID No 445、482、525及563。
在一最佳實施例中，抗原性PCSK9肽為序列SEQ ID No 445之肽。
該等抗原性PCSK9肽可單獨或組合使用，較佳在結合於免疫原性載體時，誘導個體中之自體抗PCSK9抗體以治療、預防或改善PCSK9相關病症。
熟習此項技術者應顯而易知何種技術可用於確證特定構築體是否屬於本發明之範疇。該等技術包含(但不限於)本申請案實例部分以及下文所述之技術。
可使用本申請案實例3所揭示之測試在小鼠中量測本發明抗原性PCSK9肽誘導自體抗PCSK9抗體之能力。可使用實例3所揭示之測試在小鼠中量測本發明抗原性PCSK9肽所誘導之自體抗體降低循環血漿膽固醇含量之能力。可使用實例3揭示之測試(FRET檢定)直接量測或藉由量測因阻斷PCSK9介導之下調所致的細胞表面LDL受體之上調(亦描述於相關文獻中，使用活體外細胞株或在抗體表現動物之肝臟生檢中量測LDL受體含量(例如西方墨點法(Western blotting)))間接量測本發明抗原性PCSK9肽所誘導之自體抗體抑制PCSK9與LDL受體之間的相互作用的能力。
術語「抗原性PCSK9肽生物活性」在本文中使用時係指本發明之抗原性PCSK9肽誘導患者之自體抗PCSK9抗體的能力。
該抗原性PCSK9肽較佳在投與個體時能夠降低該個體血液中之LDL-膽固醇含量。較佳地，該個體為哺乳動物，較佳為人類。該抗原性PCSK9肽較佳能夠使LDL-膽固醇含量降低至少2%、5%、10%、20%、30%或50%。
在一實施例中，本發明之抗原性PCSK9肽具有使其模擬選自整個PCSK9域中存在天然抗原決定基之區的尺寸。在一特定實施例中，本發明之抗原性PCSK9肽的長度小於100個胺基酸，較佳短於75個胺基酸，更佳小於50個胺基酸，甚至更佳小於40個胺基酸。本發明之抗原性PCSK9肽的長度通常為4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個胺基酸，較佳為4至20個胺基酸，例如6至12個、6至8、或9至12個胺基酸。
在序列表中提供本發明之抗原性PCSK9肽的特定實例且其包括長度在5至17個胺基酸範圍內之肽。
本發明之抗原性肽包括衍生自哺乳動物PCSK9、較佳人類PCSK9(SEQ ID No 399)或小鼠PCSK9(SEQ ID No 400)、更佳人類PCSK9之一部分的胺基酸序列，該PCSK9衍生部分對應於天然存在之PCSK9的胺基酸序列或對應於變異PCSK9，亦即已有少量胺基酸經取代、添加或缺失但保留基本上相同免疫性質之天然存在之PCSK9的胺基酸序列。另外，該PCSK9衍生部分可進一步經胺基酸修飾，尤其在N及C末端，使得抗原性PCSK9肽之構形受限制及/或使得在進行適當化學作用後抗原性PCSK9肽與免疫原性載體偶合。
本文所揭示之抗原性PCSK9肽包涵衍生自PCSK9胺基酸序列的功能活性變異肽，其中已有胺基酸缺失、插入或經取代但基本上不降低其免疫性質，亦即該等功能活性變異肽保留實質性抗原性PCSK9肽生物活性。通常，該等功能變異肽具有與選自由SEQ ID No 1至312、330至398、及420至588組成之群的胺基酸序列同源、較佳高度同源之胺基酸序列。
在一實施例中，該等功能活性變異肽與選自由SEQ ID No 1至312、330至398、及420至588組成之群的胺基酸序列展現至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%一致性。
多肽之序列相似性(亦稱為序列一致性)通常使用序列分析軟體來量測。蛋白質分析軟體使用歸因於各種取代、缺失及其他修飾(包括保守性胺基酸取代)之相似性量度來匹配類似序列。舉例而言，GCG含有諸如「Gap」及「Bestfit」之程式，其可在預設參數下用於測定密切相關多肽(諸如來自不同生物物種之同源多肽)之間或野生型蛋白質與其突變蛋白質之間的的序列同源性或序列一致性。參見例如6.1版GCG。多肽序列亦可使用FASTA(6.1版GCG中之程式)，使用預設或推薦參數來比較。FASTA(例如FASTA2及FASTA3)提供查詢及搜尋序列之間的最佳重疊區域的比對及序列一致性百分比(Pearson,Methods Enzymol. 183:63-98(1990)；Pearson,Methods Mol. Biol. 132:185-219(2000))。當將本發明之序列與含有大量來自不同生物之序列的資料庫作比較時，替代算法為使用預設參數之電腦程式BLAST，尤其blastp或tblastn。參見例如Altschul等人，J. Mol. Biol. 215:403-410(1990)；Altschul等人，Nucleic Acids Res. 25:3389-402(1997)。
功能活性變異體包含天然存在之功能活性變異體(諸如對偶基因變異體及物種變異體)及可藉由例如突變誘發技術或藉由直接合成而產生之非天然存在之功能活性變異體。
功能活性變異體與SEQ ID No 1至312、330至398、及420至588所示之任何肽存在約例如1、2、3、4或5個胺基酸殘基之差異，但仍保留抗原性PCSK9生物活性。當此比較需要比對時，比對序列之最大同源性。變異位點可出現於肽之任何地方，只要生物活性實質上類似於SEQ ID No 1至312、330至398、及420至588所示之肽即可。
關於如何產生表型沉默胺基酸取代之指導提供於Bowie等人，Science,247: 1306-1310(1990)中，該文獻教示存在兩種研究胺基酸序列對改變之容許度的主要策略。
第一種策略開發進化過程中自然選擇之胺基酸取代容許度。藉由比較不同物種之胺基酸序列，可鑑別物種間保留之胺基酸位置。此等保留之胺基酸可能對於蛋白質功能很重要。相反，自然選擇所容許之取代所在的胺基酸位置表示對於蛋白質功能不重要之位置。因此，可修飾容許胺基酸取代之位置，同時仍維持經修飾肽之特異性免疫原性活性。
第二種策略利用遺傳工程改造在經選殖基因之特定位置處引入胺基酸變化以鑑別對於蛋白質功能重要之區域。舉例而言，可使用定點突變誘發或丙胺酸掃描突變誘發(Cunningham等人，Science,244: 1081-1085(1989))。接著可測試所得變異肽之特異性抗原性PCSK9生物活性。
根據Bowie等人，此兩種策略已揭露蛋白質具有驚人的胺基酸取代容許度。作者進一步指出在蛋白質中之某些胺基酸位置處可能容許何種胺基酸變化。舉例而言，大部分內埋或內部(在蛋白質之三級結構內)胺基酸殘基需要非極性側鏈，而一般極少保留表面或外部側鏈之特徵。
將突變引入蛋白質之胺基酸中的方法為熟習此項技術者所熟知。參見例如Ausubel(編),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Inc.(1994)；T. Maniatis,E. F. Fritsch及J. Sambrook,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor laboratory,Cold Spring Harbor,N. Y.(1989)。
亦可使用市售套組(諸如「QuikChangeTM定點突變誘發套組」(Stratagene))或直接藉由肽合成來引入突變。熟習此項技術者可藉由置換不顯著影響抗原性PCSK9肽之功能的胺基酸來產生該抗原性PCSK9肽之功能活性變異體。
一類可在本發明之一種肽中進行的胺基酸取代為保守性胺基酸取代。「保守性胺基酸取代」為一胺基酸殘基經另一側鏈R基團具有類似化學性質(例如電荷或疏水性)之胺基酸殘基取代。一般而言，保守性胺基酸取代不會實質上改變蛋白質之功能性質。在兩個或兩個以上胺基酸序列彼此不同之處為保守性取代之情況下，可調高序列一致性或相似度百分比以校正該取代之保守性質。進行此調節之方式為熟習此項技術者所熟知。參見例如Pearson,Methods Mol. Biol. 243:307-31(1994)。
側鏈具有類似化學性質之胺基酸組的實例包括：1)脂族側鏈：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸；2)脂族羥基側鏈：絲胺酸及蘇胺酸；3)含有醯胺之側鏈：天冬醯胺及麩醯胺酸；4)芳族側鏈：苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸；5)鹼性側鏈：離胺酸、精胺酸及組胺酸；6)酸性側鏈：天冬胺酸及麩胺酸；及7)含硫側鏈：半胱胺酸及甲硫胺酸。較佳保守性胺基酸取代組為：纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸、麩胺酸-天冬胺酸及天冬醯胺-麩醯胺酸。
或者，保守性置換為Gonnet等人，Science 256:1443-45(1992)中所揭示之PAM250對數概似矩陣具有正值之任何改變。「中度保守性」置換為PAM250對數概似矩陣具有非負值之任何改變。
功能活性變異肽亦可使用雜交技術來分離。簡言之，使用與編碼所需肽(例如SEQ ID No 1至312、330至398、及420至588)之核酸序列的全部或一部分具有高同源性之DNA來製備功能活性肽。因此，本發明之抗原性PCSK9肽亦包括如下肽：功能上等同於SEQ ID No 1至312、330至398、及420至588之一或多種肽且由與編碼SEQ ID No 1至312、330至398、及420至588中之任一者之核酸或其互補序列雜交的核酸分子編碼。熟習此項技術者可容易地使用易於得到之密碼子表來確定編碼本發明之肽的核酸序列。因此，本文中不提供此等核酸序列。
編碼功能活性變異體肽、多肽或蛋白質之核酸的雜交嚴格度為例如10%甲醯胺、5×SSPE、1×登氏溶液(Denhart's solution)及1×鮭魚精子DNA(低嚴格度條件)。更佳條件為25%甲醯胺、5×SSPE、1×登氏溶液及1×鮭魚精子DNA(中等嚴格度條件)，且甚至更佳條件為50%甲醯胺、5×SSPE、1×登氏溶液及1×鮭魚精子DNA(高嚴格度條件)。然而，除上述甲醯胺濃度外，若干種因素會影響雜交嚴格度，且熟習此項技術者可適當地選擇此等因素以達到類似嚴格度。
編碼功能活性變異體之核酸分子亦可藉由諸如PCR之基因擴增方法，使用編碼所需肽、多肽或蛋白質(例如SEQ ID No 1至312、330至398、及420至588所示之任一肽)之核酸分子DNA之一部分作為探針來分離。
在本發明之一實施例中，本發明之肽係來源於天然來源且自諸如人類、靈長類動物、貓、狗、馬、小鼠或大鼠之哺乳動物，較佳自人類來源分離。因此，本發明之肽可使用標準蛋白質純化技術自細胞或組織來源分離。
或者，本發明之肽可以化學方式合成或使用重組DNA技術產生。
舉例而言，本發明之肽可藉由此項技術中熟知之固相程序來合成。適合之合成可藉由使用「T-boc」或「F-moc」程序來執行。環狀肽可藉由固相程序，使用熟知之「F-moc」程序及聚醯胺樹脂，在完全自動裝置中合成。或者，熟習此項技術者將知曉手動執行製程之必要實驗步驟。用於固相合成之技術及程序描述於E. Atherton及R. C. Sheppard之「Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach」,Oxford University Press之IRL出版(1989)及D. Andreau等人之「Methods in Molecular Biology」,第35卷：Peptide Synthesis Protocols(M. W.Pennington及B. M. Dunn編),第7章，第91-171頁中。
或者，可使用此項技術中熟知之技術將編碼本發明之肽的聚核苷酸引入可在適合之表現系統中表現之表現載體中，隨後分離或純化所表現之所需肽、多肽或蛋白質。此項技術中可使用各種細菌、酵母、植物、哺乳動物及昆蟲表現系統且可使用任何該種表現系統。編碼本發明之肽的聚核苷酸視情況可在無細胞轉譯系統中轉譯。
本發明之抗原性PCSK9肽亦可包含因存在多個基因、替代性轉錄事件、替代性RNA拼接事件及替代性轉譯與轉譯後事件而產生之彼等肽。肽可在引起與該肽在天然細胞中表現時所存在實質上相同的轉譯後修飾之系統(例如培養細胞)中表現，或在引起在天然細胞中表現時所存在之轉譯後修飾(例如糖基化或裂解)改變或省略的系統中表現。
本發明之抗原性PCSK9肽可製備成融合蛋白形式，該融合蛋白含有其他非PCSK9或非PCSK9衍生之胺基酸序列，諸如胺基酸連接子或信號序列或如本文所定義之免疫原性載體，以及適用於蛋白質純化之配位體，諸如麩胱甘肽-S-轉移酶、組胺酸標籤及葡萄球菌蛋白A。一種以上本發明之抗原性PCSK9肽可以融合蛋白形式存在。異源多肽可例如與本發明肽的N端或C端融合。本發明之肽亦可製備成包含同源胺基酸序列(亦即其他PCSK9或PCSK9衍生之序列)的融合蛋白形式。
本發明之抗原性PCSK9肽可呈線性或構形受限制。如本文中關於肽所使用，術語「構形受限制」意謂肽之三維結構隨時間實質上維持一種空間排列。構形受限制之分子可具有改良之性質，諸如親和力、代謝穩定性、膜滲透性或溶解性增加。
另外，預期該等構形受限制之肽提供構形類似於其天然環構形之抗原性PCSK9抗原決定基，從而誘導抗PCSK9抗體更易識別完整之天然自體PCSK9分子或以增加之親和力識別自體PCSK9分子。構形限制之方法為此項技術所熟知且包括(但不限於)橋接及環化。
先前技術中已知若干種方法將構形限制引入線性肽中。舉例而言，肽中兩個相鄰胺基酸之間的橋接引起局部構形改變，其可撓性與規則肽相比受限制。可能形成該等橋鍵之情況包括併入內醯胺及哌嗪酮(關於評論，請參見Giannis及Kolter,Angew. Chem. Int. Ed.,1993,32: 1244)。
如本文中關於肽所使用，術語「環狀」係指在兩個非相鄰胺基酸或胺基酸類似物之間包括分子內鍵之結構。環化可經由共價或非共價鍵來實現。分子內鍵包括(但不限於)主鏈與主鏈、側鏈與主鏈、側鏈與側鏈、側鏈與端基、端基與端基之間的鍵。環化方法包括(但不限於)在肽之N末端殘基與C末端殘基之間形成醯胺鍵、在非相鄰胺基酸或胺基酸類似物之側鏈之間形成二硫鍵；在Lys與Asp/Glu殘基之側鏈之間形成醯胺鍵；在絲胺酸殘基與Asp/Glu殘基之間形成酯鍵；例如在一個胺基酸或其類似物之側鏈基團與胺基端殘基之N端胺之間形成內醯胺鍵；及形成離胺酸正白胺酸及二酪胺酸鍵。亦可使用二硫鍵之碳形式(例如乙烯基或乙基鍵)(J. Peptide Sc.,2008,14
,898-902)，以及與經適當多取代之親電子試劑(諸如二鹵烷烴、三鹵烷烴或四鹵烷烴)的烷基化反應(PNAS,2008,105
(40),15293-15298;ChemBioChem,2005,6
,821-824)。各種經修飾之脯胺酸類似物亦可用於將構形限制併入肽中(Zhang等人，J. Med Chem.,1996,39: 2738-2744；Pfeifer及Robinson,Chem. Comm.,1998,1977-1978)。可用於使本發明之肽環化的化學作用產生以包括(但不限於)以下之鍵環化的肽：內醯胺、腙、肟、噻唑烷、硫醚或鋶鍵。
US 10/114918中所述之設計構形受限制之肽的另一種方法為將所需短胺基酸序列連接於模板，產生環狀受限制肽。該等環狀肽不僅由其模板使得結構穩定，且藉此提供可模擬天然蛋白質上(諸如病毒及寄生蟲上)或自身蛋白質(自體性哺乳動物蛋白質，諸如PCSK9)上之構形抗原決定基的三維構形，而且其對血清中蛋白水解性降解的抗性高於線性肽。US 10/114918進一步揭示藉由製備合成胺基酸以與適當位置處之胺基酸進行主鏈偶合以使肽之超二級結構穩定來合成構形受限制之交聯肽。交聯可藉由正交保護之(2S,3R)-3-胺基脯胺酸殘基之一級胺基與適當位置處之麩胺酸側鏈羧基進行醯胺偶合來達成。在製備CS蛋白之構形受限制之四肽重複序列時按照此方法，其中至少一個脯胺酸由(2S,3R)-3-胺基脯胺酸置換且為了引入側鏈羧基，併有麩胺酸以置換丙胺酸。
交聯策略亦包括應用格羅布斯閉環複分解反應(Grubbs ring-closing metathesis reaction)以形成設計成模擬α螺旋構形之「卡釘型(stapled)」肽(Angew. Int. Ed. Engl.,1998,37
,3281;JACS,2000,122
,5891)；使用多官能化醣；使用胺基羧乙基硫色胺酸(tryptathionine)鍵(Chemistry Eu. J.,2008,24
,3404-3409)；使用疊氮化物與炔烴的「點擊(click)」反應，其可作為側鏈胺基酸殘基併入或位於肽序列之主鏈中(Drug Disc. Today,2003,8
(24),1128-1137)。文獻中亦已知金屬離子可經由螯合與金屬陽離子配位之特定殘基(例如組胺酸)而使線性肽之受限制構形穩定(Angew. Int. Ed. Engl.,2003,42
,421)。類似地，用非天然酸及胺官能基或多元胺及多元酸官能基使線性肽序列官能化可用於在活化及醯胺鍵形成後得到環化結構。
根據一實施例，抗原性PCSK9肽因抗原性PCSK9肽之兩個非相鄰胺基酸(例如N及C端胺基酸)彼此之間的分子內共價鍵結而構形受限制。根據另一實施例，本發明之抗原性PCSK9肽因共價結合於骨架分子而構形受限制。根據另一實施例，抗原性PCSK9肽受單一限制，亦即在一端(C或N端)或經由不位於任一端之另一胺基酸與骨架分子偶合。根據另一實施例，抗原性PCSK9肽受雙重限制，亦即在C端與N端均與骨架分子偶合。根據另一實施例，抗原性肽藉由經由異對掌性雙脯胺酸(Diproline)單元(D-Pro-L-Pro)之模板作用進行環化而受限制(Spath等人，1998,Helvetica Chimica Acta 81,第1726-1738頁)。
骨架(亦稱為「平台」)可為能夠經由共價鍵結減少抗原性PCSK9肽可採用之構形數的任何分子。構形限制性骨架之實例包括蛋白質及肽，例如脂質運載蛋白相關分子(諸如含有β桶狀體之硫氧還原蛋白及硫氧還原蛋白樣蛋白質)、核酸酶(例如RNaseA)、蛋白酶(例如胰蛋白酶)、蛋白酶抑制劑(例如水蛭素(eglin)C)、抗體或其結構剛性片段、螢光蛋白(諸如GFP或YFP)、芋螺毒素(conotoxin)、纖維結合蛋白III型域之環狀區、CTL-A4及病毒樣粒子(VLP)。
其他適合之平台分子包括碳水化合物，諸如瓊脂糖。該平台可為線性或環狀分子，例如閉合形成環。平台對於抗原性PCSK9肽一般為異源性的。認為該等連接於平台之構形受限制之肽對蛋白水解性降解之抗性高於線性肽。
根據一較佳實施例，該骨架為如本申請案中所定義之免疫原性載體。在另一實施例中，抗原性PCSK9肽單一限制於免疫原性載體上。在另一實施例中，抗原性PCSK9肽雙重限制於免疫原性載體上。以此方式，抗原性PCSK9肽形成構形受限制之環結構，其經證明為尤其適合作為細胞內識別分子之結構。
本發明之抗原性PCSK9肽可經修飾，以易於與平台結合，例如藉由在一端或兩端添加末端半胱胺酸及/或藉由添加連接序列(諸如雙甘胺酸頭或尾，加上末端半胱胺酸、以離胺酸殘基封端之連接子或熟習此項技術者已知執行該功能之任何其他連接子)來達成。該等連接子之詳情揭示於下文中。亦可使用使全肽序列與載體偶合之生物正交化學作用(諸如上述點擊反應)，由此避免任何區域化學及化學選擇性問題。已知剛化連接子(Rigidified linker)(諸如Jones等人Angew. Chem. Int. Ed. 2002,41:4241-4244中所述之連接子)會引起改良之免疫反應且亦可使用該等連接子。
在另一實施例中，抗原性PCSK9肽連接於其自身已與載體偶合之多價模板，由此增加抗原密度(參見下文)。該多價模板可為經適當官能化之聚合物或寡聚物，諸如(但不限於)寡聚麩胺酸(oligoglutamate)或殼寡糖(參見圖19)。
在本發明之一實施例中，本發明之抗原性PCSK9肽係連接於免疫原性載體分子，以形成用於疫苗接種方案之免疫原，較佳地其中該載體分子與天然PCSK9分子無關。
本文中之術語「免疫原性載體」包括如下彼等物質：具有獨立地引起宿主動物之免疫原性反應的特性且可直接經由在肽、多肽或蛋白質中之游離羧基、胺基或羥基與免疫原性載體物質上之相應基團之間形成肽或酯鍵，或者藉由透過習知雙官能鍵聯基團鍵結，或呈融合蛋白形式，與該肽、多肽或蛋白質共價偶合。
本發明之免疫原中所用的載體類型將容易為熟習此項技術者所知。該等免疫原性載體之實例為：血清白蛋白，諸如牛血清白蛋白(BSA)；球蛋白；甲狀腺球蛋白；血紅素；血氰蛋白(尤其匙孔螺血氰蛋白[Keyhole Limpet Hemocyanin/KLH])；多溶素；聚麩胺酸；離胺酸-麩胺酸共聚物；含離胺酸或鳥胺酸之共聚物；脂質體載體；結核菌素(tuberculin)純蛋白質衍生物(PPD)；失活之細菌毒素或類毒素，諸如破傷風或白喉毒素(TT及DT)或TT之片段C、CRM 197(無毒但抗原性相同之白喉毒素變異體)、其他DT點突變體，諸如CRM 176、CRM 228、CRM 45(Uchida等人，J. Biol. Chem. 218;3838-3844,1973)；CRM 9、CRM 45、CRM 102、CRM 103及CRM 107及Nicholls及Youle,Genetically Engineered Toxins,Frankel編,Maecel Dekker Inc,1992中所描述之其他突變；Glu-148缺失或突變成Asp、Gln或Ser及/或Ala 158缺失或突變成Gly及US 4709017或US 4950740中所揭示之其他突變；至少一或多個殘基Lys 516、Lys 526、Phe 530及/或Lys 534之突變及US 5917017或US 6455673中所揭示之其他突變；或US5843711中所揭示之片段、肺炎球菌溶血素(Kuo等人，(1995) Infect Immun 63;2706-13)，包括以某種方式解毒之ply，例如dPLY-GMBS(WO 04081515、PCT/EP2005/010258)或dPLY-甲醛、PhtX，包括PhtA、PhtB、PhtD、PhtE(WO 00/37105或WO 00/39299中揭示PhtA、PhtB、PhtD或PhtE之序列)及Pht蛋白質之融合體，例如PhtDE融合體、PhtBE融合體、Pht A-E(WO 01/98334、WO 03/54007、WO 2009/000826)、OMPC(腦膜炎球菌外膜蛋白，通常提取自腦膜炎奈瑟氏菌(N. meningitidis)血清群B，EP0372501)、PorB(來自腦膜炎奈瑟氏菌)、PD(流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)蛋白D，參見例如EP 0 594 610 B)或其免疫功能等效物、合成肽(EP0378881、EP0427347)、熱休克蛋白(WO 93/17712、WO 94/03208)、百日咳蛋白(WO 98/58668、EP 0471 177)、細胞激素、淋巴激素、生長因子或激素(WO 91/01146)、包含多個來自各種病原體衍生抗原之人類CD4+ T細胞抗原決定基的人造蛋白(Falugi等人，(2001)Eur J Immunol 31;3816-3824)，諸如N19蛋白(Baraldoi等人，(2004) Infect Immun 72;4884-7)、肺炎球菌表面蛋白PspA(WO 02/091998)、鐵攝取蛋白(WO 01/72337)、難養芽孢梭菌(C. difficile)之毒素A或B(WO 00/61761)。
在一較佳實施例中，本發明之免疫原性載體為CRM197。
在另一實施例中，免疫原性載體為病毒樣粒子(VLP)，較佳為重組病毒樣粒子。
如本文中所使用，術語「病毒樣粒子」係指類似於病毒粒子但顯示為非病原性之結構。一般而言，病毒樣粒子缺乏病毒基因組之至少一部分。又，病毒樣粒子通常可藉由異源表現大量產生且可容易地經純化。本發明之病毒樣粒子可含有不同於其基因組之核酸。本發明之病毒樣粒子之一典型及較佳實施例為病毒衣殼，諸如相應病毒、噬菌體或RNA-噬菌體之病毒衣殼。
如本文中所使用，術語「噬菌體病毒樣粒子」係指類似於噬菌體結構、非複製性及非傳染性、且至少缺乏編碼噬菌體之複製機構之基因、且通常亦缺乏編碼負責病毒連接於宿主或進入宿主體內之蛋白質之基因的病毒樣粒子。然而，此定義亦應涵蓋如下噬菌體病毒樣粒子，其中上述基因仍存在，但無活性，且因此亦產生非複製性及非傳染性噬菌體病毒樣粒子。
由RNA噬菌體鞘蛋白之180個次單元的自組裝所形成且視情況含有宿主RNA之衣殼結構在本文中稱為「RNA噬菌體鞘蛋白之VLP」。特定實例為Qβ、MS2、PP7或AP205鞘蛋白之VLP。舉例而言，在Qβ鞘蛋白之特定情況下，VLP可僅僅由Qβ CP次單元(藉由表現含有例如TAA終止密碼子之Qβ CP基因，經由抑制來阻止較長A1蛋白之任何表現所產生，參見Kozlovska,T. M.等人，Intervirology 39: 9-15(1996))組裝，或另外在衣殼組件中含有A1蛋白次單元。衣殼組件中Qβ A1蛋白相對於Qβ CP之百分比一般將受限制，以確保衣殼形成。
在本發明之情形下，適合用作免疫原性載體之VLP的實例包括(但不限於)Qβ、MS2、PP7或AP205及其他噬菌體鞘蛋白之VLP、B型肝炎病毒之衣殼及核心蛋白(Ulrich等人，Virus Res. 50: 141-182(1998))、麻疹病毒(Warnes等人，Gene 160: 173-178(1995))、辛德比病毒(Sindbis virus)、輪狀病毒(美國專利第5,071,651號及第5,374,426號)、口蹄疫病毒(Twomey等人，Vaccine 13: 1603-1610,(1995))、諾沃克病毒(Norwalk virus)(Jiang,X.等人，Science 250: 1580-1583(1990)；Matsui,S. M.等人，J Clin. Invest. 87: 1456-1461(1991))、反轉錄病毒GAG蛋白(PCT專利申請案第WO 96/30523號)、反轉錄轉座子Ty蛋白pl、B型肝炎病毒之表面蛋白(WO 92/11291)、人類乳頭狀瘤病毒(WO 98/15631)、人類多瘤病毒(Sasnauskas K.等人，Biol. Chem. 380(3): 381-386(1999)；Sasnauskas K.等人，Generation of recombinant virus-like particles of different polyomaviruses in yeast.第三屆國際研討會「Virus-like particles as vaccines.」Berlin,9月26-29日(2001))、RNA噬菌體、Ty、fr噬菌體、GA-噬菌體、AP 205-噬菌體及尤其Qβ-噬菌體、豇豆褪綠斑駁病毒(Cowpea chlorotic mottle virus)、豇豆花葉病毒、人類乳頭狀瘤病毒(HPV)、牛乳頭狀瘤病毒、豬小病毒、小病毒(諸如B19、豬小病毒(PPV)及牛小病毒(CPV))、杯狀病毒(例如諾沃克病毒、兔出血病病毒[RHDV])、動物嗜肝DNA病毒核心抗原VLP、絲狀/桿狀植物病毒，包括(但不限於)菸草花葉病毒(Tobacco Mosaic Virus，TMV)、馬鈴薯病毒X(Potato Virus X，PVX)、番木瓜花葉病毒(Papaya Mosaic Virus，PapMV)、苜蓿花葉病毒(Alfalfa Mosaic Virus，AlMV)、及約翰遜草花葉病毒(Johnson Grass Mosaic Virus，JGMV)；昆蟲病毒，諸如獸棚病毒(flock house virus，FHV)及四病毒；多瘤病毒，諸如鼠類多瘤病毒(Murine Polyomavirus，MPyV)、鼠類親肺病毒(Murine Pneumotropic Virus，MPtV)、BK病毒(BKV)及JC病毒(JCV)。
如對於熟習此項技術者將顯而易見，欲用作本發明之免疫原性載體的VLP不限於任何特定形式。該粒子可以化學方式或經由自然或非自然之生物過程合成。舉例而言，此種類型之實施例包括病毒樣粒子或其重組形式。在一更特定實施例中，VLP可包含已知形成VLP之任何病毒的重組多肽或者由該等重組多肽組成。病毒樣粒子可另外包含該等多肽之一或多個片段以及該等多肽之變異體或者由其組成。在胺基酸層面上，多肽之變異體可與其野生型對應物共有例如至少80%、85%、90%、95%、97%或99%一致性。適合用於本發明之變異VLP可來源於任何生物，只要其能夠形成「病毒樣粒子」且可用作如本文所定義之「免疫原性載體」即可。
本發明之較佳VLP包括HBV之衣殼蛋白或表面抗原(分別為HBcAg及HBsAg)或其重組蛋白或片段，及RNA-噬菌體之鞘蛋白或其重組蛋白或片段，更佳為Qβ之鞘蛋白或其重組蛋白或片段。
在一實施例中，與本發明之抗原性PCSK9肽組合使用的免疫原性載體為HBcAg蛋白。在本發明之情形下可使用之HBcAg蛋白的實例可容易由熟習此項技術者確定。實例包括(但不限於)Yuan等人(J. Virol. 73: 10122-10128(1999))及WO 00/198333、WO 00/177158、WO 00/214478、WO WO 00/32227、WO 01/85208、WO 02/056905、WO 03/024480及WO 03/024481中所述之HBV核心蛋白。適合用於本發明之HBcAg可來源於任何生物，只要其能夠形成「病毒樣粒子」且可用作如本文所定義之「免疫原性載體」即可。
在本發明之情形下可使用之備受關注的HBcAg變異體為一或多個天然駐留半胱胺酸殘基缺失或經取代之變異體。此項技術中熟知，游離半胱胺酸殘基可參與許多化學副反應，包括二硫鍵交換、與例如在與其他物質之組合療法中注射或形成的化學物質或代謝物反應、或在曝露於UV光後直接氧化及與核苷酸反應。尤其考慮到HBcAg結合核酸之趨勢較強，因此可產生有毒加合物。該等有毒加合物會因此分佈於多種物質之間，其個別地可能各自以低濃度存在，但合起來會達到毒性水準。鑒於上文，疫苗組合物中使用經修飾以移除天然駐留半胱胺酸殘基之HBcAg之一個優點在於當連接抗原或抗原決定子時有毒物質可結合之位點數目將減少或全部消除。
另外，在本發明之情形下亦可使用缺乏B型肝炎核心抗原前驅蛋白之N端前導序列的HBcAg之經加工形式，尤其當在不會進行加工(例如在細菌系統中表現)之條件下產生HBcAg時。
本發明之其他HBcAg變異體包括：i)與一種野生型HBcAg胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、97%或99%一致性之多肽序列或其子部分，通常使用已知電腦程式；ii)C端截短之突變體，包括自C端移除1、5、10、15、20、25、30、34或35個胺基酸之突變體；iii)N端截短之突變體，包括自N端移除1、2、5、7、9、10、12、14、15或17個胺基酸之突變體；iv)在N端與C端皆截短之突變體，包括自N端移除1、2、5、7、9、10、12、14、15或17個胺基酸及自C端移除1、5、10、15、20、25、30、34或35個胺基酸之HBcAg。
在本發明之範疇內的其他HBcAg變異蛋白為為了增強外來抗原決定基之免疫原性呈現而加以修飾的變異體，其中四個精胺酸重複序列中之一或多者缺失，但其中C端半胱胺酸得以保留(參見例如WO 01/98333)；及嵌合C端截短之HBcAg，諸如WO 02/14478、WO 03/102165及WO 04/053091中所述之HBcAg。
在另一實施例中，與本發明之抗原性PCSK9肽組合使用的免疫原性載體為HBsAg蛋白。在本發明之情形下可使用的HBsAg蛋白可容易由熟習此項技術者確定。實例包括(但不限於)US5792463、WO 02/10416及WO 08/020331中所述之HBV表面蛋白。適合用於本發明之HBsAg可來源於任何生物，只要其能夠形成「病毒樣粒子」且可用作如本文所定義之「免疫原性載體」即可。
在又一實施例中，與本發明之抗原性PCSK9肽或多肽組合使用的免疫原性載體為Qβ鞘蛋白。
發現Qβ鞘蛋白在大腸桿菌中表現時會自組裝成衣殼(Kozlovska TM.等人，GENE 137: 133-137(1993))。所獲得之衣殼或病毒樣粒子顯示直徑為25 nm且具有T=3準對稱性之二十面體噬菌體樣衣殼結構。此外，噬菌體Qss之晶體結構已解出。衣殼含有180個鞘蛋白複本，其由二硫橋鍵連接成共價五聚體及六聚體形式(Golmohammadi,R.等人，Structure 4: 5435554(1996))，從而使得Qβ鞘蛋白之衣殼具有顯著穩定性。Qβ衣殼蛋白亦對有機溶劑及變性劑顯示特殊抗性。Qβ鞘蛋白之衣殼的高穩定性為有利特徵，對於其根據本發明用於哺乳動物及人類之免疫及疫苗接種而言尤其如此。
在本發明之情形下可使用之Qβ鞘蛋白的實例可容易由熟習此項技術者確定。實例已充分描述於WO 02/056905、WO 03/024480、WO 03/024481(以全文引用的方式併入本文中)中且包括(但不限於)PIR資料庫中所揭示之胺基酸序列，關於Qβ CP為登記號VCBPQβ；關於Qβ A1蛋白為登記號AAA16663；及其變異體，包括N端甲硫胺酸經裂解之變異蛋白；失去多達100、150或180個胺基酸之Qβ A1的C端截短形式；藉由缺失或取代來移除離胺酸殘基或藉由取代或插入來添加離胺酸殘基而修飾之變異蛋白(參見例如WO 03/024481中所揭示之Qβ-240、Qβ-243、Qβ-250、Qβ-251及Qβ-259，該案以全文引用的方式併入本文中)，及與上述任何Qβ核心蛋白展現至少80%、85%、90%、95%、97%或99%一致性之變異體。適合用於本發明之變異Qβ鞘蛋白可來源於任何生物，只要其能夠形成「病毒樣粒子」且可用作如本文所定義之「免疫原性載體」即可。
可經由化學結合或藉由表現經遺傳工程改造之融合搭配物，使本發明之抗原性PCSK9肽與免疫原性載體偶合。該偶合不一定需要為直接偶合，而可經由連接序列進行。更一般而言，在抗原性肽與免疫原性載體融合、結合或以其他方式連接的情況下，通常在抗原性肽之一端或兩端添加間隔或連接序列。該等連接序列一般包含由蛋白酶體、內體蛋白酶或細胞之其他泡狀區室蛋白酶識別之序列。
在一實施例中，本發明之肽以與免疫原性載體形成之融合蛋白形式表現。肽之融合可藉由插入免疫原性載體一級序列中或藉由與免疫原性載體之N或C端融合來實現。下文中，當提及肽與免疫原性載體之融合蛋白時，涵蓋與次單元序列之任一端融合或肽內插入載體序列中。如下文所提及之融合可藉由將抗原性肽插入載體序列中，藉由用抗原性肽取代載體序列之一部分，或藉由缺失、取代或插入之組合來實現。
當免疫原性載體為VLP時，嵌合抗原性肽-VLP次單元一般將能夠自組裝成VLP。呈現與次單元融合之抗原決定基的VLP在本文中亦稱為嵌合VLP。舉例而言，EP 0 421 635 B描述使用嵌合嗜肝DNA病毒核心抗原粒子來呈現病毒樣粒子中之外來肽序列。
可將側接胺基酸殘基添加至欲與VLP次單元序列之任一端融合的抗原性肽序列之任一端，或將該肽序列內插入VLP次單元之序列中。甘胺酸及絲胺酸殘基為意欲在添加至欲融合肽中的側接序列中使用之尤其有利的胺基酸。甘胺酸殘基賦予額外可撓性，其可減弱將外來序列融合至VLP次單元序列中之潛在不穩定作用。
在本發明之一特定實施例中，免疫原性載體為HBcAg VLP。抗原性肽與HBcAg之N端形成的融合蛋白(Neyrinck,S.等人，Nature Med. 5: 11571163(1999))或在所謂的主要免疫優勢區(major immunodominant region，MIR)中插入已有所描述(Pumpens,P.及Grens,E.,Intervirology 44: 98114(2001),WO 01/98333)，且為本發明之特定實施例。MIR中有缺失之天然存在之HBcAg變異體亦有所描述(Pumpens,P.及Grens,E.,Intervirology 44: 98-114(2001))，且與N或C端形成的融合物以及在MIR中對應於與wt HBcAg相比為缺失位點之位置處插入為本發明之其他實施例。與C端形成的融合物亦有所描述(Pumpens,P.及Grens,E.,Intervirology 44: 98-114(2001))。熟習此項技術者將容易獲得如何使用經典分子生物學技術構築融合蛋白之指導。編碼HBcAg及HBcAg融合蛋白且適用於表現HBcAg及HBcAg融合蛋白之載體及質體已有所描述(Pumpens,P.及#38;Grens,E. Intervirology 44: 98-114(2001)，Neyrinck,S.等人，Nature Med. 5: 1157-1163(1999))且可用於實施本發明。優化自組裝之效率及插入HBcAg之MIR中的抗原決定基之呈現之一重要因素為選擇插入位點，以及插入後HBcAg序列之MIR中缺失的胺基酸數目(Pumpens,P.及Grens,E.,Intervirology 44: 98-114(2001)；EP 0 421 635；美國專利第6,231,864號)，或換言之，HBcAg之哪些胺基酸經新抗原決定基取代。舉例而言，用外來抗原決定基取代HBcAg胺基酸76-80、79-81、79-80、75-85或80-81已有所描述(Pumpens,P.及Grens,E.,Intervirology 44: 98-114(2001)；EP0421635；US 6,231,864、WO 00/26385)。HBcAg含有長精胺酸尾(Pumpens,P.及Grens,E.,Intervirology 44: 98-114(2001))，其對於衣殼組件為非必需的且能夠結合核酸(Pumpens,P.及Grens,E.,Intervirology 44: 98-114(2001))。包含或缺乏此精胺酸尾之HBcAg皆為本發明之實施例。
在本發明之另一特定實施例中，免疫原性載體為RNA噬菌體之VLP，較佳為Qβ。RNA噬菌體之主要鞘蛋白在細菌中且尤其在大腸桿菌中表現後自發地組裝成VLP。抗原性肽與Qβ之A1蛋白之截短形式的C端融合或插入A1蛋白中之融合蛋白構築體已有所描述(Kozlovska,T. M.等人，Intervirology,39: 9-15(1996))。該A1蛋白係藉由在UGA終止密碼子處抑制而產生且若考慮N端甲硫胺酸之裂解，則長度為329 aa或328 aa。大腸桿菌中通常發生丙胺酸(由QβCP基因編碼之第二個胺基酸)前之N端甲硫胺酸的裂解，且Qβ鞘蛋白之N端亦如此。A1基因之一部分，UGA琥珀型密碼子之3'端編碼CP延長部分，其長度為195個胺基酸。在CP延長部分之位置72與73之間插入抗原性肽形成本發明之其他實施例(Kozlovska,T.M.等人，Intervirology 39: 9-15(1996))。抗原性肽融合於C端截短之Qβ A1蛋白的C端形成本發明之其他較佳實施例。舉例而言，Kozlovska等人(Intervirology,39: 9-15(1996))描述抗原決定基融合於在位置19處截短之Qβ CP延長部分之C端的Qβ A1蛋白融合物。
如由Kozlovska等人(Intervirology,39: 9-15(1996))所述，呈現融合之抗原決定基之粒子的組裝通常需要存在A1蛋白-抗原融合物以及wt CP以形成鑲嵌粒子。然而，包含病毒樣粒子且由此尤其RNA噬菌體Qβ鞘蛋白之VLP(僅由與抗原性肽融合之VLP次單元構成)的實施例亦在本發明之範疇內。
鑲嵌粒子之製造可以多種方法實現。Kozlovska等人，Intervirology,39: 9-15(1996)描述三種方法，全部均可用於實施本發明。在第一種方法中，融合之抗原決定基在VLP上之有效呈現係藉由在具有編碼經選殖之UGA抑制型tRNA從而使得UGA密碼子轉譯為Trp的質體(pISM3001質體(Smiley B. K.等人，Gene 134: 33-40(1993)))之大腸桿菌菌株中表現編碼在CP與CP延長部分之間具有UGA終止密碼子的Qβ A11蛋白融合物之質體來介導。在另一種方法中，CP基因終止密碼子經修飾成UAA，且表現A1蛋白-抗原融合物之第二質體經共轉型。該第二質體編碼不同抗生素抗性且複製起點與第一質體相容。在第三種方法中，CP及A1蛋白-抗原融合物以雙順反子方式編碼，可操作地連接於啟動子(諸如Trp啟動子)，如Kozlovska等人，Intervirology,39: 9-15(1996)之圖1中所述。
適於抗原或抗原決定子融合之其他VLP描述於WO 03/024481中且包括噬菌體fr、RNA噬菌體MS-2、乳頭狀瘤病毒之衣殼蛋白、反轉錄轉座子Ty、酵母以及反轉錄病毒樣粒子、HIV2 Gag、豇豆花葉病毒、小病毒VP2 VLP、HBsAg(US 4,722,840、EP0020416B1)。適於實施本發明之嵌合VLP的實例亦為Intervirology 39: 1(1996)中所述之VLP。預期用於本發明中之VLP的其他實例為：HPV-1、HPV-6、HPV-11、HPV-16、HPV-18、HPV-33、HPV-45、CRPV、COPV、HIV GAG、菸草花葉病毒，SV-40、多瘤病毒、腺病毒、單純疱疹病毒、輪狀病毒及諾沃克病毒之病毒樣粒子。
對於任何重組表現之偶合或不偶合免疫原性載體之本發明抗原性PCSK9肽，編碼該肽或蛋白質之核酸亦形成本發明之態樣，包含該核酸之表現載體及含有該表現載體(自主插入或插入染色體中)之宿主細胞亦形成本發明之態樣。藉由使肽或蛋白質在上述宿主細胞中表現來重組產生該肽或蛋白質及自其分離免疫原之方法為本發明之另一態樣。本發明不涵蓋全長天然PCSK9分子或編碼其之全長天然DNA序列。
在另一實施例中，使用此項技術中熟知之技術，使本發明之肽以化學方式與免疫原性載體偶合。可發生結合以允許肽經由單點結合(例如N端或C端點)或以肽之兩端皆與免疫原性載體蛋白或骨架結構(諸如VLP)結合之鎖定結構形式自由移動。結合經由熟習此項技術者已知之結合化學作用發生，諸如經由半胱胺酸殘基、離胺酸殘基或通常稱為結合點之其他羧基部分(諸如麩胺酸或天冬胺酸)。因此，舉例而言，直接共價偶合可利用碳化二亞胺、戊二醛或N-[y-順丁烯二醯亞胺基丁醯氧基]丁二醯亞胺酯，使用常見市售之異雙官能連接子(諸如CDAP及SPDP)(使用製造商之說明書)。肽(尤其環化肽)經由醯肼肽衍生物與蛋白質載體結合之實例描述於WO 03/092714中。偶合反應後，免疫原可容易藉助於透析方法、凝膠過濾方法、分餾方法等來分離及純化。以半胱胺酸殘基(較佳連接子在環化區以外)封端之肽宜經由順丁烯二醯亞胺化學作用與載體蛋白結合。
當免疫原性載體為VLP時，可使具有相同胺基酸序列或不同胺基酸序列之若干個抗原性肽與單個VLP分子偶合，較佳產生以定向方式呈現若干抗原決定子之重複及有序結構，如WO 00/32227、WO 03/024481、WO 02/056905及WO 04/007538中所述。
在一較佳實施例中，經由化學交聯，通常且較佳藉由使用異雙官能交聯劑，使抗原性PCSK9肽結合於VLP。若干種異雙官能交聯劑為此項技術所已知。在一些實施例中，該異雙官能交聯劑含有可與第一連接位點(亦即與VLP或VLP次單元之離胺酸殘基的側鏈胺基)反應之官能基，及可與較佳第二連接位點(亦即與抗原性肽融合且視情況亦可用於還原反應之半胱胺酸殘基)反應之另一官能基。該程序之第一步驟(通常稱為衍生化)為VLP與交聯劑反應。此反應之產物為活性VLP，亦稱為活性載體。在第二步驟中，使用常用方法(諸如凝膠過濾或透析)移除未反應之交聯劑。在第三步驟中，使抗原性肽與活性VLP反應，且此步驟通常稱為偶合步驟。可視情況在第四步驟中例如藉由透析來移除未反應之抗原性肽。若干種異雙官能交聯劑為此項技術所已知。此等交聯劑包括較佳交聯劑SMPH(Pierce)、磺酸基-MBS、磺酸基-EMCS、磺酸基-GMBS、磺酸基-SIAB、磺酸基-SMPB、磺酸基-SMCC、SVSB、SIA及例如可得自Pierce Chemical Company(Rockford,IL,USA)且具有一個可與肽基反應之官能基及一個可與半胱胺酸殘基反應之官能基的其他交聯劑。上述交聯劑均形成硫醚鍵。
另一類適於實施本發明的交聯劑之特徵為在偶合後在抗原性肽與VLP之間引入二硫鍵。屬於此類之較佳交聯劑包括例如SPDP及磺酸基-LC-SPDP(Pierce)。VLP經交聯劑衍生化之程度可受不同實驗條件影響，諸如各反應搭配物之濃度、一種試劑相對於另一種試劑之過量、pH值、溫度及離子強度。偶合度(亦即每VLP次單元之抗原性肽量)可藉由改變上述實驗條件來調整以符合疫苗要求。
另一種使抗原性肽結合於VLP之方法為將VLP表面上的離胺酸殘基與抗原性肽上之半胱胺酸殘基連接。在一些實施例中，可能需要含有半胱胺酸殘基作為第二連接位點或作為其一部分之胺基酸連接子與抗原性肽融合以與VLP偶合。一般而言，可撓性胺基酸連接子為有利的。胺基酸連接子之實例係選自由以下組成之群：(a) CGG；(b) N端γ1-連接子；(c) N端γ3-連接子；(d) Ig鉸鏈區；(e) N端甘胺酸連接子；(f)(G) kC(G) n，其中n=0-12且k=0-5；(g) N端甘胺酸-絲胺酸連接子；(h)(G) kC(G) m(S) i(GGGGS)n，其中n=0-3，k=0-5，m=0-10，i=0-2；(i) GGC；(k) GGC-NH2；(l)C端γ1-連接子；(m)C端γ3-連接子；(n)C端甘胺酸連接子；(o)(G) nC(G)k，其中n=0-12且k=0-5；(p) C端甘胺酸-絲胺酸連接子；(q)(G) m(S) t(GGGGS)n(G) oC(G) k，其中n=0-3，k=0-5，m=0-10，t=0-2，且o=0-8。胺基酸連接子之其他實例為免疫球蛋白之鉸鏈區、甘胺酸絲胺酸連接子(GGGGS)n及甘胺酸連接子(G)n，其均另外含有半胱胺酸殘基作為第二連接位點且視情況含有其他甘胺酸殘基。通常，該等胺基酸連接子之較佳實例為N端γ1：CGDKTHTSPP；C端γ1：DKTHTSPPCG；N端γ3：CGGPKPSTPPGSSGGAP；C端γ3：PKPSTPPGSSGGAPGGCG；N端甘胺酸連接子：GCGGGG；及C端甘胺酸連接子：GGGGCG。
當疏水性抗原性肽結合於VLP時，尤其適於實施本發明的其他胺基酸連接子為CGKKGG或CGDEGG(N端連接子)，或GGKKGC及GGEDGC(C端連接子)。對於C端連接子，末端半胱胺酸視情況在C端經醯胺化。
在本發明之一些實施例中，肽之C端處的GGCG、GGC或GGC-NH2(「NH2」表示醯胺化)連接子或其N端處之CGG作為胺基酸連接子較佳。一般而言，甘胺酸殘基將插入於龐大胺基酸與欲用作第二連接位點的半胱胺酸之間，以消除較龐大胺基酸在偶合反應中.之潛在位阻。在本發明之另一實施例中，胺基酸連接子GGC-NH2與抗原性肽之C端融合。
抗原性肽上存在之半胱胺酸殘基必須呈其還原態以與活性VLP上之異雙官能交聯劑反應，亦即游離半胱胺酸或具有游離氫硫基之半胱胺酸殘基必須為可用的。在充當結合位點之半胱胺酸殘基呈氧化形式的情況下，例如，若其形成二硫橋，則需要用例如DTT、TCEP或對巰基乙醇還原此二硫橋。如WO 02/05690中所述，低濃度之還原劑順應偶合，較高濃度抑制偶合反應，如熟習此項技術者所已知，在該情況下必須在偶合之前例如藉由透析、凝膠過濾或逆相HPLC移除還原劑或降低其濃度。
根據上述方法藉由使用異雙官能交聯劑使抗原性肽結合於VLP允許抗原性肽以定向方式與VLP偶合。使抗原性肽結合於VLP之其他方法包括使用碳化二亞胺EDC及NHS使抗原性肽與VLP交聯之方法。
在其他方法中，使用諸如戊二醛、DSGBM[PEO] 4、BS3(Pierce Chemical Company,Rockford,IL,USA)之同雙官能交聯劑或具有可與VLP之胺基或羧基反應的官能基之其他已知同雙官能交聯劑使抗原性肽連接於VLP。
使VLP結合於抗原性肽之其他方法包括VLP經生物素標記且抗原性肽表現為抗生蛋白鏈菌素-融合蛋白之方法，或抗原性肽與VLP兩者皆經生物素標記之方法，例如如WO 00/23955中所述。在此情況下，可使抗原性肽首先結合於抗生蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白，其中調整抗原性肽與抗生蛋白鏈菌素之比率以使游離結合位點仍可用於結合在下一步驟中添加之VLP。或者，所有組份均可在「一鍋」反應中混合。可使用其他配位體-受體對作為結合劑以使抗原性肽結合於VLP，在該等配位體-受體對中可溶形式之受體及配位體可用且能夠與VLP或抗原性肽交聯。或者，該配位體或該受體可與抗原性肽融合，且因此分別介導與以化學方式結合或融合於受體或配位體之VLP結合。融合亦可藉由插入或取代來實現。
一個或若干個抗原分子可連接於RNA噬菌體鞘蛋白之衣殼或VLP的一個次單元，若空間上允許，則較佳經由RNA噬菌體之VLP的暴露離胺酸殘基來連接。因此，RNA噬菌體之鞘蛋白的VLP且尤其QP鞘蛋白VLP之一特定特徵在於可能每個次單元偶合若干個抗原。此允許產生緻密抗原陣列。
Q鞘蛋白之VLP或衣殼在其表面上呈現確定數目之離胺酸殘基，其中三個離胺酸殘基之確定拓撲結構對著衣殼內部且與RNA相互作用，而其他四個離胺酸殘基暴露於衣殼外部。此等確定性質有利於抗原連接於粒子外部，而非離胺酸殘基與RNA相互作用之粒子內部。其他RNA噬菌體鞘蛋白之VLP亦在其表面上具有確定數目之離胺酸殘基及此等離胺酸殘基之確定拓撲結構。
在本發明之另一實施例中，第一連接位點為離胺酸殘基且/或第二連接包含氫硫基或半胱胺酸殘基。在本發明之另一實施例中，第一連接位點為離胺酸殘基且/或第二連接為半胱胺酸殘基。在本發明之其他實施例中，抗原或抗原決定子經由半胱胺酸殘基結合於RNA噬菌體鞘蛋白之VLP的離胺酸殘基，且尤其結合於Qβ鞘蛋白之VLP。
來源於RNA噬菌體之VLP的另一優點為其在細菌中之高表現產量，由此允許以可承受之成本產生大量物質。此外，使用VLP作為載體允許分別形成具有可變抗原密度之穩固抗原陣列及結合物。詳言之，使用RNA噬菌體之VLP且由此尤其使用RNA噬菌體Qβ鞘蛋白之VLP可達到極高抗原決定基密度。
根據本發明之一實施例，本文所揭示之抗原性PCSK9肽直接或經由本文所揭示之一個肽連接子連接於、較佳以化學方式交聯於CRM197，以產生免疫原。在一實施例中，本文中所揭示之抗原性PCSK9肽經由如上所揭示之化學交聯方式且較佳藉由使用如本文所述之異雙官能交聯劑連接於CRM197。
供CRM197使用之較佳異雙官能交聯劑為BAANS(溴乙酸N-羥基丁二醯亞胺酯)、SMPH(丁二醯亞胺基-6-[β-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺基]己酸酯)、磺酸基-MBS、磺酸基-EMCS、磺酸基-GMBS、磺酸基-SIAB、磺酸基-SMPB、磺酸基-SMCC、SVSB、SIA及例如可得自Pierce Chemical Company(Rockford,IL,USA)之其他交聯劑。在本發明之一較佳實施例中，異雙官能交聯劑為BAANS或SMPH。
或者，在本發明之情況下，亦可使用適合允許在抗原性肽與CRM197之間引入二硫鍵之交聯劑。屬於此類別之較佳交聯劑包含例如SPDP及磺酸基-LC-SPDP(Pierce)。
在一特定實施例中，當本文中所揭示之抗原性PCSK9肽之序列包含半胱胺酸時，該抗原性PCSK9肽可經由該半胱胺酸直接共價連接於CRM197。
在本發明之一些實施例中，本發明之免疫原性組合物可包含免疫原性結合物之混合物，亦即免疫原性載體與本發明之一個或若干個抗原性PCSK9肽偶合。因此，此等免疫原性組合物可包含胺基酸序列不同之免疫原性載體。舉例而言，可製備包含「野生型」VLP及一或多個胺基酸殘基已改變(例如缺失、插入或取代)之經修飾VLP蛋白的疫苗組合物。或者，可使用相同但與不同胺基酸序列之抗原性PCSK9肽偶合的免疫原性載體。
因此，本發明亦關於製造本發明之免疫原的方法，其包含i)提供本發明之抗原性PCSK9肽，ii)提供本發明之免疫原性載體(較佳為VLP)及iii)組合該抗原性PCSK9肽與該免疫原性載體。在一實施例中，該組合步驟經由化學交聯，較佳經由異雙官能交聯劑進行。
在本發明之一實施例中，本文中所揭示之抗原性PCSK9肽連接於免疫原性載體分子。在一實施例中，該免疫原性載體係選自由本文所述之任何免疫原性載體組成之群。在另一實施例中，該免疫原性載體係選自由以下組成之群：血清白蛋白，諸如牛血清白蛋白(BSA)；球蛋白；甲狀腺球蛋白；血紅素；血氰蛋白(尤其匙孔螺血氰蛋白[KLH])及病毒樣粒子(VLP)。在一較佳實施例中，該免疫原性載體為白喉類毒素、白喉毒素之CRM197突變體、破傷風類毒素、匙孔螺血氰蛋白或病毒樣粒子(VLP)。在一甚至較佳實施例中，該免疫原性載體為DT、CRM197或選自由HBcAg VLP、HBsAg VLP、Qβ VLP、PP7 VLP、PPV VLP、諾沃克病毒VLP或本文所揭示之任何變異體組成之群的VLP。在一甚至較佳實施例中，該免疫原性載體為噬菌體VLP，諸如選自由Qβ CP、Qβ A1、Qβ-240、Qβ-243、Qβ-250、Qβ-251及Qβ-259(WO 03/024481中揭示)或PP7組成之群的Qβ VLP。
在另一較佳實施例中，該免疫原性載體為CRM197。
在一實施例中，該免疫原性載體直接或經由連接子共價連接於本文所揭示之抗原性PCSK9肽。在一實施例中，該免疫原性載體藉由表現如本文所述之融合蛋白而連接於本文所揭示之抗原性PCSK9肽。在另一實施例中，本文所揭示之抗原性PCSK9肽經由如本文所述之化學交聯且較佳藉由使用異雙官能交聯劑連接於免疫原性載體(較佳VLP)。若干種異雙官能交聯劑為此項技術所已知。在一些實施例中，該異雙官能交聯劑含有可與第一連接位點(亦即與VLP或VLP次單元之離胺酸殘基的側鏈胺基)反應之官能基，及可與較佳第二連接位點(亦即與抗原性肽融合且可用於還原反應之半胱胺酸殘基)反應之另一官能基。
在本發明之一實施例中，本文所揭示之抗原性PCSK9肽另外在其N端或C端或其N端與C端均包含能夠在化學交聯反應中與免疫原性載體之連接位點反應的連接子。在一實施例中，本文所揭示之抗原性PCSK9肽另外包含位於其C端之具有式(G)n
C、(G)n
SC或(G)n
K、較佳(G)n
C之連接子，其中n為選自由0、1、2、3、4、5、6、7、8、9及10組成之群，較佳選自由0、1、2、3、4及5組成之群，更佳選自由0、1、2及3組成之群的整數，n最佳為0或1(當n等於0時，該式表示半胱胺酸)。較佳地，本文所揭示之抗原性PCSK9肽另外包含位於其C端之具有式GGGC、GGC、GC或C之連接子。
在本發明之另一實施例中，本文所揭示之抗原性PCSK9肽另外包含位於其N端之具有式C(G)n
、CS(G)n
或K(G)n
、較佳C(G)n
之連接子，其中n為選自由0、1、2、3、4、5、6、7、8、9及10組成之群，較佳選自由0、1、2、3、4及5組成之群，更佳選自由0、1、2及3組成之群的整數，n最佳為0或1(當n等於0時，該式表示半胱胺酸)。較佳地，本文所揭示之抗原性PCSK9肽另外包含位於其N端之具有式CGGG、CGG、CG或C之連接子。
在另一實施例中，本文所揭示之抗原性PCSK9肽另外包含位於其C端之具有式(G)n
C、(G)n
SC或(G)n
K、較佳(G)n
C之連接子，其中n為選自由0、1、2、3、4、5、6、7、8、9及10組成之群，較佳選自由0、1、2、3、4及5組成之群，更佳選自由0、1、2及3組成之群的整數，n最佳為0或1(當n等於0時，該式表示半胱胺酸)，及位於其N端之具有式C(G)n
、CS(G)n
或K(G)n
、較佳C(G)n
之連接子，其中n為選自由0、1、2、3、4、5、6、7、8、9及10組成之群，較佳選自由0、1、2、3、4及5組成之群，更佳選自由0、1、2及3組成之群的整數，n最佳為0或1(當n等於0時，該式表示半胱胺酸)。較佳地，本文所揭示之抗原性PCSK9肽另外包含位於其N端之具有式CGGG、CGG、CG或C之連接子及位於其C端之具有式GGGC、GGC、GC或C之連接子。較佳地，本文所揭示之抗原性PCSK9肽另外包含位於其N端之半胱胺酸及位於其C端之半胱胺酸。
另外包含該連接子之該等抗原性PCSK9肽的代表性實例以SEQ ID NO 313、314、315、316、317、322、323、324、325、326、327、328、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418及419揭示。
另外包含該連接子之該等抗原性PCSK9肽的代表性實例以SEQ ID NO 313、314、315、316、317、322、323、324、325、326、327及328揭示。
包含連接子之較佳抗原性PCSK9肽係以SEQ ID No 317、322、323、324、401、402、403、413、414、415及416揭示。
包含連接子之較佳抗原性PCSK9肽以SEQ ID No 317、322、323及324揭示。
包含連接子之最佳抗原性PCSK9肽以SEQ ID No 317、322、402及413揭示。
在一實施例中，抗原性PCSK9肽經環化。在一實施例中，環化抗原性PCSK9肽連接於免疫原性載體。在一實施例中，該環化抗原性PCSK9肽藉由共價結合連接於免疫原性載體。在一實施例中，該環化抗原性PCSK9肽藉由其胺基酸之一條側鏈與免疫原性載體共價結合而連接於該載體。在一實施例中，環化PCSK9肽中添加半胱胺酸、包含可變數目之甘胺酸殘基及一個半胱胺酸殘基之GC或CC片段以使之能夠經由添加之半胱胺酸共價結合於免疫原性載體。
在一實施例中，抗原性PCSK9肽經環化且包含半胱胺酸、(G)n
C或C(G)n
片段，其中n為選自由0、1、2、3、4、5、6、7、8、9及10組成之群，較佳選自由0、1、2、3、4及5組成之群，更佳選自由0、1、2及3組成之群的整數，n最佳為0或1(當n等於0時，該式表示半胱胺酸)。
該構形受限制之抗原性PCSK9肽之非限制性實例為SEQ ID No 318、319、320及321之肽。較佳環化肽為SEQ ID No 318之肽。
以下提供使用各種連接子的上述抗原性PCSK9肽與載體或骨架之結合的實例，其均在本發明之範疇內且構成多種實施例：肽-GGGGGC-骨架、肽-GGGGC-骨架、肽-GGGC-骨架、肽-GGC-骨架、肽-GC-骨架、肽-C-骨架、肽-GGGGGK-骨架、肽-GGGGK-骨架、肽-GGGK-骨架、肽-GGK-骨架、肽-GK-骨架、肽-K-骨架、肽-GGGGSC-骨架、肽-GGGSC-骨架、肽-GGSC-骨架、肽-GSC-骨架、肽-SC-骨架、骨架-CSGGGG-肽、骨架-CSGGG-肽、骨架-CSGG-肽、骨架-CSG-肽、骨架-CS-肽、骨架-KGGGG-肽、骨架-KGGG-肽、骨架-KGG-肽、骨架-KG-肽、骨架-K-肽。
在一實施例中，該肽由本文所揭示之任何抗原性PCSK9肽組成且該骨架由本文所揭示之任何免疫原性載體(較佳VLP)組成。
以下提供使用各種連接子及雙重受限制之肽的例示性結合組合，其中該載體可為載體之相同單體或載體之相異單體。(在以下實例中，GC連接子可經上文例示之任何GK連接子或GSC連接子或熟習此項技術者已知之任何其他連接子取代)：載體-CGGGGG-肽-GGGGGC-載體、載體-CGGGG-肽-GGGGC-載體、載體-CGGGG-肽-GGGGC-載體、載體-CGGG-肽-GGGC-載體、載體-CG-肽-GC-載體、載體-CG-肽-C-載體、載體-C-肽-C-載體。
在一實施例中，該肽由本文所揭示之任何抗原性PCSK9肽組成且該載體由本文所揭示之任何免疫原性載體(較佳VLP)組成。
在一實施例中，本發明係關於包含抗原性PCSK9肽之免疫原，該抗原性PCSK9肽由或基本上由選自由SEQ ID No: 1至312、330至398及420至588組成之群的胺基酸序列組成，其中該抗原性PCSK9肽另外在其C端或N端包含經由硫醚鍵以化學方式交聯於免疫原性載體之半胱胺酸。在一較佳實施例中，該免疫原性載體係選自由以下組成之群：DT(白喉毒素)、TT(破傷風類毒素)或TT之片段C、PD(流感嗜血桿菌蛋白D)、CRM 197、其他DT點突變體，諸如CRM176、CRM228、CRM 45、CRM 9、CRM102、CRM103及CRM107。該免疫原性載體較佳為CRM197。
在一實施例中，本發明係關於包含抗原性PCSK9肽之免疫原，該抗原性PCSK9肽由或基本上由選自由SEQ ID No: 1至312、330至398及420至588組成之群的胺基酸序列組成，其中該抗原性PCSK9肽另外包含位於其C端或N端之使用SMPH(丁二醯亞胺基-6-[β-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺基]己酸酯)或BAANS(溴乙酸N-羥基丁二醯亞胺酯)作為交聯劑經由硫醚鍵以化學方式交聯於免疫原性載體之半胱胺酸。在一較佳實施例中，該免疫原性載體係選自由以下組成之群：DT(白喉毒素)、TT(破傷風類毒素)或TT之片段C、PD(流感嗜血桿菌蛋白D)、CRM 197、其他DT點突變體，諸如CRM176、CRM228、CRM 45、CRM 9、CRM102、CRM 103及CRM107。該免疫原性載體較佳為CRM197。該免疫原性載體較佳為CRM197。
在一實施例中，本發明係關於包含抗原性PCSK9肽之免疫原，該抗原性PCSK9肽由或基本上由選自由SEQ ID No: 1至312、330至398及420至588組成之群的胺基酸序列組成，其中該抗原性PCSK9肽另外包含位於其C端之使用SMPH(丁二醯亞胺基-6-[β-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺基]己酸酯)或BAANS(溴乙酸N-羥基丁二醯亞胺酯)作為交聯劑經由硫醚鍵以化學方式交聯於免疫原性載體之半胱胺酸，該鍵位於CRM197之離胺酸殘基與該抗原性肽之半胱胺酸殘基之間。
本發明另外關於組合物，尤其亦稱為「標的免疫原性組合物」之免疫原性組合物，其包含本發明之抗原性PCSK9肽較佳連接於免疫原性載體，及視情況存在之至少一種佐劑。該等免疫原性組合物(尤其當調配為醫藥組合物時)被認為適用於預防、治療或減輕PCSK9相關病症。
在一些實施例中，本發明之標的免疫原性組合物包含視情況包含連接子之抗原性PCSK9肽，其包含選自SEQ ID No 1至328、330至398、及401至588的胺基酸序列及其功能活性變異體。在一些實施例中，該抗原性PCSK9肽連接於免疫原性載體，較佳DT、CRM197或VLP，更佳HBcAg、HBsAg、Qβ、PP7、PPV或諾沃克病毒VLP。
在一較佳實施例中，本發明之標的免疫原性組合物包含連接於VLP、較佳Qβ VLP之視情況包含連接子的抗原性PCSK9肽，其包含選自SEQ ID No 1至328、330至398、及401至588的胺基酸序列及其功能活性變異體。
在一較佳實施例中，本發明之標的免疫原性組合物包含連接於CRM197之視情況包含連接子的抗原性PCSK9肽，其包含選自SEQ ID No 1至328、330至398、及401至588的胺基酸序列及其功能活性變異體。
如下文更詳細地描述，包含本發明之抗原性PCSK9肽的標的免疫原性組合物可以多種方式調配。
在一些實施例中，標的免疫原性組合物包含一種抗原性PCSK9肽，例如該免疫原性組合物包含一群抗原性PCSK9肽，實質上所有該等抗原性PCSK9肽具有相同胺基酸序列。在其他實施例中，標的免疫原性組合物包含兩種或兩種以上不同抗原性PCSK9肽，例如該免疫原性組合物包含一群抗原性PCSK9肽，該群之成員的胺基酸序列可不同。標的免疫原性組合物可包含2至約20種不同抗原性PCSK9肽，例如標的免疫原性組合物可包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11-15或15-20種不同抗原性PCSK9肽，該等肽各自具有之胺基酸序列不同於其他抗原性PCSK9肽之胺基酸序列。
在其他實施例中，標的免疫原性組合物包含如上文所述之多聚化抗原性PCSK9多肽。如本文中所使用，術語「包含抗原性PCSK9肽之免疫原性組合物」或「本發明之免疫原性組合物」或「標的免疫原性組合物」係指包含與免疫原性載體偶合或不與免疫原性載體偶合之一種(多聚化或不多聚化)或多種抗原性PCSK9肽的免疫原性組合物。當使用兩種或兩種以上肽與載體偶合時，該等肽可與同一載體分子偶合或個別地與載體分子偶合接著組合產生免疫原性組合物。
本發明之另一態樣係關於製造本發明之免疫原的方法，該方法包含使抗原性PCSK9肽與免疫原性載體偶合。在一實施例中，該偶合為化學偶合。
在一些實施例中，標的免疫原性組合物包含至少一種佐劑。適合之佐劑包括適合用於哺乳動物(較佳人類)之佐劑。可用於人類之已知合適佐劑的實例包括(但不一定限於)明礬、磷酸鋁、氫氧化鋁、MF59(4.3% w/v角鯊烯、0.5% w/v聚山梨醇酯80(吐溫80(Tween 80))、0.5% w/v脫水山梨糖醇三油酸酯(斯潘85(Span 85))、含有CpG之核酸(其中胞嘧啶未經甲基化)、QS21(皂苷佐劑)、MPL(單磷醯基脂質A)、3DMPL(3-O-脫醯基之MPL)、來自Aquilla之萃取物、ISCOMS(參見例如Sjlander等人(1998)J. Leukocyte Biol. 64:713；WO 90/03184、WO 96/11711、WO 00/48630、WO 98/36772、WO 00/41720、WO 06/134423及WO 07/026190)、LT/CT突變體、聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒、Quil A、經典TiterMax、TiterMax Gold、介白素及其類似物。對於包括(但不限於)動物實驗之獸醫應用，吾人可使用弗氏佐劑(Freund's adjuvant)、N-乙醯基-胞壁醯基-L-酥胺醯基-D-異麩醯胺酸(thr-MDP)、N-乙醯基-降-胞壁醯基-L-丙胺醯基-D-異麩醯胺酸(CGP 11637，稱為nor-MDP)、N-乙醯基胞壁醯基-L-丙胺醯基-D-異麩醯胺醯基-L-丙胺酸-2-(1'-2'-二軟脂醯基-sn-甘油-3-羥基磷醯氧基)-乙胺(CGP 19835A，稱為MTP-PE)及RIBI，其含有存於2%角鯊烯/吐溫80乳液中之三種自細菌萃取的組份，單磷醯基脂質A、海藻糖二黴菌酸酯及細胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。
用於增強組合物之有效性的其他例示性佐劑包括(但不限於)：(1)水包油乳液調配物(存在或不存在其他特定免疫刺激劑，諸如胞壁醯肽(參見下文)或細菌細胞壁組份)，例如(a)MF59TM
(WO 90/14837；Vaccine design中之第10章：the subunit and adjuvant approach,Powell及Newman編,Plenum Press 1995)，其含有5%角鯊烯、0.5%吐溫80(聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯)及0.5%斯潘85(脫水山梨糖醇三油酸酯)(視情況含有共價連接於二軟脂醯基磷脂醯乙醇胺(MTP-PE)之胞壁醯三肽)且使用微流化劑調配成次微粒子；(b)SAF，其含有10%角鯊烷、0.4%吐溫80、5%泊洛尼克(pluronic)嵌段共聚物L121及thr-MDP且微流體化為次微乳液或經渦旋產生較大粒徑乳液；及(c)RIBITM
佐劑系統(RAS)(Ribi Immunochem,Hamilton,MT)，其含有2%角鯊烯、0.2%吐溫80及一或多種細菌細胞壁組份，諸如單磷醯基脂質A(MPL)、海藻糖二黴菌酸酯(TDM)及細胞壁骨架(CWS)，較佳為MPL+CWS(DETOXTM
)；(2)可使用皂苷佐劑，諸如QS21、STIMULONTM
(Cambridge Bioscience,Worcester,MA)、Abisco(Isconova,Sweden)或Iscomatrix(Commonwealth Serum Laboratories,Australia)，或自其產生之粒子，諸如ISCOM(免疫刺激性複合物)，該等ISCOM可能不含其他去污劑，例如WO 00/07621；(3)完全弗氏佐劑(Complete Freund's Adjuvant，CFA)及不完全弗氏佐劑(Incomplete Freund's Adjuvant，IFA)；(4)細胞激素，諸如介白素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12(WO 99/44636)等)、干擾素(例如γ干擾素)、巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF)、腫瘤壞死因子(TNF)等；(5)單磷醯基脂質A(MPL)或3-O-脫醯基的MPL(3dMPL)，例如GB-2220221、EP-A-0689454，當與肺炎球菌醣一起使用時，視情況實質上不存在明礬，例如WO 00/56358；(6)3dMPL與例如QS21及/或水包油乳液之組合，例如EP-A-0835318、EP-A-0735898、EP-A-0761231；(7)包含CpG基元之寡核苷酸[Krieg Vaccine 2000,19,618-622；Krieg Curr opin Mol Ther2001 3:15-24；Roman等人，Nat. Med.,1997,3,849-854；Weiner等人，PNAS USA,1997,94,10833-10837；Davis等人，J. Immunol,1998,160,870-876；Chu等人，J. Exp.Med,1997,186,1623-1631；Lipford等人，Ear. J. Immunol.,1997,27,2340-2344；Moldoveami等人，Vaccine,1988,16,1216-1224,Krieg等人，Nature,1995,374,546-549；Klinman等人，PNAS USA,1996,93,2879-2883；Ballas等人，J. Immunol,1996,157,1840-1845；Cowdery等人，J. Immunol,1996,156,4570-4575；Halpern等人，Cell Immunol,1996,167,72-78；Yamamoto等人，Jpn. J. Cancer Res.,1988,79,866-873；Stacey等人，J. Immunol.,1996,157,2116-2122；Messina等人，J. Immunol,1991,147,1759-1764；Yi等人，J. Immunol,1996,157,4918-4925；Yi等人，J. Immunol,1996,157,5394-5402；Yi等人，J. Immunol,1998,160,4755-4761；及Yi等人，J. Immunol,1998,160,5898-5906；國際專利申請案WO 96/02555、WO 98/16247、WO 98/18810、WO 98/40100、WO 98/55495、WO 98/37919及WO 98/52581]，亦即含有至少一種CG二核苷酸，其中胞嘧啶未經甲基化；(8)聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯，例如WO 99/52549；(9)聚氧乙烯脫水山梨糖醇酯界面活性劑與辛苯聚醇之組合(WO 01/21207)，或聚氧乙烯烷基醚或酯界面活性劑與至少一種其他非離子性界面活性劑(諸如辛苯聚醇)之組合(WO 01/21152)；(10)皂苷及免疫刺激性寡核苷酸(例如CpG寡核苷酸)(WO 00/62800)；(11)免疫刺激劑及金屬鹽粒子，例如WO 00/23105；(12)皂苷及水包油乳液，例如WO 99/11241；(13)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IM2(視情況+固醇)，例如WO 98/57659；(14)充當免疫刺激劑以增強組合物功效之其他物質，諸如胞壁醯肽，包括N-乙醯基-胞壁醯基-L-酥胺醯基-D-異麩醯胺酸(thr-MDP)、N-25乙醯基-降胞壁醯基-L-丙胺醯基-D-異麩醯胺酸(nor-MDP)、N-乙醯基胞壁醯基-L-丙胺醯基-D-異麩醯胺醯基-L-丙胺酸-2-(1'-2'-二軟脂醯基-sn-甘油-3-羥基磷醯氧基)-乙胺(MTP-PE)；(15)天然或合成之鐸樣受體(toll-like receptor，TLR)的配位體(例如，如Kanzler等人2007,Nature Medicine 13,第1552-9頁中所述)，包括TLR3配位體，諸如polyI:C及類似化合物，諸如Hiltonol及Ampligen。
在一特定實施例中，該佐劑為免疫刺激性寡核苷酸，且更佳為CpG寡核苷酸。如本文所使用之CpG寡核苷酸係指免疫刺激性CpG寡脫氧核苷酸(CpG ODN)，且因此，除非另外指出，否則此等術語可互換使用。免疫刺激性CpG寡脫氧核苷酸含有一或多個免疫刺激性CpG基元，即未甲基化之胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸，視情況在某種較佳鹼基環境下。CpG免疫刺激性基元之甲基化狀態一般指二核苷酸中之胞嘧啶殘基。含有至少一個未甲基化CpG二核苷酸之免疫刺激性寡核苷酸為含有5'未甲基化胞。嘧啶經磷酸鍵連接於3'鳥嘌呤且經由結合鐘樣受體9(TLR-9)活化免疫系統的寡核苷酸。在另一實施例中，免疫刺激性寡核苷酸可含有一或多個甲基化CpG二核苷酸，該一或多個甲基化CpG二核苷酸將經由TLR9活化免疫系統，但不如CpG基元未甲基化時強。CpG免疫刺激性寡核苷酸可包含一或多個迴文序列，該一或多個迴文序列又可涵蓋CpG二核苷酸。CpG寡核苷酸已描述於許多頒佈專利、公開專利申請案及其他公開案中，包括美國專利第6,194,388號；第6,207,646號；第6,214,806號；第6,218,371號；第6,239,116號；及第6,339,068號。
已鑑別出不同種類之CpG免疫刺激性寡核苷酸。其被稱為A、B、C及P類，且更詳細地描述於下文中。本發明之方法包含使用此等不同種類之CpG免疫刺激性寡核苷酸。
可使任一種類進行增強其效能之E修飾。E修飾可為5'端核苷酸之鹵素取代；該等取代之實例包括(但不限於)溴-尿苷或碘-尿苷取代。E修飾亦可包括5'端核苷酸之乙基-尿苷取代。
「A類」CpG免疫刺激性寡核苷酸功能上之特徵為能夠自漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)誘導出高含量之干擾素-α(IFN-α)及誘導NK細胞活化，同時對B細胞活化之影響極小。在結構上，此類通常在5'及3'端具有穩定之poly-G序列。其亦具有至少6個核苷酸之含有迴文磷酸二酯CpG二核苷酸的序列，例如(但不一定)，其含有由Yamamoto及同事描述之以下六聚體迴文中之一者：GACGTC、AGCGCT或AACGTT。Yamamoto S等人J. Immunol 148:4072-6(1992)。A類CpG免疫刺激性寡核苷酸及此類之例示性序列已描述於美國非臨時專利申請案第09/672,126號及公開PCT申請案PCT/USOO/26527(WO 01/22990)中，兩者皆於2000年9月27日申請。
在一實施例中，本發明之「A類」CpG寡核苷酸具有以下核酸序列：5'GGGGACGACGTCGTGGGGGGG 3'。
A類寡核苷酸之一些非限制性實例包括：5' G*G*G_G_A_C_G_A_C_G_T_C_G_T_G_G*G*G*G*G*G3'；其中*係指硫代磷酸酯鍵且_係指磷酸二酯鍵。
本發明之B類CpG寡核苷酸序列為以上所概述以及公開PCT專利申請案PCT/US95/01570及PCT/US97/19791及USP 6,194,388、6,207,646、6,214,806、6,218,371、6,239,116及6,339,068中所揭示之序列。例示性序列包括(但不限於)上述申請案及專利中所揭示之序列。
在一實施例中，本發明之「B類」CpG寡核苷酸具有以下核酸序列：5' TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT 3'(SEQ ID No 589)或5' TCGTCGTTTTTCGGTCGTTTT 3'(SEQ ID No 590)或5' TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 3'(SEQ ID No 591)或5' TCGTCGTTTCGTCGTTTTGTCGTT 3'(SEQ ID No 592)或5' TCGTCGTTTTGTCGTTTTTTTCGA 3'(SEQ ID No 593)。
在任何此等序列中，所有鍵可均為硫代磷酸酯鍵。在另一實施例中，在任何此等序列中，一或多個鍵可為磷酸二酯，較佳位於CpG基元之「C」與「G」之間，從而產生半軟CpG寡核苷酸。在任何此等序列中，乙基-尿苷或鹵素可取代5'T；鹵素取代之實例包括(但不限於)溴-尿苷或碘-尿苷取代。
B類寡核苷酸之一些非限制性實例包括：5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*G*C*T*T*T*T 3'或5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T 3'或5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T 3'或5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T 3'或5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*T*T*T*C*G*A 3'，其中*係指硫代磷酸酯鍵。
「C類」CpG免疫刺激性寡核苷酸功能上之特徵為能夠活化B細胞及NK細胞且誘導IFN-α。在結構上，此類通常包括具有一或多個B類免疫刺激性CpG基元之區域，及允許分子形成二級(例如莖環)或三級(例如二聚體)類型結構之富含GC之迴文區域或近似迴文區域。此等寡核苷酸中有一些具有傳統「刺激性」CpG序列與「富含GC」或「B細胞中和」基元。此等組合基元寡核苷酸具有免疫刺激作用，其介於與傳統B類CpG寡核苷酸相關之作用(亦即B細胞活化及樹突狀細胞(DC)活化之強誘導)與與A類CpG ODN相關之作用(亦即IFN-α及NK細胞活化之強誘導，但對B細胞及DC活化之誘導作用相對較弱)之間。Krieg AM等人(1995) Nature 374:546-9；Ballas ZK等人(1996) J Immunol 157:1840-5；Yamamoto S等人(1992) J Immunol 148:4072-6。
C類組合基元免疫刺激性寡核苷酸可具有完全穩定(例如所有硫代磷酸酯)、嵌合(磷酸二酯中心區域)或半軟(例如CpG基元中之磷酸二酯)主鏈。此類已描述於2002年8月19日申請之美國專利申請案US 10/224,523中。
C類CpG寡核苷酸之一個刺激性域或基元由下式定義：5'X1
DCGHX2
3'。D為除C外之核苷酸。C為胞嘧啶。G為鳥嘌呤。H為除G外之核苷酸。X1
及X2
為長度為0至10個核苷酸之任何核酸序列。X1
可包括CG，在該情況下較佳T緊鄰於此CG之前。在一些實施例中，DCG為TCG。X1
之長度較佳為0至6個核苷酸。在一些實施例中，X2
不含有任何poly G或poly A基元。在其他實施例中，免疫刺激性寡核苷酸在5'端或在3'端具有poly-T序列。如本文中所使用，「poly-A」或「poly-T」應分別指連續四個或四個以上A或T之延伸段，例如5' AAAA 3'或5' TTTT 3'。如本文中所使用，「poly-G端」應指連續四個或四個以上G之延伸段，例如5' GGGG 3'，其存在於核酸之5'端或3'端。如本文中所使用，「poly-G寡核苷酸」應指具有式5'X1
X2
GGGX3
X4
3'之寡核苷酸，其中X1
、X2
、X3
及X4
為核苷酸且X3
及X4
中之至少一者較佳為G。根據此式，B細胞刺激性域之一些較佳設計包含TTTTTCG、TCG、TTCG、TTTCG、TTTTCG、TCGT、TTCGT、TTTCGT、TCGTCGT。
C類CpG寡核苷酸之第二基元被稱為P或N且定位成緊鄰X1
之5'端或X2
之3'端。
N為以CGG三核苷酸開始且長度為至少10個核苷酸之B細胞中和序列。B細胞中和基元包括至少一個CpG序列，其中C在CG之前或G在CG之後(Krieg AM等人(1998) Proc Natl Acad Sd USA 95:12631-12636)；或為含有CG之DNA序列，其中CG之C經甲基化。中和基元或序列在存在於另外非刺激性基元中時具有一定程度之免疫刺激能力，但當存在於其他免疫刺激性基元之情況下時用以降低其他基元之免疫刺激潛能。
P為含有長度為至少10個核苷酸之序列的富含GC之迴文。
如本文中所使用，「迴文」及同等地「迴文序列」應指反向重複序列，亦即諸如ABCDEE'D'C'B'A'之序列，其中A及A'、B及B'等為能夠形成常見瓦生克立克鹼基對(Watson-Crick base pair)之鹼基。
如本文中所使用，「富含GC之迴文」應指具有至少三分之二的G及C之鹼基組成的迴文。在一些實施例中，富含GC之域較佳在「B細胞刺激性域」之3'端。在長度為10個鹼基之富含GC之迴文的情況下，該迴文由此含有至少8個G及C。在長度為12個鹼基之富含GC之迴文的情況下，該迴文亦含有至少8個G及C。在富含GC之14-mer迴文的情況下，該迴文之至少10個鹼基為G及C。在一些實施例中，富含GC之迴文僅由G及C構成。
在一些實施例中，富含GC之迴文具有至少81%G及C之鹼基組成。在該長度為10個鹼基之富含GC之迴文的情況下，該迴文由此僅由G及C構成。在該長度為12個鹼基之富含GC之迴文的情況下，較佳該迴文之至少10個鹼基(83%)為G及C。在一些較佳實施例中，長度為12個鹼基之富含GC的迴文僅由G及C構成。在富含GC之14-mer迴文的情況下，該迴文之至少12個鹼基(86%)為G及C。在一些較佳實施例中，長度為14個鹼基之富含GC的迴文僅由G及C構成。富含GC之迴文的C可未經甲基化或其可經甲基化。
一般而言，此域具有至少3個C及G，更佳各為4個，且最佳各為5個或5個以上。此域中C及G之數目無需相同。較佳排列C及G使其能夠形成自體互補雙鏈體或迴文，諸如CCGCGCGG。此可間雜有A或T，但較佳至少部分保留自體互補性，如例如基元CGACGTTCGTCG或CGGCGCCGTGCCG中。當不保留互補性時，較佳非互補鹼基對為TG。在一較佳實施例中，不存在超過連續3個不為迴文之一部分的鹼基，較佳不超過2個且最佳僅為1個。在一些實施例中，富含GC之迴文包括至少一個CGG三聚體、至少一個CCG三聚體或至少一個CGCG四聚體。在其他實施例中，富含GC之迴文不為CCCCCCGGGGGG或GGGGGGCCCCCC、CCCCCGGGGG或GGGGGCCCCC。
富含GC之區域的至少一個G可經肌苷(I)取代。在一些實施例中，P包括一個以上I。
在某些實施例中，免疫刺激性寡核苷酸具有以下各式中之一者：5' NX1
DCGHX2
3'、5' X1
DCGHX2
N 3'、5' PX1
DCGHX2
3'、5' X1
DCGHX2
P 3'、5' X1
DCGHX2
PX3
3'、5' X1
DCGHPX3
3'、5' DCGHX2
PX3
3'、5' TCGHX2
PX3
3'、5' DCGHPX3
3'或5'DCGHP 3'。
本發明提供其他由式5' N1
PyGN2
P 3'定義之免疫刺激性寡核苷酸。N1
為長度為1至6個核苷酸之任何序列。Py為嘧啶。G為鳥嘌呤。N2
為長度為0至30個核苷酸之任何序列。P為含有長度為至少10個核苷酸之序列的富含GC之迴文。
N1
及N2
可含有大於50%嘧啶且更佳大於50% T。N1
可包括CG，在該情況下較佳T緊鄰於此CG之前。在一些實施例中，N1
PyG為TCG，且最佳為TCGN2
，其中N2
不為G。
N1
Py
GN2
P可包括一或多個肌苷(1)核苷酸。N1
中之C或G可由肌苷置換，但CpI優於IpG。對於諸如IpG之肌苷取代，最佳活性可藉助於「半軟」或嵌合主鏈來達成，其中IG或CI之間的鍵為磷酸二酯。N1
可包括至少一個CI、TCI、IG或TIG基元。
在某些實施例中，N1
PyGN2
為選自由TTTTTCG、TCG、TTCG、TTTCG、TTTTCG、TCGT、TTCGT、TTTCGT及TCGTCGT組成之群的序列。
在一實施例中，本發明之「C類」CpG寡核苷酸具有以下核酸序列：5' TCGCGTCGTTCGGCGCGCGCCG 3'(SEQ ID No 594)或5' TCGTCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3'(SEQ ID No 595)或5' TCGGACGTTCGGCGCGCGCCG 3'(SEQ ID No 596)或5' TCGGACGTTCGGCGCGCCG 3'(SEQ ID No 597)或5' TCGCGTCGTTCGGCGCGCCG 3'(SEQ ID No 598)或5' TCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3'(SEQ ID No 599)或5' TCGACGTTCGGCGCGCCG 3'(SEQ ID No 600)或5' TCGCGTCGTTCGGCGCCG 3'(SEQ ID No 601)或5' TCGCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3'(SEQ ID No 602)或5' TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG 3'(SEQ ID No 603)或5' TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG 3'(SEQ ID No 604)或5' TCGTCGTTTTACGGCGCCGTGCCG 3'(SEQ ID No 605)或5' TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCGT 3'(SEQ ID No 606)。
在任何此等序列中，所有鍵可均為硫代磷酸酯鍵。在另一實施例中，在任何此等序列中，一或多個鍵可為磷酸二酯，較佳位於CpG基元之「C」與「G」之間，從而產生半軟CpG寡核苷酸。
C類寡核苷酸之一些非限制性實例包括：5'T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G3'或5'T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G3'或5'T*C_G*G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G3'或5'T*C_G*G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G3'或5'T*C_G*C_G*T*C_G*T*T* C_G*G*C*G*C*G*C*C*G3'或5'T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G3'或5'T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G3'或5'T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*C*G3'或5'T*C_G*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G3'或5'T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G3'或5'T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G3'或5'T*C*G*T*C_G*T*T*T*T*A*C_G*G*C*G*C*C_G*T*G*C*C*G3'或5'T*CG*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T3'，其中*係指硫代磷酸酯鍵且係指磷酸二酯鍵。
在任何此等序列中，乙基-尿苷或鹵素可取代5'T；鹵素取代之實例包括(但不限於)溴-尿苷或碘-尿苷取代。
「P類」CpG免疫刺激性寡核苷酸已描述於WO 2007/095316中且特徵為其含有形成雙鏈體之區域，例如在5'與3'端處或附近之完全或不完全迴文，從而使其具有形成高級結構(諸如多聯體)之可能。在一些情況下，此等稱為P類寡核苷酸之寡核苷酸能夠誘導遠高於C類之IFN-α分泌量。P類寡核苷酸能夠在活體外及/或活體內自發地自組裝成多聯體。在不受關於此等分子之作用方法之任何特定理論束縛的情況下，一種可能的假設為此性質賦予P類寡核苷酸以與先前所述種類之CpG寡核苷酸相比在某些免疫細胞內更高度交聯TLR9之能力，從而誘導不同之免疫活化模式。
在一實施例中，用於本發明之CpG寡核苷酸為含有5'TLR活化域及至少2個迴文區域之P類CpG寡核苷酸，一個迴文區域為長度為至少6個核苷酸之5'迴文區域且直接或經由間隔基連接於長度為至少8個核苷酸之3'迴文區域，其中該寡核苷酸包括至少一個YpR二核苷酸。在一實施例中，該寡核苷酸不為T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G。在一實施例中，P類CpG寡核苷酸包括至少一個未經甲基化之CpG二核苷酸。在另一實施例中，TLR活化域為TCG、TTCG、TTTCG、TYpR、TTYpR、TTTYpR、UCG、UUCG、UUUCG、TTT或TTTT。在又一實施例中，TLR活化域在5'迴文區域內。在另一實施例中，TLR活化域緊鄰5'迴文區域之5'端。在又一實施例中，5'迴文區域之長度為至少8個核苷酸。在另一實施例中，3'迴文區域之長度為至少10個核苷酸。在另一實施例中，5'迴文區域之長度為至少10個核苷酸。在又一實施例中，3'迴文區域包括未經甲基化之CpG二核苷酸。在另一實施例中，3'迴文區域包括兩個未經甲基化之CpG二核苷酸。在另一實施例中，5'迴文區域包括未經甲基化之CpG二核苷酸。在又一實施例中，5'迴文區域包括兩個未經甲基化之CpG二核苷酸。在另一實施例中，5'及3'迴文區域的雙鏈體穩定性值為至少25。在另一實施例中，5'及3'迴文區域的雙鏈體穩定性值為至少30。在另一實施例中，5'及3'迴文區域的雙鏈體穩定性值為至少35。在另一實施例中，5'及3'迴文區域的雙鏈體穩定性值為至少40。在另一實施例中，5'及3'迴文區域的雙鏈體穩定性值為至少45。在另一實施例中，5'及3'迴文區域的雙鏈體穩定性值為至少50。在另一實施例中，5'及3'迴文區域的雙鏈體穩定性值為至少55。在另一實施例中，5'及3'迴文區域的雙鏈體穩定性值為至少60。在另一實施例中，5'及3'迴文區域的雙鏈體穩定性值為至少65。
在一實施例中，兩個迴文區域直接連接。在另一實施例中，兩個迴文區域經由3'-3'鍵連接。在另一實施例中，兩個迴文區域有一個核苷酸重疊。在又一實施例中，兩個迴文區域有兩個核苷酸重疊。在另一實施例中，兩個迴文區域不重疊。在另一實施例中，兩個迴文區域由間隔基連接。在一實施例中，該間隔基為長度為1-50個核苷酸之核酸。在另一實施例中，間隔基為長度為1個核苷酸之核酸。在另一實施例中，間隔基為非核苷酸間隔基。在一實施例中，該非核苷酸間隔基為D-間隔基。在另一實施例中，非核苷酸間隔基為連接子。在一實施例中，寡核苷酸具有式5'XP1
SP2
T 3'，其中X為TLR活化域，P1
為迴文，S為間隔基，P2
為迴文，且T為長度為0-100個核苷酸之3'尾。在一實施例中，X為TCG、TTCG或TTTCG。在另一實施例中，T之長度為5-50個核苷酸。在又一實施例中，T之長度為5-10個核苷酸。在一實施例中，S為長度為1-50個核苷酸之核酸。在另一實施例中，S為長度為1個核苷酸之核酸。在另一實施例中，S為非核苷酸間隔基。在一實施例中，該非核苷酸間隔基為D-間隔基。在另一實施例中，非核苷酸間隔基為連接子。在另一實施例中，寡核苷酸不為反義寡核苷酸或核糖核酸酶。在一實施例中，P1
富含A及T。在另一實施例中，P1
包括至少4個T。在另一實施例中，P2
為完全迴文。在另一實施例中，P2
富含G-C。在又一實施例中，P2
為CGGCGCX1
GCGCCG，其中X1
為T或不存在。
在一實施例中，寡核苷酸包括至少一個硫代磷酸酯鍵。在另一實施例中，寡核苷酸之所有核苷酸間鍵均為硫代磷酸酯鍵。在另一實施例中，寡核苷酸包括至少一個磷酸二酯樣鍵。在另一實施例中，該磷酸二酯樣鍵為磷酸二酯鍵。在另一實施例中，親脂性基團與寡核苷酸結合。在一實施例中，該親脂性基團為膽固醇。
在一實施例中，用於本發明之TLR-9促效劑為P類CpG寡核苷酸，其具有5' TLR活化域及至少兩個含有互補性之區域，即5'及3'含有互補性之區域，含有互補性之區域的長度各為至少8個核苷酸且直接或經由間隔基彼此連接，其中該寡核苷酸包括至少一個。密啶-嘌呤(YpR)二核苷酸，且其中至少一個含有互補性之區域不為完全迴文。在一實施例中，寡核苷酸包括至少一個未經甲基化之CpG二核苷酸。在另一實施例中，TLR活化域為TCG、TTCG、TTTCG、TYpR、TTYpR、TTTYpR、UCG、UUCG、UUUCG、TTT或TTTT。在另一實施例中，TLR活化域在5'含有互補性之區域內。在另一實施例中，TLR活化域緊鄰5'含有互補性之區域的5'端。在另一實施例中，3'含有互補性之區域的長度為至少10個核苷酸。在又一實施例中，5'含有互補性之區域的長度為至少10個核苷酸。在一實施例中，3'含有互補性之區域包括一個未經甲基化之CpG二核苷酸。在另一實施例中，3'含有互補性之區域包括兩個未經甲基化之CpG二核苷酸。在又一實施例中，5'含有互補性之區域包括一個未經甲基化之CpG二核苷酸。在另一實施例中，5'含有互補性之區域包括兩個未經甲基化之CpG二核苷酸。在另一實施例中，含有互補性之區域包括至少一個核苷酸類似物。在另一實施例中，含有互補性之區域形成分子內雙鏈體。在一實施例中，該分子內雙鏈體包括至少一個非瓦生克立克鹼基對。在另一實施例中，該非瓦生克立克鹼基對為G-T、G-A、G-G或C-A。在一實施例中，含有互補性之區域形成分子間雙鏈體。在另一實施例中，至少一個分子間雙鏈體包括至少一個非瓦生克立克鹼基對。在另一實施例中，該非瓦生克立克鹼基對為G-T、G-A、G-G或C-A。在又一實施例中，含有互補性之區域含有一個錯配。在又一實施例中，含有互補性之區域含有兩個錯配。在另一實施例中，含有互補性之區域含有一個間插核苷酸。在另一實施例中，含有互補性之區域含有兩個間插核苷酸。
在一實施例中，5'及3'含有互補性之區域的雙鏈體穩定性值為至少25。在另一實施例中，5'及3'含有互補性之區域的雙鏈體穩定性值為至少30。在另一實施例中，5'及3'含有互補性之區域的雙鏈體穩定性值為至少35。在另一實施例中，含有互補性之區域的雙鏈體穩定性值為至少40。在另一實施例中，含有互補性之區域的雙鏈體穩定性值為至少45。在另一實施例中，含有互補性之區域的雙鏈體穩定性值為至少50。在另一實施例中，含有互補性之區域的雙鏈體穩定性值為至少55。在另一實施例中，含有互補性之區域的雙鏈體穩定性值為至少60。在另一實施例中，含有互補性之區域的雙鏈體穩定性值為至少65。
在另一實施例中，兩個含有互補性之區域直接連接。在另一實施例中，兩個迴文區域經由3'-3'鍵連接。在又一實施例中，兩個含有互補性之區域有一個核苷酸重疊。在另一實施例中，兩個含有互補性之區域有兩個核苷酸重疊。在另一實施例中，兩個含有互補性之區域不重疊。在另一實施例中，兩個含有互補性之區域由間隔基連接。在另一實施例中，該間隔基為長度為1-50個核苷酸之核酸。在另一實施例中，間隔基為長度為1個核苷酸之核酸。在一實施例中，間隔基為非核苷酸間隔基。在另一實施例中，該非核苷酸間隔基為D-間隔基。在又一實施例中，非核苷酸間隔基為連接子。
在一實施例中，P類寡核苷酸具有式5' XNSPT 3'，其中X為TLR活化域，N為不完全迴文，P為迴文，S為間隔基，且T為長度為0-100個核苷酸之3'尾。在另一實施例中，X為TCG、TTCG或TTTCG。在另一實施例中，T之長度為5-50個核苷酸。在另一實施例中，T之長度為5-10個核苷酸。在另一實施例中，S為長度為1-50個核苷酸之核酸。在另一實施例中，S為長度為1個核苷酸之核酸。在另一實施例中，S為非核苷酸間隔基。在另一實施例中，該非核苷酸間隔基為D-間隔基。在另一實施例中，非核苷酸間隔基為連接子。在另一實施例中，寡核苷酸不為反義寡核苷酸或核糖核酸酶。在另一實施例中，N富含A及T。在另一實施例中，N包括至少4個T。在另一實施例中，P為完全迴文。在另一實施例中，P富含G-C。在另一實施例中，P為CGGCGCX1
GCGCCG，其中X1
為T或不存在。在另一實施例中，寡核苷酸包括至少一個硫代磷酸酯鍵。在另一實施例中，寡核苷酸之所有核苷酸間鍵均為硫代磷酸酯鍵。在另一實施例中，寡核苷酸包括至少一個磷酸二酯樣鍵。在另一實施例中，該磷酸二酯樣鍵為磷酸二酯鍵。在另一實施例中，親脂性基團與寡核苷酸結合。在一實施例中，該親脂性基團為膽固醇。
在一實施例中，本發明之「P類」CpG寡核苷酸具有以下核酸序列：5' TCGTCGACGATCGGCGCGCGCCG 3'(SEQ ID No 607)。
在該等序列中，所有鍵均可為硫代磷酸酯鍵。在另一實施例中，一或多個鍵可為磷酸二酯，較佳位於CpG基元之「C」與「G」之間，從而產生半軟CpG寡核苷酸。在任何此等序列中，乙基-尿苷或鹵素可取代5' T；鹵素取代之實例包括(但不限於)溴-尿苷或碘-尿苷取代。
P類寡核苷酸之一非限制性實例包括：5'T*C_G*T*C_G*A*C_G*A*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G3'，其中*係指硫代磷酸酯鍵且_係指磷酸二酯鍵。
在一實施例中，本文所揭示之CpG寡核苷酸的所有核苷酸間鍵均為磷酸二酯鍵(「軟」寡核苷酸，如PCT申請案WO 2007/026190中所述)。在另一實施例中，本發明之CpG寡核苷酸抵抗降解(例如穩定)。「穩定之寡核苷酸」係指相對抵抗活體內降解(例如經由核酸外切酶或核酸內切酶)之寡核苷酸。核酸穩定亦可經由主鏈修飾來實現。具有硫代磷酸酯鍵之寡核苷酸提供最大活性且保護寡核苷酸免受細胞內核酸外切酶及核酸內切酶降解。
免疫刺激性寡核苷酸可具有嵌合主鏈，其具有磷酸二酯鍵與硫代磷酸酯鍵之組合。出於本發明之目的，嵌合主鏈係指部分穩定之主鏈，其中至少一個核苷酸間鍵為磷酸二酯或磷酸二酯樣鍵，且其中至少一個其他核苷酸間鍵為穩定之核苷酸間鍵，其中該至少一個磷酸二酯或磷酸二酯樣鍵與該至少一個穩定之鍵不同。如PCT申請案WO 2007/026190中所述，當磷酸二酯鍵優先位於CpG基元中時，該等分子稱為「半軟」。
其他經修飾之寡核苷酸包括磷酸二酯鍵、硫代磷酸酯鍵、甲基膦酸酯鍵、甲基硫代磷酸酯鍵、二硫代磷酸酯鍵及/或對乙氧基鍵之組合。
因為已報導硼烷膦酸酯鍵相對於磷酸二酯鍵為穩定的，所以出於主鏈之嵌合性質之目的，硼烷膦酸酯鍵可視上下文而分類為磷酸二酯樣鍵或穩定之鍵。舉例而言，在一些實施例中，本發明之嵌合主鏈可包括至少一個磷酸二酯(磷酸二酯或磷酸二酯樣)鍵及至少一個硼烷膦酸酯(穩定之)鍵。在其他實施例中，本發明之嵌合主鏈可包括硼烷膦酸酯(磷酸二酯或磷酸二酯樣)及硫代磷酸酯(穩定之)鍵。「穩定之核苷酸間鍵」應意謂與磷酸二酯核苷酸間鍵相比相對抵抗活體內降解(例如經由核酸外切酶或核酸內切酶)之核苷酸間鍵。較佳穩定之核苷酸間鍵包括(但不限於)硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯及甲基硫代磷酸酯。其他穩定之核苷酸間鍵包括(但不限於)肽、烷基、去磷及如上文所述之其他鍵。
可使用自動化技術，採用胺基磷酸酯或H-膦酸酯化學法來合成經修飾之主鏈(諸如硫代磷酸酯)。芳基-膦酸酯及烷基-膦酸酯可例如如美國專利第4,469,863號中所述製備；且烷基磷酸三酯(其中帶電氧部分經烷基化，如美國專利第5,023,243號及歐洲專利第092,574號中所述)可藉由自動化固相合成，使用市售試劑來製備。進行其他DNA主鏈修飾及取代之方法已有所描述。Uhlmann E等人(1990)Chem Rev 90:544;Goodchild J(1990) Bioconjugate Chem 1:165。製備嵌合寡核苷酸之方法亦為已知。舉例而言，頒予Uhlmann等人之專利已描述該等技術。
混合型主鏈經修飾之ODN可如PCT申請案WO 2007/026190中所述合成。
本發明之寡核苷酸亦可包括其他修飾。此等修飾包括非離子性DNA類似物，諸如烷基-磷酸酯及芳基-磷酸酯(其中帶電膦酸酯氧由烷基或芳基置換)、磷酸二酯及烷基磷酸三酯(其中帶電氧部分經烷基化)。在任一端或兩端含有二醇(諸如四乙二醇或六乙二醇)之核酸亦顯示為實質上抵抗核酸酶降解。
CpG寡核苷酸之尺寸(亦即沿寡核苷酸之長度的核苷酸殘基數目)亦可有助於寡核苷酸之刺激活性。為促進吸收至細胞中，本發明之CpG寡核苷酸較佳具有6個核苷酸殘基的最小長度。若存在足夠免疫刺激性基元，則任何尺寸大於6個核苷酸(甚至許多個kb長)之寡核苷酸均能夠誘導免疫反應，因為較大寡核苷酸在細胞內降解。在某些實施例中，CpG寡核苷酸之長度為6至100個核苷酸，較佳長度為8至30個核苷酸。在重要實施例中，本發明之核酸及寡核苷酸不為質體或表現載體。
在一實施例中，本文所揭示之CpG寡核苷酸包含取代或修飾，諸如在鹼基及/或糖中，如WO 2007/026190之第134至147段中所述。
在一實施例中，本發明之CpG寡核苷酸經化學修飾。化學修飾之實例為熟習此項技術者所已知且例如描述於Uhlmann E.等人，(1990),Chem. Rev. 90:543,S. Agrawal編,Humana Press,Totowa,USA 1993；Crooke,S.T.等人(1996) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 36:107-129；及Hunziker J.等人，(1995),Mod. Synth. Methods 7:331-417中。本發明之寡核苷酸可具有一或多種修飾，其中與包含天然DNA或RNA之具有相同序列的寡核苷酸相比，各修飾位於特定磷酸二酯核苷間橋及/或特定β-D-核糖單元及/或特定天然核苷鹼基位置。
在本發明之一些實施例中，含有CpG之核酸可根據熟習此項技術者已知之方法簡單地與免疫原性載體混合(參見例如WO 03/024480)。
在本發明之一特定實施例中，本文所揭示之任何疫苗包含20 μg至20 mg CpG寡核苷酸，較佳0.1 mg至10 mg CpG寡核苷酸，較佳0.2 mg至5 mg CpG寡核苷酸，較佳0.3 mg至3 mg CpG寡核苷酸，甚至較佳0.4 mg至2 mg CpG寡核苷酸，甚至較佳0.5 mg至1.5 mg CpG寡核苷酸。在一較佳實施例中，本文所揭示之任何疫苗包含約0.5 mg至1 mg CpG寡核苷酸。
用於本發明之較佳佐劑為明礬、QS21、CpG ODN、明礬與CpG ODN組合、Iscomatrix及Iscomatrix與CpG ODN組合。
本發明亦提供醫藥組合物，其包含本發明之抗原性PCSK9肽或其免疫原性組合物，與一或多種醫藥學上可接受之賦形劑締合及視情況與一或多種佐劑(如上文所述之佐劑)組合成調配物。術語「賦形劑」在本文中用於描述除活性成份(亦即最後與免疫原性載體偶合及視情況與一或多種佐劑組合之本發明之抗原性PCSK9肽)外之任何成份。賦形劑之選擇將在很大程度上視諸如特定投藥方式、賦形劑對溶解性及穩定性之影響及劑型之性質的因素而定。如本文中所使用，「醫藥學上可接受之賦形劑」包括任何及所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延緩劑及生理學上相容之類似物。醫藥學上可接受之賦形劑的一些實例為水、生理食鹽水、磷酸鹽緩衝生理食鹽水、右旋糖、甘油、乙醇及其類似物以及其組合。在多數情況下，較佳在該組合物中包括等張劑，例如糖、多元醇(諸如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化鈉。醫藥學上可接受之物質的其他實例為濕潤劑或少量輔助物質，諸如濕潤劑或乳化劑、防腐劑或緩衝劑，其延長活性成份之存放期或增強活性成份之有效性。
本發明之醫藥組合物及其製備方法對於熟習此項技術者而言為顯而易知的。該等組合物及其製備方法可見於例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第19版(Mack Publishing Company,1995)中。醫藥組合物較佳在GMP條件下製造。
本發明之醫藥組合物可以單一單位劑量形式或以複數個單一單位劑量形式整批製備、包裝或出售。如本文中所使用，「單位劑量」為包含預定量活性成份之醫藥組合物的個別量。活性成份之量一般等於向個體投與之活性成份的劑量或該劑量之合適部分(例如該劑量之一半或三分之一)。
此項技術所接受之任何投與肽或蛋白質的方法均可適當地用於本發明之肽或蛋白質。
本發明之醫藥組合物通常適於非經腸投與。如本文中所使用，醫藥組合物之「非經腸投與」包括如下特徵之任何投藥途徑：物理破壞個體之組織及經由該組織之破口投與醫藥組合物，由此一般導致直接投入血流、肌肉或內臟器官中。因此，非經腸投藥包括(但不限於)藉由注射組合物、經由手術切口施用組合物、經由組織刺穿非手術創口施用組合物及其類似方式投與醫藥組合物。特定而言，非經腸投藥意欲包括(但不限於)皮下、腹膜內、肌肉內、胸骨內、靜脈內、動脈內、鞘內、室內、尿道內、顱內、滑膜內注射或輸注；及腎透析輸注技術。較佳實施例包括靜脈內、皮下、皮內及肌肉內途徑，甚至更佳實施例為肌肉內或皮下途徑。
適於非經腸投與之醫藥組合物的調配物通常一般包含活性成份與醫藥學上可接受之載劑(諸如無菌水或無菌等張生理食鹽水)組合。該等調配物可以適於大丸劑(bolus))投藥或連續投藥之形式製備、包裝或出售。可注射調配物可以單位劑型製備、包裝或出售，諸如安瓿或含有防腐劑之多劑量容器。用於非經腸投與之調配物包括(但不限於)懸浮液、溶液、於油性或水性媒劑中之乳液、糊劑及其類似物。該等調配物可另外包含一或多種其他成份，包括(但不限於)懸浮劑、穩定劑或分散劑。在用於非經腸投與之調配物的一實施例中，活性成份以乾燥(亦即粉末或顆粒)形式提供，在用適合之媒劑(例如無菌無熱原質水)復原之後，非經腸投與復原組合物。非經腸調配物亦包括可含有諸如鹽、碳水化合物及緩衝劑之賦形劑的水溶液(較佳達到pH 3至9)，但對於一些應用，可更適當地調配為無菌非水溶液或乾燥形式，以與適合之媒劑(諸如無菌無熱原質水)結合使用。例示性非經腸投藥形式包括於無菌水溶液(例如丙二醇水溶液或右旋糖水溶液)中之溶液或懸浮液。必要時，該等劑型可適當緩衝處理。其他適用之可非經腸投與之調配物包括彼等包含呈微晶形式、微粒或脂質體製劑形式之活性成份的調配物。用於非經腸投與之調配物可調配成立即釋放及/或修飾釋放。修飾釋放調配物包括延遲釋放、持續釋放、脈衝釋放、控制釋放、靶向釋放及程控釋放(programmed release)。
舉例而言，在一態樣中，無菌可注射溶液可藉由將所需量之抗PCSK9肽(較佳與免疫原性載體偶合，視情況與一或多種佐劑組合)併入含有上文所列舉之一種成份或成份組合的適當溶劑中，若需要時，隨後過濾滅菌而製成。一般藉由將活性化合物併入含有基礎分散介質及上文所列舉之所需其他成份的無菌媒劑中來製備分散液。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉末的情況下，較佳製備方法為真空乾燥及凍乾，由此自先前無菌過濾之溶液得到活性成份加上任何其他所需成份之粉末。可例如藉由使用包衣(諸如卵磷脂)，藉由在分散液情況下維持所需粒徑及藉由使用界面活性劑來維持溶液之適當流動性。可注射組合物之延長吸收可藉由在該組合物中包括延緩吸收之藥劑(例如單硬脂酸鹽及明膠)來實現。
本發明之例示性、非限制性醫藥組合物為呈無菌水溶液之調配物，其pH值在約5.0至約6.5之範圍內且包含約0.1 mg/mL至約20 mg/mL本發明之肽、約1毫莫耳濃度至約100毫莫耳濃度組胺酸緩衝液、約0.01 mg/mL至約10 mg/mL聚山梨醇酯80、約100毫莫耳濃度至約400毫莫耳濃度海藻糖及約0.01毫莫耳濃度至約1.0毫莫耳濃度二水合乙二胺四乙酸二鈉。
本發明之抗原性PCSK9肽亦可經鼻內投與或通常以乾粉形式(單獨、以混合物形式、或以混合組份粒子形式，例如與適合之醫藥學上可接受之賦形劑混合)自乾粉吸入器藉由吸入法投與，以氣溶膠噴霧形式自加壓容器、泵、噴霧器、霧化器(較佳為利用電流體動力學來產生細霧之霧化器)或噴灑器，在使用或不使用適合之推進劑的情況下投與，或以滴鼻劑形式投與。
該加壓容器、泵、噴霧器、霧化器或噴灑器一般含有本發明抗體的溶液或懸浮液，其包含例如適於分散活性物質、溶解活性物質或延長活性物質釋放之試劑，及作為溶劑之推進劑。
在以乾粉或懸浮液調配物形式使用之前，一般將藥品微米尺寸化至適於藉由吸入傳遞之尺寸(通常小於5微米)。此可藉由任何適當磨碎方法來達成，諸如螺旋噴射研磨、流體床噴射研磨、形成奈米粒子之超臨界流體處理、高壓均質化或噴霧乾燥。
於吸入器或吹入器中使用之膠囊、發泡藥及藥筒可調配成含有本發明之化合物、適合之粉末基劑及效能調節劑的粉末混合物。
適合於利用電流體動力學來產生細霧之霧化器中使用的溶液調配物可含有適合每次致動劑量之本發明之抗原性PCSK9肽且致動體積可例如在1 μL至100 μL之範圍內
可將適合之芳香劑(諸如薄荷腦及左旋薄荷腦)或甜味劑(諸如糖精或糖精鈉)添加至欲用於吸入/鼻內投與之本發明之調配物中。
用於吸入/鼻內投與之調配物可調配成立即釋放及/或修飾釋放。修飾釋放調配物包括延遲釋放、持續釋放、脈衝釋放、控制釋放、靶向釋放及程控釋放。
在乾粉吸入器及氣溶膠之情況下，藉助於傳遞計定量的閥來確定劑量單位。本發明之單位通常配置成投與定劑量或「噴一次劑量」之本發明之抗體。總日劑量通常將以單次劑量投與或更通常以分次劑量在一天內投與。
包含抗原性PCSK9肽之醫藥組合物亦可經調配用於經口途徑投藥。經口投藥可包括吞咽，以使化合物進入胃腸道中；及/或頰內、經舌或舌下投藥，藉此化合物直接自口腔進入血流中。
適於經口投與之調配物包括固體、半固體及液體系統，諸如錠劑；含有多微粒或奈米微粒、液體或粉末之軟膠囊或硬膠囊；口含錠(包括液體填充型)；咀嚼片；凝膠；快速分散劑型；薄膜；卵形栓劑(ovule)；噴霧劑；及頰內/黏膜黏附貼片。
液體調配物包括懸浮液、溶液、糖漿及酏劑。該等調配物可以軟膠囊或硬膠囊(例如由明膠或羥丙基甲基纖維素製成)中之填充物形式使用且通常包含載劑(例如水、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、甲基纖維素或適合之油)及一或多種乳化劑及/或懸浮劑。液體調配物亦可藉由使固體(例如來自藥囊)復原來製備。
本發明之組合物可用於藉由用免疫療法刺激處於罹患PCSK9介導病症或症狀之風險中的個體之免疫反應來治療、減輕或預防該個體之該等病症或症狀。免疫療法可包含初始免疫，隨後為另外(例如一次、兩次、三次或三次以上)加強免疫。
本發明之抗原性PCSK9肽或其組合物的「免疫有效量」為以單次劑量形式或作為一系列之一部分傳遞至哺乳動物個體之量，該量可有效誘導該個體針對PCSK9之免疫反應。此量視待治療個體之健康及身體狀況、待治療個體之分類群、個體免疫系統合成抗體之能力、疫苗之調配物及其他相關因素而變化。預期該量將在可經由常規試驗來確定的相對較寬之範圍內。
「醫藥學上有效之劑量」或「治療有效劑量」為治療或預防或減輕個體之一或多種PCSK9相關病症或症狀所需的劑量。該醫藥學上有效之劑量尤其視欲投與之特定化合物、症狀之嚴重程度、個體對副作用之敏感性、疾病類型、所用組合物、投藥途徑、所治療哺乳動物之類型、應考慮的特定哺乳動物之身體特徵(諸如健康及身體狀況)、共存藥物療法、個體免疫系統合成抗體之能力、所需預防程度及熟習醫學技術者會認識到之其他因素而定。出於預防目的，選擇誘導典型接種疫苗者之免疫保護反應而無顯著不良副作用之量作為各劑量中之肽量。在初始接種疫苗後，個體可接受一或若干次適當間隔之加強免疫。
應瞭解用於任何特定患者之特定劑量視多種因素而定，包括所用特定化合物之活性、年齡、體重、一般健康狀況、性別、飲食、投藥時間、投藥途徑及排泄速率、藥物組合及進行治療之特定疾病的嚴重程度。
舉例而言，本發明之抗原性PCSK9肽或醫藥組合物可以約0.1 μg至約5 mg之劑量向個體投與，例如約0.1 μg至約5 μg、約5 μg至約10 μg、約10 μg至約25 μg、約25 μg至約50 μg、約50 μg至約100 μg、約100 μg至約500 μg、約500 μg至約1 mg、約1 mg至約2 mg，其中視情況在例如1週後、2週後、3週後、4週後、2個月後、3個月後、6個月後及/或1年後給與加強免疫。
在一些實施例中，投與單次劑量之本發明之抗原性PCSK9肽或醫藥組合物。在其他實施例中，投與多次劑量之本發明之抗原性PCSK9肽或醫藥組合物。投藥頻率可視多種因素中之任一者而變化，例如症狀之嚴重程度、所需免疫保護程度、組合物用於預防性目的抑或治癒性目的等。舉例而言，在一些實施例中，如下投與本發明之抗原性PCSK9肽或醫藥組合物：每月一次、每月兩次、每月三次、每隔一週(qow)、每週一次(qw)、每週兩次(biw)、每週三次(tiw)、每週四次、每週五次、每週六次、每隔一日(qod)、每日(qd)、每日兩次(qid)或每日三次(tid)。當本發明之組合物用於預防目的時，其一般將以初次劑量與加強劑量投與。預期加強劑量將適當地間隔，或較佳每年給與或以使得循環抗體之含量降至所需含量之下的次數給與。加強劑量可由抗原性PCSK9肽組成而無原始免疫原性載體分子。該等加強構築體可包含替代性免疫原性載體或可無任何載體。該等加強組合物可在佐劑存在或不存在下進行調配。
投與本發明之抗原性PCSK9肽的持續時間(例如投與抗原性PCSK9肽所經時段)可視多種因素(例如患者反應等)中之任一者而變化。舉例而言，抗原性PCSK9肽可經如下範圍之時段投與：約1日至約1週、約2週至約4週、約1個月至約2個月、約2個月至約4個月、約4個月至約6個月、約6個月至約8個月、約8個月至約1年、約1年至約2年、或約2年至約4年或更長時間。
本發明亦涵蓋各種治療方法，該等方法包含投與本發明之抗原性PCSK9肽。本發明治療方法包括誘導個體對自體PCSK9之免疫反應的方法，及預防、減輕或治療個體之PCSK9介導病症或症狀的方法。
在一態樣中，本發明提供一種治療、預防或減輕個體之PCSK9相關病症或症狀的方法，其包含向該個體投與治療有效量之本發明之抗原性PCSK9肽或其免疫原性或醫藥組合物。
在另一態樣中，本發明提供一種誘導個體針對自體PCSK9之免疫反應的方法，其包含向該個體投與治療有效或免疫有效量之本發明之抗原性PCSK9肽或其免疫原性或醫藥組合物。
PCSK9相關疾病或PCSK9介導之疾病為例如PCSK9活性之抑制或PCSK9與LDL受體相互作用之抑制可為有益的疾病。
「治療」係指減輕或消除生物學病症及/或其至少一種伴隨症狀之方法。如本文中所使用，「減輕」疾病、病症或病狀意謂降低該疾病、病症或病狀之症狀的嚴重程度及/或出現頻率。此外，本文中提及「治療」包括提及治癒性、緩解性及預防性處理。該個體較佳為人類且可為任何年齡之男性或女性。
本發明之其他態樣係關於本發明之抗原性PCSK9肽或其免疫原性組合物或醫藥組合物，其用作藥劑，較佳用於治療、減輕或預防PCSK9相關病症。
在另一態樣中，本發明提供本發明之抗原性PCSK9肽或其免疫原性組合物或醫藥組合物的用途，其用於製造較佳用於治療PCSK9相關病症的藥劑。
詳言之，本發明係關於本發明之抗原性PCSK9肽或其免疫原性或醫藥組合物，其用作藥劑，較佳用於治療、減輕或預防與高膽固醇含量相關之疾病。
在又一態樣中，本發明提供本發明之抗原性PCSK9肽或其免疫原性組合物或醫藥組合物之用途，其用於製造藥劑，較佳降低有需要個體血液中LDL-膽固醇含量之藥劑。
在本發明之用途或方法之一些態樣中，該PCSK9相關病症係選自由以下組成之群：高膽固醇或與高LDL-膽固醇相關之病狀，例如脂質病症(例如高脂血症，第I型、第II型、第III型、第IV型或第V型高脂血症、繼發性高甘油三酸酯血症、高膽固醇血症、家族性高膽固醇血症、黃瘤病、膽固醇乙醯基轉移酶缺乏)、動脈硬化病狀(例如動脈粥樣硬化症)、冠狀動脈疾病及心血管疾病。
在又一態樣中，本發明提供本發明抗原性PCSK9肽或其免疫原性組合物或醫藥組合物之用途，其用於製造供治療或減輕LDL受體之上調或PCSK9與LDL受體之間相互作用之抑制為有利的疾病用的藥劑。
在又一態樣中，本發明提供本發明之抗原性PCSK9肽或其免疫原性組合物或醫藥組合物之用途，其用於製造供治療阿茲海默氏病用之藥劑。
在本發明之用途或方法的其他態樣中，該個體為哺乳動物，較佳為人類個體。
在本發明之用途或方法的其他態樣中，該個體罹患該PCSK9介導病症。或者，該個體處於罹患該PCSK9相關病症之風險中，例如歸因於存在一或多個風險因子(例如高血壓、吸菸、糖尿病、肥胖症或高同半胱胺酸血症)。
本發明之抗原性PCSK9肽或其免疫原性組合物或醫藥組合物適用於對另一降膽固醇劑之療法不耐受之個體或另一降膽固醇劑療法所產生之效果不充分之個體(例如接受士他汀(statin)療法但LDL-膽固醇降低不足之個體)。本發明之抗原性PCSK9肽可投與高LDL-膽固醇之個體。
高膽固醇之個體較佳為總血漿膽固醇含量為200 mg/dl或更高之人類個體。高膽固醇之個體較佳為LDL-膽固醇含量為160 mg/dl或更高之人類個體。
總血漿膽固醇含量及LDL-膽固醇含量係使用標準方法對適當禁食之後獲得之血液樣品量測。量測總血漿膽固醇含量及LDL-膽固醇含量之方案為熟習此項技術者所熟知。
在一實施例中，抗原性PCSK9肽或其免疫原性組合物或醫藥組合物與另一藥劑一起投與，兩者可以任何順序依次投與或同時投與。在一些實施例中，抗原性PCSK9肽或其免疫原性組合物或醫藥組合物投與亦接受第二藥劑(例如第二降膽固醇劑)療法之個體。降膽固醇劑包含士他汀、膽酸螯合劑、菸酸、纖維酸衍生物及長鏈a,ω-二元羧酸。士他汀藉由阻斷膽固醇生物合成中之關鍵酶HMGCoA抑制膽固醇合成。士他汀之實例為洛伐他汀(lovastatin)、普伐他汀(pravastatin)、阿托伐他汀(atorvastatin)、西立伐他汀(cerivastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)及辛伐他汀(simvastatin)。膽酸螯合劑中斷膽酸自腸至肝臟之再循環。此等藥劑之實例為消膽胺(cholestyramine)及鹽酸考來替泊(colestipol hydrochloride)。纖維酸衍生物之實例為對氯苯氧異丁酸乙酯(clofibrate)及吉非貝齊(gemfibrozil)。長鏈α,ω-二元羧酸描述於例如Bisgaier等人，1998,J. Lipid Res. 39:17-30、WO 98/30530、美國專利第4,689,344號、WO 99/001 16、美國專利第5,756,344號、美國專利第3,773,946號、美國專利第4,689,344號、美國專利第4,689,344號、美國專利第4,689,344號及美國專利第3,930,024號中；醚(參見例如美國專利第4,711,896號、美國專利第5,756,544號、美國專利第6,506,799號)。多萜醇(dolichol)之磷酸酯(美國專利第4,613,593號)及吡咯啶二酮(azolidinedione)衍生物(美國專利第4,287,200號)亦可用於降低膽固醇含量。組合療法可為疊加療法，或其可產生協同效果(例如膽固醇降低量高於對兩種藥劑組合使用所預期的量)。在一些實施例中，抗原性PCSK9肽或其免疫原性組合物或醫藥組合物與士他汀之組合療法產生協同效果(例如膽固醇協同降低)。在一些個體中，此可允許減少士他汀劑量而獲得所要之膽固醇含量。
提出以下實例以便為一般熟習此項技術者提供如何進行及使用本發明之完整的揭示及描述，且不欲限制發明者視為其發明之範疇，且亦不欲表示以下實驗為所執行之全部或唯一實驗。已努力確保所用數字(例如量、溫度等)之準確度，但應考慮一些實驗誤差及偏差。除非另外指示，否則份數為重量份，分子量為重量平均分子量，溫度以攝氏溫度計，且壓力為大氣壓或接近大氣壓。可使用標準縮寫，例如：bp，鹼基對；kb，千鹼基；pl，皮升；s或sec，秒；min，分鐘；h或hr，小時；aa，胺基酸；kb，千鹼基；bp，鹼基對；nt，核苷酸；i.m.，肌肉內；i.p.，腹膜內；s.c.，皮下；及其類似縮寫。
與LDL受體之EGF-A域結合之人類PCSK9的結構已解出並公開(Kwon等人，PNAS 105,1820-1825,2008)。此結構資訊(PDB:3BPS)與游離PCSK9之結構PDB:2P4E之資訊(Cunningham等人，Nature Structural & Molecular Biology,14,413-419,2007)一起使用以設計以下將對應於對PCSK9-LDL受體相互作用而言重要之區域的肽(參見圖1)。
肽1.ASSDCSTCFV
(SEQ ID No: 19)
肽2. GTRFHRQASK
(SEQ ID No: 63)
肽3. IQSDHREIEGRV
(SEQ ID No: 109)
肽4. SGRDAGVAKGA
(SEQ ID No: 153)
肽5. SIPWNLERITP
(SEQ ID No: 184)
因為肽1-4表示PCSK9結構中之環，所以各別序列(SEQ ID No 19、63、109及153)經製備成添加有Cys、Cys-Gly或Lys連接子以允許經由兩端偶合於VLP載體，從而提供天然環結構之構形模擬物(表1中之VR_9.1至VR_9.4)。另外，亦可製備肽2-4之環化形式(表1中之VR_9.6至VR_9.9)，其提供Cys殘基以偶合於VLP。肽1經製備成具有Lys-Gly-Gly N端連接子以用於偶合目的，以致兩個Cys殘基如同在天然PCSK9結構中一樣不具有雙硫鍵。肽5表示人類PCSK9之成熟加工形式之N端，且經由C端添加之半胱胺酸殘基偶合，從而使N端游離以達成抗體識別(表1中之VR_9.5)。下表(表1)描述9種產生用於作為疫苗候選物評估之肽。
下劃線指示出於接合目的而添加之半胱胺酸殘基，且雙下劃線指示GC或KGG連接子。
使用標準Fmoc方案，在CLEAR醯胺樹脂上合成肽。在HOBt(羥基苯并三唑)及NMM(N-甲基嗎啉)存在下使用5倍過量之經1當量HBTU(六氟磷酸2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基)活化的受Fmoc保護之胺基酸進行胺基酸偶合反應。用20%哌啶/DMF脫除Fmoc保護基。接著裂解結合樹脂之肽且同時用試劑D(TFA/H2
O/DODT：89/3/8)移除側鏈保護基。該肽製備成具有游離N端及醯胺化C端。藉由HPLC，使用BEH 130 C18管柱及水/乙腈梯度，在0.1% TFA存在下純化粗肽至均質。使用凍乾器真空乾燥經純化之肽。使用質譜分析法(LC-MS)分析該肽且得到令人滿意的數據。
用於此研究中之Qβ VLP係藉由在併有編碼14kD單體蛋白質之pET28質體的BL21(DE3)菌株中進行細菌大腸桿菌醱酵來製造：MAKLETVTLGNIGKDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVPALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQAYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY(Genbank ID: M99039)。在0.8之OD600下用IPTG誘導該醱酵且使其在含有卡那黴素(kanamycin)之極品肉湯(terrific broth，TB)中進行隔夜。接著使用專利申請案EP1736538中所述之方法，自醱酵細胞小球純化在宿主細胞中自組裝之VLP，以下為不同之處：在細胞破碎後，用50%飽和度之硫酸銨處理澄清之勻漿且藉由離心回收細胞小球。接著將該小球再溶解於HEPES緩衝液中且相對於HEPES緩衝液進行透析，隨後進行公開方法中之第一管柱步驟。在離子交換管柱及羥磷灰石管柱步驟後，使用另一陰離子交換管柱步驟純化物質且無菌過濾，產生最終VLP塊狀物質，藉由尺寸排阻層析、SDS-PAGE及電子顯微術進行分析，得到可接受之結果。
使用N-γ-順丁烯二醯亞胺基-丁醯氧基-丁二醯亞胺酯(GMBS)或較長的丁二醯亞基-6-[β-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺基]己酸酯連接試劑活化Qβ VLP。該兩種試劑之使用程序類似：將固體試劑溶解於二甲亞碸(DMSO)中且以10倍莫耳過量添加至VLP溶液中。使活化反應進行90分鐘且接著使用NAP-25除鹽管柱，在含有5 mM EDTA之杜爾貝科磷酸鹽緩衝生理食鹽水(Dulbeccos Phosphate Buffered Saline，DPBS)或已藉由添加固體NaCl(14.6 g/L)改質之杜爾貝科磷酸鹽緩衝生理食鹽水(DPBS)中使溶液除鹽。必要時，在下一結合反應之前，使用10 kD旋轉微量濃縮器略微濃縮蛋白質溶液。
在結合反應之前，將肽溶解於含有5 mM EDTA作為添加劑之pH 7.4 DPBS的等分試樣中。溶液肽的濃度為10 mg/ml。將溶解之肽添加至已用含有5 mM EDTA之DPBS洗滌的經TCEP固定之還原劑(Pierce Chemical)之等分試樣中。藉由在TCEP凝膠存在下混合，將肽之等分試樣培育約1小時，此後在microfuge中離心該等分試樣且棄去固體顆粒。將經還原之含肽上清液直接添加至先前製備之活性VLP中。然而，該程序之一替代方案為直接將固體肽添加至活性Qβ VLP樣品中。該兩種方法同等有效地產生肽-VLP結合物。
使VLP與經還原之肽在極平緩混合下反應至少30分鐘。在反應時間結束時，使用NAP-10或NAP-25除鹽管柱(GE Healthcare)，於杜爾貝科PBS(DPBS)中使各樣品除鹽。使用Bradford(庫馬斯亮藍(Coomassie Brilliaht Blue)，Pierce Chemical Co)檢定或BCA蛋白質檢定(二辛可寧酸(bicinchoninic acid))(Pierce Chemical Co)且藉由SDS-PAGE及尺寸排阻層析來分析經除鹽之結合肽的蛋白質含量。使用0.22 μm過濾器對結合產物進行無菌過濾且儲存於2-8℃下直至使用為止。在儲存期間小心注意此等樣品以防止冷凍或暴露於極端溫度。
藉由使用BAANS(溴乙酸N-羥基丁二醯亞胺酯，Sigma B8271)進行PCSK9肽與CRM197之結合。首先藉由在冷室中在0.1 M碳酸鈉(pH 8.3)中使CRM197與BAANS以100莫耳比反應90分鐘來活化CRM197。使反應混合物通過Zeba脫鹽管柱，且收集流動通過之物。在室溫下將10 mg/mL PCSK9肽與等體積之固定TCEP還原凝膠(Thermo Scientific)一起培育1小時，且在離心後經由0.2 μm過濾器收集。隨後在冷室中混合活性CRM197與經處理之肽隔夜，接著以PBS緩衝液澈底透析。回收結合物，濃縮，且經由0.22 μm過濾器滅菌。使用考馬斯藍檢定(Coomassie blue assay)(Thermo Scientific)測定蛋白質濃度。
為達成肽經由胺殘基結合於Qβ，尤其肽VR_9.1，遵循以下程序。最初藉由添加相對於VLP單體10倍莫耳過量之固體丁二酸酐使Qβ衍生化。使丁二酸酐溶解，且使衍生化反應進行至少30分鐘。此後，接著使用NAP-25脫鹽管柱於含5 mM EDTA之杜爾貝科磷酸鹽緩衝生理食鹽水(DPBS)中使樣品脫鹽。接著，按所列順序添加相對於VLP單體10倍莫耳過量之下列試劑：固體肽、N-羥基磺酸基丁二醯亞胺及1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺。按所列順序添加各試劑後，在室溫下培育樣品，且使反應進行至少30分鐘，此後，使用NAP-25脫鹽管柱於杜爾貝科磷酸鹽緩衝生理食鹽水(DPBS)中使VLP-肽結合物脫鹽。
使用SDS-PAGE量測VLP-肽樣品之結合程度，且所有樣品均觀察到與向VLP蛋白質單體中添加肽一致之分子量增加。另外，在HPLC尺寸排阻層析檢定中測試樣品(使用Tosoh PWXL5000 HPLC管柱)，且發現當與VLP之非結合樣品相比時，含有組裝之VLP。VLP-肽結合特徵概述於表2中。
*如由SDS-PAGE及密度測定計算所測定
此研究之目的在於評估與Qβ VLP結合之肽(如以上實例2中所詳述)如何有效誘導可結合人類及小鼠PCSK9之抗體反應。在第0、21及42天，經由肌肉內途徑給雌性Balb/c(6-8週)注射調配於明礬及式5' TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT 3'之CpG中之VLP-肽結合物(向各脛前肌中注射50微升體積)。根據相同方案用偶合於對照(非PCSK9)肽之VLP對一組對照小鼠進行免疫，且第二對照組保持不經免疫。在第49天進行屍檢。屍檢時，藉由心臟穿刺，使用抗凝血劑，自安樂死之小鼠取得400-600微升血液樣品。離心血液以分離血漿，冷凍儲存直至測試為止。
使用比色ELISA方法量測IgG抗體對全長人類重組PCSK9蛋白之反應。由血清樣品製備連續稀釋液且在檢定中測試。
人類PCSK9 ELISA方法1：用每孔25 μL以0.01 M PBS(pH 7.4)稀釋至1 μg/mL之人類PCSK9蛋白儲備液塗佈384孔高結合檢定板(Corning International，目錄號3700)且於室溫下在震盪器上培育3小時。用PBS(pH 7.4)洗滌板2次後，使用每孔80 μL 0.01 M PBS/1% BSA阻斷板，於室溫下培育1小時，隨後用0.01 M PBS(pH 7.4)/0.05%吐溫20最後洗滌3次。第二天，以1:25稀釋度(PBS/1% BSA稀釋劑)開始製備各樣品之8點對數連續稀釋液，將每孔25 μL連續稀釋液一式兩份轉移至塗有人類PCSK9之板中，接著於室溫下震盪培育1.5小時。用0.01 M PBS(pH 7.4)/0.05%吐溫20洗滌3次後，每孔添加25 μL以0.01 M PBS(pH 7.4)/1%BSA 1:6000稀釋之總IgG偵測抗體(兔抗mu IgG-Fc，目錄號A90-130A，Bethyl Laboratories)，接著於室溫下震盪培育1小時。用0.01 M PBS(pH 7.4)/0.05%吐溫20洗滌5次後，每孔添加25 μL以0.01 M PBS(pH 7.4)/0.05%吐溫20(pH 7.4)1:3000稀釋之Bio-Rad套組山羊抗兔辣根過氧化酶結合物(Bio-Rad，目錄號172-1019)，接著於室溫下震盪培育1小時。用0.01 M PBS(pH 7.4)/0.05%吐溫20洗滌4次，接著用單獨0.01 M PBS(pH 7.4)洗滌1次後，每孔添加25 μL小鼠Typer HRP受質(Bio-Rad，目錄號172-1064)，且於室溫下培育板30分鐘。每孔添加25 μL 2%乙二酸，接著於405 nm吸收波長下讀取吸光度。
小鼠PCSK9 ELISA方法1：在4℃下，用100 μl含1 μg/ml重組小鼠PCSK9之PBS塗佈Thermo Immunolon 4HBX 96孔ELISA板隔夜。洗滌後，用300 ml PBS/0.5% BSA(Sigma A7030)阻斷板1小時，用300 μl PBS/0.01%吐溫20洗滌4次，且添加100 μl血漿樣品連續稀釋液(以PBS/0.5% BSA稀釋)。於室溫下在輕輕震盪下培育1小時後，用300 μl PBS/0.01%吐溫20洗滌板4次，且每孔添加100 μl山羊抗小鼠IgG-HRP(辣根過氧化酶；Pierce 31430)之1:5000稀釋液。於室溫下在輕輕震盪下培育板45分鐘，隨後用300 μl PBS/0.01%吐溫20洗滌7次。隨後添加100 μl TMB受質(Sigma T-4444)，4分鐘後，藉由添加2 N硫酸終止比色反應，且於405 nm吸收波長下讀取吸光度。
數據分析：繪製各測試樣品之滴定曲線(樣品稀釋度對吸光度)。接著採用達成1.0或0.5截止光密度(O.D.)值之血清稀釋度作為樣品效價(接著轉換成效價倒數)。
使用WAKO膽固醇E檢定套組(目錄號439-17501)根據製造商之說明書量測血漿及血清樣品之膽固醇含量。向96孔板之各孔中添加膽固醇標準物或測試血漿/血清樣品之稀釋液(4 μl體積)，且添加196 μl已製備之膽固醇試劑。在37℃下培育板5分鐘，且在30分鐘內在600 nm下讀取所顯顏色之吸光度。
用TR-FRET檢定(時差式螢光共振能量轉移檢定)，使用螢光團標記之LDLR細胞外域(LDLR-ECD)及全長野生型PCSK9蛋白測定小鼠血漿對LDLR及PCSK9結合之中斷。用銪(GE healthcare，目錄號PA99148)根據製造商之說明書(Eu:LDLR莫耳比為6:1)標記LDLR-ECD(R&D system，目錄號2148-LD/CF)。用生物素-XX-SSE(Pierce，目錄號21237)在生物素：PCSK9之莫耳比為8下對PCSK9進行生物素標記。在384孔黑色板(Corning，目錄號3676)中用5 nM LDLR-Eu+3、30 nM PCSK9-生物素及50 nM Alexa Fluor 647結合抗生蛋白鏈菌素(SA647，Invitrogen，目錄號S21374)在20 μl檢定緩衝液(20 mM Hepes(pH 7.0)、150 mM NaCl、0.1 mM CaCl2
及0.05%(w/v)BSA)中進行TR-FRET檢定。將小鼠血漿之連續稀釋液與PCSK9-生物素一起在加濕腔室中在室溫下預先培育30分鐘，接著與LDLR及抗生蛋白鏈菌素-SA647混合。再在加濕氛圍中在黑暗中在室溫下培育60分鐘後，在Perkin Elmer Victor 2板讀取器上使用50 μs延遲時間及400 μs窗讀取板。數據以(665 nm/615 nM)×1000之信號比形式報導。
結果：如圖2所示，用作免疫原之所有肽均能夠誘導對完整全長人類PCSK9蛋白之抗體反應，一些誘導之反應高於其他。如圖3所示，在所有情況下，此等反應均與小鼠PCSK9交叉反應。圖4顯示肽VR_9.5免疫亦使得血漿膽固醇含量降低，且圖5及6顯示VR_9.5及VR_9.6誘導可抑制PCSK9與LDL受體之間相互作用的血清抗體反應，使用螢光共振能量轉移(FRET)檢定。
LDL受體為多域蛋白質，其細胞外域由N端配位體結合域、三個EGF樣重複單元(其中一個為EGF-A)、β螺旋槳域及「O連接糖域」組成(Kwon等人，PNAS 105,1820-1825,2008)。PDB檔案3GCX詳述與LDL受體之單獨EGF-A域之可溶性形式複合的PCSK9之結構，因此吾人假設，PCSK9與LDL受體之間可能存在其他不明顯的相互作用，其不能藉由直接分析以PDB:3GCX表示之分子而推斷。此等區之實例詳述於圖7中，且尤其鑑別PCSK9中兩個可充當其他推定受體界面之序列(NAQDQPVTLGTL及INEAWFPEDQRVL，參見圖8)。
SIPWNLERIIP(SEQ ID No 332)(小鼠)
NAQDQPVTLGTL(SEQ ID No: 227)
INEAWFPEDQRVL(SEQ ID No: 263)
INMAWFPEDQQVL(SEQ ID No 360)(小鼠)
藉由使用可自公開資料庫獲得之鼠類PCSK9序列，亦可鑑別鼠類同源物(如表3中所示)。吾人亦假設，肽VR_9.5(實例1所述)內所含之胺基酸序列之一部分亦可與PDB:3BPS中不可見之LDL受體部分相互作用(圖8)。藉由改變胺基酸連接子及結合定向改進序列VR_9.5來探查此概念。吾人亦鑑別對應於VR_9.5之小鼠同源物之肽(肽VR_9.10)。藉由添加胺基酸來修飾由上述方法產生之肽序列系列以允許化學結合且作為疫苗候選物評估(肽詳述於表3中)。
加下劃線之殘基指示出於結合目的而添加之胺基酸。
肽VR_9.10至VR_9.16(以及VR_9.5以作比較)如實例2所述結合於Qβ VLP，且如實例3所述用於使小鼠免疫並評估對PCSK9之抗體反應，其中使用未結合VLP作為對照免疫原。如圖9及10中所示，在ELISA檢定中所有肽均誘導可識別完整全長小鼠PCSK9之抗體。
基於吾人關於膽固醇降低可藉由用表示人類PCSK9之成熟加工形式之N端的肽VR_9.5(SEQ ID No: 184)免疫來誘導之觀察，吾人假設，因為已知不成熟PCSK9之裂解前域保持與成熟PCSK9蛋白締合，所以此前域(SEQ ID No. 329)之區亦為降低膽固醇含量之候選抗體標靶。
MGTVSSRRSWWPLPLLLLLLLLLGPAGARAQEDEDGDYEELVLALRSEEDGLAEAPEHGTTATFHRCAKDPWRLPGTYVVVLKEETHLSQSERTARRLQAQAARRGYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDLLELALKLPHVDYIEEDSSVFAQ
(SEQ ID No: 329)
所需肽之特定非限制性實例可見於前域區之C端序列及表面暴露序列及環內，包括人類之含有已知之功能喪失或功能增加的遺傳突變的區：
VDYIEEDSSVFAQ
(SEQ ID No: 308)
RCAKDPWRLPGT
(SEQ ID No: 309)
AQAARRGYLTKIL
(SEQ ID No: 310)
GDYEELVLALRSEEDG
(SEQ ID No: 311)
FLVKMSGDLLELALKLP
(SEQ ID No: 312)
上述肽及其截短形式經合成為具有N端或C端添加之連接子(例如CGG或GGC)或合成為環化或其他構形受限制之分子，且如實例2所述偶合於Qβ VLP，且如實例3所述用於使小鼠免疫並評估對PCSK9之抗體反應。
肽VR_9.5及9.10如實例2所述結合於Qβ VLP或CRM197，且用於使用TiterMax Gold、明礬或明礬-CpG作為佐劑使小鼠(BALB/c或C57BL/6)免疫。B型肝炎病毒衍生之肽(胺基酸28-29(IPQSLDSWWTSL))結合於Qβ VLP或CRM197，且用作對照免疫原。
所用之ELISA方法與實例3中所揭示之方法略有不同：對於人類及小鼠PCSK9 ELISA，如下進行ELISA方法(方法2)：每孔用25 μL經1×PBS(pH 7.4)稀釋至1 μg/mL之人類或小鼠PCSK9蛋白儲備液塗佈384孔高結合檢定板(Greiner bio-one 781061)並在4℃下培育隔夜。第二天，每孔使用25 μL 1×PBS/0.05%吐溫20/1% BSA阻斷板，在室溫下在震盪器上培育1小時。以1:50或1:500稀釋度(1×PBS/0.05%吐溫20稀釋劑)開始製備各樣品之10點對數連續稀釋液，將每孔25 μL連續稀釋液一式兩份轉移至塗有人類或小鼠PCSK9之板中，接著在室溫下震盪培育1小時。用1×PBS(pH 7.4)/0.05%吐溫20洗滌3次後，每孔添加25 μL以1×PBS(pH 7.4)/0.05%吐溫20 1:3000稀釋之總IgG偵測抗體(山羊抗小鼠IgG(γ)，HRP，Invitrogen M30107)，接著於室溫下震盪培育1小時。用1×PBS(pH 7.4)/0.05%吐溫20洗滌5次後，每孔添加25 μL Bio-Rad TMB過氧化物酶EIA受質套組(Bio-Rad，目錄號172-1067)，且培育板15分鐘。每孔添加12.5 μL 1 N硫酸，接著在405 nm吸收波長下讀取吸光度。
結果：結合於Qβ VLP或CRM197之肽VR_9.5及9.10能夠誘導對完整全長人類及小鼠PCSK9蛋白之抗體反應(參見圖11及12)。圖13及14以及表4亦顯示肽VR_9.5及9.10結合於不同載體且在不同佐劑存在下會使血清膽固醇含量降低。
統計(a)
：單因子ANOVA統計比較，Tukey事後檢驗顯示測試組對未處理組之p值。
統計(b)
：單因子ANOVA統計比較，Tukey事後檢驗顯示測試組對匹配之對照肽-載體之p值。
自PCSK9之前域與催化域之C端區選擇其他肽(SEQ ID No 312、420、421、422、423、425、426、427、428、445、482、525及563)以用於表面暴露及與在人類中鑑別之功能增加或功能喪失突變締合。藉由添加胺基酸來修飾由上述方法所產生之肽序列系列以允許化學結合且作為疫苗候選物評估(表5肽9.23-9.35)。
加下劃線之殘基指示出於結合目的而添加之胺基酸。
肽VR_9.17至VR_9.35(以及VR_9.5)如實例2所述結合於Qβ VLP，且如實例3所述用於使小鼠免疫以評估對PCSK9之抗體反應。B型肝炎病毒衍生之肽(胺基酸28-29(IPQSLDSWWTSL))結合於Qβ VLP，且用作對照免疫原。ELISA使用第2種方法。
結果：如圖15及16中所示，大部分結合於Qβ VLP之肽能夠誘導對完整全長PCSK9之抗體反應。關於肽9.31及9.32未偵測到抗體反應。在某些狀況下(肽9.23、9.24、9.27、9.28、9.29、9.30、9.33及9.34)，抗體反應具有物種特異性。用肽9.5、9.18及9.29免疫亦使得血清膽固醇降低，而用肽9.17、9.19、9.30、9.31及9.32免疫產生降低膽固醇之趨勢(表6，圖17)。
統計(a)
：單因子ANOVA統計比較，Bonferroni事後檢驗顯示測試組對未處理組之p值。
統計(b)
：單因子ANOVA統計比較，Bonferroni事後檢驗顯示測試組對對照肽組之p值。
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<400> 607
圖1：結合於LDL-R之EGF-A域之人類PCSK9的PDB結構(3BPS)，顯示PCSK9中之5個肽序列(肽1-5)選擇為與此兩個蛋白質之間的相互作用有關。
圖2：使用明礬+CpG作為佐劑用結合於VLP之肽VR_9.1至VR_9.9使小鼠免疫，且藉由在ELISA檢定中滴定血清來量測對全長重組人類PCSK9之抗體反應。結果以每組6隻小鼠各自之效價倒數來顯示，其中效價倒數以得到0.5之光密度讀數時血清之稀釋度來量測。
圖3：如圖2所述之對全長重組小鼠PCSK9蛋白的抗體反應。
圖4：接種疫苗之小鼠之血清(與圖2及3之抗體檢定中所用之樣品相同)中量測到之血漿膽固醇含量。
圖5：如FRET檢定所量測，測試圖2至4中所用之血漿樣品在不同稀釋度下抑制重組PCSK9與LDL受體之細胞外域之間的相互作用的能力。
圖6：FRET檢定中肽VR_9.5及VR_9.6接種疫苗之血漿樣品的稀釋度，顯示對PCSK9與LDL受體之間的相互作用的劑量-反應性抑制。
圖7：PDB:3BPS之PCSK9(帶狀模型)與EGF-A(空間填滿模型)之複合物。橢圓指示PCSK9中可與LDLR之除EGF-A以外之域相互作用的可能區。
圖8：PCSK9(帶狀模型)與EGF-A(空間填滿模型)之複合物，其中顯示對應於肽VR_13/14(A)及VR_15/16(B)及VR_9.5(C)之胺基酸。
圖9及10：用肽VR_9.5及VR_9.10至VR_9.16接種疫苗之小鼠的血漿抗體反應。藉由對連續血漿稀釋液之ELISA檢定，使用全長小鼠PCSK9蛋白量測針對小鼠PCSK9之抗體。顯示每組8隻小鼠之個別滴定曲線，其中用未結合VLP免疫之小鼠血漿的ELISA反應顯示作為對照。
圖11：用結合於VLP的肽VR_9.5或VR_9.10(使用明礬+/-CpG作為佐劑)或CRM197(使用TiterMax作為佐劑)接種疫苗之BALB/c及C57BL/6小鼠中誘導之對全長人類PCSK9蛋白的血清抗體反應。藉由在ELISA檢定中滴定血清來量測針對人類PCSK9之抗體。結果以針對每組8隻小鼠各自測定的在1.0光密度下的log(效價倒數)來顯示。
圖12：在如圖11所述接種疫苗之BALB/c及C57BL/6小鼠中誘導之對全長小鼠PCSK9蛋白的血清抗體反應。結果以針對每組8隻小鼠各自測定的在0.5光密度下的log(效價倒數)來顯示。
圖13：在BALB/c接種疫苗之小鼠血清樣品(與圖11及12之抗體檢定中所用之樣品相同)中量測到之總膽固醇含量。
圖14：在C57BL/6接種疫苗之小鼠血清樣品(與圖11及12之抗體檢定中所用之樣品相同)中量測到之總膽固醇含量。
圖15：使用明礬+CpG作為佐劑，用結合於VLP的肽VR_9.5或VR_9.17至VR_9.35免疫之BALB/c小鼠中誘導之對全長人類PCSK9的抗體反應。藉由在ELISA檢定中滴定血清來量測針對人類PCSK9之抗體。結果以針對每組8隻小鼠各自測定的在1.0光密度下的log(效價倒數)來顯示。
圖16：如圖15所述免疫之BALB/c小鼠中誘導之對全長小鼠PCSK9的抗體反應。藉由在ELISA檢定中滴定血清來量測針對小鼠PCSK9之抗體。結果以針對每組8隻小鼠各自測定的在0.5光密度下的log(效價倒數)來顯示。
圖17：在BALB/c接種疫苗之小鼠血清樣品(與圖15及16之抗體檢定中所用之樣品相同)中量測到之總膽固醇含量。
圖18：PCSK9(帶狀模型)與EGF-A(空間填滿模型)之複合物，其中橢圓指示PCSK9中含有連接於功能增加或喪失突變之胺基酸序列的區及/或蛋白質表面暴露之抗原決定基。
圖19：偶合於載體且經由連接子連接於多價模板之抗原性PCSK9肽。
(無元件符號說明)
Claims (43)
- 一種免疫原，其包含至少一種抗原性PCSK9肽或其功能活性變異體連接於疫原性載體，其中該抗原性PCSK9肽係選自由以下組成之群：SEQ ID No 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、 210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、 464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587及588。
- 如請求項1之免疫原，其中該免疫原性載體係選自白喉毒素、CRM197或選自HBcAg、HBsAg、Qβ、PP7、PPV或諾沃克病毒(Norwalk Virus)VLP之VLP。
- 如請求項1之免疫原，其中該免疫原性載體係選自CRM197或Qβ VLP。
- 如請求項1之免疫原，其中該抗原性PCSK9肽係選自由以下組成之群：SEQ ID No 182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、 214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225及226。
- 如請求項1之免疫原，其中該抗原性PCSK9肽係選自由以下組成之群：SEQ ID No 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、 212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358及359。
- 如請求項1之免疫原，其中該抗原性PCSK9肽係選自由以下組成之群：SEQ ID No 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44及45。
- 如請求項1之免疫原，其中該抗原性PCSK9肽係選自由以下組成之群：SEQ ID No 46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100及101。
- 如請求項1之免疫原，其中該抗原性PCSK9肽係選自由以下組成之群：SEQ ID No 102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145及146。
- 如請求項1之免疫原，其中該抗原性PCSK9肽係選自由以下組成之群：SEQ ID No 147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180及181。
- 如請求項1之免疫原，其中該抗原性PCSK9肽係選自由以下組成之群：SEQ ID No 330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358及359。
- 如請求項1之免疫原，其中該抗原性PCSK9肽係選自由以下組成之群：SEQ ID No 19、56、63、109、153、165、184、186、187、188、332及424。
- 如請求項1之免疫原，其中該抗原性PCSK9肽係選自由以下組成之群：SEQ ID No 184、186、187、188及332。
- 如請求項1至3中任一項之免疫原，其中該抗原性PCSK9肽為SEQ ID No 56。
- 如請求項1之免疫原，其中該抗原性PCSK9肽係選自由以下組成之群：SEQ ID No 308、309、310、311、312、421至424及426至588。
- 如請求項1之免疫原，其中該抗原性PCSK9肽係選自由以下組成之群：SEQ ID 445、482、525及563。
- 如請求項1之免疫原，其中該抗原性PCSK9肽係選自由以 下組成之群：SEQ ID 420及425。
- 如請求項1及4至16中任一項之免疫原，其中該抗原性PCSK9肽另外包含：位於其C端之連接子，具有式(G)n C、(G)n SC或(G)n K，其中n為選自由0、1、2、3、4、5、6、7、8、9及10組成之群的整數，位於其N端之連接子，具有式C(G)n 、CS(G)n 或K(G)n ，其中n為選自由0、1、2、3、4、5、6、7、8、9及10組成之群的整數，位於其C端之連接子，具有式(G)n C、(G)n SC或(G)n K，其中n為選自由0、1、2、3、4、5、6、7、8、9及10組成之群的整數，及位於其N端之連接子，具有式C(G)n 、CS(G)n 或K(G)n ，其中n為選自由0、1、2、3、4、5、6、7、8、9及10組成之群的整數。
- 如請求項1及4至16中任一項之免疫原，其中該抗原性PCSK9肽另外包含：位於其C端之連接子，具有式(G)n C、(G)n SC或(G)n K，其中n為選自由0、1或2組成之群的整數，位於其N端之連接子，具有式C(G)n 、CS(G)n 或K(G)n ，其中n為選自由0、1或2組成之群的整數，位於其C端之連接子，具有式(G)n C、(G)n SC或(G)n K，其中n為選自由0、1或2組成之群的整數，及位於其N端之連接子，具有式C(G)n 、CS(G)n 或K(G)n ，其中n為選自由0、1或2組成之群的整數。
- 如請求項1及4至16中任一項之免疫原，其中該抗原性PCSK9肽另外包含位於其C端之半胱胺酸。
- 如請求項19之免疫原，其中該抗原性PCSK9肽另外包含位於其N端之CG基團或半胱胺酸。
- 如請求項1及4至16中任一項之免疫原，其中該抗原性PCSK9肽另外包含位於其N端之CGG。
- 如請求項1及4至16中任一項之免疫原，其中該抗原性PCSK9肽另外包含位於其C端之GGC。
- 如請求項1及4至16中任一項之免疫原，其中該抗原性PCSK9肽經環化且包含半胱胺酸、(G)n C或C(G)n 片段，其中n為選自由0、1、2、3、4、5、6、7、8、9及10組成之群的整數。
- 如請求項1及4至16中任一項之免疫原，其中該抗原性PCSK9肽經環化且包含半胱胺酸、GC或CG片段。
- 如請求項1及4至16中任一項之免疫原，其中該抗原性PCSK9肽另外包含位於其N端之KG或KGG。
- 如請求項1至3中任一項之免疫原，其中該抗原性PCSK9肽之構形受限制。
- 如請求項1及4至16中任一項之免疫原，其中該免疫原在投與個體時能夠使該個體血液中之LDL膽固醇含量降低至少5%。
- 如請求項27之免疫原，其中該免疫原在投與個體時能夠使該個體血液中之LDL膽固醇含量降低至少10%。
- 如請求項1及4至16中任一項之免疫原，其用作藥劑。
- 如請求項1及4至16中任一項之免疫原，其用於預防、減輕或治療PCSK9相關病症。
- 如請求項30之免疫原，其中該PCSK9相關病症為高LDL-膽固醇或與高LDL-膽固醇相關之病狀。
- 如請求項30之免疫原，其中該PCSK9相關病症係選自脂質病症，諸如高脂血症，第I型、第II型、第III型、第IV型或第V型高脂血症、繼發性高甘油三酸酯血症、高膽固醇血症、家族性高膽固醇血症、黃瘤病、膽固醇乙醯基轉移酶缺乏；動脈硬化病狀、冠狀動脈疾病及心血管疾病。
- 如請求項1或4至16中任一項之免疫原，其用於預防、減輕或治療阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)。
- 一種組合物，其包含至少兩種如請求項1至28中任一項之免疫原。
- 一種免疫原性組合物，其包含如請求項1至27中任一項之免疫原或如請求項34之免疫原組合物，其另外包含至少一種佐劑。
- 如請求項35之免疫原性組合物，其中該佐劑係選自明礬、CpG ODN、QS21及Iscomatrix。
- 如請求項35之免疫原性組合物，其中該佐劑係選自QS21、明礬與CpG ODN組合、或Iscomatrix與CpG ODN組合。
- 如請求項35之免疫原性組合物，其中該佐劑係選自明礬與CpG ODN組合。
- 如請求項37之免疫原性組合物，其中該CpG ODN係選自5' TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT 3'，或5' TCGTCGTTTTTCGGTCGTTTT 3'，或5' TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 3'。
- 一種醫藥組合物，其包含如請求項1及4至16中任一項之免疫原及醫藥學上可接受之賦形劑。
- 一種核酸，其編碼如請求項1至28中任一項之免疫原。
- 一種表現載體，其包含如請求項41之核酸。
- 一種宿主細胞，其包含如請求項42之表現載體。
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| TW200906439A (en) * | 2007-04-13 | 2009-02-16 | Novartis Ag | Molecules and methods for modulating proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) |
| TW200916481A (en) * | 2007-08-23 | 2009-04-16 | Amgen Inc | Antigen binding proteins to proprotein convertase subtilisin kexin type 9 (PCSK9) |
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