KR101512053B1 - Pcsk9 백신 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 PCSK9-매개 장애의 예방, 치료 또는 완화를 위한, 면역원성 담체에 연결된 항원성 PCSK9 펩티드를 포함하는 신규한 면역원의 제공에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 이들 약제, 그의 면역원성 조성물 및 제약 조성물의 생산 방법, 및 그의 의약에서의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 PCSK9-관련 장애의 예방, 치료 또는 완화를 위한, 바람직하게는 면역원성 담체에 연결된 항원성 PCSK9 펩티드를 포함하는 신규한 면역원의 제공에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 이들 약제, 그의 면역원성 조성물 및 제약 조성물의 생산 방법, 및 그의 의약에서의 용도에 관한 것이다.
신경 아폽토시스-조절 전환효소 1 ("NARC-1")로도 알려진 전구단백질 전환효소 서브틸리신-켁신 타입 9 (이하에서 "PCSK9"로 칭함)는 포유동물 PCSK 패밀리의 9번째 구성원으로서 확인된 프로테이나제 K-유사 서브틸라제이다 (문헌 [Seidah et al., 2003 PNAS 100:928-933] 참조). PCSK9에 대한 유전자는 인간 염색체 1p33-p34.3에 위치한다. PCSK9는 예를 들어 간세포, 신장 중간엽 세포, 회장, 및 결장 상피뿐만 아니라 배아 뇌 종뇌 뉴런을 비롯한, 증식 및 분화를 할 수 있는 세포에서 발현된다.
PCSK9는 본래 그의 기능성을 활성화하기 위해 소포체 ("ER")에서 자가촉매성 분자내 처리를 겪는 ~72 kDa의 불활성 효소 전구체, 즉 자이모겐의 형태로 합성된다. 692개 아미노산의 단백질을 코딩하는 12개 엑손을 갖는 ~22 kb 길이의 인간 PCSK9에 대한 유전자 서열은 예를 들어 기탁 번호 NP_777596.2에서 발견될 수 있다. 인간, 마우스 및 래트 PCSK9 핵산 서열이 기탁되어 있고; 예를 들어, 각각 젠뱅크 (GenBank) 기탁 번호 AX127530 (또한, AX207686), AX207688 및 AX207690을 참조한다.
인간 PCSK9는 신장, 간 및 장에서 주로 발현되는 분비형 단백질이다. 이것은 다음과 같은 3개의 도메인을 갖는다: 억제성 프로-도메인 (pro-domain) (아미노산 1-152; 아미노산 1-30의 신호 서열 포함), 촉매 도메인 (아미노산 153-448), 및 시스테인 잔기가 풍부한 C-말단 도메인 (210개 잔기 길이) (아미노산 449-692). PCSK9는 소포체에서 프로-도메인과 촉매 도메인 사이에서 자가촉매성 절단을 겪는 자이모겐으로서 합성된다. 프로-도메인은 절단 후에 성숙 단백질에 결합된 상태로 유지되고, 복합체가 분비된다. 시스테인-풍부 도메인은 활성화된 프로테아제의 폴딩 (folding) 및 조절에 필수적인 것으로 보이는 다른 푸린/켁신/서브틸리신-유사 세린 프로테아제의 P-(처리) 도메인에 유사한 역할을 수행할 수 있다. PCSK9의 돌연변이는 저밀도 지단백질 콜레스테롤 (LDL-c)의 비정상적인 수준과 연관된다 (Horton et al., 2006 Trends. Biochem. Sci. 32(2):71-77). PCSK9는 간 및 뉴런 세포의 분화에서 역할을 수행하고 (Seidah et al., 상기 문헌), 배아 간에서 고도로 발현되고, 콜레스테롤 항상성에 크게 관련된다. 심혈관 질환의 치료에 효과적인 화합물 및/또는 물질의 확인이 매우 바람직하다. LDL 콜레스테롤 수준의 감소는 관상동맥 사건의 비율에 직접 관련되는 것으로 임상 시험에서 이미 입증되었다 (Law et al., 2003 BMJ 326: 1423-1427). 보다 최근에, 혈장 LDL 콜레스테롤 수준의 일생 동안의 중등도 감소는 관상동맥 사건 발생율의 실질적인 감소와 실질적으로 밀접하게 관련되는 것으로 밝혀졌다 (Cohen et al., 상기 문헌). 이것은 심지어 비지질 관련 심혈관 위험 인자의 높은 유병률을 갖는 집단에서도 적용되는 것으로 밝혀졌다 (상기 문헌).
따라서, LDL 콜레스테롤 수준을 억제할 수 있는 치료제의 확인이 매우 중요하다.
따라서, PCSK9의 활성 및 PCSK9가 다양한 치료 상태에서 수행하는 대응하는 역할을 억제하거나 길항하는 의약을 생산하는 것이 매우 중요할 것이다.
PCSK9의 발현 또는 상향조절은 LDL 콜레스테롤의 증가된 혈장 수준과 연관되고, PCSK9 발현의 억제 또는 결여는 낮은 LDL 콜레스테롤 혈장 수준과 연관된다. 유의하게, PCSK9의 서열 변이와 연관되는 보다 낮은 LDL 콜레스테롤 수준은 관상동맥 심장 질환에 대한 보호를 제시한다 (Cohen, 2006 N. Engl. J. Med. 354: 1264-1272).
발명의 개요
본 발명은 항원성 PCSK9 펩티드 및 임의로 면역원성 담체를 포함하는 면역원에 관한 것이다.
본 발명은 또한 면역원성 담체에 임의로 연결된 상기 항원성 PCSK9 펩티드를 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 임의로 하나 또는 수개의 아주반트, 바람직하게는 하나 또는 두개의 아주반트를 포함하는, 면역원성 담체에 임의로 연결된 상기 항원성 PCSK9 펩티드를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명에 따른 항원성 PCSK9 펩티드, 또는 그의 면역원성 조성물을 포함하는 제약 조성물, 및 상기 조성물의 의료 용도에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 바람직하게는 PCSK9-관련 장애의 치료, 완화 또는 예방에서 의약으로서 사용하기 위한, 본 발명의 항원성 PCSK9 펩티드, 또는 그의 면역원성 또는 제약 조성물에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 바람직하게는 콜레스테롤의 수준 상승과 연관된 질환의 치료, 완화 또는 예방에서 의약으로서 사용하기 위한, 본 발명의 항원성 PCSK9 펩티드, 또는 그의 면역원성 또는 제약 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 항원성 PCSK9 펩티드는 상승한 LDL-콜레스테롤 또는 상승한 LDL-콜레스테롤과 연관된 상태, 예를 들어 지질 장애 (예를 들어, 고지혈증, I형, II형, III형, IV형 또는 V형 고지혈증, 2차성 고트리글리세리드 혈증, 고콜레스테롤 혈증, 가족성 고콜레스테롤 혈증, 황색종증, 콜레스테롤 아세틸트랜스퍼라제 결핍)를 갖거나 가질 위험이 있는 인간 환자의 치료에 특히 적합하다. 본 발명의 항원성 PCSK9 펩티드는 또한 동맥경화성 상태 (예를 들어, 아테롬성동맥경화증), 관상 동맥 질환, 심혈관 질환을 갖는 인간 환자, 및 예를 들어 하나 이상의 위험 인자 (예를 들어, 고혈압, 흡연, 당뇨병, 비만, 또는 고호모시스테인 혈증)의 존재에 의해 상기 장애의 위험이 있는 환자의 치료에 적합하다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 알츠하이머 (Alzheimer) 병의 치료를 위한 의약의 제조에서 본 발명의 항원성 PCSK9 펩티드 또는 그의 면역원성 조성물 또는 제약 조성물의 용도를 제공한다.
한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드 또는 그의 면역원성 조성물 또는 제약 조성물은 또 다른 물질과 함께 투여된다.
도 1: 두 단백질 사이의 상호작용에 관여하는 것으로서 선택된 PCSK9 내의 5개의 펩티드 서열 (펩티드 1-5)을 보여주는, LDL-R (3BPS)의 EGF-A 도메인에 결합된 인간 PCSK9의 PDB 구조.
도 2: 마우스를 아주반트로서 백반 + CpG를 사용하여, VLP에 접합된 펩티드 VR_9.1 내지 VR_9.9로 면역화하고, 전장 재조합 인간 PCSK9에 대한 항체 반응을 ELISA 분석에서 혈청을 적정함으로써 측정하였다. 그 결과를 군 당 6마리의 마우스 각각에 대한 역가의 역수 (reciprocal titer)로서 제시하고, 여기서 역가의 역수는 0.5의 광학 밀도 판독치를 제시하는 혈청의 희석률로서 측정된다.
도 3: 도 2에서 설명된 전장 재조합 마우스 PCSK9 단백질에 대한 항체 반응.
도 4: 백신접종된 마우스의 혈청 (도 2 및 3에서 항체 분석을 위해 사용된 것과 동일한 샘플)에서 측정된 혈장 콜레스테롤 수준.
도 5: 도 2 내지 4에 사용된 혈장 샘플을 FRET 분석에 의해 측정된, 재조합 PCSK9와 LDL 수용체의 세포외 도메인 사이의 상호작용을 억제하는 능력에 대해 상이한 희석액에서 시험하였다.
도 6: PCSK9와 LDL 수용체 사이의 상호작용의 용량 반응성 억제를 보여주는, FRET 분석에서 펩티드 VR_9.5 및 VR_9.6 백신접종시의 혈장 샘플의 희석액.
도 7: PDB:3BPS로부터의 PCSK9 (리본) 및 EGF-A (스페이스 필 (space fill))의 복합체. EGF-A 이외의 다른 LDLR의 도메인과 상호작용할 수 있는 PCSK9의 잠재적인 영역은 타원으로 표시된다.
도 8: 아미노산이 펩티드 VR_13/14 (A) 및 VR_15/16 (B) 및 VR_9.5 (C)에 대응하는, PCSK9 (리본) 및 EGF-A (스페이스 필)의 복합체가 제시된다.
도 9 및 10: 펩티드 VR_9.5 및 VR_9.10 내지 VR_9.16으로 백신접종된 마우스의 혈장 항체 반응. 마우스 PCSK9에 대한 항체는 전장 마우스 PCSK9 단백질을 사용하여 연속 혈장 희석액의 ELISA 분석에 의해 측정하였다. 개별적인 적정 곡선을 군 당 8마리의 마우스에 대해 제시하고, 비접합된 VLP로 면역화된 마우스로부터의 혈장의 ELISA 반응을 대조군으로 제시한다.
도 11: VLP에 접합된 펩티드 VR_9.5 또는 VR_9.10 (아주반트로서 백반 +/- CpG 사용) 또는 CRM197 (아주반트로서 타이터맥스 (TiterMax) 사용)로 백신접종된 BALB/c 및 C57BL/6 마우스에서 유도된 전장 인간 PCSK9 단백질에 대한 혈청 항체 반응. 인간 PCSK9에 대한 항체는 ELISA 분석에서 혈청을 적정함으로써 측정하였다. 그 결과를 군 당 8마리의 마우스 각각에 대해 1.0의 광학 밀도에서 결정된 log 역가의 역수로서 제시한다.
도 12: 도 11에서 설명된 바와 같이 백신접종된 BALB/c 및 C57BL/6 마우스에서 유도된 전장 마우스 PCSK9 단백질에 대한 혈청 항체 반응. 그 결과를 군 당 8마리의 마우스 각각에 대해 0.5의 광학 밀도에서 결정된 log 역가의 역수로서 제시한다.
도 13: BALB/c 백신접종된 마우스로부터의 혈청 샘플 (도 11 및 12에서 항체 분석을 위해 사용된 동일한 샘플)에서 측정된 총 콜레스테롤 수준.
도 14: C57BL/6 백신접종된 마우스로부터의 혈청 샘플 (도 11 및 12에서 항체 분석을 위해 사용된 동일한 샘플)에서 측정된 총 콜레스테롤 수준.
도 15: 아주반트로서 백반 + CpG를 사용하여 VLP에 접합된 펩티드 VR_9.5 또는 VR_9.17 내지 VR_9.35로 면역화된 BALB/c 마우스에서 유도된 전장 인간 PCSK9에 대한 항체 반응. 인간 PCSK9에 대한 항체는 ELISA 분석에서 혈청을 적정함으로써 측정하였다. 그 결과를 군 당 8마리의 마우스 각각에 대해 1.0의 광학 밀도에서 결정된 log 역가의 역수로서 제시한다.
도 16: 도 15에서 설명된 바와 같이 면역화된 BALB/c 마우스에서 유도된 전장 마우스 PCSK9에 대한 항체 반응. 마우스 PCSK9에 대한 항체는 ELISA 분석에서 혈청을 적정함으로써 측정하였다. 그 결과를 군 당 8마리의 마우스 각각에 대해 0.5의 광학 밀도에서 결정된 log 역가의 역수로서 제시한다.
도 17: BALB/c 백신접종된 마우스로부터의 혈청 샘플 (도 15 및 16에서 항체 분석을 위해 사용된 동일한 샘플)에서 측정된 총 콜레스테롤 수준.
도 18: PCSK9 (리본) 및 EGF-A (스페이스 필)의 복합체, 여기서 기능 획득 또는 상실 돌연변이에 연결된 아미노산 서열 및/또는 단백질 표면 노출 에피토프를 함유하는 PCSK9의 영역은 타원으로 표시함.
도 2: 마우스를 아주반트로서 백반 + CpG를 사용하여, VLP에 접합된 펩티드 VR_9.1 내지 VR_9.9로 면역화하고, 전장 재조합 인간 PCSK9에 대한 항체 반응을 ELISA 분석에서 혈청을 적정함으로써 측정하였다. 그 결과를 군 당 6마리의 마우스 각각에 대한 역가의 역수 (reciprocal titer)로서 제시하고, 여기서 역가의 역수는 0.5의 광학 밀도 판독치를 제시하는 혈청의 희석률로서 측정된다.
도 3: 도 2에서 설명된 전장 재조합 마우스 PCSK9 단백질에 대한 항체 반응.
도 4: 백신접종된 마우스의 혈청 (도 2 및 3에서 항체 분석을 위해 사용된 것과 동일한 샘플)에서 측정된 혈장 콜레스테롤 수준.
도 5: 도 2 내지 4에 사용된 혈장 샘플을 FRET 분석에 의해 측정된, 재조합 PCSK9와 LDL 수용체의 세포외 도메인 사이의 상호작용을 억제하는 능력에 대해 상이한 희석액에서 시험하였다.
도 6: PCSK9와 LDL 수용체 사이의 상호작용의 용량 반응성 억제를 보여주는, FRET 분석에서 펩티드 VR_9.5 및 VR_9.6 백신접종시의 혈장 샘플의 희석액.
도 7: PDB:3BPS로부터의 PCSK9 (리본) 및 EGF-A (스페이스 필 (space fill))의 복합체. EGF-A 이외의 다른 LDLR의 도메인과 상호작용할 수 있는 PCSK9의 잠재적인 영역은 타원으로 표시된다.
도 8: 아미노산이 펩티드 VR_13/14 (A) 및 VR_15/16 (B) 및 VR_9.5 (C)에 대응하는, PCSK9 (리본) 및 EGF-A (스페이스 필)의 복합체가 제시된다.
도 9 및 10: 펩티드 VR_9.5 및 VR_9.10 내지 VR_9.16으로 백신접종된 마우스의 혈장 항체 반응. 마우스 PCSK9에 대한 항체는 전장 마우스 PCSK9 단백질을 사용하여 연속 혈장 희석액의 ELISA 분석에 의해 측정하였다. 개별적인 적정 곡선을 군 당 8마리의 마우스에 대해 제시하고, 비접합된 VLP로 면역화된 마우스로부터의 혈장의 ELISA 반응을 대조군으로 제시한다.
도 11: VLP에 접합된 펩티드 VR_9.5 또는 VR_9.10 (아주반트로서 백반 +/- CpG 사용) 또는 CRM197 (아주반트로서 타이터맥스 (TiterMax) 사용)로 백신접종된 BALB/c 및 C57BL/6 마우스에서 유도된 전장 인간 PCSK9 단백질에 대한 혈청 항체 반응. 인간 PCSK9에 대한 항체는 ELISA 분석에서 혈청을 적정함으로써 측정하였다. 그 결과를 군 당 8마리의 마우스 각각에 대해 1.0의 광학 밀도에서 결정된 log 역가의 역수로서 제시한다.
도 12: 도 11에서 설명된 바와 같이 백신접종된 BALB/c 및 C57BL/6 마우스에서 유도된 전장 마우스 PCSK9 단백질에 대한 혈청 항체 반응. 그 결과를 군 당 8마리의 마우스 각각에 대해 0.5의 광학 밀도에서 결정된 log 역가의 역수로서 제시한다.
도 13: BALB/c 백신접종된 마우스로부터의 혈청 샘플 (도 11 및 12에서 항체 분석을 위해 사용된 동일한 샘플)에서 측정된 총 콜레스테롤 수준.
도 14: C57BL/6 백신접종된 마우스로부터의 혈청 샘플 (도 11 및 12에서 항체 분석을 위해 사용된 동일한 샘플)에서 측정된 총 콜레스테롤 수준.
도 15: 아주반트로서 백반 + CpG를 사용하여 VLP에 접합된 펩티드 VR_9.5 또는 VR_9.17 내지 VR_9.35로 면역화된 BALB/c 마우스에서 유도된 전장 인간 PCSK9에 대한 항체 반응. 인간 PCSK9에 대한 항체는 ELISA 분석에서 혈청을 적정함으로써 측정하였다. 그 결과를 군 당 8마리의 마우스 각각에 대해 1.0의 광학 밀도에서 결정된 log 역가의 역수로서 제시한다.
도 16: 도 15에서 설명된 바와 같이 면역화된 BALB/c 마우스에서 유도된 전장 마우스 PCSK9에 대한 항체 반응. 마우스 PCSK9에 대한 항체는 ELISA 분석에서 혈청을 적정함으로써 측정하였다. 그 결과를 군 당 8마리의 마우스 각각에 대해 0.5의 광학 밀도에서 결정된 log 역가의 역수로서 제시한다.
도 17: BALB/c 백신접종된 마우스로부터의 혈청 샘플 (도 15 및 16에서 항체 분석을 위해 사용된 동일한 샘플)에서 측정된 총 콜레스테롤 수준.
도 18: PCSK9 (리본) 및 EGF-A (스페이스 필)의 복합체, 여기서 기능 획득 또는 상실 돌연변이에 연결된 아미노산 서열 및/또는 단백질 표면 노출 에피토프를 함유하는 PCSK9의 영역은 타원으로 표시함.
<발명의 상세한 설명>
본 발명의 항원성
PCSK9
펩티드
본 발명은 면역원성 담체에 임의로 연결된 항원성 PCSK9 펩티드를 포함하는 면역원에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 4 내지 20개의 아미노산을 포함하는 PCSK9의 일부분이고, 대상체에게 투여될 때, 상기 대상체의 혈액 내의 LDL-콜레스테롤 수준을 저하시킬 수 있다. 바람직하게는, 상기 대상체는 포유동물, 바람직하게는 인간이다. 바람직하게는, 상기 항원성 PCSK9 펩티드는 LDL-콜레스테롤 수준을 적어도 2%, 5%, 10%, 20%, 30% 또는 50% 저하시킬 수 있다.
한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 PCSK9와 LDL 수용체의 상호작용에 참여하는 PCSK9의 일부분이다.
한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 4 내지 20개의 아미노산을 포함하는, PCSK9와 LDL 수용체의 상호작용에 참여하는 PCSK9의 일부분이고, 대상체에게 투여될 때 상기 대상체의 혈액 내의 LDL-콜레스테롤 수준을 저하시킬 수 있다. 바람직하게는, 상기 대상체는 포유동물, 바람직하게는 인간이다. 바람직하게는, 상기 항원성 PCSK9 펩티드는 LDL-콜레스테롤 수준을 적어도 2%, 5%, 10%, 20%, 30% 또는 50% 저하시킬 수 있다.
한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 서열 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542, 543, 544, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587 및 588로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 서열 1 내지 312, 330 내지 398, 421, 423, 424, 426 및 428 내지 588로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 서열 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397 및 398로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 LDL 수용체의 도메인 EGF-A와의 상호작용에 참여할 수 있는 PCSK9의 일부분이다. 상기 일부분의 예는 도 1에 제시된다.
한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 4 내지 20개의 아미노산을 포함하는, LDL 수용체의 도메인 EGF-A와의 상호작용에 참여할 수 있는 PCSK9의 일부분이고, 대상체에게 투여될 때, 상기 대상체의 혈액 내의 LDL-콜레스테롤 수준을 저하시킬 수 있다. 바람직하게는, 상기 대상체는 포유동물, 바람직하게는 인간이다. 바람직하게는, 상기 항원성 PCSK9 펩티드는 LDL-콜레스테롤 수준을 적어도 2%, 5%, 10%, 20%, 30% 또는 50% 저하시킬 수 있다.
한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 서열 1의 PCSK9 단편의 5 내지 13, 바람직하게는 6 내지 8개의 연속적인 아미노산을 포함하는 펩티드이다.
한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 서열 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 및 45로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 서열 46의 PCSK9 단편의 5 내지 15, 바람직하게는 6 내지 8개의 연속적인 아미노산을 포함하는 펩티드이다.
한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 서열 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 및 101로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 서열 102의 PCSK9 단편의 5 내지 14, 바람직하게는 6 내지 8개의 연속적인 아미노산을 포함하는 펩티드이다.
한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 서열 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145 및 146으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 서열 147의 PCSK9 단편의 5 내지 13, 바람직하게는 6 내지 8개의 연속적인 아미노산을 포함하는 펩티드이다.
한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 서열 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180 및 181로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 서열 182의 PCSK9 단편의 5 내지 13, 바람직하게는 6 내지 8개의 연속적인 아미노산을 포함하는 펩티드이다.
한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 서열 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225 및 226으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 서열 330의 PCSK9 단편의 5 내지 13, 바람직하게는 6 내지 8개의 연속적인 아미노산을 포함하는 펩티드이다.
한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 서열 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358 및 359로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
바람직한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 서열 19, 56, 63, 109, 153, 165, 184, 186, 187, 188, 332 및 424로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
바람직한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 서열 19, 56, 63, 109, 153 및 184로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
바람직한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 서열 56, 184, 186, 187, 188 및 332로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
가장 바람직한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 서열 56의 서열을 갖는 펩티드이다. 보다 바람직한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 서열 184 또는 187의 서열을 갖는 펩티드이다.
가장 바람직한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 서열 184의 서열을 갖는 펩티드이다. 가장 바람직한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 서열 332의 서열을 갖는 펩티드이다.
한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 EGF-A 도메인 이외의 다른 LDL 수용체의 영역과의 상호작용에 참여할 수 있는 PCSK9의 영역 내에서 선택된다. 그러한 일부분의 예를 도 7 및 8에 제시한다.
한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 4 내지 20개의 아미노산을 포함하는, EGF-A 도메인 이외의 다른 LDL 수용체의 영역과의 상호작용에 참여할 수 있는 PCSK9의 일부분이고, 대상체에게 투여될 때, 상기 대상체의 혈액 내의 LDL-콜레스테롤 수준을 저하시킬 수 있다. 바람직하게는, 상기 대상체는 포유동물, 바람직하게는 인간이다. 바람직하게는, 상기 항원성 PCSK9 펩티드는 LDL-콜레스테롤 수준을 적어도 2%, 5%, 10%, 20%, 30% 또는 50% 저하시킬 수 있다.
한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 서열 227의 PCSK9 단편의 5 내지 12, 바람직하게는 6 내지 8개의 연속적인 아미노산을 포함하는 펩티드이다.
한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 서열 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261 및 262로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 서열 263의 PCSK9 단편의 5 내지 13, 바람직하게는 6 내지 8개의 연속적인 아미노산을 포함하는 펩티드이다.
한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 서열 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306 및 307로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 서열 360의 PCSK9 단편의 5 내지 13, 바람직하게는 6 내지 8개의 연속적인 아미노산을 포함하는 펩티드이다.
한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 서열 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397 및 398로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 PCSK9 프로-도메인 (서열 329)의 영역에서 선택된다.
한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 4 내지 20개의 아미노산을 포함하는 PCSK9 프로-도메인의 일부이고, 대상체에게 투여될 때, 상기 대상체의 혈액 내의 LDL-콜레스테롤 수준을 저하시킬 수 있다. 바람직하게는, 상기 대상체는 포유동물, 바람직하게는 인간이다. 바람직하게는, 상기 항원성 PCSK9 펩티드는 LDL-콜레스테롤 수준을 적어도 2%, 5%, 10%, 20%, 30% 또는 50% 저하시킬 수 있다.
한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 서열 308, 309, 310, 311 및 312로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 서열 309의 PCSK9 단편의 5 내지 12, 바람직하게는 6 내지 8개의 연속적인 아미노산을 포함하는 펩티드이다.
한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 서열 309, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462 및 463으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 서열 508의 PCSK9 단편의 5 내지 12, 바람직하게는 6 내지 8개의 연속적인 아미노산을 포함하는 펩티드이다.
한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 서열 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542 및 543으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 서열 310의 PCSK9 단편의 5 내지 13, 바람직하게는 6 내지 8개의 연속적인 아미노산을 포함하는 펩티드이다.
한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 서열 310, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506 및 507로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 서열 544의 PCSK9 단편의 5 내지 13, 바람직하게는 6 내지 8개의 연속적인 아미노산을 포함하는 펩티드이다.
한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 서열 544, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 및 588로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
바람직한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 서열 312, 421, 422, 423, 426, 427, 428, 445, 482, 525, 및 563으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
보다 바람직한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 서열 445, 482, 525, 및 563으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
가장 바람직한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 서열 445의 서열을 갖는 펩티드이다.
상기 항원성 PCSK9 펩티드는 PCSK9-관련 장애의 치료, 예방 또는 호전을 위해 대상체에서 자가 항-PCSK9 항체를 유도하기 위해 단독으로 또는 면역원성 담체와 조합되어, 바람직하게는 접합되어 사용될 수 있다.
특정 구성체가 본 발명의 범위 내에 포함되는지를 확인하기 위해 어떤 기술을 사용할 수 있는지는 당업자에게 자명할 것이다. 그러한 기술은 본원의 실시예 섹션에 기재된 기술, 및 하기 내용의 것을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
자가 항-PCSK9 항체를 유도하는 본 발명의 항원성 PCSK9 펩티드의 능력을 본원의 실시예 3에 개시된 시험을 이용하여 마우스에서 측정할 수 있다. 순환 혈장 콜레스테롤의 수준을 감소시키는, 본 발명의 항원성 PCSK9 펩티드에 의해 유도된 자가항체의 능력을 실시예 3에 개시된 시험을 이용하여 마우스에서 측정할 수 있다. PCSK9와 LDL 수용체 사이의 상호작용을 억제하는, 본 발명의 항원성 PCSK9 펩티드에 의해 유도된 자가항체의 능력을 실시예 3에 개시된 시험 (FRET 분석)을 이용하여 직접, 또는 PCSK9-매개된 하향-조절의 차단 결과인 세포 표면 LDL 수용체의 상향조절을 측정함으로써 간접적으로 측정할 수 있다 (관련 문헌에 잘 설명된 바와 같이, 시험관 내에서 세포주를 사용하여 또는 항체 발현 동물의 간 생검에서 LDL 수용체 수준을 측정함으로써 (예를 들어 웨스턴 블로팅 (Western blotting)에 의해)).
용어 "항원성 PCSK9 펩티드 생물학적 활성"은 본원에서 사용될 때, 환자에서 자가 항-PCSK9 항체를 유도하는 본 발명의 항원성 PCSK9 펩티드의 능력을 나타낸다.
바람직하게는, 상기 항원성 PCSK9 펩티드는 대상체에게 투여될 때, 상기 대상체의 혈액 내의 LDL-콜레스테롤 수준을 저하시킬 수 있다. 바람직하게는, 상기 대상체는 포유동물, 바람직하게는 인간이다. 바람직하게는, 상기 항원성 PCSK9 펩티드는 LDL-콜레스테롤 수준을 적어도 2%, 5%, 10%, 20%, 30% 또는 50% 저하시킬 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항원성 PCSK9 펩티드는 천연 에피토프가 발견되는 전체 PCSK9 도메인으로부터 선택되는 영역을 모방하도록 하는 크기이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항원성 PCSK9 펩티드의 길이는 100개 미만의 아미노산, 바람직하게는 75개 미만의 아미노산, 보다 바람직하게는 50개 미만의 아미노산, 훨씬 더 바람직하게는 40개 미만의 아미노산이다. 본 발명의 항원성 PCSK9 펩티드의 길이는 일반적으로 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개 아미노산, 바람직하게는 4 내지 20개 아미노산, 예를 들어 6 내지 12, 6 내지 8 또는 9 내지 12개 아미노산이다. 본 발명의 항원성 PCSK9 펩티드의 구체적인 예가 서열 목록에 제시되고, 길이가 5 내지 17개 아미노산인 펩티드를 포함한다.
본 발명의 항원성 펩티드는 포유동물 PCSK9, 바람직하게는 인간 PCSK9 (서열 399) 또는 마우스 PCSK9 (서열 400), 보다 바람직하게는 인간 PCSK9의 일부분으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 PCSK9의 유래된 일부분은 천연 생성 PCSK9의 아미노산 서열에 대응하거나 또는 변이체 PCSK9, 즉 소수의 아미노산이 치환, 부가 또는 결실되었지만 본질적으로 동일한 면역학적 특성을 보유하는 천연 생성 PCSK9의 아미노산 서열에 대응한다. 또한, 상기 유래된 PCSK9 일부분은 항원성 PCSK9 펩티드가 입체형태적으로 제한되도록 하고/하거나 적절한 화학 처리가 수행된 후에 항원성 PCSK9 펩티드가 면역원성 담체에 커플링되도록 하기 위해 특히 N- 및 C-말단 단부에서 아미노산에 의해 추가로 변형될 수 있다.
본원에서 개시되는 항원성 PCSK9 펩티드는 그의 면역학적 특성을 본질적으로 손상하지 않으면서 아미노산이 결실, 삽입 또는 치환된 PCSK9의 아미노산 서열로부터 유래된 기능적 활성 변이체 펩티드를 포함하고, 상기 기능적 활성 변이체 펩티드는 실질적인 항원성 PCSK9 펩티드의 생물학적 활성을 보유한다. 일반적으로, 상기 기능적 변이체 펩티드는 서열 1 내지 312, 330 내지 398 및 420 내지 588로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대한 아미노산 서열 상동성, 바람직하게는 높은 상동성을 갖는다.
한 실시양태에서, 상기 기능적 활성 변이체 펩티드는 서열 1 내지 312, 330 내지 398 및 420 내지 588로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대한 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일성을 보인다.
서열 동일성으로도 언급되는 폴리펩티드에 대한 서열 유사성은 일반적으로 서열 분석 소프트웨어를 이용하여 측정된다. 단백질 분석 소프트웨어는 보존적 아미노산 치환을 포함하여 다양한 치환, 결실 및 다른 변형에 지정된 유사성 척도를 사용하여 유사한 서열을 맞춘다. 예를 들어, GCG는 밀접하게 관련된 폴리펩티드, 예를 들어 상이한 종의 유기체로부터의 상동성 폴리펩티드 사이의 또는 야생형 단백질과 그의 뮤테인 (mutein) 사이의 서열 상동성 또는 서열 동일성을 결정하기 위해 디폴트 파라미터와 함께 사용될 수 있는 "Gap" 및 "Bestfit"와 같은 프로그램을 포함한다 (예를 들어, GCG 버전 6.1 참조). 또한, 폴리펩티드 서열은 GCG 버전 6.1 내의 프로그램인 디폴트 또는 권장되는 파라미터를 사용하는 FASTA를 사용하여 비교될 수 있다. FASTA (예를 들어, FASTA2 및 FASTA3)는 질의 서열과 탐색 서열 사이의 최적 중첩 영역의 정렬 및 서열 동일성 비율을 제공한다 ([Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990)]; [Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219 (2000)]). 본 발명의 서열을 상이한 유기체로부터의 매우 많은 서열을 함유하는 데이타베이스와 비교할 때 다른 알고리듬은 디폴트 파라미터를 사용하는 컴퓨터 프로그램 BLAST, 특히 blastp 또는 tblastn이다 (예를 들어, 문헌 [Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)]; [Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-402 (1997)] 참조).
기능적 활성 변이체는 천연 생성 기능적 활성 변이체, 예를 들어 대립유전자 변이체 및 종 변이체, 및 예를 들어 돌연변이 유발 기술에 의해 또는 직접적인 합성에 의해 생산될 수 있는 비-천연 생성 기능적 활성 변이체를 포함한다.
기능적 활성 변이체는 서열 1 내지 312, 330 내지 398 및 420 내지 588에 제시된 임의의 펩티드와 예를 들어 약 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기가 상이하고, 항원성 PCSK9의 생물학적 활성을 계속 보유한다. 상기 비교가 정렬을 필요로 하는 경우, 서열은 최대 상동성을 보이도록 정렬된다. 변이 부위는 생물학적 활성이 서열 1 내지 312, 330 내지 398 및 420 내지 588에 제시된 펩티드와 실질적으로 유사하다면 펩티드 내의 어떤 위치에서 발생할 수 있다. 표현형 침묵 아미노산 치환을 만드는 방법에 대한 지침은 아미노산 서열 변화의 허용성을 연구하기 위한 2개의 주요 전략이 존재함을 제시하는 문헌 [Bowie et al., Science, 247: 1306-1310 (1990)]에 제시되어 있다.
제1 전략은 진화 과정 동안 자연 선택에 의한 아미노산 치환의 허용성을 이용한다. 상이한 종 내의 아미노산 서열을 비교함으로써, 종들 사이에서 보존된 아미노산 위치를 확인할 수 있다. 이들 보존된 아미노산은 단백질 기능에 중요할 가능성이 있다. 이와 대조적으로, 치환이 자연 선택에 의해 허용된 아미노산 위치는 단백질 기능에 중요하지 않은 위치를 나타낸다. 따라서, 아미노산 치환을 허용하는 위치는 변형된 펩티드의 특이적인 면역원성 활성을 계속 유지하면서 변형될 수 있다.
제2 전략은 단백질 기능에 중요한 영역을 확인하기 위해 클로닝된 유전자의 특이적인 위치에서 아미노산 변화를 도입하기 위해 유전공학을 이용한다. 예를 들어, 부위 지정 돌연변이 유발 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이 유발이 사용될 수 있다 (Cunningham et al., Science, 244: 1081-1085 (1989)). 이어서, 생성되는 변이체 펩티드를 특이적 항원성 PCSK9 생물학적 활성에 대해 시험할 수 있다.
보위 (Bowie) 등에 따르면, 상기 2개의 전략은 단백질이 놀랍게도 아미노산 치환에 대해 허용성임을 보여준다. 상기 저자들은 어느 아미노산 변화가 단백질 내의 특정 아미노산 위치에서 허용성일 가능성이 있는지를 추가로 제시한다. 예를 들어, 대부분의 매립된 (buried) 또는 내부 (단백질의 3차 구조 내의) 아미노산 잔기는 비극성 측쇄를 필요로 하는 반면에, 표면 또는 외부 측쇄의 특징부는 거의 보존되지 않는다.
단백질의 아미노산 내로 돌연변이를 도입하는 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Ausubel (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1994)]; [T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)] 참조).
또한, 돌연변이가 시판되는 키트, 예를 들어 "QuikChange™ 부위-지정 돌연변이 유발 키트" (스트라타젠 (Stratagene))를 사용하여 또는 펩티드 합성에 의해 직접 도입될 수 있다. 상기 항원성 PCSK9 펩티드의 기능에 유의하게 영향을 주지 않는 아미노산을 교체함으로써 항원성 PCSK9 펩티드에 대한 기능적 활성 변이체를 생성하는 것은 당업자에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 펩티드 중의 하나에서 이루어질 수 있는 아미노산 치환의 종류는 보존적 아미노산 치환이다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성 (예를 들어, 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄 R 기를 갖는 또 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되는 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능적 특성을 실질적으로 변경하지 않을 것이다. 2 이상의 아미노산 서열이 보존적 치환에 의해 서로 상이한 경우에, 서열 동일성 비율 또는 유사성 정도는 치환의 보존적 특성을 교정하기 위해 높게 조정될 수 있다. 상기 조정 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Pearson, Methods Mol. Biol. 243:307-31 (1994)] 참조).
유사한 화학적 특성을 갖는 아미노산의 군의 예는 다음을 포함한다: 1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신; 2) 지방족-히드록실 측쇄: 세린 및 트레오닌; 3) 아미드-함유 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민; 4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판; 5) 염기성 측쇄: 라이신, 아르기닌, 및 히스티딘; 6) 산성 측쇄: 아스파르트산 및 글루탐산; 및 7) 황-함유 측쇄: 시스테인 및 메티오닌. 바람직한 보존적 아미노산 치환기는 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 라이신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루타메이트-아스파르테이트, 및 아스파라긴-글루타민이다. 별법으로, 보존적 교체는 문헌 [Gonnet et al., Science 256:1443-45 (1992)]에 개시되어 있는 PAM250 log-가능성 매트릭스에서 양성 값을 갖는 임의의 변경이다. "중등도 보존적" 교체는 PAM250 log-가능성 매트릭스에서 비음성 값을 갖는 임의의 변경이다.
또한, 기능적 활성 변이체 펩티드는 혼성화 기술을 사용하여 단리될 수 있다. 간단히 설명하면, 관심있는 펩티드, 예를 들어 서열 1 내지 312, 330 내지 398 및 420 내지 588을 코딩하는 핵산 서열의 전부 또는 일부에 높은 상동성을 갖는 DNA를 사용하여 기능적 활성 펩티드를 제조한다. 따라서, 본 발명의 항원성 PCSK9 펩티드는 또한, 서열 1 내지 312, 330 내지 398, 및 420 내지 588의 펩티드 중의 하나 이상에 기능적으로 동등하고 서열 1 내지 312, 330 내지 398 및 420 내지 588 중의 임의의 하나를 코딩하는 핵산, 또는 그의 보체와 혼성화하는 핵산 분자에 의해 코딩되는 펩티드를 포함한다. 당업자는 쉽게 이용가능한 코돈표를 사용하여 본 발명의 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 쉽게 결정할 수 있다. 따라서, 상기 핵산 서열은 본원에서 제시하지 않는다.
기능적 활성 변이체인 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 핵산에 대한 혼성화 엄격성은 예를 들어 10% 포름아미드, 5 x SSPE, 1 x 덴하르트 (Denhart) 용액, 및 1 x 연어 정자 DNA (저 엄격성 조건)이다. 보다 바람직한 조건은 25% 포름아미드, 5 x SSPE, 1 x 덴하르트 용액, 및 1 x 연어 정자 DNA (중등 엄격성 조건)이고, 훨씬 더 바람직한 조건은 50% 포름아미드, 5 x SSPE, 1 x 덴하르트 용액, 및 1 x 연어 정자 DNA (고 엄격성 조건)이다. 그러나, 몇몇 인자가 상기한 포름아미드 농도 이외의 다른 혼성화 엄격성에 영향을 주고, 당업자는 유사한 엄격성을 달성하기 위해 상기 인자를 적절하게 선택할 수 있다.
또한, 기능적 활성 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 유전자 증폭 방법, 예를 들어 관심있는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질, 예를 들어 서열 1 내지 312, 330 내지 398 및 420 내지 588에 제시된 펩티드 중의 임의의 하나를 코딩하는 핵산 분자 DNA의 일부를 프로브로서 사용하는 PCR에 의해 단리될 수 있다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, 본 발명의 펩티드는 천연 공급원으로부터 유래되고, 포유동물, 예를 들어 인간, 영장류, 고양이, 개, 말, 마우스, 또는 래트, 바람직하게는 인간 공급원으로부터 단리된다. 따라서, 본 발명의 펩티드는 표준 단백질 정제 기술을 사용하여 세포 또는 조직 공급원으로부터 단리될 수 있다.
별법으로, 본 발명의 펩티드는 화학적으로 합성되거나 또는 재조합 DNA 기술을 사용하여 생산될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 펩티드는 당업계에 공지된 고체상 절차에 의해 합성할 수 있다. 적합한 합성은 "T-boc" 또는 "F-moc" 절차를 이용함으로써 수행할 수 있다. 시클릭 펩티드는 완전 자동화 기구 내에서 공지된 "F-moc"절차 및 폴리아미드 수지를 사용하는 고체상 절차에 의해 합성할 수 있다. 별법으로, 당업자는 과정을 수동으로 수행하기 위해 필요한 실험 절차를 알 것이다. 고체상 합성을 위한 기술 및 절차는 문헌 ['Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach' by E. Atherton and R. C. Sheppard, published by IRL at Oxford University Press (1989)] 및 [Methods in Molecular Biology, Vol. 35: Peptide Synthesis Protocols (ed. M. W. Pennington and B. M. Dunn), chapter 7, pp91-171 by D. Andreau et al.]에 기재되어 있다.
별법으로, 본 발명의 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 당업계에 잘 공지된 기술을 이용하여 적합한 발현 시스템 내에서 발현될 수 있는 발현 벡터 내로 도입된 후, 관심있는 발현된 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질을 단리 또는 정제할 수 있다. 다양한 세균, 효모, 식물, 포유동물, 및 곤충 발현 시스템이 당업계에서 이용가능하고, 임의의 그러한 발현 시스템을 사용할 수 있다. 임의로, 본 발명의 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 무세포 번역 시스템에서 번역될 수 있다.
본 발명의 항원성 PCSK9 펩티드는 또한 여러 유전자의 존재, 선택적 전사 사건, 선택적 RNA 스플라이싱 사건, 및 선택적 번역 및 번역후 사건의 결과로서 발생하는 펩티드를 포함할 수 있다. 펩티드는 펩티드가 천연 세포에서 발현될 때와 실질적으로 동일한 번역후 변형을 야기하는 시스템, 예를 들어 배양된 세포에서, 또는 천연 세포에서 발현될 때 존재하는 번역후 변형, 예를 들어 글리코실화 또는 절단의 변경 또는 상실을 야기하는 시스템에서 발현될 수 있다.
본 발명의 항원성 PCSK9 펩티드는 다른 비-PCSK9 또는 비-PCSK9-유래 아미노산 서열, 예를 들어 본원에서 규정되는 아미노산 링커 또는 신호 서열 또는 면역원성 담체, 및 단백질 정제에 유용한 리간드, 예를 들어 글루타티온-S-트랜스퍼라제, 히스티딘 태그, 및 스태필로코커스 (staphylococcal) 단백질 A를 함유하는 융합 단백질로서 생산될 수 있다. 1 초과의 본 발명의 항원성 PCSK9 펩티드가 융합 단백질에 존재할 수 있다. 이종성 폴리펩티드는 예를 들어 본 발명의 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다. 본 발명의 펩티드는 또한 상동성 아미노산 서열, 즉, 다른 PCSK9 또는 PCSK9-유래 서열을 포함하는 융합 단백질로서 생산될 수 있다.
본 발명의 항원성 PCSK9 펩티드는 선형이거나 또는 입체형태적으로 제한될 수 있다. 펩티드와 관련하여 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "입체형태적으로 제한된"은 3차원 구조가 시간에 걸쳐 실질적으로 한 공간 배열로 유지되는 펩티드를 의미한다. 입체형태적으로 제한된 분자는 개선된 특성, 예를 들어 증가된 친화도, 대사적 안정성, 막 투과도 또는 가용성을 가질 수 있다.
또한, 상기 입체형태적으로 제한된 펩티드는 항원성 PCSK9 에피토프를 그의 천연 루프 입체형태와 유사한 입체형태로 제시하여, 무손상, 천연 자가 PCSK9 분자를 보다 민감하게 인식하거나 또는 자가 PCSK9 분자를 인식하는 증가된 친화도를 갖는 항-PCSK9 항체를 유도할 것으로 예상된다. 입체형태적 제한의 방법은 당업계에 공지되어 있고, 가교화 (bridging) 및 고리화를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
입체형태적 제한을 선형 펩티드 내로 도입하기 위한 여러 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 펩티드 내의 2개의 이웃하는 아미노산 사이의 가교화는 그의 유연성이 일반적인 펩티드에 비해 제한되는 국소 입체형태적 변형을 야기한다. 상기 다리를 형성할 몇몇 가능성은 락탐 및 피페라지논의 혼입을 포함한다 (문헌 [Giannis and Kolter, Angew. Chem. Int. Ed., 1993, 32: 1244] 참조).
펩티드와 관련하여 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "시클릭"은 2개의 비-인접한 아미노산 또는 아미노산 유사체 사이의 분자내 결합을 포함하는 구조를 의미한다. 고리화는 공유 또는 비공유 결합을 통해 실시될 수 있다. 분자내 결합은 백본 대 백본, 측쇄 대 백본, 측쇄 대 측쇄, 측쇄 대 말단기, 말단 대 말단 결합을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 고리화 방법은 펩티드의 N-말단 잔기와 C-말단 잔기 사이의 아미드 결합의 형성, 비-인접한 아미노산 또는 아미노산 유사체의 측쇄 사이의 디술피드 결합의 형성; Lys 및 Asp/Glu 잔기의 측쇄 사이의 아미드 결합의 형성; 세린 잔기 및 Asp/Glu 잔기 사이의 에스테르 결합의 형성; 예를 들어 한 아미노산 또는 그의 유사체의 측쇄기와 아미노-말단 잔기의 N-말단 아민 사이의 락탐 결합의 형성; 및 라이시노노르류신 및 디티로신 결합의 형성을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 디술피드 연결의 탄소 버전, 예를 들어 에테닐 또는 에틸 연결 (J. Peptide Sc., 2008, 14, 898-902) 및 적절하게 다치환된 친전자성 시약, 예를 들어 디-, 트리- 또는 테트라할로알칸과의 알킬화 반응 ([PNAS, 2008, 105(40), 15293-15298]; [ChemBioChem, 2005, 6, 821-824])도 사용될 수 있다. 다양한 변형 프롤린 유사체도 입체형태적 제한을 펩티드 내로 도입하기 위해 사용될 수 있다 ([Zhang et al., J. Med Chem., 1996, 39: 2738-2744]; [Pfeifer and Robinson, Chem. Comm., 1998, 1977-1978]). 본 발명의 펩티드를 고리화하기 위해 사용될 수 있는 화학적 방법은 락탐, 히드라존, 옥심, 티아졸리딘, 티오에테르 또는 술포늄 결합을 포함하고 이로 제한되지 않는 결합으로 고리화된 펩티드를 생성시킨다.
US10/114918에 기재된 입체형태적으로 제한된 펩티드 설계의 또 다른 방법은 시클릭 제한 펩티드를 생성하기 위해 관심있는 짧은 아미노산 서열을 주형에 부착하는 것이다. 그러한 시클릭 펩티드는 그의 주형에 의해 구조상 안정화되어 천연 단백질 상의, 예를 들어 바이러스 및 기생충 상의 또는 자가 단백질 (자가 포유동물 단백질, 예를 들어 PCSK9) 상의 입체형태적 에피토프를 모방할 수 있는 3차원 입체형태를 제공할 뿐만 아니라, 혈청 내에서 단백질 분해에 대해 선형 펩티드보다 더 강한 내성을 보인다. US 10/114918은 펩티드의 초2차 (supersecondary) 구조를 안정화하기 위해 적절하게 위치하는 아미노산에 대한 백본 커플링을 위한 합성 아미노산의 제조에 의한 입체형태적으로 제한된 가교결합된 펩티드의 합성을 개시하고 있다. 가교결합은 글루타메이트의 적절하게 위치한 측쇄 카르복실기에 대한, 오르토고날 (orthogonally) 보호된 (2S, 3R)-3-아미노프롤린 잔기의 1차 아미노기의 아미드 커플링에 의해 달성될 수 있다. 상기 방법에 이어서, 적어도 하나의 프롤린이 (2S, 3R)-3-아미노프롤린에 의해 교체되고 측쇄 카르복실기를 도입하기 위해서 글루타메이트가 알라닌에 대한 대체물로서 도입된 CS 단백질의 입체형태적으로 제한된 테트라펩티드 반복체의 제조가 수행된다.
또한, 가교결합 전략은 알파-나선 입체형태를 모방하도록 설계된 '스테이플드 (stapled)' 펩티드를 형성하기 위한 그루브스 (Grubbs) 폐환 복분해 반응의 적용 ([Angew. Int. Ed. Engl., 1998, 37, 3281]; [JACS, 2000, 122, 5891]); 다관능성 당류의 사용; 트립타티오닌 연결의 사용 (Chemistry Eu. J., 2008, 24, 3404-3409); 측쇄 아미노산 잔기로서 혼입되거나 펩티드 서열의 백본 내에 위치하는 아지드 및 알킨의 '클릭 (click)' 반응의 사용 (Drug Disc. Today, 2003, 8(24), 1128-1137)을 포함한다. 또한, 금속 이온이, 금속 양이온에 배위결합하는 특이적인 잔기, 예를 들어 히스티딘을 통해 선형 펩티드의 제한된 입체형태를 안정화시킬 수 있음이 알려져 있다 (Angew. Int. Ed. Engl., 2003, 42, 421). 이와 유사하게, 비-천연 산 및 아민 관능기, 또는 폴리아민 및 다중산 (polyacid) 관능기를 사용한 선형 펩티드 서열의 관능화도 활성화 및 아미드 결합 형성 후에 고리화된 구조에 대한 접근을 허용하기 위해 사용될 수 있다.
한 실시양태에 따르면, 항원성 PCSK9 펩티드는 항원성 PCSK9 펩티드의 2개의 비-인접 아미노산, 예를 들어 N- 및 C-말단 아미노산의 서로에 대한 분자내 공유 결합에 의해 입체형태적으로 제한된다. 또 다른 실시양태에 따르면, 본 발명의 항원성 PCSK9 펩티드는 스캐폴드 분자에 대한 공유 결합에 의해 입체형태적으로 제한된다. 추가의 실시양태에 따르면, 항원성 PCSK9 펩티드는 단순 제한되고, 즉, 한 말단부 (C 또는 N 말단)에서 또는 말단부에 위치하지 않는 또 다른 아미노산을 통해 스캐폴드 분자에 커플링된다. 또 다른 실시양태에 따르면, 항원성 PCSK9 펩티드는 이중 제한되고, 즉, C 및 N 말단 모두에서 스캐폴드 분자에 커플링된다. 또 다른 실시양태에 따르면, 항원성 펩티드는 중심부등 (heterochiral) 디프롤린 단위 (D-Pro-L-Pro)의 주형 효과를 통한 고리화에 의해 제한된다 (Spath et al., 1998, Helvetica Chimica Acta 81, p1726-1738).
스캐폴드 ('플랫폼 (platform)'으로도 불림)는 공유 결합을 통해 항원성 PCSK9 펩티드가 취할 수 있는 입체형태의 수를 감소시킬 수 있는 임의의 분자일 수 있다. 입체형태-제한 스캐폴드의 예는 단백질 및 펩티드, 예를 들어 리포칼린-관련 분자, 예를 들어 베타-배럴 (barrel) 함유 티오레독신 및 티오레독신-유사 단백질, 뉴클레아제 (예를 들어, RNaseA), 프로테아제 (예를 들어 트립신), 프로테아제 억제제 (예를 들어, 에글린 C), 항체 또는 그의 구조적 경질 (rigid) 단편, 형광 단백질, 예를 들어 GFP 또는 YFP, 코노독소, 피브로넥틴 타입 III 도메인의 루프 영역, CTL-A4, 및 바이러스-유사 입자 (VLP)를 포함한다.
다른 적합한 플랫폼 분자는 탄수화물, 예를 들어 세파로스를 포함한다. 플랫폼은 선형 또는 환상 분자, 예를 들어 루프를 형성하기 위해 닫힌 분자일 수 있다. 플랫폼은 일반적으로 항원성 PCSK9 펩티드에 대해 이종성이다. 플랫폼에 연결된 상기 입체형태적으로 제한된 펩티드는 선형 펩티드보다 단백질 분해에 보다 내성일 것으로 생각된다.
바람직한 실시양태에 따르면, 스캐폴드는 본원에서 규정되는 면역원성 담체이다. 추가의 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 면역원성 담체 상에 단순 제한된다. 또 다른 추가의 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 면역원성 담체 상에 이중 제한된다. 상기 방식에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 세포내 인식 분자로서 특히 적합한 구조로 입증된 입체형태적으로 제한된 루프 구조를 형성한다.
본 발명의 항원성 PCSK9 펩티드는 예를 들어 하나의 말단부 또는 두 말단부에 대한 말단 시스테인의 부가 및/또는 링커 서열, 이중 글리신 헤드 및 테일 + 말단 시스테인, 라이신 잔기로 끝나는 링커 또는 상기 기능을 수행하는 것으로 당업자에게 공지된 임의의 다른 링커의 부가에 의해 플랫폼에 대한 접합 용이성을 위해 변형될 수 있다. 상기 링커의 상세한 내용은 이하에서 개시된다. 전체 펩티드 서열을 담체에 커플링시켜 임의의 위치화학적 (regiochemical) 및 화학선택성 문제를 방지하기 위한 바이오오르토고날 (bioorthogonal) 화학 (예를 들어, 상기한 클릭 반응)도 사용될 수 있다. 경질화된 (rigidified) 링커, 예를 들어 문헌 [Jones et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41:4241-4244]에 기재된 것은 개선된 면역학적 반응을 유도하는 것으로 알려져 있고, 또한 사용될 수 있다. 추가의 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는, 그 자체가 담체에 커플링되어 항원의 밀도를 증가시키는 다가 주형에 부착된다 (아래 참조). 다가 주형은 적절하게 관능화된 중합체 또는 올리고머, 예를 들어 (이로 제한되지 않음) 올리고글루타메이트 또는 올리고키토산일 수 있다 (도 19 참조).
본 발명의 면역원성
담체
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 항원성 PCSK9 펩티드는 백신접종 프로토콜을 위한 면역원을 형성하기 위해 면역원성 담체 분자에 연결되고, 바람직하게는 담체 분자는 천연 PCSK9 분자에 관련되지 않는다.
본원에서 용어 "면역원성 담체"는, 숙주 동물에서 면역원성 반응을 독립적으로 유발하는 특성을 갖고 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 내의 유리 카르복실, 아미노 또는 히드록실기와 면역원성 담체 물질 상의 대응하는 기 사이의 펩티드 또는 에스테르 결합의 형성을 통해 직접, 또는 별법으로 통상적인 이중기능성 연결기를 통해, 또는 융합 단백질로서 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질에 공유 커플링될 수 있는 물질을 포함한다.
본 발명의 면역원에서 사용되는 담체의 종류는 당업자에게 알려져 있다. 그러한 면역원성 담체의 예는 다음과 같다: 혈청 알부민, 예를 들어 소 혈청 알부민 (BSA); 글로불린; 티로글로불린; 헤모글로빈; 헤모시아닌 (특히 키홀 림펫 헤모시아닌 [KLH]); 폴리리신; 폴리글루탐산; 라이신-글루탐산 공중합체; 라이신 또는 오르니틴 함유 공중합체; 리포좀 담체; 튜베르쿨린의 정제된 단백질 유도체 (PPD); 불활성화된 세균 독소 또는 톡소이드, 예를 들어 파상풍 또는 디프테리아 독소 (TT 및 DT) 또는 TT의 단편 C, CRM197 (무독성이지만, 디프테리아 독소의 항원적으로 동일한 변이체), 다른 DT 점 돌연변이체, 예를 들어 CRM176, CRM228, CRM 45 (Uchida et al. J. Biol. Chem. 218; 3838-3844, 1973); CRM 9, CRM 45, CRM102, CRM 103 및 CRM107 및 문헌 [Nicholls and Youle in Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992]에 기재된 다른 돌연변이; Glu-148의 결실 또는 Asp, Gln 또는 Ser으로의 돌연변이 및/또는 Ala 158의 Gly로의 돌연변이 및 US 4709017 또는 US 4950740에 개시된 다른 돌연변이; 적어도 1개 이상의 잔기 Lys 516, Lys 526, Phe 530 및/또는 Lys 534의 돌연변이 및 US 5917017 또는 US 6455673에 개시된 다른 돌연변이; 또는 US 5843711에 개시된 단편, 폐렴구균 뉴몰리신 (pneumococcal pneumolysin) (Kuo et al. (1995) Infect Immun 63; 2706-13), 예를 들어 몇몇 방식으로 해독된 ply, 예를 들어 dPLY-GMBS (WO 04081515, PCT/EP2005/010258) 또는 dPLY-포르몰, PhtX, 예를 들어 PhtA, PhtB, PhtD, PhtE (PhtA, PhtB, PhtD 또는 PhtE의 서열은 WO 00/37105 또는 WO 00/39299에 개시되어 있다) 및 Pht 단백질의 융합체, 예를 들어 PhtDE 융합체, PhtBE 융합체, Pht A-E (WO 01/98334, WO 03/54007, WO2009/000826), OMPC (수막구균 (meningococcal) 외막 단백질 - 대체로 엔. 메닝기티디스 (N. meningitidis) 혈청군 B로부터 추출됨 - EP0372501), PorB (엔. 메닝기티디스), PD (해모필루스 인플루엔자에 (Haemophilus influenzae) 단백질 D - 예를 들어, EP 0 594 610 B 참조), 또는 그의 면역학상 기능적 동등물, 합성 펩티드 (EP0378881, EP0427347), 열 충격 단백질 (WO 93/17712, WO 94/03208), 백일해 단백질 (WO 98/58668, EP0471177), 시토킨, 림포킨, 성장 인자 또는 호르몬 (WO 91/01146), 다양한 병원체 유래 항원으로부터의 다수의 인간 CD4+ T 세포 에피토프를 포함하는 인공 단백질 (Falugi et al. (2001) Eur J Immunol 31; 3816-3824), 예를 들어 N19 단백질 (Baraldoi et al. (2004) Infect Immun 72; 4884-7), 폐렴구균 표면 단백질 PspA (WO 02/091998), 철 흡수 단백질 (WO 01/72337), 씨. 디피실레 (C. difficile)의 독소 A 또는 B (WO 00/61761).
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 담체는 CRM197이다.
또 다른 실시양태에서, 면역원성 담체는 바이러스-유사 입자 (VLP), 바람직하게는 재조합 바이러스-유사 입자이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "바이러스-유사 입자"는 바이러스 입자와 유사하지만 비병원성인 것으로 입증된 구조를 의미한다. 일반적으로, 바이러스-유사 입자에는 적어도 일부의 바이러스 게놈이 결여된다. 또한, 바이러스-유사 입자는 종종 이종성 발현에 의해 다량 생산될 수 있고, 쉽게 정제될 수 있다. 본 발명에 따른 바이러스-유사 입자는 그 게놈과 상이한 핵산을 함유할 수 있다. 본 발명에 따른 바이러스-유사 입자의 전형적인 및 바람직한 실시양태는 바이러스 캡시드, 예를 들어 대응하는 바이러스의 바이러스 캡시드, 박테리오파지, 또는 RNA-파지이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "박테리오파지의 바이러스-유사 입자"는, 비복제성 및 비감염성이고 적어도 박테리오파지의 복제 기구를 코딩하는 유전자 또는 유전자들이 결여되고 일반적으로 숙주에 대한 바이러스 부착 또는 숙주 내로의 도입을 담당하는 단백질 또는 단백질들을 코딩하는 유전자 또는 유전자들 역시 결여된, 박테리오파지의 구조와 유사한 바이러스-유사 입자를 의미한다. 그러나, 상기 정의는 상기 유전자 또는 유전자들이 계속 존재하지만 불활성이고, 따라서 박테리오파지의 비복제성 및 비감염성 바이러스-유사 입자를 역시 생성하는, 박테리오파지의 바이러스-유사 입자도 포함하여야 한다.
RNA 파지 코트 단백질의 180개 하위단위의 자가조립체로부터 형성되고 임의로 숙주 RNA를 함유하는 캡시드 구조는 본원에서 "RNA 파지 코트 단백질의 VLP"로서 언급된다. 구체적인 예는 Qbeta, MS2, PP7 또는 AP205 코트 단백질의 VLP이다. 예를 들어, Qbeta 코트 단백질의 특정 경우에, VLP는 Qbeta CP 하위단위 (예를 들어, 억제를 통해 보다 긴 A1 단백질의 임의의 발현을 방해하는 TAA 중지 코돈을 함유하는 Qbeta CP 유전자의 발현에 의해 생성됨, 문헌 [Kozlovska, T. M., et al., Intervirology 39: 9-15 (1996)] 참조)로부터만 조립될 수 있거나, 또는 캡시드 조립체 내에 A1 단백질 하위단위를 추가로 함유할 수 있다. 일반적으로, 캡시드 조립체 내의 Qbeta CP에 비해 Qbeta A1 단백질의 비율은 캡시드 형성을 보장하기 위해 제한될 것이다. 본 발명의 측면에서 면역원성 담체로서 적합한 VLP의 예는 Qbeta, MS2, PP7, AP205 및 다른 박테리오파지 코트 단백질의 VLP, B형 간염 바이러스 (Ulrich, et al., Virus Res. 50: 141-182 (1998)), 홍역 바이러스 (Warnes, et al., Gene 160: 173-178 (1995)), 신드비스 (Sindbis) 바이러스, 로타바이러스 (미국 특허 5,071,651 및 5,374,426), 수족구병 바이러스 (Twomey, et al., Vaccine 13: 1603-1610, (1995)), 노워크 (Norwalk) 바이러스 ([Jiang, X., et al., Science 250: 1580-1583 (1990)]; [Matsui, S. M., et al., J Clin. Invest. 87: 1456-1461 (1991)]), 레트로바이러스 GAG 단백질 (PCT 특허 출원 WO 96/30523), 레트로프랜스포존 (retrotransposon) Ty 단백질 pI, B형 간염 바이러스의 표면 단백질 (WO 92/11291), 인간 유두종 바이러스 (WO 98/15631), 인간 폴리오마 바이러스 ([Sasnauskas K., et al., Biol. Chem. 380 (3): 381-386 (1999)]; [Sasnauskas K., et al., Generation of recombinant virus-like particles of different polyomaviruses in yeast. 3rd Interational Workshop "Virus-like particles as vaccines." Berlin, September 26-29 (2001)]), RNA 파지, Ty, fr파지, GA-파지, AP 205-파지, 및 특히 Qbeta-파지, 동부 연한얼룩 (Cowpea chlorotic mottle) 바이러스, 동부 모자이크 바이러스, 인간 유두종 바이러스 (HPV), 소 유두종 바이러스, 돼지 파르보바이러스, 파르보바이러스, 예를 들어 B19, 돼지 (PPV) 및 개 (CPV) 파르보바이러스, 칼리시바이러스 (예를 들어, 노워크 바이러스, 토끼 출혈병 바이러스 [RHDV]), 동물 헤파드나바이러스 코어 항원 VLP, 사상/막대기형 식물 바이러스, 비제한적인 예를 들어 담배 모자이크 바이러스 (TMV), 감자 바이러스 X (PVX), 파파야 모자이크 바이러스 (PapMV), 알팔파 모자이크 바이러스 (AIMV), 및 존슨 그래스 (Johnson Grass) 모자이크 바이러스 (JGMV), 곤충 바이러스, 예를 들어 플록 하우스 (flock house) 바이러스 (FHV) 및 테트라바이러스, 폴리오마바이러스, 예를 들어 쥐 폴리오마바이러스 (MPyV), 쥐 폐친화성 바이러스 (MPtV), BK 바이러스 (BKV), 및 JC 바이러스 (JCV)의 캡시드 및 코어 단백질을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
당업자가 쉽게 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 면역원성 담체로서 사용되는 VLP는 임의의 특정 형태로 제한되지 않는다. 입자는 화학적으로 또는 생물학적 과정을 통해 합성될 수 있고, 천연 또는 비천연일 수 있다. 예를 들어, 상기 종류의 실시양태는 바이러스-유사 입자 또는 그의 재조합 형태를 포함한다. 보다 구체적인 실시양태에서, VLP는 VLP를 형성하는 것으로 알려진 임의의 바이러스의 재조합 폴리펩티드를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 바이러스-유사 입자는 추가로 상기 폴리펩티드의 하나 이상의 단편 및 그러한 폴리펩티드의 변이체를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 폴리펩티드의 변이체는 그들의 야생형 대응물과 아미노산 수준에서 예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 또는 99% 동일성을 공유할 수 있다. 본 발명에서 사용하기 적합한 변이체 VLP는 "바이러스-유사 입자"를 형성할 수 있는 한 임의의 유기체로부터 유래될 수 있고, 본원에서 규정된 "면역원성 담체"로서 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 바람직한 VLP는 HBV의 캡시드 단백질 또는 표면 항원 (각각 HBcAg 및 HBsAg) 또는 그의 재조합 단백질 또는 단편, 및 RNA-파지의 코트 단백질 또는 그의 재조합 단백질 또는 단편, 보다 바람직하게는 Qbeta의 코트 단백질 또는 재조합 단백질 또는 그의 단편을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항원성 PCSK9 펩티드와 조합되어 사용되는 면역원성 담체는 HBcAg 단백질이다. 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 HBcAg 단백질의 예는 당업자가 쉽게 결정할 수 있다. 그 예는 문헌 [Yuan et al., (J. Virol. 73: 10122-10128 (1999)], 및 WO00/198333, WO00/177158, WO00/214478, WO00/32227, WO01/85208, WO02/056905, WO03/024480, 및 WO03/024481에 기재된 HBV 코어 단백질을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 본 발명에서 사용하기 적합한 HBcAg는 "바이러스-유사 입자"를 형성할 수 있는 한 임의의 유기체로부터 유래될 수 있고, 본원에서 규정된 "면역원성 담체"로서 사용될 수 있다.
본 발명의 문맥에서 사용될 수 있는 특히 관심있는 HBcAg 변이체는 하나 이상의 천연에 존재하는 시스테인 잔기가 결실 또는 치환된 변이체이다. 유리 시스테인 잔기가 많은 화학적 부반응, 예를 들어 디술피드 교환, 예를 들어 다른 물질과 함께 조합 요법에서 주입되거나 형성되는 화학물질 또는 대사산물과의 반응, 또는 UV 광 노출시에 뉴클레오티드와의 반응 및 직접 산화에 관련될 수 있음이 당업계에 잘 공지되어 있다. 따라서, 특히 HBcAg가 핵산에 결합하는 경향이 크다는 사실을 고려할 때, 독성 부가물이 생성될 수 있다. 또한, 독성 부가물은 다수의 종 사이에 분포할 것이고, 이들은 각각 개별적으로 낮은 농도로 존재할 수 있지만, 함께 존재할 때 독성 수준에 도달할 수 있다. 상기 내용에 비추어, 천연에 존재하는 시스테인 잔기를 제거하기 위해 변형된 HBcAg을 백신 조성물에 사용하는 잇점 중의 하나는 항원 또는 항원성 결정자가 부착될 때 독성 종이 결합할 수 있는 부위가 감소하거나 완전히 제거된다는 것이다.
또한, B형 간염 바이러스 코어 항원 전구체 단백질의 N-말단 리더 서열이 결여된 HBcAg의 처리된 형태가, 특히 HBcAg가 처리가 발생하지 않을 조건 (예를 들어, 세균 시스템에서의 발현) 하에 생산될 때 본 발명의 문맥에서 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 다른 HBcAg 변이체는 다음을 포함한다: i) 통상적으로 알려진 컴퓨터 프로그램을 사용할 때 야생형 HBcAg 아미노산 서열 중의 하나에 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 동일한 폴리펩티드 서열, 또는 그의 하위부분, ii) 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 34 또는 35개의 아미노산이 C-말단으로부터 제거된 돌연변이체를 포함하는 C-말단 절단 (truncation) 돌연변이체, ii) 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15, 또는 17개의 아미노산이 N-말단으로부터 제거된 돌연변이체를 포함하는 N-말단 절단 돌연변이체, iii) 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15 또는 17개의 아미노산이 N-말단으로부터 제거되고 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 34 또는 35개의 아미노산이 C-말단으로부터 제거된 HBcAg를 포함하는 N-말단 및 C-말단 모두에서 말단 절단된 돌연변이체.
본 발명의 범위 내의 또 다른 HBcAg 변이체 단백질은 하나 이상의 4개 아르기닌 반복체가 결실되었지만 C-말단 시스테인이 보유된, 외래 에피토프의 면역원성 제시를 향상시키기 위해 변형된 변이체 (예를 들어 WO01/98333 참조), 및 키메릭 (chimeric) C-말단 절단된 HBcAg, 예를 들어 WO02/14478, WO03/102165 및 WO04/053091에 기재된 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항원성 PCSK9 펩티드와 조합되어 사용되는 면역원성 담체는 HBsAg 단백질이다. 본 발명의 문맥에서 사용될 수 있는 HBsAg 단백질은 당업자가 쉽게 결정할 수 있다. 그 예는 US5792463, WO02/10416, 및 WO08/020331에 기재된 HBV 표면 단백질을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 본 발명에서 사용하기 적합한 HBsAg는 "바이러스-유사 입자"를 형성할 수 있는 한 임의의 유기체로부터 유래될 수 있고, 본원에서 규정된 "면역원성 담체"로서 사용될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항원성 PCSK9 펩티드 또는 폴리펩티드와 조합되어 사용되는 면역원성 담체는 Qbeta 코트 단백질이다.
Qbeta 코트 단백질은 이. 콜라이 (E. coli)에서 발현될 때 캡시드로 자가조립되는 것으로 밝혀졌다 (Kozlovska TM. et al., GENE 137: 133-137 (1993)). 수득된 캡시드 또는 바이러스-유사 입자는 직경 25 nm 및 T=3 준대칭의 20면체의 파지-유사 캡시드 구조를 보여주었다. 추가로, 파지 Qss의 결정 구조가 밝혀졌다. 캡시드는 디술피드 다리에 의해 공유 오량체 및 육량체에서 연결되어 Qbeta 코트 단백질의 캡시드의 현저한 안전성을 유도하는 180개 카피의 코트 단백질을 함유한다 (Golmohammadi, R. et al., Structure 4: 5435554 (1996)). Qbeta 캡시드 단백질은 또한 유기 용매 및 변성제에 대한 흔치 않은 저항성을 보인다. Qbeta 코트 단백질의 캡시드의 높은 안전성은 특히 본 발명에 따른 포유동물 및 인간의 면역화 및 백신접종에서 그의 사용을 위해 유리한 특징이다.
본 발명의 문맥에서 사용될 수 있는 Qbeta 코트 단백질의 예는 당업자가 쉽게 결정할 수 있다. 그 예는 WO02/056905, WO03/024480, WO03/024481 (전문을 본원에 참고로 포함시킴)에 자세하게 기재되어 있고, PIR 데이타베이스에 개시된 아미노산 서열, Qbeta CP로 언급되는 기탁 번호 VCBPQbeta; Qbeta A1 단백질로 언급되는 기탁 번호 AAA16663; 및 N-말단 메티오닌이 절단된 변이체 단백질을 포함하는 그의 변이체; 100, 150 또는 180개의 많은 아미노산이 상실된 Qbeta A1의 C-말단 절단된 형태; 결실 또는 치환에 의한 라이신 잔기의 제거에 의해 또는 치환 또는 삽입에 의한 라이신 잔기의 부가에 의해 변형된 변이체 단백질 (예를 들어 그 전부가 본원에 참고로 포함된 WO03/024481에 개시된 Qbeta-240, Qbeta-243, Qbeta-250, Qbeta-251 및 Qbeta-259 참조), 및 상기한 임의의 Qbeta 코어 단백질에 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 또는 99% 동일성을 보이는 변이체를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 본 발명에서 사용하기 위해 적합한 변이체 Qbeta 코트 단백질은 "바이러스-유사 입자"를 형성할 수 있는 한 임의의 유기체로부터 유래될 수 있고, 본원에서 규정된 "면역원성 담체"로서 사용될 수 있다.
본 발명의 항원성 PCSK9 펩티드는 화학적 접합을 통해 또는 유전공학에 의해 조작된 융합 파트너의 발현에 의해 면역원성 담체에 커플링될 수 있다. 커플링은 반드시 직접적일 필요는 없고, 링커 서열을 통해 발생할 수 있다. 보다 일반적으로는, 항원성 펩티드가 면역원성 담체에 융합되거나 접합되거나 또는 달리 부착될 경우에, 스페이서 또는 링커 서열이 일반적으로 항원성 펩티드의 한 말단 또는 두 말단 모두에 부가된다. 상기 링커 서열은 일반적으로 프로테아좀, 엔도좀의 프로테아제 또는 세포의 다른 소포성 구획 (vesicular compartment)에 의해 인식되는 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 펩티드는 면역원성 담체와의 융합 단백질로서 발현된다. 펩티드의 융합은 면역원성 담체 1차 서열 내로의 삽입에 의해, 또는 면역원성 담체의 N- 또는 C-말단에 대한 융합에 의해 실시될 수 있다. 이하에서, 면역원성 담체에 대한 펩티드의 융합 단백질로 언급할 때, 하위단위 서열의 한 말단에 대한 융합 또는 담체 서열 내의 펩티드의 내부 삽입이 포함된다. 이하에서 언급될 때, 융합은 항원성 펩티드의 담체 서열 내로의 삽입에 의해, 담체 서열의 일부의 항원성 펩티드에 의한 치환에 의해, 또는 결실, 치환 또는 삽입의 조합에 의해 실시될 수 있다.
면역원성 담체가 VLP일 때, 키메릭 항원성 펩티드-VLP 하위단위는 일반적으로 VLP로 자가-조립될 수 있을 것이다. 또한, 그의 하위단위에 융합된 에피토프를 보이는 VLP는 본원에서 키메릭 VLP로도 불린다. 예를 들어, EP 0 421 635 B에는 바이러스-유사 입자에 외래 펩티드 서열을 제시하기 위해 키메릭 헤파드나바이러스 코어 항원 입자의 사용이 기재되어 있다.
측면에 위치하는 아미노산 잔기는 VLP의 하위단위의 서열의 한 말단에 융합되는 항원성 펩티드 서열의 한 말단에, 또는 상기 펩티드 서열의 VLP의 하위단위의 서열 내로의 내부 삽입을 위해 부가될 수 있다. 글리신 및 세린 잔기가 융합되는 펩티드에 부가되는 측면에 위치하는 서열에 사용되는 특히 유리한 아미노산이다. 글리신 잔기는 추가의 가요성을 부여하고, 이는 외래 서열의 VLP 하위단위의 서열 내로의 융합시의 잠재적인 불안정화 효과를 감소시킬 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시양태에서, 면역원성 담체는 HBcAg VLP이다. 항원성 펩티드의 HBcAg의 N-말단에 대한 융합 단백질 (Neyrinck, S. et al., Nature Med. 5: 1157-1163 (1999)) 또는 소위 주요 면역 우성 영역 (MIR) 내의 삽입은 문헌에 기재되어 있고 (Pumpens, P. and Grens, E., Intervirology 44: 98114 (2001)), WO 01 /98333), 본 발명의 구체적인 실시양태이다. MIR 내의 결실이 존재하는 HBcAg의 천연 생성 변이체도 문헌에 기재되어 있고 (Pumpens, P. and Grens, E., Intervirology 44: 98-114 (2001)), N- 또는 C-말단에 대한 융합, 및 wt HBcAg에 비교할 때 결실 부위에 대응하는 MIR 위치에서의 삽입은 본 발명의 추가의 실시양태이다. C-말단에 대한 융합도 문헌에 기재되어 있다 (Pumpens, P. and Grens, E., Intervirology 44: 98-114 (2001)). 당업자는 전통적인 분자 생물학 기술을 사용하여 융합 단백질을 제조하는 방법에 대한 지침을 쉽게 볼 수 있을 것이다. HBcAg 및 HBcAg 융합 단백질을 코딩하고, HBcAg 및 HBcAg 융합 단백질의 발현을 위해 유용한 벡터 및 플라스미드는 문헌 설명되어 있고 ([Pumpens, P. and #38; Grens, E. Intervirology 44: 98-114 (2001)], [Neyrinck, S. et al., Nature Med. 5: 1157-1163 (1999)]), 본 발명의 실시에서 사용될 수 있다. 자가-조립의 효율 및 HBcAg의 MIR 내에 삽입되는 에피토프의 제시의 최적화를 위한 중요한 인자는 삽입 부위의 선택 및 삽입시에 MIR 내의 HBcAg 서열로부터 결실되는 아미노산의 수 (Pumpens, P. and Grens, E., Intervirology 44: 98-114 (2001); EP 0 421 635; 미국 특허 6,231, 864), 또는 달리 표현하면, HBcAg로부터 어느 아미노산이 새로운 에피토프로 치환되어야 하는지이다. 예를 들어, HBcAg 아미노산 76-80, 79-81, 79-80, 75-85 또는 80-81의 외래 에피토프로의 치환이 문헌에 기재되어 있다 ([Pumpens, P. and Grens, E., Intervirology 44: 98-114 (2001)]; EP0421635; US 6,231,864, WO00/26385). HBcAg는 캡시드 조립에 불필요하고 핵산에 결합할 수 있는 (Pumpens, P. and Grens, E., Intervirology 44: 98-114 (2001)) 긴 아르기닌 테일을 갖는다 (Pumpens, P. and Grens, E., Intervirology 44: 98-114 (2001)). 상기 아르기닌 테일을 포함하거나 테일이 결여된 HBcAg는 본 발명의 두 실시양태이다.
본 발명의 또 다른 구체적인 실시양태에서, 면역원성 담체는 RNA 파지의 VLP, 바람직하게는 Qbeta이다. RNA 파지의 주요 코트 단백질은 세균, 특히 이. 콜라이에서 발현시에 VLP로 자연적으로 조립된다. 항원성 펩티드가 Qbeta의 A1 단백질의 말단 절단된 형태의 C-말단에 융합되거나 또는 A1 단백질 내에 삽입된 융합 단백질 구성체가 문헌에 기재되어 있다 (Kozlovska, T. M., et al., Intervirology, 39: 9-15 (1996)). A1 단백질은 UGA 중지 코돈에서의 억제에 의해 생성되고, 329 aa, 또는 N-말단 메티오닌의 절단을 고려할 때 328 aa의 길이를 갖는다. 알라닌 (Qbeta CP 유전자에 의해 코딩되는 제2 아미노산) 앞의 N-말단 메티오닌의 절단은 대체로 이. 콜라이에서 발생하고, Qbeta 코트 단백질의 N-말단에 대해서도 마찬가지이다. UGA 앰버 코돈의 3'에 위치하는 A1 유전자의 일부는 195개 아미노산의 길이를 갖는 CP 연장부를 코딩한다. CP 연장부의 위치 72와 73 사이에 항원성 펩티드의 삽입은 본 발명의 추가의 실시양태를 형성한다 (Kozlovska, T. M., et al., Intervirology 39: 9-15 (1996)). C-말단 절단된 Qbeta A1 단백질의 C-말단에서 항원성 펩티드의 융합은 본 발명의 추가의 바람직한 실시양태를 형성한다. 예를 들어, 문헌 [Kozlovska et al., (Intervirology, 39: 9-15 (1996))]에는 Qbeta A1 단백질 융합체가 기재되어 있고, 여기서 에피토프는 위치 19에서 말단 절단된 Qbeta CP 연장부의 C-말단에서 융합된다.
문헌 [Kozlovska et al. (Intervirology, 39: 9-15 (1996))]에 기재된 바와 같이, 융합된 에피토프를 보이는 입자의 조립은 일반적으로 모자이크 입자를 형성하기 위해 A1 단백질-항원 융합체 및 wt CP의 존재를 필요로 한다. 그러나, 바이러스-유사 입자, 특히 항원성 펩티드가 그에 대해 융합된 VLP 하위단위로만 이루어진 RNA 파지 Qbeta 코트 단백질의 VLP를 포함하는 실시태양도 본 발명의 범위에 포함된다.
모자이크 입자의 생성은 많은 방식으로 실시될 수 있다. 문헌 [Kozlovska et al., Intervirology, 39: 9-15 (1996)]에는 3가지 방법이 기재되어 있고, 그 모두가 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 제1 방법에서, VLP 상의 융합된 에피토프의 효율적인 제시는 UGA 코돈의 Trp로의 번역을 유도하는 클로닝된 UGA 억제자 tRNA를 코딩하는 플라스미드 (pISM3001 플라스미드 (Smiley B. K., et al., Gene 134: 33-40 (1993)))를 보유하는 이. 콜라이 균주에서 CP와 CP 연장부 사이에 UGA 중지 코돈을 갖는 Qbeta A1 단백질 융합체를 코딩하는 플라스미드의 발현에 의해 매개된다. 또 다른 방법에서, CP 유전자 중지 코돈은 UAA로 변경되고, A1 단백질-항원 융합체를 코딩하는 제2 플라스미드는 동시형질전환된다. 제2 플라스미드는 상이한 항생제 내성을 코딩하고, 복제 기점은 제1 플라스미드와 상용성이다. 제3 방법에서, CP 및 A1 단백질-항원 융합체는 문헌 [Kozlovska et al., Intervirology, 39: 9-15 (1996)]의 도 1에 기재된 바와 같이 프로모터, 예를 들어 Trp 프로모터에 작동가능하게 연결된 2중 시스트론 (bicistronic) 방식으로 코딩된다.
항원 또는 항원 결정자의 융합에 적합한 추가의 VLP는 WO03/024481에 기재되어 있고, 박테리오파지 fr, RNA 페이스 (phase) MS-2, 유두종바이러스의 캡시드 단백질, 레트로프랜스포존 Ty, 효모 및 레트로바이러스-유사-입자, HIV2 Gag, 동부 모자이크 바이러스, 파르보바이러스 VP2 VLP, HBsAg (US 4,722,840, EP0020416B1)를 포함한다. 또한, 본 발명의 실시를 위해 적합한 키메릭 VLP의 예도 문헌 [Intervirology 39: 1 (1996)]에 기재되어 있다. 본 발명에서 사용하기 위해 고려되는 VLP의 추가의 예는 다음과 같다: HPV-1, HPV-6, HPV-11, HPV-16, HPV-18, HPV-33, HPV-45, CRPV, COPV, HIV GAG, 담배 모자이크 바이러스, SV-40, 폴리오마바이러스, 아데노바이러스, 단순 포진 바이러스, 로타바이러스 및 노워크 바이러스의 바이러스-유사 입자.
면역원성 담체에 커플링되거나 되지 않은, 본 발명에 따른 임의의 재조합 방식으로 발현된 항원성 PCSK9 펩티드의 경우, 상기 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 핵산, 핵산을 포함하는 발현 벡터 및 발현 벡터 (자발적으로 또는 염색체 삽입된)를 함유하는 숙주 세포도 본 발명의 한 측면을 형성한다. 상기 숙주 세포에서 펩티드 또는 단백질을 발현시키고 이로부터 면역원을 단리함으로써 상기 펩티드 또는 단백질을 재조합 방식으로 생산하는 방법은 본 발명의 추가의 측면이다. 전장 천연 PCSK9 분자 또는 이를 코딩하는 전장 천연 DNA 서열은 본 발명에 의해 포함되지 않는다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 펩티드는 당업계에 잘 공지된 기술을 사용하여 면역원성 담체에 화학적으로 커플링된다. 접합은 단일점 접합 (예를 들어, N-말단 또는 C-말단 지점)을 통한 펩티드의 자유로운 이동을 허용하도록 또는 펩티드의 두 말단 모두가 면역원성 담체 단백질에 또는 스캐폴드 구조, 예를 들어 VLP에 접합된 고정된 구조로서 발생할 수 있다. 접합은 당업자에게 공지된 접합 화학 기술을 통해, 예를 들어 시스테인 잔기, 라이신 잔기 또는 접합점으로 통상 알려진 다른 카르복시 모이어티, 예를 들어 글루탐산 또는 아스파르트산을 통해 발생한다. 따라서, 예를 들어, 직접 공유 커플링을 위해, 통상적인 시판되는 이종이관능성 링커, 예를 들어 CDAP 및 SPDP (제조자의 지시를 이용하여)를 사용하여, 카르보디이미드, 글루타르알데히드 또는 (N-[γ-말레이미도부티릴옥시] 숙신이미드 에스테르를 이용할 수 있다. 아실히드라진 펩티드 유도체를 통한 펩티드, 특히 고리화 펩티드의 단백질 담체에 대한 접합의 예는 WO03/092714에 기재되어 있다. 커플링 반응 후에, 면역원은 투석법, 겔 여과 방법, 분획법 등에 의해 쉽게 단리 및 정제될 수 있다. 시스테인 잔기로 끝나는 펩티드 (바람직하게는 고리화 영역 외부의 링커로)는 말레이미드 화학법을 통해 담체 단백질에 편리하게 접합될 수 있다.
면역원성 담체가 VLP일 때, 동일한 아미노산 서열 또는 상이한 아미노산 서열을 갖는 몇몇 항원성 펩티드가 단일 VLP 분자에 커플링되어, 바람직하게는 WO00/32227, WO03/024481, WO02/056905 및 WO04/007538에 기재된 바와 같은 지향 (oriented) 방식으로 몇몇 항원성 결정자를 제시하는 반복적이고 규칙적인 구조를 생성할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 일반적으로 및 바람직하게는 이종이관능성 가교-링커를 사용하여 화학적 가교결합에 의해 VLP에 결합된다. 몇몇의 이종이관능성 가교-링커는 당업자에게 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 이종이관능성 가교 가교링커는 제1 부착 부위와, 즉 VLP 또는 VLP 하위단위의 라이신 잔기의 측쇄 아미노기와와 반응할 수 있는 관능기, 및 바람직한 제2 부착 부위, 즉 항원성 펩티드에 융합되고 임의로 환원에 의해 반응에 이용될 수 있는 시스테인 잔기와 반응할 수 있는 추가의 관능기를 함유한다. 일반적으로 유도체화로 불리는 절차의 제1 단계는 VLP와 가교-링커의 반응이다. 상기 반응의 산물은 활성화된 담체로도 불리는 활성화된 VLP이다. 제2 단계에서, 비반응된 가교-링커는 통상적인 방법, 예를 들어 겔 여과 또는 투석을 사용하여 제거된다. 제3 단계에서, 항원성 펩티드는 활성화된 VLP와 반응하고, 이 단계는 일반적으로 커플링 단계로 불린다. 비반응된 항원성 펩티드는 제4 단계에서 예를 들어 투석에 의해 임의로 제거될 수 있다. 몇몇의 이종이관능성 가교링커가 당업자에게 공지되어 있다. 이들은 바람직한 가교-링커 SMPH (피어스 (Pierce)), 술포-MBS, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-SIAB, 술포-SMPB, 술포-SMCC, SVSB, SIA, 및 예를 들어 피어스 케미컬 컴퍼니 (Pierce Chemical Company, 미국 일리노이주 록포드))로부터 이용가능하고 아미노기에 대해 반응성인 하나의 관능기 및 시스테인 잔기에 대해 반응성인 하나의 관능기를 갖는 다른 가교-링커를 포함한다. 상기한 가교-링커는 모두 티오에테르 연결의 형성을 야기한다.
본 발명의 실시에 적합한 또 다른 클래스의 가교-링커는 커플링시에 항원성 펩티드와 VLP 사이에 디술피드 연결의 도입을 특징으로 한다. 상기 클래스에 속하는 바람직한 가교-링커는 예를 들어 SPDP 및 술포-LC-SPDP (피어스)를 포함한다. 가교-링커를 사용한 VLP의 유도체화 정도는 실험 조건, 예를 들어 각각의 반응 파트너의 농도, 한 시약의 다른 시약에 대한 과량, pH, 온도 및 이온 강도를 변경함으로써 영향받을 수 있다. 커플링 정도, 즉 VLP의 하위단위당 항원성 펩티드의 양은 백신의 요건에 일치시키기 위해 상기한 실험 조건을 변경함으로써 조정될 수 있다.
항원성 펩티드를 VLP에 결합시키기 위한 또 다른 방법은 VLP의 표면 상의 라이신 잔기를 항원성 펩티드 상의 시스테인 잔기와 연결하는 것이다. 일부 실시양태에서, 제2 부착 부위 또는 그의 일부로서 시스테인 잔기를 함유하는 아미노산 링커의 VLP에 대한 커플링을 위한 항원성 펩티드에 대한 융합이 필요할 수 있다. 일반적으로, 가요성 아미노산 링커가 유리하다. 아미노산 링커의 예는 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택된다: (a) CGG; (b) N-말단 감마 1-링커; (c) N-말단 감마 3-링커; (d) Ig 힌지 (hinge) 영역; (e) N-말단 글리신 링커; (f)(G)kC(G)n (n=0-12 및 k=0-5); (g) N-말단 글리신-세린 링커; (h) (G)kC(G)m(S)i(GGGGS)n (n=0-3, k=0-5, m=0-10, i=0-2); (i) GGC; (k) GGC-NH2; (l) C-말단 감마 1-링커; (m) C-말단 감마 3-링커; (n) C-말단 글리신 링커; (o) (G)nC(G)k (n=0-12 및 k=0-5); (p) C-말단 글리신-세린 링커; (q) (G)m(S)t(GGGGS)n(G)oC(G)k (n=0-3, k=0-5, m=0-10, 1=0-2, 및 o=0-8). 아미노산 링커의 추가의 예는 면역글로불린의 힌지 영역, 글리신 세린 링커 (GGGGS)n, 및 글리신 링커 (G)n (모두 제2 부착 부위로서 시스테인 잔기 및 임의로 추가의 글리신 잔기를 추가로 함유함)이다. 상기 아미노산 링커의 일반적으로 바람직한 예는 N-말단 감마 1: CGDKTHTSPP; C-말단 감마 1: DKTHTSPPCG; N-말단 감마 3: CGGPKPSTPPGSSGGAP; C-말단 감마 3: PKPSTPPGSSGGAPGGCG; N-말단 글리신 링커: GCGGGG 및 C-말단 글리신 링커: GGGGCG.
소수성 항원성 펩티드가 VLP에 결합할 때 본 발명의 실시에 특히 적합한 다른 아미노산 링커는 N-말단 링커의 경우 CGKKGG, 또는 CGDEGG, 또는 C-말단 링커의 경우 GGKKGC 및 GGEDGC이다. C-말단 링커에 대해, 말단 시스테인은 임의로 C-말단에서 아미드화된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 펩티드의 C-말단에서의 GGCG, GGC 또는 GGC-NH2 ("NH2"는 아미드화를 나타낸다) 링커 또는 그의 N-말단에서의 CGG가 아미노산 링커로서 바람직하다. 일반적으로, 글리신 잔기는 커플링 반응에서 부피가 보다 큰 아미노산의 잠재적인 입체 방해를 방지하기 위해 부피가 큰 아미노산과 제2 부착 부위로서 사용되는 시스테인 사이에 삽입될 것이다. 본 발명의 추가의 실시양태에서, 아미노산 링커 GGC-NH2가 항원성 펩티드의 C-말단에 융합된다.
항원성 펩티드 상에 존재하는 시스테인 잔기는 활성화된 VLP 상의 이종이관능성 가교-링커와 반응하기 위해 그의 환원된 상태로 존재하여야 한다. 즉, 유리 시스테인 또는 유리 술프히드릴기를 갖는 시스테인 잔기가 이용가능하여야 한다. 결합 부위로서 기능하는 시스테인 잔기가 산화된 형태로 존재하는 경우, 예를 들어 이 잔기가 디술피드 다리를 형성한다면, 예를 들어 DTT, TCEP 또는 p-머캅토에탄올을 사용한 상기 디술피드 다리의 환원이 필요하다. 낮은 농도의 환원제가 WO 02/05690에 기재된 바와 같이 커플링에 적합하고, 당업자가 알 수 있는 바와 같이 보다 농도는 커플링 반응을 억제하고, 이 경우에 환원제는 커플링 전에, 예를 들어 투석, 겔 여과 또는 역상 HPLC에 의해 제거되거나 그의 농도가 저하되어야 한다.
상기한 방법에 따라 이종이관능성 가교-링커를 사용하여 항원성 펩티드를 VLP에 결합시키면, 지향 방식으로 항원성 펩티드를 VLP에 커플링하는 것이 가능하다. VLP에 항원성 펩티드를 결합하는 다른 방법은 카르보디이미드 EDC, 및 NHS를 사용하여 항원성 펩티드를 VLP에 가교결합하는 방법을 포함한다.
다른 방법에서, 항원성 펩티드는 동종이관능성 가교-링커, 예를 들어 글루타르알데히드, DSGBM [PEO] 4, BS3, (피어스 케미컬 컴퍼니, 미국 일리노이주 록포드) 또는 VLP의 아민기 또는 카르복실기에 대해 반응성인 관능기를 갖는 다른 공지의 동종이관능성 가교-링커를 사용하여 VLP에 부착된다.
VLP를 항원성 펩티드에 결합시키는 다른 방법은 VLP가 비오티닐화되고 항원성 펩티드가 스트렙타비딘-융합 단백질로서 발현되는 방법, 또는 예를 들어 WO 00/23955에 기재된 바와 같이 항원성 펩티드 및 VLP 둘 모두가 비오티닐화되는 방법을 포함한다. 이 경우에, 항원성 펩티드는 자유 결합 부위가 VLP의 결합을 위해 계속 이용가능하도록 항원성 펩티드 대 스트렙타비딘의 비율을 조정함으로써 스트렙타비딘 또는 아비딘에 먼저 결합될 수 있고, 다음 단계에 첨가된다. 별법으로, 모든 성분은 "단일 용기" 내 반응에서 혼합될 수 있다. 다른 리간드-수용체 쌍은 수용체 및 리간드의 가용성 형태가 이용가능하고 VLP 또는 항원성 펩티드에 가교결합될 수 있는 경우에, 항원성 펩티드를 VLP에 결합시키기 위한 결합제로서 사용될 수 있다. 별법으로, 리간드 또는 수용체는 항원성 펩티드에 융합될 수 있고, 따라서 각각 수용체 또는 리간드에 화학적으로 결합되거나 융합된 VLP에 대한 결합을 매개할 수 있다. 또한, 융합은 삽입 또는 치환에 의해서 실시될 수 있다.
하나 또는 몇몇의 항원 분자는 입체적으로 허용될 경우, 바람직하게는 RNA 파지의 VLP의 노출된 라이신 잔기를 통해 RNA 파지 코트 단백질의 캡시드 또는 VLP의 하나의 하위단위에 부착될 수 있다. RNA 파지의 코트 단백질의 VLP 및 특히 QP 코트 단백질 VLP의 특정 특징은 하위단위당 몇몇의 항원을 커플링시킬 가능성이다. 이에 의해 조밀한 항원 어레이를 생성할 수 있다.
Q 코트 단백질의 VLP 또는 캡시드는 3개의 라이신 잔기는 캡시드의 내부를 향하고 RNA와 상호작용하고, 4개의 다른 라이신 잔기는 캡시드의 외부에 노출된 규정된 토폴로지 (topology)를 갖는, 그 표면 상에 규정된 수의 라이신 잔기를 제시한다. 상기 규정된 특성은 라이신 잔기가 RNA와 상호작용하는 입자의 내부보다는 입자의 외부에 대한 항원의 부착에 유리하다. 다른 RNA 파지 코트 단백질의 VLP는 또한 그 표면에 규정된 수의 라이신 잔기 및 상기 라이신 잔기의 규정된 토폴로지를 갖는다.
본 발명의 추가의 실시양태에서, 제1 부착 부위는 라이신 잔기이고/이거나 제2 부착는 술프히드릴기 또는 시스테인 잔기를 포함한다. 본 발명의 추가의 실시양태에서, 제1 부착 부위는 라이신 잔기이고, 제2 부착 부위는 시스테인 잔기이다. 본 발명의 추가의 실시양태에서, 항원 또는 항원성 결정자는 시스테인 잔기를 통해 RNA 파지 코트 단백질의 VLP의 라이신 잔기에, 특히 Qbeta 코트 단백질의 VLP에 결합된다.
RNA 파지로부터 유래된 VLP의 또 다른 잇점은 적당한 비용으로 다량의 물질의 생산을 가능하게 하는, 세균에서의 높은 발현 수율이다. 또한, 담체로서 VLP를 사용하면, 각각 가변 항원 밀도로 강력한 항원 어레이 및 접합체를 형성할 수 있다. 특히, RNA 파지의 VLP, 및 특히 RNA 파지 Qbeta 코트 단백질의 VLP를 사용하면, 매우 높은 에피토프 밀도를 달성할 수 있다.
본 발명의 실시양태에 따르면, 본원에 개시된 항원성 PCSK9 펩티드는 면역원을 생성하기 위해 직접 또는 본원에 개시된 펩티드 링커의 하나를 통해 CRM197에 연결된, 바람직하게는 화학적으로 가교결합된다. 한 실시양태에서, 본원에 개시된 항원성 PCSK9 펩티드는 본원에 개시된 바와 같은 화학적 가교결합에 의해, 바람직하게는 상기 개시된 바와 같은 이종이관능성 가교-링커를 사용하여 CRM197에 연결된다.
CRM197과 사용하기 위한 바람직한 이종이관능성 가교-링커는 BAANS (브로모아세트산 N-히드록시숙신이미드 에스테르), SMPH (숙신이미딜-6-[β-말레이미도프로피온아미도]헥사노에이트), 술포-MBS, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-SIAB, 술포-SMPB, 술포-SMCC, SVSB, SIA, 및 예를 들어 피어스 케미컬 컴퍼니 (미국 일리노이주 록포드)로부터 이용가능한 다른 가교-링커이다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 이종이관능성 가교링커는 BAANS 또는 SMPH이다. 별법으로, 항원성 펩티드와 CRM197 사이에 디술피드 연결의 도입을 허용하기에 적합한 가교-링커가 본 발명의 문맥에서 또한 사용될 수 있다. 상기 클래스에 속하는 바람직한 가교-링커는 예를 들어 SPDP 및 술포-LC-SPDP (피어스)를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 항원성 PCSK9 펩티드의 서열이 시스테인을 포함할 때, 상기 항원성 PCSK9 펩티드는 상기 시스테인을 통해 직접 CRM197에 공유 연결될 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 면역원성 접합체의 혼합물, 즉 본 발명의 하나의 또는 몇몇 항원성 PCSK9 펩티드에 커플링된 면역원성 담체를 포함할 수 있다. 따라서, 이들 면역원성 조성물은 아미노산 서열이 상이한 면역원성 담체들로 이루어질 수 있다. 예를 들어, "야생형" VLP 및 하나 이상의 아미노산 잔기가 변경된 (예를 들어, 결실된, 삽입된 또는 치환된) 변형 VLP 단백질을 포함하는 백신 조성물이 제조될 수 있다. 별법으로, 동일한 면역원성 담체가 사용될 수 있지만, 상이한 아미노산 서열의 항원성 PCSK9 펩티드에 커플링될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 i) 본 발명에 따른 항원성 PCSK9 펩티드를 제공하고, ii) 본 발명에 따른 면역원성 담체, 바람직하게는 VLP를 제공하고, iii) 상기 항원성 PCSK9 펩티드 및 상기 면역원성 담체를 조합하는 것을 포함하는, 본 발명에 따른 면역원을 생산하는 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 상기 조합 단계는 화학적 가교결합을 통해, 바람직하게는 이종이관능성 가교-링커를 통해 발생한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본원에 개시된 항원성 PCSK9 펩티드는 면역원성 담체 분자에 연결된다. 한 실시양태에서, 상기 면역원성 담체는 본원에 기재된 임의의 면역원성 담체로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 상기 면역원성 담체는 혈청 알부민, 예를 들어 소 혈청 알부민 (BSA); 글로불린; 티로글로불린; 헤모글로빈; 헤모시아닌 (특히 키홀 림펫 헤모시아닌 [KLH]) 및 바이러스-유사 입자 (VLP)로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 상기 면역원성 담체는 디프테리아 톡소이드, 디프테리아 독소의 CRM197 돌연변이체, 파상풍 톡소이드, 키홀 림펫 헤모시아닌 또는 바이러스-유사 입자 (VLP)이다. 훨씬 바람직한 실시양태에서, 상기 면역원성 담체는 DT, CRM197 또는 HBcAg VLP, HBsAg VLP, Qbeta VLP, PP7 VLP, PPV VLP, 노워크 바이러스 VLP 또는 본원에 개시된 임의의 변이체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 VLP이다. 훨씬 바람직한 실시양태에서, 상기 면역원성 담체는 박테리오파지 VLP, 예를 들어 Qbeta CP; Qbeta A1, Qbeta-240, Qbeta-243, Qbeta-250, Qbeta-251 및 Qbeta-259 (WO03/024481에 개시됨)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 Qbeta VLP 또는 PP7이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 면역원성 담체는 CRM197이다.
한 실시양태에서, 상기 면역원성 담체는 본원에 개시된 항원성 PCSK9 펩티드에 직접 또는 링커를 통해 공유 연결된다. 한 실시양태에서, 상기 면역원성 담체는 본원에 기재된 융합 단백질의 발현에 의해 본원에 개시된 항원성 PCSK9 펩티드에 연결된다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 항원성 PCSK9 펩티드는 본원에 기재된 화학적 가교결합에 의해 및 바람직하게는 이종이관능성 가교-링커를 사용함으로써 면역원성 담체, 바람직하게는 VLP에 연결된다. 몇몇의 이종이관능성 가교-링커가 당업계에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 이종이관능성 가교링커는 제1 부착 부위, 즉 VLP 또는 VLP 하위단위의 라이신 잔기의 측쇄 아미노기와 반응할 수 있는 관능기, 및 바람직한 제2 부착 부위, 즉 환원에 의해 반응에 이용가능하게 되는 항원성 펩티드에 융합된 시스테인 잔기와 반응할 수 있는 추가의 관능기를 함유한다.
링커를 포함하는 본 발명의 항원성
PCSK9
펩티드
본 발명의 한 실시양태에서, 본원에 개시된 항원성 PCSK9 펩티드는 화학적 가교결합 반응에서 면역원성 담체의 부착 부위와 반응할 수 있는 링커를 그의 N-말단에, 또는 그의 C-말단에 또는 N-말단 및 C-말단 모두에 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 본원에 개시된 항원성 PCSK9 펩티드는 화학식 (G)nC, (G)nSC 또는 (G)nK, 바람직하게는 (G)nC의 링커를 그의 C-말단에 추가로 포함하고, 상기 식에서 n은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로 이루어진 군, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 및 5로 이루어진 군, 보다 바람직하게는 0, 1, 2 및 3으로 이루어진 군에서 선택된 정수이고, 가장 바람직하게는 n은 0 또는 1이다 (n이 0일 경우, 상기 화학식은 시스테인을 나타낸다). 바람직하게는, 본원에 개시된 항원성 PCSK9 펩티드는 화학식 GGGC, GGC, GC 또는 C의 링커를 그의 C-말단에 추가로 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 항원성 PCSK9 펩티드는 화학식 C(G)n, CS(G)n 또는 K(G)n, 바람직하게는 C(G)n의 링커를 그의 N-말단에 추가로 포함하고, 상기 식에서 n은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로 이루어지는 군, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 및 5로 이루어지는 군, 보다 바람직하게는 0, 1, 2 및 3으로 이루어지는 군으로부터 선택된 정수이고, 가장 바람직하게는 n은 0 또는 1이다 (n이 0일 경우, 화학식은 시스테인을 나타낸다). 바람직하게는 본원에 개시된 항원성 PCSK9 펩티드는 화학식 CGGG, CGG, CG 또는 C의 링커를 그의 N-말단에 추가로 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 항원성 PCSK9 펩티드는 화학식 (G)nC, (G)nSC 또는 (G)nK, 바람직하게는 (G)nC의 링커를 그의 C-말단에 추가로 포함하고, 상기 식에서 n은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로 이루어지는 군, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 및 5로 이루어지는 군, 보다 바람직하게는 0, 1, 2 및 3으로 이루어지는 군에서 선택된 정수이고, 가장 바람직하게는 n은 0 또는 1이고 (n이 0일 경우, 화학식은 시스테인을 나타낸다), 화학식 C(G)n, CS(G)n 또는 K(G)n, 바람직하게는 C(G)n의 링커를 그의 N-말단에 추가로 포함하고, 상기 식에서 n은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로 이루어지는 군, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 및 5로 이루어지는 군, 보다 바람직하게는 0, 1, 2 및 3으로 이루어지는 군에서 선택된 정수이고, 가장 바람직하게는 n은 0 또는 1이다 (n이 0일 경우, 화학식은 시스테인을 나타낸다). 바람직하게는, 본원에 개시된 항원성 PCSK9 펩티드는 화학식 CGGG, CGG, CG 또는 C의 링커를 그의 N-말단에 및 화학식 GGGC, GGC, GC 또는 C의 링커를 그의 C-말단에 추가로 포함한다. 바람직하게는, 본원에 개시된 항원성 PCSK9 펩티드는 그의 N-말단에 시스테인을, 그의 C-말단에 시스테인을 추가로 포함한다.
상기 링커를 추가로 포함하는 상기 항원성 PCSK9 펩티드의 대표적인 예는 서열 313, 314, 315, 316, 317, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418 및 419에 개시된다.
상기 링커를 추가로 포함하는 상기 항원성 PCSK9 펩티드의 대표적인 예는 서열 313, 314, 315, 316, 317, 322, 323, 324, 325, 326, 327 및 328에 개시된다.
링커를 포함하는 바람직한 항원성 PCSK9 펩티드는 서열 317, 322, 323, 324, 401, 402, 403, 413, 414, 415 및 416에 개시되어 있다.
링커를 포함하는 바람직한 항원성 PCSK9 펩티드는 서열 317, 322, 323 및 324에 개시되어 있다.
링커를 포함하는 가장 바람직한 항원성 PCSK9 펩티드는 서열 317, 322, 402 및 413에 개시되어 있다.
한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 고리화된다. 한 실시양태에서, 고리화된 항원성 PCSK9 펩티드는 면역원성 담체에 부착된다. 한 실시양태에서, 상기 고리화된 항원성 PCSK9 펩티드는 공유 결합에 의해 면역원성 담체에 부착된다. 한 실시양태에서, 상기 고리화된 항원성 PCSK9 펩티드는 그의 아미노산의 측쇄의 하나의 담체에 대한 공유 결합에 의해 면역원성 담체에 부착된다. 한 실시양태에서, 시스테인, 가변적인 수의 글리신 잔기 및 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 GC 또는 CC 단편은, 부가된 시스테인을 통해 면역원성 담체에 대한 공유 결합이 가능하도록 고리화된 PCSK9 펩티드에 부가된다. 한 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드는 고리화되고, 시스테인, (G)nC 또는 C(G)n 단편을 포함하고, 여기서 n은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로 이루어지는 군, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 및 5로 이루어지는 군, 보다 바람직하게는 0, 1, 2 및 3으로 이루어지는 군에서 선택되는 정수이고, 가장 바람직하게는 n은 0 또는 1이다 (n이 0일 경우, 화학식은 시스테인을 나타낸다). 상기 입체형태적으로 제한된 항원성 PCSK9 펩티드의 비제한적인 예는 서열 318, 319, 320 및 321의 펩티드이다. 바람직한 고리화된 펩티드는 서열 318의 펩티드이다.
모두 본 발명의 범위에 포함되고 다양한 실시태양을 구성하는, 다양한 링커를 사용한 항원성 PCSK9 펩티드와 상기 설명된 담체 또는 스캐폴드의 접합의 예가 아래에 제시된다:
펩티드 - GGGGGC - 스캐폴드, 펩티드 - GGGGC - 스캐폴드, 펩티드 - GGGC - 스캐폴드, 펩티드 - GGC - 스캐폴드, 펩티드 - GC - 스캐폴드, 펩티드 - C - 스캐폴드, 펩티드 - GGGGGK - 스캐폴드, 펩티드 - GGGGK - 스캐폴드, 펩티드 - GGGK - 스캐폴드, 펩티드 - GGK - 스캐폴드, 펩티드 - GK - 스캐폴드, 펩티드 - K- 스캐폴드, 펩티드 - GGGGSC - 스캐폴드, 펩티드 - GGGSC - 스캐폴드, 펩티드 - GGSC - 스캐폴드, 펩티드 - GSC - 스캐폴드, 펩티드 - SC - 스캐폴드, 스캐폴드 - CSGGGG - 펩티드, 스캐폴드 - CSGGG- 펩티드, 스캐폴드 - CSGG- 펩티드, 스캐폴드 - CSG- 펩티드, 스캐폴드 - CS - 펩티드, 스캐폴드 - KGGGG - 펩티드, 스캐폴드 - KGGG- 펩티드, 스캐폴드 - KGG - 펩티드, 스캐폴드 - KG - 펩티드, 스캐폴드 - K - 펩티드.
한 실시양태에서, 펩티드는 임의의 본원에 개시된 항원성 PCSK9 펩티드로 구성되고, 스캐폴드는 본원에 개시된 임의의 면역원성 담체, 바람직하게는 VLP로 구성된다.
다양한 링커 및 이중 제한된 펩티드를 사용한 접합의 예시적인 조합이 아래에서 제시되고, 여기서 담체는 담체의 동일한 단량체 또는 담체의 상이한 단량체일 수 있다 (하기 예에서, GC 링커는 상기 예시된 임의의 GK 링커 또는 GSC 링커 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 링거로 치환될 수 있다):
담체 - CGGGGG - 펩티드 - GGGGGC - 담체, 담체 - CGGGG - 펩티드 - GGGGC - 담체, 담체 - CGGGG - 펩티드 - GGGGC - 담체, 담체 - CGGG - 펩티드 - GGGC - 담체, 담체 - CG - 펩티드 - GC - 담체, 담체 - CG - 펩티드 - C - 담체, 담체 - C - 펩티드 - C - 담체. 한 실시양태에서, 펩티드는 임의의 본원에 개시된 항원성 PCSK9 펩티드로 구성되고, 담체는 본원에 개시된 임의의 면역원성 담체, 바람직하게는 VLP로 구성된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열 1 내지 312, 330 내지 398 및 420 내지 588로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성되거나 본질적으로 이로 구성되는 항원성 PCSK9 펩티드를 포함하는 면역원에 관한 것이고, 여기서 상기 항원성 PCSK9 펩티드는 티오에테르 연결을 통해 면역원성 담체에 화학적으로 가교결합된 시스테인을 그의 C-말단 또는 그의 N-말단에 추가로 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 면역원성 담체는 DT (디프테리아 독소), TT (파상풍 톡소이드) 또는 TT의 단편 C, PD (해모필루스 인플루엔자에 단백질 D), CRM197, 다른 DT 점 돌연변이체, 예를 들어 CRM176, CRM228, CRM45, CRM9, CRM102, CRM 103 및 CRM107로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 상기 면역원성 담체는 CRM197이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 1 내지 312, 330 내지 398 및 420 내지 588로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성되거나 본질적으로 이로 구성되는 항원성 PCSK9 펩티드를 포함하는 면역원에 관한 것이고, 상기 항원성 PCSK9 펩티드는 가교 링커로서 SMPH (숙신이미딜-6-[β-말레이미도프로피온아미도]헥사노에이트) 또는 BAANS (브로모아세트산 N-히드록시숙신이미드 에스테르)를 사용하여 티오에테르 연결을 통해 면역원성 담체에 화학적으로 가교결합된 시스테인을 그의 C-말단 또는 그의 N-말단에 추가로 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 면역원성 담체는 DT (디프테리아 독소), TT (파상풍 톡소이드) 또는 TT의 단편 C, PD (해모필루스 인플루엔자에 단백질 D), CRM197, 다른 DT 점 돌연변이체, 예를 들어 CRM176, CRM228, CRM45, CRM9, CRM 102, CRM103 및 CRM107로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 상기 면역원성 담체는 CRM197이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열 1 내지 312, 330 내지 398 및 420 내지 588로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성되거나 본질적으로 이로 구성되는 항원성 PCSK9 펩티드를 포함하는 면역원에 관한 것이고, 상기 항원성 PCSK9 펩티드는 가교 링커로서 SMPH (숙신이미딜-6-[β-말레이미도프로피온아미도]헥사노에이트) 또는 BAANS (브로모아세트산 N-히드록시숙신이미드 에스테르)를 사용하여 티오에테르 연결을 통해 면역원성 담체에 화학적으로 가교결합된 시스테인을 그의 C-말단에 추가로 포함하고, 상기 연결은 CRM197의 라이신 잔기와 상기 항원성 펩티드의 시스테인 잔기 사이에서 이루어진다.
본 발명의 항원성
PCSK9
펩티드를 포함하는 조성물
본 발명은 추가로 바람직하게는 면역원성 담체에 연결된 본 발명의 항원성 PCSK9 펩티드 및 임의로 적어도 하나의 아주반트를 포함하는 조성물, 특히 "대상 면역원성 조성물"로도 언급되는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 상기 면역원성 조성물은 특히 제약 조성물로서 제형화될 때 PCSK9-관련 장애를 예방, 치료 또는 완화시키기 위해 유용한 것으로 생각된다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 대상 면역원성 조성물은 임의로 링커를 포함하고, 서열 1 내지 328, 330 내지 398, 및 401 내지 588로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항원성 PCSK9 펩티드 및 그의 기능적 활성 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 항원성 PCSK9 펩티드는 면역원성 담체, 바람직하게는 DT, CRM197 또는 VLP, 보다 바람직하게는 HBcAg, HBsAg, Qbeta, PP7, PPV 또는 노워크 바이러스 VLP에 연결된다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 대상 면역원성 조성물은 임의로 링커를 포함하고, VLP, 바람직하게는 Qbeta VLP에 연결된, 서열 1 내지 328, 330 내지 398 및 401 내지 588로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항원성 PCSK9 펩티드, 및 그의 기능적 활성 변이체를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 대상 면역원성 조성물은 임의로 링커를 포함하고, CRM197에 연결된 서열 1 내지 328, 330 내지 398, 및 401 내지 588로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 항원성 PCSK9 펩티드 및 그의 기능적 활성 변이체를 포함한다.
본 발명에 따른 항원성 PCSK9 펩티드를 포함하는 대상 면역원성 조성물은 아래에서 보다 상세하게 설명되는 바와 같이 많은 방법으로 제형화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 대상 면역원성 조성물은 항원성 PCSK9 펩티드의 단일 종을 포함하고, 예를 들어, 면역원성 조성물은 실질적으로 모든 펩티드가 동일한 아미노산 서열을 갖는 항원성 PCSK9 펩티드의 집단을 포함한다. 다른 실시양태에서, 대상 면역원성 조성물은 2 이상의 상이한 항원성 PCSK9 펩티드를 포함하고, 예를 들어, 면역원성 조성물은 집단의 구성원이 아미노산 서열에서 상이할 수 있는 항원성 PCSK9 펩티드의 집단을 포함한다. 대상 면역원성 조성물은 2 내지 약 20종의 상이한 항원성 PCSK9 펩티드를 포함할 수 있고, 예를 들어, 대상 면역원성 조성물은 각각 다른 항원성 PCSK9 펩티드의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 갖는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11-15, 또는 15-20종의 상이한 항원성 PCSK9 펩티드를 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 대상 면역원성 조성물은 상기한 바와 같은 다량체화된 항원성 PCSK9 폴리펩티드를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항원성 PCSK9 펩티드를 포함하는 면역원성 조성물" 또는 "본 발명의 면역원성 조성물" 또는 "대상 면역원성 조성물"은 면역원성 담체에 커플링되거나 되지 않은 단일 종 (다량체화되거나 되지 않은) 또는 다수 종의 항원성 PCSK9 펩티드(들)을 포함하는 면역원성 조성물을 의미한다. 담체에 커플링된 2 이상의 펩티드가 사용될 경우, 펩티드는 동일한 담체 분자에 커플링되거나 또는 담체 분자에 개별적으로 커플링된 후 조합되어 면역원성 조성물을 생산할 수 있다. 본 발명의 또 다른 측면은 항원성 PCSK9 펩티드를 면역원성 담체에 커플링시키는 것을 포함하는, 본 발명에 따른 면역원을 생산하는 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 상기 커플링은 화학적 커플링이다.
아주반트
일부 실시양태에서, 대상 면역원성 조성물은 적어도 하나의 아주반트를 포함한다. 적합한 아주반트는 포유동물, 바람직하게는 인간에 사용하기 적합한 것을 포함한다. 인간에서 사용할 수 있는 공지의 적합한 아주반트의 예는 백반, 알루미늄 포스페이트, 수산화알루미늄, MF59 (4.3% w/v 스쿠알렌, 0.5% w/v 폴리소르베이트 80 (트윈 (Tween) 80), 0.5% w/v 소르비탄 트리올레에이트 (Span 85)), CpG-함유 핵산 (여기서, 시토신은 비메틸화된다), QS21 (사포닌 아주반트), MPL (모노포스포릴 지질 A), 3DMPL (3-O-탈아실화 MPL), 아퀼라 (Aquilla)로부터의 추출물, ISCOMS (예를 들어, 문헌 [Sjoelander et al. (1998) J. Leukocyte Biol. 64:713]; WO90/03184, W096/11711, WO 00/48630, W098/36772, WOOO/41720, WO06/134423 및 WO07/026190 참조), LT/CT 돌연변이체, 폴리(D,L-락티드-co-글리콜리드) (PLG) 마이크로입자, Quil A, 타이터맥스 클래식, 타이터맥스 골드 (Gold), 인터류킨 등을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 동물 실험을 포함하고 이로 제한되지 않는 수의 용도를 위해, 프로인트 (Freund) 아주반트, N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민 (thr-MDP), N-아세틸-nor-무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민 (CGP 11637, nor-MDP로 언급됨), N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'-디팔미토일-sn-글리세로-3-히드록시포스포릴옥시)-에틸아민 (CGP 19835A, MTP-PE로 언급됨), 및 2% 스쿠알렌/트윈 80 에멀젼 내의 세균으로부터 추출된 3개의 성분 모노포스포릴 지질 A, 트레할로스 디미콜레이트 및 세포벽 골격 (MPL+TDM+CWS)을 함유하는 RIBI를 사용할 수 있다.
조성물의 유효성을 향상하기 위한 추가의 예시적인 아주반트는 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다:
(1) 수중유형 에멀젼 제형 (다른 특이적인 면역자극제, 예를 들어 무라밀 펩티드 (하기 참조) 또는 세균 세포벽 성분 함유 또는 비함유), 예를 들어 (a) 미세유화기 (microfluidizer)를 사용하여 마이크로미터 미만 입자로 제형화된, 5% 스쿠알렌, 0.5% 트윈 80 (폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노-올레에이트), 및 0.5% Span 85 (소르비탄 트리올레에이트) (임의로 디팔미토일 포스파티딜에탄올아민 (MTP-PE)에 공유 연결된 무라밀 트리-펩티드 함유)를 함유하는 MF59™ (WO90/14837; Chapter 10 in Vaccine design: the subunit and adjuvant approach, eds. Powell & Newman, Plenum Press 1995), (b) 보다 큰 입자 크기 에멀젼을 생성하기 위해 마이크로미터 미만 에멀젼으로 미세유화된 또는 볼텍싱된 (vortexed), 10% 스쿠알렌, 0.4% 트윈 80, 5% 플루로닉 (pluronic)-블록 중합체 L121, 및 thr-MDP를 함유하는 SAF, 및 (c) 2% 스쿠알렌, 0.2% 트윈 80, 및 하나 이상의 세균 세포벽 성분, 예를 들어 모노포스포릴 지질 A (MPL), 트레할로스 디미콜레이트 (TDM), 및 세포벽 골격 (CWS), 바람직하게는 MPL + CWS (데톡스 (DETOX)™)를 함유하는 RIBI™ 아주반트 시스템 (RAS) (리비 이뮤노켐 (Ribi Immunochem, 미국 몬태나주 해밀턴)); (2) 사포닌 아주반트, 예를 들어 QS21, 스티물론 (STIMULON)™ (캠브리지 바이오사이언스 (Cambridge Bioscience, 미국 매사추세츠주 워세스터), 아비스코 (Abisco)® (이스코노바 (Isconova, 스웨덴)), 또는 이스코매트릭스 (Iscomatrix)® (커먼웰쓰 씨럼 래보래토리즈 (Commonwealth Serum Laboratories, 호주)) 또는 이로부터 생성된 입자, 예를 들어 ISCOM (면역자극 복합체) (ISCOMS에는 추가의 세제가 결여될 수 있다, 예를 들어 WO00/07621); (3) 완전 프로인트 아주반트 (CFA) 및 불완전 프로인트 아주반트 (IFA); (4) 시토킨, 예를 들어 인터류킨 (예를 들어, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 (W099/44636) 등), 인터페론 (예를 들어, 감마 인터페론), 대식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF), 종양 괴사 인자 (TNF) 등; (5) 임의로 폐렴구균 당류와 함께 사용될 때 실질적으로 백반의 부재 하의 (예를 들어 WO00/56358) 모노포스포릴 지질 A (MPL) 또는 3-O-탈아실화 MPL (3dMPL) (예를 들어 GB-2220221, EP-A-0689454); (6) 예를 들어 QS21 및/또는 수중유형 에멀젼과 3dMPL의 조합물 (예를 들어 EP-A-0835318, EP-A-0735898, EP-A-0761231); (7) CpG 모티프를 포함하는, 즉, 적어도 하나의 CG 디뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 시토신이 비메틸화된 것인 올리고뉴클레오티드 ([Krieg Vaccine 2000, 19, 618-622]; [Krieg Curr opin Mol Ther 2001 3: 15-24]; [Roman et al., Nat. Med., 1997, 3, 849-854]; [Weiner et al., PNAS USA, 1997, 94, 10833-10837]; [Davis et al. J. Immunol, 1998, 160, 870-876]; [Chu et al., J. Exp. Med, 1997, 186, 1623-1631]; [Lipford et al., Ear. J. Immunol., 1997, 27, 2340-2344]; [Moldoveami et al., Vaccine, 1988, 16, 1216-1224], [Krieg et al., Nature, 1995, 374, 546-549]; [Klinman et al., PNAS USA, 1996, 93, 2879-2883]; [Ballas et al., J. Immunol, 1996, 157, 1840-1845]; [Cowdery et al., J. Immunol, 1996, 156, 4570-4575]; [Halpern et al., Cell Immunol, 1996, 167, 72-78]; [Yamamoto et al., Jpn. J. Cancer Res., 1988, 79, 866-873]; [Stacey et al., J. Immunol., 1996, 157, 2116-2122]; [Messina et al., J. Immunol, 1991, 147, 1759-1764]; [Yi et al., J. Immunol, 1996, 157,4918-4925]; [Yi et al., J. Immunol, 1996, 157, 5394-5402]; [Yi et al., J. Immunol, 1998, 160, 4755-4761]; 및 [Yi et al., J. Immunol, 1998, 160, 5898-5906]; 국제 특허 출원 WO96/02555, W098/16247, WO98/18810, WO98/40100, W098/55495, W098/37919 및 W098/52581]; (8) 폴리옥시에틸렌 에테르 또는 폴리옥시에틸렌 에스테르 (예를 들어 W099/52549); (9) 옥토시놀과 조합된 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제 (WO01/21207) 또는 적어도 하나의 추가의 비-이온성 계면활성제, 예를 들어 옥토시놀과 조합된 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 또는 에스테르 계면활성제 (WO01/21152); (10) 사포닌 및 면역자극성 올리고뉴클레오티드 (예를 들어 CpG 올리고뉴클레오티드) (WO00/62800); (11) 면역자극제 및 금속염의 입자 (예를 들어 WO00/23105); (12) 사포닌 및 수중유형 에멀젼 (예를 들어 W099/11241); (13) 사포닌 (예를 들어 QS21) + 3dMPL + IM2 (임의로 + 스테롤) (예를 들어 W098/57659); (14) 조성물의 효능을 증강시키기 위한 면역자극제로서 작용하는 다른 물질, 예를 들어 무라밀 펩티드, 예를 들어 N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민 (thr-MDP), N-25 아세틸-노르무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민 (nor-MDP), N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'-디팔미토일-sn-글리세로-3-히드록시포스포릴옥시)-에틸아민 MTP-PE), (15) toll-유사 수용체 (TLR)에 대한 천연 또는 합성 리간드 (예를 들어, 문헌 [Kanzler et al. 2007, Nature Medicine 13, p1552-9]에 기재됨), 예를 들어 TLR3 리간드, 예를 들어 폴리I:C 및 유사한 화합물, 예를 들어 힐토놀 (Hiltonol) 및 암플리겐 (Ampligen).
특정 실시양태에서, 상기 아주반트는 면역자극성 올리고뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 CpG 올리고뉴클레오티드이다. 본원에서 사용되는 CpG 올리고뉴클레오티드는 면역자극성 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (CpG ODN)를 의미하고, 따라서 상기 용어는 달리 나타내지 않으면 상호교환가능하게 사용된다. 면역자극성 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드는 임의로 특정한 바람직한 염기 배경 내에 비메틸화된 시토신-구아닌 디뉴클레오티드인 하나 이상의 면역자극성 CpG 모티프를 함유한다. CpG 면역자극성 모티프의 메틸화 상태는 일반적으로 디뉴클레오티드 내의 시토신 잔기를 의미한다. 적어도 하나의 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 함유하는 면역자극성 올리고뉴클레오티드는, 포스페이트 결합에 의해 3' 구아닌에 연결된 5' 비메틸화된 시토신을 함유하고 Toll-유사 수용체 9 (TLR-9)에 대한 결합을 통해서 면역계를 활성화하는 올리고뉴클레오티드이다. 또 다른 실시양태에서, 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 TLR9를 통해 면역계를 활성화하지만 CpG 모티프(들)이 비메틸화된 것처럼 강하지는 않은 하나 이상의 메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 함유할 수 있다. CpG 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 CpG 디뉴클레오티드를 포함할 수 있는 하나 이상의 팔린드롬 (palindrome)을 포함할 수 있다. CpG 올리고뉴클레오티드는 미국 특허 6,194,388; 6,207,646; 6,214,806; 6,218,371; 6,239,116; 및 6,339,068을 비롯하여 많은 등록된 특허, 공개된 특허 출원, 및 다른 공개에 기재되어 있다.
상이한 클래스의 CpG 면역자극성 올리고뉴클레오티드가 확인되었다. 이들은 A, B, C 및 P 클래스로 언급되고, 아래에서 보다 상세하게 설명된다. 본 발명의 방법은 이들 상이한 클래스의 CpG 면역자극성 올리고뉴클레오티드의 사용을 포함한다.
임의의 클래스는 그의 효능을 향상시키는 E 변형이 적용될 수 있다. E 변형은 5' 말단 뉴클레오티드에 대한 할로겐 치환일 수 있고; 상기 치환의 예는 브로모-우리딘 또는 요오도-우리딘 치환을 포함하고 이로 제한되지 않는다. E 변형은 또한 5' 말단 뉴클레오티드에 대한 에틸-우리딘 치환을 포함할 수 있다.
"A 클래스" CpG 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 형질세포양 수지상 세포 (pDC)로부터 높은 수준의 인터페론-알파 (IFN-α)를 유도하고 B 세포 활성화에 대한 최소 효과를 가지면서 NK 세포 활성화를 유도하는 능력에 의해 기능적으로 특성화된다. 구조상, 상기 클래스는 일반적으로 5' 및 3' 말단에 안정화된 폴리-G 서열을 갖는다. 이것은 또한 적어도 6개 뉴클레오티드의 팔린드롬성 포스포디에스테르 CpG 디뉴클레오티드-함유 서열을 갖고, 반드시는 아니지만 예를 들어, 다음 육량체 팔린드롬 중의 하나를 함유한다: 문헌 [Yamamoto and colleagues. Yamamoto S et al. J. Immunol 148:4072-6 (1992)]에 기재된 GACGTC, AGCGCT, 또는 AACGTT. A 클래스 CpG 면역자극성 올리고뉴클레오티드 및 상기 클래스의 예시적인 서열은 미국 특허 출원 09/672,126 및 PCT 출원 공개 PCT/USOO/26527 (WO 01/22990) (둘 모두 2000년 9월 27일 출원됨)에 기재되어 있다.
A-클래스 올리고뉴클레오티드의 일부의 비제한적인 예는 다음을 포함한다:
여기서, *는 포스포로티오에이트 결합을 나타내고, _는 포스포디에스테르 결합을 나타낸다.
본 발명의 B 클래스 CpG 올리고뉴클레오티드 서열은 위에서 넓게 설명되고, 공개된 PCT 특허 출원 PCT/US95/01570 및 PCT/US97/19791, 및 USP 6,194,388, 6,207,646, 6,214,806, 6,218,371, 6,239,116 및 6,339,068에 개시되어 있다. 예시적인 서열은 이들 출원 및 특허에 개시된 것을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
한 실시양태에서, 본 발명의 "B 클래스" CpG 올리고뉴클레오티드는 다음 핵산 서열을 갖는다:
임의의 상기 서열에서, 모든 연결은 모든 포스포로티오에이트 결합일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 임의의 상기 서열에서, 하나 이상의 연결은 바람직하게는 반-연질 (semi-soft) CpG 올리고뉴클레오티드를 만드는 CpG 모티프의 "C"와 "G" 사이의 포스포디에스테르일 수 있다. 임의의 이들 서열에서, 에틸-우리딘 또는 할로겐은 5' T를 치환할 수 있고; 할로겐 치환의 예는 브로모-우리딘 또는 요오도-우리딘 치환을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
B-클래스 올리고뉴클레오티드의 일부의 비제한적인 예는 다음을 포함한다:
여기서, *은 포스포로티오에이트 결합을 나타낸다.
"C 클래스"의 CpG 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 B 세포 및 NK 세포를 활성화하고 IFN-α를 유도하는 능력에 의해 기능적으로 특성화된다. 구조상, 상기 클래스는 일반적으로 하나 이상의 B 클래스-타입 면역자극성 CpG 모티프를 갖는 영역, 및 분자가 2차 (예를 들어, 스템-루프) 또는 3차 (예를 들어, 이량체) 타입 구조를 형성하도록 하는 GC-풍부 팔린드롬 또는 준-팔린드롬 (near-palindrome) 영역을 포함한다. 상기 올리고뉴클레오티드의 일부는 전통적인 "자극성" CpG 서열 및 "GC-풍부" 또는 "B-세포 중화" 모티프를 모두 갖는다. 상기 조합 모티프 올리고뉴클레오티드는 전통적인 B 클래스 CpG 올리고뉴클레오티드와 연관된 효과 (즉, B 세포 활성화 및 수지상 세포 (DC) 활성화의 강한 유도)와 A 클래스 CpG ODN와 연관된 효과 (즉, IFN-α 및 NK 세포 활성화의 강한 유도, 그러나 B 세포 및 DC 활성화의 비교적 약한 유도) 사이에 해당하는 면역 자극 효과를 갖는다 ([Krieg AM et al. (1995) Nature 374:546-9]; [Ballas ZK et al. (1996) J Immunol 157: 1840-5]; [Yamamoto S et al. (1992) J Immunol 148:4072-6]).
C 클래스의 조합 모티프 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 완전히 안정화된 (예를 들어, 모든 포스포로티오에이트), 키메릭 (포스포디에스테르 중앙 영역), 또는 반-연질 (예를 들어, CpG 모티프 내의 포스포디에스테르) 백본을 가질 수 있다. 상기 클래스는 2002년 8월 19일 출원된 미국 특허 출원 US 10/224,523에서 설명되었다.
C 클래스 CpG 올리고뉴클레오티드의 한 자극성 도메인 또는 모티프는 화학식 5' X1DCGHX2 3'로 규정된다. D는 C 이외의 다른 뉴클레오티드이다. C는 시토신이다. G는 구아닌이다. H는 G 이외의 다른 뉴클레오티드이다. X1 및 X2는 0 내지 10개 뉴클레오티드 길이의 임의의 핵산 서열이다. X1은 CG이고, 이 경우에 바람직하게는 상기 CG 바로 앞에 T가 존재한다. 일부 실시양태에서, DCG는 TCG이다. X1은 바람직하게는 0 내지 6개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, X2는 임의의 폴리 G 또는 폴리 A 모티프를 함유하지 않는다. 다른 실시양태에서, 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 폴리-T 서열을 5' 말단 또는 3' 말단에 갖는다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "폴리-A" 또는 "폴리-T"는 각각 4개 이상의 연속적인 A 또는 T의 스트레치, 예를 들어, 5' AAAA 3' 또는 5' TTTT 3'을 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "폴리-G 말단"은 핵산의 5' 말단 또는 3' 말단에서 발생하는 4개 이상의 연속적인 G의 스트레치, 예를 들어, 5' GGGG 3'를 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "폴리-G 올리고뉴클레오티드"는 화학식 5' X1X2GGGX3X4 3'의 올리고뉴클레오티드를 의미하고, 여기서 X1, X2, X3, 및 X4는 뉴클레오티드이고, 바람직하게는 X3 및 X4 중의 적어도 하나는 G이다. 상기 화학식 하에서 B 세포 자극성 도메인에 대한 일부 바람직한 설계는 TTTTTCG, TCG, TTCG, TTTCG, TTTTCG, TCGT, TTCGT, TTTCGT, TCGTCGT를 포함한다.
C 클래스 CpG 올리고뉴클레오티드의 제2 모티프는 P 또는 N으로 언급되고, X1의 5'에 또는 X2의 3'에 바로 위치한다.
N은 CGG 트리뉴클레오티드로 시작하고 적어도 10개 뉴클레오티드 길이를 갖는 B 세포 중화 서열이다. B 세포 중화 모티프는 CG 앞에 C가 존재하거나 CG 뒤에 G가 존재하는 적어도 1개의 CpG 서열을 포함하거나 (Krieg AM et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95:12631-12636) 또는 CG의 C가 메틸화된 CG 함유 DNA 서열이다. 중화 모티프 또는 서열은 비-자극성 모티프에 존재할 때 어느 정도의 면역자극 능력을 갖지만, 다른 면역자극성 모티프의 배경에 존재할 때에는 다른 모티프의 면역자극 능력을 감소시키는 작용을 한다.
P는 적어도 10개 뉴클레오티드 길이의 서열을 함유하는 GC-풍부 팔린드롬이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "팔린드롬" 및 동등하게 "팔린드롬성 서열"은 반전 반복체, 즉, ABCDEE'D'C'B'A'와 같은 서열을 의미하고, 여기서 A 및 A', B 및 B' 등은 통상적인 왓슨 크릭 (Watson Crick) 염기쌍을 형성할 수 있는 염기이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "GC-풍부 팔린드롬"은 적어도 2/3의 G 및 C의 염기 조성을 갖는 팔린드롬을 의미한다. 일부 실시양태에서, GC-풍부 도메인은 바람직하게는 "B 세포 자극성 도메인"의 3'에 위치한다. 따라서, 10개 염기 길이의 GC-풍부 팔린드롬의 경우에, 팔린드롬은 적어도 8개의 G 및 C를 함유한다. 12개 염기 길이의 GC-풍부 팔린드롬의 경우에, 팔린드롬은 또한 적어도 8개의 G 및 C를 함유한다. 14-mer GC-풍부 팔린드롬의 경우에, 팔린드롬의 적어도 10개의 염기가 G 및 C이다. 일부 실시양태에서, GC-풍부 팔린드롬은 G 및 C로만 이루어진다. 일부 실시양태에서, GC-풍부 팔린드롬은 적어도 81%의 G 및 C의 염기 조성을 갖는다. 상기 10개 염기 길이의 GC-풍부 팔린드롬의 경우에, 팔린드롬은 G 및 C로만 이루어진다. 상기 12개 염기 길이의 GC-풍부 팔린드롬의 경우에, 팔린드롬의 적어도 10개의 염기 (83 %)가 G 및 C인 것이 바람직하다. 일부 바람직한 실시양태에서, 12개 염기 길이의 GC-풍부 팔린드롬은 G 및 C로만 이루어진다. 14-mer GC-풍부 팔린드롬의 경우에, 팔린드롬의 적어도 12개의 염기 (86%)가 G 및 C이다. 일부 바람직한 실시양태에서, 14개 염기 길이의 GC-풍부 팔린드롬은 G 및 C로만 이루어진다. GC-풍부 팔린드롬의 C는 비메틸화되거나 또는 메틸화될 수 있다.
일반적으로, 상기 도메인은 각각 적어도 3개, 보다 바람직하게는 4개, 가장 바람직하게는 5개 또는 그 초과의 C 및 G를 갖는다. 상기 도메인 내의 C 및 G의 수가 동일할 필요는 없다. C 및 G는 자가-상보성 이중체, 또는 팔린드롬, 예를 들어 CCGCGCGG를 형성할 수 있도록 배열되는 것이 바람직하다. 이는 A 또는 T에 의해 방해될 수 있지만, 자가-상보성은 예를 들어 모티프 CGACGTTCGTCG 또는 CGGCGCCGTGCCG에서와 같이 적어도 부분적으로 보존되는 것이 바람직하다. 상보성이 보존되지 않을 경우, 비-상보성 염기쌍은 TG가 바람직하다. 바람직한 실시양태에서, 팔린드롬의 일부가 아닌 3개 이하, 바람직하게는 2개 이하의 연속적인 염기, 가장 바람직하게는 단지 1개의 염기가 존재한다. 일부 실시양태에서, GC-풍부 팔린드롬은 적어도 1개의 CGG 삼량체, 적어도 1개의 CCG 삼량체, 또는 적어도 1개의 CGCG 사량체를 포함한다. 다른 실시양태에서, GC-풍부 팔린드롬은 CCCCCCGGGGGG 또는 GGGGGGCCCCCC, CCCCCGGGGG 또는 GGGGGCCCCC가 아니다.
GC 풍부 영역의 G 중의 적어도 하나는 이노신 (I)으로 치환될 수 있다. 일부 실시양태에서, P는 1 초과의 I를 포함한다.
특정 실시양태에서, 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 다음 화학식 중의 하나를 갖는다: 5' NX1DCGHX2 3', 5' X1DCGHX2N 3', 5' PX1DCGHX2 3', 5' X1DCGHX2P 3', 5' X1DCGHX2PX3 3', 5' X1DCGHPX3 3', 5' DCGHX2PX3 3', 5' TCGHX2PX3 3', 5' DCGHPX3 3' 또는 5' DCGHP 3'.
본 발명은 화학식 5' N1PyGN2P 3'에 의해 규정되는 다른 면역자극성 올리고뉴클레오티드를 제공한다. N1은 1 내지 6개 뉴클레오티드 길이의 임의의 서열이다. Py는 피리미딘이다. G는 구아닌이다. N2는 0 내지 30개 뉴클레오티드 길이의 임의의 서열이다. P는 적어도 10개 뉴클레오티드 길이의 서열을 함유하는 GC-풍부 팔린드롬이다. N1 및 N2는 50% 초과의 피리미딘, 보다 바람직하게는 50% 초과의 T를 함유할 수 있다. N1은 CG를 포함할 수 있고, 이 경우에 바람직하게는 상기 CG 바로 앞에 T가 존재한다. 일부 실시양태에서, N1PyG는 TCG, 가장 바람직하게는 TCGN2 (여기서, N2는 G가 아님)이다.
N1PyGN2P는 하나 이상의 이노신 (I) 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. N1 내의 C 또는 G는 이노신으로 교체될 수 있지만, CpI가 IpG보다 바람직하다. 이노신 치환, 예를 들어 IpG에 대해, 광학 활성은 IG 또는 CI 사이의 연결이 포스포디에스테르인 "반-연질" 또는 키메릭 백본의 사용에 의해 달성될 수 있다. N1은 적어도 1개의 CI, TCI, IG 또는 TIG 모티프를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, N1PyGN2는 TTTTTCG, TCG, TTCG, TTTCG, TTTTCG, TCGT, TTCGT, TTTCGT, 및 TCGTCGT로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 "C 클래스" CpG 올리고뉴클레오티드는 다음 핵산 서열을 갖는다:
임의의 상기 서열에서, 모든 연결은 모든 포스포로티오에이트 결합일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 임의의 상기 서열에서, 하나 이상의 연결은 바람직하게는 반-연질 CpG 올리고뉴클레오티드를 만드는 CpG 모티프의 "C"와 "G" 사이의 포스포디에스테르일 수 있다.
C-클래스 올리고뉴클레오티드의 비제한적인 일부 예는 다음을 포함한다:
여기서, *는 포스포로티오에이트 결합을 나타내고, _는 포스포디에스테르 결합을 나타낸다.
임의의 상기 서열에서, 에틸-우리딘 또는 할로겐은 5' T를 치환할 수 있고; 할로겐 치환의 예는 브로모-우리딘 또는 요오도-우리딘 치환을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
"P 클래스" CpG 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 WO2007/095316에 기재되어 있고, 5' 및 3' 말단에 또는 이들 말단 근처에 예를 들어 완전한 또는 불완전한 팔린드롬과 같은 이중체 형성 영역을 함유하여 보다 규칙적인 구조, 예를 들어 연쇄체 (concatamer)를 형성할 잠재력을 제시한다는 사실을 특징으로 한다. P-클래스 올리고뉴클레오티드로 언급되는 이들 올리고뉴클레오티드는 일부 경우에 C-클래스보다 훨씬 높은 수준의 IFN-α 분비를 유도하는 능력을 갖는다. P-클래스 올리고뉴클레오티드는 시험관 내에서 및/또는 생체 내에서 연쇄체로 자연적으로 자가조립되는 능력을 갖는다. 이들 분자의 작용 방법에 대해 임의의 특정 이론에 얽매이지 않으면서, 하나의 잠재적인 가설은 상기 특성이 특정 면역 세포 내의 TLR9에 보다 고도로 가교결합하여, 이전에 설명된 P-클래스 CpG 올리고뉴클레오티드에 비해 면역 활성화의 상이한 패턴을 유도하는 능력을 부여한다는 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명에서 사용하기 위한 CpG 올리고뉴클레오티드는 5' TLR 활성화 도메인 및 적어도 2개의 팔린드롬성 영역을 함유하는 P 클래스 CpG 올리고뉴클레오티드이고, 여기서 1개의 팔린드롬성 영역은 적어도 6개 뉴클레오티드 길이의 5' 팔린드롬성 영역이고 적어도 8개 뉴클레오티드 길이의 3' 팔린드롬성 영역에 직접 또는 스페이서를 통해 연결되고, 올리고뉴클레오티드는 적어도 1개의 YpR 디뉴클레오티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 가 아니다. 하나의 실시양태에서, P 클래스 CpG 올리고뉴클레오티드는 적어도 1개의 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, TLR 활성화 도메인은 TCG, TTCG, TTTCG, TYpR, TTYpR, TTTYpR, UCG, UUCG, UUUCG, TTT, 또는 TTTT이다. 또 다른 실시양태에서, TLR 활성화 도메인은 5' 팔린드롬성 영역 내에 있다. 또 다른 실시양태에서, TLR 활성화 도메인은 5' 팔린드롬성 영역의 5'에 바로 위치한다. 또 다른 실시양태에서, 5' 팔린드롬성 영역은 적어도 8개 뉴클레오티드 길이이다. 또 다른 실시양태에서, 3' 팔린드롬성 영역은 적어도 10개 뉴클레오티드 길이이다. 또 다른 실시양태에서, 5' 팔린드롬성 영역은 적어도 10개 뉴클레오티드 길이이다. 또 다른 실시양태에서, 3' 팔린드롬성 영역은 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 3' 팔린드롬성 영역은 2개의 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 5' 팔린드롬성 영역은 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 5' 팔린드롬성 영역은 2개의 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 5' 및 3' 팔린드롬성 영역은 적어도 25의 이중체 안전성 값을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 5' 및 3' 팔린드롬성 영역은 적어도 30의 이중체 안전성 값을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 5' 및 3' 팔린드롬성 영역은 적어도 35의 이중체 안전성 값을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 5' 및 3' 팔린드롬성 영역은 적어도 40의 이중체 안전성 값을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 5' 및 3' 팔린드롬성 영역은 적어도 45의 이중체 안전성 값을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 5' 및 3' 팔린드롬성 영역은 적어도 50의 이중체 안전성 값을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 5' 및 3' 팔린드롬성 영역은 적어도 55의 이중체 안전성 값을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 5' 및 3' 팔린드롬성 영역은 적어도 60의 이중체 안전성 값을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 5' 및 3' 팔린드롬성 영역은 적어도 65의 이중체 안전성 값을 갖는다.
하나의 실시양태에서, 2개의 팔린드롬성 영역은 직접 연결된다. 또 다른 실시양태에서, 2개의 팔린드롬성 영역은 3'-3' 연결을 통해 연결된다. 또 다른 실시양태에서, 2개의 팔린드롬성 영역은 1개의 뉴클레오티드가 겹친다. 또 다른 실시양태에서, 2개의 팔린드롬성 영역은 2개의 뉴클레오티드가 겹친다. 또 다른 실시양태에서, 2개의 팔린드롬성 영역은 겹치지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 2개의 팔린드롬성 영역은 스페이서에 의해 연결된다. 하나의 실시양태에서, 스페이서는 길이가 1-50개 뉴클레오티드인 핵산이다. 또 다른 실시양태에서, 스페이서는 길이가 1개 뉴클레오티드인 핵산이다. 또 다른 실시양태에서, 스페이서는 비-뉴클레오티드 스페이서이다. 하나의 실시양태에서, 비-뉴클레오티드 스페이서는 D-스페이서이다. 또 다른 실시양태에서, 비-뉴클레오티드 스페이서는 링커이다. 하나의 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 화학식 5' XP1SP2T 3'을 갖고, 여기서 X는 TLR 활성화 도메인이고, P1은 팔린드롬이고, S는 스페이서이고, P2는 팔린드롬이고, T는 0-100개 뉴클레오티드 길이의 3' 테일이다. 하나의 실시양태에서, X는 TCG, TTCG, 또는 TTTCG이다. 또 다른 실시양태에서, T는 5-50개 뉴클레오티드 길이이다. 또 다른 실시양태에서, T는 5-10개 뉴클레오티드 길이이다. 하나의 실시양태에서, S는 길이가 1-50개 뉴클레오티드인 핵산이다. 또 다른 실시양태에서, S는 길이가 1개 뉴클레오티드인 핵산이다. 또 다른 실시양태에서, S는 비-뉴클레오티드 스페이서이다. 하나의 실시양태에서, 비-뉴클레오티드 스페이서는 D-스페이서이다. 또 다른 실시양태에서, 비-뉴클레오티드 스페이서는 링커이다. 또 다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 리보자임이 아니다. 하나의 실시양태에서, P1은 A 및 T 풍부 서열이다. 또 다른 실시양태에서, P1은 적어도 4개의 T를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, P2는 완전한 팔린드롬이다. 또 다른 실시양태에서, P2는 G-C 풍부 서열이다. 또 다른 실시양태에서, P2는 CGGCGCX1GCGCCG이고, 여기서 X1은 T이거나 또는 아무것도 아니다.
하나의 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 1개의 포스포로티오에이트 연결을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 모든 뉴클레오티드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다. 또 다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 1개의 포스포디에스테르-유사 연결을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 포스포디에스테르-유사 연결은 포스포디에스테르 연결이다. 또 다른 실시양태에서, 친지성 기가 올리고뉴클레오티드에 접합된다. 하나의 실시양태에서, 친지성 기는 콜레스테롤이다.
한 실시양태에서, 본 발명에서 사용하기 위한 TLR-9 효현제는 5' TLR 활성화 도메인 및 적어도 2개의 상보성-함유 영역, 5' 및 3' 상보성-함유 영역을 갖는 P 클래스 CpG 올리고뉴클레오티드이고, 각각의 상보성-함유 영역은 적어도 8개 뉴클레오티드 길이이고 직접 또는 스페이서를 통해 서로 연결되고, 여기서 올리고뉴클레오티드는 적어도 1개의 피리미딘-퓨린 (YpR) 디뉴클레오티드를 포함하고, 적어도 1개의 상보성-함유 영역은 완전한 팔린드롬이 아니다. 하나의 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 1개의 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, TLR 활성화 도메인은 TCG, TTCG, TTTCG, TYpR, TTYpR, TTTYpR, UCG, UUCG, UUUCG, TTT, 또는 TTTT이다. 또 다른 실시양태에서, TLR 활성화 도메인은 5' 상보성-함유 영역 내에 있다. 또 다른 실시양태에서, TLR 활성화 도메인은 5' 상보성-함유 영역의 5'에 바로 위치한다. 또 다른 실시양태에서, 3' 상보성-함유 영역은 적어도 10개 뉴클레오티드 길이이다. 또 다른 실시양태에서, 5' 상보성-함유 영역은 적어도 10개 뉴클레오티드 길이이다. 하나의 실시양태에서, 3' 상보성-함유 영역은 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 3' 상보성-함유 영역은 2개의 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 5' 상보성-함유 영역은 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 5' 상보성-함유 영역은 2개의 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상보성-함유 영역은 적어도 1개의 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상보성-함유 영역은 분자내 이중체를 형성한다. 하나의 실시양태에서, 분자내 이중체는 적어도 1개의 비-왓슨 크릭 염기쌍을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 비-왓슨 크릭 염기쌍은 G-T, G-A, G-G, 또는 C-A이다. 하나의 실시양태에서, 상보성-함유 영역은 분자간 이중체를 형성한다. 또 다른 실시양태에서, 분자간 이중체의 적어도 1개는 적어도 1개의 비-왓슨 크릭 염기쌍을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 비-왓슨 크릭 염기쌍은 G-T, G-A, G-G, 또는 C-A이다. 또 다른 실시양태에서, 상보성-함유 영역은 1개의 미스매치 (mismatch)를 함유한다. 또 다른 실시양태에서, 상보성-함유 영역은 2개의 미스매치를 함유한다. 또 다른 실시양태에서, 상보성-함유 영역은 개재 (intervening) 뉴클레오티드를 함유한다. 또 다른 실시양태, 상보성-함유 영역은 2개의 개재 뉴클레오티드를 함유한다.
하나의 실시양태에서, 5' 및 3' 상보성-함유 영역은 적어도 25의 이중체 안전성 값을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 5' 및 3' 상보성-함유 영역은 적어도 30의 이중체 안전성 값을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 5' 및 3' 상보성-함유 영역은 적어도 35의 이중체 안전성 값을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 상보성-함유 영역은 적어도 40의 이중체 안전성 값을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 상보성-함유 영역은 적어도 45의 이중체 안전성 값을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 상보성-함유 영역은 적어도 50의 이중체 안전성 값을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 상보성-함유 영역은 적어도 55의 이중체 안전성 값을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 상보성-함유 영역은 적어도 60의 이중체 안전성 값을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 상보성-함유 영역은 적어도 65의 이중체 안전성 값을 갖는다.
또 다른 실시양태에서, 2개의 상보성-함유 영역은 직접 연결된다. 또 다른 실시양태에서, 2개의 팔린드롬성 영역은 3'-3' 연결을 통해 연결된다. 또 다른 실시양태에서, 2개의 상보성-함유 영역은 1개의 뉴클레오티드가 겹친다. 또 다른 실시양태에서, 2개의 상보성-함유 영역은 2개의 뉴클레오티드가 겹친다. 또 다른 실시양태에서, 2개의 상보성-함유 영역은 겹치지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 2개의 상보성-함유 영역은 스페이서에 의해 연결된다. 또 다른 실시양태에서, 스페이서는 길이가 1-50개 뉴클레오티드인 핵산이다. 또 다른 실시양태에서, 스페이서는 길이가 1개 뉴클레오티드인 핵산이다. 하나의 실시양태에서, 스페이서는 비-뉴클레오티드 스페이서이다. 또 다른 실시양태에서, 비-뉴클레오티드 스페이서는 D-스페이서이다. 또 다른 실시양태에서, 비-뉴클레오티드 스페이서는 링커이다.
하나의 실시양태에서, P-클래스 올리고뉴클레오티드 화학식 5' XNSPT 3'을 갖고, 여기서 X는 TLR 활성화 도메인이고, N은 비-완전한 팔린드롬이고, P는 팔린드롬이고, S는 스페이서이고, T는 0-100개 뉴클레오티드 길이의 3' 테일이다. 또 다른 실시양태에서, X는 TCG, TTCG, 또는 TTTCG이다. 또 다른 실시양태에서, T는 5-50개 뉴클레오티드 길이이다. 또 다른 실시양태에서, T는 5-10개 뉴클레오티드 길이이다. 또 다른 실시양태에서, S는 길이가 1-50 뉴클레오티드인 핵산이다. 또 다른 실시양태에서, S는 길이가 1개 뉴클레오티드인 핵산이다. 또 다른 실시양태에서, S는 비-뉴클레오티드 스페이서이다. 또 다른 실시양태에서, 비-뉴클레오티드 스페이서는 D-스페이서이다. 또 다른 실시양태에서, 비-뉴클레오티드 스페이서는 링커이다. 또 다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 리보자임이 아니다. 또 다른 실시양태에서, N은 A 및 T 풍부 서열이다. 또 다른 실시양태에서, N은 적어도 4개의 T를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, P는 완전한 팔린드롬이다. 또 다른 실시양태에서, P는 G-C 풍부 서열이다. 또 다른 실시양태에서, P는 CGGCGCX1GCGCCG이고, 여기서 X1은 T이거나 또는 아무것도 아니다. 또 다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 1개의 포스포로티오에이트 연결을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 모든 뉴클레오티드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다. 또 다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 1개의 포스포디에스테르-유사 연결을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 포스포디에스테르-유사 연결은 포스포디에스테르 연결이다. 또 다른 실시양태에서, 친지성 기가 올리고뉴클레오티드에 접합된다. 하나의 실시양태에서, 친지성 기는 콜레스테롤이다.
상기 서열에서, 모든 연결은 모든 포스포로티오에이트 결합일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 연결은 바람직하게는 반-연질 CpG 올리고뉴클레오티드를 만드는 CpG 모티프의 "C"와 "G" 사이의 포스포디에스테르일 수 있다. 임의의 이들 서열에서, 에틸-우리딘 또는 할로겐은 5' T를 치환할 수 있고; 할로겐 치환의 예는 브로모-우리딘 또는 요오도-우리딘 치환을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
P-클래스 올리고뉴클레오티드의 비-제한적인 예는 다음을 포함한다:
여기서, *는 포스포로티오에이트 결합을 나타내고, _는 포스포디에스테르 결합을 나타낸다.
한 실시양태에서, 본원에 개시된 CpG 올리고뉴클레오티드의 모든 뉴클레오티드간 연결은 포스포디에스테르 결합 (PCT 출원 WO2007/026190에 기재된 "연질" 올리고뉴클레오티드)이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 CpG 올리고뉴클레오티드는 분해에 대해 저항성으로 된다 (예를 들어, 안정화된다). "안정화된 올리고뉴클레오티드"는 생체내 분해에 대해 비교적 저항성 (예를 들어 엑소- 또는 엔도-뉴클레아제를 통한)인 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 핵산 안정화는 백본 변형을 통해 달성할 수 있다. 포스포로티오에이트 연결을 갖는 올리고뉴클레오티드는 최대 활성을 제공하고, 세포내 엑소- 및 엔도-뉴클레아제에 의한 분해로부터 올리고뉴클레오티드를 보호한다.
면역자극성 올리고뉴클레오티드는 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트 연결의 조합을 갖는 키메릭 백본을 가질 수 있다. 본 발명의 목적에서, 키메릭 백본은 부분적으로 안정화된 백본을 나타내고, 여기서 적어도 1개의 뉴클레오티드간 연결은 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 연결이고, 적어도 1개의 다른 뉴클레오티드간 연결은 안정화된 뉴클레오티드간 연결이고, 여기서 적어도 1개의 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 연결 및 적어도 1개의 안정화된 연결은 상이하다. 포스포디에스테르 연결이 CpG 모티프 내에 우세하게 위치할 때, 상기 분자는 PCT 출원 WO2007/026190에 기재된 바와 같이 "반-연질"로 불린다.
다른 변형된 올리고뉴클레오티드는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 메틸포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 및/또는 p-에톡시 연결의 조합을 포함한다.
보라노포스포네이트 연결은 포스포디에스테르 연결에 비해 안정화된 것으로 보고되었기 때문에, 백본의 키메릭 특성을 위해, 보라노포스포네이트 연결은 배경에 따라 포스포디에스테르-유사 또는 안정화된 것으로 분류될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 키메릭 백본은 일부 실시양태에서 적어도 1개의 포스포디에스테르 (포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사) 연결 및 적어도 1개의 보라노포스포네이트 (안정화된) 연결을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 키메릭 백본은 보라노포스포네이트 (포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사) 및 포스포로티오에이트 (안정화된) 연결을 포함할 수 있다. "안정화된 뉴클레오티드간 연결"은 포스포디에스테르 뉴클레오티드간 연결에 비해 생체내 분해에 비교적 저항성 (예를 들어, 엑소- 또는 엔도-뉴클레아제를 통한)인 뉴클레오티드간 연결을 의미한다. 바람직한 안정화된 뉴클레오티드간 연결은 비제한적으로, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 메틸포스포네이트, 및 메틸포스포로티오에이트를 포함한다. 다른 안정화된 뉴클레오티드간 연결은 비제한적으로 펩티드, 알킬, 데포스포, 및 상기 설명한 다른 것을 포함한다.
변형된 백본, 예를 들어 포스포로티오에이트는 포스포르아미데이트 또는 H-포스포네이트 화학을 사용하는 자동화 기술을 이용하여 합성할 수 있다. 아릴- 및 알킬-포스포네이트는 예를 들어 미국 특허 4,469,863에 기재된 바와 같이 제조할 수 있고; 알킬포스포트리에스테르 (하전된 산소 모이어티는 미국 특허 5,023,243 및 유럽 특허 092,574에 기재된 바와 같이 알킬화된다)는 시판 시약을 사용하는 자동화 고체상 합성에 의해 제조할 수 있다. 다른 DNA 백본 변형 및 치환을 시행하는 방법은 문헌에 설명되어 있다 ([Uhlmann E et al. (1990) Chem Rev 90:544]; [Goodchild J (1990) Bioconjugate Chem 1:165]). 키메릭 올리고뉴클레오티드의 제조 방법은 또한 공지되어 있다. 예를 들어, 울만 등 (Uhlmann et al.)의 등록된 특허에서 상기 기술이 기재되어 있다.
혼합된 백본 변형 ODN은 PCT 출원 공개 WO2007/026190에 기재된 바와 같이 합성할 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 또한 다른 변형을 포함할 수 있다. 이들은 비이온성 DNA 유사체, 예를 들어 알킬- 및 아릴-포스페이트 (여기서, 하전된 포스포네이트 산소는 알킬 또는 아릴기로 교체된다), 포스포디에스테르 및 알킬포스포트리에스테르를 포함하고, 여기서 하전된 산소 모이어티는 알킬화된다. 디올, 예를 들어 테트라에틸렌글리콜 또는 헥사에틸렌글리콜을 한 말단 또는 두 말단 모두에 함유하는 핵산도 뉴클레아제 분해에 대해 실질적으로 저항성인 것으로 밝혀졌다.
CpG 올리고뉴클레오티드의 크기 (즉, 올리고뉴클레오티드의 길이를 따른 뉴클레오티드 잔기의 수)가 또한 올리고뉴클레오티드의 자극 활성에 기여할 수 있다. 세포 내로의 흡수를 촉진하기 위해, 본 발명의 CpG 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 6개 뉴클레오티드 잔기의 최소 길이를 갖는다. 6개 초과의 뉴클레오티드의 임의의 크기 (심지어 수 kb 길이)의 올리고뉴클레오티드는 충분한 면역자극성 모티프가 존재하면 면역 반응을 유도할 수 있고, 그 이유는 보다 큰 올리고뉴클레오티드가 세포 내부에서 분해되기 때문이다. 특정 실시양태에서, CpG 올리고뉴클레오티드는 6 내지 100개 뉴클레오티드, 우세하게는 8 내지 30개 뉴클레오티드 길이이다. 중요한 실시양태에서, 본 발명의 핵산 및 올리고뉴클레오티드는 플라스미드 또는 발현 벡터가 아니다.
한 실시양태에서, 본원에 개시된 CpG 올리고뉴클레오티드는 WO2007/026190의 문단 134 내지 147에 기재된 바와 같이 염기 및/또는 당 내에 치환 또는 변형을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 CpG 올리고뉴클레오티드는 화학적으로 변형된다. 화학적 변형의 예는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Uhlmann E. et al. (1990), Chem. Rev. 90:543], [S. Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa, USA 1993]; [Crooke, S.T. et al. (1996) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 36: 107-129]; 및 [Hunziker J. et al., (1995), Mod. Synth. Methods 7:331-417]에 기재되어 있다. 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형을 가질 수 있고, 각각의 변형은 특정 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 다리에 및/또는 특정 β-D-리보스 단위에 및/또는 천연 DNA 또는 RNA로 이루어진 동일한 서열의 올리고뉴클레오티드에 비해 특정 천연 뉴클레오시드 염기 위치에 존재한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, CpG-함유 핵산은 당업자에게 공지된 방법에 따라 면역원성 담체와 간단히 혼합될 수 있다 (예를 들어, WO03/024480 참조).
본 발명의 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 임의의 백신은 20 ㎍ 내지 20 mg의 CpG 올리고뉴클레오티드, 바람직하게는 0.1 mg 내지 10 mg CpG 올리고뉴클레오티드, 바람직하게는 0.2 mg 내지 5 mg CpG 올리고뉴클레오티드, 바람직하게는 0.3 mg 내지 3 mg CpG 올리고뉴클레오티드, 훨씬 바람직하게는 0.4 내지 2 mg CpG 올리고뉴클레오티드, 훨씬 바람직하게는 0.5 내지 1.5 mg CpG 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 본원에 개시된 임의의 백신은 약 0.5 내지 1 mg CpG 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명에 사용하기 바람직한 아주반트는 백반, QS21, CpG ODN, CpG ODN과 조합된 백반, 이스코매트릭스 및 CpG ODN과 조합된 이스코매트릭스이다.
본 발명의 제약 조성물
또한, 본 발명은 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제(들)와 회합되고 임의로 하나 이상의 아주반트 (상기한 아주반트로서)와 조합된 제형 내의 본 발명의 항원성 PCSK9 펩티드 또는 그의 면역원성 조성물을 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 용어 '부형제'는 본원에서 활성 성분, 즉 최종적으로 면역원성 담체에 커플링되고 임의로 하나 이상의 아주반트와 조합된 본 발명의 항원성 PCSK9 펩티드 이외의 임의의 다른 성분을 설명하기 위해 사용된다. 부형제(들)의 선택은 특정 투여 방식, 용해도 및 안전성에 대한 부형제의 효과, 및 투여 형태의 특성과 같은 요인에 따라 크게 결정될 것이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "제약상 허용되는 부형제"는 생리학상 적합성인 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 제약상 허용되는 부형제의 일부 예는 물, 염수, 포스페이트 완충 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등, 및 이들의 조합물이다. 많은 경우에, 등장제, 예를 들어, 당, 다가 알콜, 예를 들어 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 조성물에 포함하는 것이 바람직할 것이다. 제약상 허용되는 물질의 추가의 예는 활성 성분의 유효 기한 또는 유효성을 향상시키는 습윤제 또는 소량의 보조 물질, 예를 들어 습윤제 또는 유화제, 보존제 또는 버퍼이다.
본 발명의 제약 조성물 및 그의 제조 방법은 당업자에게 자명할 것이다. 그러한 조성물 및 그의 제조 방법은 예를 들어 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company, 1995)]에서 볼 수 있다. 제약 조성물은 바람직하게는 GMP 조건 하에서 제조된다.
본 발명의 제약 조성물은 대량으로, 단일 단위 용량, 또는 다수의 단일 단위 용량으로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "단위 용량"은 소정량의 활성 성분을 포함하는 제약 조성물의 분리된 양이다. 활성 성분의 양은 일반적으로 대상체에게 투여되는 투여량 또는 상기 투여량의 편리한 비율, 예를 들어 상기 투여량의 1/2 또는 1/3과 같다.
당업계에서 수용되는 펩티드, 또는 단백질의 투여를 위한 임의의 방법이 본 발명의 펩티드 또는 단백질에 대해 적절하게 사용될 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 일반적으로 비경구 투여에 적합하다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 제약 조성물의 "비경구 투여"는 대상체의 조직에 물리적으로 구멍을 만들고 조직 내 구멍을 통해 제약 조성물을 투여함으로써, 일반적으로 혈류, 근육 또는 내부 장기 내로 직접 투여하는 것을 특징으로 하는 임의의 투여 경로를 포함한다. 따라서, 비경구 투여는 조성물의 주사, 수술적 절개를 통한 조성물의 적용, 조직 투과 비-수술적 상처를 통한 조성물의 적용에 의한 제약 조성물의 투여 등을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 특히, 비경구 투여는 피하, 복강내, 근육내, 흉골내, 정맥내, 동맥내, 경막내, 뇌실내, 요도내, 두개내, 활막내 주사 또는 주입; 및 신장 투석 주입 기술을 포함하고 이로 제한되지 않는 것으로 고려된다. 바람직한 실시양태는 정맥내, 피하, 피내 및 근육내 경로를 포함하고, 훨씬 더 바람직한 실시양태는 근육내 또는 피하 경로이다.
비경구 투여에 적합한 제약 조성물의 제형은 일반적으로 제약상 허용되는 담체, 예를 들어 멸균수 또는 멸균 등장 염수와 조합된 활성 성분을 포함한다. 상기 제형은 볼러스 (bolus) 투여 또는 연속 투여에 적합한 형태로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 주사가능 제형은 단위 투여 형태, 예를 들어 앰퓰 또는 보존제를 함유하는 다중 용량 용기로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 비경구 투여용 제형은 현탁액, 용액, 유성 또는 수성 비히클 내의 에멀젼, 페이스트 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 상기 제형은 현탁제, 안정화제, 또는 분산제를 포함하고 이로 제한되지 않는 하나 이상의 추가의 성분을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여를 위한 제형의 하나의 실시양태에서, 활성 성분은 재구성되는 조성물의 비경구 투여 전에 적합한 비히클 (예를 들어 멸균 발열원 미함유 물)로 재구성을 위한 건조 (즉, 분말 또는 과립) 형태로 제공된다. 비경구 제형은 또한 부형제, 예를 들어 염, 탄수화물 및 완충제 (바람직하게는 3 내지 9의 pH)를 함유할 수 있는 수용액을 포함하지만, 일부 용도에서는 멸균 비-수성 용액으로서 또는 적합한 비히클, 예를 들어 멸균, 발열원 미함유 물과 함께 사용되는 건조 형태로서 보다 적절하게 제형화될 수 있다. 예시적인 비경구 투여 형태는 멸균 수용액, 예를 들어, 수성 프로필렌 글리콜 또는 덱스트로스 용액 내의 용액 또는 현탁액을 포함한다. 상기 투여 형태는 필요한 경우 적절하게 완충될 수 있다. 유용한 다른 비경구 투여가능 제형은 미세결정질 형태, 마이크로입자, 또는 리포좀 제제 내에 활성 성분을 포함하는 제형을 포함한다. 비경구 투여를 위한 제형은 즉시 및/또는 변형된 방출 형태로 제형화될 수 있다. 변형된 방출 제형은 지연, 지속, 펄스형, 제어, 표적화 및 프로그래밍된 방출을 포함한다.
예를 들어, 한 측면에서, 멸균 주사가능 용액은 바람직하게는 면역원성 담체에 커플링된 항-PCSK9 펩티드를, 필요한 경우 상기 나열된 성분 중의 하나 또는 성분들의 조합물과 함께 적절한 용매 내에 요구되는 양으로 임의로 하나 이상의 아주반트와 조합하여 혼입한 후, 멸균 여과함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 염기성 분산 매질 및 상기 나열한 것과 다른 요구되는 성분을 함유하는 멸균 비히클 내에 활성 화합물을 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사가능 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 앞서 멸균-여과된 그의 용액으로부터 활성 성분 + 임의의 추가의 요구되는 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결건조이다. 용액의 적절한 유동성은 예를 들어 코팅, 예를 들어 레시틴의 사용, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 조성물에 흡수 지연제, 예를 들어, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 포함시킴으로써 유도될 수 있다.
본 발명의 예시적인, 비-제한적인 제약 조성물은 pH가 약 5.0 내지 약 6.5이고 약 0.1 mg/mL 내지 약 20 mg/mL의 본 발명의 펩티드, 약 1 밀리몰 내지 약 100 밀리몰의 히스티딘 버퍼, 약 0.01 mg/mL 내지 약 10 mg/mL의 폴리소르베이트 80, 약 100 밀리몰 내지 약 400 밀리몰의 트레할로스, 및 약 0.01 밀리몰 내지 약 1.0 밀리몰의 이나트륨 EDTA 이수화물을 포함하는 멸균 수용액으로서의 제형이다.
또한, 본 발명의 항원성 PCSK9 펩티드는 일반적으로 건조 분말 흡입기로부터 건조 분말의 형태로 (단독으로, 혼합물로서, 또는 예를 들어 적합한 제약상 허용되는 부형제와 혼합된 혼합 성분 입자로서), 적합한 추진제를 사용하거나 사용하지 않으면서 가압 용기, 펌프, 스프레이, 분무기 (atomiser) (바람직하게는 미세 연무를 생성하기 위해 전기수력학을 이용하는 분무기), 또는 연무기 (nebuliser)로부터 에어로졸 스프레이로서, 또는 점비제로서 비내로 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다.
가압 용기, 펌프, 스프레이, 분무기, 또는 연무기는 일반적으로 예를 들어 활성 물질의 분산, 용해 또는 방출 연장을 위해 적합한 물질인 추진제(들)를 용매로서 포함하는, 본 발명의 항체의 용액 또는 현탁액을 함유한다.
건조 분말 또는 현탁액 제형으로 사용하기 전에, 약품은 일반적으로 흡입에 의한 전달에 적합한 크기 (대개 5 마이크로미터 미만)로 미분화된다. 이것은 임의의 적절한 분쇄 방법, 예를 들어 나선 제트 밀링, 유동층 제트 밀링, 나노입자 형성을 위한 초임계 유체 처리, 고압 균질화, 또는 스프레이 건조에 의해 수행될 수 있다.
흡입기 또는 취입기 (insufflator)에 사용하기 위한 캡슐, 블리스터 (blister) 및 카트리지는 본 발명의 화합물, 적합한 분말 베이스 및 성능 변경제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화될 수 있다.
미세 연무를 생성하기 위해 전기수력학을 이용하는 분무기에 사용하기 적합한 용액 제형은 작동당 적합한 용량의 본 발명의 항원성 PCSK9 펩티드를 함유할 수 있고, 작동 부피는 예를 들어 1 μL 내지 100μL로 상이할 수 있다.
적합한 향미제, 예를 들어 멘톨 및 레보멘톨, 또는 감미제, 예를 들어 사카린 또는 사카린 나트륨이 흡입/비내 투여가 의도되는 본 발명의 제형에 첨가될 수 있다.
흡입/비내 투여를 위한 제형은 즉시 및/또는 변형된 방출 형태로 제형화될 수 있다. 변형된 방출 제형은 지연, 지속, 펄스형, 제어, 표적화 및 프로그래밍된 방출을 포함한다.
건조 분말 흡입기 및 에어로졸의 경우에, 투여 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브에 의해 결정된다. 본 발명에 따른 장치는 일반적으로 본 발명의 항체의 계량된 용량 또는 "1회 흡입량 (puff)'을 투여하기 위해 배열된다. 전체 일일 용량은 일반적으로 단일 용량으로 또는 보다 일반적으로는 하루 내내 분할된 용량으로 투여될 것이다.
항원성 PCSK9 펩티드를 포함하는 제약 조성물은 또한 경구 경로 투여를 위해 제형화될 수 있다. 경구 투여는 화합물이 위장관에 들어가도록 삼키는 것 및/또는 화합물이 입으로부터 직접 혈류 내로 들어가도록 하는 입안, 혀, 또는 설하 투여를 수반할 수 있다.
경구 투여에 적합한 제형은 고체, 반-고체 및 액체 시스템, 예를 들어 정제; 다중 입자 또는 나노입자, 액체, 또는 분말을 함유하는 연질 또는 경질 캡슐; 로젠지 (액체-충전형 포함); 츄잉제 (chew); 겔; 신속 분산 투여 형태; 필름; 오뷸 (ovule); 스프레이; 및 입안/점막점착성 패치를 포함한다.
액체 제형은 현탁액, 용액, 시럽 및 엘릭시르제를 포함한다. 상기 제형은 연질 또는 경질 캡슐 (예를 들어, 젤라틴 또는 히드록시프로필메틸셀룰로스) 내의 충전제로서 사용될 수 있고, 일반적으로 담체, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 메틸셀룰로스, 또는 적합한 오일, 및 하나 이상의 유화제 및/또는 현탁화제를 포함한다. 또한, 액체 제형은 예를 들어 향낭 (sachet)으로부터 고체의 재구성에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 조성물은 면역요법에 의해 PCSK9-매개 장애 또는 증상의 위험이 있거나 이로 고통받는 대상체에서 면역 반응을 자극함으로써 상기 대상체에서 상기 장애 또는 증상을 치료, 완화 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다. 면역요법은 초기 면역화, 이어서 추가의, 예를 들어 1, 2, 3회 이상의 추가접종 (booster)을 포함할 수 있다.
본 발명의 항원성 PCSK9 펩티드, 또는 그의 조성물의 "면역학상 유효량"은 포유동물 대상체에서 PCSK9에 대한 면역 반응 유도에 효과적인, 단일 용량으로 또는 일련의 투여의 일부로서 포유동물 대상체에 전달되는 양이다. 상기 양은 치료되는 개체의 건강 및 신체적 상태, 치료되는 개체의 분류 집단, 항체를 합성하는 개체의 면역계의 능력, 백신의 제형, 및 다른 관련 인자에 따라 상이하다. 이 양은 일상적인 시험을 통해 결정할 수 있는 비교적 넓은 범위에 해당할 것으로 예상된다.
"제약 유효 용량" 또는 "치료 유효 용량"은 대상체에서 하나 이상의 PCSK9-관련 장애 또는 증상을 치료 또는 예방하거나 완화시키기 위해 요구되는 용량이다. 제약 유효 용량은 특히 투여되는 특정 화합물, 증상의 심도, 대상체의 부작용에 대한 감수성, 질환의 종류, 사용된 조성물, 투여 경로, 치료받는 포유동물의 종류, 치료되는 특정 포유동물의 신체적 특성, 예를 들어 건강 및 신체적 상태, 동시에 투여되는 약물, 개체의 면역계의 항체를 합성하는 능력, 요구되는 보호의 정도, 및 의료 분야의 숙련인이 인식하는 다른 인자에 따라 결정된다. 예방 목적을 위해, 각각의 용량 내의 펩티드의 양은 전형적인 백신에서 심각한 유해 부작용을 보이지 않으면서 면역보호 반응을 유도하는 양으로서 선택된다. 초기 백신접종 후에, 대상체에게 1회 또는 적절한 간격으로 몇몇의 추가접종을 실시할 수 있다.
임의의 특정 환자에 대한 특이적인 용량 수준은 사용되는 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 전반적인 건강, 성별, 섭생, 투여 시간, 투여 경로, 및 배설 속도, 약물 조합 및 요법이 시행되는 특정 질환의 심도를 포함하는 다양한 요인에 따라 결정됨이 이해된다.
예를 들어, 본 발명의 항원성 PCSK9 펩티드 또는 제약 조성물은 대상체에게 약 0.1 ㎍ 내지 약 5 mg, 예를 들어, 약 0.1 ㎍ 내지 약 5 ㎍, 약 5 ㎍ 내지 약 10 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 25 ㎍, 약 25 ㎍ 내지 약 50 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 100 ㎍, 약 100 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 약 500 ㎍ 내지 약 1 mg, 약 1 mg 내지 약 2 mg의 용량으로 투여되고, 예를 들어 1주, 2주, 3주, 4주, 2개월, 3개월, 6개월 및/또는 1년 후에 임의의 추가접종을 실시할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 항원성 PCSK9 펩티드 또는 제약 조성물의 단일 용량이 투여된다. 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 항원성 PCSK9 펩티드 또는 제약 조성물의 다수 용량이 투여된다. 투여 빈도는 임의의 다양한 인자, 예를 들어, 증상의 심도, 요구되는 면역보호의 정도, 조성물이 예방 또는 치유 목적을 위해 사용되는 지의 여부 등에 따라 상이할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 항원성 PCSK9 펩티드 또는 제약 조성물은 매월 1회, 매월 2회, 매월 3회, 격주 (qow), 매주 1회 (qw), 매주 2회 (biw), 매주 3회 (tiw), 매주 4회, 매주 5회, 매주 6회, 격일 (qod), 매일 (qd), 매일 2회 (qid), 또는 매일 3회 (tid) 투여된다. 본 발명의 조성물이 예방 목적으로 사용될 때, 이는 일반적으로 프라이밍 (priming) 및 추가접종 용량 모두를 위해 투여될 것이다. 추가접종 용량은 적절한 간격으로 투여되거나, 또는 바람직하게는 매년 또는 순환 항체의 수준이 요구되는 수준 미만으로 저하되는 시기에 제공될 것으로 예상된다. 추가접종 용량은 본래의 면역원성 담체 분자의 부재 하에 항원성 PCSK9 펩티드로 구성될 수 있다. 상기 추가접종 용량은 다른 면역원성 담체를 포함할 수 있거나 또는 임의의 담체를 포함하지 않을 수 있다. 상기 추가접종 조성물은 아주반트와 함께 또는 그 없이 제형화될 수 있다.
본 발명에 따른 항원성 PCSK9 펩티드의 투여 기간, 예를 들어 항원성 PCSK9 펩티드가 그에 걸쳐서 투여되는 기간은 예를 들어 환자 반응 등과 같은 임의의 다양한 요인에 따라 상이할 수 있다. 예를 들어, 항원성 PCSK9 펩티드는 약 1일 내지 약 1주, 약 2주 내지 약 4주, 약 1개월 내지 약 2개월, 약 2개월 내지 약 4개월, 약 4개월 내지 약 6개월, 약 6개월 내지 약 8개월, 약 8개월 내지 약 1년, 약 1년 내지 약 2년, 또는 약 2년 내지 약 4년 또는 그 초과의 기간에 걸쳐 투여될 수 있다.
또한, 다양한 치료 방법이 본 개시내용에 의해 고려되고, 이 방법은 본 발명에 따른 항원성 PCSK9 펩티드의 투여를 포함한다. 대상체 치료 방법은 개체에서 자가-PCSK9에 대한 면역 반응을 유도하는 방법, 및 개체에서 PCSK9-관련 장애 또는 증상을 예방, 완화 또는 치료하는 방법을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 치료 유효량의 본 발명의 항원성 PCSK9 펩티드, 또는 그의 면역원성 또는 제약 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 PCSK9-관련 장애 또는 증상을 치료, 예방 또는 완화하기 위한 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 치료상 또는 면역원상 유효량의 본 발명의 항원성 PCSK9 펩티드, 또는 그의 면역원성 또는 제약 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 자가-PCSK9에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
PCSK9 관련 질환 또는 PCSK9 매개 질환은 예를 들어 PCSK9 활성의 억제 또는 PCSK9와 LDL 수용체의 상호작용의 억제가 유익할 수 있는 질환이다.
"치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 생물학적 장애 및/또는 적어도 1개의 그의 수반하는 증상의 완화 또는 제거 방법을 나타낸다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 질환, 장애 또는 상태의 "완화"는 질환, 장애 또는 상태의 증상의 심도 및/또는 발생 빈도의 감소를 의미한다. 추가로, 본원에서 "치료"에 대한 언급은 치유, 완화 및 예방적 처치에 대한 언급을 포함한다. 상기 대상체는 바람직하게는 인간이고, 임의의 연령의 남성 또는 여성일 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 바람직하게는 PCSK9-관련 장애의 치료, 완화 또는 예방에서 의약으로서 사용하기 위한, 본 발명에 따른 항원성 PCSK9 펩티드 또는 그의 면역원성 조성물 또는 제약 조성물에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 바람직하게는 PCSK9-관련 장애의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서 본 발명의 항원성 PCSK9 펩티드 또는 그의 면역원성 조성물 또는 제약 조성물의 용도를 제공한다.
특히, 본 발명은 바람직하게는 콜레스테롤의 수준 상승과 연관된 질환의 치료, 완화 또는 예방에서 의약으로서 사용하기 위한, 본 발명의 항원성 PCSK9 펩티드, 또는 그의 면역원성 또는 제약 조성물에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 바람직하게는 그를 필요로 하는 대상체의 혈액 내의 LDL-콜레스테롤 수준을 저하시키기 위한 의약의 제조에 있어서 본 발명의 항원성 PCSK9 펩티드 또는 그의 면역원성 조성물 또는 제약 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 용도 또는 방법의 일부 측면에서, 상기 PCSK9-관련 장애는 상승한 콜레스테롤, 상승한 LDL-콜레스테롤과 연관된 질환, 예를 들어, 지질 장애 (예를 들어, 고지혈증, I형, II형, III형, IV형 또는 V형 고지혈증, 2차성 고트리글리세리드 혈증, 고콜레스테롤 혈증, 가족성 고콜레스테롤 혈증, 황색종증, 콜레스테롤 아세틸트랜스퍼라제 결핍), 동맥경화성 상태 (예를 들어, 아테롬성동맥경화증), 관상 동맥 질환, 및 심혈관 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 LDL 수용체의 상향조절 또는 PCSK9와 LDL 수용체 사이의 상호작용의 억제가 유익한 질환의 치료 또는 완화용 의약의 제조에 있어서 본 발명의 항원성 PCSK9 펩티드 또는 그의 면역원성 조성물 또는 제약 조성물의 용도를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 알츠하이머병의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서 본 발명의 항원성 PCSK9 펩티드 또는 그의 면역원성 조성물 또는 제약 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 용도 또는 방법의 다른 측면에서, 상기 대상체는 포유동물, 바람직하게는 인간 대상체이다.
본 발명의 용도 또는 방법의 또 다른 측면에서, 상기 대상체는 상기 PCSK9-관련 장애로 고통받는다. 별법으로, 상기 대상체는 예를 들어 하나 이상의 위험 인자 (예를 들어, 고혈압, 흡연, 당뇨병, 비만, 또는 고호모시스테인 혈증)의 존재로 인해 상기 PCSK9-관련 장애로 고통받을 위험이 있다.
본 발명의 항원성 PCSK9 펩티드 또는 그의 면역원성 조성물 또는 제약 조성물은 또 다른 콜레스테롤-감소제를 사용하는 요법에 비관용성인 대상체, 또는 또 다른 콜레스테롤-감소제를 사용한 요법이 부적절한 결과를 생성한 대상체 (예를 들어, 스타틴 요법에 대해 불충분한 LDL-c 감소를 경험한 대상체)에 유용하다. 본원에서 설명되는 본 발명의 항원성 PCSK9 펩티드는 상승한 LDL-콜레스테롤을 갖는 대상체에게 투여될 수 있다.
바람직하게는, 상승한 콜레스테롤을 갖는 대상체는 총 혈장 콜레스테롤 수준이 200 mg/dl 이상인 인간 대상체이다. 바람직하게는, 상승한 콜레스테롤을 갖는 대상체는 LDL-콜레스테롤 수준이 160 mg/dl인 인간 대상체이다.
총 혈장 콜레스테롤 수준 및 LDL-콜레스테롤 수준은 적절한 금식 후에 얻은 혈액 샘플에 대해 표준 방법을 이용하여 측정한다. 총 혈장 콜레스테롤 수준 및 LDL-콜레스테롤 수준을 측정하기 위한 프로토콜은 당업자에게 공지되어 있다.
하나의 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드 또는 면역원성 조성물 또는 그의 제약 조성물은 또 다른 물질과 함께 투여되고, 이들은 임의의 순서로 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드 또는 면역원성 조성물 또는 그의 제약 조성물은 제2 물질 (예를 들어, 제2 콜레스테롤-감소제)을 시행중인 대상체에게 투여된다. 콜레스테롤 감소제는 스타틴, 담즙산 흡착제 (담즙산의 순환을 차단시킨다), 니아신, 피브르산 유도체, 및 장쇄 알파, 오메가-디카르복실산을 포함한다. 스타틴은 콜레스테롤 생합성의 핵심 효소인 HMGCoA를 차단함으로써 콜레스테롤 합성을 억제한다. 스타틴의 예는 로바스타틴, 프라바스타틴, 아토르바스타틴, 세리바스타틴, 플루바스타틴, 및 심바스타틴이 있다. 담즙산 흡착제는 창자로부터 간으로의 담즙산의 순환을 차단한다. 이들 흡착제의 예는 콜레스티라민 및 콜레스티폴 염산염이 있다. 피브르산 유도체의 예는 클로피브레이트 및 겜피브로질이 있다. 장쇄 알파, 오메가-디카르복실산은 예를 들어 문헌 [Bisgaier et al., 1998, J. Lipid Res. 39: 17-30]; WO 98/30530; 미국 특허 4,689,344; WO 99/00116; 미국 특허 5,756,344; 미국 특허 3,773,946; 미국 특허 4,689,344; 미국 특허 4,689,344; 미국 특허 4,689,344; 및 미국 특허 3,930,024)에; 에테르는 예를 들어, 미국 특허 4,711,896; 미국 특허 5,756,544; 미국 특허 6,506,799에 기재되어 있다. 돌리콜의 포스페이트 (미국 특허 4,613,593), 및 아졸리딘디온 유도체 (미국 특허 4,287,200)도 콜레스테롤 수준을 저하시키기 위해 사용될 수 있다. 조합 요법은 상가적 (additive)일 수 있거나, 또는 상승적 결과 (예를 들어, 2가지 물질의 조합 사용에 대해 예상된 것보다 더 큰 콜레스테롤의 감소)를 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원성 PCSK9 펩티드 또는 그의 면역원성 조성물 또는 제약 조성물 및 스타틴의 조합 요법은 상승적 결과 (예를 들어, 콜레스테롤의 상승적 감소)를 생성한다. 일부 대상체에서, 이에 의해 목적하는 콜레스테롤 수준을 달성하기 위한 스타틴 투여량을 감소시킬 수 있다.
<실시예>
다음 실시예는 당업자에게 본 발명의 실시 및 이용 방법의 완전한 개시 및 설명을 제공하도록 제시되고, 본 발명자가 발명으로서 간주하는 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않고, 또한 아래의 실험이 수행된 유일한 모든 실험임을 나타내고자 의도되지 않는다. 사용된 수치 (예를 들어 양, 온도 등)에 관하여 정확도를 보장하기 위해 노력하였지만, 일부 실험 오차 및 편차를 고려해야 한다. 달리 지시하지 않으면, 부는 중량부, 분자량은 중량 평균 분자량, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압 또는 그 근처이다. 다음의 표준 약어를 사용할 수 있다: 예를 들어, bp, 염기쌍(들); kb, 킬로염기(들); pl, 피코리터(들); s 또는 sec, 초(들); min, 분(들); h 또는 hr, 시간(들); aa, 아미노산(들); kb, 킬로염기(들); bp, 염기쌍(들); nt, 뉴클레오티드(들); i.m., 근육내(로); i.p., 복강내(로); s.c, 피하(로) 등.
실시예
1.
LDL
수용체 계면의
PCSK9
-
EGF
-A 도메인에서 항원성
PCSK9
펩티드의 선택
LDL 수용체의 EGF-A 도메인에 결합하는 인간 PCSK9의 구조는 해명되고 공개되었다 (Kwon et al., PNAS 105, 1820-1825, 2008). 상기 구조 정보 (PDB: 3BPS)를 유리 PCSK9의 구조 (PDB: 2P4E (Cunningham et al., Nature Structural & Molecular Biology, 14, 413-419, 2007))로부터의 정보와 함께 사용하여, PCSK9-LDL 수용체 상호작용에 대해 중요한 영역에 상응할 다음 펩티드를 설계하였다 (도 1 참조).
펩티드 1-4는 PCSK9 구조 내의 루프를 나타내므로, 각각의 서열 (서열 19, 63, 109 및 153)은 양 말단을 통해 VLP 담체에 커플링하여 천연 루프 구조의 입체형태적 모방체 (표 1에서 VR_9.1 내지 VR_9.4)를 제공하도록 첨가된 Cys, Cys-Gly 또는 Lys 링커를 갖도록 제조하였다. 추가로, VLP에 커플링을 위한 Cys 잔기를 제공하는 펩티드 2-4의 고리화된 버전을 또한 제조하였다 (표 1에서 VR_9.6 내지 VR_9.9). 펩티드 1은 커플링 목적을 위한 Lys-Gly-Gly N-말단 링커를 갖도록 제조하여, 2개의 Cys 잔기가 천연 PCSK9 구조 내에서 그러하듯 자유롭게 디술피드 결합하도록 하였다. 펩티드 5는 인간 PCSK9의 성숙한 처리된 형태의 N-말단을 나타내고, N-말단이 항체 인식을 위해 자유롭도록 하기 위해 C-말단에 첨가된 시스테인 잔기를 통해 커플링되었다 (표 1의 VR_9.5). 다음 표 (표 1)은 백신 후보물질로서 평가하기 위한 생성된 9개의 펩티드를 기술한다.
실시예
2 - 백신 후보물질로서 평가를 위한 펩티드-
VLP
접합체의 제조
펩티드는 CLEAR 아미드 수지 상에 표준 Fmoc 프로토콜을 이용하여 합성하였다. 아미노산 커플링 반응은 HOBt (히드록시벤조트리아졸) 및 NMM (N-메틸모르폴린)의 존재 하에 1 eq의 HBTU (2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트)로 활성화시킨 5배 과량의 Fmoc-보호된 아미노산을 사용하여 수행하였다. Fmoc 기의 탈보호는 20% 피페리딘/DMF를 사용하여 달성하였다. 이어서, 수지-결합된 펩티드를 절단하고, 측쇄 보호기를 시약 D (TFA/H2O/DODT: 89/3/8)를 사용하여 동시에 제거하였다. 펩티드는 유리 N-말단 및 아미드화된 C-말단을 갖도록 제조되었다. 조질 펩티드를 0.1% TFA의 존재 하에 BEH 130 C18 컬럼 및 물/아세토니트릴 구배를 사용하여 HPLC에 의한 균질도까지 정제하였다. 정제된 펩티드를 동결건조기를 사용하여 진공 건조시켰다. 펩티드를 질량 분광법 (LC-MS)을 이용하여 분석하였고, 만족스러운 데이타를 얻었다.
본 연구에 사용된 Qβ VLP는 하기 서열의 14 kD 단량체 단백질을 코딩하는 pET28 플라스미드를 포함하는 BL21 (DE3) 균주 내에서 세균 이. 콜라이 발효에 의해 생산하였다:
(젠뱅크 ID: M99039). 발효는 IPTG를 사용하여 0.8의 OD600에서 유도시키고, 카나마이신을 함유한 테리픽 브로쓰 (terrific broth: TB) 내에서 철야 진행시켰다. 이어서, 숙주 세포 내에서 자가조립하는 VLP를 발효 세포 펠렛로부터 다음 차이가 있는 특허 출원 EP1736538에 기재된 방법을 이용하여 정제하였다: 세포 파괴 후에, 청정화된 균질물을 황산암모늄으로 50% 포화에서 처리하고, 세포 펠렛을 원심분리에 의해 회수하였다. 이어서, 펠렛을 HEPES 버퍼 내에 재용해시키고, HEPES 버퍼에 대해 투석시킨 후, 공개된 방법의 제1 컬럼 단계로 진행하였다. 이온-교환 컬럼 및 히드록실아파타이트 컬럼 단계 후에, 물질을 추가의 음이온-교환 컬럼 단계를 이용하여 정제하고, 멸균 여과하여 최종 VLP 벌크 물질을 제조하고, 크기-배제 크로마토그래피, SDS-PAGE 및 전자 현미경에 의해 분석하여 허용되는 결과를 얻었다.
시스테인 잔기를 통한 펩티드의 접합 :
Qβ VLP를 N-감마-말레이미도-부티릴옥시-숙신이미드 에스테르 (GMBS) 또는 보다 긴 숙신이미딜-6-[β-말레이미도프로피온아미도]헥사노에이트 연결 시약을 이용하여 활성화시켰다. 이들 시약의 사용 절차는 유사하였다: 고체 시약을 디메틸 술폭시드 (DMSO)에 용해시키고, VLP 용액에 ≥10배 몰 과량에서 첨가하였다. 활성화 반응을 ≥90분 동안 진행시킨 후, 용액을 NAP-25 탈염 컬럼을 이용하여 5 mM EDTA를 함유한 둘베코 (Dulbeccos) 포스페이트 완충 염수 (DPBS) 또는 고체 NaCl (14.6 g/L)의 첨가에 의해 변형시킨 둘베코 포스페이트 완충 염수 (DPBS) 내로 탈염시켰다. 필요한 경우에, 단백질 용액을 다음 접합 반응에 앞서 10 kD 회전 마이크로농축기를 이용하여 약간 농축시켰다.
접합 반응에 앞서, 펩티드를 첨가제로서 5 mM EDTA을 함유하는 pH 7.4 DPBS의 분취액에 용해시켰다. 용액 내 펩티드의 농도는 10 mg/ml이었다. 용해된 펩티드를 5 mM EDTA를 함유하는 DPBS 내에 세척시킨 TCEP 고정된 환원제 (피어스 케미컬)의 분취액에 첨가하였다. 펩티드의 분취액을 TCEP 겔의 존재 하에 대략 1시간 동안 혼합하면서 인큐베이팅하고, 이 후, 분취액을 마이크로원심분리기 내에서 원심분리하고, 고체 펠렛을 폐기하였다. 환원된 펩티드-함유 상등액을 앞서 제조한 활성화시킨 VLP에 직접 첨가하였다. 그러나, 상기 절차에 대한 한가지 대안은 활성화된 Qβ VLP의 샘플 내로 고체 펩티드의 직접 첨가이다. 두 방법은 모두 펩티드-VLP 접합체의 생성을 위해 동등하게 잘 작용한다.
VLP 및 환원된 펩티드 사이의 반응을 매우 부드럽게 혼합하면서 적어도 30분 동안 진행시켰다. 반응 시간의 끝에, 각각의 샘플을 NAP-10 또는 NAP-25 탈염 컬럼 (지이 헬쓰케어 (GE Healthcare))을 이용하여 둘베코 PBS (DPBS) 내로 탈염시켰다. 탈염시킨 접합된 펩티드를 단백질 함량에 대해 브래드포드 (Bradford) (쿠마지 브릴리언트 블루 (Coomassie Brilliant Blue) (피어스 케미컬 컴퍼니) 분석 또는 BCA 단백질 분석 (비신코니닌산 (bicinchoninic acid)) (피어스 케미컬 컴퍼니)을 이용하여 및 SDS-PAGE 및 크기-배제 크로마토그래피에 의해 분석하였다. 접합체 생성물을 0.22 ㎛ 필터를 이용하여 멸균 여과하고, 2-8℃에서 사용시까지 저장하였다. 저장하는 동안 동결 또는 농도의 극심함에의 노출을 방지하기 위해 이들 샘플에 주의를 기울였다.
CRM197에 대한 PCSK9 펩티드의 접합은 BAANS (브로모아세트산 N-히드록시숙신이미드 에스테르, 시그마 (Sigma) B8271) 사용하여 수행하였다. CRM197을 먼저 100의 몰비로 0.1 M 탄산나트륨 pH 8.3 내에서 BAANS와 90분 동안 냉실에서 반응시킴으로써 활성화시켰다. 반응 혼합물을 Zeba 탈염 컬럼을 통해 통과시키고, 유동 통과물을 수집하였다. 10 mg/ml의 PCSK9 펩티드를 동일 부피의 고정된 TCEP 환원 겔 (써모 사이언티픽 (Thermo Scientific))과 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이팅하고, 0.2 ㎛ 필터를 통한 원심분리 후에 수집하였다. 이어서, 활성화시킨 CRM197을 처리된 펩티드와 냉실에서 철야 혼합한 후, PBS 버퍼 내에 광범하게 투석하였다. 접합체를 회수하고, 농축시키고, 0.22 ㎛ 필터를 통해 멸균시켰다. 단백질 농도는 쿠마지 블루 분석 (써모 사이언티픽)을 이용하여 결정하였다.
아민을
통한 펩티드의 접합
아민 잔기를 통한 Qβ에 대한 펩티드, 구체적으로 펩티드 VR_9.1의 접합을 위해, 다음 절차에 따랐다. Qβ를 VLP 단량체에 비해 ≥10배 몰 과량에서 고체 숙신산 무수물의 첨가에 의해 초기에 유도체화하였다. 숙신산 무수물을 용해시키고, 유도체화 반응을 적어도 30분 동안 진행시켰다. 이 후에, 샘플을 NAP-25 탈염 컬럼을 이용하여 5 mM EDTA를 함유하는 둘베코 포스페이트 완충 염수 (DPBS) 내로 탈염시켰다. 이어서, 다음 시약들을 VLP 단량체에 비해 ≥10배 몰 과량에서 나열된 순서로 첨가하였다: 고체 펩티드, N-히드록시술포숙신이미드 및 마지막으로 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드. 상기 나열된 순서의 시약 첨가 후에, 샘플을 실온에서 인큐베이팅하고, 반응을 적어도 30분 동안 진행시키고, 그 후 VLP-펩티드 접합체를 NAP-25 탈염 컬럼을 이용하여 둘베코 포스페이트 완충 염수 (DPBS) 내로 탈염시켰다.
VLP-펩티드 샘플에 대한 접합의 정도는 SDS-PAGE를 이용하여 측정하고, 모든 샘플에 대한 분자량 증가를 관찰하였다 (이는 VLP 단백질 단량체에 대한 펩티드의 첨가와 일치한다). 또한, 샘플을 HPLC 크기-배제 크로마토그래피 분석 (Tosoh PWXL5000 HPLC 컬럼 사용)으로 시험하였고, VLP의 비접합된 샘플에 비해 조립된 VLP를 함유함을 발견하였다. VLP-펩티드 접합 특징을 표 2에 요약한다.
실시예
3:
PCSK9
펩티드 면역원성
펩티드가 얼마나 효율적으로 Qbeta VLP에 접합되는지 평가하기 위한 본 연구 (상기 실시예 2에 상술한 바와 같이)는 인간 및 마우스 PCSK9에 결합할 수 있는 항체 반응을 유도하는 것이다. 암컷 Balb/c (6-8주)에게 근육내 경로 (각각의 전경골근에 50 마이크로리터 부피를 주사함)를 통해 제0, 21 및 42일에 백반 내에서 식 5' TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT 3'의 CpG와 제형화시킨 VLP-펩티드 접합체를 주사하였다. 1군의 대조 마우스는 동일한 프로토콜에 따라 대조 (비-PCSK9) 펩티드에 커플링된 VLP로 면역화시키고, 제2 대조군은 면역화시키지 않고 두었다. 제49일에 해부하였다. 해부 시에, 안락사시킨 마우스로부터 400 - 600 마이크로리터 혈액을 항응고제를 사용하여 심장 천자에 의해 샘플링하였다. 혈액을 원심분리하여 혈장을 분리하고, 이를 시험 때까지 동결 저장하였다.
전장 인간 재조합 PCSK9 단백질에 대한 IgG 항체 반응을 비색 ELISA 방법을 이용하여 측정하였다. 혈청 샘플로부터 연속 희석액을 제조하고 본 분석에서 시험하였다.
인간 PCSK9 ELISA 방법 1: 384-웰 고 결합 분석 플레이트 (코닝 인터내셔날 (Corning International) Cat#3700)를 0.01 M PBS (pH 7.4)로 1 ㎍/mL로 희석시키고 진탕기 상에서 RT에서 3시간 동안 인큐베이팅한 25 μL/웰의 인간 PCSK9 단백질 원액으로 코팅하였다. PBS (pH 7.4)로 2회 세척한 후, 플레이트를 80 μL/웰의 0.01 M PBS/1% BSA를 사용하여 차단시키고, RT에서 1시간 동안 인큐베이팅한 후, 0.01 M PBS (pH 7.4)/0.05% 트윈 20으로 3회 최종 세척하였다. 다음날, 각각의 샘플의 8개 점 ½ 로그 연속 희석액을 1:25 희석 (PBS/1 %BSA 희석제)에서 시작하여 제조하고, 25 μL/웰의 연속 희석액을 인간 PCSK9 코팅된 플레이트 내로 이중으로 옮긴 후, RT에서 1.5시간 동안 진탕하면서 인큐베이팅하였다. 0.01 M PBS (pH 7.4)/0.05% 트윈 20으로 3회 세척한 후, 0.01 M PBS (pH 7.4)/1 %BSA로 1:6000 희석한 25 μL/웰의 총 IgG 검출 항체 (토끼 항-mu IgG-Fc, Cat# A90-130A 베틸 래보래토리즈 (Bethyl Laboratories))를 첨가한 후, RT에서 1시간 동안 진탕하면서 인큐베이팅하였다. 0.01 M PBS (pH 7.4)/0.05% 트윈 20으로 5회 세척한 후, 0.01 M PBS (pH 7.4)/0.05% 트윈 20 (pH 7.4)로 1:3000 희석시킨 25 μL/웰 바이오-라드 (Bio-Rad) 키트 염소 항-토끼 양고추냉이 퍼옥시다제 접합체 (바이오-라드 Cat#172-1019)를 첨가한 후, RT에서 1시간 동안 진탕하면서 인큐베이팅하였다. 0.01 M PBS (pH 7.4)/0.05% 트윈 20으로 4회, 이어서 0.01 M PBS (pH 7.4)만으로 1회 세척한 후, 25 μL/웰 마우스 Typer HRP 기질 (바이오-라드 Cat#172-1064)을 첨가하고, 플레이트를 RT에서 30분 동안 인큐베이팅하였다. 25 μL/웰의 2% 옥살산을 첨가한 후, Abs 405 nm에서 흡광도를 판독하였다.
마우스 PCSK9 ELISA 방법 1: 써모 이뮤놀론 (Thermo Immunolon) 4HBX 96-웰 ELISA 플레이트를 100 ㎍/ml의 재조합 마우스 PCSK9로 PBS 내에서 철야로 4℃에서 코팅하였다. 세척한 후, 플레이트를 300 ml PBS/0.5% BSA (시그마 A7030)로 1 hr 동안 차단시키고, 300 ㎕의 PBS/0.01 % 트윈-20으로 4회 세척하고, 100 ㎕의 혈장 샘플의 연속 희석액 (PBS/0.5% BSA 중)을 첨가하였다. 1시간 동안 실온에서 부드럽게 진탕하면서 인큐베이팅한 후, 플레이트를 300 ㎕ PBS/0.01 % 트윈-20으로 4회 세척하고, 100 ㎕의 염소 항-마우스 IgG-HRP (양고추냉이 퍼옥시다제; 피어스 31430)의 1:5000 희석액을 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 45분 동안 부드럽게 진탕하면서 인큐베이팅한 후, 300 ㎕ PBS/0.01% 트윈-20으로 7회 세척하였다. 이어서, 100 ㎕ TMB 기질 (시그마 T-4444)을 첨가하고, 비색 반응을 4분 후에 2 N 황산을 첨가하여 중지시키고, 450 nm에서 흡광도를 판독하였다.
데이타 분석: 각각의 시험 샘플에 대해 역가 곡선을 작성하였다 (샘플 희석 대 흡광도). 이어서, 샘플 역가 (나중에 역가의 역수로 변환됨)를 1.0 또는 0.5의 컷-오프 (cut-off) 광학 밀도 (O.D.) 값을 달성하는 혈청 희석으로서 취하였다.
혈장/혈청 콜레스테롤 수준의 측정
혈장 및 혈청 샘플 내의 콜레스테롤 수준을 제조자의 지시에 따라 WAKO 콜레스테롤 E 분석 키트 (Cat# 439-17501)를 사용하여 측정하였다. 콜레스테롤 표준물 또는 시험 혈장/혈청 샘플의 희석액 (4 ㎕ 부피)을 96-웰 플레이트의 웰에 첨가하고, 196 ㎕의 제조된 콜레스테롤 시약을 첨가하였다. 플레이트를 5분 동안 37℃에서 인큐베이팅하고, 발색된 색상의 흡광도를 30분 이내에 600 nm에서 판독하였다.
PCSK9
및
LDL
수용체의
세포외
도메인 사이의 상호작용의 측정
마우스 혈장에 의한 LDLR 및 PCSK9 결합의 차단을 형광단-표지된 LDLR 세포외 도메인 (LDLR-ECD) 및 전장 야생형 PCSK9 단백질을 사용하여 TR-FRET 분석 (시간 분해 형광 공명 에너지 전달 분석)으로 결정하였다. 제조자의 지시에 따라 LDLR-ECD (알앤디 시스템즈 (R&D system), cat#2148-LD/CF))를 유로퓸 (지이 헬쓰케어, Cat#PA99148)으로 표지하였다 (Eu:LDLR 몰비 6:1로). PCSK9를 Biotin-XX-SSE (피어스, cat#21237)로 8의 비오틴:PCSK9 몰비로 비오티닐화하였다. TR-FRET 분석은 5 nM LDLR-Eu+3, 30 nM PCSK9-비오틴 및 50 nM Alexa Fluor 647 접합된 스트렙타비딘 (SA647, 인비트로겐 (Invitrogen), cat# S21374)를 사용하여 20 ㎕의 분석 버퍼 (20 mM Hepes, pH 7.0, 150 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2 및 0.05%(w/v) BSA) 내에서 384-웰 흑색 플레이트 (코닝, Cat# 3676)에서 수행하였다. 마우스 혈장의 연속 희석액을 PCSK9-비오틴과 함께 RT에서 30분 동안 가습 챔버 내에서 예비-인큐베이팅한 후, LDLR 및 스트렙타비딘-SA647과 혼합하였다. 암소에서 가습 분위기 내에서 RT에서 추가의 60분 인큐베이션 후에, 플레이트를 50 μs 지연 시간 및 400 μs 창을 이용하여 퍼킨 엘머 (Perkin Elmer) Victor2 플레이트 판독기 상에서 판독하였다. 데이타를 (665 nm/615 nM)x1000의 신호의 비로서 보고한다.
결과: 도 2에 제시된 바와 같이, 면역원으로서 사용된 모든 펩티드는 무손상 전장 인간 PCSK9 단백질에 대한 항체 반응을 유도할 수 있었고, 일부는 다른 것보다 더 높은 반응을 유도하였다. 모든 경우에, 이들 반응은 도 3에 제시된 바와 같이 마우스 PCSK9와 교차-반응하였다. 도 4는 펩티드 VR_9.5 면역화가 또한 혈장 콜레스테롤 수준을 감소시켰음을 보여주고, 도 5 및 6은 VR_9.5 및 VR_9.6이 형광 공명 에너지 전달 (FRET) 분석을 이용하여 PCSK9 및 LDL 수용체 사이의 상호작용을 억제할 수 있는 혈청 항체 반응을 유도하였음을 보여준다.
실시예 4 - PDB :3 BPS 내에 존재하는 수용체 EGF -A 도메인과 구분되는 영역에 상응하는 펩티드의 설계 :
LDL 수용체는 멀티도메인 단백질이고, 그의 세포외 도메인은 N-말단 리간드 결합 도메인, 3개의 EGF 유사 리피트 (그 중 EGF-A가 하나임), β-프로펠러 (propeller) 도메인 및 "O 연결된 당 도메인"으로 이루어진다 (Kwon et al., PNAS 105, 1820-1825, 2008). PDB 파일 3GCX는 PCSK9의 구조를 LDL 수용체의 EGF-A 도메인만의 가용형 형태와 복합체로 상술하고, 따라서, 본 발명자들은 PDB:3GCX로 나타낸 분자의 직접 분석으로부터 추정될 수 없는, PCSK9 및 LDL 수용체 사이의 추가의 명백하지 않은 상호작용이 존재할 수 있음을 가정하였다. 이들 영역의 예를 도 7에 상세히 제시하고, 구체적으로 추가의 추정 수용체 계면으로서 작용할 수 있는 PCSK9 내의 2개의 서열이 확인되었다 (NAQDQPVTLGTL 및 INEAWFPEDQRVL - 도 8 참조).
공공 데이타베이스에서 발견된 쥐 PCSK9 서열을 사용함으로써, 쥐 상동체가 또한 확인되었다 (표 3에 나타낸 바와 같이). 본 발명자들은 또한 펩티드 VR_9.5 내에 하유된 아미노산 서열의 일부 (실시예 1에 기재된)가 또한 PDB:3BPS 내에서 가시적이지 않은 LDL 수용체의 일부와 상호작용함을 가정하였다 (도 8). 이 개념은 아미노산 링커 및 접합의 배향을 변경시킴으로써 서열 VR_9.5를 개량함으로써 입증되었다. 본 발명자들은 또한 VR_9.5의 마우스 상동체에 상응하는 펩티드를 확인하였다 (펩티드 VR_9.10). 상기한 방안으로부터 생성되는 일련의 펩티드 서열을 화학적 접합을 허용하기 위해 아미노산의 첨가에 의해 변형시키고, 백신 후보물질로서 평가하였다 (표 3에 상술한 펩티드).
실시예
5
펩티드 VR_9.10 내지 VR_9.16 (및 비교를 위한 VR_9.5)를 실시예 2에 기재된 바와 같이 Qβ VLP에 접합시키고, 실시예 3에 기재된 바와 같이 마우스를 면역화시키고 PCSK9에 대한 항체 반응을 평가하기 위해 사용하였고, 여기서 비접합된 VLP를 대조 면역원으로서 사용하였다. 도 9 및 10에 제시한 바와 같이, 모든 펩티드가 ELISA 분석에서 무손상 전장 마우스 PCSK9를 인식할 수 있는 항체를 유도하였다.
실시예
6
본 발명자들이 관찰한 인간 PCSK9의 성숙한 처리된 형태의 N-말단 (서열 184)을 나타내는 펩티드 VR_9.5를 사용한 면역화에 의해 유도되는 콜레스테롤 저하에 기초하여, 본 발명자들은 미성숙 PCSK9의 절단된 프로도메인이 성숙한 PCSK9 단백질과 회합되어 유지되는 것이 공지되어 있으므로, 상기 프로도메인의 영역 (서열 329)이 또한 콜레스테롤 수준을 저하하기 위한 후보 항체 표적임을 가정한다.
관심있는 펩티드의 구체적이고 비제한적인 예는 인간에서 공지의 기능 상실 또는 기능 획득 유전자 돌연변이를 함유하는 영역을 비롯한, 프로도메인 영역의 C-말단 서열 및 표면 노출된 서열 및 루프 내에서 발견된다:
상기 펩티드 및 그의 절단체는 N- 또는 C-말단에 첨가된 링커 (예를 들어 CGG 또는 GGC)를 사용하여 또는 고리화된 또는 달리 입체형태적으로 제한된 분자로서 합성하고, 실시예 2에 기재된 바와 같이 Qβ VLP에 커플링하고, 실시예 3에 기재된 바와 같이 마우스를 면역화시키고 PCSK9에 대한 항체 반응을 평가하기 위해 사용하였다.
실시예
7
펩티드 VR_9.5 및 9.10을 실시예 2에 기재된 바와 같이 Qβ VLP 또는 CRM197에 접합시키고, 아주반트로서 타이터맥스 골드, 백반 또는 백반-CpG를 사용하여 마우스 (BALB/c 또는 C57BL/6)를 면역화시키기 위해 사용하였다. B형 간염 바이러스 유래 펩티드 (아미노산 28-39 (IPQSLDSWWTSL))을 Qβ VLP 또는 CRM197에 접합시키고, 대조 면역원으로서 사용하였다.
사용된 ELISA 방법은 실시예 3에 개시된 것과 약간 상이하였다: ELISA 방법은 인간 및 마우스 PCSK9 ELISA (방법 2)에 대해 다음과 같이 수행하였다: 384-웰 고 결합 분석 플레이트 (그라이너 바이오-원 (Greiner bio-one) 781061)를 1X PBS (pH 7.4) 내에 1 ㎍/mL로 희석시킨 25 ㎕/웰의 인간 또는 마우스 PCSK9 단백질 원액으로 코팅하고 4℃에서 철야 인큐베이팅하였다. 다음날, 플레이트를 25 ㎕/웰의 1X PBS/0.05% 트윈-20/1% BSA를 사용하여 차단하고, 진탕기 상에서 RT에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 각각의 샘플의 10개 점 ½ 로그 연속 희석액을 1:50 또는 1:500 희석 (1X PBS/0.05% 트윈-20 희석제)에서 시작하여 제조하고, 25 ㎕/웰의 연속 희석액을 인간 또는 마우스 PCSK9 코팅된 플레이트 내로 이중으로 옮긴 후 RT에서 1시간 동안 진탕하면서 인큐베이팅하였다. 1X PBS (pH 7.4)/0.05% 트윈-20으로 3회 세척한 후, 1X PBS (pH 7.4)/0.05% 트윈-20으로 1:3000 희석시킨 25 ㎕/웰의 총 IgG 검출 항체 (염소 항-마우스 IgG (γ), HRP, 인비트로겐 M30107)를 첨가한 후, RT에서 1시간 동안 진탕하면서 인큐베이팅하였다. 1X PBS (pH 7.4)/0.05% 트윈 20으로 5회 세척한 후, 25 ㎕/웰 바이오-라드 TMB 퍼옥시다제 EIA 기질 키트 (바이오-라드 Cat#172-1067)을 첨가하고, 플레이트를 15분 동안 인큐베이팅하였다. 12.5 ㎕/웰의 1 N 황산을 첨가한 후, Abs 450 nm에서 흡광도를 판독하였다.
결과: Qβ VLP 또는 CRM197에 접합된 펩티드 VR_9.5 및 9.10은 무손상 전장 인간 및 마우스 PCSK9 단백질에 대한 항체 반응을 유도할 수 있었다 (도 11 및 12 참조). 도 13 및 14와 표 4는 또한 상이한 아주반트의 존재 하에 상이한 담체에 접합된 펩티드 VR_9.5 및 9.10이 혈청 콜레스테롤 수준을 감소시켰음을 보여준다.
실시예
8
표면 노출 및 인간에서 확인된 기능 획득 또는 기능 상실 돌연변이과의 연관을 위해 PCSK9의 촉매 도메인의 C-말단 영역 및 프로도메인 모두로부터 추가의 펩티드 (서열 312, 420, 421, 422, 423, 425, 426, 427, 428, 445, 482, 525 및 563)를 선택하였다. 상기한 방안으로부터 생성되는 일련의 펩티드 서열을 화학적 접합을 허용하기 위해 아미노산의 첨가에 의해 변형시키고, 백신 후보물질로서 평가하였다 (표 5 펩티드 9.23-9.35).
실시예
9
펩티드 VR_9.17 내지 VR_9.35 (및 VR_9.5)를 실시예 2에 기재된 바와 같이 Qβ VLP에 접합시키고, 실시예 3에 기재된 바와 같이 마우스를 면역화시키고 PCSK9에 대한 항체 반응을 평가하기 위해 사용하였다. B형 간염 바이러스 유래 펩티드 (아미노산 28-39 (IPQSLDSWWTSL))을 Qβ VLP에 접합시키고, 대조 면역원으로서 사용하였다. ELISA를 위해 방법 번호 2를 사용하였다.
결과: 도 15 및 16에 제시된 바와 같이, Qβ VLP에 접합된 펩티드의 대부분은 무손상 전장 PCSK9에 대한 항체 반응을 유도할 수 있었다. 펩티드 9.31 및 9.32에 대한 항체 반응은 검출되지 않았다. 몇몇 경우에 (펩티드 9.23, 9.24, 9.27, 9.28, 9.29, 9.30, 9.33, 및 9.34), 항체 반응은 종 특이적이었다. 펩티드 9.5, 9.18, 및 9.29를 사용한 면역화는 또한 혈청 콜레스테롤을 감소시킨 한편, 펩티드 9.17, 9.19, 9.30, 9.31, 및 9.32를 사용한 면역화는 콜레스테롤 감소 경향을 일으켰다 (표 6, 도 17).
<서열 목록>
SEQUENCE LISTING
<110> PFIZER VACCINE LLC
<120> PCSK9 Vaccine
<130> PC33896A
<160> 607
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 1
Ile Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser
1 5 10
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 2
Ile Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe Val
1 5 10
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 3
Ile Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe
1 5 10
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 4
Ile Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys
1 5 10
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 5
Ile Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr
1 5
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 6
Ile Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser
1 5
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 7
Ile Gly Ala Ser Ser Asp Cys
1 5
<210> 8
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 8
Ile Gly Ala Ser Ser Asp
1 5
<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 9
Ile Gly Ala Ser Ser
1 5
<210> 10
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 10
Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser
1 5 10
<210> 11
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 11
Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe Val
1 5 10
<210> 12
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 12
Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe
1 5 10
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 13
Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys
1 5
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 14
Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr
1 5
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 15
Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser
1 5
<210> 16
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 16
Gly Ala Ser Ser Asp Cys
1 5
<210> 17
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 17
Gly Ala Ser Ser Asp
1 5
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 18
Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser
1 5 10
<210> 19
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 19
Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe Val
1 5 10
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 20
Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe
1 5
<210> 21
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 21
Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys
1 5
<210> 22
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 22
Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr
1 5
<210> 23
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 23
Ala Ser Ser Asp Cys Ser
1 5
<210> 24
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 24
Ala Ser Ser Asp Cys
1 5
<210> 25
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 25
Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser
1 5 10
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 26
Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe Val
1 5
<210> 27
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 27
Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe
1 5
<210> 28
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 28
Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys
1 5
<210> 29
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 29
Ser Ser Asp Cys Ser Thr
1 5
<210> 30
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 30
Ser Ser Asp Cys Ser
1 5
<210> 31
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 31
Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser
1 5
<210> 32
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 32
Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe Val
1 5
<210> 33
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 33
Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe
1 5
<210> 34
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 34
Ser Asp Cys Ser Thr Cys
1 5
<210> 35
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 35
Ser Asp Cys Ser Thr
1 5
<210> 36
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 36
Asp Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser
1 5
<210> 37
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 37
Asp Cys Ser Thr Cys Phe Val
1 5
<210> 38
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 38
Asp Cys Ser Thr Cys Phe
1 5
<210> 39
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 39
Asp Cys Ser Thr Cys
1 5
<210> 40
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 40
Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser
1 5
<210> 41
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 41
Cys Ser Thr Cys Phe Val
1 5
<210> 42
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 42
Cys Ser Thr Cys Phe
1 5
<210> 43
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 43
Ser Thr Cys Phe Val Ser
1 5
<210> 44
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 44
Ser Thr Cys Phe Val
1 5
<210> 45
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 45
Thr Cys Phe Val Ser
1 5
<210> 46
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 46
Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp Ser
1 5 10 15
<210> 47
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 47
Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp
1 5 10
<210> 48
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 48
Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys
1 5 10
<210> 49
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 49
Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys
1 5 10
<210> 50
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 50
Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser
1 5 10
<210> 51
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 51
Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala
1 5 10
<210> 52
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 52
Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln
1 5
<210> 53
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 53
Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp Ser
1 5 10
<210> 54
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 54
Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp
1 5 10
<210> 55
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 55
Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys
1 5 10
<210> 56
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 56
Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys
1 5 10
<210> 57
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 57
Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser
1 5 10
<210> 58
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 58
Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala
1 5
<210> 59
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 59
Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln
1 5
<210> 60
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 60
Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp Ser
1 5 10
<210> 61
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 61
Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp
1 5 10
<210> 62
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 62
Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys
1 5 10
<210> 63
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 63
Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys
1 5 10
<210> 64
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 64
Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser
1 5
<210> 65
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 65
Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala
1 5
<210> 66
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 66
Gly Thr Arg Phe His Arg Gln
1 5
<210> 67
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 67
Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp Ser
1 5 10
<210> 68
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 68
Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp
1 5 10
<210> 69
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 69
Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys
1 5 10
<210> 70
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 70
Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys
1 5
<210> 71
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 71
Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser
1 5
<210> 72
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 72
Thr Arg Phe His Arg Gln Ala
1 5
<210> 73
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 73
Thr Arg Phe His Arg Gln
1 5
<210> 74
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 74
Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp Ser
1 5 10
<210> 75
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 75
Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp
1 5 10
<210> 76
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 76
Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys
1 5
<210> 77
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 77
Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys
1 5
<210> 78
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
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<223> Synthetic Peptide
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<212> PRT
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<223> Synthetic Peptide
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<223> Synthetic Peptide
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<223> Synthetic Peptide
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<223> Synthetic Peptide
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Pro Glu Asp Gln Arg
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<223> Synthetic Peptide
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Pro
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<223> Synthetic Peptide
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<223> Synthetic Peptide
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<223> Synthetic Peptide
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 329
Met Gly Thr Val Ser Ser Arg Arg Ser Trp Trp Pro Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ala Arg Ala Gln Glu
20 25 30
Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg Ser Glu
35 40 45
Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Phe
50 55 60
His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr Val Val
65 70 75 80
Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr Ala Arg
85 90 95
Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu
100 105 110
His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met Ser Gly
115 120 125
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130 135 140
Glu Asp Ser Ser Val Phe Ala Gln
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<211> 13
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<213> Artificial
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<223> Synthetic Peptide
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 331
Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg Ile Ile Pro Ala
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<211> 11
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 332
Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg Ile Ile Pro
1 5 10
<210> 333
<211> 10
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 333
Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg Ile Ile
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<210> 334
<211> 12
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<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 334
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<210> 335
<211> 12
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 335
Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg Ile Ile Pro Ala Trp
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<210> 336
<211> 10
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
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<211> 9
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<213> Artificial
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<223> Synthetic Peptide
<400> 337
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<213> Artificial
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<223> Synthetic Peptide
<400> 338
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 339
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<213> Artificial
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<223> Synthetic Peptide
<400> 340
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<223> Synthetic Peptide
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Pro Trp Asn Leu Glu Arg Ile Ile
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<223> Synthetic Peptide
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<223> Synthetic Peptide
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<223> Synthetic Peptide
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Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu Ile Gly Leu Glu Phe Ile Arg
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Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Glu Val Ile Thr Val
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Gly Ala Thr Asn Ala Gln Asp Gln Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly
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Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly Glu Asp Ile
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Thr Ser Gln Ala Ala Ala His Val Ala Gly Ile Ala Ala Met Met Leu
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Phe Ile Arg Lys Ser Gln Leu Ile Gln Pro Ser Gly Pro Leu Val Val
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Ile Thr Val Gly Ala Thr Asn Ala Gln Asp Gln Pro Val Thr Leu Gly
340 345 350
Thr Leu Gly Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly
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Lys Asp Ile Ile Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe Met Ser
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Gln Ser Gly Thr Ser Gln Ala Ala Ala His Val Ala Gly Ile Val Ala
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Arg Met Leu Ser Arg Glu Pro Thr Leu Thr Leu Ala Glu Leu Arg Gln
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Arg Leu Ile His Phe Ser Thr Lys Asp Val Ile Asn Met Ala Trp Phe
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Pro Glu Asp Gln Gln Val Leu Thr Pro Asn Leu Val Ala Thr Leu Pro
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Pro Ser Thr His Glu Thr Gly Gly Gln Leu Leu Cys Arg Thr Val Trp
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Ser Ala His Ser Gly Pro Thr Arg Thr Ala Thr Ala Thr Ala Arg Cys
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Cys Cys Leu Val Pro Arg Ala Asn Cys Ser Ile His Asn Thr Pro Ala
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Ala Arg Ala Gly Leu Glu Thr His Val His Cys His Gln Lys Asp His
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Val Leu Thr Gly Cys Ser Phe His Trp Glu Val Glu Asp Leu Ser Val
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Gly His Gln Ala Ala Ser Val Tyr Ala Ser Cys Cys His Ala Pro Gly
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Phe Leu Val Lys Met Ser Ser Asp Leu Leu Gly Leu Ala Leu Lys Leu
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Pro Gly Gly Cys
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<223> Synthetic Peptide
<400> 444
Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly
1 5
<210> 445
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 445
Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro
1 5
<210> 446
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 446
Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu
1 5
<210> 447
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 447
Ala Lys Asp Pro Trp Arg
1 5
<210> 448
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 448
Ala Lys Asp Pro Trp
1 5
<210> 449
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 449
Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr
1 5
<210> 450
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 450
Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly
1 5
<210> 451
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 451
Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro
1 5
<210> 452
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 452
Lys Asp Pro Trp Arg Leu
1 5
<210> 453
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 453
Lys Asp Pro Trp Arg
1 5
<210> 454
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 454
Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 455
Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly
1 5
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 456
Asp Pro Trp Arg Leu Pro
1 5
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 457
Asp Pro Trp Arg Leu
1 5
<210> 458
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 458
Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr
1 5
<210> 459
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 459
Pro Trp Arg Leu Pro Gly
1 5
<210> 460
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 460
Pro Trp Arg Leu Pro
1 5
<210> 461
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 461
Trp Arg Leu Pro Gly Thr
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 462
Trp Arg Leu Pro Gly
1 5
<210> 463
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 463
Arg Leu Pro Gly Thr
1 5
<210> 464
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 464
Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile
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<210> 465
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 465
Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys
1 5 10
<210> 466
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 466
Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr
1 5 10
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 467
Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 468
Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 469
Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly
1 5
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<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 470
Ala Gln Ala Ala Arg Arg
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 471
Ala Gln Ala Ala Arg
1 5
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 472
Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu
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<210> 473
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 473
Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 474
Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys
1 5 10
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 475
Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr
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<212> PRT
<213> Artificial
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<223> Synthetic Peptide
<400> 476
Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 477
Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 478
Gln Ala Ala Arg Arg Gly
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 479
Gln Ala Ala Arg Arg
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 480
Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 481
Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile
1 5 10
<210> 482
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 482
Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys
1 5
<210> 483
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 483
Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr
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<210> 484
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 484
Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu
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<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 485
Ala Ala Arg Arg Gly Tyr
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 486
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 487
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 488
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 489
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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 490
Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr
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<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 491
Ala Arg Arg Gly Tyr Leu
1 5
<210> 492
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 492
Ala Arg Arg Gly Tyr
1 5
<210> 493
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 493
Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu
1 5
<210> 494
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 494
Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile
1 5
<210> 495
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 495
Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys
1 5
<210> 496
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 496
Arg Arg Gly Tyr Leu Thr
1 5
<210> 497
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 497
Arg Arg Gly Tyr Leu
1 5
<210> 498
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 498
Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu
1 5
<210> 499
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 499
Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile
1 5
<210> 500
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 500
Arg Gly Tyr Leu Thr Lys
1 5
<210> 501
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 501
Arg Gly Tyr Leu Thr
1 5
<210> 502
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 502
Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu
1 5
<210> 503
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 503
Gly Tyr Leu Thr Lys Ile
1 5
<210> 504
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 504
Gly Tyr Leu Thr Lys
1 5
<210> 505
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 505
Tyr Leu Thr Lys Ile Leu
1 5
<210> 506
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 506
Tyr Leu Thr Lys Ile
1 5
<210> 507
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 507
Leu Thr Lys Ile Leu
1 5
<210> 508
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 508
Arg Cys Ser Lys Glu Ala Trp Arg Leu Pro Gly Thr
1 5 10
<210> 509
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 509
Arg Cys Ser Lys Glu Ala Trp Arg Leu Pro Gly
1 5 10
<210> 510
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 510
Arg Cys Ser Lys Glu Ala Trp Arg Leu Pro
1 5 10
<210> 511
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 511
Arg Cys Ser Lys Glu Ala Trp Arg Leu
1 5
<210> 512
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 512
Arg Cys Ser Lys Glu Ala Trp Arg
1 5
<210> 513
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 513
Arg Cys Ser Lys Glu Ala Trp
1 5
<210> 514
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 514
Arg Cys Ser Lys Glu Ala
1 5
<210> 515
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 515
Arg Cys Ser Lys Glu
1 5
<210> 516
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 516
Cys Ser Lys Glu Ala Trp Arg Leu Pro Gly Thr
1 5 10
<210> 517
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 517
Cys Ser Lys Glu Ala Trp Arg Leu Pro Gly
1 5 10
<210> 518
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 518
Cys Ser Lys Glu Ala Trp Arg Leu Pro
1 5
<210> 519
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 519
Cys Ser Lys Glu Ala Trp Arg Leu
1 5
<210> 520
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 520
Cys Ser Lys Glu Ala Trp Arg
1 5
<210> 521
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 521
Cys Ser Lys Glu Ala Trp
1 5
<210> 522
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 522
Cys Ser Lys Glu Ala
1 5
<210> 523
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 523
Ser Lys Glu Ala Trp Arg Leu Pro Gly Thr
1 5 10
<210> 524
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 524
Ser Lys Glu Ala Trp Arg Leu Pro Gly
1 5
<210> 525
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 525
Ser Lys Glu Ala Trp Arg Leu Pro
1 5
<210> 526
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 526
Ser Lys Glu Ala Trp Arg Leu
1 5
<210> 527
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 527
Ser Lys Glu Ala Trp Arg
1 5
<210> 528
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 528
Ser Lys Glu Ala Trp
1 5
<210> 529
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 529
Lys Glu Ala Trp Arg Leu Pro Gly Thr
1 5
<210> 530
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 530
Lys Glu Ala Trp Arg Leu Pro Gly
1 5
<210> 531
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 531
Lys Glu Ala Trp Arg Leu Pro
1 5
<210> 532
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 532
Lys Glu Ala Trp Arg Leu
1 5
<210> 533
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 533
Lys Glu Ala Trp Arg
1 5
<210> 534
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 534
Glu Ala Trp Arg Leu Pro Gly Thr
1 5
<210> 535
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 535
Glu Ala Trp Arg Leu Pro Gly
1 5
<210> 536
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 536
Glu Ala Trp Arg Leu Pro
1 5
<210> 537
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 537
Glu Ala Trp Arg Leu
1 5
<210> 538
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 538
Ala Trp Arg Leu Pro Gly Thr
1 5
<210> 539
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 539
Ala Trp Arg Leu Pro Gly
1 5
<210> 540
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 540
Ala Trp Arg Leu Pro
1 5
<210> 541
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 541
Trp Arg Leu Pro Gly Thr
1 5
<210> 542
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 542
Trp Arg Leu Pro Gly
1 5
<210> 543
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 543
Arg Leu Pro Gly Thr
1 5
<210> 544
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 544
Thr Arg Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Val Ile Lys Val Leu
1 5 10
<210> 545
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 545
Thr Arg Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Val Ile Lys Val
1 5 10
<210> 546
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 546
Thr Arg Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Val Ile Lys
1 5 10
<210> 547
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 547
Thr Arg Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Val Ile
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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Arg Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Val Ile Lys Val
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<213> Artificial
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Arg Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Val Ile Lys
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<223> Synthetic Peptide
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Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Val Ile Lys Val Leu
1 5 10
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<213> Artificial
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<223> Synthetic Peptide
<400> 562
Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Val Ile Lys Val
1 5 10
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
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Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Val Ile Lys
1 5
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<213> Artificial
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<223> Synthetic Peptide
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<213> Artificial
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<223> Synthetic Peptide
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Ala Ala Arg Arg Gly
1 5
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<223> Synthetic Peptide
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1 5
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<211> 8
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<213> Artificial
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<223> Synthetic Peptide
<400> 570
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1 5
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<213> Artificial
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<223> Synthetic Peptide
<400> 571
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<213> Artificial
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<223> Synthetic Peptide
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Ala Arg Arg Gly Tyr Val
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 573
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1 5
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 574
Arg Arg Gly Tyr Val Ile Lys Val Leu
1 5
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
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Arg Arg Gly Tyr Val Ile Lys Val
1 5
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<211> 7
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 576
Arg Arg Gly Tyr Val Ile Lys
1 5
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<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 577
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1 5
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 578
Arg Arg Gly Tyr Val
1 5
<210> 579
<211> 8
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
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Arg Gly Tyr Val Ile Lys Val Leu
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 580
Arg Gly Tyr Val Ile Lys Val
1 5
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<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 581
Arg Gly Tyr Val Ile Lys
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 582
Arg Gly Tyr Val Ile
1 5
<210> 583
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 583
Gly Tyr Val Ile Lys Val Leu
1 5
<210> 584
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 584
Gly Tyr Val Ile Lys Val
1 5
<210> 585
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 585
Gly Tyr Val Ile Lys
1 5
<210> 586
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 586
Tyr Val Ile Lys Val Leu
1 5
<210> 587
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 587
Tyr Val Ile Lys Val
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 588
Val Ile Lys Val Leu
1 5
<210> 589
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 589
tcgtcgtttt tcggtgcttt t 21
<210> 590
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 590
tcgtcgtttt tcggtcgttt t 21
<210> 591
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 591
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 592
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 592
tcgtcgtttc gtcgttttgt cgtt 24
<210> 593
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 593
tcgtcgtttt gtcgtttttt tcga 24
<210> 594
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 594
tcgcgtcgtt cggcgcgcgc cg 22
<210> 595
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 595
tcgtcgacgt tcggcgcgcg ccg 23
<210> 596
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 596
tcggacgttc ggcgcgcgcc g 21
<210> 597
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 597
tcggacgttc ggcgcgccg 19
<210> 598
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 598
tcgcgtcgtt cggcgcgccg 20
<210> 599
<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 599
tcgacgttcg gcgcgcgccg 20
<210> 600
<211> 18
<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 600
tcgacgttcg gcgcgccg 18
<210> 601
<211> 18
<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 601
tcgcgtcgtt cggcgccg 18
<210> 602
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 602
tcgcgacgtt cggcgcgcgc cg 22
<210> 603
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 603
tcgtcgtttt cggcgcgcgc cg 22
<210> 604
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 604
tcgtcgtttt cggcggccgc cg 22
<210> 605
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 605
tcgtcgtttt acggcgccgt gccg 24
<210> 606
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 606
tcgtcgtttt cggcgcgcgc cgt 23
<210> 607
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Peptide
<400> 607
tcgtcgacga tcggcgcgcg ccg 23
Claims (50)
- 면역원성 담체에 연결된 적어도 1개의 항원성 PCSK9 펩티드를 포함하고, 여기서 항원성 PCSK9 펩티드가 서열 188 또는 서열 403의 아미노산 서열로 이루어지는 것이고, 면역원성 담체가 CRM197 또는 Qbeta VLP인 면역원.
- 제1항에 있어서, 상기 면역원성 담체가 CRM197인 면역원.
- 제1항에 있어서, 상기 면역원성 담체가 Qbeta VLP인 면역원.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제2항 또는 제3항에 있어서, 항원성 PCSK9 펩티드가 서열 188의 아미노산 서열로 이루어지는 것인 면역원.
- 제2항 또는 제3항에 있어서, 항원성 PCSK9 펩티드가 서열 403의 아미노산 서열로 이루어지는 것인 면역원.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제9항에 있어서, 상기 면역원이 PCSK9 펩티드의 C-말단에 화학식 (G)nC (여기서, n은 0, 1 및 2로 이루어지는 군으로부터 선택된 정수임)을 갖는 펩티드 링커를 추가로 포함하는 것인 면역원.
- 삭제
- 제22항에 있어서, 상기 링커가 PCSK9 펩티드의 C-말단에서의 시스테인인 면역원.
- 삭제
- 삭제
- 제22항에 있어서, 상기 링커가 PCSK9 펩티드의 C-말단에서의 GGC인 면역원.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 면역원을 포함하는 조성물.
- 제1항의 면역원 및 적어도 하나의 아주반트를 포함하는 면역원성 조성물.
- 제36항에 있어서, 상기 아주반트가 백반, CpG ODN, QS21 및 이스코매트릭스로부터 선택되는 것인 면역원성 조성물.
- 제36항에 있어서, 상기 아주반트가 QS21, CpG ODN과 조합된 백반, 및 CpG ODN과 조합된 이스코매트릭스로부터 선택되는 것인 면역원성 조성물.
- 제36항에 있어서, 상기 아주반트가 CpG ODN 및 백반의 조합물인 면역원성 조성물.
- (i) 제1항의 면역원, 및
(ii) 제약상 허용되는 부형제
를 포함하는, 대상체에서 LDL-콜레스테롤을 저하시키기 위한 제약 조성물. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
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