CN102711823A - 使用抗氧化的ldl抗体治疗的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于提高胰岛素敏感性的方法和组合物，包括施用抗氧化的LDL抗体。

Description

使用抗氧化的LDL抗体治疗的方法
对相关申请的交叉引用
本申请要求2009年8月28日提交的美国临时申请号61/238,114的优先权权益，在此通过提及而收录其全文。
发明领域
本发明关注使用抗氧化的低密度脂蛋白(LDL)抗体来提高受试者中的胰岛素敏感性的方法。
发明背景
代谢综合征是一种由美国心脏协会(American Heart Association)以下列异常：腹部肥胖、致动脉粥样硬化血脂障碍(atherogenic dyslipidemia)、高血压、伴有或没有葡萄糖不耐受性的胰岛素抗性、促炎性状态和血栓前(prothrombotic)状态表征的复杂疾病(Grundy等，“DEFINITION OFMETABOLIC SYNDROME”Circulation，2004，V109，第433页-第438页，在www.circulationaha.org  可获得的文件号DOI：10.116I/01.CIR.0000111245.75752.C6，通过提及而将其完整收入本文)。本领域中一般公认，可以认为具有三种或更多种上述症状的人患有代谢综合征。美国心脏协会估计约20至25％的美国成人患有代谢综合征。
大量患有代谢综合征的人群是前驱糖尿病(pre-diabetic)，并且具有比正常高，但是高得不足以诊断糖尿病的血糖浓度，并且有风险形成2型糖尿病、心脏病和中风。前驱糖尿病(pre-diabetes)在美国正变得更常见。美国健康和人类服务部(U.S.Department of Health and Human Services)估计在2007年，至少570万年龄为20岁或更大的美国成人患有前驱糖尿病。那些患有前驱糖尿病的人有可能在10年内形成2型糖尿病，除非他们采取步骤来阻止或延迟糖尿病。
糖尿病自身在美国影响着估计2360万人-占人口的7.8％。那些人之中，已经诊断出1790万，而570万尚未得到诊断。在2007年，约160万年龄为20岁或更大的人诊断出患有糖尿病。糖尿病是由于胰岛素作用的缺乏或不足由葡萄糖、蛋白质和脂质的异常代谢的发生引起的。
糖尿病的典型体征包括血清葡萄糖水平异常升高超过葡萄糖水平的正常范围和尿液中的葡萄糖排泄。糖尿病是一种在美国影响着数百万人的疾病，并且虽然是异质性病症，它一般有三种主要类别，即I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠糖尿病。在美国的所有糖尿病的约80％在II型类别中。此糖尿病类型以受损的胰岛素分泌和胰岛素抗性两者为特征。大多数患者是肥胖成人，并且减肥可以在一些病例中恢复血糖量正常。然而，此糖尿病类型也可以在非肥胖成人中及在儿童中发生。
迫切需要寻找一种提高患者中的胰岛素敏感性的方法以改善预防或治疗代谢综合征或与代谢综合征有关的症状或状况诸如前驱糖尿病和糖尿病的方法。
发明概述
本文中提供了提高受试者中的胰岛素敏感性的方法，包括对所述受试者施用有效量的包含选择性结合氧化的低密度脂蛋白(LDL)的表位的抗体的组合物。
本文中进一步提供了选择性结合氧化的低密度脂蛋白(LDL)的表位的抗体在制造用于提高受试者中的胰岛素敏感性的药物中的用途。
本文中还提供了用于提高受试者中的胰岛素敏感性的药物，其包含选择性结合氧化的低密度脂蛋白(LDL)的表位的抗体。
本文中还提供了用于胰岛素敏感性的抗体，其选择性结合氧化的LDL的表位。
在本文中提供的方法、用途、药物和抗体中任一种的一些实施方案中，所述氧化的LDL的表位包含氧化的ApoB-100的表位。在一些实施方案中，所述氧化的ApoB-100的表位选自由表1中的肽序列组成的组。在一些实施方案中，所述氧化的ApoB-100的表位选自下组：SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：38。在一些实施方案中，所述氧化的ApoB-100的表位是P45(氨基酸残基661-680-IEIGLEGKGFEPTLEALFGK；SEQ ID NO：32)、P143(氨基酸残基2131-2150-IALDDAKINFNEKLSQLQT Y；SEQ ID NO：13)、P210(氨基酸序列KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH；SEQ ID NO：14)和/或P129(氨基酸序列GSISHHLVSRKSISAALEHK；SEQ ID NO：16)。
在本文中提供的方法、用途、药物和抗体中任一种的一些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，所述单克隆抗体是IgG1抗体。在一些实施方案中，所述单克隆抗体是人源化抗体或人抗体。在一些实施方案中，所述单克隆抗体包含轻链可变域，其包含：(i)包含序列CSGSNTNIGKNYVS(SEQ ID NO：39)的CDR-L1；(ii)包含序列ANSNRPS(SEQ ID NO：40)的CDR-L2；和/或(iii)包含序列CASWDASLNGWV(SEQ IDNO：41)的CDR-L3。在一些实施方案中，所述单克隆抗体包含重链可变域，其包含：(i)包含序列FSNAWMSWVRQAPG(SEQ ID NO：42)的CDR-H1；(ii)包含序列SSISVGGHRTYYADSVKGR(SEQ ID NO：43)的CDR-H2；和/或(iii)包含序列ARIRVGPSGGAFDY(SEQ ID NO：44)的CDR-H3。在一些实施方案中，所述单克隆抗体包含轻链可变域，其包含(i)包含序列CSGSSSNIGNNAVN(SEQ ID NO：45)的CDR-L1；(ii)包含序列GNDRRPS(SEQ ID NO：46)的CDR-L2；和/或(iii)包含序列CQTWGTGRGV(SEQ IDNO：47)的CDR-L3。在一些实施方案中，所述单克隆抗体包含重链可变域，其包含(i)包含序列FSDYYMSWVRQAPG(SEQ ID NO：48)的CDR-H1；(ii)包含序列SGVSWNGSRTHYADSVKGR(SEQ ID NO：49)的CDR-H2；和/或(iii)包含序列ARAARYSYYYYGMDV(SEQ ID NO：50)的CDR-H3。在一些实施方案中，所述单克隆抗体包含轻链可变域，其包含(i)包含序列CSGSSSNIGNNYVS(SEQ ID NO：127)的CDR-L1；(ii)包含序列SNNQRPS(SEQ ID NO：128)的CDR-L2；和(iii)包含序列CAAWDDSLSHWL(SEQ IDNO：129)的CDR-L3。在一些实施方案中，所述单克隆抗体包含重链可变域，其包含：(i)包含序列FSNAWMSWVRQVPG(SEQ ID NO：130)的CDR-H1；(ii)包含序列STLGGSGGGSTYYADSVKGR(SEQ ID NO：131)的CDR-H2；和/或(iii)包含序列AKLGGRSRYGRWPRQFDY(SEQ ID NO：132)的CDR-H3。在一些实施方案中，所述单克隆抗体包含轻链可变域，其包含(i)包含序列CSGSSSNIGSNYVS(SEQ ID NO：133)的CDR-L1；(ii)包含序列GNYNRPS(SEQ ID NO：134)的CDR-L2；和/或(iii)包含序列CAAWDDSLSGWV(SEQ IDNO：135)的CDR-L3。在一些实施方案中，所述单克隆抗体包含重链可变域，其包含(i)包含序列FSSYWMSWVRQAPG(SEQ ID NO：136)的CDR-H1；(ii)包含序列SSISGSGRRTYYADSVQGR(SEQ ID NO：137)的CDR-H2；和/或(iii)包含序列ARLVSYGSGSFGFDY(SEQ ID NO：138)的CDR-H3。在一些实施方案中，所述单克隆抗体包含轻链可变域，其包含(i)包含序列CSGRSSNIGNSYVS(SEQ ID NO：139)的CDR-L1；(ii)包含序列RNNQRPS(SEQ ID NO：140)的CDR-L2；和/或(iii)包含序列CAGWDDTLRAWV(SEQ IDNO：141)的CDR-L3。在一些实施方案中，所述单克隆抗体包含重链可变域，其包含(i)包含序列FRDYYVSWIRQAPG(SEQ ID NO：142)的CDR-H1；(ii)包含序列SSISGSGGRTYYADSVEGR(SEQ ID NO：143)的CDR-H2；和/或(iii)包含序列ARVSALRRPMTTVTTYWFDP(SEQ ID NO：144)的CDR-H3。
在本文中提供的方法、用途、药物和抗体中任一种的一些实施方案中，所述单克隆抗体是人抗体。在一些实施方案中，所述人抗体包含含有选自下组的序列的重链可变域：SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：72，SEQID NO：76，SEQ ID NO：80，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：96，SEQ ID NO：100，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：108，SEQ IDNO：112，SEQ ID NO：116，SEQ ID NO：120和SEQ ID NO：124。在一些实施方案中，所述人抗体包含含有选自下组的序列的轻链可变域：SEQ ID NO：66，SEQID NO：70，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：78，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：86，SEQ ID NO：90，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：98，SEQ ID NO：102，SEQ IDNO：106，SEQ ID NO：110，SEQ ID NO：114，SEQ ID NO：118，SEQ ID NO：122和SEQ ID NO：126。在一些实施方案中，所述人抗体包含含有SEQ ID NO：104的重链可变域和含有SEQ ID NO：106的轻链可变域。在一些实施方案中，所述人抗体包含含有SEQ ID NO：68的重链可变域和含有SEQ ID NO：70的轻链可变域。在一些实施方案中，所述人抗体包含含有SEQ ID NO：96的重链可变域和含有SEQ ID NO：98的轻链可变域。在一些实施方案中，所述人抗体包含含有SEQ ID NO：72的重链可变域和含有SEQ ID NO：74的轻链可变域。在一些实施方案中，所述人抗体包含含有SEQ ID NO：76的重链可变域和含有SEQID NO：78的轻链可变域。
在本文中提供的方法、用途、药物和抗体中任一种的一些实施方案中，所述人源化抗体或人抗体是抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗原结合片段选自下组：Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、scFv、Fv和双抗体。在一些实施方案中，所述抗体进一步减轻炎症。在一些实施方案中，所述炎症与糖尿病有关。在一些实施方案中，所述抗体进一步降低炎性标志物的水平，其中所述炎性标志物选自下组：IL-1β、IL-15、EN-RAGE、MCP-1、IL-6和TNF-α。在一些实施方案中，炎性标志物是IL-1β、IL-15、EN-RAGE和TNF-α。
在本文中提供的方法、用途、药物和抗体中任一种的一些实施方案中，所述受试者患有代谢综合征。在一些实施方案中，所述受试者有风险形成代谢综合征。在一些实施方案中，所述受试者具有选自下组的一项或多项特征：(a)男性中约102cm或更多和女性中约88cm或更多的腰围，(b)约150mg/dL或更多的空腹甘油三酯，(c)约95mg/dL或更高的空腹葡萄糖，和(d)高水平的氧化的LDL。在一些实施方案中，所述受试者进一步患有与糖尿病有关的炎症。在一些实施方案中，所述受试者在过夜禁食后具有约95mg/dL或更高的血糖水平。在一些实施方案中，所述受试者在过夜禁食后具有约126mg/dL或更高的血糖水平。在一些实施方案中，所述受试者在2小时口服葡萄糖耐受性测试后具有约140mg/dL或更高的血糖水平。在一些实施方案中，所述受试者在2小时口服葡萄糖耐受性测试后具有约200mg/dL或更高的血糖水平。在一些实施方案中，所述受试者患有前驱糖尿病。在一些实施方案中，所述受试者患有糖尿病。在一些实施方案中，所述糖尿病选自下组：I型糖尿病、II型糖尿病和妊娠糖尿病。在一些实施方案中，所述糖尿病是I型糖尿病。在一些实施方案中，所述受试者患有心血管疾病或冠心病。在一些实施方案中，所述心血管疾病或冠心病与糖尿病有关。在一些实施方案中，所述受试者患有动脉粥样硬化。在一些实施方案中，所述动脉粥样硬化与糖尿病有关。
在本文中所描述的方法、用途、药物和抗体中任一种的一些实施方案中，胰岛素敏感性升高用于治疗受试者中的前驱糖尿病。在一些实施方案中，胰岛素敏感性升高用于治疗受试者中的糖尿病。在一些实施方案中，所述糖尿病选自下组：I型糖尿病、II型糖尿病和妊娠糖尿病。在一些实施方案中，所述糖尿病是II型糖尿病。在一些实施方案中，胰岛素敏感性升高用于治疗受试者中的心血管疾病或冠心病。在一些实施方案中，所述心血管疾病或冠心病与糖尿病有关。在一些实施方案中，胰岛素敏感性升高用于治疗受试者中的动脉粥样硬化。在一些实施方案中，所述动脉粥样硬化与糖尿病有关。
在本文中提供的方法、用途、药物和抗体中任一种的一些实施方案中，所述方法、用途、或药物进一步包括第二治疗剂。在一些实施方案中，施用所述第二治疗剂。在一些实施方案中，所述第二治疗剂是胰岛素。在一些实施方案中，所述第二治疗剂是抑制素(statin)。
附图简述
图1显示了实验日程表的示意图和评估的参数的列表。
图2A显示了基于动物鉴别号的胰岛素IVGTT(静脉内葡萄糖耐受性测试)的曲线下面积(AUC；血清浓度-时间曲线下面积)结果。
图2B显示了随时间的血浆胰岛素水平(uIU/mL)，其是基于动物鉴别号通过IVGTT所测定的。
图3A显示了使用IVGTT得到的在基线、在果糖后、及在2D03处理12周后年龄匹配的、HFD-升高的胰岛素、HFD-正常的胰岛素的均值血浆胰岛素(uIU/mL)。
图3B显示了用2D03处理之前和之后喂养高脂肪或正常饮食的动物的葡萄糖耐受性测试，其是使用IVGTT通过胰岛素AUC测量的。
图4显示了随时间的按ng/mL计的EN-RAGE水平，其是基于动物鉴别号由Rules-Based Medicine测量的。
图5显示了随时间的按pg/mL计的碱性FGF(FGF-basic)水平，其是基于动物鉴别号由Rules-Based Medicine测量的。
图6显示了随时间的按pg/mL计的IL-13水平，其是基于动物鉴别号由Rules-Based Medicine测量的。
图7A显示了随时间的按μg/mL计的IL-15水平，其是基于动物鉴别号由Rules-Based Medicine测量的。
图7B显示了随时间的按pg/mL计的干扰素-γ水平，其是基于动物鉴别号由Rules-Based Medicine测量的。
图8A显示了随时间的按pg/mL计的白介素-1β水平，其是基于动物鉴别号通过ELISA测量的。
图8B显示了随时间的按pg/mL计的TNF-α水平，其是基于动物鉴别号通过ELISA测量的。
图9A显示了随时间的按pg/mL计的IL-6水平，其是基于动物鉴别号通过ELISA测量的。
图9B显示了随时间的按pg/mL计的IL-6水平，其是基于动物鉴别号由Rules-Based Medicine测量的。
图10显示了处理前期(基线期)、处理期和清洗期(处理后期)期间的T细胞亚群。白色条形代表对照动物(CTR)，而黑色条形代表按高脂肪和果糖补充饮食(HFD)的动物。
发明详述
I.处理和使用的方法
本文中提供了提高受试者中的胰岛素敏感性的方法，包括对受试者施用有效量的包含抗氧化的LDL抗体的组合物。本文中进一步提供了抗氧化的LDL抗体在制造用于提高受试者中的胰岛素敏感性的药物中的用途和在提高胰岛素敏感性中使用的药物，其包含选择性结合氧化的低密度脂蛋白(LDL)的表位的抗体。
在任何方法和用途的一些实施方案中，胰岛素敏感性提高至少约5％、10％、25％、50％、75％、100％、150％、或200％之任一。在一些实施方案中，胰岛素敏感性提高约5％、10％、25％、50％、75％、100％、150％、或200％之任一。在一些实施方案中，胰岛素抗性是降低的。在一些实施方案中，胰岛素抗性降低至少约5％、10％、25％、50％、75％、或90％之任一。在一些实施方案中，胰岛素抗性降低约5％、10％、25％、50％、75％、或90％之任一。与开始处理时相比，胰岛素敏感性可以是升高的。在一些实施方案中，与开始处理时相比，胰岛素抗性可以是降低的。如本文中所使用的，“开始处理时”指第一次暴露于抗氧化的LDL抗体时或之前的时段。在一些实施方案中，“开始处理时”是抗氧化的LDL抗体前约一年、9个月、6个月、3个月、第二个月、或1个月之任一。在一些实施方案中，“开始处理时”刚好就在第一次暴露于抗氧化的LDL抗体前。
在任何方法和用途的一些实施方案中，使用下列一种或多种测试来测试胰岛素敏感性和/或胰岛素抗性：高血胰岛素正常血糖钳(hyperinsulinemiceuglycemic clamp)、胰岛素抑制测试(IST)、胰岛素耐受性测试(ITT)、葡萄糖连续输注及模型评估(CIGMA)、静脉内葡萄糖耐受性测试(IVGTT)，口服葡萄糖耐受性测试(OGTT)、HOMA模型、空腹胰岛素(I0)、葡萄糖/胰岛素比率(G/I比率)和/或胰岛素敏感性指数(ISI)。
在任何方法和用途的一些实施方案中，通过高血胰岛素正常血糖钳测量胰岛素敏感性，所述高血胰岛素正常血糖钳测量在不引起低血糖的情况中补偿胰岛素水平升高必需的葡萄糖量。在该测试的最后30分钟期间的葡萄糖输注的速率决定胰岛素敏感性。若需要高水平(7.5mg/分钟或更高)，则患者是胰岛素敏感的。非常低的水平(4.0mg/分钟或更低)指示身体对胰岛素作用有抗性。4.0和7.5mg/分钟间的水平可以提示“受损的葡萄糖耐受性”，即胰岛素抗性的早期体征。受试者在开始处理时可以具有大于约9mg/分钟、8mg/分钟、7.5mg/分钟、7.0mg/分钟、6mg/分钟、5mg/分钟、或4mg/分钟之任一的葡萄糖输注速率。在一些实施方案中，胰岛素敏感性在受试者中可以是升高的，如通过在暴露于抗氧化的LDL抗体后小于约7.5mg/分钟、7.0mg/分钟、6mg/分钟、5mg/分钟、或4mg/分钟之任一的葡萄糖输注速率所指示的。
在任何方法和用途的一些实施方案中，使用胰岛素抑制测试(IST)来测试胰岛素敏感性。认为具有大于150mg/dl的稳态血浆葡萄糖(SSPG)水平的受试者是胰岛素抗性的。在一些实施方案中，受试者在开始处理时具有大于约150mg/dL、175mg/dL、或200mg/dL之任一的SSPG水平。在一些实施方案中，胰岛素敏感性在受试者中是升高的，如通过在暴露于抗氧化的LDL抗体后小于175mg/dL、150mg/dL、或125mg/dL的SSPG水平所指示的。
在任何方法和用途的一些实施方案中，使用葡萄糖耐受性测试，诸如OGTT或IVGTT来测试胰岛素敏感性。在一些实施方案中，受试者在两小时口服葡萄糖耐受性测试后具有约140mg/dL或更高的血糖水平。在一些实施方案中，受试者在两小时口服葡萄糖耐受性测试后具有约200mg/dL或更高的血糖水平。在一些实施方案中，受试者具有受损的葡萄糖耐受性(IGT)。在一些实施方案中，受试者在施用75g葡萄糖后2小时具有约140mg/dL或更高、150mg/dL或更高、160mg/dL或更高、170mg/dL或更高、180mg/dL或更高、190mg/dL或更高、或200mg/dL或更高之任一的血糖水平。在一些实施方案中，受试者在施用75g葡萄糖后2小时具有约140mg/dL、150mg/dL、160mg/dL、170mg/dL、180mg/dL、190mg/dL、或200mg/dL之任一的血糖水平。
在任何方法和用途的一些实施方案中，使用葡萄糖示踪剂。可以用稳定的或放射活性的原子标记葡萄糖。常用的示踪剂是3-3H葡萄糖(放射活性的)、6，62H-葡萄糖(稳定的)和1-13C葡萄糖(稳定的)。在开始高血胰岛素期前，3小时示踪剂输注使技术人员能够测定葡萄糖生成的基础速率。血浆示踪剂浓度实现全身胰岛素刺激的葡萄糖代谢及身体的葡萄糖生成(即，内源葡萄糖生成)的计算。
在任何方法和用途的一些实施方案中，受试者患有代谢综合征。在一些实施方案中，受试者有风险形成代谢综合征。受试者可以具有选自下组的一项或多项特征：(a)男性中约102cm或更多和女性中约88cm或更多的腰围，(b)约150mg/dL或更多的空腹甘油三酯，(c)约95mg/dL或更高的空腹葡萄糖，和(d)高水平的氧化的LDL。在一些实施方案中，受试者具有低于约40mg/dL(对于男性)和低于约50mg/dL(对于女性)的胆固醇水平。在一些实施方案中，受试者具有约130/85或之上或约140/90或之上的血压水平。在一些实施方案中，氧化的LDL的高水平是约大于或等于0.5nmol/mg、0.6nmol/mg、0.7nmol/mg、0.8nmol/mg、0.9nmol/mg、1.0nmol/mg脱辅蛋白质(apoprotein)的氧化的LDL之任一。
在任何方法和用途的一些实施方案中，空腹葡萄糖水平是约95mg/dL、100mg/dL、105mg/dL、110mg/dL、115mg/dL、120mg/dL、125mg/dL、或130mg/dL之任一。在一些实施方案中，空腹葡萄糖水平是约95mg/dL或更高、100mg/dL或更高、105mg/dL或更高、110mg/dL或更高、115mg/dL或更高、120mg/dL或更高、125mg/dL或更高、或130mg/dL或更高之任一。受试者在过夜禁食后可以具有约95mg/dL或更高的血糖水平。在一些实施方案中，受试者在过夜禁食后可以具有约126mg/dL或更高的血糖水平。
在任何方法和用途的一些实施方案中，对受试者施用有效量的包含选择性结合氧化的低密度脂蛋白(LDL)表位的抗体的组合物提高血糖控制(改善血糖控制)。在任何方法和用途的一些实施方案中，对受试者施用有效量的包含选择性结合氧化的低密度脂蛋白(LDL)表位的抗体的组合物提高脂质代谢和总体能量消耗。在一些实施方案中，通过比较用抗体处理前与用抗体处理后的水平来测定升高。
在任何方法和用途的一些实施方案中，受试者患有前驱糖尿病。在一些实施方案中，受试者患有糖尿病。在一些实施方案中，糖尿病选自下组：I型糖尿病、II型糖尿病和妊娠糖尿病。糖尿病可以是II型糖尿病。在一些实施方案中，本文中提供的方法或用途可用于治疗、预防或延迟糖尿病的进展。糖尿病可以选自下组：I型糖尿病、II型糖尿病和妊娠糖尿病。在一些实施方案中，本文中提供的方法或用途可用于阻止或延迟前驱糖尿病向糖尿病的进展。
在任何方法和用途的一些实施方案中，受试者患有心血管疾病或冠心病。心血管疾病或冠心病可以与糖尿病有关。心血管疾病或冠心病也可以与胰岛素抗性和代谢综合征有关。在一些实施方案中，受试者患有动脉粥样硬化。动脉粥样硬化可以与糖尿病有关。动脉粥样硬化也可以与胰岛素抗性和代谢综合征有关。
在任何方法和用途的一些实施方案中，受试者进一步患有炎症。炎症可以与糖尿病有关。
本文中还提供了降低受试者中的炎症的方法和/或抗氧化的LDL抗体在制备在降低受试者中的炎症中使用的药物中的用途，所述方法包括施用有效量的包含抗氧化的LDL抗体的组合物。在一些实施方案中，所述方法和用途包括在受试者中减轻炎症并提高胰岛素敏感性，如上文所描述的，包括施用有效量的包含抗氧化的LDL抗体的组合物。在一些实施方案中，炎症与糖尿病有关。在一些实施方案中，炎症是降低的，如通过降低炎性标志物的水平证明的。炎性标志物的水平可以降低约5％、10％、25％、50％、75％、或90％之任一。在一些实施方案中，炎性标志物的水平可以降低大于约5％、10％、25％、50％、75％、或90％之任一。炎性标志物可以选自下组：碱性FGF、IL-1β、IL-15、IL-8、IL-13、IL-6、MCP-1、EN-RAGE和TNF-α。在一些实施方案中，炎性标志物可以选自下组：IL-1β、IL-15、EN-RAGE和TNF-α。与开始用抗氧化的LDL抗体处理时的炎症或炎性标志物水平相比，炎症或炎性标志物水平可以是降低的。
在任何方法和用途的一些实施方案中，所述方法和用途还可以包括超过一种活性化合物，优选地那些具有没有彼此不利地影响的互补活性的。例如，可以期望进一步施用配制剂中的抗炎剂、抗糖尿病剂和/或“抑制素”类的胆固醇降低药物。在一些实施方案中，所述方法和用途包括施用第二活性剂。在一些实施方案中，所述方法和用途包括施用第二活性剂，其中所述第二活性剂是胰岛素。胰岛素是快速作用的、短时间作用的、规律作用的、中效作用的、或长效作用的胰岛素。在一些实施方案中，胰岛素可以是，和/或包含Humalog、Lispro、Novolog、Apidra、Humulin、Aspart、正规级胰岛素(regularinsulin)、NPH、Lente、Ultralente、Lantus、Glargine、Levemir、或Detemir。在一些实施方案中，所述方法和/或用途包括施用第二活性剂，其中所述第二活性剂是抑制素。抑制素可以是，和/或包含阿托伐他汀(Atorvastatin)(例如立普妥(Lipitor)或Torvast)、西立伐他汀(Cerivastatin)(例如Lipobay或Baycol)、氟伐他汀(Fluvastatin)(例如来适可(Lescol)或来适可(Lescol))、洛伐他汀(Lovastatin)(例如美降脂(Mevacor)、Altocor、或Altoprev)、美伐他汀(Mevastatin)、匹伐他汀(Pitavastatin)(例如Livalo或Pitava)、普伐他汀(Pravastatin)(例如，普拉固(Pravachol)、Selektine、或Lipostat)、罗苏伐他汀(Rosuvastatin)(例如Crestor)、辛伐他汀(Simvastatin)(例如舒降之(Zocor)或Lipex)、Vytorin、Advicor、Besylate Caduet或辛可(Simcor)。
在任何方法和用途的一些实施方案中，可以通过本领域中公知的方法和路径，诸如静脉内施用，例如以推注或者通过在一段时间里连续输注、通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、表面、或吸入路径施用抗氧化的LDL抗体。在本文中所描述的方法和用途包括超过一种活性剂时，该方法和用途可以包括与一种或多种其它(即，别的)活性剂组合施用抗氧化的LDL抗体。与一种或多种其它活性剂“组合”施用包括同时(并发)、以任何次序连续施用、及以任何次序序贯地施用。组合施用包括共施用(使用分开的配制剂或单一药物配制剂进行)、以任何次序的连续施用和以任何次序的序贯施用，其中优选地，存在着两种(或所有)活性剂同时施加其生物学活性的时段。优选地，此类组合疗法导致协同治疗效果。
如本文中所使用的，“处理”或“治疗”是一种用于获得有益的或期望的结果，包括临床结果的方法。出于本发明的目的，有益的或期望的结果包括但不限于下列一项或多项：降低一种或多种源自疾病的症状、减少疾病的程度、稳定疾病(例如，阻止或延迟疾病的恶化)、延迟或减缓疾病的进展、改善疾病状态、降低治疗疾病需要的一种或多种其它药物的剂量和/或提高生命质量。
如本文中所使用的，“延迟”进展意指推迟、阻碍、减缓、推后、稳定和/或延迟疾病的形成。此延迟可以随疾病史和/或所处理的个体而具有不同时间长度。
在任何方法和用途的一些实施方案中，本文中所描述的治疗方法改善一种或多种疾病症状(例如，降低发生、缩短持续时间、降低或减轻严重性)。
本文中的“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人、马、家畜、运动动物、啮齿类、灵长类和某些宠物。在一些实施方案中，哺乳动物是人。
“症状”是由受试者经历的任何病态现象或自结构、功能、或感觉常态的偏离。
表述“有效量”指有效提高胰岛素敏感性和/或减轻炎症(诸如与糖尿病有关的炎症)的抗体(或其它药物)量。此类有效量一般会导致胰岛素抗性和/或炎症的体征、症状或其它适应症的改善。
提及“约”，本文中的数值或参数包括(并且描述)涉及所述数值或参数本身的变化。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。
如本文和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个/一种”、“或”和“所述”包括复数提及物，除非上下文另有明确指示。可以理解的是，本文中所描述的本发明的诸方面和变型包括“由...组成”和/或“基本上由...组成”的各方面和变型。
II.抗体
本文中提供了在提高胰岛素敏感性的任何方法和/或用途中使用的抗氧化的LDL抗体。在一些实施方案中，抗氧化的LDL抗体结合氧化的LDL。
氧化的LDL含有可以被抗体识别的几个不同表位。LDL可以经由极其多种不同化学反应而经历氧化和降解变化。这些包括由氧、酶(例如，髓过氧化物酶)、金属离子(例如Fe2+和Cu2+)、自由基和其它类型的化学应激的活性引起的不同类型的修饰引起的反应。
一些氧化表位在LDL的蛋白质部分找到(Yang等，J.Lipid Res.42(11)：1891-6(2001))，而其它是存在于LDL颗粒中的脂质修饰。可以形成许多氧化修饰的且有生物学活性的磷脂(Heery等，J.Clin.Invest.96(5)：2322-30(1995)；Friedman等，J.Biol.Chem.277(9)：7010-20(2002)；Watson等，J.Biol.Chem.274(35)：34787-98(1999))。多不饱和脂肪酸被转化成脂肪酸氢过氧化物，其快速地形成高度反应性的产物诸如丙二醛和4-羟基壬烯酸(hydroxynonenal)(Smiley等，J.Biol.Chem.266(17)：11104-10(1991))。这些类型的中间产物可以继续与LDL的ApoB-100蛋白中的赖氨酸形成共价希夫(Schiff)碱和迈克尔(Michael)型产物。反应性醛也可以在磷酸卵磷酯模块中经由酯键附着的脂肪酸中找到(Witztum和Berliner，Curr.Opin.Lipidol.9(5)：441-8(1998))。经常找到的是磷脂1-棕榈酰-2-花生酰(arachidonoyl)sn-甘油-3-磷酰胆碱(PAPC)，即一种在sn-2氧化花生四烯酸的碳处产生醛的近末端氧化产物，生成POVPC(1-棕榈酰-2-(5-氧)戊酰(valeroyl)-sn-甘油-3-磷酸胆碱)。POVPC可以与赖氨酸起反应，而且还与含有胺的磷脂诸如磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸起反应。最终结果是多种氧化的脂质-蛋白质和氧化的脂质-脂质加合物。这些氧化中的一些是由诸如分泌的磷脂酶等酶驱动的(Leitinger等，Arterioscler Thromb Vasc.Biol.19(5)：1291-8(1999))。其它酶形成的变化诸如HOCL的硝化和添加通过髓过氧化物酶实施(Carr等，ArteriosclerThromb Vasc.Biol.20(7)：1716-23(2000))。认为所有新表位(neoepitope)是免疫原性和有生物学活性的(McIntyre等，J.Biol.Chem.274(36)：25189-92(1999))。由于对LDL颗粒的氧化修饰，而不是它们自身被氧化的隐藏表位，如磷酸胆碱和蛋白质片段也是氧化的LDL颗粒的标志，并且通过免疫疗法靶向此类表位。
在一些实施方案中，抗氧化的LDL抗体结合包含氧化的ApoB-100(例如，NP 000375.2)表位的氧化的LDL表位。在一些实施方案中，抗氧化的LDL抗体结合包含表1的氨基酸序列的氧化的ApoB-100表位。在一些实施方案中，抗氧化的LDL抗体能够结合由表1的序列组成的肽。在一些实施方案中，抗氧化的LDL抗体能够结合选自由SEQ ID NO：1-38组成的组的氧化的ApoB-100表位。
记载于WO 2002/080954、WO 2004/030607、Schiopu等，Circulation110(14)：2047-52(2004)和WO 2007/025781的每种抗体是可以在本发明的上下文中使用的抗体的例子，并且在此通过提及而收入它们。
表1.
Figure BDA0000158811850000131
Figure BDA0000158811850000141
Figure BDA0000158811850000151
如上文表1中所显示的，可以将肽分组成具有共同特征的7个类别：
A类：生成高水平的针对MDA经修饰的肽的IgG抗体的片段(n＝3)。
B类：生成高水平的IgM抗体、但是天然的与MDA-经修饰的肽间没有差异的片段(n＝9)。
C类：生成高水平的IgG抗体、但是天然的与MDA-经修饰的肽间没有10个差别的片段(n＝2)。
D类：生成高水平的针对MDA经修饰的肽的IgG抗体、，并且与AHP集合相比NHP集合中的抗体多至少两倍的片段(n＝5)。
E类：生成高水平的针对MDA经修饰的肽的IgM抗体、并且与AHP集合相比NHP集合中的抗体多至少两倍的片段(n＝11)。
F类：生成高水平的IgG抗体、但是完整的和MDA-经修饰的肽间没有差异、与NHP集合相比AHP集合中的抗体多至少两倍的片段(n＝7)。
G类：没有生成IgG或IgM抗体水平的片段。
在一些实施方案中，抗氧化的LDL抗体能够结合(例如结合)选自下组的氧化的ApoB-100的表位：SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：35，SEQ IDNO：36，SEQ ID NO：37。在一些实施方案中，抗氧化的LDL抗体能够结合选自下组的氧化的ApoB-100的表位：SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ IDNO：16和SEQ ID NO：32。在一些实施方案中，抗氧化的LDL抗体能够结合SEQ ID NO：32(IEIGLEGKGFEPTLEALFGK)。
应当领会，可以使用蛋白质化学技术，例如使用部分蛋白水解(外切水解或内切水解)，或者通过从头合成来生成ApoB-100的肽片段。或者，可以通过重组DNA技术来生成变体。适合于克隆、操作、修饰和表达核酸、及纯化表达的蛋白质的技术是本领域中公知的，并且记载于例如Sambrook等(2001)“Molecular Cloning，a Laboratory Manual”，第3版，Sambrook等(编)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，USA，通过提及而将其收入本文。
“肽”不仅包括通过肽(-CO-NH-)连接来连接氨基酸残基的分子，而且还有倒转肽键的分子。此类反-逆(retro-inverso)肽模拟物可以使用本领域中已知的方法，例如诸如那些记载于Meziere等，J.Immunol.159(7)：3230-7(1997)的方法来生成。此方法涉及生成含有涉及主链，而不是侧链取向的变化的假肽。至少对于MHC II类和T辅助细胞应答，显示了这些假肽是有用的。反-逆肽(其含有NH-CO键替代CO-NH肽键)对蛋白水解有多得多的抗性。类似地，可以一起消除肽键，只要使用保留氨基酸残基的Cα原子间的间隔的合适接头模块。在一些实施方案中，接头模块与肽键具有基本上相同的电荷分布和基本上相同的平面性。还应当领会，可以方便地将肽在其N或C端封闭，从而帮助降低对外切蛋白水解消化的易感性。
在一些实施方案中，氧化的LDL抗体结合表1(SEQ ID NO：1-38)中所列的ApoB-100的肽表位片段。表1(SEQ ID NO：1-38)中所列的“ApoB-100的肽表位片段”由表1(SEQ ID NO：1-38)中的给定序列的至少六个连续氨基酸组成。在一些实施方案中，ApoB-100的肽表位片段可以包含给定序列的约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19之任一的连续氨基酸。
在一些实施方案中，抗氧化的LDL抗体是针对LDL的氧化表位，诸如那些在表1(SEQ ID NO：1-38)中所列的表位生成的抗体。可以通过暴露于多种试剂，诸如铁、氧、铜、髓过氧化物酶、磷脂酶、次氯酸，或者通过丙二醛(malone dealdehyde，MDA)修饰以模拟可以在LDL氧化期间发生的不同氨基酸修饰来将肽氧化。或者，可以采用本领域中已知的其它方法来氧化的LDL的表位。
可以以本领域技术人员会显而易见的多种方式表征抗体。这些包括通过诸如ELISA等技术来物理测量其浓度及通过SDS-PAGE来测量抗体纯度。另外，可以通过在溶液中或在固相系统诸如ELISA、表面等离振子共振(例如BIAcore)或免疫荧光测定法中检测分子对氧化的LDL的结合来测定多肽的功效。在一些实施方案中，抗氧化的LDL抗体以比天然的和/或未氧化的LDL大的亲和力结合氧化的LDL(即，选择性结合氧化的LDL的表位)。在一些实施方案中，抗氧化的LDL抗体以比未氧化的LDL大至少约1.5、2、5、10、或50倍之任一的亲和力结合LDL的氧化表位。在一些实施方案中，抗氧化的LDL抗体分子以比未氧化的LDL大至少约100、1,000、或10,000倍之任一的亲和力结合LDL的氧化表位。可以通过本领域中公知的方法，诸如
Figure BDA0000158811850000161
系统之一来测定此类结合。在一些实施方案中，抗氧化的LDL抗体结合氧化的LDL的表位，但是不结合天然的/未氧化的LDL。可以例如通过记载于WO02/080954的方法来测定此类氧化的和天然的LDL表位。
在一些实施方案中，抗体具有至少约10-4M、10-6M、或10-8M或更高之任一的针对其靶表位的亲和力。
在一些实施方案中，抗氧化的LDL抗体进一步减轻炎症。在一些实施方案中，炎症与糖尿病有关。在一些实施方案中，抗氧化的LDL抗体进一步降低炎性标志物的水平。在一些实施方案中，炎性标志物选自下组：IL-1β、IL-15、IL-8、IL-6、MCP-1、EN-RAGE和TNF-α。在一些实施方案中，炎性标志物选自下组：IL-1β、IL-15、EN-RAGE和TNF-α。在一些实施方案中，与用抗氧化的LDL抗体处理前的炎症或炎性标志物水平相比，炎症或炎性标志物水平是降低的。
(i)定义
本文中的术语“抗体”以最广义使用，明确涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两个完整的抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们展现出期望的生物学活性。术语“免疫球蛋白”(Ig)在本文中与抗体可互换使用。
抗体是具有均基于免疫球蛋白折叠的不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，IgG抗体具有两条“重”链和两条“轻”链，它们进行二硫键键合以形成功能性抗体。每条重和轻链自身包含“恒定”(C)和“可变”(V)区。V区决定抗体的抗原结合特异性，而C区提供结构支持和与免疫效应器非抗原特异性相互作用的功能。抗体的抗原结合特异性或抗体的抗原结合片段是抗体特异性结合特定抗原的能力。
抗体的抗原结合特异性由V域的结构特征决定。变异性并非均匀分布于可变域的110个氨基酸范围。相反，V区由15-30个氨基酸的、相对不变的区段(称作框架区(FR))及将框架区分开的、每个长度为9-12个氨基酸的、高度变异的较短区域(称作“高变区”)构成。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR，它们大多采取β-片层构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-片层结构一部分的三个高变区连接。每条链中的高变区通过FR非常接近地保持在一起，并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(见Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991))。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出多种效应器功能，诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)中抗体的参与。
每个V区通常包含三个互补决定区(“CDR”，每个含有“高变环”)和四个框架区。因此，抗体结合位点，即以实质性亲和力结合特定期望抗原需要的最小结构单元通常会包含三个CDR和至少三个，优选地四个散布于其中以保持并呈现合适构象的CDR的框架区。经典的四链抗体具有由VH和VL域协作限定的抗原结合位点。某些抗体诸如骆驼和鲨鱼抗体缺乏轻链，并且依赖于仅由重链形成的结合位点。可以制备单域工程免疫球蛋白，其中在缺乏VH和VL间的协作的情况中由单独的重链或轻链形成结合位点。
遍及本说明书和权利要求书，除非另有指示，免疫球蛋白重链的恒定域中的残基的编号方式是EU索引的，如Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，Md.(1991)中的，通过提及而将其明确收入本文。“如Kabat中的EU索引”指人IgG1 EU抗体的残基编号方式。依照Kabat编号方式来编号V区中的残基，除非明确指示连续或其它编号系统。
术语“可变的”指可变域中的某些部分在抗体间序列差异很大，并且在每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性中使用的实情。然而，变异性并非遍及整个抗体可变域均匀分布。它集中于轻链和重链可变域两者中三个称作高变区的区段中。可变域的较为高度保守的部分称作框架区(FRs)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR，它们大多采取β-(折叠)片层构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-(折叠)片层结构一部分的三个高变区连接。每条链中的高变区通过FR非常接近地保持在一起，并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等，Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD，1991)。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出多种效应器功能，诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)中抗体的参与。
术语“高变区”在用于本文时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区可以包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如VL中大约残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)附近及VH中大约残基31-35B(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)附近(Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，Md，1991)和/或那些来自“高变环”的残基(例如VL中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)及VH中的残基26-32(H1)、52A-55(H2)和96-101(H3)(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。
“框架”或“FR”残基是与如本文中所限定的高变区残基不同的那些可变域残基。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。抗体片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。
用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的各具有单一抗原结合位点的抗原结合片段，称作“Fab”片段，和一个残余的“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点，而且仍能够交联抗原的F(ab’)2片段。
“Fv”是含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。此区域由非共价紧密结合的一个重链和一个轻链可变域的二聚体组成。每个可变域的三个高变区相互作用以限定VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点的正是处于此构型。六个高变环共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域(或只包含对抗原特异的三个CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于完整结合位点。
Fab片段还含有轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。Fab’片段由于在包含来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸的重链CH1域的羧基端添加几个残基与Fab片段不同。Fab’-SH是本文中关于Fab’的名称，其中恒定域的半胱氨酸残基携带至少一个游离的硫醇基团。F(ab’)2抗体片段最初以其间具有铰链半胱氨酸的Fab’片段对生成。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。
基于其恒定域的氨基酸序列，可将来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”归入两种截然不同的型之一，称为卡帕(kappa，κ)和拉姆达(lambda，λ)。
根据其重链恒定域氨基酸序列，抗体可归入不同的类。有五大类完整的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，且这些中的数种可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。与不同类的免疫球蛋白相对应的重链恒定域分别称作α、δ、ε、γ和μ。不同类免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是公知的。
““单链Fv”或“sFv”抗体片段包含抗体的VH和VL域，其中这些域存在于一条多肽链中。在一些实施方案中，Fv多肽在VH和VL域之间进一步包含多肽接头，使得sFv能够形成结合抗原的期望结构。关于sFv的综述见Plückthun于The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，第269页-第315页(1994)。
术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段，该片段包含在同一多肽链(VH-VL)中连接的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)。通过使用太短以致于不容许同一条链上的两个域间配对的接头，迫使所述域与另一条链的互补域配对，并创建两个抗原结合位点。双抗体更为全面地记载于例如，EP 404,097；WO 93/11161；及Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)。
如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了可以在单克隆抗体的生成期间生成的可能的变体(此类变体一般以极小量存在)外。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在其特异性外，单克隆抗体的有利之处在于它们不被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”指示如自一群基本上同质的抗体获得的抗体的特性，而不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，要依照本文中所提供的方法使用的单克隆抗体可以通过最初由Kohler等，Nature 256：495(1975)描述的杂交瘤方法来制备，或者可以通过重组DNA方法来制备(参见例如美国专利No.4,816,567)。“单克隆抗体”还可以使用例如Clackson等，Nature 352：624-628(1991)及Marks等，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)中记载的技术从噬菌体抗体库分离。
单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们表现所需的生物学活性(美国专利No.4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984))。本文中感兴趣的嵌合抗体包括包含衍生自非人灵长类动物(如旧大陆猴类(Old World Monkey)，诸如狒狒、猕猴或猕猴)的可变域抗原结合序列和人恒定区序列的“灵长类化(primatized)”抗体(美国专利No.5,693,780)。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。大体上，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、家兔或非人灵长类的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的框架区(FR)残基替换为相应的非人残基。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有发现的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。通常，人源化抗体包含至少一个、通常为两个基本上整个可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR，除了如上文所述的FR替代外。人源化抗体任选还包含至少部分免疫球蛋白恒定区，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones等，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332：323-329(1988)；及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。
出于本文中的目的，“完整的抗体”是包含重和轻可变域及Fc区的。
“天然抗体”指通常由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链间有变化。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫键。每条重链在一端具有一个可变域(VH)，接着是多个恒定域。每条轻链在一端具有一个可变域(VL)，而另一端是一个恒定域。轻链的恒定域与重链的第一恒定域排列在一起，而轻链的可变域与重链的可变域排列在一起。认为特定的氨基酸残基在轻链和重链可变域之间形成界面。
“天然抗体”指通常由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链间有变化。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫键。每条重链在一端具有一个可变域(VH)，接着是多个恒定域。每条轻链在一端具有一个可变域(VL)，而另一端是一个恒定域。轻链的恒定域与重链的第一恒定域排列在一起，而轻链的可变域与重链的可变域排列在一起。认为特定的氨基酸残基在轻链和重链可变域之间形成界面。
“裸抗体(裸露的抗体)”指未偶联异源分子，诸如细胞毒性模块或放射性标记物的抗体(如本文中限定的)。
“分离的”抗体是已经鉴定且与/自其天然环境的一种成分分开和/或回收的抗体。多肽的天然环境的污染性成分指会干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可以包括酶、激素和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在一些实施方案中，将抗体纯化至(1)大于95％(按抗体重量计)，如通过Lowry法测定的，且在一些实施方案中，超过99％(按重量计)，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据使用考马斯蓝或(在一些实施方案中)银染色的非还原性或还原性条件下的SDS-PAGE，达到同质。既然抗体的天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包含重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常会通过至少一个纯化步骤来制备。可以以任何程度分离或纯化本文中所描述的抗体或抗体片段。
“纯化的”意指抗体或抗体片段在纯度上已经升高，从而它以比其存在于其天然环境中和/或在实验室条件下最初合成和/或扩增时更纯的形式存在。纯度是相对术语，并且不必意味着绝对纯度。
在一些实施方案中，抗体“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的生物学活性，且随抗体同种型而变化。抗体效应器功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体的下调。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”指表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体，随后引起靶细胞裂解的细胞介导的反应。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。汇总的造血细胞上的FcR表达是Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.，9：457-92(1991)的第464页上的表3。为了评估目的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，诸如美国专利No.5,500,362或5,821,337中所述。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可在体内评估目的分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes等，PNAS(USA)95：652-656(1998)中所公开的。
“人效应细胞”指表达一种或多种FcR，并执行效应器功能的白细胞。在一个实施方案中，该细胞至少表达FcγRIII并实施ADCC效应器功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞，优选PBMC和NK细胞。
术语“Fc受体”或“FcR”用于描述与抗体Fc区结合的受体。在一个实施方案中，FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是与IgG抗体结合的FcR(γ受体)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，区别主要在于其胞质域。活化受体FcγRIIA在其胞质域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(见
Figure BDA0000158811850000231
Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997))。FcR的综述参见Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)；Capel等，Immunomethods 4：25-34(1994)；及de Haas等，J.Lab.Clin.Med.126：330-341(1995))。术语“FcR”在本文中涵盖其它FcR，包括未来将会鉴定的FcR。该术语还包括新生儿受体，FcRn，它负责将母体的IgG转移给胎儿(Guyer等，J.Immunol.117：587(1976)及Kim等，J.Immunol.24：249(1994))。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指在存在补体的情况中分子裂解靶物的能力。补体激活途径是由补体系统第一组分(C1q)结合与关联抗原复合的分子(例如抗体)启动的。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所述。
(ii)多克隆抗体
在一些实施方案中，抗氧化的LDL抗体是多克隆抗体。优选地，通过在动物中多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂(例如，相关抗原的，见PCT/GB2006/000987，通过提及将其完整收录)来生成多克隆抗体。使用双功能或衍生化剂，例如马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(经半胱氨酸残基的缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(经赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2、或R1N＝C＝NR，其中R和R1是不同的烃基，将相关抗原与在要免疫的物种中有免疫原性的蛋白质偶联可能是有用的，例如匙孔
Figure BDA0000158811850000232
血蓝蛋白、血清清蛋白、牛甲状腺球蛋白、或大豆胰蛋白酶抑制剂。
通过将例如100μg或5μg蛋白质或偶联物(分别用于家兔或小鼠)与3倍体积的弗氏完全佐剂混和，并将溶液皮内注射于多个部位，由此将动物针对抗原、免疫原性偶联物或衍生物进行免疫。一个月后，通过多个部位的皮下注射，用弗氏完全佐剂中1/5-1/10初始量的肽或偶联物对动物进行强化免疫。7-14天后，采集动物的血液，并测定血清的抗体滴度。对动物进行强化直到滴度达到稳定的高水平。在一些实施方案中，用相同抗原的，但是与不同蛋白质和/或经由不同交联试剂得到的缀合物加强动物。偶联物还可在重组细胞培养物中作为蛋白质融合物来制备。同样，适当使用凝聚剂诸如明矾来增强免疫应答。
(iii)单克隆抗体
在一些实施方案中，抗氧化的LDL抗体是单克隆抗体。单克隆抗体自一群基本上同质的抗体获得，即构成群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了可以在单克隆抗体的生成期间生成的可能的变体(此类变体一般以极小量存在)外。如此，修饰语“单克隆”指示抗体不是离散的或多克隆的抗体的混合物的特征。
例如，单克隆抗体可以使用最初由Kohler等，Nature 256：495(1975)记载的杂交瘤方法来制备，或者可以通过重组DNA方法来制备(美国专利No.4,816,567)。
在杂交瘤方法中，如本文中所描述的那样免疫小鼠或其它合适的宿主动物，诸如仓鼠，以引发生成或能够生成如下抗体的淋巴细胞，所述抗体会特异性结合用于免疫的蛋白质。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。然后，使用合适的融合剂诸如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，第59页-第103页，Academic Press，1986)。
将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养，所述培养基优选含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，那么用于杂交瘤的培养基通常会含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。
在一些实施方案中，骨髓瘤细胞是那些高效融合、支持选择的抗体生成细胞稳定地高水平生成抗体、并对培养基诸如HAT培养基敏感的骨髓瘤细胞。在一些实施方案中，这些之中，骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，诸如可从索尔克研究所细胞分配中心(Salk Institute Cell Distribution Center，SanDiege，California，USA)获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤所衍生的细胞系，以及可从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，Rockville，Maryland USA)获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞。用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也已有描述(Kozbor，J.Immunol.133：3001(1984)；Brodeur等，Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications，第51页-第63页，Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)。
可对杂交瘤细胞正在其中生长的培养基测定针对抗原的单克隆抗体的生成。在一些实施方案中，通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，诸如放射性免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)，测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。
单克隆抗体的结合亲和力可以通过例如Munson等，Anal.Biochem.107：220(1980)的Scatchard分析来测定。
在鉴定得到生成具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，所述克隆可通过有限稀释流程进行亚克隆，并通过标准方法进行培养(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103，Academic Press，1986)。适于这一目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可在动物中作为腹水瘤进行体内培养。
可通过常规免疫球蛋白纯化流程，诸如例如蛋白A-Sepharose、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析、或亲和层析，将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹水或血清适当分开。
编码单克隆抗体的DNA易于使用常规流程分离并测序(例如通过使用能够与编码鼠抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。在一些实施方案中，以杂交瘤细胞作为此类DNA的来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将该表达载体转染到不另外产生免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞中，诸如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述性论文包括Skerra等，Curr.Opinion in Immunol.5：256-262(1993)及Plückthun，Immunol.Revs.130：151-188(1992)。
在另一个实施方案中，可从使用McCafferty等，Nature 348：552-554(1990)所述技术构建的噬菌体抗体文库中分离抗体或抗体片段。Clackson等，Nature352：624-628(1991)及Marks等，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)分别描述了使用噬菌体文库分离鼠抗体和人抗体。后续出版物描述了通过链改组(Marks等，Bio/Technology 10：779-783(1992))，以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse等，Nuc.Acids Res.21：2265-2266(1993))，生成高亲和力(nM范围)的人抗体。如此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替换方法。
也可以修饰DNA，例如通过用人重和轻链恒定域的编码序列替代同源鼠序列(美国专利No.4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851(1984))，或通过将非免疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列共价连接至免疫球蛋白编码序列来进行。
通常，用此类非免疫球蛋白多肽替代抗体的恒定域，或者用它们替代抗体的一个抗原结合位点的可变域，以产生嵌合二价抗体，它包含对一种抗原具有特异性的一个抗原结合位点以及对不同抗原具有特异性的另一个抗原结合位点。
在一些实施方案中，单克隆抗体包含来自IEIA8、IEI-G8、IEI-D8、KTT-D6、1-B12、1-C07、1-C12、1-G10、2-F07、2-F09、4-A02、IEI-E3、2D03、LDO-D4和/或KTT-B8的一个或多个(至少1个、2个、3个、4个、5个、或6个)CDR。在一些实施方案中，单克隆抗体包含来自IEI-G8、IEI-D8、IEI-E3、2D03、LDO-D4和/或KTT-B8的一个或多个(至少1个、2个、3个、4个、5个、或6个)CDR。
在一些实施方案中，单克隆抗体包含来自选自下组的序列的一个或多个(至少1个、2个、3个、4个、5个、或6个)CDR：SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：72，SEQ ID NO：76，SEQ ID NO：80，SEQ ID NO：84，SEQ IDNO：88，SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：96，SEQ ID NO：100，SEQ ID NO：104，SEQID NO：108，SEQ ID NO：112，SEQ ID NO：116，SEQ ID NO：120，SEQ IDNO：124，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：70，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：78，SEQID NO：82，SEQ ID NO：86，SEQ ID NO：90，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：98，SEQ ID NO：102，SEQ ID NO：106，SEQ ID NO：110，SEQ ID NO：114，SEQ IDNO：118，SEQ ID NO：122和SEQ ID NO：126。在一些实施方案中，单克隆抗体包含自WO 2004/030607(通过提及而将其完整收录)的图3中的抗体的一个或多个VH和/或VL序列衍生的一个或多个(至少1个、2个、3个、4个、5个、或6个)CDR。在一些实施方案中，人源化抗体包含WO 2007/025781(通过提及而将其完整收录)的表2的抗体的一个或多个(至少1个、2个、3个、4个、5个、或6个)CDR。
在一些实施方案中，单克隆抗体包含一个或多个(至少1个、2个、3个、4个、5个、或6个)选自下组的CDR：CSGSNTNIGKNYVS(SEQ ID NO：39)、ANSNRPS(SEQ ID NO：40)、CASWDASLNGWV(SEQ ID NO：41)、FSNAWMSWVRQAPG(SEQ ID NO：42)、SSISVGGHRTYYADSVKGR，(SEQID NO：43)和ARIRVGPSGGAFDY(SEQ ID NO：44)。在一些实施方案中，单克隆抗体包含轻链可变域，其包含(i)包含序列CSGSNTNIGKNYVS(SEQ IDNO：39)的CDR-L1；(ii)包含序列ANSNRPS(SEQ ID NO：40)的CDR-L2；和(iii)包含序列CASWDASLNGWV(SEQ ID NO：41)的CDR-L3。在一些实施方案中，单克隆抗体包含重链可变域，其包含：(i)包含序列FSNAWMSWVRQAPG(SEQ ID NO：42)的CDR-H1；(ii)包含序列SSISVGGHRTYYADSVKGR(SEQID NO：43)的CDR-H2；和(iii)包含序列ARIRVGPSGGAFDY(SEQ ID NO：44)的CDR-H3。在一些实施方案中，单克隆抗体包含轻链可变域和重链可变域，所述轻链可变域包含(i)包含序列CSGSNTNIGKNYVS(SEQ ID NO：39)的CDR-L1；(ii)包含序列ANSNRPS(SEQ ID NO：40)的CDR-L2；和(iii)包含序列CASWDASLNGWV(SEQ ID NO：41)的CDR-L3，所述重链可变域包含(i)包含序列FSNAWMSWVRQAPG(SEQ ID NO：42)的CDR-H1；(ii)包含序列SSISVGGHRTYYADSVKGR(SEQ ID NO：43)的CDR-H2；和(iii)包含序列ARIRVGPSGGAFDY(SEQ ID NO：44)的CDR-H3。
在一些实施方案中，单克隆抗体包含一个或多个(至少1个、2个、3个、4个、5个、或6个)选自下组的CDR：CSGSSSNIGNNAVN(SEQ ID NO：45)、GNDRRPS(SEQ ID NO：46)、CQTWGTGRGV(SEQ ID NO：47)、FSDYYMSWVRQAPG(SEQ ID NO：48)、SGVSWNGSRTHYADSVKGR(SEQID NO：49)和ARAARYSYYYYGMDV(SEQ ID NO：50)。在一些实施方案中，单克隆抗体包含轻链可变域，其包含(i)包含序列CSGSSSNIGNNAVN(SEQID NO：45)的CDR-L1；(ii)包含序列GNDRRPS(SEQ ID NO：46)的CDR-L2；和(iii)包含序列CQTWGTGRGV(SEQ ID NO：47)的CDR-L3。在一些实施方案中，单克隆抗体包含重链可变域，其包含(i)包含序列FSDYYMSWVRQAPG(SEQ ID NO：48)的CDR-H1；(ii)包含序列SGVSWNGSRTHYADSVKGR(SEQID NO：49)的CDR-H2；和(iii)包含序列ARAARYSYYYYGMDV(SEQ IDNO：50)的CDR-H3。在一些实施方案中，单克隆抗体包含轻链可变域和重链可变域，所述轻链可变域包含(i)包含序列CSGSSSNIGNNAVN(SEQ IDNO：45)的CDR-L1；(ii)包含序列GNDRRPS(SEQ ID NO：46)的CDR-L2；和(iii)包含序列CQTWGTGRGV(SEQ ID NO：47)的CDR-L3，所述重链可变域包含(i)包含序列FSDYYMSWVRQAPG(SEQ ID NO：48)的CDR-H1；(ii)包含序列SGVSWNGSRTHYADSVKGR(SEQ ID NO：49)的CDR-H2；和(iii)包含序列ARAARYSYYYYGMDV(SEQ ID NO：50)的CDR-H3。
在一些实施方案中，单克隆抗体包含一个或多个(至少1个、2个、3个、4个、5个、或6个)选自下组的CDR：CSGSSSSIGNNFVS(SEQ ID NO：51)、DNNKRPS(SEQ ID NO：52)、CAAWDDSLNGWV(SEQ ID NO：53)、FSNAWMSWVRQAPG(SEQ ID NO：54)、SSISTSSNYIYYADSVKGR(SEQID NO：55)和ARVKKYSSGWYSNYAFDI(SEQ ID NO：56)。在一些实施方案中，单克隆抗体包含轻链可变域，其包含(i)包含序列CSGSSSSIGNNFVS(SEQ ID NO：51)的CDR-L1；(ii)包含序列DNNKRPS(SEQ ID NO：52)的CDR-L2；和(iii)包含序列CAAWDDSLNGWV(SEQ ID NO：53)的CDR-L3。在一些实施方案中，单克隆抗体包含重链可变域，其包含(i)包含序列FSNAWMSWVRQAPG(SEQ ID NO：54)的CDR-H1；(ii)包含序列SSISTSSNYIYYADSVKGR(SEQ ID NO：55)的CDR-H2；和(iii)包含序列ARVKKYSSGWYSNYAFDI(SEQ ID NO：56)的CDR-H3。在一些实施方案中，单克隆抗体包含轻链可变域和重链可变域，所述轻链可变域包含(i)包含序列CSGSSSSIGNNFVS(SEQ ID NO：51)的CDR-L1；(ii)包含序列DNNKRPS(SEQ ID NO：52)的CDR-L2；和(iii)包含序列CAAWDDSLNGWV(SEQ IDNO：53)的CDR-L3，所述重链可变域包含(i)包含序列FSNAWMSWVRQAPG(SEQ ID NO：54)的CDR-H1；(ii)包含序列SSISTSSNYIYYADSVKGR(SEQ IDNO：55)的CDR-H2；和(iii)包含序列ARVKKYSSGWYSNYAFDI(SEQ IDNO：56)的CDR-H3。
在一些实施方案中，单克隆抗体包含一个或多个(至少1个、2个、3个、4个、5个、或6个)选自下组的CDR：CSGSSSNIGGESVS(SEQ ID NO：57)、SNNQRPS(SEQ ID NO：58)、CAAWDDSLNGWV(SEQ ID NO：59)、FSSYAMSWVRQAPG(SEQ ID NO：60)、SSISSSGRFIYYADSMKGR(SEQ IDNO：61)和TRLRRGSYFWAFDI(SEQ ID NO：62)。在一些实施方案中，单克隆抗体包含轻链可变域，其包含(i)包含序列CSGSSSNIGGESVS(SEQ ID NO：57)的CDR-L1；(ii)包含序列SNNQRPS(SEQ ID NO：58)的CDR-L2；和(iii)包含序列CAAWDDSLNGWV(SEQ ID NO：59)的CDR-L3。在一些实施方案中，单克隆抗体包含重链可变域，其包含(i)包含序列FSSYAMSWVRQAPG(SEQ IDNO：60)的CDR-H1；(ii)包含序列SSISSSGRFIYYADSMKGR(SEQ ID NO：61)的CDR-H2；和(iii)包含序列TRLRRGSYFWAFDI(SEQ ID NO：62)的CDR-H3。在一些实施方案中，单克隆抗体包含轻链可变域和重链可变域，所述轻链可变域包含(i)包含序列CSGSSSNIGGESVS(SEQ ID NO：57)的CDR-L1；(ii)包含序列SNNQRPS(SEQ ID NO：58)的CDR-L2；和(iii)包含序列CAAWDDSLNGWV(SEQ ID NO：59)的CDR-L3，所述重链可变域包含(i)包含序列FSSYAMSWVRQAPG(SEQ ID NO：60)的CDR-H1；(ii)包含序列SSISSSGRFIYYADSMKGR(SEQ ID NO：61)的CDR-H2；和(iii)包含序列TRLRRGSYFWAFDI(SEQ ID NO：62)的CDR-H3。
在一些实施方案中，单克隆抗体包含一个或多个(至少1个、2个、3个、4个、5个、或6个)选自下组的CDR：CSGSSSNIGNNYVS(SEQ ID NO：127)、SNNQRPS(SEQ ID NO：128)、CAAWDDSLSHWL(SEQ ID NO：129)、FSNAWMSWVRQVPG(SEQ ID NO：130)、STLGGSGGGSTYYADSVKGR(SEQ ID NO：131)和AKLGGRSRYGRWPRQFDY(SEQ ID NO：132)。在一些实施方案中，单克隆抗体包含轻链可变域，其包含(i)包含序列CSGSSSNIGNNYVS(SEQ ID NO：127)的CDR-L1；(ii)包含序列SNNQRPS(SEQ ID NO：128)的CDR-L2；和(iii)包含序列CAAWDDSLSHWL(SEQ IDNO：129)的CDR-L3。在一些实施方案中，单克隆抗体包含重链可变域，其包含(i)包含序列FSNAWMSWVRQVPG(SEQ ID NO：130)的CDR-H1；(ii)包含序列STLGGSGGGSTYYADSVKGR(SEQ ID NO：131)的CDR-H2；和(iii)包含序列AKLGGRSRYGRWPRQFDY(SEQ ID NO：132)的CDR-H3。在一些实施方案中，单克隆抗体包含轻链可变域和重链可变域，所述轻链可变域包含(i)包含序列CSGSSSNIGNNYVS(SEQ ID NO：127)的CDR-L1；(ii)包含序列SNNQRPS(SEQ ID NO：128)的CDR-L2；和(iii)包含序列CAAWDDSLSHWL(SEQ ID NO：129)的CDR-L3，所述重链可变域包含(i)包含序列FSNAWMSWVRQVPG(SEQ ID NO：130)的CDR-H1；(ii)包含序列STLGGSGGGSTYYADSVKGR(SEQ ID NO：131)的CDR-H2；和(iii)包含序列AKLGGRSRYGRWPRQFDY(SEQ ID NO：132)的CDR-H3。
在一些实施方案中，单克隆抗体包含一个或多个(至少1个、2个、3个、4个、5个、或6个)选自下组的CDR：CSGSSSNIGSNYVS(SEQ ID NO：133)、GNYNRPS(SEQ ID NO：134)、CAAWDDSLSGWV(SEQ ID NO：135)、FSSYWMSWVRQAPG(SEQ ID NO：136)、SSISGSGRRTYYADSVQGR(SEQID NO：137)和ARLVSYGSGSFGFDY(SEQ ID NO：138)。在一些实施方案中，单克隆抗体包含轻链可变域，其包含(i)包含序列CSGSSSNIGSNYVS(SEQID NO：133)的CDR-L1；(ii)包含序列GNYNRPS(SEQ ID NO：134)的CDR-L2；和(iii)包含序列CAAWDDSLSGWV(SEQ ID NO：135)的CDR-L3。在一些实施方案中，单克隆抗体包含重链可变域，其包含(i)包含序列FSSYWMSWVRQAPG(SEQ ID NO：136)的CDR-H1；(ii)包含序列SSISGSGRRTYYADSVQGR(SEQ ID NO：137)的CDR-H2；和(iii)包含序列ARLVSYGSGSFGFDY(SEQ ID NO：138)的CDR-H3。在一些实施方案中，单克隆抗体包含轻链可变域和重链可变域，所述轻链可变域包含(i)包含序列CSGSSSNIGSNYVS(SEQ ID NO：133)的CDR-L1；(ii)包含序列GNYNRPS(SEQ ID NO：134)的CDR-L2；和(iii)包含序列CAAWDDSLSGWV(SEQ IDNO：135)的CDR-L3，所述重链可变域(i)包含序列FSSYWMSWVRQAPG(SEQ ID NO：136)的CDR-H1；(ii)包含序列SSISGSGRRTYYADSVQGR(SEQID NO：137)的CDR-H2；和(iii)包含序列ARLVSYGSGSFGFDY(SEQ IDNO：138)的CDR-H3。
在一些实施方案中，单克隆抗体包含一个或多个(至少1个、2个、3个、4个、5个、或6个)选自下组的CDR：CSGRSSNIGNSYVS(SEQ ID NO：139)、RNNQRPS(SEQ ID NO：140)、CAGWDDTLRAWV(SEQ ID NO：141)、FRDYYVSWIRQAPG(SEQ ID NO：142)、SSISGSGGRTYYADSVEGR(SEQID NO：143)和ARVSALRRPMTTVTTYWFDP(SEQ ID NO：144)。在一些实施方案中，在一些实施方案中，单克隆抗体包含轻链可变域，其包含(i)包含序列(SEQ ID NO：139)的CDR-L1；(ii)包含序列RNNQRPS(SEQ ID NO：140)的CDR-L2；和(iii)包含序列CAGWDDTLRAWV(SEQ ID NO：141)的CDR-L3。在一些实施方案中，单克隆抗体包含重链可变域，其包含(i)包含序列FRDYYVSWIRQAPG(SEQ ID NO：142)的CDR-H1；(ii)包含序列SSISGSGGRTYYADSVEGR(SEQ ID NO：143)的CDR-H2；和(iii)包含序列ARVSALRRPMTTVTTYWFDP(SEQ ID NO：144)的CDR-H3。在一些实施方案中，单克隆抗体包含轻链可变域和重链可变域，所述轻链可变域包含(i)包含序列(SEQ ID NO：139)的CDR-L1；(ii)包含序列RNNQRPS(SEQ ID NO：140)的CDR-L2；和(iii)包含序列CAGWDDTLRAWV(SEQ ID NO：141)的CDR-L3，所述重链可变域(i)包含序列FRDYYVSWIRQAPG(SEQ ID NO：142)的CDR-H1；(ii)包含序列SSISGSGGRTYYADSVEGR(SEQ ID NO：143)的CDR-H2；和(iii)包含序列ARVSALRRPMTTVTTYWFDP(SEQ ID NO：144)的CDR-H3。
(iv)人源化抗体
在一些实施方案中，抗氧化的LDL抗体是人源化抗体。本领域中已经描述了用于将非人抗体人源化的方法。在一些实施方案中，人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称作“输入”残基，它们通常取自“输入”可变域。人源化可基本上依照Winter及其同事的方法实施(Jones等，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature332：323-327(1988)；Verhoeyen等，Science 239：1534-1536(1988))，通过用高变区序列替代相应的人抗体序列来进行。因而，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利No.4,816,567)，其中基本上少于整个人可变域用来自非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体通常是将人抗体中的一些CDR残基和可能的一些FR残基用来自啮齿类抗体中类似位点的残基替代而得到的抗体。
用于生成人源化抗体的人可变域的选择(包括轻链和重链二者)对于降低抗原性是非常重要的。依照所谓的“最适(best-fit)”方法，用啮齿类抗体可变域序列对已知的人可变域序列的整个文库进行筛选。接受与啮齿类最接近的人序列作为人框架区(FR)用于人源化抗体(Sims等，J.Immunol.151：2296(1993)；Chothia等，J.Mol.Biol.196：901(1987))。另一种方法使用自轻或重链可变区的特定亚型的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架区。同一框架可用于数种不同的人源化抗体(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4285(1992)；Presta等，J.Immunol.151：2623(1993))。
更为重要的是，抗体在人源化后保持对抗原的高亲和力及其它有利的生物学特性。为了实现这一目的，在所述方法的一些实施方案中，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的，且为本领域熟练技术人员所熟悉。还可获得图解和显示所选择的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。检查这些显示图像能够分析残基在候选免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可从受体和输入序列中选出FR残基并进行组合，从而获得所需抗体特征，诸如对靶抗原的亲和力提高。通常，高变区残基直接且最实质的涉及对抗原结合的影响。
在一些实施方案中，人源化抗体包含来自IEIA8、IEI-G8、IEI-D8、KTT-D6、1-B12、1-C07、1-C12、1-G10、2-F07、2-F09、4-A02、IEI-E3、2D03、LDO-D4和/或KTT-B8的一个或多个(至少1个、2个、3个、4个、5个、或6个)CDR。在一些实施方案中，人源化抗体包含来自IEI-G8、IEI-D8、IEI-E3、2D03、LDO-D4和/或KTT-B8的一个或多个(至少1个、2个、3个、4个、5个、或6个)CDR。
在一些实施方案中，人源化抗体包含来自选自下组的序列的一个或多个(至少1个、2个、3个、4个、5个、或6个)CDR：SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：72，SEQ ID NO：76，SEQ ID NO：80，SEQ ID NO：84，SEQ IDNO：88，SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：96，SEQ ID NO：100，SEQ ID NO：104，SEQID NO：108，SEQ ID NO：112，SEQ ID NO：116，SEQ ID NO：120，SEQ IDNO：124，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：70，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：78，SEQID NO：82，SEQ ID NO：86，SEQ ID NO：90，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：98，SEQ ID NO：102，SEQ ID NO：106，SEQ ID NO：110，SEQ ID NO：114，SEQ IDNO：118，SEQ ID NO：122和SEQ ID NO：126。在一些实施方案中，人源化抗体包含自WO 2004/030607(通过提及而将其完整收录)的图3中的抗体的一个或多个VH和/或VL序列衍生的一个或多个(至少1个、2个、3个、4个、5个、或6个)CDR。在一些实施方案中，人源化抗体包含WO 2007/025781(通过提及而将其完整收录)的表2的抗体的一个或多个(至少1个、2个、3个、4个、5个、或6个)CDR。
在一些实施方案中，人源化抗体包含一个或多个(至少1个、2个、3个、4个、5个、或6个)选自下组的CDR：CSGSNTNIGKNYVS(SEQ ID NO：39)、ANSNRPS(SEQ ID NO：40)、CASWDASLNGWV(SEQ ID NO：41)、FSNAWMSWVRQAPG(SEQ ID NO：42)、SSISVGGHRTYYADSVKGR，(SEQID NO：43)和ARIRVGPSGGAFDY(SEQ ID NO：44)。在一些实施方案中，人源化抗体包含轻链可变域，其包含(i)包含序列CSGSNTNIGKNYVS(SEQ IDNO：39)的CDR-L1；(ii)包含序列ANSNRPS(SEQ ID NO：40)的CDR-L2；和(iii)包含序列CASWDASLNGWV(SEQ ID NO：41)的CDR-L3。在一些实施方案中，人源化抗体包含重链可变域，其包含：(i)包含序列FSNAWMSWVRQAPG(SEQ ID NO：42)的CDR-H1；(ii)包含序列SSISVGGHRTYYADSVKGR(SEQID NO：43)的CDR-H2；和(iii)包含序列ARIRVGPSGGAFDY(SEQ ID NO：44)的CDR-H3。在一些实施方案中，人源化抗体包含轻链可变域和重链可变域，所述轻链可变域包含(i)包含序列CSGSNTNIGKNYVS(SEQ ID NO：39)的CDR-L1；(ii)包含序列ANSNRPS(SEQ ID NO：40)的CDR-L2；和(iii)包含序列CASWDASLNGWV(SEQ ID NO：41)的CDR-L3，所述重链可变域包含(i)包含序列FSNAWMSWVRQAPG(SEQ ID NO：42)的CDR-H1；(ii)包含序列SSISVGGHRTYYADSVKGR(SEQ ID NO：43)的CDR-H2；和(iii)包含序列ARIRVGPSGGAFDY(SEQ ID NO：44)的CDR-H3。
在一些实施方案中，人源化抗体包含一个或多个(至少1个、2个、3个、4个、5个、或6个)选自下组的CDR：CSGSSSNIGNNAVN(SEQ ID NO：45)、GNDRRPS(SEQ ID NO：46)、CQTWGTGRGV(SEQ ID NO：47)、FSDYYMSWVRQAPG(SEQ ID NO：48)、SGVSWNGSRTHYADSVKGR(SEQID NO：49)和ARAARYSYYYYGMDV(SEQ ID NO：50)。在一些实施方案中，人源化抗体包含轻链可变域，其包含(i)包含序列CSGSSSNIGNNAVN(SEQID NO：45)的CDR-L1；(ii)包含序列GNDRRPS(SEQ ID NO：46)的CDR-L2；和(iii)包含序列CQTWGTGRGV(SEQ ID NO：47)的CDR-L3。在一些实施方案中，人源化抗体包含重链可变域，其包含(i)包含序列FSDYYMSWVRQAPG(SEQ ID NO：48)的CDR-H1；(ii)包含序列SGVSWNGSRTHYADSVKGR(SEQID NO：49)的CDR-H2；和(iii)包含序列ARAARYSYYYYGMDV(SEQ IDNO：50)的CDR-H3。在一些实施方案中，人源化抗体包含轻链可变域和重链可变域，所述轻链可变域包含(i)包含序列CSGSSSNIGNNAVN(SEQ IDNO：45)的CDR-L1；(ii)包含序列GNDRRPS(SEQ ID NO：46)的CDR-L2；和(iii)包含序列CQTWGTGRGV(SEQ ID NO：47)的CDR-L3，所述重链可变域包含(i)包含序列FSDYYMSWVRQAPG(SEQ ID NO：48)的CDR-H1；(ii)包含序列SGVSWNGSRTHYADSVKGR(SEQ ID NO：49)的CDR-H2；和(iii)包含序列ARAARYSYYYYGMDV(SEQ ID NO：50)的CDR-H3。
在一些实施方案中，人源化抗体包含一个或多个(至少1个、2个、3个、4个、5个、或6个)选自下组的CDR：CSGSSSSIGNNFVS(SEQ ID NO：51)、DNNKRPS(SEQ ID NO：52)、CAAWDDSLNGWV(SEQ ID NO：53)、FSNAWMSWVRQAPG(SEQ ID NO：54)、SSISTSSNYIYYADSVKGR(SEQID NO：55)和ARVKKYSSGWYSNYAFDI(SEQ ID NO：56)。在一些实施方案中，人源化抗体包含轻链可变域，其包含(i)包含序列CSGSSSSIGNNFVS(SEQ ID NO：51)的CDR-L1；(ii)包含序列DNNKRPS(SEQ ID NO：52)的CDR-L2；和(iii)包含序列CAAWDDSLNGWV(SEQ ID NO：53)的CDR-L3。在一些实施方案中，人源化抗体包含重链可变域，其包含(i)包含序列FSNAWMSWVRQAPG(SEQ ID NO：54)的CDR-H1；(ii)包含序列SSISTSSNYIYYADSVKGR(SEQ ID NO：55)的CDR-H2；和(iii)包含序列ARVKKYSSGWYSNYAFDI(SEQ ID NO：56)的CDR-H3。在一些实施方案中，人源化抗体包含轻链可变域和重链可变域，所述轻链可变域包含(i)包含序列CSGSSSSIGNNFVS(SEQ ID NO：51)的CDR-L1；(ii)包含序列DNNKRPS(SEQ ID NO：52)的CDR-L2；和(iii)包含序列CAAWDDSLNGWV(SEQ IDNO：53)的CDR-L3，所述重链可变域包含(i)包含序列FSNAWMSWVRQAPG(SEQ ID NO：54)的CDR-H1；(ii)包含序列SSISTSSNYIYYADSVKGR(SEQ IDNO：55)的CDR-H2；和(iii)包含序列ARVKKYSSGWYSNYAFDI(SEQ IDNO：56)的CDR-H3。
在一些实施方案中，人源化抗体包含一个或多个(至少1个、2个、3个、4个、5个、或6个)选自下组的CDR：CSGSSSNIGGESVS(SEQ ID NO：57)、SNNQRPS(SEQ ID NO：58)、CAAWDDSLNGWV(SEQ ID NO：59)、FSSYAMSWVRQAPG(SEQ ID NO：60)、SSISSSGRFIYYADSMKGR(SEQ IDNO：61)和TRLRRGSYFWAFDI(SEQ ID NO：62)。在一些实施方案中，人源化抗体包含轻链可变域，其包含(i)包含序列CSGSSSNIGGESVS(SEQ ID NO：57)的CDR-L1；(ii)包含序列SNNQRPS(SEQ ID NO：58)的CDR-L2；和(iii)包含序列CAAWDDSLNGWV(SEQ ID NO：59)的CDR-L3。在一些实施方案中，人源化抗体包含重链可变域，其包含(i)包含序列FSSYAMSWVRQAPG(SEQ IDNO：60)的CDR-H1；(ii)包含序列SSISSSGRFIYYADSMKGR(SEQ ID NO：61)的CDR-H2；和(iii)包含序列TRLRRGSYFWAFDI(SEQ ID NO：62)的CDR-H3。在一些实施方案中，人源化抗体包含轻链可变域和重链可变域，所述轻链可变域包含(i)包含序列CSGSSSNIGGESVS(SEQ ID NO：57)的CDR-L1；(ii)包含序列SNNQRPS(SEQ ID NO：58)的CDR-L2；和(iii)包含序列CAAWDDSLNGWV(SEQ ID NO：59)的CDR-L3，所述重链可变域包含(i)包含序列FSSYAMSWVRQAPG(SEQ ID NO：60)的CDR-H1；(ii)包含序列SSISSSGRFIYYADSMKGR(SEQ ID NO：61)的CDR-H2；和(iii)包含序列TRLRRGSYFWAFDI(SEQ ID NO：62)的CDR-H3。
在一些实施方案中，人源化抗体包含一个或多个(至少1个、2个、3个、4个、5个、或6个)选自下组的CDR：CSGSSSNIGNNYVS(SEQ ID NO：127)、SNNQRPS(SEQ ID NO：128)、CAAWDDSLSHWL(SEQ ID NO：129)、FSNAWMSWVRQVPG(SEQ ID NO：130)、STLGGSGGGSTYYADSVKGR(SEQ ID NO：131)和AKLGGRSRYGRWPRQFDY(SEQ ID NO：132)。在一些实施方案中，人源化抗体包含轻链可变域，其包含(i)包含序列CSGSSSNIGNNYVS(SEQ ID NO：127)的CDR-L1；(ii)包含序列SNNQRPS(SEQ ID NO：128)的CDR-L2；和(iii)包含序列CAAWDDSLSHWL(SEQ IDNO：129)的CDR-L3。在一些实施方案中，人源化抗体包含重链可变域，其包含(i)包含序列FSNAWMSWVRQVPG(SEQ ID NO：130)的CDR-H1；(ii)包含序列STLGGSGGGSTYYADSVKGR(SEQ ID NO：131)的CDR-H2；和(iii)包含序列AKLGGRSRYGRWPRQFDY(SEQ ID NO：132)的CDR-H3。在一些实施方案中，人源化抗体包含轻链可变域和重链可变域，所述轻链可变域包含(i)包含序列CSGSSSNIGNNYVS(SEQ ID NO：127)的CDR-L1；(ii)包含序列SNNQRPS(SEQ ID NO：128)的CDR-L2；和(iii)包含序列CAAWDDSLSHWL(SEQ ID NO：129)的CDR-L3，所述重链可变域包含(i)包含序列FSNAWMSWVRQVPG(SEQ ID NO：130)的CDR-H1；(ii)包含序列STLGGSGGGSTYYADSVKGR(SEQ ID NO：131)的CDR-H2；和(iii)包含序列AKLGGRSRYGRWPRQFDY(SEQ ID NO：132)的CDR-H3。
在一些实施方案中，人源化抗体包含一个或多个(至少1个、2个、3个、4个、5个、或6个)选自下组的CDR：CSGSSSNIGSNYVS(SEQ ID NO：133)、GNYNRPS(SEQ ID NO：134)、CAAWDDSLSGWV(SEQ ID NO：135)、FSSYWMSWVRQAPG(SEQ ID NO：136)、SSISGSGRRTYYADSVQGR(SEQID NO：137)和ARLVSYGSGSFGFDY(SEQ ID NO：138)。在一些实施方案中，人源化抗体包含轻链可变域，其包含(i)包含序列CSGSSSNIGSNYVS(SEQID NO：133)的CDR-L1；(ii)包含序列GNYNRPS(SEQ ID NO：134)的CDR-L2；和(iii)包含序列CAAWDDSLSGWV(SEQ ID NO：135)的CDR-L3。在一些实施方案中，人源化抗体包含重链可变域，其包含(i)包含序列FSSYWMSWVRQAPG(SEQ ID NO：136)的CDR-H1；(ii)包含序列SSISGSGRRTYYADSVQGR(SEQ ID NO：137)的CDR-H2；和(iii)包含序列ARLVSYGSGSFGFDY(SEQ ID NO：138)的CDR-H3。在一些实施方案中，人源化抗体包含轻链可变域和重链可变域，所述轻链可变域包含(i)包含序列CSGSSSNIGSNYVS(SEQ ID NO：133)的CDR-L1；(ii)包含序列GNYNRPS(SEQ ID NO：134)的CDR-L2；和(iii)包含序列CAAWDDSLSGWV(SEQ IDNO：135)的CDR-L3，所述重链可变域(i)包含序列FSSYWMSWVRQAPG(SEQ ID NO：136)的CDR-H1；(ii)包含序列SSISGSGRRTYYADSVQGR(SEQID NO：137)的CDR-H2；和(iii)包含序列ARLVSYGSGSFGFDY(SEQ IDNO：138)的CDR-H3。
在一些实施方案中，人源化抗体包含一个或多个(至少1个、2个、3个、4个、5个、或6个)选自下组的CDR：CSGRSSNIGNSYVS(SEQ ID NO：139)、RNNQRPS(SEQ ID NO：140)、CAGWDDTLRAWV(SEQ ID NO：141)、FRDYYVSWIRQAPG(SEQ ID NO：142)、SSISGSGGRTYYADSVEGR(SEQID NO：143)和ARVSALRRPMTTVTTYWFDP(SEQ ID NO：144)。在一些实施方案中，在一些实施方案中，人源化抗体包含轻链可变域，其包含(i)包含序列(SEQ ID NO：139)的CDR-L1；(ii)包含序列RNNQRPS(SEQ ID NO：140)的CDR-L2；和(iii)包含序列CAGWDDTLRAWV(SEQ ID NO：141)的CDR-L3。在一些实施方案中，人源化抗体包含重链可变域，其包含(i)包含序列FRDYYVSWIRQAPG(SEQ ID NO：142)的CDR-H1；(ii)包含序列SSISGSGGRTYYADSVEGR(SEQ ID NO：143)的CDR-H2；和(iii)包含序列ARVSALRRPMTTVTTYWFDP(SEQ ID NO：144)的CDR-H3。在一些实施方案中，人源化抗体包含轻链可变域和重链可变域，所述轻链可变域包含(i)包含序列(SEQ ID NO：139)的CDR-L1；(ii)包含序列RNNQRPS(SEQ ID NO：140)的CDR-L2；和(iii)包含序列CAGWDDTLRAWV(SEQ ID NO：141)的CDR-L3，所述重链可变域(i)包含序列FRDYYVSWIRQAPG(SEQ ID NO：142)的CDR-H1；(ii)包含序列SSISGSGGRTYYADSVEGR(SEQ ID NO：143)的CDR-H2；和(iii)包含序列ARVSALRRPMTTVTTYWFDP(SEQ ID NO：144)的CDR-H3。
(v)人抗体
在一些实施方案中，抗氧化的LDL抗体是人抗体。作为人源化的替代方法，可生成人抗体。例如，现在有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫后生成人抗体完整全集的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经描述了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合删除导致对内源抗体生成的完全抑制。将人种系免疫球蛋白基因阵列(array)转移到此类种系突变小鼠中会导致在抗原攻击后生成人抗体。参见例如Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2551(1993)；Jakobovits等，Nature 362：255-258(1993)；Bruggemann等，Year in Immuno.7：33(1993)；及美国专利No.5,591,669；5,589,369；及5,545,807。
或者，噬菌体展示技术(McCafferty等，Nature 348：552-553(1990))可用于在体外从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)域基因全集生成人抗体和抗体片段。依照这种技术，将抗体V结构域基因以符合读码框的方式克隆到丝状噬菌体诸如M13或fd的主要或次要外壳蛋白基因中，并在噬菌体颗粒表面上展示为功能性抗体片段。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，以抗体的功能特性为基础进行的选择也导致编码展示那些特性的抗体的基因的选择。如此，噬菌体模拟B细胞的一些特性。噬菌体展示可以多种形式进行，关于其综述，见例如Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，CurrentOpinion in Structural Biology 3：564-571(1993)。V基因区段的数种来源可用于噬菌体展示。Clackson等，Nature 352：624-628(1991)从衍生自免疫小鼠脾的小型V基因随机组合文库分离得到大量不同的抗
Figure BDA0000158811850000371
唑酮抗体。可基本上遵循Marks等，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)或Griffith等，EMBO J.12：725-734(1993)所述技术，由未免疫人供体构建V基因全集，并分离针对大量不同抗原(包括自身抗原)的抗体。还可参见美国专利No.5,565,332和5,573,905。
还可通过体外激活B细胞(参见美国专利No.5,567,610和5,229,275)来生成人抗体。
在一些实施方案中，人抗体包含来自IEIA8、IEI-G8、IEI-D8、KTT-D6、1-B12、1-C07、1-C12、1-G10、2-F07、2-F09、4-A02、IEI-E3、2D03、LDO-D4和/或KTT-B8的一个或多个(至少1个、2个、3个、4个、5个、或6个)CDR。在一些实施方案中，人抗体包含来自IEI-E3、2D03、LDO-D4和/或KTT-B8的一个或多个(至少1个、2个、3个、4个、5个、或6个)CDR。
在一些实施方案中，人抗体包含选自表2的轻链可变域或重链可变域的人抗体。在一些实施方案中，人抗体包含选自下组的重链可变域：SEQ IDNO：64，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：72，SEQ ID NO：76，SEQ ID NO：80，SEQID NO：84，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：96，SEQ ID NO：100，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：108，SEQ ID NO：112，SEQ ID NO：116，SEQ IDNO：120和SEQ ID NO：124。在一些实施方案中，人抗体包含选自下组的轻链可变域：SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：70，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：78，SEQID NO：82，SEQ ID NO：86，SEQ ID NO：90，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：98，SEQ ID NO：102，SEQ ID NO：106，SEQ ID NO：110，SEQ ID NO：114，SEQ IDNO：118，SEQ ID NO：122和SEQ ID NO：126。在一些实施方案中，人抗体包含含有SEQ ID NO：104的重链可变域和含有SEQ ID NO：106的轻链可变域。在一些实施方案中，人抗体包含含有SEQ ID NO：68的重链可变域和含有SEQID NO：70的轻链可变域。在一些实施方案中，人抗体包含含有SEQ ID NO：96的重链可变域和含有SEQ ID NO：98的轻链可变域。
在一些实施方案中，人抗体包含一个或多个(至少1个、2个、3个、4个、5个、或6个)来自选自下组的序列的CDR：SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：68，SEQID NO：72，SEQ ID NO：76，SEQ ID NO：80，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：96，SEQ ID NO：100，SEQ ID NO：104，SEQ IDNO：108，SEQ ID NO：112，SEQ ID NO：116，SEQ ID NO：120，SEQ ID NO：124，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：70，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：78，SEQ IDNO：82，SEQ ID NO：86，SEQ ID NO：90，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：98，SEQID NO：102，SEQ ID NO：106，SEQ ID NO：110，SEQ ID NO：114，SEQ IDNO：118，SEQ ID NO：122和SEQ ID NO：126。在一些实施方案中，人抗体包含自WO 2004/030607(通过提及而将其完整收录)的图3中的抗体的一个或多个VH和/或VL序列衍生的一个或多个(至少1个、2个、3个、4个、5个、或6个)CDR。在一些实施方案中，在一些实施方案中，人抗体包含WO2007/025781(通过提及而将其完整收录)的表2的抗体的一个或多个(至少1个、2个、3个、4个、5个、或6个)CDR。
表2.
Figure BDA0000158811850000391
Figure BDA0000158811850000411
Figure BDA0000158811850000421
Figure BDA0000158811850000431
Figure BDA0000158811850000441
Figure BDA0000158811850000461
在一些实施方案中，人抗体包含一个或多个(至少1个、2个、3个、4个、5个、或6个)选自下组的CDR：CSGSNTNIGKNYVS(SEQ ID NO：39)、ANSNRPS(SEQ ID NO：40)、CASWDASLNGWV(SEQ ID NO：41)、FSNAWMSWVRQAPG(SEQ ID NO：42)、SSISVGGHRTYYADSVKGR，(SEQID NO：43)和ARIRVGPSGGAFDY(SEQ ID NO：44)。在一些实施方案中，人抗体包含轻链可变域，其包含(i)包含序列CSGSNTNIGKNYVS(SEQ IDNO：39)的CDR-L1；(ii)包含序列ANSNRPS(SEQ ID NO：40)的CDR-L2；和(iii)包含序列CASWDASLNGWV(SEQ ID NO：41)的CDR-L3。在一些实施方案中，人抗体包含重链可变域，其包含(i)包含序列FSNAWMSWVRQAPG(SEQID NO：42)的CDR-H1；(ii)包含序列SSISVGGHRTYYADSVKGR(SEQ IDNO：43)的CDR-H2；和(iii)包含序列ARIRVGPSGGAFDY(SEQ ID NO：44)的CDR-H3。在一些实施方案中，人源化抗体包含轻链可变域和重链可变域，所述轻链可变域包含(i)包含序列CSGSNTNIGKNYVS(SEQ ID NO：39)的CDR-L1；(ii)包含序列ANSNRPS(SEQ ID NO：40)的CDR-L2；和(iii)包含序列CASWDASLNGWV(SEQ ID NO：41)的CDR-L3，所述重链可变域包含(i)包含序列FSNAWMSWVRQAPG(SEQ ID NO：42)的CDR-H1；(ii)包含序列SSISVGGHRTYYADSVKGR(SEQ ID NO：43)的CDR-H2；和(iii)包含序列ARIRVGPSGGAFDY(SEQ ID NO：44)的CDR-H3。
在一些实施方案中，人抗体包含一个或多个(至少1个、2个、3个、4个、5个、或6个)选自下组的CDR：CSGSSSNIGNNAVN(SEQ ID NO：45)、GNDRRPS(SEQ ID NO：46)、CQTWGTGRGV(SEQ ID NO：47)、FSDYYMSWVRQAPG(SEQ ID NO：48)、SGVSWNGSRTHYADSVKGR(SEQID NO：49)和ARAARYSYYYYGMDV(SEQ ID NO：50)。在一些实施方案中，人抗体包含轻链可变域，其包含(i)包含序列CSGSSSNIGNNAVN(SEQ IDNO：45)的CDR-L1；(ii)包含序列GNDRRPS(SEQ ID NO：46)的CDR-L2；和(iii)包含序列CQTWGTGRGV(SEQ ID NO：47)的CDR-L3。在一些实施方案中，人抗体包含重链可变域，其包含(i)包含序列FSDYYMSWVRQAPG(SEQ IDNO：48)的CDR-H1；(ii)包含序列SGVSWNGSRTHYADSVKGR(SEQ IDNO：49)的CDR-H2；和(iii)包含序列ARAARYSYYYYGMDV(SEQ ID NO：50)的CDR-H3。在一些实施方案中，人抗体包含轻链可变域和重链可变域，所述轻链可变域包含(i)包含序列CSGSSSNIGNNAVN(SEQ ID NO：45)的CDR-L1；(ii)包含序列GNDRRPS(SEQ ID NO：46)的CDR-L2；和(iii)包含序列CQTWGTGRGV(SEQ ID NO：47)的CDR-L3，所述重链可变域包含(i)包含序列FSDYYMSWVRQAPG(SEQ ID NO：48)的CDR-H1；(ii)包含序列SGVSWNGSRTHYADSVKGR(SEQ ID NO：49)的CDR-H2；和(iii)包含序列ARAARYSYYYYGMDV(SEQ ID NO：50)的CDR-H3。
在一些实施方案中，人抗体包含一个或多个(至少1个、2个、3个、4个、5个、或6个)选自下组的CDR：CSGSSSSIGNNFVS(SEQ ID NO：51)、DNNKRPS(SEQ ID NO：52)、CAAWDDSLNGWV(SEQ ID NO：53)、FSNAWMSWVRQAPG(SEQ ID NO：54)、SSISTSSNYIYYADSVKGR(SEQID NO：55)和ARVKKYSSGWYSNYAFDI(SEQ ID NO：56)。在一些实施方案中，人抗体包含轻链可变域，其包含(i)包含序列CSGSSSSIGNNFVS(SEQ IDNO：51)的CDR-L1；(ii)包含序列DNNKRPS(SEQ ID NO：52)的CDR-L2；和(iii)包含序列CAAWDDSLNGWV(SEQ ID NO：53)的CDR-L3。在一些实施方案中，人抗体包含重链可变域，其包含(i)包含序列FSNAWMSWVRQAPG(SEQID NO：54)的CDR-H1；(ii)包含序列SSISTSSNYIYYADSVKGR(SEQ IDNO：55)的CDR-H2；和(iii)包含序列ARVKKYSSGWYSNYAFDI(SEQ IDNO：56)的CDR-H3。在一些实施方案中，人抗体包含轻链可变域和重链可变域，所述轻链可变域包含(i)包含序列CSGSSSSIGNNFVS(SEQ ID NO：51)的CDR-L1；(ii)包含序列DNNKRPS(SEQ ID NO：52)的CDR-L2；和(iii)包含序列CAAWDDSLNGWV(SEQ ID NO：53)的CDR-L3，所述重链可变域包含(i)包含序列FSNAWMSWVRQAPG(SEQ ID NO：54)的CDR-H1；(ii)包含序列SSISTSSNYIYYADSVKGR(SEQ ID NO：55)的CDR-H2；和(iii)包含序列ARVKKYSSGWYSNYAFDI(SEQ ID NO：56)的CDR-H3。
在一些实施方案中，人抗体包含一个或多个(至少1个、2个、3个、4个、5个、或6个)选自下组的CDR：CSGSSSNIGGESVS(SEQ ID NO：57)、SNNQRPS(SEQ ID NO：58)、CAAWDDSLNGWV(SEQ ID NO：59)、FSSYAMSWVRQAPG(SEQ ID NO：60)、SSISSSGRFIYYADSMKGR(SEQ IDNO：61)和TRLRRGSYFWAFDI(SEQ ID NO：62)。在一些实施方案中，人抗体包含轻链可变域，其包含(i)包含序列CSGSSSNIGGESVS(SEQ ID NO：57)的CDR-L1；(ii)包含序列SNNQRPS(SEQ ID NO：58)的CDR-L2；和(iii)包含序列CAAWDDSLNGWV(SEQ ID NO：59)的CDR-L3。在一些实施方案中，人抗体包含重链可变域，其包含(i)包含序列FSSYAMSWVRQAPG(SEQ ID NO：60)的CDR-H1；(ii)包含序列SSISSSGRFIYYADSMKGR(SEQ ID NO：61)的CDR-H2；和(iii)包含序列TRLRRGSYFWAFDI(SEQ ID NO：62)的CDR-H3。在一些实施方案中，人抗体包含轻链可变域和重链可变域，所述轻链可变域包含(i)包含序列CSGSSSNIGGESVS(SEQ ID NO：57)的CDR-L1；(ii)包含序列SNNQRPS(SEQ ID NO：58)的CDR-L2；和(iii)包含序列CAAWDDSLNGWV(SEQ ID NO：59)的CDR-L3，所述重链可变域包含(i)包含序列FSSYAMSWVRQAPG(SEQ ID NO：60)的CDR-H1；(ii)包含序列SSISSSGRFIYYADSMKGR(SEQ ID NO：61)的CDR-H2；和(iii)包含序列TRLRRGSYFWAFDI(SEQ ID NO：62)的CDR-H3。
在一些实施方案中，人抗体包含一个或多个(至少1个、2个、3个、4个、5个、或6个)选自下组的CDR：CSGSSSNIGNNYVS(SEQ ID NO：127)、SNNQRPS(SEQ ID NO：128)、CAAWDDSLSHWL(SEQ ID NO：129)、FSNAWMSWVRQVPG(SEQ ID NO：130)、STLGGSGGGSTYYADSVKGR(SEQ ID NO：131)和AKLGGRSRYGRWPRQFDY(SEQ ID NO：132)。在一些实施方案中，人抗体包含轻链可变域，其包含(i)包含序列CSGSSSNIGNNYVS(SEQ ID NO：127)的CDR-L1；(ii)包含序列SNNQRPS(SEQ ID NO：128)的CDR-L2；和(iii)包含序列CAAWDDSLSHWL(SEQ ID NO：129)的CDR-L3。在一些实施方案中，人抗体包含重链可变域，其包含(i)包含序列FSNAWMSWVRQVPG(SEQ ID NO：130)的CDR-H1；(ii)包含序列STLGGSGGGSTYYADSVKGR(SEQ ID NO：131)的CDR-H2；和(iii)包含序列AKLGGRSRYGRWPRQFDY(SEQ ID NO：132)的CDR-H3。在一些实施方案中，人抗体包含轻链可变域和重链可变域，所述轻链可变域包含(i)包含序列CSGSSSNIGNNYVS(SEQ ID NO：127)的CDR-L1；(ii)包含序列SNNQRPS(SEQ ID NO：128)的CDR-L2；和(iii)包含序列CAAWDDSLSHWL(SEQ IDNO：129)的CDR-L3，所述重链可变域包含(i)包含序列FSNAWMSWVRQVPG(SEQ ID NO：130)的CDR-H1；(ii)包含序列STLGGSGGGSTYYADSVKGR(SEQ ID NO：131)的CDR-H2；和(iii)包含序列AKLGGRSRYGRWPRQFDY(SEQ ID NO：132)的CDR-H3。
在一些实施方案中，人抗体包含一个或多个(至少1个、2个、3个、4个、5个、或6个)选自下组的CDR：CSGSSSNIGSNYVS(SEQ ID NO：133)、GNYNRPS(SEQ ID NO：134)、CAAWDDSLSGWV(SEQ ID NO：135)、FSSYWMSWVRQAPG(SEQ ID NO：136)、SSISGSGRRTYYADSVQGR(SEQID NO：137)和ARLVSYGSGSFGFDY(SEQ ID NO：138)。在一些实施方案中，人抗体包含轻链可变域，其包含(i)包含序列CSGSSSNIGSNYVS(SEQ IDNO：133)的CDR-L1；(ii)包含序列GNYNRPS(SEQ ID NO：134)的CDR-L2；和(iii)包含序列CAAWDDSLSGWV(SEQ ID NO：135)的CDR-L3。在一些实施方案中，人抗体包含重链可变域，其包含(i)包含序列FSSYWMSWVRQAPG(SEQ ID NO：136)的CDR-H1；(ii)包含序列SSISGSGRRTYYADSVQGR(SEQID NO：137)的CDR-H2；和(iii)包含序列ARLVSYGSGSFGFDY(SEQ IDNO：138)的CDR-H3。在一些实施方案中，人抗体包含轻链可变域和重链可变域，所述轻链可变域包含(i)包含序列CSGSSSNIGSNYVS(SEQ ID NO：133)的CDR-L1；(ii)包含序列GNYNRPS(SEQ ID NO：134)的CDR-L2；和(iii)包含序列CAAWDDSLSGWV(SEQ ID NO：135)的CDR-L3，所述重链可变域(i)包含序列FSSYWMSWVRQAPG(SEQ ID NO：136)的CDR-H1；(ii)包含序列SSISGSGRRTYYADSVQGR(SEQ ID NO：137)的CDR-H2；和(iii)包含序列ARLVSYGSGSFGFDY(SEQ ID NO：138)的CDR-H3。
在一些实施方案中，人抗体包含一个或多个(至少1个、2个、3个、4个、5个、或6个)选自下组的CDR：CSGRSSNIGNSYVS(SEQ ID NO：139)、RNNQRPS(SEQ ID NO：140)、CAGWDDTLRAWV(SEQ ID NO：141)、FRDYYVSWIRQAPG(SEQ ID NO：142)、SSISGSGGRTYYADSVEGR(SEQID NO：143)和ARVSALRRPMTTVTTYWFDP(SEQ ID NO：144)。在一些实施方案中，在一些实施方案中，人抗体包含轻链可变域，其包含(i)包含序列(SEQID NO：139)的CDR-L1；(ii)包含序列RNNQRPS(SEQ ID NO：140)的CDR-L2；和(iii)包含序列CAGWDDTLRAWV(SEQ ID NO：141)的CDR-L3。在一些实施方案中，人抗体包含重链可变域，其包含(i)包含序列FRDYYVSWIRQAPG(SEQ ID NO：142)的CDR-H1；(ii)包含序列SSISGSGGRTYYADSVEGR(SEQID NO：143)的CDR-H2；和(iii)包含序列ARVSALRRPMTTVTTYWFDP(SEQID NO：144)的CDR-H3。在一些实施方案中，人抗体包含轻链可变域和重链可变域，所述轻链可变域包含(i)包含序列(SEQ ID NO：139)的CDR-L1；(ii)包含序列RNNQRPS(SEQ ID NO：140)的CDR-L2；和(iii)包含序列CAGWDDTLRAWV(SEQ ID NO：141)的CDR-L3，所述重链可变域(i)包含序列FRDYYVSWIRQAPG(SEQ ID NO：142)的CDR-H1；(ii)包含序列SSISGSGGRTYYADSVEGR(SEQ ID NO：143)的CDR-H2；和(iii)包含序列ARVSALRRPMTTVTTYWFDP(SEQ ID NO：144)的CDR-H3。
(vi)抗体片段
[0150]在一些实施方案中，抗氧化的LDL抗体是抗体片段。已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见例如Morimoto等，Journal of Biochemical and BiophysicalMethods 24：107-117(1992)；及Brennan等，Science 229：81(1985))。然而，现在可以直接由重组宿主细胞生成这些片段。例如，可以自上文讨论的抗体噬菌体文库分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab’-SH片段，并通过化学方法偶联以形成F(ab′)2片段(Carter等，Bio/Technology 10：163-167(1992))。依照另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab’)2片段。用于生成抗体片段的其它技术对熟练从业人员是显而易见的。在其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185；美国专利No.5,571,894；及美国专利No.5,587,458。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如如美国专利No.5,641,870中所描述的。此类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。
在一些实施方案中，提供了本文中所描述的抗体的片段。在一些实施方案中，抗体片段是抗原结合片段。
(vii)双特异性抗体
在一些实施方案中，抗氧化的LDL抗体是双特异性抗体。双特异性抗体指对至少两种不同表位具有结合特异性的抗体。例示性的双特异性抗体可以结合氧化的LDL的两种不同表位。其它此类抗体可以结合氧化的LDL，而且进一步结合第二种不同的氧化的LDL。或者，可以将抗氧化的LDL结合臂与结合白细胞上触发分子诸如T细胞受体分子(例如CD2或CD3)或IgG的Fc受体(FcγR)诸如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD 16)的臂组合，从而将细胞防御机制聚焦于细胞。可以将双特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab’)2双特异性抗体)。
用于生成双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统生成基于两种免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两种链具有不同的特异性(Millstein等，Nature 305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))生成10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦，且产物产量低。WO 93/08829及Traunecker等，EMBO J.10：3655-3659(1991)中公开了类似的流程。
依照一种不同的方法，将具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变域与免疫球蛋白恒定域序列融合。在一个实施方案中，融合使用包含至少部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定域。在一个实施方案中，在至少一种融合物中具有包含轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物以及，如果需要，免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体中，并共转染到合适的宿主生物体中。在用于构建的三种多肽链比例不等时提供最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供了更大的灵活性。然而，在至少两种多肽链以相同比率表达导致高产量时或在该比率是特别重要时，有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列在一种表达载体中插入。
在本方法的一些实施方案中，双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了分离的便利途径，因此发现这种不对称结构便于将所需双特异性化合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开。该方法公开于WO 94/04690。关于生成双特异性抗体的其它细节见例如Suresh等，Methods in Enzymology121：210(1986)。
依照美国专利No.5,731,168中描述的另一种方法，可改造一对抗体分子之间的界面，将从重组细胞培养物中回收的异二聚体的百分比最大化。在一些实施方案中，界面包含抗体恒定域的至少部分CH3结构域。在该方法中，将第一抗体分子界面的一个或多个小型氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换。通过用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大型氨基酸侧链，在第二抗体分子的界面上产生大小与大型侧链相同或相似的补偿性“空腔”。这提供了较之其它不想要的终产物诸如同二聚体提高异二聚体产量的机制。
双特异性抗体包括交联或“异源偶联”抗体。例如，异源偶联物中的一种抗体可与亲合素偶联，另一种抗体与生物素偶联。例如，此类抗体建议用于将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利No.4,676,980)，及用于治疗HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373及EP 03089)。可使用任何便利的交联方法制备异源偶联抗体。合适的交联剂是本领域众所周知的，并且连同许多交联技术一起公开于美国专利No.4,676,980。
文献中还描述了由抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如，可使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan等，Science 229：81(1985)描述了一种规程，其中通过蛋白水解切割完整抗体以生成F(ab′)2片段。将这些片段在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠的情况下还原，以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫键的形成。然后将产生的Fab’片段转变为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后将Fab’-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成Fab’-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab’-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。
还描述了从重组细胞培养物直接制备和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，已使用亮氨酸拉链生成双特异性抗体。Kostelny等，J.Immunol.148(5)：1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab’部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原而形成单体，然后重新氧化而形成抗体异二聚体。这种方法也可用于生成抗体同二聚体。由Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)描述的“双抗体(diabody)”技术提供了制备双特异性抗体片段的替代机制。该片段包含通过接头相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)，所述接头太短使得同一条链上的两个结构域之间不能配对。因而，迫使一个片段上的VH和VL结构域与另一个片段上的互补VL和VH结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(scFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber等，J.Immunol.152：5368(1994)。
涵盖具有超过两个效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt等，J.Immunol.147：60(1991)。
(viii)多价抗体
在一些实施方案中，抗氧化的LDL抗体是多价抗体。多价抗体可以比二价抗体更快地受到表达该抗体所结合抗原的细胞的内化(和/或异化)。本文中提供的抗体可以是具有三个或更多抗原结合位点(例如四价抗体)的多价抗体(不同于IgM类)，其可容易地通过编码抗体多肽链的核酸的重组表达来生成。多价抗体可包含二聚化结构域和三个或更多抗原结合位点。优选的二聚化结构域包含(或由其组成)Fc区或铰链区。在这种情况中，抗体可包含Fc区及Fc区氨基末端的三个或更多抗原结合位点。本文中优选的多价抗体包含(或由其组成)三个至约八个，但优选四个抗原结合位点。多价抗体包含至少一条多肽链(且优选两条多肽链)，其中所述多肽链包含两个或多个可变域。例如，多肽链可包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可变域，VD2是第二可变域，Fc是Fc区的一条多肽链，X1和X2代表氨基酸或多肽，而n是0或1。例如，多肽链可包含：VH-CH1-柔性接头-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文中的多价抗体优选进一步包含至少两条(且优选四条)轻链可变域多肽。本文中的多价抗体可包含例如约两条至约八条轻链可变域多肽。本文涵盖的轻链可变域多肽包含轻链可变域，且任选进一步包含CL结构域。
(ix)其它氨基酸序列修饰
涵盖对本文中所描述的氧化的LDL结合抗体的氨基酸序列修饰。例如，可以期望改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。抗氧化的LDL抗体的氨基酸序列变体是通过将合适的核苷酸变化引入抗氧化的LDL抗体核酸或通过肽合成制备的。此类修饰包括例如抗氧化的LDL抗体氨基酸序列内的残基删除和/或插入和/或替代。可进行任何删除、插入和替代组合以获得最终的构建物，倘若最终的构建物拥有期望的特征。氨基酸变化也可以改变抗氧化的LDL抗体的翻译后加工，诸如改变糖基化位点的数目或位置。
可用于鉴定抗氧化的LDL抗体中作为优选诱变位置的某些残基或区域的一种方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells，Science，244：1081-1085(1989)中所描述的。这里，鉴定一个残基或一组靶残基(例如带电荷的残基，诸如Arg、Asp、His、Lys和Glu)并用中性或带负电荷的氨基酸(最优选丙氨酸或多聚丙氨酸)替代，以影响氨基酸与氧化的LDL抗原的相互作用。然后通过在或对替代位点引入更多或其它变体，推敲对替代展示出功能敏感性的那些氨基酸位置。如此，尽管用于引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，然而突变本身的本质不必预先决定。例如，为了分析指定位点处突变的后果，在靶密码子或区域进行丙氨酸扫描或随机诱变，并对所表达抗氧化的LDL抗体筛选期望的活性。
氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端的融合，长度范围由一个残基至包含上百或更多残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N端甲硫氨酰残基的抗氧化的LDL抗体或与细胞毒性多肽融合的抗体。抗氧化的LDL抗体分子的其它插入变体包括将抗氧化的LDL抗体的N或C末端与酶(例如用于ADEPT)或延长抗体血清半衰期的多肽融合。
另一类变体是氨基酸替代变体。这些变体在抗氧化的LDL抗体分子中有至少一个氨基酸残基用不同残基替代。最有兴趣进行替代诱变的位点包括高变区，但是也涵盖FR改变。下文表中“优选替代”栏显示了保守替代。如果此类替代导致生物学活性变化，那么可导入下文表中称为“例示替代”的更实质变化，或如下文参照氨基酸分类进一步所述，并筛选产物。
表3.
Figure BDA0000158811850000541
Figure BDA0000158811850000551
对抗体生物学特性的实质性修饰通过选择对维持以下方面的效果差异显著的替代来实现：(a)替代区域中多肽主链的结构，例如(折叠)片层或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。可以依照其侧链特性的相似性将氨基酸分组(于A.L.Lehninger，in Biochemistry，第二版，第73页-第75页，Worth Publishers，New York(1975))：
(1)非极性：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)
(2)不带电荷的极性：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)
(3)酸性：Asp(D)、Glu(E)
(4)碱性：Lys(K)、Arg(R)、His(H)
或者，可以基于共同的侧链特性将天然存在的残基分组：
(1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性、亲水性的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性的：Asp、Glu；
(4)碱性的：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。
非保守替代会需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的。
一般也可以用丝氨酸替换不涉及维持抗氧化的LDL抗体的正确构象的任何半胱氨酸残基，以改善分子的氧化稳定性，并阻止异常交联。相反，可以将半胱氨酸键添加至抗体以改善其稳定性(特别地，在抗体是抗体片段诸如Fv片段的情况中)。
一类特别优选的替代变体涉及替代亲本抗体(例如人源化抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步开发的所得变体相对于产生它们的亲本抗体会具有改良的生物学特性。用于生成此类替代变体的一种便利方法涉及使用噬菌体展示的亲和力成熟。简言之，将数个高变区位点(例如6-7个位点)突变，在各个位点产生所有可能的氨基酸替代。将如此生成的抗体变体以单价形式展示在丝状噬菌体颗粒上，作为与各个颗粒内包装的M13基因III产物的融合物。然后如本文所公开的对噬菌体展示的变体筛选其生物学活性(例如结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可进行丙氨酸扫描诱变以鉴定对抗原结合具有重要贡献的高变区残基。或者/另外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和氧化的LDL之间的接触点可能是有益的。所述接触残基及邻近残基是依照本文详述的技术进行替代的候选位点。一旦产生这样的变体，如本文所述对该组变体进行筛选，可选择在一种或多种相关测定法中具有优良特性的抗体用于进一步的开发。
另一类抗体氨基酸变体改变抗体的初始糖基化样式。抗体可以包含非氨基酸模块。例如，抗体可以是糖基化的。此类糖基化可以在宿主细胞或宿主生物体中表达抗体期间天然发生，或者可以是源自人干预的有意修饰。改变意指删除抗体中找到的一个或多个碳水化合物模块和/或添加一个或多个不存在于抗体中的糖基化位点。
通常，抗体的糖基化或是N-连接的或是O-连接的。N-连接指碳水化合物模块附着于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是将碳水化合物模块酶促附着于天冬酰胺侧链的识别序列。如此，抗体氨基酸序列中这些三肽序列任一的存在创建了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指将糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附着于羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。
通过改变氨基酸序列使其包含一个或多个上述三肽序列来便利地完成对抗体添加糖基化位点(用于N-连接的糖基化位点)。所述改变还可以通过向初始抗体的序列添加或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行(用于O-连接的糖基化位点)。
通过本领域中已知的多种方法来制备编码抗氧化的LDL抗体的氨基酸序列变体的核酸分子。这些方法包括但不限于自天然来源分离(在天然存在的氨基酸序列变体的情况中)或通过对抗氧化的LDL抗体的早期制备变体或非变体型式的寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变和盒式诱变来制备。
可以期望在效应器功能方面修饰本文中所提供的抗体，例如为了增强抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。这可通过在抗体Fc区中引入一个或多个氨基酸替代来实现。或者/另外，可在Fc区中引入半胱氨酸残基，从而容许在该区中形成链间二硫键。如此生成的同二聚体抗体可具有改善的内化能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。参见Caron等，J.Exp.Med.176：1191-1195(1992)及Shopes，B.，J.Immunol.148：2918-2922(1992)。具有增强的抗肿瘤活性的同二聚体抗体还可使用如Wolff等，Cancer Research 53：2560-2565(1993)中描述的异双功能交联剂来制备。或者，抗体可改造成具有双重Fc区，由此可具有增强的补体介导的裂解和ADCC能力。参见Stevenson等，Anti-Cancer Drug Design 3：219-230(1989)。
为了延长抗体的血清半衰期，可以在抗体中进行氨基酸变化，如记载于U.S.2006/0067930的，在此通过提及而将其完整收录。
(x)其它抗体修饰
本文中涵盖对抗体的其它修饰。例如，可以将抗体与多种非蛋白质性聚合物之一，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物连接。抗体也可以包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、在胶状药物投递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或在粗滴乳状液中。此类技术披露于Remington’sPharmaceutical Sciences，第16版，Oslo，A.编，(1980)中。
另外/或者，人源化抗体可以进行其它化学修饰。一种此类期望的修饰是添加一个或多个聚乙二醇(PEG)模块。已经显示了PEG化显著延长各种抗体片段的体内半衰期(Chapman 2002 Adv.Drug Delivery Rev.54，531-545)。然而，对抗体片段的随机PEG化对所述片段对抗原的结合亲和力可以具有高度不利的影响。为了避免这点，期望的是，PEG化限于人源化抗体的特定的、靶定的残基(见Knight等，2004 Platelets 15，409-418和Chapman，见上文)。
(xi)筛选具有期望特性的抗体
为了筛选结合氧化的LDL上被感兴趣的抗体结合的表位的抗体，可以实施常规的交叉阻断测定法，诸如记载于Antibodies，A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，Harlow和David Lane编(1988)的。可以使用此测定法来测定测试抗体是否与本文中提供的抗氧化的LDL抗体结合相同位点或表位。或者/另外，可以通过本领域中已知的方法来实施表位定位。例如，可以诸如例如通过丙氨酸扫描来将抗体序列诱变以鉴定接触残基。最初，用多克隆抗体对突变体抗体测试结合以确保正确折叠。在一种不同方法中，可以在用测试抗体或用测试抗体和具有已表征的或已知的表位的抗体的竞争测定法中使用与氧化的LDL的不同区域对应的肽。
III.获得方法和用途中使用的抗体
可以使用本领域中公知的方法，包括重组方法来获得本文中所描述的方法和用途中使用的抗体。以下部分提供了关于这些方法的指导。
(i)多核苷酸
如本文中可互换使用的，“多核苷酸”或“核酸”指任何长度的多核苷酸的聚合物，并且包括DNA和RNA。
多核苷酸可以编码本文中所描述的任何抗氧化的LDL抗体。例如，多核苷酸可以编码整个免疫球蛋白分子链，诸如轻链或重链。完整的重链不仅包含重链可变区(VH)，而且还有重链恒定区(CH)(其通常会包含三个恒定域：CH1、CH2和CH3)；和“铰链”区。在一些情况中，恒定区的存在是期望的。
多核苷酸可以编码可变轻链和/或可变重链。在一些实施方案中，多核苷酸包含选自表2的轻链可变域或重链可变域。在一些实施方案中，多核苷酸包含选自下组的重链可变域：SEQ ID NO：63，SEQ ID NO：67，SEQ ID NO：71，SEQ ID NO：75，SEQ ID NO：79，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：87，SEQ IDNO：91，SEQ ID NO：95，SEQ ID NO：99，SEQ ID NO：103，SEQ ID NO：107，SEQID NO：111，SEQ ID NO：115，SEQ ID NO：119和SEQ ID NO：123。在一些实施方案中，多核苷酸包含选自下组的轻链可变域：SEQ ID NO：65，SEQ IDNO：69，SEQ ID NO：73，SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：81，SEQ ID NO：85，SEQID NO：89，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：97，SEQ ID NO：101，SEQ ID NO：105，SEQ ID NO：109，SEQ ID NO：113，SEQ ID NO：117，SEQ ID NO：121和SEQ IDNO：125。在一些实施方案中，多核苷酸包含含有SEQ ID NO：103的重链可变域和含有SEQ ID NO：105的轻链可变域。在一些实施方案中，多核苷酸包含含有SEQ ID NO：67的重链可变域和含有SEQ ID NO：69的轻链可变域。
可以由多核苷酸编码的其它多肽包括抗原结合抗体片段诸如单域抗体(“dAb”)、Fv、scFv、Fab’和F(ab’)2和“微型抗体”。微型抗体(通常)是已经切除CH1和CK或CL域的二价抗体片段。因为微型抗体比常规的抗体小，所以它们应当在临床/诊断用途中实现更好的组织渗入，但是是二价的，它们应当比单价抗体片段，诸如dAb保留更高的结合亲和力。因而，除非上下文另有规定，如本文中所使用的，术语“抗体”不仅涵盖全抗体分子，而且还有上文所讨论类型的抗原结合抗体片段。
同时，编码的多肽通常会具有与IEIA8、IEI-G8、IEI-D8、KTT-D6、1-B12、1-C07、1-C12、1-G10、2-F07、2-F09、4-A02、IEI-E3、2D03、LDO-D4和/或KTT-B8相同或基本上相同的CDR序列。如此，优选地，多核苷酸会编码具有相对于IEIA8、IEI-G8、IEI-D8、KTT-D6、1-B12、1-C07、1-C12、1-G10、2-F07、2-F09、4-A02、IEI-E3、2D03、LDO-D4和/或KTT-B8的重和/或轻链(在适当时)的如本文中所描述的重和/或轻链可变区的多肽。若编码的多肽包含部分或完整的重和/或轻链恒定区，则其来自人源也是有利的。
在一些实施方案中，相对于人受体，编码多肽的至少一个框架区，且最优选地每个框架区会包含氨基酸替代，从而变得与IEIA8、IEI-G8、IEI-D8、KTT-D6、1-B12、1-C07、1-C12、1-G10、2-F07、2-F09、4-A02、IEI-E3、2D03、LDO-D4和/或KTT-B8更相似，从而提高人源化抗体的结合活性。
在一些实施方案中，相对于相应的人受体框架，存在于编码多肽中的每个框架区会包含至少一处氨基酸替代。如此，例如，相对于受体框架区，框架区可以包含总共3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15处氨基酸替代。有利地，突变是回复突变以匹配存在于IEIA8、IEI-G8、IEI-D8、KTT-D6、1-B12、1-C07、1-C12、1-G10、2-F07、2-F09、4-A02、IEI-E3、2D03、LDO-D4和/或KTT-B8框架中等同位置处的残基。在一些实施方案中，在重链中进行六处回复突变，而在轻链中进行一处。
合适地，可以分离和/或纯化本文中所描述的多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸是分离的多核苷酸。
术语“分离的多核苷酸”意图指示分子自其正常的或天然的环境取出或分开或者已经以如下的方式生成，使得它不存在于其正常的或天然的环境中。在一些实施方案中，多核苷酸是纯化的多核苷酸。术语纯化的意图指示已经至少除去一些污染性分子或物质。
合适地，多核苷酸是基本上纯化的，从而相关多核苷酸构成存在于组合物中的主要(即最丰富的)多核苷酸。
可以在所述方法中使用包含编码重链可变域和/或轻链可变域的插入物的重组核酸，如本文中所描述的。根据定义，此类核酸包含编码单链核酸、由所述编码核酸和由其互补核酸组成的双链核酸、或这些互补(单链)核酸自身。
也可以在抗氧化的LDL抗体的重链可变域和/或轻链可变域外部进行修饰。此类突变体核酸可以是沉默突变体，其中将一个或多个核苷酸用具有编码相同氨基酸的新密码子的其它核苷酸替换。此类突变体序列可以是简并序列。简并序列在遗传密码的意义内的简并之处在于将有限数目的核苷酸在不导致最初编码的氨基酸序列变化的情况中用其它核苷酸替换。此类简并序列由于其不同限制性位点和/或特定宿主，特别地酵母、细菌或哺乳动物细胞优选的特定密码子的频率而可以用于获得重链可变域和/或轻链可变域的最佳表达。
本文中还提供了与具有本文中限定的特定特性的多肽的氨基酸序列或编码此类多肽的任何核苷酸序列具有一定程度的序列同一性或序列同源性的序列(下文称为“同源序列”)的用途。这里，术语“同源”意指与主题氨基酸序列和主题核苷酸序列具有某种同源性的实体。这里，术语“同源性”可以等同于“同一性”。
在一些实施方案中，同源氨基酸序列和/或核苷酸序列应当提供和/或编码保留抗体的功能性活性和/或增强抗体的活性的多肽。在一些实施方案中，同源序列考虑包含可以与主题序列至少75、85、或90％相同，优选地至少95或98％相同的氨基酸序列。通常，同源物会与主题氨基酸序列包含相同的活性位点等。虽然也可以就相似性(即，具有相似化学特性/功能的氨基酸残基)而言考虑同源性。在一些实施方案中，优选的是，就序列同一性而言表述同源性。
在本上下文中，同源序列考虑包括可以与编码本文中所描述的多肽的核苷酸序列(主题序列)至少75、85、或90％相同，优选地至少95或98％相同的核苷酸序列。通常，同源物会与主题氨基酸序列包含相同的编码活性位点的序列等。虽然也可以就相似性(即，具有相似化学特性/功能的氨基酸残基)而言考虑同源性。在一些实施方案中，优选的是，就序列同一性而言表述同源性。
(ii)重组抗体的表达
下文描述主要涉及通过培养经含有多肽编码多核苷酸的载体转化或转染的细胞来生成多肽。当然，涵盖的是，可以采用本领域中公知的备选方法来制备多肽(例如固相技术或体外蛋白质合成)。
可以将如本文中所描述的多核苷酸插入表达载体中以生成抗体。任选地，将编码如本文中所描述的轻和重链可变区的多核苷酸与恒定区可操作连接，并插入表达载体中。可以将轻和重链在相同或不同表达载体中克隆。将编码免疫球蛋白链的DNA区段与表达载体中的控制序列可操作连接，所述控制序列确保免疫球蛋白多肽的表达。表达控制序列包括但不限于启动子(例如，天然结合的或异源的启动子)、信号序列、增强子元件和转录终止序列。
合适地，表达控制序列是能够转化或转染真核宿主细胞(例如COS细胞，诸如COS 7细胞或CHO细胞)的载体中的真核启动子序列。一旦已经将载体掺入合适的宿主中，在适合于核苷酸序列高水平表达及交叉反应性抗体的收集和纯化的条件下维持宿主。
这些表达载体通常在宿主生物体中以附加体或以宿主染色体DNA的真核部分可复制。
选择基因构件：通常，表达载体可以含有选择基因，又称作选择标志。典型的标志物(例如氨苄青霉素抗性、潮霉素抗性、四环素抗性、卡那霉素抗性或新霉素抗性)容许检测用期望的DNA序列转化的那些细胞(见例如Itakura等，U.S.4,704,362)。在一些实施方案中，表达和克隆载体可包含选择基因，也称为选择标志。典型的选择基因编码如下蛋白质：(a)赋予对抗生素或其它毒素的抗性，例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素；(b)补足相应的营养缺陷；或(c)提供不能从复合培养基获得的关键营养物，例如编码芽胞杆菌(Bacilli)的D-丙氨酸消旋酶的基因。
选择方案的一个例子利用药物来阻滞宿主细胞的生长。经异源基因成功转化的那些细胞生成赋予药物抗性的蛋白质，因而幸免于选择方案。此类显性选择的例子使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。
适于哺乳动物细胞的选择标志的另一个例子是能够鉴定有能力摄取编码本文中所描述的抗氧化的LDL抗体的核酸的细胞的选择标志，诸如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白I和III优选灵长类金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。
例如，首先通过将所有转化子在含有甲氨蝶呤(Mtx，DHFR的一种竞争性拮抗剂)的培养基中进行培养来鉴定经DHFR选择基因转化的细胞。在采用野生型DHFR时，适宜的宿主细胞是DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(例如ATCC CRL-9096)。
或者，可通过在含有针对选择标志的选择剂诸如氨基糖苷抗生素例如卡那霉素、新霉素或G418的培养基中培养细胞来选择经编码抗体、野生型DHFR蛋白和另一种选择标志诸如氨基糖苷3′-磷酸转移酶(APH)的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(特别是包含内源DHFR的野生型宿主)。参见美国专利No.4,965,199。
酵母中使用的合适的选择基因是存在于酵母质粒YRp7中的trp1基因(Stinchcomb等，Nature 282：39(1979))。trp1基因为缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母突变体菌株，例如，ATCC No.44076或PEP4-1提供选择标志。Jones，Genetics 85：12(1977)。然后，酵母宿主细胞基因组中的trp1损伤的存在提供了通过在缺乏色氨酸的情况中生长检测转化的有效环境。类似地，Leu2缺陷型酵母株(ATCC 20，622或38，626)由携带Leu2基因的已知质粒互补。
另外，可以使用自1.6μm环状质粒pKD1衍生的载体来转化克鲁维酵母属(Kluyveromyces)酵母。或者，对乳酸克鲁维斯酵母(K.lactis)报告了重组牛凝乳酶的大规模生产的表达系统。Van den Berg，Bio/Technology 8：135(1990)。还已经披露了用于克鲁维斯酵母的工业菌株分泌成熟的重组人血清清蛋白的稳定的多拷贝表达载体。Fleer等，Bio/Technology 9：968-975(1991)。
信号序列构件-抗氧化的LDL抗体不仅可以直接重组生成，而且可以以与异源多肽的融合多肽生成，所述异源多肽优选的是在成熟蛋白质或多肽的N端具有特定的切割位点的信号序列或其它多肽。优选地，选定的异源信号序列是被宿主细胞识别和加工(例如被信号肽酶切割)的。信号序列可以用选自例如下组的原核信号序列替换：碱性磷酸酶、青霉素酶、1pp、或人稳定性肠毒素II前导物。对于酵母分泌，天然的信号序列可以通过例如酵母转化酶前导物、α因子前导物(包括酵母(Saccharomyces)和克鲁维酵母α因子前导物)、或酸性磷酸酶前导物、白念珠菌(C.albicans)葡萄糖淀粉酶前导物、或WO 90/13646中描述的信号替换。在哺乳动物细胞表达中，可用哺乳动物信号序列及病毒分泌前导物，例如，单纯疱疹gD信号。
将此类前体区的DNA以符合可读框的方式与编码本文中所描述的抗氧化的LDL抗体的DNA连接。
复制起点-表达和克隆载体两者都含有使载体能够在一种或多种选定的宿主细胞中复制的核酸序列。一般地，在克隆载体中，此序列是使载体能够不依赖于宿主染色体DNA复制的，并且包含复制起点或自主复制序列。此类序列对于多种细菌、酵母和病毒是公知的。来自质粒pBR322的复制起点适合于大多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒起点适合于酵母，而各种病毒起点(SV40、多瘤、腺病毒、VSV或BPV)对于哺乳动物细胞中的克隆载体是有用的。一般地，哺乳动物表达载体不需要复制起点构件(通常仅可以使用SV40起点，因为它含有早期启动子)。
启动子构件-表达和克隆载体通常含有被宿主生物体识别的启动子，并且与编码抗氧化的LDL抗体的核酸可操作连接。适合于与原核宿主一起使用的启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶启动子、色氨酸(trp)启动子系统和杂合启动子诸如tac启动子。然而，其它已知的细菌启动子是合适的。在细菌系统中使用的启动子还会含有与编码抗氧化的LDL抗体的DNA可操作连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
启动子序列对于真核生物是已知的。实际上所有真核基因具有位于启动转录的位点上游约25至30个碱基的富含AT的区域。在许多基因转录起始上游70至80个碱基找到的另一个序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3’端的是AATAAA序列，其可以是将多聚A尾部添加至编码序列3’端的信号。将所有这些序列适当地插入真核表达载体中。
与酵母宿主一起使用的合适的启动子序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖分解酶，诸如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、果糖磷酸激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶的启动子。
其它酵母启动子(其是具有受生长条件控制的转录的额外优点的诱导型启动子)是醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酯酶、与氮代谢有关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。适合于在酵母表达中使用的载体和启动子进一步记载于EP 73,657。有利地，酵母增强子与酵母启动子一起使用。
在哺乳动物宿主细胞中由载体转录本文中所描述的抗氧化的LDL抗体受到例如从病毒(诸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(诸如2型腺病毒)、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒，且最优选地，和猿病毒40(SV40))基因组获得的、来自异源哺乳动物启动子(如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子)的、来自热休克启动子的启动子的控制，倘若这些启动子与宿主细胞系统相容的话。
方便的以SV40限制性片段的形式获得SV40病毒的早期和晚期启动子，该片段还包含SV40病毒复制起点。方便的以HindIIIE限制性片段的形式获得人巨细胞病毒的立即早期启动子。美国专利No.4,419,446中公开了使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。美国专利No.4,601,978中记载了该系统的一种修改。关于在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子控制下在小鼠细胞中表达人β-干扰素cDNA，还可见Reyes等，Nature297：598-601(1982)。或者，可使用劳氏肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子。
增强子元件构件：常常通过在载体中插入增强子序列来提高高等真核细胞对编码本文中所描述的抗氧化的LDL抗体的DNA的转录。现在知道来自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)的许多增强子序列。然而，通常会使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括SV40复制起点晚期侧的增强子(bp 100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒复制起点晚期侧的增强子和腺病毒增强子。关于激活真核启动子的增强元件还可参见Yaniv，Nature 297：17-18(1982)。增强子可剪接到载体中，位于抗氧化的LDL抗体编码序列的5′或3′位置，但是优选位于启动子的5′位点。
转录终止构件-在真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人、或来自其它多细胞生物体的有核细胞)中使用的表达载体通常还包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA非翻译区的5′端和偶尔的3′端获得。一种有用的转录终止构件是牛生长激素聚腺苷酸化区。参见WO94/11026及其中公开的表达载体。
通过公知方法(其随细胞宿主类型而变化)来将含有多核苷酸序列(例如，可变重和/或可变轻链编码序列和任选的表达控制序列)的载体转移入宿主细胞中。例如，通常对原核细胞利用氯化钙转染，而可以对其它细胞宿主使用磷酸钙处理、电穿孔、脂转染、生物射弹或基于病毒的转染。(一般见Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring HarborPress，第2版，1989)。用于转化哺乳动物细胞的其它方法包括使用Polybrene、原生质体融合、脂质体、电穿孔和微注射(一般见Sambrook等，见上文)。为了生成转基因动物，可以将转基因微注射入受精的卵母细胞中，或者可以掺入胚胎干细胞的基因组中，并且将此类细胞的细胞核转移入无核卵母细胞中。
在不同表达载体上克隆重和轻链时，共转染宿主以获得完整免疫球蛋白的表达和装配。一旦表达，可以依照本领域的标准规程，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、HPLD纯化、凝胶电泳等(一般见Scopes，Protein Purification(Springer-Verlag，N.Y.，(1982))来纯化全抗体、其二聚体、个别的轻和重链、或其它免疫球蛋白形式。对于药物用途，至少约90至95％同质性的基本上纯的免疫球蛋白是优选的，且98至99％或更多的同质性是最优选的。
(iii)构建体
通常，构建体会是容许在合适的宿主中表达由多核苷酸编码的多肽的表达载体。构建体可以包含例如，下列一项或多项：宿主中有活性的启动子；一种或多种调节序列，诸如增强子；复制起点；和标志物，优选地选择标志。宿主可以是真核或原核宿主，但是真核(且尤其是哺乳动物)宿主可以是优选的。合适启动子的选择明显会在一定程度上取决于使用的宿主细胞，但是可以包括来自人病毒诸如HSV、SV40、RSV等的启动子。许多启动子是本领域技术人员已知的。
构建体可以包含编码包含三个轻链高变环或三个重链高变环的多肽的多核苷酸。或者，多核苷酸可以编码包含通过合适长度的合适柔性接头连接的三个重链高变环和三个轻链高变环的多肽。另一种可能性是单一构建体可以包含编码两种不同多肽(一种包含轻链环，而一种包含重链环)的多核苷酸。不同多肽可以独立表达或可以形成单一共同操纵子的一部分。
构建体可以包含一种或多种调节特征，诸如增强子、复制起点和一种或多种标志物(选择或以其它方式)。构建体可以采用质粒、酵母人工染色体、酵母微型染色体形式，或者整合入病毒，尤其是减毒病毒或对人非病原性的类似病毒的整个或部分基因组中。
可以将构建体常规地配成制剂以对哺乳动物，优选地人受试者安全施用。通常，它们会以多个等分试样提供，每个等分试样含有足以有效免疫至少一个正常成年人受试者的构建体。
构建体可以以液体或固体形式，优选地以冻干粉末提供，所述冻干粉末通常在使用前用无菌水性液体再水合。
可以用具有提高响应构建体施用的受试者的免疫应答的效果(如通过特异性抗体滴度测量的)的佐剂或其它组分配制构建体。
(iv)载体
术语“载体”包括表达载体和转化载体以及穿梭载体。
术语“表达载体”意指能够体内或体外表达的构建体。
术语“转化载体”意指能够自一种实体转移至另一种实体(其可以该物种的或可以是不同物种的)的构建体。若构建体能够自一种物种转移另一种，诸如自大肠杆菌质粒至细菌，诸如芽胞杆菌属(Bacillus)的，则转化载体有时称作“穿梭载体”。它甚至可以是能够自大肠杆菌质粒转移至土壤杆菌(Agrobacterium)，至植物的构建体。
如下文所描述的，可以将载体转化入合适的宿主细胞中以提供本发明涵盖的多肽的表达。如此，在又一方面，本发明提供了一种用于制备本发明中使用的多肽的方法，其包括在提供编码多肽的编码序列的载体表达的条件下培养用如上文所描述的表达载体转化或转染的宿主细胞，并回收表达的多肽。
载体可以是例如，质粒、病毒或噬菌体载体，其提供有复制起点，任选地所述多核苷酸表达的启动子和任选地启动子的调节物。
载体可以含有本领域中公知的一种或多种选择标志基因。
(v)宿主细胞
例如，宿主细胞可以是细菌、酵母或其它真菌细胞、昆虫细胞、植物细胞、或哺乳动物细胞。
本发明还提供了转基因多细胞宿主生物体，其已经进行过遗传操作，从而生成依照本发明的多肽。生物体可以是例如，转基因哺乳动物生物体(例如转基因山羊或小鼠系)。
大肠杆菌是一种可以使用的原核宿主。其它微生物宿主包括芽孢杆菌，诸如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和其它肠杆菌科(enterobacteriaceae)，诸如沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)和各种假单胞菌属(Pseudomonas)物种。在这些原核宿主中，可以生成表达载体，其通常会含有与宿主细胞相容的表达控制序列(例如复制起点)。另外，会存在许多公知的启动子，诸如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统、或来自噬菌体λ的启动子系统。启动子通常会控制表达，任选地与操纵基因序列一起，并且具有核糖体结合位点序列等，以启动并完整转录和翻译。
可以使用其它微生物诸如酵母来表达。酵母属是一种优选的酵母宿主，在想要时，合适的载体具有表达控制序列(例如启动子)、复制起点、终止序列等。典型的启动子包括3-磷酸甘油酸激酶和其它糖分解酶。诱导型酵母启动子包括来自醇脱氢酶、异细胞色素C和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子等。
在微生物外，也可以使用哺乳动物组织细胞培养物来表达并生成人源化抗体，如本文中所描述的，并且在一些情况中，其是优选的(见Winnacker，From Genes to Clones，VCH Publishers，N.Y.，N.Y.(1987))。对于一些实施方案，真核细胞(例如COS7细胞)可以是优选的，因为许多能够分泌异源蛋白质(例如完整免疫球蛋白)的合适宿主细胞系在本领域中已经得到开发，并且包括CHO细胞系、各种Cos细胞系、HeLa细胞，优选地，骨髓瘤细胞系，或经转化的B细胞或杂交瘤。
在一些实施方案中，宿主细胞是脊椎动物宿主细胞。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子是通过SV40(COS-7，ATCC CRL 1651)转化的猴肾CV1系；人胚肾系(293细胞或为了在悬浮培养物中生长而亚克隆的293细胞，Graham等，J.Gen Virol.36：59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))或CHO-DP-12系；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝瘤(hepatoma)系(Hep G2).
或者，可以将抗体编码序列掺入转基因中以导入转基因动物的基因组中，随后在转基因动物的奶中表达(见例如美国专利No.5,741,957；5,304,489；及5,849,992)。合适的转基因包含与来自乳腺特异性基因，诸如酪蛋白或β乳球蛋白的启动子和增强子可操作连接的轻和/或重链编码序列。
或者，本文中所描述的抗体可以在转基因植物(例如，烟草、玉米、大豆和苜蓿)中生成。改善的“植物体(plantibody)”载体(Hendy等(1999)J.Immunol.Methods 231：137-146)和与可转化作物物种增加偶联的纯化策略使此类方法成为一种生成不仅用于人和动物疗法，而且也用于工业应用(例如催化抗体)的重组免疫球蛋白的实际且有效的手段。此外，已经显示了植物生成的抗体是安全且有效的，而且避免使用动物衍生的材料。此外，植物和哺乳动物细胞生成的抗体的糖基化样式的差异对抗原结合或椭圆形具有很少的影响或没有影响。另外，在接受植物衍生的分泌性二聚体IgA抗体的表面口服应用的患者中尚未观察到毒性或HAMA的证据(见Larrick等(1998)Res.Immunol.149：603-608)。
可以在细菌中生成全长抗体、抗体片段和抗体融合蛋白，特别地在不需要糖基化和Fc效应器功能时，诸如在治疗性抗体与细胞毒剂(例如毒素)缀合，并且免疫缀合物单独显示肿瘤细胞破坏功效时。全长抗体具有更大的循环半衰期。大肠杆菌中的生成是更快且更为成本有效的。关于细菌中的抗体片段和多肽的表达，见例如美国专利No.5,648,237；5,789,199；及5,840,523，其描述了翻译起始区(TIR)和用于优化表达和分泌的信号序列，通过提及而将这些专利收入本文。在表达后，自大肠杆菌细胞团在可溶性级分中分离抗体，并可以根据同种型经由例如蛋白A或G柱纯化。可以与用于纯化例如在CHO细胞中表达的抗体的方法相似地实施最终的纯化。
适合于表达本文中所描述的糖基化抗氧化的LDL抗体的宿主细胞自多细胞生物体衍生。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株和变体及相应的允许的昆虫宿主细胞，其来自诸如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)等宿主。多种用于转染的病毒株是公众可获得的，例如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5株，并且可以使用此类病毒作为依照本发明的本文中的病毒，特别地用于转染草地夜蛾细胞。
(vi)抗体的纯化
在使用重组技术时，可在细胞内、在壁膜间隙中生成抗体，或者直接分泌到培养基中。如果在细胞内生成抗体，那么首先通过例如离心或超滤清除微粒碎片，或是宿主细胞或是裂解片段。Carter等，Bio/Technology 10：163-167(1992)描述了一种用于分离分泌到大肠杆菌的壁膜间隙的抗体的方法。简言之，将细胞团在存在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟化物(PMSF)的情况中在约30分钟里融化。可以通过离心来除去细胞碎片。如果抗体分泌到培养基中，那么通常首先使用商品化蛋白质浓缩滤器(例如Amicon或MilliporePellicon超滤单元)浓缩来自这些表达系统的上清液。可在任何上述步骤中包括蛋白酶抑制剂诸如PMSF以抑制蛋白水解，而且可包括抗生素以防止外来污染物的生长。
可使用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析(优选的纯化技术是亲和层析)来纯化从细胞制备的抗体组合物。蛋白A作为亲和配体的适宜性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人1、2、或4重链的抗体(Lindmark等，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和人3(Guss等，EMBO J.5：1567-1575(1986))。亲和配体所附着的基质最常用的是琼脂糖，但是可使用其它基质。物理稳定的基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯容许获得比琼脂糖更快的流速和更短的加工时间。若抗体包含CH3结构域，则可使用Bakerbond ABX树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)进行纯化。根据待回收的抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术诸如离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的层析、肝素SEPHAROSE上的层析、阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。
在任何初步纯化步骤之后，可将含有感兴趣抗体和污染物的混合物进行低pH疏水相互作用层析，使用pH约2.5-4.5的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度(例如约0-0.25M盐)进行。
IV.药物配制剂
本文中提供了在本文中所描述的方法和用途中使用的包含抗氧化的LDL抗体的药物配制剂。通过将具有期望纯度的抗体与任选的药学可接受载体、赋形剂或稳定剂(Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.编(1980))混合来制备冻干配制剂或水溶液形式的依照本发明使用的抗体的治疗用配制剂，供贮存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，而且包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烃基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
在一些实施方案中，将包含抗氧化的LDL抗体的药物配制剂冻干。可以用合适的稀释剂以高蛋白质浓度重建此类冻干的配制剂，并且可以对要在本文中处理的哺乳动物皮下施用重建的配制剂。
本发明还涵盖晶体化形式的抗体或抗体。见例如，U.S.2002/0136719A1(Shenoy等)。
本文中的配制剂还可含有所治疗具体适应症所必需的超过一种活性化合物，优选活性互补且彼此没有不利影响的。例如，可以期望进一步提供配制剂中的抗炎剂、抗糖尿病剂和/或“抑制素”类的胆固醇降低药物。在一些实施方案中，配制剂包含第二活性剂，其中所述第二活性剂是胰岛素。在一些实施方案中，胰岛素是快速作用的、短效的、规律作用的、中效作用的、或长效作用的胰岛素。在一些实施方案中，胰岛素是，和/或包含Humalog、Lispro、Novolog、Apidra、Humulin、Aspart、正规级胰岛素(regular insulin)、NPH、Lente、Ultralente、Lantus、Glargine、Levemir、或Detemir。在一些实施方案中，配制剂包含第二活性剂，其中所述第二活性剂是抑制素。在一些实施方案中，抑制素是，和/或包含阿托伐他汀(Atorvastatin)(例如立普妥(Lipitor)或Torvast)、西立伐他汀(Cerivastatin)(例如Lipobay或Baycol)、氟伐他汀(Fluvastatin)(例如来适可(Lescol)或来适可(Lescol))、洛伐他汀(Lovastatin)(例如美降脂(Mevacor)、Altocor、或Altoprev)、美伐他汀(Mevastatin)、匹伐他汀(Pitavastatin)(例如Livalo或Pitava)、普伐他汀(Pravastatin)(例如，普拉固(Pravachol)、Selektine、或Lipostat)、罗苏伐他汀(Rosuvastatin)(例如Crestor)、辛伐他汀(Simvastatin)(例如舒降之(Zocor)或Lipex)、Vytorin、Advicor、Besylate Caduet或辛可(Simcor)。此类其它药剂的类型和有效量取决于例如，配制剂中存在的抗体量和受试者的临床参数。这些一般以如前文所使用的相同剂量和施用路径或迄今采用剂量的1至99％使用。在一些实施方案中，第二活性剂和抗氧化的LDL抗体在单一药物配制剂中。在一些实施方案中，第二活性剂和抗氧化的LDL抗体在不同配制剂中。
活性成分还可包载入例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、胶状药物投递系统(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或粗滴乳状液。此类技术披露于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.编(1980)。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质以定型产品的形式存在，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
要用于体内施用的配制剂可以是无菌的。这容易通过过滤流过无菌过滤膜来实现。
V.制品
本文中所描述的抗氧化的LDL抗体可以包含在制品内，所述制品包含关于本文中描述的方法和用途的指令。优选地，制品包含：(a)包含组合物的容器，所述组合物包含容器内的本文中所描述的抗氧化的LDL抗体和药学可接受载体或稀释剂；和(b)包装插页，其具有关于对患有胰岛素抗性和/或需要升高的胰岛素敏感性的受试者施用组合物的指令。
在一些实施方案中，受试者患有代谢综合征。在一些实施方案中，所述受试者有风险形成代谢综合征。在一些实施方案中，所述受试者具有选自下组的一项或多项特征：(a)男性中约102cm或更多和女性中约88cm或更多的腰围，(b)约150mg/dL或更多的空腹甘油三酯，(c)约95mg/dL或更高的空腹葡萄糖，和(d)高水平的氧化的LDL。在一些实施方案中，所述受试者进一步患有与糖尿病有关的炎症。在一些实施方案中，所述受试者在过夜禁食后具有约95mg/dL或更高的血糖水平。在一些实施方案中，所述受试者在过夜禁食后具有约126mg/dL或更高的血糖水平。在一些实施方案中，所述受试者在2小时口服葡萄糖耐受性测试后具有约140mg/dL的血糖水平。在一些实施方案中，所述受试者在2小时口服葡萄糖耐受性测试后具有约200mg/dL的血糖水平。在一些实施方案中，所述受试者患有前驱糖尿病。在一些实施方案中，所述受试者患有糖尿病。在一些实施方案中，所述糖尿病选自下组：I型糖尿病、II型糖尿病和妊娠糖尿病。在一些实施方案中，所述糖尿病是II型糖尿病。
制品包含容器和容器上或与之结合的标签或包装插页。合适的容器含有例如，瓶、管形瓶、注射器等。溶液可以由多种材料诸如玻璃或塑料形成。容器容纳或含有有效治疗胰岛素敏感性的组合物，并且可以具有无菌存取口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有通过皮下注射针可穿过的塞子的管形瓶)。组合物中的至少一种活性剂是抗体。标签或包装插页指示组合物用于治疗受累受试者中的胰岛素敏感性，具有关于给药量和抗体和提供的任何其它药物的时间间隔的特定指导。制品可以进一步包含第二容器，其包含药学可接受稀释缓冲液，诸如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲液盐水、林格(Ringer)氏溶液和右旋糖溶液。制品可以进一步包含从商业和用途观点看期望的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针和注射器。
任选地，本文中的制品进一步包含容器，其包含与用于治疗的抗体不同的另一种(例如第二)药剂，而且进一步包含关于用此类药剂治疗哺乳动物的指令。在一些实施方案中，抗炎剂、抗糖尿病剂和/或“抑制素”类的胆固醇降低药物。在一些实施方案中，所述方法和用途包括施用第二活性剂。在一些实施方案中，所述方法和用途包括施用第二活性剂，其中所述第二活性剂是胰岛素。胰岛素是快速作用的、短效的、规律作用的、中效作用的、或长效作用的胰岛素。在一些实施方案中，胰岛素可以是，和/或包含Humalog、Lispro、Novolog、Apidra、Humulin、Aspart、正规级胰岛素(regular insulin)、NPH、Lente、Ultralente、Lantus、Glargine、Levemir、或Detemir。在一些实施方案中，所述方法和/或用途包括施用第二活性剂，其中所述第二活性剂是抑制素。抑制素可以是，和/或包含阿托伐他汀(Atorvastatin)(例如立普妥(Lipitor)或Torvast)、西立伐他汀(Cerivastatin)(例如Lipobay或Baycol)、氟伐他汀(Fluvastatin)(例如来适可(Lescol)或来适可(Lescol))、洛伐他汀(Lovastatin)(例如美降脂(Mevacor)、Altocor、或Altoprev)、美伐他汀(Mevastatin)、匹伐他汀(Pitavastatin)(例如Livalo或Pitava)、普伐他汀(Pravastatin)(例如，普拉固(Pravachol)、Selektine、或Lipostat)、罗苏伐他汀(Rosuvastatin)(例如Crestor)、辛伐他汀(Simvastatin)(例如舒降之(Zocor)或Lipex)、Vytorin、Advicor、Besylate Caduet或辛可(Simcor)。
“包装插页”用于指通常包含在治疗产品的商业包装中的指令，其包含关于适应症、用法、剂量、施用、禁忌、要与包装产品组合的其它治疗产品和/或关注使用此类治疗性产品的警告等信息。
本发明的更多详情通过以下非限制性实施例例示。通过提及而将所有参考文献的公开内容明确收入本文。
实施例
实施例(其意图完全是本发明例示性的，并且因此不应认为以任何方式限制本发明)也描述并详述了上文所讨论的本发明的方面和实施方案。前述例子和详细描述作为例示而不作为限制提供。
实施例1：抗氧化的LDL抗体在高脂肪和果糖饲养的猕猴中对血清生物标志物和胰岛素抗性的影响
为了调查抗氧化的LDL抗体对炎症的血清标志物、代谢、促凝血活性和胰岛素抗性的效果，用抗氧化的LDL抗体处理高脂肪和果糖饲养的猕猴。
实验设计
基线期(再启动果糖；前三个月)
在启动果糖补充前，对每只动物实施静脉内葡萄糖耐受性测试(IVGTT)、用于身体脂肪的双能量X-射线吸光测定法(DEXA)扫描和颈动脉内膜-中层厚度(CIMT)的超声测量一次。同时(在葡萄糖施用以进行IVGTT前)，通过自笼盆回收3-10mL自每只动物收集尿液样品。相隔不小于4天自10只动物之每只取出两份血液样品(果糖前(pre-fructose)1和果糖前2，下文表4中所描述的；还可见图1)。一次可以在用于IVGTT的镇静时，但是在施用葡萄糖前。
在所有动物中完成扫描后，并在第二份血液样品后，开始对7只高脂肪和果糖补充饮食(“HFD”)动物进行果糖补充，并持续到研究结束(HFD＝高脂肪+果糖饮食，伴有有限的运动；动物编号19267、20169、20280、20282、20358、21074、2193)。对三只其它动物给予正常的饮食(正常饮食组＝正常的饮食+正常的运动；动物编号19836、19843、23527)。
在基线期期间自所有10只动物取出血液样品，如表4中所描述的。还可见图1。在三个月基线期结束时，所有10只动物再次经历IVGTT、DEXA和CIMT，并收集尿液样品。
处理期
在完成基线期后，以10mg/kg的剂量通过IV用抗氧化的LDL抗体2D03处理所有10只动物，每周一次持续12周。每周针对体重调节剂量体积。使用一次性注射器和针或蝴蝶型导管经由臂或腿上的浅静脉(例如头、隐静脉)静脉内施用所述剂量。静脉内注射后继之以约1mL的盐水冲洗。实验中使用的抗氧化的LDL抗体配制剂是20mM乙酸组氨酸、150mM乙酸精氨酸和0.02％Polysorbate 20，pH 5.5中的150mg/ml 2D03。
对每只动物给予总共13剂。剂量给药的此第一天称为研究日0。在研究日0、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77和84对动物给药。第一剂的天数会是研究日0。研究日0前的所有天数会称作研究日-1、研究日-2等。研究日0后的所有天数会称作研究日1、研究日2等。在处理期期间，在多个时间点取出血液样品，如下文表4中所限定的。还可见图1。在施用最后一剂后一周中，所有动物再次经历IVGTT/DEXA/CIMT和尿液取样。
处理后观察期
在施用最后一剂抗氧化的LDL抗体2D03后，对所有10只动物再观察12周。遍及整个时段的多个时间点采集血液样品，如下文表4中所描述的。在观察期结束时，完成最终的IVGTT/DEXA/CIMT，并收集最终的尿液样品。
表4：实验日程表
Figure BDA0000158811850000741
Figure BDA0000158811850000761
Figure BDA0000158811850000771
材料和方法
实验中使用的动物
在实验中使用猕猴(Macaca mulatta)(猕猴(rhesus monkey))。猕猴是一种响应此类药物的公认的非人灵长类模型。凭借高脂肪和果糖饲养，以及对运动的限制，在先前的研究中已经显示了这些动物展现出具有胰岛素抗性的人中看到的胰岛素抗性的大多数标志。这些猴的使用会使鉴定与那些可以预期在人中看到的响应在定量和定性上相似的实验响应的可能性最大化。
这些猴在给药时的体重范围自14.4变化至21kg(对于HFD动物)和7.8变化至9.8(对于正常的饮食组)。这些猴都是雄性、未处理的年龄9.5至12.5年的动物。
HFD和正常的饮食
给HFD组中的动物喂养定制灵长类研究中心食物(Customized PrimateResearch Center Diet)5A1F(Lab Diet，Inc.)。给动物每天供应多至20块饼干，早上一半及下午一半。每天还给这些动物喂养花生酱处理(300kcal)和半个苹果。在10:00给动物喂养其早餐，在14:00除去早餐的剩余部分，并称重。在15:00喂养晚餐，并在17:00除去该餐的剩余部分。动物在就寝(lights outs)期间不进食。HFD组中的每只动物每周还接受500mL樱桃Kool-Aid中的10％果糖三次。
给正常饮食组中的动物喂养猴饮食#5038或猴饮食Jumbo#5037(LabDiet Inc.)。每天给动物供应多至20块饼干，早上一半及下午一半。正常饮食组中的动物不接受果糖补充。它们以与上文相同的方式喂养。
在整个研究中监测并记录(除了周末外)每只动物的食物摄取(饼干计数)。
为了提供禁食血液样品，(晚间喂食后)整夜不再给动物喂食，直至取样当天血液收集后。
葡萄糖和胰岛素耐受性测试
通过在推注无菌50％右旋糖溶液(600mg/kg)后测量血糖清除来实施IVGTT。测试前将动物禁食过夜，并用Telezol(3mg/kg)镇静以进行操作。在施用右旋糖前及施用右旋糖后1、3、5、10、20、40和60分钟时收集1mL血液样品。立即用血糖测计仪(Onetouch Ultra Blood Glucose Monitor；LifeScan；Milpitas，CA)在全血中测量血糖。由ONPRC/OHSU内分泌服务(EndocrineServices)实验室(Portland，OR)使用Immulite 2000来对血浆测定胰岛素。使用Prism GraphPad软件来计算胰岛素和葡萄糖曲线下面积(AUC)(其中针对时间对葡萄糖和胰岛素水平绘图)。
DEXA扫描
对于身体组成分析，将动物用Telezol(3mg/kg)镇静，并用氯胺酮维持镇静。将动物在DEXA(Hologic Discovery A)上平坦放置，并实施全身扫描。计算中间脂肪重量及全身脂肪。将这与中心和总共的无脂肪质量(central andtotal lean mass)比较。
颈动脉超声扫描
用氯胺酮(10mg/kg)镇静动物。用Siemens Doppler超声仪对颈动脉成像。通过来自Siemens的自动化软件包计算颈动脉内膜厚度。
体重
在处理期间，在给药前一天喂养前对所有动物称重，以调节测试制品体积，维持10mg/kg剂量。基线和处理后观察期期间，每两周一次对动物称重。
尿液取样
在果糖前、第-1周、第12周(最后一剂后)和第24周自每只动物收集尿液样品。通过自笼盆回收自每只动物收集三个-10mL干净的尿液。将尿液离心以除去大的碎片，然后在用动物号、研究日、日期和样品类型(“尿液”)标记的干净管中放置，并于-70℃贮存。
血液取样和加工
自研究的10只动物之每只取出静脉血液样品，如表4中所显示的。
容许RTT(血清)中收集的血液在室温凝结20-30分钟，然后离心以产生血清。将血清在约1mL等分试样中倒入干净的塑料管中。用动物号、样品时间点、样品描述(“血清”)和日期清楚地标记管。将血清于约70℃贮存，直至在干冰上运输。对这些样品测定各种生物标志物、测试品和抗测试品抗体水平和血清化学概况。
将用于完全血液细胞计数和血红蛋白A1c的LTT(EDTA)中收集的血液冷冻，并转移以进行测定。
将用LipoScience的脂质概况分析的LTT(EDTA)中收集的血液离心以产生血浆。将血浆倒入干净的塑料管中，所述塑料管用动物号、样品时间点、样品描述(“EDTA血浆”)和日期标记。将管于4℃贮存(冷冻)，并在湿冰上过夜运输以进行分析。
容许PaxGene管中收集的血液在收集后于室温放置2小时以容许红细胞裂解。然后，将管转移至70℃冰箱，供未来微阵列分析用。
将GTT(肝素锂)中收集的血液转移至免疫学专家以进行T细胞测定法。将自T细胞分选回收的细胞于70℃贮存，供未来细胞因子表达/释放分析用。
将BTT(柠檬酸钠)中收集的血液离心以产生血浆。将血浆倒入干净的塑料管中，所述塑料管用动物号、样品时间点、样品描述(“柠檬酸盐血浆”)和日期标记。将管于70℃贮存。
测定法
血清2D03浓度
将用于测量2D03浓度的血清样品于70℃贮存，并刚好在测定法前解冻。使用基于抗原结合的ELISA方法来测定每份血清样品中的2D03浓度。该测定法使用MDA ApoB 100(Academy BioMedical Company，Inc.；Houston，TX)作为捕捉试剂并使用家兔抗人IgG HRP(Dako；Glostrup，Denmark)作为检测试剂。测定法的可报告范围是孔中的1.4至195ng/mL。对所有样品使用最小血清样品稀释1∶200。最小可量化浓度是280ng/mL。
抗治疗剂抗体测定法
使用为Meso Scale Discovery(MSD)电化学发光平台(Gaithersburg，MD)开发的测定法自于70℃贮存并在测试前解冻的血清测量抗治疗剂抗体(ATA)水平。
Rules Based Medicine多分析物概况
将冷冻的血清给出Rules Based Medicine Inc.(Austin，TX)以进行人多分析物概况(第1.6版)，即一种89种不同生物标志的专有的基于Luminex的测定法。还使用证明为捕获猕猴分析物的特异性猕猴抗体或人抗体通过ELISA来测量几种关键的分析物。
酶联免疫吸附测定法
使用商品化的试剂盒并依照制造商的指示来实施所有测定法。测定法使用证明为捕获猕猴分析物的猕猴特异性抗体或人抗体。一些分析物与也在Rules Based Medicine多分析物组中测量的那些分析物相同。在已经于70℃贮存并在测定法前解冻的血清中通过ELISA测量以下分析物：
·氧化的LDL：氧化的LDL竞争ELISA试剂盒，Mercodia，Inc.，产品目录编号10 1158 01
·粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)：猴GM CSF试剂盒，CellSciences，Inc.，产品目录编号CKM000
·干扰素γ(IFN-γ)：干扰素γ(Monkey)EIA试剂盒，ALPCO Immunoassays，Inc.，产品目录编号45IFNMK E01
·肿瘤坏死因子α(TNF-α)：TNF-α猴ELISA试剂盒，Invitrogen Inc.，产品目录编号KPC3011
·脂连蛋白：人血清脂连蛋白试剂盒Acrp30，Alpha DiagnosticInternational，Inc.产品目录编号100 140 ADH
·C反应蛋白(CRP)：猴C反应蛋白试剂盒，Alpha Diagnostics Inc.，产品目录编号1050
·白介素-18(IL-18)：IL-18试剂盒，MBL，Inc.，产品目录编号7620
·白介素-8(IL-8)：白介素-8ELISA试剂盒，R&D，Inc.，产品目录编号D8050
·可溶性CD40(sCD40)：可溶性CD40ELISA试剂盒，KamyaBiomedical，产品目录编号KT 004
·白介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)：IL 1ra试剂盒，Biosource International(现在为Invitrogen)，产品目录编号KAC1181
·单核细胞化学引诱蛋白1(MCP-1)：单核细胞化学引诱蛋白1ELISA试剂盒BD OptEIA，Becton Dickinson，产品目录编号559017
·白介素6(IL-6)：猴白介素6ELISA试剂盒，Cell Sciences，Inc.，产品目录编号CKM005
·白介素1β(IL-1β)：猴白介素1βELISA试剂盒，Cell Sciences，Inc.，产品目录编号CKM039
脂蛋白颗粒分析
将新鲜的、EDTA抗凝的血浆(冷冻)过夜运输到LipoScience以对脂蛋白细分级分(subfraction)进行核磁共振(NMR)分析。
测量下列10个亚类类别的浓度：大VLDL(包括乳糜微粒，若存在的话)(＞60nm)、中等VLDL(35-60nm)、小VLDL(27-35nm)、IDL(23-27nm)、大LDL(21.2-23nm)、中等小的LDL(19.8-21.2nm)、非常小的LDL(18-19.8nm)、大HDL(8.8-13nm)、中等HDL(8.2-8.8nm)和小HDL(7.3-8.2nm)。因为已经发现“中等小”和“非常小”LDL亚类的水平与脂质水平及冠心病和糖尿病后果具有非常相似的关联性，所以将它们分组成单一“小LDL”亚类(18-21.2nm)。VLDL和LDL亚类颗粒浓度以单位nmol/L给出，而HDL亚类颗粒浓度以μmol/L给出。亚类水平的进一步求和还提供了总的VLDL、LDL(包括IDL)和HDL颗粒浓度。加权的平均VLDL、LDL和HDL颗粒大小(为nm直径单位)以每个亚类直径的总和乘以其相对质量百分比计算，如自其NMR信号的幅度评估的。
血清化学组
使用Roche Cobas Integra 400多通道化学分析仪(Roche，Inc.；Indianapolis，IN)自已经于70℃贮存并刚好在测定法前解冻的血清实施17种分析物及HDL、LDL、胆固醇和甘油三酯的标准血清化学概况。使用Siemens Immulite2000免疫测定分析仪(Siemens，Inc.；Piscataway，NJ)自相同的解冻血清测量胰岛素水平。
尿液分析
将已经于70℃贮存的尿液解冻，并通过浸渍条(Multistix SG 10，Siemens，Inc.；Piscataway NJ)测试。
完全血液细胞计数
使用Horiba ABX Pentra 60
Figure BDA0000158811850000821
(Horiba ABX；Irvine，CA)对新鲜的、EDTA抗凝的全血实施10项血液参数的标准组。
血红蛋白A1c
使用来自Bayer(Pittsburgh，PA)的A1cNow试剂盒并遵循制造商的指令自EDTA抗凝全血测量HbA1c水平。
T细胞表型测定和分选
开始果糖喂养前、在开始给药前、在给药第6周期间(在施用第7剂前)和在最后一剂后10周实施T细胞表型测定。在Ficoll-Histopaque(Sigma；StLouis，MO)上离心后自全血分离外周血单个核细胞(PBMCs)。通过使用受控冷冻保存装置方法(CryoMed Freezer No.7454；ThermoForma；Marietta，OH)将细胞冷冻以进行随后的分析。所有抗体购自PharMingen(San Diego，CA)、Ebioscience(San Diego，CA)、或Caltag(Burlingame，CA)，并且依照制造商的推荐使用。使用FACSCalibur或FACSLSRII(Becton Dickinson；San Jose，CA)收集样品，并使用CellQuest(BD Biosciences；Mountain View，CA)或FlowJo(Treestar；Ashland，OR)来分析数据，每份样品收集最小105个事件。
药动学分析
使用WinNonlin专业版(第5.2.1版，Pharsight Corporation；Mountain View，CA)通过非区室分析来计算2D03的药动学(PK)参数。使用规定(nominal)剂量和取样次数。
评估下列参数：
·Cmax-血清中最大观察浓度
·t1/2-消除半衰期
·AUC0-7-通过线性梯形法则评估的自第0天至第7天的血清浓度时间曲线下的面积
·AUCτ-通过线性梯形法则评估的表示稳态时的AUC的自第84天至第91天的血清浓度时间曲线下面积
·CLSS-稳态时的清除
·VSS-稳态时的分布体积
·AR-C谷的积累比率(第84天和第7天的剂量给予前浓度(predoseconcentration)比率)。
统计学分析
在不应用多次测量的校正的情况中使用成对t-检验评估来计算显著性的偶然性评估(Occasional estimate)。
结果
IVGTT
表5中显示了葡萄糖耐受性测试的结果。在2D03处理期期间10只动物中的8只中存在着胰岛素敏感性的改善(胰岛素AUC降低)，其中只有1只动物在12周冲洗(washout)后显示返回基线(升高的)胰岛素AUC(图2A)。前IVGTT血清葡萄糖水平在此研究期间没有改变。7只HFD动物中的四只在整个研究中具有升高的或非常可变的前IVGTT血浆胰岛素水平。其它3只HFD动物与3只对照具有相似的血浆胰岛素水平。前IVGTT胰岛素在用2D03处理期间在10只动物中的7只中降低，然后在冲洗后在10只动物的6只中升高(图2B)。
如通过IVGTT指示的胰岛素敏感性在具有或没有升高的胰岛素水平的高果糖饮食动物中在用2D03处理后升高(图3A)。此外，如使用IVGTT实验通过胰岛素AUC测量的葡萄糖耐受性在高果糖饮食和正常饮食动物两者中在用2D03处理后降低(图3B)。
表5A.
Figure BDA0000158811850000831
表5B.
Figure BDA0000158811850000841
AUC＝曲线下面积；基线＝前测试血浆浓度(mg/dL或uIU/mL)；IVGTT＝静脉内葡萄糖耐受性测试。
注意：数值以天·μg/mL计。
DEXA
没有可归因于2D03处理的百分比总身体脂肪或百分比躯干脂肪的明显变化。两只对照动物(动物19836和23527)在9个月研究期间明显提高其身体脂肪。
体重
HFD组的平均重量变化在-9周至24周的实验期期间是+0.5kg(范围为-0.2至+0.8)。虽然1只对照动物(动物19843)没有在所述时间期里显示重量变化，但是动物19836增重1.6kg，而动物23527增重2.7kg。尽管不断消耗高脂肪饮食，HFD动物没有像3只对照动物的2只那样多的增重。
食物摄取
食物摄取在实验期间没有变化。
测定法
血清2D03浓度
第一IV剂量后的均值2D03Cmax是236±30μg/mL。最后的IV剂量后的均值2D03Cmax是286±46μg/mL。所有动物在第一剂后达到约36和49μg/mL间的2D03谷血清水平，而在倒数第二剂后达到23和137μg/mL间的水平。
抗治疗剂抗体(ATA)测定法
在第112天、第126天和第140天在来自动物19267的血清中检出针对2D03的抗体，这导致超出第14天所述猴中的血清浓度下降。此动物的血清浓度不变地低于剩余动物的。另外，HFD组中的动物20169和21937和对照组中的动物19836和19843在恢复期期间在针对2D03的抗体方面也呈阳性；然而，血清2D03浓度与那些在ATA方面不呈测试阳性的猴相似。
Rules Based Medicine多分析物测定法
89项参数由Rules Based Medicine测试。下列分析物在处理期期间显示明显变化：GM-CSF、EN-RAGE、碱性FGF、IL-1β、TNF-α、IL-13、IL-15、干扰素-γ和血小板生成素。
GM-CSF水平在8周时间点时在所有动物中形成峰值，在处理期结束时返回基线，并到4周时返回到基线数值。
EN-RAGE、碱性FGF、IL-1β和TNF-α水平在2D03处理期间都降低，并且到冲洗期(washout period)结束保持较低，但是碱性FGF显示有些向基线数值返回(见例如图4和5)。
IL-13和IL-15的数值接近RBM测定法检测限度，但是两者在2D03处理期间都显示降低，其一直持续到冲洗期(分别为图6和7A)。干扰素-γ水平在处理期期间略微升高，并且对于冲洗期的前四周不断升高，然后在第20周时显示短暂的下降，在第24周时再升高(图7B)。
血小板生成素水平在2D03处理期间升高，并且在冲洗期期间返回基线。
酶联免疫吸附测定法
如通过ELISA测量的氧化的LDL在实验期里可变，但是在2D03处理期间没有看到对此分析物的清楚影响。
在开始果糖补充后，HFD动物比对照动物展现出更高的IL-1β水平。这些水平在2D03处理期期间明显降低至对照动物的水平。此降低维持到冲洗期结束(图8A)。也在RBM测定法中测量到IL-1β的明显降低(见图5B)；然而，HFD和对照组间处理前数值的分离在那些结果中是不明显的。测量的绝对值也稍低。
与对照相比，TNF-α的处理前水平在HFD动物中升高。这些水平在处理期期间明显降低，并且降低维持到冲洗期(washout period)(图8B)。
如通过ELISA测量的IL-6在2D03处理期期间显示可变性(variability)的小幅升高，并且一直持续到冲洗期。RBM组中测量的IL-6水平是高度可变的，但是在给药期间在可变性上没有升高(图9A-B)。
在研究期间IL-1受体拮抗剂(IL-1ra)水平没有变化。在此研究的9个月期间任何动物中的脂连蛋白、CRP、IL-18、或可溶性CD40配体没有明显变化。这与Rules Based Medicine多分析物概况中获得的这些分析物的结果一致。
脂蛋白颗粒分析
用2D03处理期期间任何测量的脂质细分级分没有明显的变化。在HFD动物中，小VLDL颗粒浓度和总VLDL颗粒及乳糜微粒在果糖补充开始后不久开始趋向降低，在整个处理期中不断略微降低，并且在冲洗期期间表现为变平。
在果糖前时间点时，与对照动物相比，7只HFD动物的5只中的IDL颗粒明显升高。在这些动物的1只中，IDL水平在对饮食添加果糖后的第一时间点时开始下降。在剩余的动物中，IDL下降到果糖添加后的第二时间点。然后，对于研究的剩余部分，所有猴的IDL水平不断下降。用2D03的处理不表现为影响此参数。
血清化学组
在整个研究中与正常饮食动物相比，BUN在HFD动物中较低(HFD 7.5±1.7mg/dL对对照16.9±2.7mg/dL处理前)。在正常的饮食动物中，虽然从未高得异常，BUN在处理期期间略微升高(HFD max 11.3±3.3mg/dL(第12周)对对照max 24±6.5mg/dL(第12周))，但是在最后一剂后4周内返回基线。血清肌酸酐从未在正常值外面，但是在处理期期间在大多数动物中略微升高(HFD 0.93±0.09mg/dL处理前至max 1.19±0.06mg/dL(第12周)对对照0.85±0.1mg/dL处理前至max 1.14±0.16mg/dL(第12周))。此参数到处理后4周时返回基线。
尿液蛋白质：肌酸酐比率在处理期期间没有明显改变。血清清蛋白在2D03处理的4周后在所有动物中略微降低，然后在最后一剂后4周升高至处理前基线的约125％的最大值，到冲洗期结束时返回基线数值。血清钙水平显示自5.9±0.25mg/dL(HFD)和5.7±0.72mg/dL(对照)的处理前均值下降至第8周的4.4±0.8mg/dL(HFD)和5.0±0.4mg/dL(对照)，接着升高至第12周的8.5±0.7mg/dL(HFD)和8.0±0.2mg/dL(对照)。升高一直持续到研究结束。血清无机磷在实验期间没有变化。基线血清氯化物是96.7±2.3mg/dL(HFD)和94.1±5.6mg/dL(对照)。血清氯化物在整个处理期中缓慢升高，并且这一直持续到冲洗期(max 110.3±2.6mg/dL HFD(第24周)；max 110.3±3.2mg/dL对照(第24周))。在相同时间期里存在着钠水平可变性的升高。
尿液分析
大多数HFD和对照动物在果糖前(pre-fructose)和处理前期时间点间显示尿液蛋白质含量增加。几乎1只动物在2D03处理期间(剂量给予前至第12周时间点)展现出尿液蛋白质的下降。然后，大多数动物中的蛋白质水平到12周冲洗结束时升高到剂量给予前水平。
两只HFD动物在果糖前时间点时在尿液葡萄糖方面呈阳性。在剂量给予前(pre-dose)或处理后期时间点时在任何尿液样品中没有检测到葡萄糖。然而，到冲洗期结束时，4只HFD动物具有阳性尿液葡萄糖结果。
完全血液细胞计数
在整个研究期中任何测量的参数没有明显变化。虽然如在RBM测定法中的测量的血小板生成素水平在处理期期间上升，但是血小板计数在研究的9个月里是稳定的。
血红蛋白A1c
血红蛋白A1c在研究开始时在任何动物中没有升高，并且在处理后没有改变。
T细胞表型测定和分选
T细胞表型测定显示了CD8阳性T细胞亚群在2D03处理的12周后自效应记忆(effector memory)至中枢记忆(central memory)的转化。在处理前约60％的CD8阳性T细胞是效应记忆性的，20％是中枢记忆性的，对应于处理后20％是效应记忆性的，并且60％是中枢记忆性的。在2D03处理期间也存在着CD4亚群自中枢记忆至未处理的转变。这些转化到冲洗期结束时逆转。未对多次测量校正的配对T检验计算显示这些群体转化是显著的(图10)。
药动学分析
2D03展现出两相概况，其具有初始分布相和继之的消除相。观察到2D03积累，并且到第63天时达到稳态。均值积累比率计算为2.70(对于HFD组)和4.58(对于对照组)。均值消除半衰期(t1/2)计算为13.7±2.50天(9.38-16.5天)(对于HFD猴)和11.6±3.78天(8.47-15.8天)(对于正常饮食猴)。稳态的AUC(AUCτ)对于所有猴是相似的，并且对于HFD和正常饮食猴分别是约843和680天·μg/mL。CLSS计算为12.2mL/天/kg(对于HFD猴)和15.6mL/天/kg(对于正常饮食猴)。VSS是275mL/kg(对于HFD猴)和405mL/kg(对于正常饮食猴)。
因为在来自动物19267的血清样品中检出针对2D03的抗体(其导致超出第14天的血清浓度下降)，所以将此动物排除出PK分析。另外，HFD组中的动物20169和21937及对照组中的动物19836和19843在恢复期期间在针对2D03的抗体方面也呈阳性，但是这些动物包括在PK分析中。
结论
HFD猕猴变得肥胖和对胰岛素有抗性及炎性细胞因子升高。用10mg/kg2D03IV每周处理改善胰岛素敏感性，并“标准化”炎性细胞因子概况。显示了2D03调控几种促炎症介导物和抗炎症介导物。在IL-1β、TNF-α、IL-13、IL-15、碱性FGF看到降低，在EN-RAGE中明显地看到降低。相反，GM-CSF水平升高。此剂(dose)是被良好耐受的，在一些血清化学分析物方面仅测量到适度趋势。
2D03是全长人IgG1抗体，以高亲和力结合LDL分子的丙二醛氧化的apoB 100蛋白部分。总之，这些数据表明2D03是抗炎症性的，并且改善HFD猕猴的胰岛素敏感性，并且与先前的实验观察结果一致，所述观察结果支持2D03用于治疗疾病和病症诸如II型糖尿病的治疗潜力。

Claims (61)

1.一种提高受试者中的胰岛素敏感性的方法，包括对所述受试者施用有效量的包含选择性结合氧化的低密度脂蛋白(LDL)的表位的抗体的组合物。
2.选择性结合氧化的LDL的表位的抗体在制造用于提高受试者中的胰岛素敏感性的药物中的用途。
3.一种用于提高受试者中的胰岛素敏感性的药物，其包含选择性结合氧化的LDL的表位的抗体。
4.一种用于提高胰岛素敏感性的抗体，其选择性结合氧化的LDL的表位。
5.权利要求1的方法、权利要求2的用途、权利要求3的药物、或权利要求4的抗体，其中所述氧化的LDL的表位包含氧化的ApoB-100的表位。
6.权利要求5的方法、用途、药物、或抗体，其中所述氧化的ApoB-100的表位选自下组：SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：38。
7.权利要求5-6中任一项的方法、用途、药物、或抗体，其中所述氧化的ApoB-100的表位是P45(氨基酸残基661-680-IEIGLEGKGFEPTLEALFGK；SEQ ID NO：32)、P143(氨基酸残基2131-2150-IALDDAKINFNEKLSQLQT Y；SEQ ID NO：13)、P210(氨基酸序列KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH；SEQ ID NO：14)和/或P129(氨基酸序列GSTSHHLVSRKSISAALEHK；SEQ IDNO：16)。
8.前述权利要求中任一项的方法、用途、药物、或抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
9.权利要求8的方法、用途、药物、或抗体，其中所述单克隆抗体是IgG1抗体。
10.权利要求8-9中任一项的方法、用途、药物、或抗体，其中所述单克隆抗体是人源化抗体或人抗体。
11.权利要求10的方法、用途、药物、或抗体，其中所述单克隆抗体是人抗体。
12.权利要求1-11中任一项的方法、用途、药物、或抗体，其中所述单克隆抗体包含轻链可变域，该轻链可变域包含：(i)包含序列CSGSNTNIGKNYVS(SEQ ID NO：39)的CDR-L1；(ii)包含序列ANSNRPS(SEQ ID NO：40)的CDR-L2；和/或(iii)包含序列CASWDASLNGWV(SEQ ID NO：41)的CDR-L3。
13.权利要求1-12中任一项的方法、用途、药物、或抗体，其中所述单克隆抗体包含重链可变域，该重链可变域包含：(i)包含序列FSNAWMSWVRQAPG(SEQ ID NO：42)的CDR-H1；(ii)包含序列SSISVGGHRTYYADSVKGR(SEQ ID NO：43)的CDR-H2；和/或(iii)包含序列ARIRVGPSGGAFDY(SEQ ID NO：44)的CDR-H3。
14.权利要求1-11中任一项的方法、用途、药物、或抗体，其中所述单克隆抗体包含轻链可变域，该轻链可变域包含(i)包含序列CSGSSSNIGNNAVN(SEQ ID NO：45)的CDR-L1；(ii)包含序列GNDRRPS(SEQ ID NO：46)的CDR-L2；和/或(iii)包含序列CQTWGTGRGV(SEQ ID NO：47)的CDR-L3。
15.权利要求1-11或14中任一项的方法、用途、药物、或抗体，其中所述单克隆抗体包含重链可变域，该重链可变域包含(i)包含序列FSDYYMSWVRQAPG(SEQ ID NO：48)的CDR-H1；(ii)包含序列SGVSWNGSRTHYADSVKGR(SEQ ID NO：49)的CDR-H2；和/或(iii)包含序列ARAARYSYYYYGMDV(SEQ ID NO：50)的CDR-H3。
16.权利要求1-11中任一项的方法、用途、药物、或抗体，其中所述单克隆抗体包含轻链可变域，该轻链可变域包含(i)包含序列CSGSSSNIGNNYVS(SEQ ID NO：127)的CDR-L1；(ii)包含序列SNNQRPS(SEQ ID NO：128)的CDR-L2；和(iii)包含序列CAAWDDSLSHWL(SEQ ID NO：129)的CDR-L3。
17.权利要求1-11或16中任一项的方法、用途、药物、或抗体，其中所述单克隆抗体包含重链可变域，该重链可变域包含：(i)包含序列FSNAWMSWVRQVPG(SEQ ID NO：130)的CDR-H1；(ii)包含序列STLGGSGGGSTYYADSVKGR(SEQ ID NO：131)的CDR-H2；和(iii)包含序列AKLGGRSRYGRWPRQFDY(SEQ ID NO：132)的CDR-H3。
18.权利要求1-11中任一项的方法、用途、药物、或抗体，其中所述单克隆抗体包含轻链可变域，该轻链可变域包含(i)包含序列CSGSSSNIGSNYVS(SEQ ID NO：133)的CDR-L1；(ii)包含序列GNYNRPS(SEQ ID NO：134)的CDR-L2；和(iii)包含序列CAAWDDSLSGWV(SEQ ID NO：135)的CDR-L3。
19.权利要求1-11或18中任一项的方法、用途、药物、或抗体，其中所述单克隆抗体包含重链可变域，该重链可变域包含(i)包含序列FSSYWMSWVRQAPG(SEQ ID NO：136)的CDR-H1；(ii)包含序列SSISGSGRRTYYADSVQGR(SEQ ID NO：137)的CDR-H2；和(iii)包含序列ARLVSYGSGSFGFDY(SEQ ID NO：138)的CDR-H3。
20.权利要求1-11中任一项的方法、用途、药物、或抗体，其中所述单克隆抗体包含轻链可变域，该轻链可变域包含(i)包含序列CSGRSSNIGNSYVS(SEQ ID NO：139)的CDR-L1；(ii)包含序列RNNQRPS(SEQ ID NO：140)的CDR-L2；和(iii)包含序列CAGWDDTLRAWV(SEQ ID NO：141)的CDR-L3。
21.权利要求1-11或20中任一项的方法、用途、药物、或抗体，其中所述单克隆抗体包含重链可变域，该重链可变域包含(i)包含序列FRDYYVSWIRQAPG(SEQ ID NO：142)的CDR-H1；(ii)包含序列SSISGSGGRTYYADSVEGR(SEQ ID NO：143)的CDR-H2；和(iii)包含序列ARVSALRRPMTTVTTYWFDP(SEQ ID NO：144)的CDR-H3。
22.权利要求1-11中任一项的方法、用途、药物、或抗体，其中所述人抗体包含含有选自下组的序列的重链可变域：SEQ ID NO：64，SEQ IDNO：68，SEQ ID NO：72，SEQ ID NO：76，SEQ ID NO：80，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：96，SEQ ID NO：100，SEQID NO：104，SEQ ID NO：108，SEQ ID NO：112，SEQ ID NO：116，SEQ IDNO：120和SEQ ID NO：124。
23.权利要求1-11或22中任一项的方法、用途、药物、或抗体，其中所述人抗体包含含有选自下组的序列的轻链可变域：SEQ ID NO：66，SEQID NO：70，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：78，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：86，SEQ ID NO：90，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：98，SEQ IDNO：102，SEQ ID NO：106，SEQ ID NO：110，SEQ ID NO：114，SEQ IDNO：118，SEQ ID NO：122和SEQ ID NO：126。
24.权利要求1-11中任一项的方法、用途、药物、或抗体，其中所述人抗体包含含有SEQ ID NO：104的重链可变域和含有SEQ ID NO：106的轻链可变域。
25.权利要求1-11中任一项的方法、用途、药物、或抗体，其中所述人抗体包含含有SEQ ID NO：68的重链可变域和含有SEQ ID NO：70的轻链可变域。
26.权利要求1-11中任一项的方法、用途、药物、或抗体，其中所述人抗体包含含有SEQ ID NO：96的重链可变域和含有SEQ ID NO：98的轻链可变域。
27.权利要求1-11中任一项的方法、用途、药物、或抗体，其中所述人抗体包含含有SEQ ID NO：72的重链可变域和含有SEQ ID NO：74的轻链可变域。
28.权利要求1-11中任一项的方法、用途、药物、或抗体，其中所述人抗体包含含有SEQ ID NO：76的重链可变域和含有SEQ ID NO：78的轻链可变域。
29.权利要求1-28中任一项的方法、用途、药物、或抗体，其中所述抗体是抗原结合片段。
30.权利要求29的方法、用途、药物、或抗体，其中所述抗原结合片段选自下组：Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、scFv、Fv和双抗体。
31.前述权利要求中任一项的方法、用途、药物、或抗体，其中所述抗体进一步减轻炎症。
32.权利要求31的方法、用途、药物、或抗体，其中所述炎症与糖尿病有关。
33.前述权利要求中任一项的方法、用途、药物、或抗体，其中所述抗体进一步降低炎性标志物的水平，其中所述炎性标志物选自下组：
IL-1β、IL-15、EN-RAGE、MCP-1、IL-6和TNF-α。
34.权利要求1-33中任一项的方法、用途、药物、或抗体，其中所述受试者患有代谢综合征。
35.权利要求1-33中任一项的方法、用途、药物、或抗体，其中所述受试者有风险形成代谢综合征。
36.权利要求35的方法、用途、药物、或抗体，其中所述受试者具有选自下组的一项或多项特征：(a)男性中约102cm或更大和女性中约88cm或更大的腰围，(b)约150mg/dL或更多的空腹甘油三酯，(c)约95mg/dL或更高的空腹葡萄糖，和(d)高水平的氧化的LDL。
37.权利要求1-36中任一项的方法、用途、药物、或抗体，其中所述受试者还患有与糖尿病有关的炎症。
38.权利要求1-37中任一项的方法、用途、药物、或抗体，其中所述受试者在过夜禁食后具有约95mg/dL或更高的血糖水平。
39.权利要求38的方法、用途、药物、或抗体，其中所述受试者在过夜禁食后具有约126mg/dL或更高的血糖水平。
40.权利要求1-39中任一项的方法、用途、药物、或抗体，其中所述受试者在2小时口服葡萄糖耐受性测试后具有约140mg/dL或更高的血糖水平。
41.权利要求40的方法、用途、药物、或抗体，其中所述受试者在2小时口服葡萄糖耐受性测试后具有约200mg/dL或更高的血糖水平。
42.权利要求1-41中任一项的方法、用途、药物、或抗体，其中所述受试者患有前驱糖尿病。
43.权利要求1-42中任一项的方法、用途、药物、或抗体，其中所述受试者患有糖尿病。
44.权利要求43的方法、用途、药物、或抗体，其中所述糖尿病选自下组：I型糖尿病、II型糖尿病和妊娠糖尿病。
45.权利要求44的方法、用途、药物、或抗体，其中所述糖尿病是I型糖尿病。
46.权利要求1-45中任一项的方法、用途、药物、或抗体，其中所述受试者患有心血管疾病或冠心病。
47.权利要求46的方法、用途、药物、或抗体，其中所述心血管疾病或冠心病与糖尿病有关。
48.权利要求1-47中任一项的方法、用途、药物、或抗体，其中所述受试者患有动脉粥样硬化。
49.权利要求48方法、用途、药物、或抗体，其中所述动脉粥样硬化与糖尿病有关。
50.权利要求1-49中任一项的方法、用途、药物、或抗体，其中胰岛素敏感性升高用于治疗受试者中的前驱糖尿病。
51.权利要求1-49中任一项的方法、用途、药物、或抗体，其中胰岛素敏感性升高用于治疗受试者中的糖尿病。
52.权利要求51的方法、用途、药物、或抗体，其中所述糖尿病选自下组：I型糖尿病、II型糖尿病和妊娠糖尿病。
53.权利要求52的方法、用途、药物、或抗体，其中所述糖尿病是II型糖尿病。
54.权利要求1-53中任一项的方法、用途、药物、或抗体，其中胰岛素敏感性升高用于治疗受试者中的心血管疾病或冠心病。
55.权利要求54的方法、用途、药物、或抗体，其中所述心血管疾病或冠心病与糖尿病有关。
56.权利要求1-55中任一项的方法、用途、药物、或抗体，其中胰岛素敏感性升高用于治疗受试者中的动脉粥样硬化。
57.权利要求57的方法、用途、药物、或抗体，其中所述动脉粥样硬化与糖尿病有关。
58.前述权利要求中任一项的方法、用途、药物、或抗体，其进一步包含施用第二治疗剂。
59.权利要求58的方法、用途、药物、或抗体，其中所述第二治疗剂是胰岛素。
60.权利要求58的方法、用途、药物、或抗体，其中所述第二治疗剂是抑制素。
61.本文中参照说明书限定的任何抗体的用途。
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