JP5179474B2 - 拮抗性抗ヒトcd40モノクローナル抗体 - Google Patents
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Description
CD40Lは、CD40産生性細胞、主にB細胞及びマクロファージの強力な活性化を媒介することができ、すなわち病変におけるTNF−α及びIL−12の増加した産生を結果する。免疫組織化学を用いて、5D12による増加した染色が、病気でない領域と比較して、クローン病患者からの病気の領域の全ての試料において発見された。CD40と、CD20(B細胞)又はCD68(マクロファージ)とについての二重の染色は、クローン病を有する患者からの切片において、CD40+細胞は主に、リンパ濾胞においてB細胞であり、及び固有層においてマクロファージであったことを示した。クローン病患者の炎症の粘膜からの固有層T細胞は、共培養の48時間後で、単球が、かなりの量のIL−12及びTNF−αを産生することを誘発した。5D12の添加は、減少したIL−12及びTNF−αの産生を結果した;産生の水準は、IFN−Υの不在下及び存在下の両方において、対照固有層T細胞を用いて観察された水準に減少された39。
のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、ここで、
該ポリペプチドは、5D12抗体の重鎖可変ドメインとの広範な配列同一性を含むが、該ポリペプチドは、そのようなものとして又は該ポリペプチドを含む抗体において投与されたヒトの個体においてより免疫原性でない。表示された位置X1〜X5で、いくつかのアミノ酸は、表示されたとおりに存在しうる。本発明のポリペプチドを含む結合性分子は、よいCD40結合特性を有する。細胞における抗体の産生は、表示された位置でのアミノ酸の種類によりいくらか変わりうることが注目される。これは、本明細書中の以下のほかの場所において詳述されるであろう。
を含む上記ポリペプチドを提供する。上記のポリペプチドは本質的に、マウス5D12抗体の重鎖の可変ドメインにわたる。該アミノ酸配列は、マウス配列に対していくつかの位置で変化される。該変化したポリペプチドは、良い結合特性を有し、同時に、該ポリペプチドを与えられたヒトによる忍容性が良好である。原型のマウスポリペプチドと比較したときに、該ポリペプチドの少なくとも免疫学的特性を劇的に減少せず及び/又は変化することなく、表示された位置で、種々のアミノ酸が挿入されうる。本発明のポリペプチドは、位置X1で、
を含むことが好ましい。このようにして、哺乳類細胞における該ポリペプチドの少なくとも産生特性は、原型のマウス又はキメラのポリペプチドと比較して、劇的に減少されず及び/又は変化されない。特に好ましい実施態様において、
これらのポリペプチドは、特に抗体の文脈における、哺乳類細胞における高水準産生にとってより適当である。
これらのポリペプチドは、高水準抗体産生にとってより適当であると同時にヒトにおける良い忍容特性を示す。本発明はさらに、式(I)のポリペプチドであって、X1がLであり;X2がIであり;X3がPであり;X4がMであり;及び/又はX5がSである上記ポリペプチドを提供する。このポリペプチドは特に好ましく、なぜなら、抗体ch5D12の結合特性及び薬理学的特性を模倣するが、マウス又はch5D12抗体と比較したときに免疫学的特性がヒトにおいて改善される抗体の文脈におけるその優れた産生特性の故であり、ここで該ポリペプチドの少なくとも産生はマウス又はキメラのカウンターパートと比較して劇的に減少されない
を含むポリペプチドを提供し、ここでX1はLであり且つX2はIである;又は、X1はIであり且つX2はVである。このポリペプチドは、5D12重鎖可変断片の改変CDR1を含む。このCDR1は、抗体5D12の重鎖可変断片のCDR1と比較して少なくとも1の異なるアミノ酸を含む。このアミノ酸変化は、改変された5D12又はch5D12の改善された免疫学的特性を両方とももたらし、ここで、該改変は、5D12又はch5D12における該ポリペプチドの対応する配列の、本発明のポリペプチドとの少なくとも置換を含むが、同時に哺乳類細胞における該抗体の良い産生を可能とする。
より好ましくは、X1はLであり、X2はIであり、X3はPであり、X4はMであり、及び/又はX5はSである。X1がIであり且つX2がVである、X1がIであり且つX2がIである、X1がLであり且つX2がIである、X1がLであり且つX2がLである、X1がVであり且つX2がIである、X1がVであり且つX2がVである、X1がLであり且つX2がLである、X1がVであり且つX2がLである、又は、X1がLであり且つX2がVであるときが特に好ましい。これらの後者のポリペプチドは特に、X3がPであり、X4がMであり、且つX5がF又はS、好ましくはSであることとの組み合わせにおいて好ましい。一つの実施態様において、本発明は本発明に従うポリペプチドを提供し、ここでX1はLであり、X2はVであり、X3はLであり、X4はLであり、及びX5はFである。該ポリペプチドを含む抗体の産生が良く、同時に、ch5D12と比較したときに、ヒトにおける改善された免疫学的特性を提供する。
のアミノ酸配列を含む上記結合性物体を提供し、
ここで、
該結合性物体は、好ましくは、本発明に従う拮抗性抗ヒトCD40モノクローナル抗体である。好ましい実施態様において、X6、X7、X8、X9、X10又はX11から選ばれるXは、実施例2において示されるとおり、5D12アミノ酸配列中の対応する位置でのアミノ酸配列に似ており且つ/又は良い発現水準を生じると本発明により示される配列中の対応する位置でのアミノ酸に似ている群から選ばれる。それ故に、本発明に従う結合性物体は好ましくは、式(II)のアミノ酸配列を含み、ここで
他の実施態様において、本発明は、本発明に従う拮抗性抗ヒトCD40モノクローナル抗体であって、以下のとおりのアミノ酸配列を含む本発明の式(II)のポリペプチドを含む上記抗体を提供する。
好ましい実施態様において、本発明は、本発明の式(II)のポリペプチドを提供し、ここでX6はT又はSであり、X7はD又はQであり、X8はQ又はPであり、X9はV又はAであり、X10はV又はLであり且つX11はF又はYであり、より好ましくはX6はTであり、X7はQであり、X8はPであり、X9はAであり、X10はVであり且つX11はYである。式(I)のポリペプチド及び式(II)の好ましいポリペプチドを含む5D12様抗体は、産生細胞における良い発現水準と、ヒトにおける良い忍容特性及び薬力学的特性とを兼備する。
ここで該原型の抗体は、重鎖可変ドメインアミノ酸配列
を含み、ここでX1及びX2は、X1=I且つX2=V、X1=L且つX2=I、X1=V且つX2=V、X1=L且つX2=L、又はX1=L且つX2=Vから成る群から対で選ばれる、
該方法はさらに、
該原型の抗体の変異体を産生する少なくとも1のさらなる細胞株を作ること、ここで該変異体抗体は該原型の抗体と比較したときに、約1〜5のアミノ酸の挿入、欠失、逆位及び/又は置換を含む改変された原型の抗体であり、ここで該改変はX1及びX2により同定される位置でのアミノ酸の改変から成らない、
及び、
該少なくとも1のさらなる細胞株により産生される変異体抗体の量を決定すること
を含み、
該方法はさらに、
原型の抗体の量の少なくとも50%である量で産生される変異体抗体を選択することを含む。
好ましくは、該原型の抗体は、軽鎖アミノ酸配列
を含む。
の改変を含み、
ここで、X1及びX2は、X1=I且つX2=Vであり;X1=L且つX2=I;X1=V且つX2=V;X1=L且つX2=L;又は、X1=L且つX2=Vから成る群から対で選ばれる、
該改変は、該重鎖アミノ酸配列と比較したときに、約1〜5アミノ酸の挿入、欠失、逆位及び/又は置換を含み、及び、該改変は、X1及びX2により同定される位置でのアミノ酸の改変から成らない。
放射線学的証拠、内視鏡的証拠又は組織学的証拠により確認されたクローン病の臨床診断を有し且つ少なくとも220だが450より多くないクローン病活性指標(CDAI)スコアを有する(治験薬投与(study drug administration)に先立つ7日にわたり採点された)18の成人の被験者(年齢18〜60歳)が、治験取り込み(study inclusion)の為に選ばれた。被験者は、治験の前及び間に以下の処置を有することが許された:スクリーニングの前4週間で安定なままである用量による8週間又はそれより多い週間のメサラミン処置;スクリーニング前2週で安定なままである用量による、8又はそれより多い週間の1日当たり最大の30mgのコルチコステロイド(又は1日当たり9mgブデソニド);スクリーニングの前8週間安定なままである用量による4またはそれより多い月の間のメルカプトプリン又はアザチオプリン。被験者は、スクリーニング前3ヶ月内でシクロスポリンA又はメトトレキセートによる処置を受けることができず、また、彼らはMabによる処置へ先に曝されることは許されなかった。登録された全ての被験者の平均年齢は35.8歳であり、そのうち7が男性であり及び11が女性であった。全ての被験者は、コーカサス人種であった。取り込みでの、種々の集団における患者の間の明白な差異は、より低い3つの用量群において対象の大部分が女性であった一方で最も高い用量の群(10.0mg/kg)が男性の被験者だけからなったことを除き、観察されなかった(表1)。ベースラインの心電図(ECG)、バイタルサイン、理学的検査、クローン病兆候及び症状の病歴、並びにベースラインの実験室での値に関して、4つの集団の間で顕著な差異は無かった。4つの用量の集団の間で、ベースラインの特徴に関して有意な差は無かった。しかしながら、最も高い用量の集団は、ベースラインで、最高のCDAIスコアも示した。この治験は、ルーバン大学病院の倫理委員会、ベルギー、ライデン大学医療センター、オランダ、医学クリニック(medizinische klinik)、キール、ドイツ、及びハダッサ医療センター、エルサレム、イスラエルにより承認された。全ての患者は、本治験にインフォームドコンセントを与えた。
ch5D12は、Mab 5D12親バージョンの重鎖及び軽鎖の可変ドメインを有する、分子的に操作されたヒトIgG4抗体である。このMabは、CD40を有する細胞に結合すること及び種々の細胞のCD40媒介の活性化を拮抗することが示された20−27。ch5D12は、非盲検の、単回投与の、多施設試験で投与され、4つの用量水準を治験した。3の被験者だけが登録された最後の用量集団を除き、夫々の処置群には、5の対象があった。ch5D12の0.3、1.0、3.0及び10.0mg/kgの用量水準での単回投与が、静脈内に行われた。1の用量の群へのリクルートメント(recruitment)の完了後、次の群へのリクルートメントが、現在の用量水準で安全性が確立されたときにだけ開始された。臨床的な病気の活性は、最初の28日期間の週1回の夫々の来診及び、56日目での次の最後の来診で評価された。2つの被験者(3.0mg/kg用量集団)が28日目の評価のあとの治験から除かれたが、それらのデータは評価に含まれる。治験の経過の間、彼らの現在の投薬の同じ用量について安定なままであった。許容されない併用の投薬は、本治験の間で用いられなかった。ch5D12処置への応答は、100ポイント以上のCDAIにおける減少として定義され、及び、臨床的な病気の寛解は、150以下のCDAI(合計スコア)且つ少なくとも100のCDAIの減少として定義された。スクリーニングで及び28日目で内視鏡検査を受けた全ての被験者(n=11)が、彼らのクローン病内視鏡検査的な重症度の指標(CDEIS))の採点指標における減少について分析された。バイオプシーは、組織病理学及び免疫組織化学について、ch5D12投与の前に及びch5D12投与後28日目で、これらの11の患者から取られた。安全性評価は、理学的検査、バイタルサイン、ECG、及び、抗dsDNA、pANCA及びヒト抗キメラ抗体(HACA)評価を含む実験室データ(化学、血液学及び検尿)を含んだ。HACAは、参考文献(27)に説明されるとおり、酵素結合免疫吸着検定(ELISA)により測定された。
ch5D12の血清濃度が、前に記載されたとおりにELISAにより決定された27。注入されたch5D12によるCD40の被覆を測定する為に、血液がヘパリンチューブ中に集められ、そしてPBS中に2倍に希釈された。末梢血単核球(PBMC)が、勾配遠心分離により単離され(Lymphoprep、Nycomed、Roskilde、デンマーク)、そして500,000の細胞が、FITCラベル化ch5D12及びPerCPラベル化抗CD20(Becton−Dickinson、Mountain View、CA、米国)により染色され、そして氷上で30分間インキュベートされた。5D12−FITC結合性についての背景対照として、PBMCの別のチューブが、PerCPラベル化抗CD20抗体だけにより染色された。結合していない抗体は洗い流され、そして、細胞がフローサイトメトリーを用いて分析された(FACSort;Becton−Dickinson)。イベントの取得は、全部で5000のイベントについて、CDを20発現する細胞をゲートすること及び取得することにより実施された。もしCD20を発現する細胞が、試料セットに関してより低かったならば、染色されていない調製物及び染色された調製物の両方において、同じ数のイベントを取得する為のケアが取られた。
標準の鉗子により0日目及び28日目における処理に先立ち、回腸結腸内視鏡検査法(ileocolonoscopy)の間に得られた回腸および結腸からの膜のバイオプシーが、通常の分析の為に、フォルマリン6%中に固定された。追加の試料がすぐに、液体窒素により冷却されたイソペンタン中のTissue−Tek最適切削温度化合物(Miles Laboratories Inc、Naperville、IL、米国)中で瞬間凍結された(snap frozen)。試料は、さらなる使用まで−80℃で保存された。ホルマリン固定化試料は、通常にパラフィン加工された。5マイクロメーターの薄い切片が、ヘマトキシリン及びエオシンにより調製されそして染色された。該切片は、Leitz Wetzlar顕微鏡(Wetzler、ドイツ)を用いて分析された。夫々の試料についての4つの準連続的切片の全てが分析された。凍結された試料は免疫組織化学分析の為に用いられ、これは、リンパ球及び単球/マクロファージの種々のサブセットの存在を評価する為に、Mabのパネルを用いて実施された。該パネルは、CD40及びCD40Lに対して向けられたMabにより完了された。免疫組織化学的染色が、クリオスタット切片について実施され、室温で一晩乾燥され、そして、10分間無水アセトン中に固定された。再水和されたスライドが以下のMabと30分間インキュベートされた;CD3(クローン:UCHT1、1/10希釈)(Dako、Glostrup、デンマーク)、CD4(クローン:MT310、1/10希釈)(Dako)、CD8(クローン:144B、1/20希釈)(Dako)、CD19(クローン:HD37、1/30希釈)(Dako)、CD40(クローン:5D12、1/100希釈)(PanGenetics、アムステルダム、オランダ)、CD68(クローン:Kp1、1/50希釈)(Dako)、CD154(クローン:M90、1/10希釈)(Serotec、Oxford、英国)。二次Mabは、ビオチンラベル化抗マウスイムノグロブリン(1/400希釈;Dako)であり、30分間適用された。内因性のペルオキシダーゼを効率的にブロックする為に、切片はまた、0.3%(v/v)H2O2を有するメタノール溶液中で20分間インキュベートされた。PBSによる3回の洗浄後、アビジン/ビオチンペルオキシダーゼラベル化複合体(Dako)が添加された。インキュベーションの間に、該切片は、リン酸緩衝生理食塩水中でpH7で15分間洗浄された。反応産物は、0.05%の3−アミノ−9−エチル−カルバゾール(Janssen、Beerse、ベルギー)及び0.01%H2O2を有する0.05mlのアセテートバッファー中でpH4.9で10分間、該切片をインキュベートすることにより視覚化され、明るい赤の免疫反応性部位を結果した。その後、該スライドは、Harrisヘマトキシリンにより淡く対比染色され、蒸留水によりリンスされ、そして、カバーガラスがグリセロールと一緒に適用された。負であった対照は、一次又は二次抗体の脱落、色素原単独の使用、及び無関係のアイソタイプマッチのIgG(ビメンチン;Dako)の使用からなった。
ch5D12による何らかの非特異的免疫抑制を評価する為に、フィトヘマグルチニンマイトジェン(PHA)に応答した抹消血T細胞の増殖が評価された。PHA刺激(1μg/mL)が、前に報告されたとおりに、単離されたPBMCに対して実施された41。加えて、循環するCD3+、CD4+、CD8+、CD20+細胞の百分率が、循環する細胞の枯渇を排除する為に測定された。フローサイトメトリーの為に、血液が、指示された時間でヘパリンチューブ中に集められ、夫々の試験管中の100μLの全血が、以下のとおりに染色された(全てのMabは、Becton−Dickinsonから購入された):抗CD3−FITC、抗CD19−PE、抗CD45−PerCP、抗CD45−FITC、抗CD4−PE、抗CD8−PE及び抗CD14−PE。該染色された細胞は次に、FACScanフローサイトメトリー中で分析された(Becton−Dickinson)。このプロトコルは、CD4+対CD8+細胞の比を計算する為に及びリンパ球系集団内のB細胞の割合を決定する為に、実施された。CD3及びCD19について報告された百分率は、リンパ球系集団内のT細胞及びB細胞の百分率であった一方で、CD4及びCD8細胞は、CD3細胞の百分率として報告された。CD14(単球系の集団)だけが、全CD45集団の百分率として示される。
単回の静脈内注入後のch5D12の平均のピーク水準は、用量依存的であり且つ用量比例的であった(図1)。24時間後、投与されたch5D12の約50%が、最も高い3の用量集団において血清中に検出された。0.3mg/kg集団について、15%だけが、24時間後の血清中に存在した。非ヒト霊長類研究から、8〜10日のt1/2βが計算され27、これは現在のヒトのデータにより確認された。FITCラベル化ch5D12を用いたエクスビボ競合検定により決定されたときに、末梢血B細胞上のCD40の完全な被覆は、0.3mg/kgの注入により達成されなかった(示されていない)。1.0mg/kgの集団について、循環するB細胞上のCD40の約1週の被覆が観察されることができた一方で、2の最も高い用量集団では、この期間は2〜3週に増加した。これは、最も低い用量集団において、CD40の拮抗が不完全であったが、他方完全な拮抗が、1.0mg/kg集団では1週間達成され、そして、より高い用量集団ではより長くさえ達成されたことを示す。
CDAI評価の分析は、18の被験者のうち13(72%)が、ch5D12注入後に有利な応答を経験したことを示す。同様に、18の被験者のうち4(22%)が、その期間の間に寛解を経験した。21日目で評価されたときに、有利な応答が18の被験者のうち10において記録された。集団2及び4は、CDAIにおける最大の平均の減少を示し、そして明白な用量−効果の関係は観察されなかった(図2;表2)。事後の反復測定分散分析は、56日観察期間にわたって、CDAIにおける統計的に有意な減少を示した(P<0.001)。集団の間の差は、統計的に有意でなかった。(内視鏡検査が、集団1及び2における3の被験者だけにおいて実施されたので)集団3及び4においてだけ、CDEISが評価された。集団3において、5の被験者のうち2が、CDEISにおける減少を有したが、集団4において3の被験者のうち2が減少を有した。これらの2の集団における残りの被験者は、変化を示さなかった(示されていない)。
バイオプシーが取られた患者(n=11)において、ただ一人の調査員が、組織病理学及び免疫組織化学における変化の評価を実施した。バイオプシー材料について実施された評価は、該病気の微小な活性に対する及び固有層単核細胞浸潤の強度に対する、処置の明白な影響を示す。
有害事象(AE)の大部分が重症度において軽度から中等度であるAE群の故に、治験から取り除かれた被験者は無かった。AEの総数の5%以上で発生するAEの評価は、最も一般的なAEが発熱、関節痛、筋肉痛及び頭痛であることを明らかにした。ベースラインで及び続く期間の間の両方でしばしば発生する関節痛は、該続く期間の経過にわたり頻度において減少した。インフルエンザ様症状及びそう痒性発疹が4の被験者において発生し、そのうち1の被験者だけが、治験薬投与(3.0mg/kg)後すぐに開始する中等度の発疹を経験した。全体的にみて、頭痛/片頭痛の可能性を除いて、いずれの単独のAEについても明白な用量応答は無かった。
ch5D12は、インビトロでのB細胞活性化を抑制するので、合計のイムノグロブリン水準は、フォローアップ期間の経過にわたり安定であると測定され且つ分かった。ch5D12が循環からB細胞を枯渇できることの可能性を排除する為に、我々は治験の経過にわたりPBMCのサブセット分析を実施した。CD3、CD4、CD8及びCD14陽性細胞の百分率及び絶対数は、ch5D12投与により影響されなかった。循環するCD19+B細胞の絶対計数は、ch5D12投与後直ちに一過性に減少し、そして、循環からch5D12が取り除かれた後にそれらの元の値に回復した(示されていない)。
この非盲検の多施設試験において、ch5D12の4の用量水準が、中等度から重症のクローン病を有する被験者に投与された。18の被験者が登録され、3の被験者だけが登録された最後の用量の集団を除き、夫々の処置の集団において5の被験者を有した。ch5D12血清水準は用量依存的に増加し、そして、カニクイザルにおいて観察された長い血清半減期27がヒトにおいて確認された。本研究は、主な副作用が無く、ch5D12を用いて、CD40媒介の細胞活性化(CD40-mediated cell activation)を拮抗することの実行可能性を示す。CDAI分析は、被験者の72%が臨床的な応答を経験したこと、そして、22%が治験の間の寛解を経験したことを示す。これらの結果は有望である;しかしながら、非盲検設計及び対照群の欠如は、観察された変化を、治験薬の投与に明確に帰することを不可能とする。しかしながら、我々は、ch5D12の抗炎症性効果を支持するいくつかの論拠を有する。第1に、2の最も高い用量の集団における被験者の間の、CDEISにおいて観察された減少は、処置の効能を指示する。第2に、バイオプシーについてなされた組織学的及び免疫組織化学的分析の結果は、ch5D12が、回腸又は結腸における炎症活性を減少することを示す。低用量集団において、明白な効果は観察されなかった。10.0mg/kg集団における被験者は、0日目での最も低い組織学的活性スコアを有し、そしてそれ故に、この集団において、活性スコアにおける減少は限定される。ベースラインでの最高のスコアが、1.0mg/kg及び3.0mg/kg集団において見られ、そして、これらの患者において、28日目での組織学的スコアにおける明白な減少があった。本治験において、2の患者は、抗ch5D12抗体を有すると同定されたが、HACA抗体の水準は非常に低いままであり、そして非常に低い血清希釈で検出可能であるだけであった。抗ch5D12応答が、続く研究において検出されるであろうかどうかはまだ確立されていない。
5D12ハイブリドーマ細胞株から始まり、5D12のマウス可変領域がクローン化された。簡潔にいうと、Qiagenを用いて溶解された細胞から全RNAが単離された。
配列分析後、V領域についてのコンセンサス配列が決定された。次に、該V領域が、キメラIgG4免疫グロブリン発現プラスミドを構築する為に、ヒトIgG4及びヒトκをコードするゲノム配列と一緒に、pcDNA3002(Marissen et al, J. of Virol, 2005: 79:4672-4678)中に再クローン化された。
Biovationと共同で、彼らの専売のDeImmunisation技術を用いて、V領域内に、潜在的なT細胞エピトープが同定された。ヘルパーT細胞エピトープは、MHCクラスII分子に結合する能力を有するタンパク質内の短いアミノ酸配列を含む。T細胞エピトープの除去により、該抗体は、T細胞援助及びそれに対する続く免疫原性をもはや誘発できない。同定は、ペプチドスレディング(Peptide Threading)を用いてなされた。ペプチドスレディングアプローチは、X線結晶学により解析された既知の構造に基づく18の異なるヒトMHCクラスII分子へのペプチドの結合性を予測する、コンピューターに基づく方法である。さらに、データベース(www.wehil.wehi.edu.au)から、既知のヒトT細胞結合性ペプチドの存在についてV領域を探索するための分析が行われた。
脱免疫化pcDNA3002発現プラスミドのVH領域内のマウス配列を再建するために、StrategeneのQuick Change部位特異的変異キットが、製造者のプロトコルに従い用いられた。表4において、用いられたオリゴヌクレオチドが示される。簡潔にいうと、該プラスミドが変性され、所望の変異を有するセンスプライマー及びアンチセンスプライマーのアニーリングが続いた。Biometra T勾配PCR装置を用いて、16回のの繰り返し(30秒95℃;30秒55℃;600秒68℃)により、変異配列が組み込まれた。変異していない親プラスミドが、メチル化DNAだけを切断するDpnIを用いて消化された。その後、変異したプラスミドを有するPCR混合物が、XL1−Blueコンピテント細胞中に形質転換された。コロニーが選ばれ、正確なプラスミドについてのDNA配列により分析された。実験の第2の設定は、特に、Iの構造的に関連するV又はLとの置換による、位置29及び37の追加の変異体を産生することに焦点を当てた。上記で記載されたのと同様のやり方で、表6に示されたとおりのオリゴヌクレオチドを用いてプラスミドが産生された。二重変異体を作成する為に、2の変異誘発ラウンドが要求された(表7)。プラスミドは、XL1−blueコンピテント細胞を形質転換するために用いられた。
5D12の種々のバージョンの発現がPER.C6(商標)(Crucell)において一過性に行われた。簡潔にいうと、形質導入の前日にPER.C6(商標)がトリプシン処理され、そして数えられた。細胞は、10%FCSにより置換されたDMEM中に、T24ウェルプレート中にウェル当たり4×105細胞の密度で蒔かれた。次の日に、培地が、0.5mlの新鮮培地と交換された。それぞれのウェルについて、1μgのプラスミドDNAが、50μlのOPTI−MEM I中に希釈され、これは3μlのLipoFectAMINE2000(LF2000)試薬(Invitrogen)を有する等量のOPTI−MEM Iと混合された。混合物は、室温で20分間インキュベートされて、DNA−LF2000試薬複合体を形成することを許した。続いて、DNA−LF2000試薬複合体(100μl)が、それぞれのウェルに直接に添加された。形質移入された細胞は、CO2インキュベーター中で37℃でインキュベートされた。48時間後、上清が、抗体発現について分析された。
発現された抗体の量が、サンドウィッチELISAにより測定された。簡潔にいうと、96ウェルEIA/RIAプレート(Corning 3590)が、一晩4℃で、PBS中に1/1000希釈されたポリクローナル抗体抗ヒトIgG(Jackson 109−005−088)により被覆された(100μl/ウェル)。0.05%Tween及び1%BSAを有するPBSによるブロッキング後、プレートは、PBS−0.05%Tweenにより3回洗浄された。続いて、基準として、精製されたキメラ5D12が、400ng/mlで開始し0へのタイトレーションにおいて、3回、適用された。試料(一過性の上清)も、タイトレーションにおいて適用された。全ての希釈は、PBS−0.05%Tween中になされた。プレートは37℃で1時間インキュベートされた。3回の洗浄後、1/5000希釈された検出抗体(アルカリホスファターゼラベル化
抗ヒトκ(Southern Biotech Associates 2060−04))が、それぞれのウェルに適用された。プレートは、37℃で1時間インキュベートされた。インキュベーションの除去後、プレートは5回洗浄された。染色は、PNP基質(Sigma N−2765)(1mgPNP/ml基質緩衝液−100mM Tris/HCl、100mM NaCl、5mM MgCl2・6H2O pH 9.5−)によりなされた。OD405nmが、基準として655nmを用いて、BioRad 550 Titertek上で測定された。
FACS分析により、発現された抗体の抗原特異性が分析された。JY細胞は、EBVにより形質転換されたヒトB細胞であり、CD40を発現する。簡潔にいうと、100,000のJY細胞が、一過性発現実験からの100μl上清と、4℃で20分間インキュベートされた。結合していない抗体を除く為に、細胞は、0.05%NaAzide及び1%BSAを有するPBSにより洗浄された。二次抗体として、1/100希釈されたFITCラベル化抗ヒトIgG(Jackson 109−095−127)が用いられた。4℃での20分のインキュベーション後、細胞は洗浄された。最終的に、細胞試料は、FACScan(BD)上で測定された。
Lonza Biologics(Lonza)が、PanGenetics BVにより、ヒト組み換えIgG4/κ抗体PG102(I29L変異体)を発現するGS−CHO細胞株の構築、選択及び評価を引き受けるよう要請された。細胞株は、Lonzaのグルタミンシンテターゼ(GS)Gene Expression System(国際公開第2003/054172号パンフレット)を用いて作られたベクターによりCHOK1SV宿主細胞を形質移入することにより構築された。遺伝子配列は、Pangeneticsにより供給された。該細胞株CHOK1SVは、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株CHOK1の懸濁変異体(suspension variant)であり、これは、化学的に規定された、動物成分無しの(CDACF)培地に適合している(Bebbington et al (1192) Biotechnology 10:169-75; de la Cruz Edmonds MC et al (2006) Mol. Biotechnol. 34:179-90)。
細胞は、37℃へすばやく温めること及び約50mlの増殖培地中に希釈することにより、凍結保存されたストックのバイアルから生き返らされた。凍結保護物質は、細胞を遠心すること、上清を捨てること及び新鮮な増殖培地中に細胞を再懸濁することにより、除去された。
形質移入の日に、非選択培地中で増殖する細胞が、遠心により回収され、そして、1.43×107生存細胞/mLの濃度で再懸濁された。それぞれの形質移入について、約0.7mLの細胞懸濁物及び40μgのプラスミドDNAが、エレクトロポレーションキュベットに添加された。エレクトロポレーションキュベットは次に、エレクトロポレーション装置中に置かれ、そして、300V,900μFの1回のパルスが送達された。エレクトロポレーションに続き、キュベットからの細胞が、96ウェルプレート中に約5000宿主細胞/ウェルで、培地CD−CHO/フェノールレッドを用いて分配された。プレートは、空気中の10%v/vCO2の雰囲気中で、35.5〜37.0℃でインキュベートされた。形質移入の次の日、150μLの選択培地CD−CHO/フェノールレッド/66.6μM MSXが、それぞれのウェルに添加された。それぞれのウェル中のMSXの最終濃度は50μMであった。プレートは、いつ形質移入されていない細胞が死んで形質移入された細胞の増殖巣(focus)を離れたかを決定する為に監視された。形質移入された細胞の増殖巣は、形質移入後約3〜4週で明白となった。試験され且つさらに発展された全ての形質移入体は、視覚の評価により決定されたときに、単独のコロニーだけを有するウェルから来た。
96ウェルプレートは、コロニー形成を許すための形質移入に続き、約3〜4週間インキュベートされた。コロニーは、それらが適当なサイズ(ウェルの底の60%超を覆う)であること及びそれぞれのウェル中に1つのコロニーだけが存在することを確認する為に、顕微鏡的に調べられた。培養物上清は次に、以下で「アセンブリーELISA」と記載される、集合した抗体についてのLonzaのELISA分析を用いて抗体産生について分析された。ウェルの百分率集密度は、サンプリングの時に評価された。該分析結果を百分率集密度により割り算することによって得られた値は、細胞株を順位付けするために用いられた。
懸濁培養物は、集密なT25フラスコ培養物から開始された。該懸濁培養物は、CD−CHO/25μM MSX培地を有する125mL振とうフラスコ中に0.05〜0.2×106生存細胞/mLの濃度で植菌された。もし生存細胞濃度が、T25フラスコ中での最大の14日後に0.05×106生存細胞/mLに達していなかったならば、それぞれの培養物の15mLが、125mL振とうフラスコ中の15mLのCD−CHO/25μM MSX中に機械的に進められた。細胞株は、次に、新鮮なCD−CHO/25μM MSX培地中へと、0.2×106生存細胞/mLの植菌濃度で、4日の継代培養計画について、許容可能且つ再現可能な増殖特性が得られるまで、連続的に継代培養された。
流加(Fed−batch)振とうフラスコ培養
夫々の選択された細胞株の一重の培養物が、500mL振とうフラスコ中で、CM42/4×SPE培地を用いた、100mLの細胞懸濁物により調製された。培養物は、0.2×106生存細胞/mLで植菌され、そして、夫々の培養物のヘッドスペースは、空気中の5% v/v CO2により平衡化された。該培養物は、140±5rpmで回転する振とうプラットフォーム上で35.5〜37.0℃で、生存細胞濃度がピーク後に0.6×106生存細胞/mLより少なくなるか若しくは等しくなるか又は15日が達せられる(「過増殖される」)まで、インキュベートされた。このときに、該培養物が回収された。細胞濃度は、Vi−CELL自動化細胞カウンターを用いて毎日測定された。1.4〜2.2×106生存細胞/mLの細胞濃度で、栄養素フィードSF40のボーラス添加(bolus addition)がなされた。さらなるボーラス添加が、該最初の添加後約24、48及び72時間でなされた。第二のフィード(SF41)が、4.0×106生存細胞/mLが得られた時点で適用された。培養物の試料が適当な間隔で取られ、遠心され、そしてプロテインA HPLCにより抗体濃度について分析されるまで−20±5℃で上清が保存された。夫々の過増殖培養物からの回収上清は、−20±5℃で保存された。最も高い抗体濃度を有する10の過増殖培養物がさらに、産生された抗体の性質について評価された。試料は、プロテインA精製及び還元及び非還元ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)及び等電点電気泳動(IEF)分析及びマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析(MALDI TOF−MS)オリゴ糖分析による抗体の特徴付けの前に、ゲル浸透高速液体クロマトグラフィー(GP−HPLC)法を用いて凝集水準について評価された。
細胞は、作業計画を通じて要所で凍結保存された。増殖する培養物中の細胞は、遠心により回収され、そして、凍結保存混合物中に再懸濁された。これは、適当な増殖培地(92.5%v/v)及びジメチルスルホキシド(7.5%v/v)から成った。
次に、細胞のアリコート(aliquot)が、ラベルが付されたバイアル中に分配され、夫々のアリコートは約1.5mLの凍結保存培地及び約0.5〜1.5×107生存細胞を有した。バイアルは、次に、自動的なプログラム可能細胞凍結装置中で凍結され、次に液体窒素冷蔵庫へと移された。
選択された細胞株の夫々について、細胞の世代数が、培養物が懸濁物中に継代された時点でゼロとして定義された。世代数は、次に、以下の等式から導かれる手順を用いて夫々の継代培養で計算された(最も近い0.5世代に切り捨てされた)。
増殖曲線下の面積の時間積分(生存細胞濃度の時間積分(IVC);109細胞・h/L)が、隣接する細胞濃度の値の間の面積(直角台形に近似された)を合計することにより計算された。該面積は、2の測定の間の経過時間(h)により、2の生存細胞濃度(細胞/mL)の平均を掛け算することにより計算された。この方法は、Renardら(1988)により、Biotechnology Leters 10(2)91〜96ページにおいて記載されたものに基づく。必要に応じて、全体の比生産速度(qp 全体:mg/109細胞/h)が、生存細胞濃度の時間積分に対する抗体濃度(mg/L)の線形回帰分析により計算された。この直線の傾きは、qp全体に等しい。回収の比生産速度(qp回収)は、回収抗体濃度を、回収でのIVCの値により割り算することにより計算された。
上清試料の抗体濃度が、集合したヒトIgGを測定するELISAを用いて決定された。これは、ヤギ抗ヒトIgG Fcにより被覆された96ウェルプレート上への、試料中及び標準中の集合した抗体の捕捉に関係した。結合した抗体は、ホースラディッシュペルオキシダーゼを結合したヤギ抗ヒト軽鎖及び発色基質テトラメチルベンジジンにより明らかにされた。色の発展は、試料中に存在する抗体の量(mass)に比例した。該濃度は、IgG標準(ロットナンバーL07387/5/2)を用いて作られた標準曲線を用いて決定された。
産物濃度が、Agilent 1100HPLC上で、プロテインA高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により定量された。抗体は、POROSプロテインA免疫検出カラムに選択的に結合された。結合していない物質はカラムから溶出され、そして、残る結合した抗体が、溶媒のpHを減少させることにより遊離された。溶出は、多波長検出器を用いて280nmでの吸光度により監視された。抗体は、抗体標準(ロット L07385/4/10)に対して(Chemstationソフトウェアを用いて)定量され、そして
の吸光計数について補正された。
重力送りのrmpプロテインAセファロースカラム(5mL)が調製された。該カラムは、6MグアニジンHClにより、使用の前に清潔にされ、そして、50mMグリシン/グリシネート−250mM NaCl緩衝液、pH8.0により平衡化された。カラム充填物質のpHは、カラムへの適用の前に、pH8.0±0.1に調節された。該rmpプロテインAアフィニティーカラムは、平衡緩衝液により洗浄され、そして、0.1Mグリシン緩衝液、pH3.5により溶出された。カラム溶出物は、2M Tris Baseにより約pH7.0に中和され、そして、Dulbeccoのホスフェート緩衝生理食塩水に対して、IEF及びSDS PAGE分析の為の準備において、透析された。
細胞培養物試料が、プロテインA精製による分析の為に調製された。電気泳動は、4〜20%のプレキャストのNovexポリアクリルアミドゲルを用いて実施された。還元性SDS−PAGEの為に、試料は、2−メルカプトエタノールを用いて還元され、そして、SDSによりpH8.0で変性された。試料は、それらがゲルにロードされる(レーン当たり10μg)前に、2.0±0.5分間加熱された。還元されていないSDS PAGEが、同じゲル及びNovex非還元性試料緩衝液(2−メルカプロエタノールが添加されていない)を用いて実施された。試料は、それらがゲル上にロードされる(レーン当たり4μg)前に、10±0.5分の標準時間、加熱された。電気泳動に続き、タンパク質は、クマシーブリリアントブルーR250により75分間染色することにより視覚化され、そして、メタノール/酢酸により脱染された。
細胞培養物試料が、プロテインA精製による分析の為に調製された。IEF分析は、プレキャストのアガロースIEFゲル、pH3〜pH10を用いて実施された。レーン当たり約10μgのタンパク質試料が、ゲル上にロードされ、そして次に70Vhについて予備フォーカスされた。試料適用ストリップの除去後、電気泳動は、1500Vhについて継続された(ゲル当たり、1500V、20mA、25W)。IEFゲルは、トリクロロ酢酸:スルホサリチル酸:メタノール溶液中に固定され、そして次に、クマシーブリリアントブルーR250(クマシーブルーのロットナンバー 003/L11905/118及び003/L11905/131)により染色された。ゲルは次に、脱染されそして乾燥された。(脱染のロットナンバー 003/L11905/117及び003/L11905/121)
GP−HPLC法は、タンパク質成分のサイズに従い、タンパク質成分を分ける。大きな成分、例えばタンパク質凝集体などは大きすぎて、どの大きさの程度のマトリックス粒子にも進入することができず、それ故に、小さな成分、例えばタンパク質モノマーなどより先にカラムから溶出される。より小さな成分、例えば断片などは、より容易にマトリックスに進入し、そしてモノマーの後に溶出される。この技術はそれ故に、凝集体及び断片の両方から、抗体モノマーを分離する為に用いられた。該モノマー成分は、その特有の保持時間及び位置により、検量マーカー(calibration marker)と比較して同定された。
希釈されていない試料が、産物濃度が1〜5mg/mLであった(Lonzaの分析の確認されたロード範囲)ところの50〜250μgロードを与える為に注入された。GF−250カラムについての分子量範囲は、4〜400kDaであった。試料成分は、280nmで検出され、そして、ピークのクロマトグラムは、Agilent Chemstationソフトウェアを用いて分析された。積分は、凝集体については垂直液滴法を用いて、そして、断片についてはタンジェントスキム(tangent skim)を用いて、実施された。試料成分の割合は、全ての積分されたピーク面積と比較した、夫々の成分のピーク面積の計算により決定された。
夫々の細胞株により産生されたPG102抗体のオリゴ糖分析が、MALDI TOF−MSにより、Micromass(商標)MALDI−LRを用いて、遅延引き出しと組合せて実施された。MALDI TOF−MSは、陽イオンモードによりリフレクトロンコンフィグレーションにおいて操作された。装置は、混合されたN−グリカン標準を用いて校正された。
抗体は、POROSプロテインAカラムを用いて、回収上清から精製された。該精製された画分が集められ、そして、ジスルフィド結合がジチオスレイトールにより還元され、ヨード酢酸を用いた還元されたチオールのアルキル化が続いた。オリゴ糖は、酵素N−グリカネース(N−glycanase)(PNGaseF)を用いて遊離され、そして、MALDI TOF−MSの為の標的プレート上の、スーパー−ジヒドロキシ安息香酸(スーパー−DHB)マトリックスの2層の間に、サンドウィッチされた。
CHOK1SV宿主細胞の形質移入
PG102遺伝子配列が、Lonzaにより、CHOK1SV宿主細胞株をエレクトロポレーションにより形質移入する為に用いられたダブル遺伝子(double gene)ベクターpPG102/DGV(示されていない)を構築する為に用いられた。形質移入の6セットが、ベクターpPG102/DGVを用いて実施され、そして、255の形質移入物の上清が、抗体産生について、96ウェルプレート中でアセンブリーELISAにより選抜された。検出できる抗体水準は、選抜された形質移入物の99.6%により産生された。43の高い順位の形質移入物が、24ウェルプレートにおけるさらなる評価のために選択された。
選択されたGH−CHO細胞株の培養物が最初に、24ウェルプレート中に展開され、そして次に、T25静置フラスコ中に展開された。24ウェルプレート中に残る細胞は、新鮮な培地が与えられ、そして抗体生産性を評価する前に「過増殖」された。選択された細胞株は、8.3〜120mg/Lの抗体濃度の範囲を示した(図10)。
アセンブリーELISAにより測定されたときに、最も高い産生濃度を有する23の細胞株の培養物が、さらなる評価の為に選択された。該選択された培養物は、懸濁培養におけるCDACF培地中に進められた。全ての細胞株は懸濁培養に成功裏に適合され、そして、流加培養におけるさらなる評価の為に選択された。
23の選択された細胞株の増殖及び生産性の特性が、流加振とうフラスコ培養において評価された。一重の培養物(singlet culture)が、夫々の細胞株について調製された。2のフィード(SF及びSF41)が、生存細胞濃度がフィーディング基準を満たしたときに、培養物に添加された。フィード計画について用いられたプロトコルは、Lonzaの一般的なGS−CHO発酵プロセスを技術的に可能な限り近く模倣する。23の選択された細胞株についての増殖及び生産性のデータは、表9中に提示される。流加振とうフラスコ培養物の回収された上清のプロテインA HPLC分析は、4の細胞株が、1000mg/L超の抗体濃度を産生したことを示した。細胞株L107は、最も高い抗体濃度、1674mg/Lを産生した。
最高の抗体濃度を有する10の細胞株の回収試料が、分析に先立ち、rmpプロテインAセファロースクロマトグラフィーを用いて精製された。該プロテインA精製された抗体は次に、SDS PAGE及びIEFを用いて分析された。非還元的条件下におけるSDS PAGEにより分析された、プロテインA精製された試料の視覚的分析は、全ての試料が互いに比較できたことを示し、約200kDaでの完全抗体バンドを示した(データは示されていない)。追加のマイナーバンドが見えたが、それらはゲル画像上では全てが視認できたわけではなかった。116と200kDaとの間の分子量を有する3つのバンド(66と97kDaとの間の分子量を有する1のバンド、37と55kDaとの間の分子量を有する1のバンド及び22と31kDaとの間の分子量を有する2のバンド)もまた観察された。66と97kDaとの間に観察された追加のバンドは、非還元性条件下におけるIgG4抗体の典型的な半抗体である。同じ半抗体は、IgG4内部評価対照(IAC)においても観察される。
還元性条件下におけるSDS PAGEにより分析された、プロテインA精製された試料もまた、互いに比較可能であり、約50kDaでの重鎖バンド及び約25kDaでの軽鎖バンドを示した(データは示されていない)。選択された細胞株からのプロテインA精製された抗体試料の完全性は、L97、M92及びM59を除く全ての細胞株について、pI範囲8.15〜9.30中に6の主要なバンド(3のメジャーバンド及び3のマイナーバンド)を有する、比較可能なプロファイルを実証したことを、IEF分析は示した。これらの3の細胞株は、3のメジャーバンド及び2のマイナーバンドを示した。追加のバンドは、試料J3及びJ4において観察されたが、これらはゲル画像上ではすべて視認できたわけではなかった。
流加振とうフラスコ培養物におけるさらなる評価の為に選択された10の細胞株のそれぞれにより産生された抗体のオリゴ糖分析が、MALDI TOF−MSにより測定された。10の細胞株から得られた抗体中の主なオリゴ糖構造はG0F及びG1Fであり、これは抗体上に観察される典型的なN−結合型オリゴ糖構造である。比較的低い水準のオリゴマンノース構造が、細胞株L52から生じた抗体について測定された全グリカンの、6.7%の最高の水準を有して観察された。オリゴマンノース−5(man−5)構造は、全グリカンの1.1〜4.6%の範囲で、全ての試料において観察された。分析された試料の全ては、比較できる水準のオリゴ糖を有し、且つ、比較的低い濃度のman−5を有した(データは示されていない)。
さらなる評価の為に選択された10の細胞株の夫々により産生された抗体がGP−HPLCにより分析されたときに、より低い分子量成分(LMWC)は最も重要性が低いが、25%より低い水準が好ましい。全ての試料は、27.1%の水準を示したL52を除き、25%より低い水準を示した(表10)。
LMWC水準が試料の間で非常に変化したので、凝集体の割合の2の異なる計算は通常は用いられないだろうが、必要であると思われた。
LMWCを排除し且つモノマーとより大きなピークだけを見る、データのさらなる分析は、全てのサンプルについて、2.2%より少ない凝集体ピーク面積を示した(表11)。5%より低い水準は、許容できると考えられる。
3の細胞株が、プリシード(pre−seed)ストック(PSS)の調製の為に選択された。用いられた選択基準は、高い回収抗体濃度、許容できる増殖特性及び許容できる産物品質特性の組合せであった。
細胞株M95は、評価された23の細胞株のうち3番目に高い回収抗体濃度を示し、且つ許容できる増殖及び産物品質の特性を有した(図11C)。この根拠に基づき、細胞株M95は、第2のバックアップ細胞株として選択された。
プリシードストック(ストック当たり20のバイアル)が、3の選択された細胞株の夫々について凍結保存された。これらのストックは、蒸気層液体窒素冷蔵庫中で保存された。細胞株L107、L25及びM95は夫々、DC1、DC2及びDC3を新たに命名された。
Lonza Biologicsは、ヒト組み換えIgG4/κ抗体PG102を発現するGS−CHO細胞株の構築、選択及び評価を行うよう要請された。
遺伝子配列は、PanGeneticsにより供給され、そして、ベクターは、LonzaのGlutamine Synthetase(GS)Gene Expression Systemを用いて産生された。化学的に規定された、動物成分フリー培地に適合したチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株CHO−K1の懸濁変異体である細胞株CHOK1SVが、エレクトロポレーションにより形質移入された。
CHOK1SV形質移入から、抗体を分泌した254の細胞株が得られた。43の細胞株が、24ウェルプレート中において増殖及び生産性について評価された。最大で120μg/mLの抗体濃度が得られた。23の細胞株が、一重の流加振とうフラスコ培養において評価された。121〜1674μg/mLの範囲の回収抗体濃度が得られた。1000mg/Lを超える回収抗体濃度が、4の細胞株について得られた。最高の抗体濃度を有する10の細胞株が、産物品質分析の為に選択された。該選択された細胞株の夫々からの精製された抗体の産物品質は、還元された及び還元されていないドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動並びに等電点電気泳動分析により互いに比較可能であった。10の選択された細胞株の夫々からの精製された抗体のオリゴ糖分析は比較的低い水準(<4.6%)のオリゴマンノース−5を示した。
GP−HPLC分析は、凝集体水準が、トップの3つの細胞株の夫々について1%より低かったことを示した。
3の細胞株(L107、L25及びM95)が、増殖、生産性及び産物品質のデータに基づきさらなる評価の為に選択された。夫々の細胞株の20のバイアルのプリシードストックが凍結保存された。3の細胞株は夫々、DC1、DC2及びDC3と新たに命名された。
ヒトCD40に結合するch5D12(PG100)及びPG102(I29L変異体)の動態学が、表面プラズモン共鳴により、25.0℃の一定温度で、Biacore3000装置を用いて、比較された。ヒトIgG1−Fcドメイン(huCD40−Fc;R&D Systems カタログナンバー 149−CD−50)へと結合された組み換えヒトCD40細胞外ドメインが、これらの実験において標的抗原として用いられた。huCD40−Fc(10mMアセテート緩衝液、pH5.0、中の1μg/mL)が、Lys残基のアミン基を介して、カルボジイミド活性化されたBiacore CM5チップへと結合されて、127.4RUの抗原固定化レベルを結果した。動態学分析の為に、ch5D12(PG100)及びPG102(範囲10.0μg/mL〜0.313μg/mL)の希釈系列が、Biacore Running Buffer(EDTA及び界面活性剤を有する、HEPESにより緩衝された生理食塩水:HBS−EP)中に調製された。動態学的分析が、30μL/分の流速で実施された。試料は、同じ流速で、4分間結合することを許され、そして、5分間解離することを許された。該チップ表面は次に、30mM NaOHを用いて30秒間再生され、そして、ベースラインが、次の試料の注入の前に、HBS−EP中で、2.5分間再確立された。PG102及びch5D12(PG100)の交互の試料が注入されて、レプリケート(replicate)の第1設定について、夫々の希釈で濃度を増し、そして、レプリケートの第2設定については減少した。。
BIAcoreコントロールソフトウェア(Version 3.2)が、データ補正の為に用いられ、そして、BIAevaluationソフトウェア(Version 4.1)が動態学的データの分析の為に用いられた。結合パラメーターは、分子相互作用の2つの異なるモデルを用いて計算された:二価アナライトモデル及びラングミュア1:1結合性モデル。
ch5D12(PG100)及びPG102抗体についての観察された結合性の最大水準は夫々、152.5RU及び140.2RUであった。
ヒトCD40を発現するJY細胞が、室温で30分間5%ヒト血清によりブロックされた。マウスmAb 5D12(クローン173−36−1)への抗イディオタイプ抗体が、種々の濃度で(0〜10μg/mL)、ch5D12(PG100)(1μg/mL)、PG102(1μg/mL)又は負の対照のキメラ抗huCD86抗体(chFUN−1;1μg/mL)と一緒に、50μL/チューブの全量で予備インキュベートされ、そして15分間インキュベートされた。JY細胞は、FACS緩衝液(1×PBS、1%BSA及び0.05%アジ化ナトリウム)により洗浄され、そして、上清が廃棄された。JY細胞は、FACS緩衝液中に、2×106細胞/mLの濃度へと再懸濁された。50μLのJY細胞懸濁物が、予備インキュベートされた抗体混合物へと添加されて、100μL/チューブの最終体積を与えた。細胞は、4mlのFACS緩衝液/チューブにより洗浄する前に、30分間4℃でインキュベートされ、そして、上清が廃棄された。細胞ペレットは、FACS緩衝液中に希釈された(1:100)ヤギ抗ヒトIgG−FITC(Jackson Immunoresearch Labs. カタログナンバー 109−095−127)の100μL中に再懸濁され、そして、30分間4℃でインキュベートされた。細胞は、4mlFACS緩衝液により洗浄され、そして上清が廃棄された。ペレットは、200μLのFACS緩衝液中に再懸濁され、そして、結合した抗体が、FACScanフローサイトメーター(Becton Dickinson)を用いて測定された。
抗イディオタイプmAb 173−36−1は濃度依存的様式で、JY細胞上に発現されたhuCD40へと結合するPG102及びch5D12(PG100)を抑制した(図13)。JY細胞上でも発現されるCD86へのchFUN−1の結合性は、mAb173−36−1により影響されなかった。JY細胞上のCD40へのCD40特異的抗体の結合性に対する、抗イディオタイプmAb 173−36−1のブロッキング効果における有意な差はなかった。例えば、mAb 173−36−1により媒介される、ch5D12(PG100)(バッチ1)及びPG102(バッチ2)の抑制についての計算されたlog IC50の値は夫々、−5.74±0.14及び−5.76±0.11であった(p>0.05;両方ともn=4)。これらの値は、約1.8μg/mL(〜12nM)の抗イディオタイプ濃度に相当する。表12は、JY細胞に結合するch5D12(PG100)及びPG102の、抗イディオタイプにより媒介される抑制についての、計算された−logIC50の値の概要を示す。
ELISAプレート(Costar EIA/RIAプレート、Corningカタログナンバー3590)が、100μL/ウェルのhuCD40−muIg(Ancell、カタログナンバー504−020)(PBS中で250ng/mLへと希釈された)により被覆され、そして、湿潤環境において4℃で一晩インキュベートされた。プレートは、200μL/ウェルの洗浄バッファー(BPS中の0.05% Tween−20)により3回洗浄された。次に、プレートは、200μL/ウェルのブロッキングバッファー(洗浄バッファー中に5% BSAフラクションV(Roche、カタログナンバー735094))により、ブロックされ、そして37℃で1時間インキュベートされた(湿潤環境)。プレートは、洗浄バッファーにより3回洗浄された。試験抗体(ch5D12(PG100)、PG102及び負の対照のキメラ抗huCD86抗体chFUN−1)が、ブロッキングバッファー中に0〜1200ng/mL範囲で希釈され、そして、アッセイプレートへと100μL/ウェルの最終体積で移され、そして37℃での1時間のインキュベーション(湿潤環境)が続いた。プレートは、洗浄バッファーにより3回洗浄され、ブロッキングバッファー中に1:1000で希釈されたヤギ抗ヒトκ−AP検出抗体(Southern Biotech Associates、カタログナンバー2060−0)の100μL/ウェルの添加が続いた。プレートは、洗浄バッファーによる3回の洗浄及びPBSによるさらなる1回の洗浄の前に、1時間、37℃で、湿潤環境においてインキュベートされた。PNP基質が、1タブレットのp−ニトロフェニルホスフェートタブレット(Sigma、カタログナンバーN−2765)を15mLのPNP基質緩衝液(12.1g Tris、5.84g NaCl、1.02g MgCl2・6H2O(HClによりpH9.6に調整された))に添加することにより調製された。PNP基質は、100μL/ウェルでアッセイプレートに添加された。プレートは、数分間(最大で30分)、37℃でインキュベートされて、色の発生を許し、その後3MのNaOHの添加により該反応が停止された。色の強度は、405nmで、マイクロプレートリーダー(Biorad、モデル550)を用いて測定された。
多くの独立の実験群において、連続的に希釈されたch5D12(PG100)及びPG102(I29L変異体)が、固定化されたCD40−Fcに比較できる程度に結合されたことが分かり(図14)、他方、抗CD86対照抗体は、CD40−Fcへの目に見えるほどの結合性を示さなかった。全ての実験についての、計算された最大の半分が結合する濃度が、表13に集約されている。評価された抗CD40抗体バッチのいずれについても、該最大の半分が結合する濃度において有意な差は観察されなかった。
CD40発現性JY細胞が、FACS緩衝液(1×PBS、1%BSA及び0.05%アジ化ナトリウム)により洗浄された。上清が廃棄され、そして、JY細胞が2×106細胞/mLの濃度へとFACS緩衝液中に再懸濁された。その後、50μLのJY細胞懸濁物が、濃度範囲0〜900ng/mLで調製された試験抗体(ch5D12(PG100)、PG102及び負の対照のキメラ抗huCD86抗体chFUN−1)の夫々の50μLに添加され、そして、30分間4℃でインキュベートされた。細胞は、4mlのFACS緩衝液/チューブにより洗浄され、そして上清が廃棄された。細胞ペレットは、FACS緩衝液中で1:100に希釈されたヤギ抗ヒトIgG−FITC(Jackson Immunoresearch Labs.カタログナンバー109−095−127)の100μL中に再懸濁された。細胞は、4mlのFACS緩衝液により洗浄され、そして、上清が廃棄された。ペレットは、200μLのFACS緩衝液中に再懸濁され、そして、結合した抗体は、FACScanフローサイトメーター(Becton Dickinson)を用いて測定された。
ch5D12(PG100)及びPG102の全ての試験されたバッチは、比較できる最大の半分の抗体が結合する濃度(表14)で、JY細胞上に発現されたCD40へと結合することの同様の特性(表15)を示した。chFUN−1もまた、ch5D12(PG100)及びPG102より低い平均蛍光強度(MFI)であるが、JY細胞に結合した。これは、JY細胞もヒトCD86を発現するからである。
種々のPG102(I29L変異体)及びch5D12(PG100)のバッチのCD40結合性特性は、インビトロでの細胞性及びELISAに基づくアッセイを用いて測定された。CD40を発現するJY細胞への、PG102及びch5D12(PG100)の結合性は、抗イディオタイプmAb173−36−1により等しい力価で抑制された。すなわち、PG102及びCH5D12(PG100)のバッチについての計算された平均−logIC50値の範囲は夫々、5.51〜6.11(n=8)及び5.43〜6.04(n=10)であった(p>0.05)。抗体173−36−1は、マウスmAb 5D12であるch5D12(PG100)前駆体の可変領域に対して向けられ、そして、抗CD86アイソタイプ対照抗体の結合性を抑制しなかった。さらなる実験において、PG102及びch5D12(PG100)の最大の半分が結合する濃度が、ヒトCD40−Fcへと結合する抗体のELISA分析により及びJY細胞への結合性のFACS分析により、測定された。ELISAアッセイにおいて、試験されたいずれのバッチについても、PG102及びch5D12(PG100)の最大の半分が結合する濃度の間で有意な差はなかった。例えば、PG102及びch5D12(PG100)のバッチについての、計算された平均−log最大の半分が結合する濃度は夫々、7.47±0.04及び7.54±0.03であり(P>0.05、両方ともn=4)、約30ng/mlに対応した。同様の最大の半分が結合する濃度が、JY細胞上に発現されるCD40へと結合するPG102及びch5D12(PG100)のFACS実験において観察された。これらの結果は、PG102及びch5D12(PG100)が、CD40へと結合するPG102及びch5D12(PG100)の抑制の為の抗イディオタイプ抗体の比較できる力価特性により実証されるとおり、同じCD40結合性パラトープを共有することを示す。さらに、両方の抗体とも、ELISA及び細胞に基づくアッセイにおいて、ヒトCD40への結合性についての、同様のインビトロ力価を示す。あわせて、提示されたデータは、ヒトCD40へのPG102及びch5D12(PG100)の結合性特性が同じであることを示唆する。
JY細胞(Epstein−Barrウィルスにより形質転換されたヒトBリンパ芽球様細胞株)が、10%の熱不活性化胎児仔ウシ血清(foetal calf serum、FCS)、2mMのL−グルタミン及び50μg/mLのゲンタマイシンを有するIscoveの修正Dulbecco培地(IMDM)中で、5%のCO2を有する空気加湿された雰囲気中で37℃で、増殖された。細胞は、フローサイトメトリー測定の日に回収された。ラベル化されていないch5D12(PG100)(バッチ4)及びPG102(バッチ2)抗体が、これらの実験において用いられた。両方の抗体は、フローサイトメトリーによるJY細胞への結合性の直接の測定の為に、PE−ラベル化形態でも用いられた。抗体は、AbD Serotec(オックスフォード、英国)によってPEを注文でラベル化された。夫々のFACS分析について、以下のプロトコルが用いられた。JY細胞は、細胞培養物から回収され、そして計数された。次に、1×105CD40発現性JY細胞/200μLインキュベーション緩衝液(PBS、1%BSA、0.05%アジ化ナトリウム)が、1μg/mLのラベル化ch5D12(PG100)又はPG102抗体と一緒に、種々の濃度(0〜10μg/mL)のラベル化されていない競合するch5D12(PG100)又はPG102の存在下で、30分間4〜8℃で、インキュベートされた。細胞は洗浄され、全ての濃度でのMFIがFACScanフローサイトメーター(Becton&Dickinson)を用いて測定されたフローサイトメトリー分析が続いた。5000イベント/試料が測定され、CellQuest(商標)ソフトウェアを用いて分析された(Becton&Dickinson)。
ラベル化されていないch5D12(PG100)及びPG102抗体は、これらのアッセイにおいて同様の抑制特性を示した(図16)。ラベル化されていないch5D12(PG100)及びPG102による1μg/mL ch5D12(PG100)結合性の抑制についての平均−logIC50値は夫々、7.50±0.03及び7.63±0.03であり(両方ともn=4)、一方で、ラベル化されていないch5D12(PG100)及びPG102による1μg/ml PG102結合性の抑制についての平均−logIC50値は夫々、7.54±0.01及び7.65±0.02であった(両方ともn=4)。これらの−logIC50値は、約20〜30ng/mL(すなわち、〜130〜200pM)のPG102濃度及びch5D12(PG100)濃度に相当する。
PG102の機能性が、細胞に基づく機能的バイオアッセイを用いて測定された。簡潔にいうと、1日目で、THP−1及びジャーカット39.8/50ヒト細胞が、Iscoveの修正Dulbeccono培地(IMDM、BioWhittaker、カタログナンバーBE12−722F、10%胎児仔ウシ血清(Gibco、ref10270−106)及び50μg/mLゲンタマイシン(Invitrogen、カタログナンバー15750−045)を補われた)中で培養された。THP−1細胞は、rhuIFN−Υにより、1000ユニット/細胞培養物のmLでパルスされた。
バイオアッセイの3日目で、4×105細胞/mLの濃度で、THP−1及びジャーカット39.8/50細胞が要求された。THP−1及びJ39.8/50細胞が計数され、そして、それらの生存率が測定された。細胞は次に、約1×106細胞/mLの濃度へ希釈され、細胞懸濁物は1:1で混合され、そして、37℃で、湿潤された5%CO2雰囲気中で、48時間インキュベートされた。
PG102(I29l変異体)及びch5D12(PG100)は、THP−1細胞により誘起されたIL−8放出に対して同様の抑制効果を示した(図17)。2の抗体について計算された−logIC50値は夫々、8.42及び8.28であった。これらの値は、約30pMのIC50濃度に相当する。
この研究の結果は、試験された用量水準のいずれについても、観察された毒性はないことを実証した。PG102は安全であり且つ忍容性が良好であった。
FACS及び定量的ELISAにより測定されたときの全体像発現データ。ch5D12及びDI5D12と一緒の夫々の5D12変異体(Q5E、K13A、E16Q、T17S、I29L、I37V、P45L、M48L、STS60NSA,T68S、S79F、及びT108S)について、MFI値(FACSより測定されたときの)、及び、回収された上清中の抗体濃度(ELIZAにより測定されたときの)が示される。ニセの形質移入物及び培地対照についてもMFI値が示される。比は、ch5D12値(100%として表される)と比較したELISAデータを用いて計算される。
表12:JY細胞へ結合するch5D12(PG100)及びPG102の、抗イディオタイプ媒介の抑制についての、計算された−logIC50の概要。データは、平均±標準誤差を示す。n回測定の平均。試験された抗体バッチのいずれによっても、抗イディオタイプの抑制力価において有意差はなかった(p>0.05、ANOVAに続き多重比較の為のテューキー検定が続く)。
表13:ELISAにより測定されたときの、ヒトCD40−Fcに結合するch5D12(PG100)及びPG102についての、計算された−log最大の半分が結合する濃度の概略。データは、平均±標準誤差を示す。n回測定の平均。試験されたいずれの抗体バッチの結合性において有意差は無かった(p>0.05、ANOVAに続き多重比較の為のテューキー検定が続く)。参考のために、7.45の−log最大の半分が結合する濃度は、約35ng/ml(〜200pmol)の濃度に相当する。
表14:ELISAにより測定されたときの、ヒトCD40を発現するJY細胞へ結合するch5D12(PG100)及びPG102についての、計算された−log最大の半分が結合する濃度の概略。データは、二重測定の平均を示す。参考のために、7.45の−log最大の半分が結合する濃度は、35ng/ml(〜200pmol)の濃度に相当する。
Claims (37)
- X5がSである、請求項6に記載の抗体。
- X1がLであり、X2がVであり、X3がLであり、X4がLであり且つX5がFである、請求項1〜6のいずれか1項に記載の抗体。
- ヒト抗体の定常領域を含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の抗体。
- 該定常領域がIgG定常領域である、請求項9に記載の抗体。
- 該定常領域が、補体活性化に乏しい領域である、請求項9又は10に記載の抗体。
- 該定常領域が、ヒトIgG4定常領域又は変異したヒトIgG1定常領域である、請求項11に記載の抗体。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載の抗体をコードする核酸。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載の抗体及び/又は請求項13に記載の核酸を含む細胞。
- 該抗体が拮抗性抗ヒトCD40モノクローナル抗体である、請求項1〜12のいずれか1項に記載の抗体。
- 請求項15に記載の、脱免疫化された拮抗性抗ヒトCD40モノクローナル抗体。
- X6がT又はSであり、X7がD又はQであり、X8がQ又はPであり、X9がV又はAであり、X10がV又はLであり、且つX11がF又はYである、請求項17に記載の抗体。
- X6がTであり、X7がQであり、X8がPであり、X9がAであり、X10がVであり、且つX11がYである、請求項17又は18に記載の抗体。
- 請求項17〜19のいずれか1項に記載の抗体を含む細胞。
- 該抗体を産生する、請求項20に記載の細胞。
- ハイブリドーマ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、NS0細胞又はPER−C6(商標)細胞である、請求項14、20又は請求項21に記載の細胞。
- 請求項20〜22のいずれか1項に記載の細胞を含む細胞培養物。
- 抗体を生産する方法であって、請求項14及び20〜22のいずれか1項に記載の細胞を培養すること及び該培養物からの該抗体を回収することを含む上記方法。
- 請求項24に記載の方法により得られる抗体。
- 精製された、請求項25に記載の抗体。
- 請求項1〜12及び15〜19のいずれか1項に記載の抗体、請求項13に記載の核酸、及び/又は請求項14及び20〜22のいずれか1項に記載の細胞を含む医薬組成物。
- 自己免疫疾患及び/若しくは炎症性疾患の症状を改善する為の、並びに/又は移植片拒絶を減少する為の、並びに/又はCD40陽性癌の処置の為の医薬組成物であって、請求項1〜12及び15〜19のいずれか1項に記載の抗体、請求項13に記載の核酸、及び/又は請求項14及び20〜22のいずれか1項に記載の細胞を含む前記組成物。
- 該自己免疫疾患及び/又は炎症性疾患が、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、乾癬、水疱性類天疱瘡及びアトピー性皮膚炎の群から選ばれる、請求項28に記載の医薬組成物。
- 該自己免疫疾患及び/又は炎症性疾患が、炎症性腸疾患を含む、請求項28に記載の医薬組成物。
- 該炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎(UC)又はクローン病(CD)を含む、請求項30に記載の医薬組成物。
- 抗ヒトCD40アンタゴニスト抗体を選択する方法であって、
原型の抗ヒトCD40アンタゴニスト抗体を産生する第1の細胞株を作ること及び該第1の細胞株により産生される原型の抗体の量を決定することを含み、
該原型の抗体は重鎖可変ドメインアミノ酸配列
を含み、
ここでX1及びX2は、X1=I且つX2=V;X1=L且つX2=I;X1=V且つX2=V;X1=L且つX2=L;又はX1=L且つX2=Vから成る群から対で選ばれ、且つ、
軽鎖アミノ酸配列
を含み、
該方法がさらに、
該原型の抗体の変異体を産生する少なくとも1のさらなる細胞株を作ること、
ここで該変異体抗体が、該原型の抗体と比較されたときに、1〜5アミノ酸の挿入、欠失、逆位及び/又は置換を含む改変された原型の抗体であり、
ここで該改変はX1及びX2により同定される位置でのアミノ酸の改変から成ることは無い、
及び
該少なくとも1のさらなる細胞株により産生される変異体抗体の量を決定すること、
を含み、
該方法がさらに、
原型の抗体の量の少なくとも50%である量で産生された変異体抗体を選択することを含む、
上記方法。 - 該1〜5のアミノ酸の挿入、欠失、逆位及び/又は置換が、該原型の抗体中の対応する鎖のアミノ酸配列と比較したときに、該重鎖アミノ酸配列又は該軽鎖アミノ酸配列の中にある、請求項32に記載の方法。
- 該1〜5のアミノ酸の挿入、欠失、逆位及び/又は置換が、該原型の抗体の該重鎖配列と比較したときに、該重鎖アミノ酸配列中にある、請求項33に記載の方法。
- 該選択された抗体を産生する抗体産生細胞株を作ることをさらに含む、請求項32〜34のいずれか1項に記載の方法。
- 該選択された抗体を集めることをさらに含む、請求項35に記載の方法。
- 請求項36に記載の方法により得られる、抗ヒトCD40アンタゴニスト抗体。
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