CN101490086B - 来自ch5D12抗体的去免疫拮抗性抗人CD40单克隆抗体 - Google Patents

Abstract

本发明提供新的拮抗性抗人CD40单克隆抗体，制备它们的方法及其用途。

Description

来自ch5D12抗体的去免疫拮抗性抗人CD40单克隆抗体

本发明涉及免疫原性降低的人、人源化的和单克隆抗体，及其用途和制备方法。本发明尤其涉及拮抗性抗人CD40单克隆抗体。 

CD40分子是50kDa的I型膜糖蛋白，在B细胞、单核细胞/巨噬细胞、树突细胞(DC)和活化的内皮细胞上表达^1-6。在某些条件下，在成纤维细胞、上皮细胞和角质形成细胞上也能发现CD40⁷。CD40配体(CD40L，CD154)是32kDa的II型膜内在糖蛋白，在活化的CD4⁺T细胞和小部分活化的CD8⁺T细胞上短暂表达^8，9。此外，在活化后的许多其他细胞类型中也发现了CD40L，包括肥大细胞、嗜碱性粒细胞、B细胞、嗜酸性粒细胞、DC和血小板^10，11。 

小鼠模型中的研究清楚地显示CD40L-CD40相互作用参与多种自身免疫性疾病的病理生理学(综述参见参考文献¹²)。来自CD40L转基因小鼠(患有致死性炎症性肠病)的证据第一次证明了CD40-CD40L相互作用还可能在炎症性肠病的发病机理中起作用¹³。抗小鼠CD40L单克隆抗体(Mab)在TNBS诱导的结肠炎中通过固有层CD4⁺T细胞有效地预防粘膜炎症和干扰素γ的产生¹⁴。在重症联合免疫缺陷综合症(SCID)小鼠的炎症性肠病模型中，已经证明从T细胞重建当天开始使用抗CD40L治疗可以完全预防实验性结肠炎的临床和组织学表现¹⁵。此外，在T细胞重建后5周的抗CD40L施用仍然可以阻止疾病的进展，与对照动物相比，被治疗的动物显示病征和组织学的改善¹⁵。此外，用来自CD40L敲除小鼠的T细胞对SCID小鼠的重建还证明了表达CD40L的T细胞在疾病发展和白介素12生成中的重要作用¹⁶。 

利用抗CD40L或者CD40的单克隆抗体(Mab)可以拮抗CD40-CD40L相互作用。在用更高剂量水平的IgG₁抗人CD40L Mab治疗患者期间，CD40L在活化血小板上的表达导致在血栓栓塞事件和这类Mab发展的终止 ^17，19。因此拮抗CD40看来是一种更吸引人的方法。利用不同的载有CD40的细胞类型在多种体外研究中证明了Mab 5D12(抗人CD40)的非刺激性拮抗活性^20，22，并且利用多种非人类灵长类动物疾病模型在体内证实了嵌合 5D12(ch5D12)的拮抗剂活性^23，27。ch5D12是一种分子工程化的人IgG₄抗体，其包含小鼠5D12重链和轻链的可变区，其被构建用来降低在人类中使用时小鼠5D12的潜在免疫原性并延长其体内半衰期。 

患有克罗恩病的患者受到胃肠道衰弱性炎性病症的折磨，但其确切的病因学和发病机理还不清楚^28，29。该疾病的特征在于活化的T细胞、B细胞和巨噬细胞流入患病粘膜^30，31，炎症可溶性介导物(mediator)的局部生成，以及相关组织损伤^28，29。已经证明粘膜CD4⁺T细胞和巨噬细胞以及细胞因子如肿瘤坏死因子(TNF)-α和IL-12在起始克罗恩病的炎症性循环(inflammatory loop)中起着重要作用^32，38。来自发炎粘膜的T细胞显示更高的增殖能力^28，29，并且分泌IFN-γ和IL-2的量增加。在克罗恩病患者的粘膜活组织检查中发现与T细胞相关的细胞因子mRNA转录产物水平增加³³。我们研究了CD40/CD40L在克罗恩病损伤中的表达，表明CD40L对活化的CD4⁺T细胞的显著作用³⁹。CD40L能够介导载有CD40细胞(主要是B细胞和巨噬细胞)的强活化，因此引起损伤处TNF-α和IL-12的生成增加。利用免疫组织化学，在所有克罗恩病患者患病区域的样品中均发现5D12染色相对于非患病区域增加。CD40和CD20(B细胞)或者CD68(巨噬细胞)的复染色法提示在克罗恩病患者的切片中，CD40⁺细胞主要是淋巴滤泡中的B细胞和固有层中的巨噬细胞。在共培养48小时后，来自克罗恩病患者发炎粘膜的固有层T细胞诱导单核细胞产生大量IL-12和TNF-α。5D12的添加造成IL-12和TNF-α生成减少；该生成水平被降低到在IFN-γ缺失和存在两种条件下利用对照固有层T细胞观察到的水平³⁹。 

本发明的一个目的是提供在体内具有5D12的至少部分安全性和/或功效、不必需具有所述安全性和/或功效的量的替代分子。抗体5D12或者至少其可变结构域具有小鼠背景。本发明提供5D12的重链和轻链可变结构域的变体。为此本发明提供包括式(I)所示氨基酸序列的多肽 

1           11             21           31 

|            |             |            | 

GFSX₁S RYSVY WX₂RQP PGKGX₃ EWX₄GM MWGGG STDYS 

     41         51           61 

      |          |            | 

TSLKS RLTIS KDTSK SQVX₅L KMNSL RTDDT AMYYC 

71 

| 

VRTDG DY 

其中： 

X₁是G，A，V，L，I，P，F，M，W，C，N，Q，S，T，Y，D，E，K，R或者H； 

X₂是G，A，V，L，I，P，F，M，W，C，N，Q，S，T，Y，D，E，K，R或者H； 

X₃是G，A，V，L，I，P，F，M，W，C，N，Q，S，T，Y，D，E，K，R或者H； 

X₄是G，A，V，L，I，P，F，M，W，C，N，Q，S，T，Y，D，E，K，R或者H；和 

X₅是G，A，V，L，I，P，F，M，W，C，N，Q，S，T，Y，D，E，K，R或者H。 

所述多肽与5D12抗体的重链可变结构域具有广泛的序列相同性，但是将这种多肽或者包括所述多肽的抗体给人类个体施用时所述多肽的免疫原性更低。在指定的X₁-X₅位可以存在指定的几种氨基酸。包括本发明多肽的结合分子具有良好的CD40结合性质。已经注意到细胞中所述抗体的生成随指定位置的氨基酸种类而稍有不同。这将在下文中详细描述。 

本发明还提供包括下列氨基酸序列的本发明多肽 

1           11          21           31 

|           |           |            | 

QVKLQ ESGPG LVKPS ETLSI TCTVS GFSX₁S RYSVY WX₂RQP 

41           51            61           71 

|             |            |           | 

PGKGX₃ EWX₄ GM MWGGG STDYS TSLKS RLTIS KDTSK 

      81         91           101             111 

       |          |            |               | 

SQVX₅L KMNSL RTDDT AMYYC VRTDG DYWGQ GTTVT VSS。 

上述多肽基本上跨越小鼠5D12抗体重链的可变结构域。与小鼠序列相比，所述氨基酸序列在数个位置发生改变。所述改变的多肽具有良好的结合性质，并且同时被施用所述多肽的人良好耐受。可以在指定位置插入多种氨基酸而与原始小鼠多肽相比不显著降低和/或改变至少所述多肽的免 疫性质。优选本发明多肽在X₁位包括G，A，V，L，P，F，M，W，C，N，Q，S，T，Y，D，E，K，R或者H。采用这种方式，至少所述多肽在哺乳动物细胞中的生成性质与原始小鼠或者嵌合多肽相比不会显著降低和/或改变。在一个特别优选的实施方案中 

X₁是G，A，V，L，P，F或者M； 

X₂是G，A，V，L，I，P，F或者M； 

X₃是G，A，V，L，I，P，F，M； 

X₄是G，A，V，L，I，P，F，M；和 

X₅是G，A，V，L，I，P，F，M，W，C，N，Q，S，T或者Y。 

这些多肽更适合于在哺乳动物细胞中高水平生成。尤其对于抗体来说。 

本发明还提供本发明的多肽，其中： 

X₁是G，A，V，L或者M； 

X₂是G，A，V，L，I或者M； 

X₃是G，A，V，L，I，P，F，M； 

X₄是G，A，V，L，I或者M；和 

X₅是P，F，W，N，Q，S，T或者Y。 

这些多肽更适合于高水平抗体生成，并且同时在人类中显示良好的耐受性质。本发明还提供式(I)所示的多肽，其中X₁是L；X₂是I；X₃是P；X₄是M；和/或X₅是S。这种多肽是特别优选的，因为其对于模拟抗体ch5D12的结合和药理性质的抗体来说具有优良的生成性质，而与小鼠或者ch5D12抗体相比，其在人类中的免疫性质被提高，且其中与小鼠或者嵌合对应物相比，至少所述多肽的生成没有显著降低。 

本发明还提供式(I)所示的多肽，其中X₁是I；X₂是V；X₃是P；X₄是M；和/或X₅是S。这种多肽是特别优选的，因为其对于模拟抗体ch5D12的结合和药理性质的抗体来说具有优良的生成性质，而与小鼠或者ch5D12抗体相比，其在人类中的免疫性质被提高，且其中与小鼠或者嵌合对应物相比，至少所述多肽的生成没有显著降低。 

在X₁-X₅位中的至少一个位置与嵌合5D12相应位置不同的抗体比嵌合5D12抗体在人类中具有更好的免疫性质。在这种抗体的优选实施方案中，本发明优选提供本发明的多肽，其中X₁是I和X₂是V；X₁是I和X₂是I；X₁是L和X₂是I；或者X₁是L和X₂是V。所述多肽尤其优选以下组合： X₃是P；X₄是M；和X₅是F或者S。在一个实施方案中，本发明提供本发明的多肽，其中：X₁是L；X₂是V；X₃是L；X₄是L和X₅是F。包括所述多肽的抗体的生成非常良好，并且与ch5D12相比其在人类中同时提供改良的免疫性质。本发明还提供包括氨基酸序列GFSX₁S RYSVY WX₂R的多肽，其中：X₁是L和X₂是I；或者X₁是I和X₂是V。该多肽包括5D12重链可变片段的修饰CDR1。与抗体5D12重链可变片段的CDR1相比，该CDR1包括至少一个不同的氨基酸。该氨基酸变化造成修饰的5D12或者ch5D12抗体的改良的免疫性质，其中所述修饰包括至少用本发明的一种多肽替换5D12或者ch5D12中所述多肽的相应序列，并且同时使所述抗体在哺乳动物细胞中有良好的生成。 

本发明还提供包括式(I)所示多肽的重链可变结构域。所述可变结构域优选包括90-130个、更优选100-120个、更优选105-115个、最优选113个氨基酸。可以通过合成或者通过细胞产生所述多肽。优选通过细胞产生所述重链可变结构域。实际上存在至少5种重链类型：γ、δ、α、μ和ε，其中每种类型限定一类免疫球蛋白。本发明的多肽可以直接用作结合体或者被整合入抗体。当被整合入抗体时，所述多肽优选与抗体重链的恒定部分组合。为此本发明还提供包括式(I)所示多肽的抗体重链。本领域已知可变结构域抗体的许多衍生物和类似物。但是，目前抗体的许多不同部分、衍生物和/或类似物正在使用。这类部分、衍生物和/或类似物的非限制性实例是单链Fv片段、单体(monobodies)、VHH、Fab片段、人工结合蛋白如avimers等等。这类特异性结合体的共同点是均存在重链可变结构域。因此本发明还提供包括式(I)所示多肽的结合体。 

本发明优选的结合体是抗体，因为抗体包括天然存在的结构。因此，在一个优选的实施方案中本发明提供包括本发明多肽的抗体。 

本发明的结合体优选是被动物良好耐受的结合体。动物对多肽的耐受性取决于许多不同方面。免疫性(T细胞介导、B细胞介导或者其他)是动物对多肽的耐受性包括的变量之一。如上所述，5D12抗体具有小鼠背景。式(I)所示的多肽在人类中具有降低的免疫原性。因此它有时被称为5D12重链可变结构域的去免疫(deimmunized)变体。因此一方面本发明提供包含5D12抗体的表位特异性的抗体，其中所述抗体的重链是式(I)所示的多肽。本文使用的“去免疫”被定义为在动物中较原始抗体更低的免疫原性。通过 去除已知的人T细胞表位，式(I)所示的多肽与5D12重链相比是去免疫的。T细胞表位是蛋白质内具有结合MHC II型分子能力的氨基酸序列。通过去除T细胞表位，抗体的免疫原性降低。优选本发明的可变结构域被进一步人源化，如镶嵌(veneered)。通过利用镶嵌技术，易与免疫系统接触的外部残基被选择性地用人类残基替换，以提供包含弱免疫原性或者基本上无免疫原性的镶嵌表面的杂种分子。本发明使用的动物优选哺乳动物，更优选灵长类动物，最优选人。 

本发明抗体优选包括人类抗体的恒定区。根据抗体重链恒定结构域的差异，抗体被分成5种类型或者同种型：IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。这些类型或者同种型包括至少一个以相应希腊字母命名的所述重链。在优选的实施方案中，本发明提供本发明的抗体，其中所述恒定区选自IgG、IgA、IgM、IgD和IgE恒定区，更优选所述恒定区包括IgG恒定区，更优选包括IgG₁恒定区，优选包括突变的IgG₁恒定区，最优选所述恒定区是IgG₄恒定区。此外，所述IgG₄恒定区优选是人IgG₄恒定区。优选本发明的IgG₄抗体包括如图18所示的重链和轻链氨基酸序列的恒定区。优选本发明的IgG₄抗体包括如图18所示的重链和轻链氨基酸序列。IgG₄恒定区的一些变化是天然存在的和/或只要不改变所获抗体的免疫性质就是被允许的。通常恒定区允许大约1-5个氨基酸的取代。具有IgG₄恒定区或者突变IgG₁恒定区的抗体具有抗体的至少大部分药理学性质，但不结合补体，因此在体内不会诱导其结合细胞的耗竭。优选所述恒定区是人类抗体的恒定区。 

在一个实施方案中，本发明提供编码本发明多肽和/或本发明结合体和/或本发明抗体的核酸。本发明使用的核酸通常但不唯一是核糖核酸(RNA)或者脱氧核糖核酸(DNA)。替代核酸也是本领域技术人员已知的，如肽核酸(PNA)。本发明的核酸例如包括在细胞中。当所述核酸在所述细胞中表达时，所述细胞产生本发明的多肽和/或结合体和/或抗体。因此，在一个实施方案中本发明提供包括本发明多肽、本发明结合体、本发明抗体和/或本发明核酸的细胞。所述细胞优选是动物细胞，更优选是哺乳动物细胞，更优选是灵长类动物细胞，最优选是人类细胞。对于本发明的目的，合适的细胞是能够包括并且优选产生本发明多肽、本发明结合体、本发明抗体和/或本发明核酸的任何细胞。 

本发明还提供包括本发明抗体的细胞。优选所述细胞产生所述抗体。 在一个优选的实施方案中，所述细胞是杂交瘤细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0细胞或者PER-C6^TM细胞。在一个特别优选的实施方案中，所述细胞是CHO细胞。本发明还提供包括本发明细胞的细胞培养物。各个机构和公司已经开发出用于大规模制备抗体如用于临床使用的细胞系。这类细胞系的非限制性实例是CHO细胞、NS0细胞或者PER.C6^TM细胞。这些细胞还可用于其他目的例如制备蛋白。被开发用于工业规模制备蛋白和抗体的细胞系在本文中还被称为工业化细胞系。因此在一个优选的实施方案中，本发明提供被开发用来大规模制备蛋白和/或抗体的细胞系在制备本发明抗体中的用途。 

本发明还提供制备抗体的方法，包括培养本发明细胞并从所述培养物中收集所述抗体。优选所述细胞在无血清培养基中培养。优选所述细胞适宜悬浮生长。此外还提供通过本发明制备抗体的方法获得的抗体。优选从培养物的培养基纯化所述抗体。优选亲和纯化所述抗体。 

本发明的细胞如杂交瘤细胞系、CHO细胞、NS0细胞或者其他已知适合于临床目的的抗体制备的细胞类型。在一个特别优选的实施方案中，所述细胞是人类细胞。优选通过腺病毒E1区或者其功能等价物转化细胞。这类细胞系的优选实例是PER.C6^TM细胞系或者其等价物。在一个特别优选的实施方案中，所述细胞是CHO细胞或者其变体。优选所述变体利用谷氨酰胺合成酶(GS)载体系统表达抗体。 

已经注意到所述X₁-X₅位的一些氨基酸不适合于在抗体生成细胞中产生高水平的包括式(I)所示多肽的抗体。在一个优选的实施方案中，所述抗体中式(I)所示多肽包括X₁-X₅，其中： 

X₁是G，A，V，L，I，P，F，M，W，C，N，Q，S，T，Y，D，E，K，R或者H。在一个特别优选的实施方案中，X₁是G，A，V，L，I，P，F或者M；X₂是G，A，V，L，I，P，F或者M；X₃是G，A，V，L，I，P，F，M；X₄是G，A，V，L，I，P，F，M；和X₅是G，A，V，L，I，P，F，M，W，C，N，Q，S，T或者Y。更优选所述抗体包括式I所示的多肽，其中X₁是G，A，V，L，I或者M；X₂是G，A，V，L，I或者M；X₃是G，A，V，L，I，P，F，M；X₄是G，A，V，L，I或者M；和X₅是P，F，W，N，Q，S，T或者Y。更优选X₁是L；X₂是I；X₃是P；X₄是M；和/或X₅是S。特别优选X₁是I和X₂是V；X₁是I和X₂是I；X₁是L和X₂是I；X₁是L和X₂是L；X₁是V和X₂是I；X₁是V和X₂是V；X₁是L和X₂是L；X₁是 V和X₂是L；或者X₁是L和X₂是V。后面的这些多肽特别优选组合X₃是P；X₄是M；和X₅是F或者S，优选S；在一个实施方案中本发明提供本发明的多肽，其中：X₁是L；X₂是V；X₃是L；X₄是L和X₅是F。包括所述多肽的抗体的生成非常良好，并且与ch5D12相比其在人类中同时提供改良的免疫性质。 

在另一个优选的实施方案中，本发明提供本发明的多肽，其中X₁、X₂、X₃、X₄或者X₅中至少一个与本发明所示序列相应位置的氨基酸相同以产生特别良好的表达水平，并且其中X₁、X₂、X₃、X₄或者X₅中还有至少一个与5D12氨基酸序列相应位置的氨基酸相同。本发明多肽(其中X₁、X₂、X₃、X₄或者X₅中至少一个与5D12氨基酸序列相应位置的氨基酸相同)的优点是，包括这种多肽的本发明结合体与本发明多肽(其中X₁、X₂、X₃、X₄或者X₅中没有一个与5D12氨基酸序列相应位置的氨基酸相同)相比具有的更好的表达水平。不受理论束缚，当X₁，X₂，X₃，X₄和/或X₅位的氨基酸与5D12氨基酸序列相应位置的氨基酸相同时，所述更好的表达水平被认为是由于所述氨基酸有助于本发明结合体的正确组装。 

包括式(I)所示多肽的抗体显示非刺激性拮抗活性。因为CD40L-CD40相互作用涉及多种炎性病症如自身免疫性疾病和移植排斥的病理生理学，因此本发明的多肽尤其适合于改善炎性病症的症状。在一个实施方案中，抗体包括本发明的结合体。在一个优选的实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。单克隆抗体技术允许制备大量基本上纯的抗体，从而获得可预测的产物。因此，在一个实施方案中本发明提供包括本发明多肽的拮抗性抗人CD40单克隆抗体。本发明的结合体均更适合于该目的，因为在一个实施方案中它相对于小鼠5D12和/或嵌合5D12是去免疫的。因此，与小鼠5D12和/或嵌合5D12相比，本发明的结合体在人类中具有降低的免疫原性和延长的半衰期。因此，本发明的结合体具有抗多种炎性病症的可持续药物潜力。因此，在一个优选的实施方案中，本发明提供本发明的去免疫的拮抗性抗人CD40单克隆抗体。 

如前所述，本发明提供包括相对于5D12氨基酸序列发生氨基酸改变的5D12样分子，其中所述改变至少在重链可变结构域并且优选还在轻链可变结构域。在这个方面本发明还提供包括式(II)所示氨基酸序列的本发明结合体 

1              11           21          31 

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X₆LGX₇X₈ ASISC RSSQS LX₉NSN GNTYL HWYLQ RPGQS 

41          51          61          71 

|           |           |           | 

PRLLI YKVSN RFSGV PDRFS GSGSG TDFTL KISRV EAEDX₁₀

81            91 

|             | 

GVYX₁₁C SQSTH VPWT 

其中： 

X₆是G，A，V，L，I，P，F，M，W，C，N，Q，S，T，Y，D，E，K，R或者H； 

X₇是G，A，V，L，I，P，F，M，W，C，N，Q，S，T，Y，D，E，K，R或者H； 

X₈是G，A，V，L，I，P，F，M，W，C，N，Q，S，T，Y，D，E，K，R或者H； 

X₉是G，A，V，L，I，P，F，M，W，C，N，Q，S，T，Y，D，E，K，R或者H； 

X₁₀是G，A，V，L，I，P，F，M，W，C，N，Q，S，T，Y，D，E，K，R或者H；和 

X₁₁是G，A，V，L，I，P，F，M，W，C，N，Q，S，T，Y，D，E，K，R或者H。 

所述结合体优选是本发明的拈抗性抗人CD40单克隆抗体。在一个优选的实施方案中，选自X₆，X₇，X₈，X₉，X₁₀或者X₁₁的X是选自类似在5D12氨基酸序列相应位置的氨基酸和/或类似如本发明实施例2所示获得良好表达水平的序列的相应位置的氨基酸。因此，本发明的结合体优选包括式(II)所示的氨基酸序列，其中： 

X₆是N，Q，S，T，Y，W或者C； 

X₇是D，E，N，Q，S，T，Y，W或者C； 

X₈是N，Q，S，T，Y，G，A，V，L，I，P，F，M，W或者C； 

X₉是G，A，V，L，I，P，F，M； 

X₁₀是G，A，V，L，I，P，F，M；和 

X₁₁是N，Q，S，T，Y，G，A，V，L，I，P，F，M，W或者C。 

在另一个实施方案中，本发明提供本发明的拮抗性抗人CD40单克隆抗体，所述抗体包括式(II)所示的包括下列氨基酸序列的多肽。 

1           11             21           31 

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ELQLT QSPLS LPVX₆L GX₇X₈AS ISCRS SQSLX₉ NSNGN TYLHW 

41          51          61          71 

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YLQRP GQSPR LLIYK VSNRF SGVPD RFSGS GSGTD FTLKI 

81           91           101         111 

|            |             |           | 

SRVEA EDX₁₀GV YX₁₁CSQ STHVP WTFGG GTKLE IKR。 

在一个优选的实施方案中，本发明提供一种本发明式(II)所示的多肽，其中X₆是T或者S，X₇是D或者Q，X₈是Q或者P，X₉是V或者A，X₁₀是V或者L，以及X₁₁是F或者Y。更优选的，其中X₆是T，X₇是Q，X₈是P，X₉是A，X₁₀是V和X₁₁是Y。包括式(I)所示多肽以及优选的式(II)所示多肽的5D12样抗体结合了在产生细胞中的良好表达水平和在人类中的良好耐受性和药物动力学性质。 

本发明的抗人CD40拮抗性抗体优选包括式(I)所示的重链可变结构域氨基酸序列和式(II)所示的轻链可变结构域氨基酸序列。这类抗体具有良好的特性。当然可以通过修饰其中一或多个氨基酸产生这类原始抗体的变体。当与所述原始抗体比较时，许多这类变体将表现或多或少的相似性。这类变体也包括在本发明的范围内。存在很多修饰本发明抗体的方式。这类修饰的一个非限制性实例是包括用焦谷氨酸而非谷氨酸的抗体。这种修饰的其他非限制性实例是与所述原始抗体相比，一或多个氨基酸的插入、缺失、倒位和/或取代。本发明提供产生这类变体的手段和方法。本发明还提供确定所述变体特性的试验。在一个优选的实施方案中，本发明提供本发明原始抗体的变体，与所述原始抗体的氨基酸序列相比，所述变体包括大约1-10个氨基酸的插入、缺失、倒位和/或取代。优选所述插入、缺失、倒位和/或取代不包括原始抗体的式(I)所示重链可变结构域的X₁位和X₂位的氨基酸。 

在一个优选的实施方案中，本发明提供一种选择抗人CD40拮抗性抗 体的方法，包括产生生成原始抗人CD40拈抗性抗体的第一细胞系，并确定所述第一细胞系生成的原始抗体的量，所述原始抗体包括重链可变结构域氨基酸序列 

1           11          21           31 

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QVKLQ ESGPGLVKPS ETLSITCTVS GFSX₁S RYSVY WX₂RQP 

41         51           61         71 

|          |            |           | 

PGKGP EWMGM MWGGG STDYS TSLKS RLTIS KDTSK 

     81        91           101         111 

      |         |            |          | 

SQVSL KMNSLRTDDTAMYYC VRTDG DYWGQ GTTVT VSS 

其中X₁和X₂配对选自X₁＝I和X₂＝V；X₁＝L和X₂＝I；X₁＝V和X₂＝V；X₁＝L和X₂＝L；或者X₁＝L和X₂＝V， 

所述方法还包括 

产生至少一种生成所述原始抗体的变体的其他细胞系，其中所述变体抗体是修饰的原始抗体，与所述原始抗体相比，其包括大约1-5个氨基酸的插入、缺失、倒位和/或取代，其中所述修饰不包括X₁和X₂位氨基酸的修饰，和确定所述至少一种其他细胞系生成的变体抗体的量， 

所述方法还包括选择生成量是原始抗体量至少50％的变体抗体。优选所述原始抗体包括轻链氨基酸序列 

1           11             21           31 

|           |              |            | 

ELQLT QSPLSLPV T L G QPAS ISCRS SQSL ANSNGN TYLHW 

41          51          61          71 

|           |           |           | 

YLQRP GQSPR LLIYK VSNRF SGVPD RFSGS GSGTD FTLKI 

81            91           101         111 

|             |             |           | 

SRVEA ED V GV Y Y CSQ STHVP WTFGG GTKLE IKR。 

所述大约1-5个氨基酸的插入、缺失、倒位和/或取代可以位于非X₁和X₂位或者与其无关的抗体任何部分。优选地，与所述原始抗体相应链的氨基酸序列相比，所述大约1-5个氨基酸的插入、缺失、倒位和/或取代位于所述重链氨基酸序列或者所述轻链氨基酸序列。优选地，与所述原始抗体的所述重链序列相比，所述大约1-5个氨基酸的插入、缺失、倒位和/或取代位于所述重链氨基酸序列。 

优选所述方法还包括制备产生所述选择抗体的抗体生产细胞系。该生产细胞系可以是所述其他细胞系，或者产生所述选择抗体的另一细胞系。优选所述方法还包括收集所述选择抗体。本发明还提供通过本发明方法获得的分离和/或重组抗人CD40拈抗性抗体。在一个优选的实施方案中，所述抗人CD40拮抗性抗体包括重链氨基酸序列的修饰 

1           11          21            31 

|           |           |             | 

QVKLQ ESGPG LVKPSETLSITCTVS GFSX₁S RYSVYWX₂RQP 

41          51           61         71 

|           |            |          | 

PGKGP EWMGM MWGGG STDYS TSLKS RLTIS KDTSK 

      81         91          101          111 

      |           |           |            | 

SQVSL KMNSL RTDDT AMYYC VRTDG DYWGQ GTTVT VSS 

其中X₁和X₂配对选自X₁＝I和X₂＝V；X₁＝L和X₂＝I；X₁＝V和X₂＝V；X₁＝L和X₂＝L；或者X₁＝L和X₂＝V， 

与所述重链氨基酸序列相比，所述修饰包括大约1-5个氨基酸的插入、缺失、倒位和/或取代，并且其中所述修饰不包括X₁和X₂位氨基酸的修饰。 

在一个实施方案中，本发明提供包括本发明多肽、本发明结合体、本 发明抗体、本发明核酸和/或本发明细胞的药物组合物。此外，本发明还提供本发明多肽、本发明结合体、本发明抗体、本发明核酸和/或本发明细胞作为药物的用途。优选用于改善自身免疫性疾病和/或炎性病症的症状和/或减轻移植排斥和/或治疗CD40阳性癌症的药物。在一个优选的实施方案中，所述自身免疫性疾病和/或炎性病症选自炎症性肠病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化、牛皮癣、大疱性类天疱疮和特应性皮炎。 

因为本发明多肽的非刺激性CD40拈抗性，所以本发明多肽尤其适合于改善炎性病症的症状，本发明多肽适合于改善数种病症的症状。本发明使用的炎性病症被定义为涉及炎性成分的任何疾病。对于本发明来说，炎性病症特别包括自身免疫性疾病和/或移植排斥。CD40-CD40L相互作用在免疫应答起始、放大和延长中的重要作用使本发明多肽特别适合于自身免疫性疾病的免疫调节。 

下文提供的关于CD40和CD40L的信息是为了说明CD40及其配体在炎性病症中的作用。CD40分子是50kDa的I型膜糖蛋白，在B细胞、单核细胞/巨噬细胞和树突细胞(DC)上表达^45-50。此外，病理条件下可以在内皮细胞(EC)、成纤维细胞、上皮细胞和角质形成细胞上发现CD40⁵¹。CD40配体(gp39、TBAM、TRAP、CD40L、CD154)是32kDa的II型膜内在糖蛋白，在活化的CD4⁺T细胞和小部分活化的CD8⁺T细胞上短暂表达^52，53。此外，在活化后的许多其他细胞类型中也发现了CD40L，包括肥大细胞、嗜碱性粒细胞、B细胞、嗜酸性粒细胞、DC和血小板^54，55。 

CD40被CD40L结合在B细胞中引发许多生物学事件，包括增殖，活化标记的表达，免疫球蛋白(Ig)产生，同种型转换，同型粘附和避免凋亡^56，57。但是，如上所述，CD40分子的分布不像预先设想的那样局限于B细胞。新分离的人单核细胞表达低水平的CD40分子，在IFN-γ存在的条件下培养，其可被上调^47-49，58。CD40与单核细胞/巨噬细胞的结合诱导大量促炎介导物如IL-1、TNF-α和IL-12的分泌，这诱导炎性应答和杀肿瘤活性^47-49，58，并使它们避免凋亡⁴⁸。CD40结合还造成DC增强它们的分化和活化，增强共刺激分子如CD86、CD80和CD58的表达，增加细胞因子生成，并抑制凋亡^50，59。此外，当在炎性条件下表达时，CD40信号转导能够诱导EC上细胞间粘附分子1(ICAM-1)、血管细胞粘附分子1(VCAM-1)和E-选择蛋白的表达⁵⁵。这些结果表明T细胞-EC相互作用期间通过CD40的信号转导 可能是调节EC活化和白细胞募集到非淋巴组织的重要步骤。体内研究已经表明CD40-CD40L相互作用在产生体液免疫应答^60，61，抗原特异性T细胞的引发和活化⁶²，巨噬细胞的短暂活化⁶³，以及保护性细胞介导的免疫应答(通过T细胞介导的抗胞内寄生虫感染如肺囊虫(Pneumocystis)、隐孢子虫属(Cryptosporidium)和利什曼原虫属(Leishmania)的巨噬细胞活化)^64-66中的重要性。 

在小鼠自身免疫性疾病模型中证明了CD40及其配体的特异性作用。动物模型研究清楚显示CD40L-CD40相互作用参与多种自身免疫性疾病的病理生理学。在这些研究中，利用患有自发性或者实验性自身免疫性疾病的小鼠，干扰CD40L-CD40相互作用具有明显的有益作用。针对小鼠CD40L的Mab显示预防或者减轻(SWR x NZB)F1狼疮小鼠和非肥胖糖尿病(NOD)小鼠(自发患有T细胞依赖性自身免疫性糖尿病)中胶原诱导的关节炎、实验性变应性脑脊髓炎(EAE；MS的动物模型)的病征。证据表明CD40-CD40L相互作用还在炎症性肠病(包括克罗恩病和溃疡性结肠炎)的发病机理中起作用。具有高转基因拷贝数的CD40L转基因小鼠显示患有致死性炎症性肠病，其特征在于CD40⁺细胞和CD40L⁺T细胞浸润患病组织⁶⁷。在用2，4，6-三硝基苯磺酸诱导的患有结肠炎的动物中，抗CD40L Mab有效地预防粘膜炎症和固有层CD4⁺T细胞产生IFN-γ⁴⁴。最近在SCID小鼠实验性炎症性肠病模型中进行了抗TNF-α治疗和利用抗CD40L Mab干扰CD40-CD40L途径的直接比较。在该模型中，将同基因CD45RB^high CD4⁺细胞注射入SCID小鼠，所述小鼠随后患上腹泻或者软便并在T细胞重建后的开始3-5周显示进行性体重减轻，这是实验性炎症性肠病的症状。在T细胞重建当天利用抗TNF-α或者抗CD40L治疗完全阻止了实验性炎症性肠病的临床和组织学表现。此外，在T细胞重建后5周的抗CD40L施用仍然可以阻止疾病的进展，与对照动物相比，被治疗的动物显示疾病征状和组织学的改善(未出版观察)。 

最近的研究还证明干扰CD40-CD40L途径在移植模型中是强烈免疫抑制的。利用同种异体小淋巴细胞或者T细胞耗尽的小淋巴细胞加上小鼠CD40L抗体的联合治疗使40例受体中的37例无限(indefinite)胰岛同种异体移植存活，所述受体在主要和次要组织相容性基因座不同⁶⁸。由这些实验可以总结得出CD40L-CD40相互作用的有效干扰很可能通过同种异体反应 性宿主T细胞阻止对静止的小淋巴细胞的共刺激分子的诱导。在近来的另一项研究中，证明在首次用于实验的宿主和致敏宿主中，移植时施用小鼠CD40L的Mab均显著延长完全不同的小鼠心脏同种异体移植物的存活。但是，当抗CD40L治疗被推迟到术后第5天时，抗CD40L未能延长移植物存活。从该研究可以总结得出抗CD40L治疗主要通过干扰T细胞的辅助效应功能来抑制同种异体移植排斥。还显示同时干扰CD80/CD86-CD28和CD40-CD40L途径有效阻止T细胞克隆的体外和体内扩增，促进完全同种异体皮肤移植物的长期存活，和抑制原发血管化心脏同种异体移植物的慢性血管排斥的发展。此外，干扰CD40-CD40L途径，任选与干扰CD80/CD86-CD28途径联用，在恒河猴肾同种异体移植模型中防止肾同种异体移植排斥^69，70。要进一步了解5D12对炎性病症效果的信息，可以参见参考文献^71-81。 

多发性硬化是中枢(脑脊)神经系统的自身免疫性疾病。在该病症中，神经纤维周围的白质发生硬化。术语多发性硬化(MS)字面意思是“许多疤痕”。神经组织的硬化区域被称为斑(plaques)。多发性硬化的症状、严重性和病程是高度可变的，这部分取决于斑的部位和白质恶化(deterioration)程度。神经系统的白质恶化减缓神经冲动，导致神经系统失调。 

常见狨猴(Callithrix jacchus)的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)是多发性硬化的有效临床前模型(综述参见^{86，87，102，104})。在该EAE模型的多种类型中发生的中枢神经系统(CNS)白质损伤都具有MS的病理形态、放射性和免疫学特征^{95，98，101}。因此，狨猴EAE模型可以连接人类和啮齿类动物的较宽免疫差异，所述差异阻碍了在临床前期的药物开发渠道中选择有希望的疗法^{96，99，103}。 

用rhMOG(表示人MOG胞外片段(氨基酸1-125)的重组蛋白)免疫的狨猴100％患上EAE，这归因于每只猴的全部组成成分(repertoire)中单形MHCII型易感元件Caja-DRB*W1201的存在^{82，84，85，107}。该模型在治疗开发中特别有用的方面在于脑白质中发生的损伤是可见的并且可以用临床相关磁共振成像技术试验性表征^92，105。利用磁共振成像(MRI)对脑白质损伤的纵向分析显示大部分损伤中的体积渐进增加和持久炎症性活性。此外，利用MRI和先前描述的组织学标准¹⁰¹对CNS病理的表征显示大部分损伤处于早期活件阶段¹⁰⁶。 

已经使用rhMOG诱导的EAE模型来检测针对抗原递呈细胞(APC)和T细胞的共刺激分子的抗体是否是MS的有效疗法。CD40与其配体CD154的相互作用在EAE中进行的多种免疫病理过程中扮演着重要角色，所述过程包括B细胞活化、抗原递呈细胞(APC)活化、抗原特异性T细胞应答的启动和巨噬细胞效应功能的诱导^{90，93，97，7}。1996年进行的一项研究证实用抗CD154的抗体治疗小鼠可以预防EAE⁸⁸。但是，由于意料之外的副作用，MS患者的抗CD154抗体临床试验被终止¹⁷，所述副作用在动物试验中没有被观察到。 

已经制备了抗人CD40的小鼠单克隆抗体(Mab)5D12(mu5D12)。5D12抗体是CD40-CD40L介导的数种细胞类型活化的有效抑制剂，与其他大部分抗CD40Mab不同，5D12抗体不产生CD40刺激活性^21，22，39。在狨猴EAE模型中，小鼠抗人CD40抗体mu5D12和该抗体的嵌合形式ch5D12均显示对CNS白质损伤进展和神经学缺陷的强抑制作用，并且没有显著的副作用 ^23，24。同一研究显示向患EAE的普通狨猴静脉内注射的抗CD40Mab能够进入脑白质损伤，其中CD40分子主要在浸润的巨噬细胞和活化的小胶质细胞上表达⁹⁵，如同早先在MS中发现的一样⁸⁸。这就提出了问题，即ch5D12是否对已有损伤具有治疗作用。 

‘t Hart等通过间隔2周的系列磁共振成像(MRI)监测了7只rhMOG免疫猴的脑损伤进展⁷⁶。该研究的结果证明所有3只ch5D12治疗猴中损伤性炎症的抑制，而3只ch5D12治疗猴中的2只损伤性肿大减轻。 

在病程早期预防CD40与其在活化T细胞上的配体CD154结合对啮齿类动物^{88，89，91，94，100}和非人灵长类动物模型^23，24中EAE的临床和神经病理表达具有重要影响。CD40主要在MS患者以及患EAE的啮齿类动物⁸⁸和非人灵长类动物⁹⁵的CNS白质损伤内表达。在骨髓嵌合小鼠中已经清楚显示CNS内载有CD40的APC(如浸润的巨噬细胞以及血管周围和实质神经胶质细胞)对EAE的发病机理非常重要⁸³。 

‘t Hart等、Laman等和Boon等的结果^76，79，81显示CD40的抗体阻断是MS的潜在有效治疗方法。重要地是，ch5D12Mab在狨猴EAE模型或者其他灵长类物种中均没有明显的副作用⁸⁰。在狨猴两种EAE模型(即用人髓磷脂⁷⁹或者rhMOG⁸¹诱导)的安慰剂对照实验中证明了抗CD40抗体的有益临床效果。此外，‘t Hart等已经证明了抗CD40抗体治疗对已有损伤的抑制 效果⁷⁶。 

牛皮癣是折磨人口总数1-2％的炎症性皮肤病。在该疾病中，损伤处的T细胞和角质形成细胞被活化并表达活化标记物和共刺激分子。认为角质形成细胞和T细胞上表达的一些共刺激分子彼此相互作用，并且这类相互作用促进疾病活性^108-110。这样一组分子可以是CD40(其在活化的角质形成细胞上表达)和CD154(CD40配体)(其在活化的CD4⁺T细胞上短暂表达)。T细胞和角质形成细胞之间的CD40-CD154结合可以从这些细胞释放炎性介质，所述炎性介质在牛皮癣损伤中丰度较高。CD40、CD154和CD40-CD154的相互作用最近被综述¹¹¹。 

培养的角质形成细胞也表达CD40；IFN处理增强该表达。IFN-γ处理的角质形成细胞(在本文自始至终被称为CD40++角质形成细胞)上高表达的CD40与CD154的结合造成ICAM的上调和细胞因子生成增加^112-114。 

到目前为止，只有一例涉及该结合在牛皮癣发病机理中的报道¹¹³。在后续研究中没有鉴定牛皮癣损伤中表达CD40的细胞类型，也没有描述其发生和损伤状况。也没有研究牛皮癣损伤中CD154⁺T细胞的存在。因此，仍然不清楚CD154是否作为角质形成细胞产生在牛皮癣损伤中发现丰度较高¹¹⁵的趋化因子和补体的信号。 

通过10例牛皮癣患者损伤和非损伤皮肤的免疫组织化学，最近Pasch等证明了CD40⁺和CD154⁺细胞的存在和位置¹¹⁶。在角质形成细胞簇中观察到CD40的阳性增加，并且在正常、非损伤和损伤表皮的几乎所有CD1a⁺郎格罕氏细胞中均显示CD40的高表达。此外，CD40的高表达存在于牛皮癣损伤中几乎所有的CD83⁺细胞；而在非损伤和正常皮肤中很难观察到它们¹¹⁶。此外，在大部分患者中，只有CD40⁺细胞邻位的小部分T细胞显示CD154表达。这些结果使以下可能性增大，即CD154⁺T细胞可以与CD40⁺角质形成细胞、郎格罕氏细胞和CD83⁺树突细胞结合，并且在损伤处从它们释放介质。此外，他们还证明了CD40结合诱导趋化因子(IL-8、RANTES和MCP-1)的释放¹¹⁶。在同一出版物中，Pasch等显示拮抗性抗CD40抗体5D12抑制趋化因子IL-8、MCP-1与CD40有关的释放，而RANTES释放受抑制的程度较低¹¹⁶。这些数据表明拮抗性抗CD40mAb 5D12至少可以部分影响牛皮癣损伤中观察到的炎症。 

US2003/0165499公开了SCID小鼠异种移植模型系统中5D12和其他 拮抗性抗CD40抗体可测量的抗牛皮癣作用，所述模型系统被用作牛皮癣治疗的模型，证明拮抗性抗CD40抗体可用于治疗牛皮癣。在该体内系统中证明了5D12的治疗作用。 

在一个特别优选的实施方案中，所述自身免疫疾病和/或炎性病症包括炎症性肠病。在另一个优选的实施方案中，提供本发明的用途，其中所述炎症性肠病包括溃疡性结肠炎(UC)或者克罗恩病(CD)。 

如上所述，本发明的多肽适合于治疗多种炎性病症，包括自身免疫性疾病和移植排斥。因此，在一个实施方案中本发明提供改善自身免疫性疾病和/或炎性病症的症状和/或减轻移植排斥的方法。在另一个实施方案中，本发明提供本发明多肽、本发明结合体、本发明抗体、本发明核酸和/或本发明细胞在制备用于改善自身免疫性疾病和/或炎性病症的症状和/或减轻移植排斥的药物中的用途。本发明使用的改善症状被定义为至少部分地改善疾病的至少一种症状。本发明尤其关注于目前还没有有效疗法的自身免疫性和/或炎性病症。这类病症的实例是类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化、牛皮癣、炎症性肠病、大疱性类天疱疮和特应性皮炎。本发明的多肽(任选包含在本发明的结合体或者细胞中，和/或由本发明的核酸编码)特别适合于改善自身免疫性疾病和/或炎性病症的症状，因为本发明多肽的限定性质允许以特异方式干扰CD40-CD40L途径。此外，因为本发明的结合体优选是去免疫的，所以本发明的结合体可以存在较长时间，因此可以在相当长的时间内在患者中显示其拮抗活性。因此，在一个实施方案中本发明提供本发明多肽、本发明结合体、本发明抗体、本发明核酸和/或本发明细胞在制备改善自身免疫性疾病和/或炎性病症的症状和/或减轻移植排斥的药物中的用途，其中所述自身免疫性疾病和/或所述炎性病症选自类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化、牛皮癣、炎症性肠病、大疱性类天疱疮和特应性皮炎。 

附图简述 

图1.如符号指示的4个剂量水平在第0天单次施用后的ch5D12血清浓度。数值表示为μg ch5D12/mL血清，这是按照参考文献²⁷的描述通过酶联免疫吸附分析测定的。 

图2.ch5D12输注后28天期间克罗恩病活性指数(Crohn′s Disease Activity Index，CDAI)评分的变化。阴影区域指示ch5D12水平超过10μg/mL浓度(参见图1)的时间段，在灵长类动物中发现所述10μg/mL浓度是功能性拮抗血清水平^24-27。在0.3mg/kg的群组中，血清水平从没有超过10μg/mL水平。 

图3.第0天和第28天的组织学疾病活性评分。最大活性评分是16，根据参考文献40进行活性评分。在第0天和第28天获得9例受试者回肠的样品(菱形)和11例受试者结肠的样品(正方形)，结果表示为每剂量水平的ch5D12[(a)0.3mg/kg；(b)，1.0mg/kg；(c)，3.0mg/kg和(d)，10.0mg/kg]。 

图4.患者012(3.0mg/kg)的结肠活检和患者011(3.0mg/kg)的回肠活检作为实例显示炎性应答的降低。在施用ch5D12前(a，c)和施用ch5D12后第28天(b，d)，利用识别所有T淋巴细胞(CD3)、B细胞(CD19)、巨噬细胞(CD68)和CD40(+)细胞的抗体对样品染色。HE，苏木精-曙红。 

图5.小鼠5D12VH和VL区的共有DNA和推导的氨基酸序列。 

图6.小鼠V区与镶嵌的和去免疫的5D12V区的氨基酸比较。 

图7.去免疫5D12VH的12个被检测氨基酸变体(Q5E，K13A，E16Q，T17S，I29L，I37V，P45L，M48L，STS60NSA，T68S，S79F和T108S)与亲代小鼠序列(ch5D12)和完全去免疫序列(DI5D12)的比对。 

图8.利用JY细胞的FACS分析。48小时后收集瞬时表达5D12变体(Q5E，K13A，E16Q，T17S，I29L，I37V，P45L，M48L，STS60NSA，T68S，S79F和T108S)的PER.C6细胞上清。作为对照还收集转染ch5D12或者DI5D12转染的细胞的上清以及模拟(无质粒)转染细胞的上清。利用JY细胞以及抗人FITC标记的二抗(1/100稀释)通过FACS检测表达抗体的结合。作为FACS对照，JY细胞只与FITC标记的二抗保温。 

图9.在去免疫5D12VH的29和37位的其他V-L-I变体(29I-37V，29V-37I，29I-37L，29V-37V，29L-37L，29V-37L，29L-37V)与亲代嵌合序列(ch5D12)、完全去免疫序列(DI5D12；29I-37I)和PG102(29L-37I)的比对。 

图10.生成PG102抗体的GS-CHO细胞系和“生长过度”24孔平板培养物的抗体生成分布。细胞系的数目绘于X轴，抗体浓度范围绘于Y轴(抗体浓度范围按照升序分布，起始于0-25μg/ml)。 

图11.CDACFA补料分批摇瓶培养中细胞系A)L107(DC1；上图)， B)L25(DC2；中间图)和C)M95(DC3，下图)的生长和抗体积聚谱。 

图12.10μg/mL的PG102(红色)和ch5D12(PG100)(蓝色)与3个不同水平的固定CD40结合的比较。 

图13.通过抗独特型mAb 173-36-1抑制CD40mAb与表达人CD40的JY细胞的结合。在1μg/ml的浓度分析抗CD40mAb。数据是每种抗体4次单独测定的平均值±平均值的标准误。 

图14.CD40-Fc ELISA。ch5D12(PG100)和PG102与人CD40-Fc浓度相关结合。板用250ng/ml人CD40-Fc包被过夜。同种型对照mAb，chFUN-1针对人CD86。数据表示为平均值±平均值的标准误(所有n＝3)。 

图15.抗CD40mAb与JY细胞结合的FACS定量。ch5D12(PG100)和PG102显示类似的半最大结合浓度(half-maximal binding concentration)。在这些实验中抗CD86mAb，chFUN-1也显示结合JY细胞，这是由于人CD86被该细胞系表面表达。数据是每种抗体两次测定的平均值。 

图16.通过未标记的ch5D12(PG100)和PG102抗体抑制ch5D12(PG100)-PE和PG102-PE与JY细胞的结合。在浓度增加的竞争性未标记抗体存在的条件下，保温1μg/ml标记的ch5D12(PG100)(A)和PG102(B)。通过流式细胞术测定用平均荧光强度(MFI)表示的标记抗体结合。ch5D12(PG100)PE和PG102PE结合的最大MFI分别是369荧光单位(A)和305荧光单位(B)。数据是4次单独实验的平均值±平均值标准误。 

图17.与Jurkat细胞共培养后抑制THP-1细胞的IL-8释放。在浓度增加的ch5D12(PG100)或者PG102存在条件下，用IFNγ刺激的THP-1细胞与Jurkat细胞共培养。通过ELISA测定THP-1细胞释放的IL-8，所述释放利用通过CD40-CD40L的Jurkat细胞与THP-1细胞的结合来诱导。数据是单次实验的结果。 

图18.IgG₄PG102重链和轻链的核酸和氨基酸序列。 

实施例

实施例1 

材料和方法 

选择临床上被诊断为克罗恩病(通过放射性、内窥镜或者组织学证据确诊)并且克罗恩病活性指数(CDAI)评分至少为220但不超过450(在施用研究 药物前7天评分)的18例成年受试者(18-60岁)进行研究。在所述研究前或者期间受试者可以接受下列治疗：美沙拉秦(mesalamine)治疗8周或者更长，其剂量在筛查前4周是稳定的；每天最多30mg皮质类固醇(或者每天9mg布地奈德(budesonide))，共8周或者更长，其剂量在筛查前2周是稳定的；巯基嘌呤或者硫唑嘌呤4个月或者更长，其剂量在筛查前8周是稳定的。受试者在筛查前3个月内不能接受环孢菌素A或者氨甲蝶呤治疗，也不允许在之前接受过Mab治疗。所有登记受试者的平均年龄是35.8岁，其中7例是男性，11例是女性。全部受试者都是白种人。在包括的不同群组的患者之间没有观察到明显的差异(表1)，除了在较低剂量的3个组中大部分受试者是女性，而最高剂量组(10.0mg/kg)只包括男性受试者。就基线心电图(ECG)、生命体征、身体检查、克罗恩病体征和症状历史以及基线实验室值来说，4个群组之间不存在显著差异。4个剂量群组中关于基线特征也不存在显著差异。但是最高剂量群组还显示基线的最高CDAI评分。该研究得到下列单位的医学伦理委员会的批准：University Hospitals Leuven，Belgium，Leiden University Medical Center，The Netherlands，MedizinischeKlinik，Kiel，Germany，和Hadassah Medical Center，Jerusalem，Israel。所有患者都签署了该研究的知情同意书。 

研究设计和治疗方案 

ch5D12是分子工程化的人IgG₄抗体，其包含Mab 5D12亲代形式的重链和轻链的可变结构域。已经证明该Mab结合载有CD40的细胞并拮抗CD40介导的多种细胞的活化^20-27。在一个开标、单剂量、多中心试验中施用ch5D12，研究4个剂量水平。除了最后一个剂量群组(其中只登记了3例受试者)外，每个治疗组有5例受试者。在静脉内完成剂量水平为0.3、1.0、3.0和10.0mg/kg ch5D12的单次施用。在完成一个剂量组的招募后，只有当确定现有剂量水平的安全性时才开始下一组的招募。前28天在每周一次的就诊时评定临床疾病活性，然后是第56天的最后一次就诊。2例(3.0mg/kg剂量群组)在第28天评定后退出本研究，但评估时仍包括他们的数据。在研究过程中，受试者稳定地采用他们当前用药的相同剂量。在研究期间不使用没有得到许可的伴随用药。对ch5D12治疗的应答被定义为CDAI的降低≥100点，临床疾病缓解被定义为CDAI≤150(总分)并且CDAI 降低至少100。对第28天筛查时接受内窥镜检查的所有受试者(n＝11)分析他们的克罗恩病内窥镜严重性指数(Crohn’s Disease Endoscopic Index ofSeverity，CDEIS)评分指数的降低。在施用ch5D12前以及施用ch5D12后第28天，从这11例患者采集活检用于组织病理学和免疫组织化学。安全性评价包括身体检查、生命体征、ECG和实验数据(化学、血液学和尿检)，所述实验数据包括抗dsDNA、pANCA和人抗嵌合抗体(HACA)评价。如参考文献(27)所述通过酶联免疫吸附分析(ELISA)测定HACA。 

药代动力学 

按照先前的描述²⁷通过ELISA测定ch5D12的血清浓度。为了测定注射的ch5D12对CD40的包被，将血液收集到肝素管，并用PBS两倍稀释。通过梯度离心(Lymphoprep，Nycomed，Roskilde，Denmark)分离外周血单核细胞(PBMC)，500000个细胞用FITC标记的ch5D12和PerCP标记的抗CD20(Becton-Dickinson，Mountain View，CA，USA)染色，并在冰上保温30分钟。作为5D12-FITC结合的背景对照，单独管的PBMC只用PerCP标记的抗CD20抗体染色。洗涤掉未结合的抗体，然后利用流式细胞仪(FACSort；Becton-Dickinson)分析细胞。通过门控(gating)和获取(acquiring)表达CD20的细胞总共5000个事件(events)来进行事件的获取。如果对于样品组来说表达CD20的细胞的数目较低，在未染色和染色制品中小心获取相同数目的事件。 

组织学和免疫组织化学 

在治疗前第0天和第28天的回肠结肠镜检查期间利用标准镊获得的回肠和结肠粘膜活检固定于6％福尔马林中用于常规分析。其他样品立刻在液氮冷却异戊烷中速冻于Tissue-Tek最佳切割温度化合物(Miles LaboratoriesInc，Naperville，IL，USA)。样品在-80℃保存直至进一步使用。福尔马林固定的样品经过常规石蜡处理。制备5微米厚的切片，并用苏木精和曙红染色。利用Leitz Wetzlar显微镜(Wetzler，Germany)分析所述切片。每种样品分析总共4个半连续切片。所述冷冻样品用于免疫组织化学分析，该分析利用一组Mab分析淋巴细胞和单核细胞/巨噬细胞不同亚群的存在。所述组利用针对CD40和CD40L的Mab来实现。免疫组织化学染色在恒冷箱切片上进行，室温下干燥过夜，并在纯丙酮中固定10分钟。再水化的载玻片与下列 Mab保温30分钟：CD3(克隆：UCHT1，1/10稀释)(Dako，Glostrup，Denmark)，CD4(克隆：MT310，1/10稀释)(Dako)，CD8(克隆：144B，1/20稀释)(Dako)，CD19(克隆：HD37，1/30稀释)(Dako)，CD40(克隆：5D12，1/100稀释)(PanGenetics，Amsterdam，The Netherlands)，CD68(克隆：Kp1，1/50稀释)(Dako)，CD154(克隆：M90，1/10稀释)(Serotec，Oxford，UK)。二抗Mab是生物素标记的抗小鼠免疫球蛋白(1/400稀释；Dako)，作用30分钟。为了有效地封闭内源性过氧化物酶，切片还在包含0.3％(v/v)H₂O₂的甲醇溶液中保温20分钟。在用PBS洗涤3次后，添加抗生物素蛋白/生物素过氧化物酶标记的复合物(Dako)。在几次保温之间，所述切片用pH 7的磷酸盐缓冲液洗涤15分钟。在包含0.05％3-氨基-9-乙基-咔唑(Janssen，Beerse，Belgium)和0.01％H₂O₂的0.05m乙酸盐缓冲液(pH 4.9)中将切片保温10分钟使反应产物显色，产生亮红色的免疫反应性部位。然后，所述载玻片用Harris苏木精进行弱复染色，用蒸馏水洗涤，并用甘油封片。阴性对照包括，不含一抗或者二抗，只使用色原体，使用无关的同种型匹配小鼠IgG(波形蛋白；Dako)。 

用苏木精和曙红染色的石蜡切片均由相同的病理学家(K.G.)进行分析，所述病理学家对样品来源是不清楚的。利用组织学数字评分⁴⁰评估疾病活性，其中最大活性是16。同样以不知情方式(blinded fashion)分析免疫组织化学染色的切片。对于15组切片，在高倍视野(放大率×40)下计算阳性染色细胞。根据基质细胞的最高密度选择所述视野。数目可以表示为基质中单核细胞总数的百分比。这些计数用于组成评分系统，据此阳性染色细胞的强度可以被细分成4类：-、+/-、+和++。回肠和结肠的CD3+、CD4+、CD8+、CD19+和CD68+的正常值是+。CD40+和CD154+细胞的正常值是阴性(-)。 

免疫安全参数 

为了评估ch5D12的任何非特异性免疫抑制，评价了外周血T细胞增殖对植物凝集素丝裂原(PHA)的应答。按照先前的报道⁴¹，对分离的PBMC进行PHA刺激(1μg/mL)。此外，测量循环CD3+、CD4+、CD8+和CD20+细胞的百分比以排除循环细胞的耗竭。对于流式细胞术，在指定时间将血液收集到肝素管，其中每个试管中的100μL全血如下染色(所有Mab均购 自Becton-Dickinson)：抗CD3-FITC，抗CD19-PE，抗CD45-PerCP，抗CD45-FITC，抗CD4-PE，抗CD8-PE和抗CD14-PE。然后在FACScan流式细胞仪(Becton-Dickinson)上分析染色的细胞。进行该方案以计算CD4+相对CD8+细胞的比例并确定淋巴细胞群中B细胞的比例。报告的CD3和CD19的百分比是淋巴细胞群内T细胞和B细胞的百分比，而CD4和CD8细胞报告为CD3细胞的百分比。只有CD14(单核细胞群)显示的是总CD45群的百分比。 

结果

药代动力学 

单次i.v.注射后ch5D12的平均峰值水平是剂量依赖和剂量成比例的(图1)。24小时后，在最高的3个剂量群组的血清中能够检测到大约50％被施用的ch5D12。对于0.3mg/kg群组，24小时后只有15％存在于血清中。对于非人灵长类动物研究，计算出t1/2β是8-10天²⁷，这被现有的人类数据确认。利用FITC标记的ch5D12通过回体(ex vivo)竞争分析确定(未显示)0.3mg/kg的输注没有实现外周血B细胞上CD40的完全包被。对于1.0mg/kg组，可以观察到循环B细胞上CD40包被大约1周，而在两个最高剂量组中这个时间延长到2-3周。这提示在最低剂量组中，CD40的拮抗作用是不完全的，而在1.0mg/kg群组中实现1周的完全拮抗作用，并且在更高剂量组中甚至更长。 

临床反应 

对CDAI进展的分析显示18例受试者中的13例(72％)在ch5D12输注后具有良好反应。类似地，18例受试者的4例(22％)在此期间经历了症状缓解。在第21天评价时，18例受试者中的10例记录了有利的反应。群组2和4显示CDAI最大的平均降低，并且没有观察到明显的剂量-效果关系(图2；表2)。之后重复测量anova显示CDAI在56天观察期间统计学上显著降低(P＜0.001)。各个群组之间的差异统计学上不显著。只在群组3和4中评价了CDEIS(因为群组1和2中只对3例受试者作了内窥镜检查)。在群组3中，5例受试者中的2例CDEIS降低，而在群组4中，3例受试者中有2例降低。这两组中的其余受试者没有显示变化(未显示)。 

组织学变化 

对于被采集活检的患者(n＝11)，单个研究者评价他们组织病理学和免疫组织化学方面的变化。对活检材料进行的评估显示治疗对于疾病的显微镜下活性以及固有层单核细胞浸润强度的显著影响。 

从基线到第28天的组织病理学活性评分的变化显示于图3。提供有第0天9例患者的回肠样品和11例患者的结肠样品。4例患者的回肠在筛查时没有患病，而5例患者患有活性回肠疾病。第0天那些患有活性疾病的患者的平均组织学评分是4.6(范围3-7)。第28天所述5例患者的平均组织学评分降低到1.0(范围0-3)。11例患者中4例的结肠在第0天没有患病，来自这些患者的结肠样品在第28天仍是正常的。7例患者的结肠显然患病，其平均组织学分数在第0天为4.5(范围2-12)。第28天其降低到平均分数为1.7(范围0-7)。7例患者的5例中，第28天的分数是0(提示是正常活检)或者1(提示只有结构异常)。在最低剂量群组(a组)，1例受试者的结肠评分降低，但该组的其他结肠评分仍然较高，回肠评分甚至增加。在更高剂量群组(b-d组)，在ch5D12治疗后第28天回肠或者结肠或者两者的活性评分全部降低。最终，在81％(9/11)的受试者中观察到阳性反应[如参考文献(41)所定义]。此外，在第0天患有活性疾病的7例受试者显示中性粒细胞活性降低到在第28天活检中不存在中性粒细胞。 

为了确定ch5D12治疗靶向何种细胞，在现有活检上对T细胞(CD3、CD4和CD8)和B细胞(CD19)标记以及巨噬细胞标记(CD68)就每个方案均进行免疫组织化学评估。结果列于表3。在最低剂量群组中第28天未观察到降低，而在所有其他群组中观察到浸润减少。在处于基线的回肠样品中，9例患者中的6例CD3+T细胞数增加。在结肠中，11例患者中的4例存在CD3+T细胞数增加，在常规组织学检查中他们均患有活性疾病。第28天，除了1例患者外所有患者的CD3+T细胞数被归一化。该患者(患者001；最低剂量组；0.3mg/kg)的回肠和结肠中存在持续的CD3+细胞增加，这与常规组织学的持续炎性活性和肉芽肿性炎症一致。CD4+和CD8+细胞显示与CD3+相似的模式。 

CD19+B细胞的模式与从T细胞观察到的模式相当。第0天，9例患者(提供其回肠活检)中的6例和11例结肠样品中的4例存在B细胞的升高。 第28天，除了低剂量组的1例患者外所有患者的B细胞量被归一化。 

第28天在CD68+单核细胞/巨噬细胞上观察到相似的降低。第0天，9例患者(提供其回肠活检)中的5例和11例结肠样品中的4例存在CD68+单核细胞/巨噬细胞的量增加。除了1例低剂量群组的患者以外，第28天所有的增加都被再次归一化，所述患者的结肠样品中仍保持较高的CD68+单核细胞/巨噬细胞，甚至在回肠活检中也有增加，表明该患者在第28天仍患有活性疾病。 

图4显示施用ch5D12前和施用ch5D12后第28天，患者011(活性评分：7)的回肠活检和患者012(活性评分：12)的结肠活检中所有3种主要细胞类型(T细胞、B细胞和单核细胞/巨噬细胞)降低的代表性实例。 

安全性 

没有受试者因为不良事件(AE)而退出研究，这些AE的大部分是轻度至中度严重性。对发生≥5％AE总数的AE的评估显示最常见的AE是发热、关节痛、肌痛和头痛。关节痛，经常发生在基线和随访期间，其频率随着随访进程而降低。4例受试者出现了流感样症状和痒疹，其中只有1例受试者是在施用研究药物(3.0mg/kg)后不久开始出现中度皮疹。总的来说，对于任何单个AE来说没有明显的剂量反应，可能例外的是头痛/偏头痛。 

在6例受试者中观察到6起严重不良事件(SAE)；0.3mg/kg群组中没有发生事件，1.0mg/kg群组中3起事件，3.0mg/kg群组中2起事件，以及10.0mg/kg群组中1起事件。6起SAE中的5起被认为可能与研究药物有关，1起事件被认为是无关的。除了1起事件以外的其他所有事件都是胃肠事件(2例不完全肠梗阻(sub-ileus)均在1.0mg/kg；2例加重的克罗恩病，1.0和3.0mg/kg受试者；和1例加重的腹痛，3.0mg/kg受试者)。但是这些事件中的两起发生在不可能与所述研究药物有因果关系的时间点(1例受试者在输注当天，另1例受试者在施用研究药物后29天经过内窥镜检查后)。观察到的异常显示与研究药物或者剂量无关。 

免疫安全参数 

因为ch5D12在体外抑制B细胞活化，所以测定总免疫球蛋白水平，发现其在随访期间是稳定的。为了排除ch5D12能够从循环中耗竭B细胞 的可能性，我们在研究过程中进行PBMC的亚型分析。CD3、CD4、CD8和CD14阳性细胞的百分比和绝对数不受施用ch5D12的影响。在施用ch5D12后不久循环CD19+B细胞的绝对数短暂降低，在ch5D12从循环中被清除后又恢复到它们的初始值(未显示)。 

为了研究ch5D12治疗是否会造成常规免疫抑制作用，用多克隆T细胞激活物PHA刺激在治疗前后不同时间点分离的PBMC。令人遗憾地是，10.0mg/kg剂量群组的细胞被不正确的冷冻，因此不会对PHA应答，包括施用ch5D12前获得的细胞。利用与PHA保温诱导的刺激指数变化剧烈，但是没有检测到ch5D12治疗后的降低趋势(数据未显示)。 

2个更低剂量的群组在整个研究过程中都没有可检测的抗ch5D12抗体。在3.0mg/kg群组，发现1例受试者产生抗ch5D12应答，尽管该信号非常低并且只能在该患者未被稀释的第28天样品中检测到。在最高剂量组，另1例受试者在研究的第28天和第56天具有抗ch5D12抗体。这些在1∶64稀释后能检测到。因此，只有2例受试者对施用ch5D12可能有免疫应答。 

讨论 

在这种开标、多中心试验中，给患有中度至严重克罗恩病的受试者施用4个剂量水平的ch5D12。登记了18例受试者，除了最后一个剂量群组(其中只登记了3例受试者)外，每个治疗组有5例受试者。在食蟹猴中观察到的ch5D12血清水平剂量依赖的增加和长血清半衰期²⁷在人类中得到确认。本研究证明了利用ch5D12拮抗CD40介导的细胞活化的可行性，并且没有明显的副作用。CDAI分析显示研究期间72％的受试者具有临床应答，22％具有症状缓解。这些结果是很有希望的；但是开标设计和对照组的缺失不可能明确的将观察到的变化归因于所述研究药物的施用。但是，我们有几个论据支持ch5D12的抗炎作用。首先，在两个最高剂量群组受试者中观察到的CDEIS降低证明治疗效果。其次，活检的组织学和免疫组织化学分析结果显示ch5D12降低结肠或者回肠中的炎性活性。在低剂量群组没有观察到明显的作用。10.0mg/kg群组的受试者在第0天具有最低的组织学活性评分，因此该群组活性评分的降低是有限的。在1.0mg/kg和3.0mg/kg组发现基线的最高评分，第28天在这些患者中组织学评分存在明显的降低。 

尽管在本研究中鉴定出2例患者具有抗ch5D12抗体，但HACA抗体 的水平仍然非常低，只能在很低的血清稀释度下被检测到。仍然需要确认抗ch5D12应答是否能够在后续研究中被检测到。 

该试验通常代表第一次施用抗CD40Mab，特别是给人施用ch5D12。但是，先前已经在狨猴的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)中体内获得了Mab 5D12生物活性的证据。疾病诱导后2-4周开始的5D12施用具有显著的有益效果²³。这种观点的体内证据促使了5D12的重组人源化和进一步发展。还在狨猴EAE模型中评价了ch5D12的生物活性。在MOG免疫后第50天，安慰剂组的发病率是100％(50％的动物因为其EAE的严重性而被处死)，而在ch5D12治疗组中没有观察到疾病迹象²⁴。此外，在恒河猴肾移植模型²⁵以及当被用于免疫抑制策略以阻止抗腺病毒颗粒及其产物的免疫应答时²⁶，ch5D12均显示功能活性。对人和食蟹猴组织的组织交叉反应研究显示ch5D12与淋巴器官中B细胞和DC的细胞表面结合。在人或者食蟹猴组织中没有观察到意料之外的交叉反应性。在食蟹猴中评价了ch5D12的安全性和耐受性，其中每周施用ch5D12共4周在全部猴中都显示是安全的，没有任何副作用。在本研究中，获得功能性证据证明ch5D12能够阻止B细胞活化和增殖²⁷。总的来说，这些研究显示拮抗性抗人CD40Mab 

ch5D12没有意料之外的交叉反应性，是安全的，限制了食蟹猴的免疫反应性，并且在狨猴中抑制中枢神经系统的典型慢性炎性疾病。因此，临床前评估支持其进一步发展以用于患者。 

已经在动物模型中证实CD40-CD154(CD40L)共刺激途径是治疗自身免疫性疾病和移植排斥的有希望的临床靶位¹⁵。有可能通过靶向CD40或者CD154来抑制CD40-CD154的相互作用。之前的所有研究都集中于拮抗CD154，CD154在活化的T细胞和血小板上选择性表达^8-11。因为血栓栓塞性事件已经停止了利用抗人CD154 Mab的人类临床研究^12-14。因为该抗CD154Mab被构建为人源化的IgG₁，其与Fc受体结合极其紧密，所以抗CD154Mab可以将CD154交联至Fc受体，造成血块形成。最近，CD40据报道在血小板上组成性表达，被认为对利用可溶性CD154刺激血小板活化是功能上重要的。通过添加抗CD154或者抗CD40Mab可以终止这些造成血小板活化的刺激效应⁴²。我们还在人血小板实验中证实了ch5D12的非刺激性特征，因为向利用亚最佳浓度的ADP或者胶原预刺激的血小板中添加ch5D12对血小板的活化状态没有任何效果(M.F.Hoylaerts，未公开的观 察，Leuven，Belgium)。此外，与IgG₁骨架相比，ch5D12Mab骨架的IgG₄Fc部分与血小板上表达的Fc受体的结合能力降低。所述两种方法的另一区别还在于ch5D12靶向B细胞、单核细胞、巨噬细胞和DC，而抗CD154Mab主要靶向活化的T细胞，导致临床策略显著不同。在本研究接受治疗的任何患者中都未观察到血栓栓塞症状。 

ch5D12作用主要基于干扰CD40介导的细胞活化。CD40引发诱导巨噬细胞和DC的细胞因子和趋化因子分泌，并增强DC的抗原递呈能力。因为ch5D12拮抗CD40受体，而TNF-α产生是通过CD40受体诱导的³⁹，所以它还可以拮抗TNF-α分泌，而TNF-α无疑是克罗恩病中的一个重要细胞因子⁴³。但是，许多其他炎性细胞因子如IL-8和IL-12³⁹也通过CD40引发来诱导，因此除了阻止TNF-α产生外，ch5D12还具有抗炎性质。不论观察到的效果是否主要取决于减弱的T细胞活化或者细胞因子和趋化因子的释放减少，都需要进一步的研究。 

本ch5D12首次用于人类的研究显示了有希望的临床益处，并且没有严重的副作用。为了确定ch5D12在维持症状缓解和安全监测多次输注中的作用及最佳给药方案，还需要进一步的临床研究。显然，拮抗CD40的治疗益处不会仅限于克罗恩病，还可以潜在延伸至许多其他炎性病症。 

实施例2 

材料和方法 

5D12嵌合形式的产生 

从5D12杂交瘤细胞系克隆小鼠5D12的可变区。简单来说，利用Qiagen从裂解的细胞分离总RNA。通过RT-PCR利用寡核苷酸5′CAG GTS MARCTS SAG SAG TC W GG 3′和5′GCA TGT ACT AGT AAT TTT TVT TGTCCA CYT TGG TGC T 3′扩增mu5D12的VH区，并利用寡核苷酸5′CGATAC GAS MTY CAG CTG ACC CAG TCT CCA 3′和5′GAC TCA TCTAGA TAC ACT CAT TCC TGT TGA AGC TCT TG 3′扩增mu5D12的VL区。序列分析后确定V区的共有序列。随后V区与编码人IgG₄和人kappa的基因组序列被再克隆到pcDNA3002(Marissen et al，J.of Virol，2005：79：4672-4678)以构建嵌合IgG₄免疫球蛋白表达质粒。 

5D12去免疫形式的产生 

与Biovation合作，利用他们拥有的DeImmunisation技术鉴定V区内可能的T细胞表位。辅助T细胞表位包括蛋白内具有结合MHC II型分子能力的短氨基酸序列。通过移除T细胞表位，抗体将不再引发T细胞辅助以及针对所述抗体的后续免疫原性。利用Peptide Threading完成鉴定。Peptide Threading方法是一种基于计算机的方法，其基于X-射线结晶学获得的已知结构来预测肽(小氨基酸序列)与18种不同的人MHC II型分子的结合。此外进行分析从V区寻找来自数据库(www.wehil.wehi.edu.au)的已知人T细胞结合肽的存在。 

根据一级鼠V区氨基酸序列，设计表面人源化(镶嵌)的V区。在这些镶嵌的VH序列内鉴定出8个可能的T细胞表位，在镶嵌的VL区内鉴定出4个T细胞表位。通过氨基酸取代去除鉴定的T细胞表位。根据这个分析，合成编码去免疫的VH和VL区的DNA序列并将其再克隆到pcDNA3002-hIgG₄-kappa表达质粒。 

定点诱变 

为了恢复去免疫pcDNA3002表达质粒VH区内的鼠序列，按照制造商的方案使用Stratagene的QuickChange Site-Directed Mutagenesis试剂盒。表4列出了使用的寡核苷酸。简单来说，变性所述质粒，然后退火包含所需突变的有义和反义引物。利用Biometra T梯度PCR仪循环(95℃30秒；55℃30秒；68℃600秒)16次，掺入诱变序列。利用只切割甲基化DNA的DpnI消化未突变的亲代质粒。然后将包含突变质粒的PCR混合物转化XL1-Blue感受态细胞。挑取菌落并通过DNA序列分析正确的质粒。第二组实验集中于产生29和37位的其他变体，通过对结构相关的V或者L特异取代I。按照上文描述的相似方式，利用表6所示的寡核苷酸产生质粒。需要两轮诱变产生双突变(表7)。用质粒转化XL1-blue感受态细胞。 

PER.C6^TM中的表达 

各种形式的5D12只在PER.C6^TM(Crucell)中瞬时表达。简单来说，转染前一天PER.C6^TM被胰蛋白酶消化并计数。将细胞以每孔4×10⁵细胞的密度铺板于T24孔板的DMEM中，所述DMEM添加有10％FCS。第二天培养基被替换为0.5ml新鲜培养基。对于每孔将1μg质粒DNA稀释到50μl OPTI-MEM I中，然后将其与包含3μl LipoFectAMINE 2000(LF2000)试剂(Invitrogen)的等体积OPTI-MEM I混合。将混合物在室温保温20分钟以便形成DNA-LF2000试剂复合物。随后将DNA-LF2000试剂复合物(100μl)直接添加到各孔。将转染细胞在37℃的CO₂培养箱中保温。48h后分析上清的抗体表达。 

ELISA 

通过夹心ELISA测量表达抗体的量。简单来说，96孔EIA/RIA板(Corning 3590)在4℃用多克隆抗体抗人IgG(Jackson 109-005-088)包被o/n，所述抗体用PBS 1/1000稀释(100μl/孔)。用包含0.05％Tween和1％BSA的PBS封闭后，板用PBS-0.05％Tween洗涤3次。作为标准品，随后滴定使用纯化的嵌合5D12，从400ng/ml开始直至零，一式三孔。样品(瞬时上清)同样也用于滴定。所有稀释均使用PBS-0.05％Tween。板在37℃保温1小时。洗涤3次后，每孔添加1/5000稀释的检测抗体(抗人kappa碱性磷酸酶标记的(Southern Biotech Associates 2060-04))。板在37℃保温1小时。除去保温液后，将板洗涤5次。利用PNP底物(Sigma N-2765)(1mg PNP/ml底物缓冲液-100mM Tris/HCl，100mM NaCl，5mM MgCl₂.6H₂O pH 9.5-)完成染色。利用655nm作为参照，在BioRad 550Titertek上测量OD405nm。 

FACS 

通过FACS分析对表达抗体的抗原特异性进行分析。JY细胞是EBV转化的人B细胞，其表达CD40。简单来说，100000个JY细胞与100μl来自瞬时表达实验的上清在4℃保温20分钟。为了去除未结合的抗体，用包含0.05％NaAzide和1％BSA的PBS洗涤细胞。使用1/100稀释的FITC标记的抗人IgG(Jackson 109-095-127)作为二抗。在4℃保温20分钟后，洗涤细胞。最终在FACScan(BD)上测量细胞样品。 

结果

在分析数个克隆后，确定了鼠5D12的V区的共有序列(图5)。 

通过人表面化(human surfacing)重新设计V区，保留关键的鼠氨基酸。通过Peptide Threading方法和数据库搜索确定这些重新设计的序列内可能的 T细胞表位。在VH区内鉴定出8个(可能表位的第一个碱基：27、30、43、46、57、61、77和83位)可能的表位，在VL区内鉴定出4个(7、13、28和86位)可能的表位。根据T细胞表位作图和镶嵌方法确定最佳的去免疫VH和VL氨基酸序列(图6)。为了去除VH区61位的T细胞表位，需要特别注意不能引入潜在的N糖基化位点(N-X-T/S)：NSA被STS取代。在这种最终设计中VH区的12个位置被改变(计数60-62位作为1个变化)。对于VL区来说，8个位置被改变。 

通过对完全去免疫5D12(DI5D12)和ch5D12(重命名为PG100)的表达水平进行比较的初步实验可以发现由于引入的突变，DI5D12的表达水平低于其亲代序列(数据未显示)。 

理论上每种取代均能影响表达抗体的特征。因此为了研究VH区各个位置变化对抗体特征的影响，设计了其他12个变体(图7)。在每个变体中，第1位被恢复到初始的鼠氨基酸序列。 

为了检测不同形式的表达水平和功能性，构建14种pcDNA3002表达质粒。每种质粒包含人IgG₄骨架(VH区与其连接)和人kappa区(VL区与其连接)。一种质粒编码ch5D12，其中使用鼠V区。其他13种质粒是去免疫形式，其中去免疫VL区与去免疫VH区或者图7所示的12种VH变体之一联用。随后利用LipoFectamine2000用所述14种质粒转染PER.C6^TM细胞。还包括阴性模拟转染(无质粒)。48小时后收集各个转染的瞬时上清，并分析抗体表达。图8显示FACS数据。显然所有被检测的构建体均结合JY细胞，表明5D12的CD40结合特异性被保留。 

此外FACS数据表明生成的抗体水平是不同的。DI5D12和ch5D12(PG100)的表达水平显然存在差异。变体Q5E，K13A，E16Q，T17S，STS60NSA和T68S显示与DI5D12相同的表达特征。其他变体看起来增加了表达水平。为了精确确定不同的表达水平，通过测量抗体水平的定量ELISA来分析全部上清。如表5所示，可以将被检测的变体分成3组：表达水平没有或者提高较低(Q5E、K13A、E16Q、T17S和STS60NSA)，与ch5D12(PG100)相比变体P45L、M48L、S79F和T108S恢复到至多40％的表达水平，而I29L和I37V变体恢复到超过50％的水平。尤其是第29位的取代(I到L)看起来对表达水平有较大的影响。I29L变体随后被重新命名为PG102抗体。 

以下观察结果(即29位(I到L)和37位(I到V)的取代均对表达水平有较大影响)是出乎意料的，因为氨基酸I、L和V在结构上密切相关，并且这3种氨基酸共同组成一组支链氨基酸。在后续研究中还进一步确认了用结构上相关的氨基酸V或者L对29和37位氨基酸I的组合取代的效果。 

图9显示参照ch5D12(PG100)、DI5D12和PG102(I29L变体)设计的V-L-I变体。 

为了检测V-L-I变体的表达水平和功能性，如上所述构建其他pcDNA3002表达质粒，其包含人IgG₄骨架(所述变体之一的VH区与其连接)和入kappa区(VL区与其连接)。随后利用LipoFectamine2000用该质粒转染PER.C6^TM细胞。48小时后收集各个转染的瞬时上清并分析抗体表达。为了精确确定不同的表达水平，通过测量抗体水平的定量ELISA来分析全部上清。如表8所示，第29和37位上V、L或者I的不同组合与变化的生成水平有关。这进一步证明最终不仅仅是全部的V、L和I取代导致更高的生成水平。 

讨论

通过降低治疗抗体的免疫原性可以改变其特征。该研究证明去免疫设计使抗体仍具有与其抗原结合的能力，但是抗体只能以低水平产生。表达时最有可能存在的问题就是去免疫VH和VL区的组装。通过将每个取代位置改回到VH区内的初始鼠序列，显示一些位置对于抗体的正确表达是必需的。尤其是基于peptide threading方法的位点对表达水平有很大的影响。所有基于镶嵌引入的N端变化几乎没有影响。值得注意的是29位的L取代I具有最大影响，这是出乎意料的，因为这两种氨基酸结构上密切相关。I29L变体随后被重新命名为PG102抗体。 

后续研究显示29和37位上V、L或者I的不同组合导致生成水平的变化，证明尽管这3种支链氨基酸V、L和I结构上密切相关，但对29和37位上这些氨基酸任一种的取代对完整抗体的生成水平均有影响。 

实施例3 

材料和方法 

用于产生PG102(I29L变体)的GS-CHO细胞系的构建、筛选和生长。 

Lonza Biologics(Lonza)在PanGenetics BV的要求下完成GS-CHO细胞系的构建、选择和评估，所述细胞系表达人重组IgG4/kappa抗体PG102(I29L变体)。 

利用Lonza的谷氨酰胺合成酶(GS)基因表达系统(WO2003054172)通过用产生的载体转染CHOK1SV宿主细胞来构建细胞系。基因序列由PanGenetics提供。细胞系CHOK1SV是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系CHOK1的悬浮变体，其适应化学限定的、无动物成分的(CDACF)培养基(Bebbingtonet al(1192)Biotechnology 10：169-75；de la Cruz Edmonds MC et al(2006)Mol.Biotechnol.34：179-90)。 

所有试剂、培养基组分和材料均购自鉴定合格的供应商。补料SF40和SF41制剂，培养基CM42和培养基补充剂SPE购自Lonza。使用培养基CD-CHO(Invitrogen)时还添加选择剂L-甲硫氨酸砜亚胺(MSX)用于CDACF适应细胞系的常规亚培养以及添加酚红用于转染。选择剂MSX由Sigma提供。这些培养基和补料不含抗生素。 

还在Lonza构建了编码PG102基因的GS表达载体。从Lonza低温保存的工作细胞库269-W的小瓶获得CHOK1SV宿主细胞。 

细胞培养，浓度和存活性 

通过快速升温至37℃并稀释到大约50mL的生长培养基从低温保存的储存液小瓶中复苏细胞。通过离心细胞去除冷冻保护剂，丢弃上清，将细胞重悬浮于新鲜的生长培养基。 

对于静止培养，细胞在T25烧瓶中生长，培养体积为5-15mL。将这些静止培养物置于35.5-37.0℃的培养箱中，所述培养箱含10％v/v CO₂的空气。 

对于悬浮培养，培养物在合适体积的生长培养基中扩增，每4天亚培养以便在CDACF培养基中生长。使用的容器是：125mL摇瓶(10-30mL的培养体积)，250mL摇瓶(30-50mL的培养体积)，500mL摇瓶(50-100mL的培养体积)，1L滚瓶(100-200mL的培养体积)，或者2L滚瓶(200-400mL的培养体积)。每个培养物的顶部空间充有5％v/v CO₂的空气，密封烧瓶。然后将培养物在35.5-37.0℃的振动平台上按照140±5rpm旋转保温。 

通过无菌提取培养样品，用台盼蓝染色非活细胞并用改进的Fuchs-Rosenthal血球计显微镜检查，获得总细胞浓度和活细胞浓度。当适当时，计数前先稀释样品。 

此外，利用CASY-1颗粒计数器或者Vi-CELL XR自动细胞计数器测量总细胞浓度和活细胞浓度。对于CASY-1计数器，从每个烧瓶无菌提取培养样品，用Casyton缓冲液稀释，测定活细胞和总细胞数。通过大小区分活细胞和非活细胞。将活细胞对总细胞的比例乘以100计算出百分比存活性。对于Vi-CELL XR计数器，无菌提取0.7mL细胞培养物，并进行自动化的台盼蓝计数。利用一系列相片和计算机分析算法鉴定和计数活细胞和非活细胞。对于所有的计数法，将活细胞对总细胞的比例乘以100计算出百分比存活性。 

CHOK1SV宿主细胞的转染 

在转染当天，离心收集在非选择性培养基中生长的细胞，并将其以1.43×10⁷个活细胞/mL的浓度重悬。对于每次转染，向电穿孔杯中添加大约0.7mL细胞悬液和40μg质粒DNA。然后将电穿孔杯放入电穿孔装置，输送300V、900μF的单脉冲。电穿孔后，利用培养基CD-CHO/酚红将杯中的细胞按照大约每孔5000个宿主细胞分配到96孔板。将所述板在35.5-37.0℃置于10％v/v CO₂的空气中保温。转染次日，每孔添加150μL选择性培养基CD-CHO/酚红/66.6μM MSX。每孔MSX的终浓度是50μM。对板进行监控以确定何时未转染细胞死亡，只留下转染细胞的聚集。在转染后大约3-4周转染细胞的聚集变得明显。所有被检测和处理的转染子进一步来自于通过目测确定只包含单个集落的孔。 

静止培养中细胞系生成的评定 

转染后将96孔板保温大约3-4周以允许集落形成。在显微镜下检测集落以证实它们具有合适的大小(覆盖孔底部超过60％)，并且每孔中只存在一个集落。然后利用Lonza对于组装抗体的ELISA分析按照“组装ELISA”的描述分析培养上清的抗体生成。在取样时测定孔的百分比铺满率(confluence)。利用分析结果除以百分比铺满率得到的值对细胞系排序。 

将高级别细胞系的培养物在24孔板的培养基CD-CHO/酚红/25μMMSX中扩增，让其达到铺满。达到铺满时，将该培养物接种于T25烧瓶中的培养基CD-CHO/酚红/25μM MSX，而向剩余培养物中再补料新鲜的CD-CHO/酚红/25μM MSX，并继续保温14天。在该时间点，从24孔板收集培养上清，并利用Lonza的用于组装抗体的ELISA分析测定抗体浓度。选择最高产的细胞系。当在T25烧瓶中达到铺满时，允许选择的细胞系生长到多层，然后再补料CD-CHO/25μM MSX。在补料后，将培养物放回培养箱再放置4-7天，直到培养基再次变成橙色/黄色，从烧瓶移取细胞。 

细胞系扩增为CDA CF悬浮培养物 

从铺满的T25烧瓶培养物开始悬浮培养。按照0.05-0.2×10⁶个活细胞/mL的浓度将悬浮培养物接种到包含CD-CHO/25μM MSX培养基的125mL摇瓶中。最多14天之后如果T25烧瓶中的活细胞浓度仍达不到0.05×10⁶个活细胞/mL，则自动将15mL各培养物加入125mL摇瓶中的15mL CD-CHO/25μM MSX中。然后按照0.2×10⁶个活细胞/mL的接种浓度，以4天亚培养方式，将所述细胞系在新鲜的CD-CHO/25μM MSX培养基中进行连续亚培养，直到获得可接受和可重复的生长特征。 

悬浮培养中细胞系生长和生产力的评定 

补料分批摇瓶培养

利用CM42/4×SPE培养基，在500mL摇瓶中用100mL细胞悬液制备每个被选细胞系的单一培养物。按照0.2×106个活细胞/mL的浓度接种培养物，各培养物的顶部空间用5％v/v CO₂的空气平衡。将培养物在35.5-37.0℃140±5rpm转动的振动平台上保温，直到后峰活细胞浓度小于或等于0.6×10⁶个活细胞/mL或者达到15天(‘生长过度’)。在该时间点收集培养物。每日用Vi-CELL自动细胞计数器测定细胞浓度。在细胞浓度为1.4-2.2×10⁶个活细胞/mL时，一次性加入营养补料SF40。在初次添加后大约24、48和72小时继续进行一次性添加。一旦细胞浓度大于4.0×10⁶个活细胞/mL时，使用第二补料(SF41)。按照合适间隔提取培养物样品，离心，将上清保存于-20±5℃直到通过A蛋白HPLC分析抗体浓度。在-20±5℃保存从各生长过度的培养物收集的上清。还评估了10个抗体浓度最高的生长过度培养物产 生的抗体量。在A蛋白纯化以及通过还原和非还原性十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的抗体特征鉴定和等电聚焦(IEF)分析以及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI TOF-MS)寡糖分析前利用凝胶渗透高效液相层析(GP-HPLC)方法评价了样品的聚集水平。 

低温保存 

在整个工作计划中在关键时间点低温保存细胞。通过离心回收生长培养物中的细胞并重悬于低温保存混合物中。所述混合物包括合适的生长培养基(92.5％v/v)和二甲基亚砜(7.5％v/v)。 

然后将等份细胞分装到标记的小瓶，每等份包含大约1.5mL低温保存培养基和大约0.5-1.5×10⁷个活细胞。然后小瓶在自动可编程细胞冷冻机中冷冻，随后转移到液氮冷藏库。 

世代数 

对于每个被选细胞系，在培养物传代到悬浮液的时候细胞的世代数被定义为零。随后利用来自下列等式的步骤计算每次亚培养的世代数(向下舍入最接近的0.5代)。 

$N_f=N_i+\{\frac{1}{\mathrm{Ln}2}.\mathrm{Ln}\frac{X_f}{X_i}\}$

其中：N_f＝在时间f的世代数 

N_i＝在时间i的世代数 

X_f＝在时间f的活细胞浓度(细胞/mL) 

X_i＝在时间i的活细胞浓度(细胞/mL) 

并且f＞i 

数据分析 

根据相邻细胞浓度值之间区域(近似直角梯形)的面积总和来计算生长曲线下区域的时间积分(活细胞浓度的时间积分(IVC)；10⁹细胞.h/L)。通过将两种活细胞浓度的平均值(细胞/mL)乘以两次测定之间的经过时间(h)计算该区域。该方法基于Renard等(1988)在Biotechnology Letters 10(2)91-96页的描述。 

当合适的时候，通过抗体浓度(mg/L)对活细胞浓度时间积分的线性回归分析计算总的特异性生成速率(总q_P：mg/10⁹细胞/h)。该线的斜率等于总q_P。用收获抗体浓度除以收获时IVC值计算收获特异性生成速率(收获q_P)。 

组装ELISA 

利用测量组装人IgG的ELISA测定上清样品的抗体浓度。这涉及在包被山羊抗人IgG Fc的96孔板上捕获样品中的组装抗体和标准品。利用与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗人轻链和显色底物四甲基联苯胺显示结合的抗体。显色程度与样品中存在的抗体质量成正比。利用IgG标准品(批号L07387/5/2)产生的标准曲线确定浓度。 

A蛋白HPLC 

利用Agilent 1100HPLC上的A蛋白高效液相层析(HPLC)定量产物浓度。抗体选择性结合POROS A蛋白免疫检测柱。从柱上洗脱未结合的材料并通过降低溶剂pH释放残留的结合抗体。利用多波长检测器通过280nm的吸光度监控洗脱。根据抗体标准品(Lot L07385/4/10)定量抗体(利用Chemstation软件)并利用 $E_{280\mathrm{nm}}^{0.1\%}=1.52$ 的消光系数校正。 

A蛋白亲和纯化 

制备Gravity fed rmp Protein A Sepharose柱(5mL)。柱在使用前用6M盐酸胍洗涤并用50mM甘氨酸/甘氨酸盐-250mM NaCl缓冲液pH 8.0平衡。在添加到柱之前，将柱负载材料的pH调节为pH 8.0±0.1。rmp A蛋白亲和柱用平衡缓冲液洗涤，用0.1M甘氨酸缓冲液pH3.5洗脱。柱洗脱液用的2M Tris Base中和至大约pH7.0，并在Dulbecco′s磷酸盐缓冲液中透析以用于IEF和SDS PAGE分析。 

A蛋白亲和纯化抗体的SDS PAGE分析 

通过A蛋白纯化制备用于分析的细胞培养样品。利用4-20％的预制Novex聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。对于还原性SDS PAGE，样品用2-巯基乙醇还原并用pH8.0的SDS变性。在样品上样到凝胶(每条泳道10μg)前，将样品加热2.0±0.5分钟。利用相同的凝胶和Novex非还原性样品缓冲液(不 添加2-巯基乙醇)进行非还原性SDS PAGE。在样品上样到凝胶(每条泳道4μg)前，将样品加热1.0±0.5分钟的标准时间。电泳后，用考马斯亮蓝R250染色75分钟并用甲醇/乙酸脱色来显影蛋白。 

A蛋白亲和纯化抗体的IEF分析 

通过A蛋白纯化制备用于分析的细胞培养样品。利用预制琼脂糖IEF凝胶，pH3-pH10进行IEF分析。按照每条泳道大约10μg蛋白样品上样凝胶，然后预聚焦70Vh。在去除样品添加条后，电泳继续1500Vh(每块凝胶1500V，20mA，25W)。在三氯乙酸∶磺基水杨酸∶甲醇溶液中固定IEF凝胶，然后用考马斯亮蓝R250(考马斯蓝批号染色003/L11905/118和003/L11905/131)。然后脱色并干燥凝胶(脱色液批号003/L11905/117和003/L11905/121)。 

GP-HPLC 

GP-HPLC方法根据蛋白组分的大小进行分离。大的组分如蛋白聚集物因为太大不能以任何程度渗入基质颗粒，所以在更小的组分如蛋白单体前从柱被洗脱。更小的组分如片段更容易渗入基质，所以在单体后被洗脱。因此使用该技术从聚集物和片段分离抗体单体。通过相对于校准标记的特征性保留时间和位置鉴定单体组分。 

注射未稀释的样品以上样50-250μg，其中产物浓度是1-5mg/mL(Lonza分析的确认荷载范围)。GF-250柱的分子量范围是4-400kDa。 

在280nm检测样品组分，并利用Agilent Chemstation软件分析色谱峰。利用聚集物的垂线法和片段的切线斜滑(tangent skim)进行积分。 

通过计算相对于总积分峰面积的各组分的峰面积确定样品组分的比例。 

MALDI TOF-MS分析 

利用组合了延时引出(delayed extraction)的Micromass^TM MALDI-LR通过MALDI TOF-MS对各细胞系产生的PG102抗体进行寡糖分析。用阳离子模式在反射式配置(reflectron configuration)中进行MALDI TOF-MS。利用混合的N-聚糖标准品校准设备。 

利用POROS A蛋白柱从收获上清纯化抗体。收集纯化级分，利用二硫苏糖醇还原二硫键，然后利用碘醋酸盐烷基化还原的硫醇。利用N-聚糖酶(PNGaseF)释放寡糖，然后将其置于靶板上两层超二羟基苯甲酸(super-dihydroxy benzoic acid，super-DHB)基质之间用于MALDI TOF-MS分析。 

结果 

CHOK1SV宿主细胞的转染 

PG102基因序列被Lonza用来构建双基因载体pPG102/DGV(未显示)，该载体用于通过电穿孔转染CHOK1SV宿主细胞系。利用载体pPG102/DGV进行6组转染，在96孔板中通过组装ELISA筛选255个转染子上清的抗体生成。99.6％被筛选的转染子产生可检测的抗体水平。选择43个高等级转染子在24孔板中进一步评估。 

静止培养物的扩增和悬浮适应 

首先在24孔板上扩增选择的GS-CHO细胞系培养物，然后将其在T25静止烧瓶中扩增。24孔板中剩余的细胞被饲喂新鲜培养基并在评价抗体生产力前“生长过度”。选择的细胞系显示抗体浓度范围为8.3-120mg/L(图10)。 

通过组装ELISA确定的产物浓度最高的23个细胞系培养物被选择用于进一步评估。将选择的培养物加入CDACF培养基进行悬浮培养。所有细胞系都成功地适应悬浮培养并选择用于在补料分批培养中进一步评估。 

选择的细胞系在补料分批摇瓶培养中生长和生产力特征的评估 

在补料分批摇瓶培养中评估23个被选细胞系的生长和生产力特征。准备每个细胞系的单一培养物。当活细胞浓度符合补料标准时，向培养物中添加两种补料SF40和SF41。用于补料方式的方案在技术上尽可能模仿Lonza的通用GS-CHO发酵方法。23个被选细胞系的生长和生产力数据示于表9。补料分批摇瓶培养物的收获上清的A蛋白HPLC分析显示4种细胞系产生的抗体浓度大于1000mg/L。细胞系L107产生最高的抗体浓度，1674mg/L。 

从所选CHO细胞系的补料分批摇瓶培养物纯化的抗体的表征 

在分析前，利用rmp A蛋白琼脂糖凝胶层析纯化具有最高抗体浓度的10个细胞系的收获样品。然后利用SDS PAGE和IEF分析A蛋白纯化抗体。非还原性条件下通过SDS PAGE对A蛋白纯化样品的目视分析显示所有样品都是彼此相似的，在大约200kDa处显示完整的抗体条带(数据未显示)。还观察到其他少量条带，尽管它们不全都在凝胶图像上可见。还观察到分子量在116-200kDa之间的3个条带，分子量在66-97kDa之间的1个条带，分子量在37-55kDa之间的1个条带和分子量在22-31kDa之间的两个条带。观察到的66-97kDa之间的额外条带是非还原条件下IgG₄抗体典型的半抗体。IgG₄批间分析对照(inter assay control，IAC)中也观察到相同的半抗体。 

还原条件下通过SDS PAGE分析的A蛋白纯化样品显示也都是彼此相似的，在大约50kDa处显示重链条带，在大约25kDa处显示轻链条带(数据未显示)。IEF分析显示来自被选细胞系的A蛋白纯化抗体样品的完整性显示类似的谱，除了L97、M92和M59以外的所有细胞系在pI范围8.15-9.30均具有6个一级条带(3个主要和3个次要条带)。这三个细胞系显示3个主要和2个次要条带。在样品J3和J4观察到其他条带，尽管这些不是在所有凝胶图像上都可见。 

抗体的寡糖分析 

通过MALDI TOF-MS对选择用于在补料分批摇瓶培养中进一步评估的10个细胞系中各个产生的抗体进行寡糖分析。从10个细胞系获得的抗体的主要寡糖结构是G0F和G1F，这是在抗体上观察到的典型的N-联寡糖结构。在来自细胞系L52的抗体测得总聚糖的最高水平6.7％，而检测到相对低水平的寡甘露糖结构。在总聚糖范围1.1-4.6％的所有样品中均观察到寡甘露糖-5(man-5)结构。全部被分析的样品都包含类似水平的寡糖和相对低浓度的man-5(数据未显示)。 

GP-HPLC 

当通过GP-HPLC分析被选择用于进一步评估的10个细胞系中各个产生的抗体时，更低分子量组分(LMWC)是最不重要的，但优选水平在25％ 以下。除显示水平为27.1％的L52外，所有样品均显示低于25％的水平(表10)。 

通常不会使用聚集比例的两种不同计算，但当样品间LMWC水平变化很大时则认为这是必需的。 

对数据的进一步分析，排除LMWC而只关注于单体和较大的峰，显示所有样品的聚集峰面积小于2.2％(表11)。低于5％的水平被认为是可接受的。 

细胞系的选择 

选择3个细胞系用于制备接种前原种(pre-seed stock，PSS)。使用的选择标准是组合高收获抗体浓度、可接受生长特征以及可接受产物质量特征。 

选择细胞系L107作为前导细胞系，因为它在评估的23个细胞系中显示最高的收获抗体浓度，以及可接受生长和产物质量特征(图11A)。 

细胞系L25在评估的23个细胞系中显示第二高的收获抗体浓度，以及可接受生长和产物质量特征(图11B)。因此细胞系L25被选为第一备用细胞系。 

细胞系M95在评估的23个细胞系中显示第三高的收获抗体浓度，并具有可接受生长和产物质量特征(图11B)。因此细胞系M95被选为第二备用细胞系。 

接种前原种的低温保存 

对于3种被选细胞系的每一种都低温保存接种前原种(每个原种20小瓶)。这些原种保存于气相液氮冷藏库中。细胞系L107、L25和M95分别被重命名为DC1、DC2和DC3。 

讨论 

Lonza Biologics(Lonza)被要求完成表达人重组IgG4/kappa抗体PG102的GS-CHO细胞系的构建、选择和评估。 

所述基因序列由PanGenetics提供，并利用Lonza谷氨酰胺合成酶(GS)基因表达系统产生载体。通过电穿孔转染细胞系CHOK1SV，其是已经适 应于化学限定的、无动物成分培养基的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系CHO-K1的悬浮变体。 

通过CHOK1SV转染获得254个分泌抗体的细胞系。在24孔板中评估了43个细胞系的生长和生产力。获得的抗体浓度高至120μg/mL。 

在单一补料分批摇瓶培养物中评估23个细胞系。获得的收获抗体浓度范围是121-1674μg/mL。4个细胞系实现收获抗体浓度超过1000mg/L。选择抗体浓度最高的10个细胞系进行产物质量分析。通过还原和非还原十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦分析显示来自各个被选细胞系的纯化抗体的产物质量是彼此相当的。对来自10个被选细胞系中各个的纯化抗体的寡糖分析显示相对低(＜4.6％)水平的寡甘露糖-5。 

GP-HPLC分析显示前3个细胞系的聚集物水平都低于1％。 

选择3个细胞系(L107、L25和M95)根据生长、生产力和产物质量数据进行进一步评估。每个细胞系低温保存20小瓶的接种前原种。这3个细胞系分别被重命名为DC1、DC2和DC3。 

实施例4 

通过表面等离子共振(Biacore)测定ch5D12(PG100)和PG102(I29L变体)与人CD40-Fc结合的动力学 

材料和方法 

利用Biacore 3000设备，在25.0℃恒温下通过表面等离子共振比较ch5D12(PG100)和PG102(I29L变体)与人CD40结合的动力学。在这些实验中与IgG1-Fc结构域(huCD40-Fc；R&D Systems目录号149-CD-50)融合的重组人CD40胞外结构域被用作靶抗原。HuCD40-Fc(1μg/mL于10mM乙酸盐缓冲液，pH 5.0)通过Lys残基的胺基与碳二亚胺活化的Biacore CM5芯片偶联，产生127.4RU的抗原固定水平。为了动力学分析，在BiacoreRunning Buffer(包含EDTA和表面活性剂的HEPES缓冲盐水；HBS-EP)中制备系列稀释的ch5D12(PG100)和PG102(10.0μg/mL-0.313μg/mL)。以30μL/分钟的流速进行动力学分析。样品以相同流速结合4分钟，解离5分钟。然后利用30mM NaOH再生芯片表面30秒，在注射下一样品前在HBS-EP中重建基准2.5分钟。交替注射PG102和ch5D12(PG100)的样品， 对第一组重复试验在每个稀释度增加浓度，然后对第二组重复试验降低浓度。 

使用BIAcore控制软件(Version 3.2)收集数据，使用BIAevaluation软件(Version 4.1)分析动力学数据。利用两种不同的分子相互作用模型：二价分析物模型和朗缪尔1∶1结合模型计算结合参数。 

结果 

观察到的结合ch5D12(PG100)和PG102抗体的最高水平分别是152.5RU和140.2RU。 

对于这两种抗体来说，根据朗缪尔和二价结合模型计算出的动力学速率常数(分别是ka和kd，或者ka1和kd1)稍有不同。尽管这两种抗体的总亲和力(KD)在模型内差异不大，但PG102比ch5D12(PG100)显示更快的结合和离解速率(图12)。来自这些实验的动力学参数概述如下： 

朗缪尔(1∶1)模型： 

    ch5D12(PG100)        PG102 

ka  1.88×10⁶M^-1s^-1      2.51×10⁶M^-1s^-1

kd  5.07×10^-4s^-1        5.96×10^-4s^-1

KD  2.71×10^-10M         2.37×10^-10M 

二价结合(1∶2)模型： 

    ch5D12(PG100)       PG102 

ka1  6.41×10⁵M^-1s^-1    7.82×10⁵M^-1s^-1

kd1  1.60×10^-3s^-1      2.47×10^-3s^-1

ka2  1.21×10^-3RUs^-1    1.31×10^-3RUs^-1

kd2  2.55×10^-3s^-1      2.24×10^-3s^-1

KD   5.29×10^-9M        5.41×10^-9M 

对这两种方法的拟合优度分析表明二价结合模型描述的数据更好。 

这两种抗体变体在两种模型中计算出的亲和力不同，但是各个抗体利用相同模型获得的解离常数(KD)的估算值是相当的：利用朗缪尔模型 ch5D12(PG100)和PG102分别是2.71×10^-10M和2.37×10^-10M；利用二价分析物模型分别是5.25×10^-9M和5.41×10^-9M。 

实施例5 

利用抗独特型抗体抑制ch5D12(PG100)和PG102结合JY细胞 

为了证明PG102(I29L变体)和其亲代分子ch5D12(PG100)结合相同的CD40表位，使用抗独特型抗体抑制PG102或者ch5D12与表达CD40的JY细胞的结合，通过FACS测量。 

材料和方法 

室温下用5％人血清封闭表达人CD40的JY细胞30分钟。将不同浓度(0-10μg/mL)的鼠mAb 5D12(克隆173-36-1)的抗独特型抗体与ch5D12(PG100)(1μg/mL)、PG102(1μg/mL)或者阴性对照嵌合抗huCD86抗体(chFUN-1；1μg/mL)在50μL/管的总体积中预保温，并保温15分钟。用FACS缓冲液(1×PBS，1％BSA和0.05％叠氮化钠)洗涤JY细胞，丢弃上清。将JY细胞以2×10⁶个细胞/mL的浓度重悬于FACS缓冲液。向预保温抗体混合物中添加50μL的JY细胞悬液，得到100μL/管的终体积。细胞在4℃保温30分钟，然后用4ml FACS缓冲液/管洗涤，丢弃上清。将细胞沉淀重悬于用FACS缓冲液(1∶100)稀释的100μL山羊抗人IgG-FITC(JacksonImmunoresearch Labs.Cat.No.109-095-127)，并在4℃保温30分钟。然后用4ml FACS缓冲液洗涤细胞，丢弃上清。将沉淀重悬于200μL FACS缓冲液，利用FACScan流式细胞仪(Becton Dickinson)测量结合的抗体。 

结果

抗独特型mAb 173-36-1以浓度依赖方式抑制PG102和ch5D12(PG100)结合JY细胞上表达的huCD40(图13)。chFUN-1与也在JY细胞上表达的CD86的结合不受mAb 173-36-1的影响。抗独特型mAb 173-36-1对CD40特异性抗体与JY细胞上CD40结合的封闭作用不存在显著差异。例如，计算出的mAb 173-3-1介导的ch5D12(PG100)(第1批)和PG102(第2批)的抑制的log IC50值分别是-5.74±0.14和-5.76±0.11(p＞0.05；n＝4)。这些值对应于大约1.8μg/mL(～12nM)的抗独特型浓度。表12显示计算出的抗独特 型介导的ch5D12(PG100)和PG102结合JY细胞的抑制的-logIC50值的总结。 

实施例6 

通过ELISA测定ch5D12(PG100)和PG102与CD-40Fc的结合 

材料和方法 

用100μL/孔的huCD40-muIg(Ancell，目录号504-020)包被ELISA板(Costar EIA/RIA板，Corning目录号3590)并在4℃的潮湿环境中保温过夜，其中huCD40-muIg用PBS稀释到250ng/mL。用200μL/孔的洗涤缓冲液(0.05％Tween-20于PBS)将板洗涤3次。随后，用200μL/孔的封闭缓冲液(5％BSA Fraction V[Roche，目录号735094]于洗涤缓冲液)封闭板，在37℃(潮湿环境)保温1小时。用洗涤缓冲液洗板3次。用封闭缓冲液将检测抗体(ch5D12(PG100)，PG102和阴性对照嵌合抗huCD86抗体chFUN-1)稀释到0-1200ng/mL，并将其转移到分析板，终体积为100μL/孔，然后在37℃(潮湿环境)保温1小时。用洗涤缓冲液洗板3次，然后添加100μl/孔的山羊抗人kappa-AP检测抗体(Southern Biotech Associates目录号2060-0)，所述抗体用封闭缓冲液1∶1000稀释。将板在37℃的潮湿环境保温1小时，然后用洗涤缓冲液洗涤3次，再用PBS洗涤一次。向15mL PNP底物缓冲液(12.1gTris，5.84g NaCl，1.02g MgCl₂.6H₂O于1L H₂O(用HCl调节至pH 9.6))中添加1片对硝基苯基磷酸盐片剂(Sigma，目录号N-2765)制备PNP底物。按照100μL/孔向分析板添加PNP底物。在添加3M NaOH终止反应前，将板在37℃保温数分钟(最多30分钟)以便显色。利用微板读数器(Biorad，model550)在405nm测定颜色强度。 

结果

在大量独立实验中发现系列稀释的ch5D12(PG100)和PG102(I29L变体)与固定的CD40-Fc同等地结合(图14)，而抗CD86对照抗体不显示与CD40-Fc可检测的结合。所有实验计算出的半最大结合浓度概述于表13。对于评估的任何抗CD40抗体批次没有观察到半最大结合浓度的显著差异。 

实施例7 

通过FACS测定ch5D12(PG100)和PG102与JY细胞表达的huCD40的结合 

材料和方法 

利用FACS缓冲液(1×PBS，1％BSA和0.05％叠氮化钠)洗涤表达CD40的JY细胞。丢弃上清，按照2×10⁶个细胞/mL的浓度将JY细胞重悬于FACS缓冲液。然后，将50μL JY细胞悬液添加到50μL各种检测抗体(ch5D12(PG100)，PG102和阴性对照嵌合抗huCD86抗体chFUN-1)，所述抗体被配制为0-900ng/mL的浓度范围，并在4℃保温30分钟。然后用4ml FACS缓冲液/管洗涤细胞，丢弃上清。将细胞沉淀重悬于用FACS缓冲液1∶100稀释的100μL山羊抗人IgG-FITC(Jackson Immunoresearch Labs.目录号109-095-127)，并在4℃保温30分钟。然后用4ml FACS缓冲液洗涤细胞，丢弃上清。将沉淀重悬于200μL FACS缓冲液，利用FACScan流式细胞仪(Becton Dickinson)测量结合的抗体。 

结果

所有被检测批次的ch5D12(PG100)和PG102都显示与JY细胞表达的CD40类似的结合特征(图15)，它们的半最大抗体结合浓度相当(表14)。chFUN-1也结合JY细胞，虽然其平均荧光强度(MFI)低于ch5D12(PG100)和PG102。这是因为JY细胞也表达人CD86。 

讨论

利用体外细胞和基于ELISA的分析，已经测定了不同PG102(I29L变体)和ch5D12(PG100)的CD40结合特征。通过抗独特型mAb 173-36-1以相同效力抑制PG102和ch5D12(PG100)与表达CD40的JY细胞的结合。因此，计算出的PG102和CH5D12(PG100)批次的平均-log IC50值的范围分别是5.51-6.11(n＝8)和5.43-6.04(n＝10)(p＞0.05)。抗体173-36-1针对ch5D12(PG100)前体即鼠mAb 5D12的可变区，不抑制抗CD86同种型对照抗体的结合。在进一步的实验中，利用结合人CD40-Fc的抗体的ELISA分析以及结合JY细胞的FACS分析测定了PG102和ch5D12(PG100)的半最大结合浓度。在ELISA分析中，任意被检测批次的PG102和ch5D12(PG100)的半最大结合浓度间都不存在显著差异。例如，计算出的PG102和ch5D12(PG100)批次的平均-log半最大结合浓度分别是7.47±0.04和7.54±0.03(P＞0.05，n＝4)， 对应于大约30ng/ml。在PG102和ch5D12(PG100)结合JY细胞表达的CD40的FACS实验中观察到类似的半最大结合浓度。这些结果表明PG102和ch5D12(PG100)具有相同的CD40结合互补位，如抑制PG102和ch5D12(PG100)结合CD40的抗独特型抗体的相似效力特征所证明。此外，这两种抗体在ELISA和基于细胞的分析中对于结合人CD40均显示类似的体外效力。总之，这里的数据表明PG102和ch5D12(PG100)与人CD40的结合性质是相同的。 

实施例8 

利用未标记的抗CD40抗体竞争性抑制ch5D12(PG100)-PE和PG102-PE与表达人CD40的JY细胞的结合 

材料和方法 

在37℃含5％CO₂的空气潮湿环境中，JY细胞(Epstein-Barr病毒转化的人B类淋巴母细胞系)在Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium(IMDM)中生长，所述培养基包含10％热灭活的胎牛血清(FCS)、2mM L-谷氨酰胺和50μg/mL庆大霉素。在流式细胞术测量当天收获细胞。 

这些实验使用未标记的ch5D12(PG100)(第4批)和PG102(第2批)抗体。还使用这两种抗体PE标记的形式，以便通过流式细胞术直接测定与JY细胞的结合。利用AbD Serotec(Oxford，UK)的PE定制标记抗体。对于每个FACS分析，使用下列方案。从细胞培养物收获JY细胞并计数。随后在不同浓度(0-10μg/mL)未标记竞争性ch5D12(PG100)或者PG102存在的条件下，将1×10⁵个表达CD40的JY细胞/200μL保温缓冲液(PBS，1％BSA，0.05％叠氮化钠)与1μg/mL标记的ch5D12(PG100)或者PG102抗体在4-8℃保温30分钟。洗涤细胞，然后进行流式细胞术分析，利用FACScan流式细胞仪(Becton&Dickinson)测定每个浓度的MFI。利用 

软件(Becton&Dickinson)测量和分析5000个事件/样品。 

结果

在这些分析中未标记的ch5D12(PG100)和PG102显示类似的抑制特征(图16)。未标记的ch5D12(PG100)和PG102对1μg/mL ch5D12(PG100)结合的抑制的平均-log IC₅₀值分别是7.50±0.03和7.63±0.03(n＝4)，而未标记 的ch5D12(PG100)和PG102对1μg/ml PG102结合的抑制的平均-log IC₅₀值分别是7.54±0.01和7.65±0.02(n＝4)。这些-log IC₅₀值对应于大约20-30ng/mL(即～130-200pM)的PG102和ch5D12(PG100)浓度。 

实施例9 

抑制THP-1细胞释放IL-8 

材料和方法 

利用基于细胞的功能性生物分析测量PG102的功能性。简单来说，第1天，在添加10％胎牛血清(Gibco，ref 10270-106)和50μg/mL庆大霉素(Invitrogen，目录号15750-045)的Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium(IMDM，BioWhittaker，目录号BE12-722F)中培养THP-1和Jurkat 39.8/50人类细胞。用1000单位/mL细胞培养物的rhuIFN-γ刺激THP-1。 

在第3天的生物分析中，需要4×10⁵个细胞/mL浓度的THP-1和Jurkat39.8/50细胞。计数THP-1和J39.8/50细胞并测定它们的存活性。然后将细胞稀释到大约1×10⁶个细胞/mL的浓度，按照1∶1混合细胞悬液并在37℃潮湿的5％CO₂环境中保温48小时。 

在第3天如下洗涤THP-1和J39.8/50细胞(对THP-1细胞来说洗涤步骤是去除IFN-γ)：将5mL IFN-γ刺激的THP-1和J39.8/50细胞悬液转移到50mL falcon管。添加40mL Hank′s平衡盐溶液(HBSS)，将细胞在1500rpm(利用IEC离心机)离心6分钟。丢弃上清。在添加10％FCS的预温IMDM中重悬细胞沉淀。将THP-1细胞和J39.8/50细胞调节到浓度为4×10⁵个细胞/mL。 

对于抑制分析，用添加10％胎牛血清的温IMDM培养基将试验样品ch5D12(PG100)或者PG102(I29L变体)系列稀释，获得范围在0-160ng/mL的最终分析浓度。按照下列顺序将THP-1、J39.8/50和试验样品一式三份添加到圆底细胞培养板(Nunclon^TM)：50μL THP-1细胞(相当于每孔2×10⁴个细胞)，50μL试验样品和50μL J39.8/50细胞。总体积是每孔150μl。用多孔食品薄膜覆盖细胞培养板并在37℃潮湿的5％CO₂环境中保温48小时。 

第5天，培养48小时后，吸出70μL细胞培养上清并转移到圆底微量滴定板。按照制造商说明书，利用商品化ELISA(Biosource，Human IL-8cytoset，目录号CHC1304)分析收获细胞培养上清的IL-8含量。 

结果

PG102(I29L变体)和ch5D12(PG100)对于激活THP-1释放IL-8显示类似的抑制效果(图17)。计算出的这两种抗体的-log IC₅₀值分别是8.42和8.28。这些值对应于大约30pM的IC₅₀浓度。 

实施例10 

先前对人和食蟹猴组织的组织交叉反应研究显示ch5D12(PG100)与淋巴器官中B细胞和DC的细胞表面结合。在人或者食蟹猴组织中没有观察到意料之外的交叉反应。对于PG102重复该研究并获得类似的结果(数据未显示)，表明ch5D12(PG100)和PG102以类似方式结合各种组织切片。 

先前还在食蟹猴中评价了ch5D12的安全性和耐受性，其中每周施用ch5D12共4周在全部猴中都显示是安全的，没有任何副作用。在本研究中，获得功能性证据证明ch5D12能够阻止B细胞活化和增殖²⁷。利用一个时间更长的方案对PG102重复了安全性研究。简单来说，设计了一个在食蟹猴中13周的静脉内毒性研究，恢复期为14周，利用3个剂量水平(0、25和100mg/kg i.v.)和26只猴(每个治疗组6只猴(3M，3F)，另外每个积极治疗组加4只猴(2M，2F)作为恢复组)。完成下列检测：TK，抗PG102应答，流式细胞术(包括PBMC的CD40包被)，淋巴结活检和标准毒理学评价如血液学和免疫组织化学。 

该研究结果显示对于被测的任何剂量水平都没有观察到毒性。PG102是安全的并被良好耐受。 

总的来说，这些研究证明拮抗性抗人CD40Mab PG102与其亲代抗体ch5D12(PG100)一样没有出乎意料的交叉反应，在体内是安全的并被良好耐受。 

表1.各组基本统计数据 

BMI，体重指数；CDAI，克罗恩病活性指数；CDEIS，克罗恩病内窥镜严重性指数 

表2.ch5D12治疗后克罗恩病活件指数评分的降低 

^ach5D12输注后的28天观察期间CDAI的最大降低 

^b症状减轻被定义为总CDAI评分≤150并且降低＞100。 

^c所有受试者都显示CDAI评分的降低，除了受试者010(1.0mg/kg群组)。 

该受试者筛查评分为241.4，而CDAI评分从没有低于筛查时得到的值。CDAI，克罗恩病活性指数。 

表3.免疫组织化学评分^a

淋巴细胞结果：0＝筛查时，28＝第28天。NS.无样品 

a用识别所有T淋巴细胞(CD3)、T辅助细胞(CD4)、细胞毒性T细胞(CD8)、 

B细胞(CD19)和巨噬细胞(CD68)的抗体染色所有提供的活检。来自非炎症组织的回肠和结肠的CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺、CD19⁺和CD68⁺的值是单阳性的(+)。 

表4 

引物        序列5′-3′ 

Q5E         ctcccaggttaagcttgaggagtctggacctgg 

Q5Erev      ccaggtccagactcctcaagcttaacctgggag 

K13A        gacctggcctggtggcaccctcagagaccc 

K13Arev     gggtctctgagggtgccaccaggccaggtc 

E16Q        cctggtgaaaccctcacagaccctgtccatcac 

E16Qrev     gtgatggacagggtctgtgagggtttcaccagg 

T17S        gtgaaaccctcagagagcctgtccatcacatgc 

T17Srev     gcatgtgatggacaggctctctgagggtttcac 

I29L        gcactgtctctgggttctcactctccagatatagtgtatac 

I29Lrev     gtatacactatatctggagagtgagaacccagagacagtgc 

I37V        gatatagtgtatactgggttcgccagcctccagg 

I37Vrev     cctggaggctggcgaacccagtatacactatatc 

P45L        cctccaggaaagggtctggagtggatgggaatg 

P45Lrev     cattcccatccactccagaccctttcctggagg 

M48L        gggtccggagtggctgggaatgatgtg 

M48Lrev     cacatcattcccagccactccggaccc 

STS60NSA    gtggtggttccacagactataattcagctctcaaatccagactgacc 

STS60NSArev ggtcagtctggatttgagagctgaattatagtctgtggaaccaccac 

T68S        ctcaaatccagactgagcatcagcaaggacacc 

T68Srev     ggtgtccttgctgatgctcagtctggatttgag 

S79F        cacctcgaagagccaggtcttcttaaaaatgaacagtctgc 

S79Frev     gcagactgttcatttttaagaagacctggctcttcgaggtg 

T108S       gggtcaaggaacctcggtcaccgtctc 

T108Srev    gagacggtgaccgaggttccttgaccc 

诱变寡核苷酸。用于在第5，13，16，17，29，37，45，48，60，68，79和108位氨基酸引入突变的寡核苷酸。对于每个位置，有义和反义(“rev”)寡核苷酸是必需的。 

表5 

         FACS      ELISA      比例 

变体     MFI       ng/ml 

Q5E      39        444        20 

K13A     31        267        12 

E16Q     39        420        19 

T17S     33        482        22 

P45L     82        566        26 

M48L     80        525        24 

STS60NSA 62        308        14 

T68S     35        295        13 

S79F     96        869        40 

T108S    99        648        30 

CH5D12   103       2187        

DI5D12   50        392        18 

模拟     11        n.d. 

空白     10        n.d. 

通过FACS和定量ELISA测得的表达数据概述。对于每个5D12变体(Q5E，K13A，E16Q，T17S，I29L，I37V，P45L，M48L，STS60NSA，T68S，S79F和T108S)以及ch5D12和DI5D12，显示MFI值(通过FACS测定)和收获上清中的抗体浓度(通过ELISA测定)。还显示模拟转染和培养基对照的MFI值。通过ELISA数据与ch5D12值(定为100％)的比较计算比例。 

表6：诱变寡核苷酸。用于在第29和37位氨基酸引入突变的寡核苷酸。列出有义和反义(rev)寡核苷酸。 

引物	序列5′-3′
		I29V  I29Vrev  I29L  I29Lrev  I37L  I37Lrev  I37V  I37Vrev	gcactgtctctgggttctcagtctctagatatagtgtatac gtatacactatatctagagactgagaacccagagacagtgc gcactgtctctgggttctcactctccagatatagtgtatac gtatacactatatctggagagtgagaacccagagacagtgc gatatagtgtatactggctgcgccagcctccagg cctggaggctggcgcagccagtatacactatatc gatatagtgtatactgggttcgccagcctccagg cctggaggctggcgaacccagtatacactatatc

表7：双重突变体的产生需要2轮诱变。下面列出用于产生其他DI5D12变体的步骤1和步骤中分别使用的引物组。

突变体	步骤1	步骤2
PG102[29L-37I(LI)]	I29L+I29Lrev	n.a.
			29I-37V(IV)	I37V+I37Vrev	n.a.
29V-37I(VI)	I29V+I29Vrev	n.a.
			29I-37L(IL)	I37L+I37Lrev	n.a.
29V-37V(VV)	I29V+I29Vrev	I37V+I37Vrev
			29L-37L(LL)	I29L+I29Lrev	I37L+I37Lrev
29V-37L(VL)	I29V+I29Vrev	I37L+I37Lrev
			29L-37V(LV)	I29L+I29Lrev	I37V+I37Vrev

表8.通过定量ELISA测得的表达数据。对于每个其他5D12变体(29I-37V，29V-37I，29I-37L，29V-37V，29L-37L，29V-37L和29L-37V)以及ch5D12(PG100)、DI5D12和PG102(I29L变体)，显示收获上清中的抗体浓度。

变体	名称	ELISA(ng/ml)
			29L-37V	ch5D12(PG100)	2846
29I-37I	DI5D12	587
			29L-37I	PG102	2226
29I-37V		1728
			29V-37I		928
29I-37L		729
			29V-37V		2027
29L-37L		1115
			29V-37L		891
29L-37V		4263

表9：在CDACF补料分批摇瓶培养中CHO细胞系的生长&生产力数据的概述 

表10：GP-HPLC分析(包括LMWC) 

ND＝未检测到 

表11：GP-HPLC分析(只有IgG产物) 

ND＝未检测到 

抗CD40mAb(批次)	-log IC50	n
			ch5D12(PG100)(第1批)	5.74±0.14	4
ch5D12(PG100)(第2批)	5.64±0.01	2
			ch5D12(PG100)(第3批)	5.55±0.06	2
ch5D12(PG100)(第4批)	5.63±0.02	2
			PG102(第1批)	5.85±0.12	4
PG102(第2批)	5.76±0.11	4

表12：计算出的对ch5D12(PG100)和PG102结合JY细胞的抗独特型介导的抑制的-logIC50的概述。数据表示n次测定的平均值±平均值标准误。用任意测试抗体批次的抗独特型的抑制效力不存在显著差异(p＞0.05，ANOVA继之以多重比较的Tukey′s检验)。 

抗CD40mAb(批次)	-log半最大结合浓度	n
			ch5D12(PG100)(第1批)	7.54±0.03	4
ch5D12(PG100)(第2批)	7.53±0.02	2
			ch5D12(PG100)(第3批)	7.48±0.10	2
ch5D12(PG100)(第4批)	7.37±0.10	2
			PG102(第1批)	7.45±0.04	4
PG102(第2批)	7.47±0.04	4

表13.计算出的ch5D12(PG100)和PG102结合人CD40-Fc的-log半最大结合浓度值的概述，通过ELISA测定。数据表示n次测定的平均值±平均值标准误。被检测的任意抗体批次的结合不存在显著差异(p＞0.05，ANOVA继之以多重比较的Tukey′s检验)。作为参考，7.45的-log半最大结合浓度对应于大约35ng/ml(～200pmol)的浓度。 

抗CD40mAb(批次)	-log半最大结合浓度	n
			ch5D12(PG100)(第1批)	7.26	2
ch5D12(PG100)(第2批)	7.34	2
			ch5D12(PG100)(第3批)	7.49	2
ch5D12(PG100)(第4批)	7.59	2
			PG102(第1批)	7.44	2
PG102(第2批)	7.48	2

表14：计算出的ch5D12(PG100)和PG102结合表达人CD40的JY细胞的-log半最大结合浓度值的概述，通过ELISA测定。数据是两次测定的平均值。作为参考，7.45的-log半最大结合浓度对应于大约35ng/ml(～200pmol)的浓度。 

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Claims (19)

1.一种抗CD40抗体，其包括轻链可变区和重链可变区，其中重链可变区由如下氨基酸序列组成：

1           11          21         31

|           |           |           |

QVKLQ ESGPG LVKPS ETLSI TCTVS GFSX₁S RYSVY WX₂RQP

41            51          61         71

|             |           |           |

PGKGX₃ EWX₄GM MWGGG STDYS TSLKS RLTIS KDTSK

       81          91          101         111

       |           |           |           |

SQVX₅L KMNSL RTDDT AMYYC VRTDG DYWGQ GTTVT VSS；以及所述轻链可变区由如下氨基酸序列组成：

1           11             21          31

|           |              |           |

ELQLT QSPLS LPVX₆L GX₇X₈AS ISCRS SQSLX₉ NSNGN TYLHW

41         51           61         71

|          |            |          |

YLQRP GQSPR LLIYK VSNRF SGVPD RFSGS GSGTD FTLKI

81            91           101         111

|             |            |           |

SRVEA EDX₁₀GV YX₁₁CSQ STHVP WTFGG GTKLE IKR

其中：

X₁是V且X₂是I；

X₁是I且X₂是L；

X₁是I且X₂是V；

X₁是V且X₂是L；

X₁是L且X₂是I；

X₁是V且X₂是V；

X₁是L且X₂是L；或

X₁是L且X₂是V；并且

X₃是P;X₄是M;X₅是S；X₆是T;X₇是Q;X₈是P;X₉是A;X₁₀是V

和X₁₁是Y。

2.如权利要求1所述的抗体，其中：

X₁是I和X₂是V;

X₁是L和X₂是I;

X₁是V和X₂是V;

X₁是L和X₂是L;或

X₁是L和X₂是V。

3.如权利要求1或2所述的抗体，包括人类抗体的恒定区。

4.如权利要求3所述的抗体，其中所述人类抗体的恒定区是IgG恒定区。

5.如权利要求3或4所述的抗体，其中所述恒定区是补体激活缺陷的区域。

6.如权利要求5所述的抗体，其中所述恒定区选自人IgG₄恒定区或者突变的人IgG₁恒定区。

7.一种核酸，其编码权利要求1-6任一所述的抗体。

8.一种细胞，包括权利要求1-6任一所述的抗体或权利要求7的核酸。

9.如权利要求8所述的细胞，其产生所述抗体。

10.如权利要求8或者9所述的细胞，其是杂交瘤细胞、中国仓鼠卵巢细胞、NS0细胞或者PER-C6^TM细胞。

11.一种细胞培养物，包括权利要求8-10任一所述的细胞。

12.一种制备抗体的方法，包括培养如权利要求8-10任一所述的细胞并从所述培养物中收集所述抗体。

13.一种通过权利要求12所述方法获得的抗体。

14.如权利要求13所述的抗体，其是纯化的。

15.一种药物组合物，包括权利要求1-6、13-14任一所述的抗体、权利要求7所述的核酸和/或权利要求8-10所述的细胞。

16.用作药物的权利要求1-6、13-14任一所述的抗体。

17.用作药物的权利要求7所述的核酸。

18.用作药物的权利要求8-10任一所述的细胞。

19.权利要求1-6、13-14任一所述的抗体在制备用于改善自身免疫性疾病和/或炎性病症的症状的药物中的用途，其中所述自身免疫性疾病和/或炎性病症是炎症性肠病，并且所述炎症性肠病是克罗恩病(CD)。

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