KR102500401B1 - 항 Orai1 항체 - Google Patents

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다이치 바바
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다카시 가가리
안리 아키
노부미 나가오카
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Abstract

인간 Orai1 을 표적으로 하는, 이식물의 거절, 면역 질환, 알레르기성 질환, 염증성 질환, 혈전, 암 등의 치료 및/또는 예방제를 제공하는 것에 있다. 인간 Orai1 을 특이적으로 인식하고, 인간 T 세포 활성화를 억제하는 활성을 갖는 항체를 포함하는 의약 조성물의 제공 등.

Description

항 Orai1 항체{ANTI-ORAI1 ANTIBODY}
본 발명은 장해 및 질환을 치료하기 위한, 보다 강 활성의 항 Orai1 항체 취득에 관한 것이다.
칼슘 방출 활성화 칼슘 (CRAC) 채널은, 세포 내 소포체 중의 칼슘 스토어의 고갈에 반응하여 열리는 스토어 감수성 채널 (SOC) 의 서브 세트로서, 특정한 비흥분성 세포, 특히 T 세포나 비만 세포를 포함하는 면역계의 세포에 있어서, 세포 외 칼슘의 유입과 거기에 수반하는 세포의 활성화를 담당하고 있다. CRAC 채널 활성의 저해제는 당해 기술 분야에서 공지이고, 그것들의 동정 및 치료 가능성은, Feske 등에 의해 기재되어 있다 (비특허문헌 1 - 2).
Orai1 (CRACM1 : 칼슘 방출-활성화 칼슘 모듈레이터 1, 막 관통 단백 142A : TMEM142A) 은, 301 아미노산 잔기로 이루어지는 4 회 막 관통형의 단백질로, 호모 4 량체를 형성함으로써 CRAC 채널의 구멍 서브 유닛을 구성하는 성분으로서 특정되어 있다 (특허문헌 1, 비특허문헌 3 - 5). 인간 Orai1 유전자는 90 ％ 이상의 상동성을 가지는 인간 Orai2 및 인간 Orai3 과 함께 Orai 유전자 패밀리를 구성하고 있고 (비특허문헌 6), 일부의 경우에 있어서는 Orai2 및/또는 Orai3 단백과 Orai1 을 함유하는 헤테로 4 량체나 6 량체가 형성될 가능성도 보고되어 있다 (비특허문헌 7 - 8). Orai1 은, 세포 내 소포체 중의 칼슘 스토어 고갈을 감지하는 단백인 STIM-1 (Stromal interaction molecule 1) 또는 STIM-2 와 공액하는 N 말단 및 C 말단의 세포질 내 영역, 4 개 지점의 세포막 관통 도메인, 그리고 약 20 아미노산 잔기로 이루어지는 제 1 세포 외 루프 도메인과 약 40 아미노산 잔기로 이루어지는 제 2 세포 외 루프 도메인으로 구성되어 있다 (비특허문헌 9). Orai1 의 DNA 배열 및 아미노산 배열은 공적 데이터베이스 상에 공개되어 있고, 예를 들어 NM＿032790, NP＿116179 (NCBI) 등의 액세션 번호에 의해 참조 가능하다.
인간 Orai1 유전자의 선천적인 기능 결손에 의해, CRAC 채널 활성을 잃고, 면역원에 대한 생체의 반응이 소실되어, 중증의 면역 부전 상태에 빠지는 것이 나타나 있는 점에서, Orai1 의 분자 기능은 CRAC 채널의 활성화에 필수인 것으로 특정되어 있다 (비특허문헌 10 - 11). 따라서 Orai1 분자를 표적으로 한 기능 저해 항체는 CRAC 채널 활성의 저해제가 될 수 있다.
CRAC 채널 활성의 저해제가 면역 질환, 알레르기성 질환, 염증성 질환, 세포나 장기의 이식 거절, 혈전, 암 등의 환자를 치료하기 위해서 사용될 수 있는 것을 시사하는 정보로부터 (비특허문헌 12), Orai1 의 분자 기능 저해를 목표로 한 항 Orai1 항체의 취득이 시도되어, 그 효과가 검토되어 있다 (특허문헌 2 - 3, 비특허문헌 13 - 14). 이들은 항체 단독으로 T 세포의 활성화를 억제하는 것을 나타내고 있지만, 그 저해 활성 강도는 아직 충분하지 않아, Orai1 을 표적으로 하는 생물 제제로서 임상 적용하는 경우에는, 높은 용량이나 수회 투여가 필요하거나, 혹은 투여 방법이 한정되는 등의 점에 있어서 미충족 의료 니즈가 존재하는 것으로 생각된다.
국제 공개 제WO07/081804호 팜플렛 국제 공개 제WO11/063277호 팜플렛 국제 공개 제WO13/091903호 팜플렛
Feske S, Nature Rev. Immunol. 7, p.690 - 702(2007) Derler I, et al., Expert Opin. Drug Discovery 3(7), p.787 - 800(2008) Prakriya M, et al., Nature 443, p.230 - 233(2006) Vig M, et al., Science 312, p.1220 - 1223(2006) Park CY, et al., Cell 136, p.876 - 890(2008) Mercer JC, et al., J. Biol. Chem. 281, p.24979 -24990(2006) Gwack Y, et al., J. Biol. Chem. 282, p.16232 - 16243(2007) Hou X, et al., Science 338, p.1308 - 1313(2012) Vig M, et al., Curr. Biol. 16, p.2073 - 2079(2006) Feske S, Nature 441, p.179 - 185(2006) McCarl CA, et al., J. Allergy Clin. Immunol. 124, p.1311 - 1318(2009) McCarl CA, et al., J. Immunol. 185, p.5845 - 5858(2010) Lin F, et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 345, p.225 -238(2013) Cox JH, et al., PLOS ONE 8(12), e82944(2013)
본 발명의 목적은, 이식물의 거절, 면역 질환, 알레르기성 질환, 염증성 질환, 혈전, 암 등의 치료 및/또는 예방제를 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은, 이식물의 거절, 면역 질환, 알레르기성 질환, 염증성 질환, 혈전, 암의 치료 및/또는 예방 효과를 갖는 물질을 탐색하는 목적으로, 래트 항 Orai1 항체를 취득하였다. 얻어진 래트 항 Orai1 항체를 인간화하고, 또한 당해 인간화 항체의 CDR, 프레임 워크 및 가변 영역을 개변하여 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명은, 이하의 발명을 포함한다.
(1) 배열 번호 2 에 기재된 아미노산 배열에 특이적으로 결합하고, 중사슬 배열이, CDRH1, CDRH2, CDRH3 을 갖는 가변 영역을 포함하고, 상기 CDRH1 은 배열 번호 102 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRH2 는 배열 번호 104, 106, 107 또는 108 의 어느 1 개에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRH3 은, 배열 번호 109 또는 110 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것 ; 및
경사슬 배열이 CDRL1, CDRL2, CDRL3 을 갖는 가변 영역을 포함하고, 상기 CDRL1 은 배열 번호 93, 94 또는 95 의 어느 1 개에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRL2 는 배열 번호 96, 97 또는 98 의 어느 1 개에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRL3 은, 배열 번호 101 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것 ;
을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(2) 중사슬 배열이, CDRH1, CDRH2, CDRH3 을 갖는 가변 영역을 포함하고, 상기 CDRH1 은 배열 번호 102 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRH2 는 배열 번호 106 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRH3 은, 배열 번호 110 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것 ; 및
경사슬 배열이 CDRL1, CDRL2, CDRL3 을 갖는 가변 영역을 포함하고, 상기 CDRL1 은 배열 번호 93 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRL2 는 배열 번호 96 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRL3 은, 배열 번호 101 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것 ;
을 특징으로 하는 (1) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(3) 중사슬 배열이, CDRH1, CDRH2, CDRH3 을 갖는 가변 영역을 포함하고, 상기 CDRH1 은 배열 번호 102 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRH2 는 배열 번호 106 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRH3 은, 배열 번호 110 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것 ; 및
경사슬 배열이 CDRL1, CDRL2, CDRL3 을 갖는 가변 영역을 포함하고, 상기 CDRL1 은 배열 번호 94 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRL2 는 배열 번호 97 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRL3 은, 배열 번호 101 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것 ;
을 특징으로 하는 (1) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(4) 중사슬 배열이, CDRH1, CDRH2, CDRH3 을 갖는 가변 영역을 포함하고, 상기 CDRH1 은 배열 번호 102 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRH2 는 배열 번호 106 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRH3 은, 배열 번호 110 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것 ; 및
경사슬 배열이 CDRL1, CDRL2, CDRL3 을 갖는 가변 영역을 포함하고, 상기 CDRL1 은 배열 번호 95 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRL2 는 배열 번호 98 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRL3 은, 배열 번호 101 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것 ;
을 특징으로 하는 (1) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(5) 중사슬 배열이, CDRH1, CDRH2, CDRH3 을 갖는 가변 영역을 포함하고, 상기 CDRH1 은 배열 번호 102 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRH2 는 배열 번호 107 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRH3 은, 배열 번호 110 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것 ; 및
경사슬 배열이 CDRL1, CDRL2, CDRL3 을 갖는 가변 영역을 포함하고, 상기 CDRL1 은 배열 번호 93 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRL2 는 배열 번호 96 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRL3 은, 배열 번호 101 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것 ;
을 특징으로 하는 (1) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(6) 중사슬 배열이, CDRH1, CDRH2, CDRH3 을 갖는 가변 영역을 포함하고, 상기 CDRH1 은 배열 번호 102 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRH2 는 배열 번호 108 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRH3 은, 배열 번호 110 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것 ; 및
경사슬 배열이 CDRL1, CDRL2, CDRL3 을 갖는 가변 영역을 포함하고, 상기 CDRL1 은 배열 번호 93 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRL2 는 배열 번호 96 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRL3 은, 배열 번호 101 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것 ;
을 특징으로 하는 (1) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(7) 중사슬 배열이, CDRH1, CDRH2, CDRH3 을 갖는 가변 영역을 포함하고, 상기 CDRH1 은 배열 번호 102 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRH2 는 배열 번호 104 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRH3 은, 배열 번호 109 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것 ; 및
경사슬 배열이 CDRL1, CDRL2, CDRL3 을 갖는 가변 영역을 포함하고, 상기 CDRL1 은 배열 번호 93 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRL2 는 배열 번호 96 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRL3 은, 배열 번호 101 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것 ;
을 특징으로 하는 (1) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(8) 배열 번호 62 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 136 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역 배열 및 배열 번호 56 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 126 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 가변 영역 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 (1) 또는 (2) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(9) 배열 번호 62 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 465 번째 또는 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 배열 및 배열 번호 56 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 배열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 (8) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(10) 배열 번호 70 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 465 번째 또는 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 배열 및 배열 번호 56 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 배열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 (8) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(11) 배열 번호 62 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 136 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역 배열 및 배열 번호 58 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 126 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 가변 영역 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 (1) 또는 (3) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(12) 배열 번호 62 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 465 번째 또는 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 배열 및 배열 번호 58 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 배열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 (11) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(13) 배열 번호 62 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 136 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역 배열 및 배열 번호 60 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 126 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 가변 영역 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 (1) 또는 (4) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(14) 배열 번호 62 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 465 번째 또는 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 배열 및 배열 번호 60 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 배열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 (13) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(15) 배열 번호 64 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 136 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역 배열 및 배열 번호 56 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 126 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 가변 영역 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 (1) 또는 (5) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(16) 배열 번호 64 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 465 번째 또는 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 배열 및 배열 번호 56 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 배열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 (15) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(17) 배열 번호 66 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 136 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역 배열 및 배열 번호 56 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 126 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 가변 영역 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 (1) 또는 (6) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(18) 배열 번호 66 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 465 번째 또는 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 배열 및 배열 번호 56 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 배열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 (17) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(19) 배열 번호 43 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 136 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역 배열 및 배열 번호 56 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 126 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 가변 영역 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 (1) 또는 (7) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(20) 배열 번호 43 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 465 번째 또는 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 배열 및 배열 번호 56 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 235 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 배열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 (19) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(21) Fab, F(ab')2, Fab' 및 Fv 로 이루어지는 군에서 선택되는, (1) 내지 (20) 의 어느 1 개에 기재된 항체의 항원 결합성 단편.
(22) scFv 인 것을 특징으로 하는, (1) 내지 (8), (11), (13), (15), (17) 또는 (19) 의 어느 1 개에 기재된 항체.
(23) (1) 내지 (22) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편의 적어도 어느 1 개를 함유하는 것을 특징으로 하는, 의약 조성물.
(24) 이식물의 거절, 면역 관련 질환, 알레르기성 질환, 염증성 질환, 암의 치료 및/또는 예방제, 항혈소판 또는 항혈전 활성제, Orai1 발현 세포 활성화 억제제인 것을 특징으로 하는, (23) 에 기재된 의약 조성물.
(25) 이식물의 거절이, 심장, 신장, 간장, 골수, 피부 등의 장기 혹은 조직의 이식에 대한 거절 반응 및 숙주 대 이식편 반응, 그리고 조혈 세포 (골수, 말초혈, 제대혈 등) 의 이식에 의해 발생하는 이식편 대 숙주병인 것을 특징으로 하는, (24) 에 기재된 의약 조성물.
(26) 면역 관련 질환이, 결합 조직이나 근골격계 (관절 류머티즘, 강직성 척추염, 전신성 에리테마토수스, 강피증, 다발 근염, 피부 근염 등), 혈액계 (재생 불량성 빈혈, 특발성 혈소판 감소성 자반병 등), 소화기계 (크론병, 궤양성 대장염 등), 신경계 (다발성 경화증, 중증 근무력증 등), 시각계 (포도막염 등), 혈관계 (베체트병, 베게너 육아종증 등), 표피계 (건선, 천포창, 백반 등), 내분비계 (1 형 당뇨병, 자기 면역 갑상선염, 바세도우병, 하시모토병 등) 등인 것, 알레르기성 질환이 아토피성 피부염, 천식, 아나필락시스, 아나필락시스 유사 반응, 음식 알레르기, 비염, 중이염, 약물 반응, 곤충 자상 반응, 식물 반응, 라텍스 알레르기, 결막염, 두드러기 등인 것, 염증성 질환이 염증성 신장 질환 (사구체신염, 네프로제 등), 염증성 폐질환 (만성 폐색성 폐질환, 낭포성 섬유증, 간질성 폐렴 등), 염증성 장 질환 (궤양성 대장염, 회장염 등), 염증성 간질환 (자기 면역 간염, 바이러스 간염 등), 염증성 심 질환 (심근염, 허혈성 심질환, 아테롬성 동맥 경화증 등), 염증성 피부 질환 (접촉성 피부염, 습진 등), 염증성 안질환 (트라코마, 안내염 등), 염증성 중추 신경 질환 (수막염, 뇌척수염, 자기 면역 뇌염 등), 관절의 염증성 질환 (예를 들어 관절염, 골관절염 등), 전신성 염증 (패혈증, 출혈, 과민증, 암 화학 요법 등에서 기인하는 쇼크 증상 등) 등인 것을 특징으로 하는, (24) 에 기재된 의약 조성물.
(27) 암의 치료 및/또는 예방이 유방암, 폐암, 피부암, 백혈병 등인 것, 항혈소판 또는 항혈전 활성이 치료 및/또는 예방에 도움이 되는 예가 심근경색, 뇌졸중, 허혈성 심질환, 혈전증 등인 것, Orai1 발현 세포 활성화 억제가 치료 및/또는 예방에 도움이 되는 예가 매스트 세포 백혈병, 매스트 세포증, 호염기성 백혈병, 자궁 내막증, 소관 집합성 마이오패티, 스토르모르켄증, 관절 류머티즘, 강직성 척추염, 아토피성 피부염 등인 것을 특징으로 하는, (24) 에 기재된 의약 조성물.
(28) (1) 내지 (22) 의 어느 1 개에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
(29) (28) 에 기재된 어느 1 개의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
(30) (28) 에 기재된 어느 1 개의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질 전환 숙주 세포.
(31) (29) 에 기재된 벡터를 포함하는 형질 전환 숙주 세포.
(32) (30) 또는 (31) 에 기재된 숙주 세포를 배양하고, 배양 산물로부터 항체를 정제하는 공정을 포함하는 (1) 내지 (22) 의 어느 1 개에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편의 생산 방법.
(33) 배열 번호 2 에 기재된 아미노산 배열에 특이적으로 결합하고, PMA 및 A23187 처리된 Jurkat 세포가 방출하는 IL-2 량을 50 ％ 저해하는 농도가 80 ng/㎖ 이하인 것을 특징으로 하는, 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(34) PMA 및 A23187 처리된 Jurkat 세포가 방출하는 IL-2 량을 50 ％ 저해하는 농도가 10 ng/㎖ 이하인 것을 특징으로 하는, (33) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(35) 배열 번호 2 에 기재된 아미노산 배열에 특이적으로 결합하고, PMA 및 A23187 처리된 인간 말초혈 단핵구 (PBMC) 가 방출하는 IL-2 량을 50 ％ 저해하는 농도가 100 ng/㎖ 이하인 것을 특징으로 하는, 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(36) PMA 및 A23187 처리된 인간 PBMC 가 방출하는 IL-2 량을 50 ％ 저해하는 농도가 20 ng/㎖ 이하인 것을 특징으로 하는, (35) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(37) 배열 번호 2 에 기재된 아미노산 배열에 특이적으로 결합하고, PMA 및 A23187 처리된 인간 PBMC 가 방출하는 IFN-γ 량을 50 ％ 저해하는 농도가 800 ng/㎖ 이하인 것을 특징으로 하는, 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(38) PMA 및 A23187 처리된 인간 PBMC 가 방출하는 IFN-γ 량을 50 ％ 저해하는 농도가 40 ng/㎖ 이하인 것을 특징으로 하는, (37) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
본 발명에 의하면, CRAC 채널의 활성 저해를 작용 기전으로 하는, 이식물의 거절, 면역 질환, 알레르기성 질환, 염증성 질환, 혈전, 암의 치료제 및/또는 예방제를 얻을 수 있다.
도 1 은 R118 및 R198 이, pcDNA3.1-hOrai1 도입 HEK293T 세포에 농도 의존적으로 결합하는 것을 나타낸 도면이다.
도 2 는 R118 및 R198 이, PMA 및 A23187 처리된 Jurkat 세포로부터의 IL-2 의 방출을 첨가 농도 의존적으로 억제하는 것을 나타낸 도면이다.
도 3 은 cR118 및 cR198 이, pcDNA3.1-hOrai1 도입 HEK293T 세포에 농도 의존적으로 결합하는 것을 나타낸 도면이다.
도 4 는 cR118 및 cR198 이, PMA 및 A23187 처리된 Jurkat 세포로부터의 IL-2 의 방출을 첨가 농도 의존적으로 억제하는 것을 나타낸 도면이다.
도 5 는 인간화 항인간 Orai1 항체 hR198＿H1/L1, hR198＿H2/L2, hR198＿H3/L3, hR198＿H4/L4 가, 모항체인 cR118, cR198 과 동일하게, pcDNA3.1-hOrai1 도입 HEK293T 세포에 농도 의존적으로 결합하는 것을 나타낸 도면이다.
도 6 은 인간화 항인간 Orai1 항체가, PMA 및 A23187 처리된 Jurkat 세포로부터의 IL-2 의 방출을 첨가 농도 의존적으로 억제하는 것을 나타낸 도면이다.
도 7 은 리보솜 디스플레이에 의해 얻어진 변이 도입 Fab 클론 LCDR60, LCDR67, LCDR83, CE151, PE057, HCDR046, HCDR047, HEP087, HEP124 및 HEP237 이, 모항체 Fab 인 hR198＿H4/L4-Fab 와 비교하여, pcDNA3.1-hOrai1 도입 HEK293T 세포에 강하게 결합하는 것을 나타낸 도면이다.
도 8 은 어피니티 매츄레이션 항체 hR198＿H3/LG1, hR198＿HG1/LG1, hR198＿HG1/LG2, hR198＿HG1/LG3, hR198＿HG2/LG1 및 hR198＿HG3/LG1 이, 모항체인 hR198＿H3/L3 및 hR198＿H4/L4 와 비교하여, pcDNA3.1-hOrai1 도입 HEK293T 세포에 동등 이상으로 결합하는 것을 나타낸 도면이다.
도 9 는 어피니티 매츄레이션 항체가, PMA 및 A23187 처리된 Jurkat 세포로부터의 IL-2 의 방출을 첨가 농도 의존적으로 억제하는 것을 나타낸 도면이다.
도 10 은 10F8, 14F74, 17F6 항체가, pcDNA3.1-hOrai1 도입 HEK293T 세포에 결합하는 것을 나타낸 도면이다.
도 11 은 hR198＿HG1/LG1, hR198＿HG1-LALA/LG1, 2C1.1, 및 5H3.1 항체가, pcDNA3.1-hOrai1 도입 HEK293T 세포에 결합하는 것을 나타낸 도면이다.
도 12 는 항 Orai1 모노클로날 항체가, PMA 및 A23187 처리된 Jurkat 세포로부터의 IL-2 의 방출을 첨가 농도 의존적으로 억제하는 것을 나타낸 도면이다.
도 13 은 hR198＿HG1/LG1, hR198＿HG1-LALA/LG1, 2C1.1, 5H3.1, 10F8, 14F74, 및 17F6 의 Jurkat 세포로부터의 IL-2 방출에 대한 반수 저해 농도 (IC50) 및 80 ％ 저해 농도 (IC80) 를 나타낸 도면이다.
도 14 는 R118 경사슬 가변 영역을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 그 가변 영역의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 15 는 R118 중사슬 가변 영역을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 그 가변 영역의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 16 은 R198 경사슬 가변 영역을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 그 가변 영역의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 17 은 R198 중사슬 가변 영역을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 그 가변 영역의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 18 은 인간 키메라화 cR118 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 그 경사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 19 는 인간 키메라화 cR198 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 그 경사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 20 은 인간 키메라화 cR118 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 그 중사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 21 은 인간 키메라화 cR198 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 그 중사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 22 는 hR198＿L1 타입 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 그 경사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 23 은 hR198＿L2 타입 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 그 경사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 24 는 hR198＿L3 타입 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 그 경사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 25 는 hR198＿L4 타입 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 그 경사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 26 은 hR198＿H1 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 그 중사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 27 은 hR198＿H2 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 그 중사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 28 은 hR198＿H3 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 그 중사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 29 는 hR198＿H4 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 그 중사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 30 은 hR198＿LG1 타입 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 그 경사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 31 은 hR198＿LG2 타입 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 그 경사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 32 는 hR198＿LG3 타입 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 그 경사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 33 은 hR198＿HG1 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 그 중사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 34 는 hR198＿HG2 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 그 중사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 35 는 hR198＿HG3 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 그 중사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 36 은 hR198＿H4-LALA 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 그 중사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 37 은 hR198＿HG1-LALA 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 그 중사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 38 은 cR118, cR198, hR198＿L1 내지 L4 및 hR198＿LG1 내지 Lg3 의 각 경사슬, 그리고 cR118, cR198, hR198＿H1 내지 H4, hR198＿HG1 내지 HG3, hR198＿H4-LALA 및 hR198＿HG1-LALA 의 각 중사슬에 포함되는 CDR 배열과 대응하는 배열 번호를 나타낸 도면이다.
도 39 는 2C1.1 항체 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 그 중사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 40 은 2C1.1 항체 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 그 경사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 41 은 5H3.1 항체 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 그 중사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 42 는 5H3.1 항체 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 그 경사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 43 은 10F8 항체 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 그 중사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 44 는 10F8 항체 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 그 경사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 45 는 14F74 항체 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 그 중사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 46 은 14F74 항체 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 그 경사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 47 은 17F6 항체 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 그 중사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 48 은 17F6 항체 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 그 경사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 49 는 hR198＿H0 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 그 중사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 50 은 hR198＿H5 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 그 중사슬의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 51 은 항 Orai1 모노클로날 항체가, PMA 및 A23187 처리된 인간 PBMC 로부터의 IL-2 의 방출을 첨가 농도 의존적으로 억제하는 것을 나타낸 도면이다.
도 52 는 hR198＿HG1/LG1, hR198＿HG1-LALA/LG1, 2C1.1, 5H3.1, 10F8, 14F74, 및 17F6 의 인간 PBMC 로부터의 IL-2 방출에 대한 반수 저해 농도 (IC50) 및 80 ％ 저해 농도 (IC80) 를 나타낸 도면이다.
도 53 은 항 Orai1 모노클로날 항체가, PMA 및 A23187 처리된 인간 PBMC 로부터의 IFNγ 의 방출을 첨가 농도 의존적으로 억제하는 것을 나타낸 도면이다.
도 54 는 hR198＿HG1/LG1, hR198＿HG1-LALA/LG1, 2C1.1, 5H3.1, 10F8, 14F74, 및 17F6 의 인간 PBMC 로부터의 IFNγ 방출에 대한 반수 저해 농도 (IC50) 및 80 ％ 저해 농도 (IC80) 를 나타낸 도면이다.
도 55 는 중증 복합 면역 부전 마우스에 인간 PBMC 를 이입함으로써 발병하는 이식편 대 숙주병에 수반하는 체중 감소를 hR198＿HG1/LG1 이 억제하는 것을 나타낸 도면이다.
도 56 은 인간 Orai1 노크인 마우스에 유도한 수동 피부 아나필락시스 반응을 hR198＿HG1/LG1 이 억제하는 것을 나타낸 도면이다.
도 57 은 인간 Orai1 노크인 마우스에 유도한 지연형 과민 반응을, 항원 투여 후 6 시간 (A) 24 시간 (B) 48 시간 (C) 의 각 시점에서 hR198＿HG1/LG1 이 억제되어 있는 것을 나타낸 도면이다.
도 58 은 hR198＿HG1/LG1, hR198＿H3/LG1, hR198＿HG1-LALA/LG1, 및 2C1.1 항체의 90 ㎎/㎖, 120 ㎎/㎖, 150 ㎎/㎖ 의 각 농도에서 측정한 점도를 나타낸 도면이다.
본 명세서 중에 있어서, 「유전자」 라고 하는 단어에는, DNA 뿐만 아니라 mRNA, cDNA 및 cRNA 도 포함되는 것으로 한다.
본 명세서 중에 있어서, 「폴리뉴클레오티드」 라고 하는 단어는 핵산과 동일한 의미로 사용하고 있고, DNA, RNA, 프로브, 올리고 뉴클레오티드, 및 프라이머도 포함되어 있다.
본 명세서 중에 있어서는, 「폴리펩타이드」 와 「단백질」 은 구별하지 않고 사용하고 있다.
본 명세서 중에 있어서, 「RNA 획분」 이란, RNA 를 포함하고 있는 획분을 말한다.
본 명세서 중에 있어서, 「세포」 에는, 동물 개체 내의 세포, 배양 세포도 포함하고 있다.
본 명세서 중에 있어서, 「Orai1」 은, Orai1 단백질과 동일한 의미로 사용하고 있다.
본 명세서 중에 있어서의 「항체의 항원 결합성 단편」 이란, 항원과의 결합 활성을 갖는 항체의 부분 단편을 의미하고 있고, Fab, F(ab')2, Fv, scFv, diabody, 선상 항체, 및 항체 단편으로부터 형성된 다특이성 항체 등을 포함한다. 또한, F(ab')2 를 환원 조건하에서 처리한 항체의 가변 영역의 1 가의 단편인 Fab' 도 항체의 항원 결합성 단편에 포함된다. 단, 항원과의 결합능을 가지고 있는 한 이들 분자에 한정되지 않는다. 또한, 이들 항원 결합성 단편에는, 항체 단백질의 전체 길이 분자를 적당한 효소로 처리한 것 뿐만 아니라, 유전자 공학적으로 개변된 항체 유전자를 사용하여 적당한 숙주 세포에 있어서 생산된 단백질도 포함된다.
항체 분자의 중사슬 및 경사슬에는 각각 3 개 지점의 상보성 결정 영역 (CDR : Complementarity determining region) 이 있는 것이 알려져 있다. 상보성 결정 영역은, 초가변 영역 (hypervariable region) 이라고도 불리고, 항체의 중사슬 및 경사슬의 가변 영역 내에 있어서, 1 차 구조의 변이성이 특히 높은 부위이고, 중사슬 및 경사슬의 폴리펩타이드 사슬의 1 차 구조 상에 있어서, 각각 3 개 지점으로 분리되어 있다. 본 명세서 중에 있어서는, 항체의 상보성 결정 영역에 대하여, 중사슬의 상보성 결정 영역을 중사슬 아미노산 배열의 아미노 말단측으로부터 CDRH1, CDRH2, CDRH3 이라고 표기하고, 경사슬의 상보성 결정 영역을 경사슬 아미노산 배열의 아미노 말단측으로부터 CDRL1, CDRL2, CDRL3 이라고 표기한다. 이들 부위는 입체 구조로 서로 근접하여, 결합하는 항원에 대한 특이성을 결정하고 있다.
본 발명에 있어서, 「스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈한다」 란, 시판되는 하이브리다이제이션 용액 ExpressHyb Hybridization Solution (CLONTECH 사) 중, 68 ℃ 에서 하이브리다이즈하는 것, 또는, DNA 를 고정시킨 필터를 사용하여 0.7 - 1.0 M 의 NaCl 존재하 68 ℃ 에서 하이브리다이제이션을 실시한 후, 0.1 - 2 배 농도의 SSC 용액 (1 배 농도 SSC 란 150 mM NaCl, 15 mM 시트르산나트륨으로 이루어진다) 을 이용하여, 68 ℃ 에서 세정함으로써 동정할 수 있는 조건 또는 그것과 동등한 조건으로 하이브리다이즈하는 것을 말한다.
본 발명에 있어서, 「숙주 대 이식편 반응」 이란, 장기 이식 후에 관찰되는 피이식자의 면역 항진 상태 및 이에 의한 이식 장기의 상해를 말한다.
본 발명에 있어서, 「이식편 대 숙주병」 이란, 조혈 세포 이식 후의 이식 세포에 의한 피이식자에 대한 면역적 공격에 의해 발병하는 증상을 말한다.
1. Orai1
본 발명에서 사용하는 Orai1 은, 인간, 인간 이외의 포유 동물 (예를 들어, 모르모트, 래트, 마우스, 토끼, 돼지, 양, 소, 원숭이 등) 혹은 닭의 T 세포 혹은 비만 세포로부터 직접 정제하여 사용하거나, 혹은 상기의 세포의 세포막 획분을 조제하여 사용할 수 있고, 또한, Orai1 을 in vitro 에서 합성하거나, 혹은 유전자 조작에 의해 숙주 세포에 생산시키는 것에 의해 얻을 수 있다. 유전자 조작에서는, 구체적으로는, Orai1 cDNA 를 발현 가능한 벡터에 조립한 후, 전사와 번역에 필요한 효소, 기질 및 에너지 물질을 포함하는 용액 중에서 합성하거나, 혹은 다른 원핵 생물, 또는 진핵 생물의 숙주 세포를 형질 전환시키는 것에 의해 Orai1 을 발현시킴으로써, 그 단백질을 얻을 수 있다.
인간 Orai1 의 cDNA 의 뉴클레오티드 배열은, Gen Bank 에 액세션 번호 : NM＿032790 으로 등록되어 있다. 마우스 Orai1 의 cDNA 의 뉴클레오티드 배열은, Gen Bank 에 액세션 번호 : NM＿175423 으로 등록되어 있다. 인간 Orai1 을 코드하는 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 1 에 기재되어 있고, 인간 Orai1 의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 2 에 기재되어 있다. 또한, Orai1 은, Calcium Release-Activated Calcium Modulator 1 (CRACM1) 또는 Transmembrane Protein 142A (TMEM142A) 라고 불리는 경우가 있고, 이들은 모두 동일한 분자를 나타내고 있다.
Orai1 의 cDNA 는 예를 들어, Orai1 의 mRNA 를 발현하고 있는 장기의 cDNA 라이브러리를 주형으로 하여, Orai1 의 cDNA 를 특이적으로 증폭하는 프라이머를 사용하여 폴리머라아제 연쇄 반응 (이하 「PCR」 이라고 한다) (Saiki, R. K., et al., Science, (1988) 239, 487-49) 을 실시하는, 이른바 PCR 법에 의해 취득할 수 있다.
또한, 인간 또는 마우스의 Orai1 을 코드하는 뉴클레오티드 배열과 상보적인 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건으로 하이브리다이즈하고, 또한, Orai1 과 동등한 생물 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드도 Orai1 의 cDNA 에 포함된다. 또한, 인간 혹은 마우스 Orai1 유전자좌로부터 전사되는 스플라이싱 배리언트 또는 스플라이싱 배리언트와 상보적인 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건으로 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드이고, 또한, Orai1 과 동등한 생물 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드도 Orai1 의 cDNA 에 포함된다.
또한, 인간 또는 마우스의 Orai1 의 아미노산 배열, 또는 이들 배열로부터 시그널 배열이 제외된 아미노산 배열에 있어서, 1 개, 2 혹은 3 개 또는 4 혹은 5 개의 아미노산이 치환, 결실, 또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, Orai1 과 동등한 생물 활성을 갖는 단백질도 Orai1 에 포함된다. 또한, 인간 또는 마우스 Orai1 유전자좌로부터 전사되는 스플라이싱 배리언트에 코드되는 아미노산 배열 또는 그 아미노산 배열에 있어서, 1 개, 2 혹은 3 개 또는 4 혹은 5 개의 아미노산이 치환, 결실, 또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한, Orai1 과 동등한 생물 활성을 갖는 단백질도 Orai1 에 포함된다.
2. 항 Orai1 항체의 제조
본 발명의 Orai1 에 대한 항체는, 통상적인 방법을 사용하여, Orai1 또는 Orai1 의 아미노산 배열에서 선택되는 임의의 폴리펩타이드를 동물에 면역하고, 생체 내에 생산되는 항체를 채취, 정제함으로써 얻을 수 있다. 항원이 되는 Orai1 의 생물종은 인간에 한정되지 않고, 마우스, 래트 등의 인간 이외의 동물에서 유래하는 Orai1 을 동물에 면역할 수도 있다. 이 경우에는, 취득된 이종 Orai1 에 결합하는 항체와 인간 Orai1 의 교차성을 시험함으로써, 인간의 질환에 적용 가능한 항체를 선별할 수 있다. 또한, 항원이 되는 Orai1 은 Orai1 유전자를 유전자 조작에 의해 숙주 세포에 생산시키는 것에 의해 얻을 수 있다. 구체적으로는, Orai1 유전자를 발현 가능한 벡터를 제작하고, 이것을 숙주 세포에 도입하여 그 유전자를 발현시켜, 발현한 Orai1 을 정제하면 된다.
본 발명의 Orai1 에 대한 항체는, DNA 면역법을 사용하여 얻을 수도 있다. DNA 면역법이란, 항원 발현 플라스미드를 마우스나 래트 등의 동물 개체에 유전자 도입하고, 항원을 개체 내에서 발현시키는 것에 의해, 항원에 대한 면역을 유도하는 수법이다. 유전자 도입의 수법에는, 직접 플라스미드를 근육에 주사하는 방법이나, 플라스미드와 리포솜이나 폴리에틸렌이민 등의 복합체를 정맥 주사하는 방법, 바이러스 벡터를 사용하는 수법, 플라스미드를 부착시킨 금 입자를 Gene Gun 에 의해 쏘아 넣는 수법, 급속히 대량의 플라스미드 용액을 정맥 주사하는 하이드로다이나믹 (Hydrodynamic) 법 등이 존재한다. 발현 플라스미드의 근주에 의한 유전자 도입법에 관해서, 발현량을 향상시키는 수법으로서, 플라스미드를 근주 후, 동일 부위에 일렉트로포레이션을 가하는 in vivo 전기 천공법 (electroporation) 이라고 하는 기술이 알려져 있다 (Aihara H, Miyazaki J. Nat Biotechnol. 1998 Sep ; 16(9) : 867-70 또는 Mir LM, Bureau MF, Gehl J, Rangara R, Rouy D, Caillaud JM, Delaere P, Branellec D, Schwartz B, Scherman D. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 Apr 13 ; 96(8) : 4262-7.). 본 수법은 플라스미드의 근주 전에 히알루로니다아제로 근육을 처리함으로써, 더욱 발현량이 향상된다 (McMahon JM1, Signori E, Wells KE, Fazio VM, Wells DJ. Gene Ther. 2001 Aug ; 8(16) : 1264-70).
또한, 공지된 방법 (예를 들어, Kohler and Milstein, Nature(1975) 256, p.495-497, Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, p.365-367, Plenum Press, N.Y. (1980)) 에 따라서, Orai1 에 대한 항체를 생산하는 항체 생산 세포와 미엘로마 세포를 융합시킴으로써 하이브리도마를 수립하고, 모노클로날 항체를 얻을 수도 있다. 이와 같은 방법의 구체적인 예는, 국제 공개 제WO09/48072호 팜플렛 (2009년 4월 16일 공개) 및 제WO10/117011호 (2010년 10월 14일 공개) 팜플렛에 기재되어 있다.
이와 같이 하여 수립된 래트 항인간 Orai1 항체의 실례로는, R118 항체 및 R198 항체를 들 수 있다. R118 항체의 경사슬 가변 영역의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 11 에, R118 항체의 중사슬 가변 영역의 배열은 배열표의 배열 번호 13 에 각각 나타나 있다. 또한, R198 항체의 경사슬 가변 영역의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 15 에, R198 항체의 중사슬 가변 영역의 배열은 배열표의 배열 번호 17 에 각각 나타나 있다.
본 발명의 항체에는, 상기의 Orai1 에 대한 모노클로날 항체에 첨가하고, 인간에 대한 이종 항원성을 저하시키는 것 등을 목적으로 하여 인위적으로 개변한 유전자 재조합형 항체, 예를 들어, 키메라 (Chimeric) 항체, 인간화 (Humanized) 항체, 인간 항체 등도 포함된다. 이들 항체는, 이미 알려진 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
키메라 항체로는, 항체의 가변 영역과 정상 영역이 서로 이종인 항체, 예를 들어 마우스 또는 래트 유래 항체의 가변 영역을 인간 유래의 정상 영역에 접합한 키메라 항체를 들 수 있다 (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 81, 6851-6855, (1984) 참조).
래트 항인간 Orai1 항체 R118 유래의 키메라 항체는, 배열 번호 23 의 21 내지 126 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬 및 배열 번호 27 의 20 내지 136 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있다. 이와 같은 R118 유래의 키메라 항체의 일례로는, 배열 번호 23 의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 및 배열 번호 27 의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있다. 본 명세서에 있어서는, 상기의 항체를 「cR118」 혹은 「cR118 항체」 라고 호칭한다.
또한, 래트 항인간 Orai1 항체 R198 유래의 키메라 항체는, 배열 번호 25 의 21 내지 126 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및 배열 번호 29 의 20 내지 136 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있다. 이와 같은 R198 유래의 키메라 항체의 일례로는, 배열 번호 25 의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 및 배열 번호 29 의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있다. 본 명세서에 있어서는, 상기의 항체를 「cR198」 혹은 「cR198 항체」 라고 호칭한다.
상기의 Orai1 에 대한 키메라 항체의 배열을, 인간에 대한 이종 항원성을 저하시키는 것 등을 목적으로 하여 인위적으로 개변하여, 유전자 재조합형 항체인 인간화 (Humanized) 항체를 제작할 수 있다. 본 발명의 항체에는, 상기 인간화 항체의 CDR 을 개변한 항체가 포함된다. 이들 항체는, 이미 알려진 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
인간화 항체로는, 상보성 결정 영역 (CDR ; complementarity determining region) 만을 인간 유래의 항체에 조립한 항체 (Nature(1986) 321, p.522-525 참조), CDR 의 배열에 더하여 일부의 프레임 워크의 아미노산 잔기도 인간 항체에 이식한 항체 (국제 공개 제WO90/07861호 팜플렛) 를 들 수 있다.
cR118 및 cR198 항체 유래의 인간화 항체는, cR118 또는 cR198 에서 유래하는 6 종 모두의 CDR 배열을 유지하고, T 세포의 활성화를 억제하는 활성을 가지고 있다. 또한, 상기의 인간화 항체의 경사슬 가변 영역은, 배열 번호 92 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL1 (RASQSIGNSLS) 또는 배열 번호 116 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL1 (RASQSISNSLS) 의 어느 1 개, 배열 번호 96 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL2 (STSTLES), 및 배열 번호 99 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL3 (LQFATFPDT) 또는 배열 번호 100 에 나타내는 CDRL3 (LQFATYPDT) 의 어느 1 개를 보유하고 있다. 또한, 인간화 항체의 중사슬 가변 영역은, 배열 번호 102 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH1 (AYYIS) 또는 배열 번호 103 에 나타내는 CDRH1 (SYYIS) 의 어느 1 개, 배열 번호 104 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH2 (YIDMGNGRTNYNARFKG) 또는 배열 번호 105 에 나타내는 CDRH2 (YVDMGNGRTNYNEKFKG) 의 어느 1 개, 및 배열 번호 109 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH3 (DSNWGVDY) 를 보유하고 있다. 또한, 상기의 CDR 의 아미노산 배열은, 도 38 에도 기재되어 있다.
바람직한 CDR 의 조합을 갖는 항체로는, 배열 번호 92 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL1, 배열 번호 96 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL2, 배열 번호 100 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL3, 배열 번호 103 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH1, 배열 번호 105 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH2, 및 배열 번호 109 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 항체, 그리고 배열 번호 92 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL1, 배열 번호 96 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL2, 배열 번호 99 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL3, 배열 번호 102 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH1, 배열 번호 104 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH2, 및 배열 번호 109 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 항체를 들 수 있다.
상기의 인간화 항체의 바람직한 사례로는, 배열 번호 31 의 21 내지 126 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬 및 배열 번호 39 의 20 내지 136 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 33 의 21 내지 126 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬 및 배열 번호 41 의 20 내지 136 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 35 의 21 내지 126 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬 및 배열 번호 43 의 20 내지 136 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬로 이루어지는 항체, 그리고 배열 번호 37 의 21 내지 126 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬 및 배열 번호 45 의 20 내지 136 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있다.
더욱 바람직한 사례로는, 배열 번호 31 의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 및 배열 번호 39 의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 33 의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 및 배열 번호 41 의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 35 의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 및 배열 번호 43 의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체, 그리고 배열 번호 37 의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 및 배열 번호 45 의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있다.
본 발명의 항체는, 상기의 인간화 항체에 추가로 변이를 도입하여, Orai1 에 대한 결합능을 증진시킨 것이어도 된다. 이와 같은 수법은 어피니티 매츄레이션이라고 불리는데, 구체적인 방법으로서 리보좀 디스플레이법을 들 수 있다. 리보좀 디스플레이법은, 단백질과 그 유전자 정보인 mRNA 가 리보솜을 개재하여 결합한 삼자 복합체를 이용하여, 표적 분자와 결합하는 단백질의 유전자 배열을 단리하는 방법이다 (Stafford RL. et. al. Protein Eng. Des. Sel. 2014(4) : 97-109.).
상기의 방법에 의해, 유전자 개변을 가한 항체의 경사슬 가변 영역은, 배열 번호 93 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL1 (RASQSIGGSLS), 배열 번호 94 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL1 (HASQNIGGSLS) 또는 배열 번호 95 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL1 (HASRNIGGSLS) 의 어느 1 개, 배열 번호 96 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL2 (STSTLES), 배열 번호 97 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL2 (LTSTLDW) 또는 배열 번호 98 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL2 (LTSSLDW) 의 어느 1 개, 및 배열 번호 101 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL3 (LQFAIFPDS) 를 보유하고 있다. 또한, 유전자 개변을 가한 항체의 중사슬 가변 영역은, 배열 번호 102 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH1 (AYYIS), 배열 번호 104 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH2 (YIDMGNGRTNYNARFKG), 배열 번호 106 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH2 (YIDMGNGRTDYNARFKG), 배열 번호 107 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH2 (YIDMGNGRTDYNGRFKG) 또는 배열 번호 108 에 나타내는 CDRH2 (YIDMGNGRTDYNMRFKG) 의 어느 1 개, 및 배열 번호 109 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH3 (DSNWGVDY) 또는 배열 번호 110 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH3 (DSNWGADY) 를 보유하고 있다. 또한, 상기의 CDR 의 아미노산 배열은, 도 38 에도 기재되어 있다.
바람직한 CDR 의 조합을 갖는 항체로는, 배열 번호 93 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL1, 배열 번호 96 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL2, 배열 번호 101 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL3, 배열 번호 102 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH1, 배열 번호 106 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH2, 및 배열 번호 110 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 항체, 배열 번호 94 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL1, 배열 번호 97 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL2, 배열 번호 101 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL3, 배열 번호 102 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH1, 배열 번호 106 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH2, 및 배열 번호 110 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 항체, 배열 번호 95 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL1, 배열 번호 98 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL2, 배열 번호 101 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL3, 배열 번호 102 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH1, 배열 번호 106 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH2, 및 배열 번호 110 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 항체, 배열 번호 93 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL1, 배열 번호 96 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL2, 배열 번호 101 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL3, 배열 번호 102 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH1, 배열 번호 107 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH2, 및 배열 번호 110 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 항체, 배열 번호 93 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL1, 배열 번호 96 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL2, 배열 번호 101 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL3, 배열 번호 102 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH1, 배열 번호 108 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH2, 및 배열 번호 110 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 항체, 그리고 배열 번호 93 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL1, 배열 번호 96 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL2, 배열 번호 101 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL3, 배열 번호 102 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH1, 배열 번호 104 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH2, 배열 번호 109 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 항체를 들 수 있다.
상기의 유전자 개변을 가한 CDR 항체의 바람직한 사례로는, 배열 번호 56 의 21 내지 126 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬 및 배열 번호 62 의 20 내지 136 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 58 의 21 내지 126 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬 및 배열 번호 62 의 20 내지 136 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 60 의 21 내지 126 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬 및 배열 번호 62 의 20 내지 136 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 56 의 21 내지 126 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬 및 배열 번호 64 의 20 내지 136 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 56 의 21 내지 126 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬 및 배열 번호 66 의 20 내지 136 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬로 이루어지는 항체, 그리고 배열 번호 56 의 21 내지 126 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬 및 배열 번호 43 의 20 내지 136 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있다.
상기의 경사슬 가변 영역 및 중사슬 가변 영역을 포함하는 바람직한 항체로는, 배열 번호 56 의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 및 배열 번호 62 의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 58 의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 및 배열 번호 62 의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 60 의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 및 배열 번호 62 의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 56 의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 및 배열 번호 64 의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 56 의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 및 배열 번호 66 의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체, 그리고 배열 번호 56 의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 및 배열 번호 43 의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있다.
정상의 인간 Orai1 발현 세포에 대한 세포 상해를 회피하기 위해서, 항체의 이팩터 활성은 낮은 것이 바람직하다. 이팩터 활성은 항체의 서브 클래스에 따라 상이한 것이 알려져 있다. IgG4 는 ADCC, CDC 활성이 낮고, IgG2 는 CDC 활성을 갖지만, ADCC 활성은 낮은, 등의 특징을 볼 수 있다. 이 특징으로부터, IgG1 의 정상 영역을 IgG2, 4 의 정상 영역으로 치환함으로써 ADCC, CDC 활성을 저감시킨 항체를 제작하는 것이 가능하다. 또한, IgG1 의 정상 영역의 일부의 배열을 IgG2, 4 를 참고로 하여 치환함으로써, ADCC, CDC 활성을 저감시킨 IgG1 항체를 제작하는 것이 가능하다. 일례로서, Marjan Hezareh et. al. Journal of Virology, 75(24) : 12161-12168(2001) 에 의하면, IgG1 의 234 번째, 235 번째의 류신 잔기 (숫자는 Kabat 등에 의한 EU 인덱스) 를 각각 알라닌 잔기로 치환하면, ADCC, CDC 활성이 저하하는 것이 나타나 있다.
상기의 방법에 의해 제작된 항 Orai1 항체의 중사슬의 예로서, 배열 번호 68 또는 70 에 기재된 중사슬을 들 수 있다. 배열 번호 68 또는 70 에 기재된 중사슬은, 본 명세서에 기재된 각 경사슬 배열과 조합하여, 치료용 항체로서 사용하는 것이 가능하다. 조합하는 경사슬의 구체예로서, 배열 번호 31, 33, 35, 37, 56, 58 또는 60 에 기재된 경사슬을 들 수 있다. 바람직한 경사슬과 중사슬을 조합한 항체로는, 배열 번호 56 의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 및 배열 번호 70 의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 58 의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 및 배열 번호 70 의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체, 그리고 배열 번호 60 의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 및 배열 번호 70 의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있다.
또한, 포유류 배양 세포로 생산되는 항체의 중사슬의 카르복실 말단의 리신 잔기가 결실하는 것이 알려져 있고 (Journal of Chromatography A, 705 : 129-134(1995)), 또한, 동일하게 중사슬 카르복실 말단의 글리신, 리신의 2 아미노산 잔기가 결실하고, 새롭게 카르복실 말단에 위치하는 프롤린 잔기가 아미드화되는 것이 알려져 있다 (Analytical Biochemistry, 360 : 75-83(2007)). 그러나, 이들 중사슬 배열의 결실 및 수식은, 항체의 항원 결합능 및 이팩터 기능 (보체의 활성화나 항체 의존성 세포 상해 작용 등) 에는 영향을 미치지 않는다. 따라서, 본 발명에는 당해 수식을 받은 항체도 포함되고, 중사슬 카르복실 말단에 있어서 1 또는 2 개의 아미노산이 결실한 결실체, 및 아미드화된 당해 결실체 (예를 들어, 카르복실 말단 부위의 프롤린 잔기가 아미드화된 중사슬) 등을 들 수 있다. 단, 항원 결합능 및 이팩터 기능이 유지되고 있는 한, 본 발명에 관련된 항체의 중사슬의 카르복실 말단의 결실체는 상기의 종류에 한정되지 않는다. 본 발명에 관련된 항체를 구성하는 2 개의 중사슬은, 완전 길이 및 상기의 결실체로 이루어지는 군에서 선택되는 중사슬의 어느 1 종이어도 되고, 어느 2 종을 조합한 것이어도 된다. 각 결실체의 양비는 본 발명에 관련된 항체를 생산하는 포유류 배양 세포의 종류 및 배양 조건에 영향을 받을 수 있는데, 본 발명에 관련된 항체의 주성분으로는 2 개의 중사슬의 쌍방에서 카르복실 말단의 1 개의 아미노산 잔기가 결실되어 있는 경우를 들 수 있다. 즉 배열표에 기재된 배열 번호 27, 29, 39, 41, 43, 45, 62, 64, 66, 68, 및 70 에 나타내는 각 중사슬 배열의 20 내지 465 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬, 또는 20 내지 464 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬도 본 발명의 항체로 사용할 수 있다.
이상의 방법에 의해 얻어진 항체는, 항원에 대한 결합성을 평가하여, 바람직한 항체를 선발할 수 있다. 항체의 성질을 비교할 때의 다른 지표의 일례로는, 항체의 안정성을 들 수 있다. 시차 주사 칼로리메트리 (DSC) 는, 단백의 상대적 구조 안정성의 바람직한 지표가 되는 열 변성 중점 (Tm) 을 신속하게, 또한 정확하게 측정할 수 있는 방법이다. DSC 를 사용하여 Tm 치를 측정하고, 그 값을 비교함으로써, 열 안정성의 차이를 비교할 수 있다. 항체의 보존 안정성은, 항체의 열 안정성과 어느 정도의 상관을 나타내는 것이 알려져 있고 (Lori Burton, et. al., Pharmaceutical Development and Technology (2007) 12, p.265-273), 열 안정성을 지표로, 바람직한 항체를 선발할 수 있다. 항체를 선발하기 위한 다른 지표로는, 적절한 숙주 세포에 있어서의 수량이 높은 것, 및 수용액 중에서의 응집성이 낮은 것을 들 수 있다. 예를 들어 수량이 가장 높은 항체가 가장 높은 열 안정성을 나타낸다고는 할 수 없기 때문에, 이상에서 서술한 지표에 기초하여 종합적으로 판단하여, 인간에 대한 투여에 가장 적합한 항체를 선발할 필요가 있다.
또한, 항체의 중사슬 및 경사슬의 전체 길이 배열을 적절한 링커를 사용하여 연결하고, 1 개 사슬 이뮤노글로불린 (single chain immunoglobulin) 을 취득하는 방법도 알려져 있다 (Lee, H-S, et. al., Molecular Immunology (1999) 36, p.61-71 ; Shirrmann, T. et. al., mAbs (2010), 2, (1) p.73-76). 이와 같은 1 개 사슬 이뮤노글로불린은 2 량체화하는 것에 의해, 본래는 4 량체인 항체와 유사한 구조와 활성을 유지하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명의 항체는, 단일의 중사슬 가변 영역을 갖고, 경사슬 배열을 갖지 않는 항체여도 된다. 이와 같은 항체는, 단일 도메인 항체 (single domain antibody : sdAb) 또는 나노보디 (nanobody) 라고 불리고 있고, 실제로 낙타 또는 라마에서 관찰되고, 항원 결합능이 유지되어 있는 것이 보고되어 있다 (Muyldemans S. et. al., Protein Eng. (1994) 7(9), 1129-35, Hamers-Casterman C. et. al., Nature (1993) 363 (6428) 446-8). 상기의 항체는, 본 발명에 있어서의 항체의 항원 결합성 단편의 일종으로 해석하는 것도 가능하다.
또한, 본 발명의 항체에 결합하고 있는 당사슬 수식을 조절함으로써, 항체 의존성 세포 상해 활성을 증강시키는 것이 가능하다. 항체의 당사슬 수식의 조절 기술로는, WO99/54342, WO00/61739, WO02/31140 등이 알려져 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
항체 유전자를 일단 단리한 후, 적당한 숙주에 도입하여 항체를 제작하는 경우에는, 적당한 숙주와 발현 벡터의 조합을 사용할 수 있다. 항체 유전자의 구체예로는, 본 명세서에 기재된 항체의 중사슬 배열을 코드하는 유전자, 및 경사슬 배열을 코드하는 유전자를 조합한 것을 들 수 있다. 숙주 세포를 형질 전환할 때에는, 중사슬 배열 유전자와 경사슬 배열 유전자는, 동일한 발현 벡터에 삽입되어 있는 것이 가능하고, 또한 다른 발현 벡터에 삽입되어 있는 것도 가능하다. 진핵 세포를 숙주로서 사용하는 경우, 동물 세포, 식물 세포, 진핵 미생물을 사용할 수 있다. 동물 세포로는, 포유류 세포, 예를 들어, 원숭이의 세포인 COS 세포 (Gluzman, Y. Cell (1981) 23, p.175-182, ATCC CRL-1650), 마우스 선유아 세포 NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658) 이나 차이니즈·햄스터 난소 세포 (CHO 세포, ATCC CCL-61) 의 디하이드로 엽산 환원 효소 결손주 (Urlaub, G. and Chasin, L. A. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (1980) 77, p.4126-4220) 를 들 수 있다. 또한, 원핵 세포를 사용하는 경우에는, 예를 들어, 대장균, 고초균을 들 수 있다. 이들 세포에 목적으로 하는 항체 유전자를 형질 전환에 의해 도입하고, 형질 전환된 세포를 in vitro 에서 배양함으로써 항체가 얻어진다. 이상의 배양법에 있어서는 항체의 배열에 따라 수량이 상이한 경우가 있고, 동등한 결합 활성을 가지는 항체 중에서 수량을 지표로 의약으로서의 생산이 용이한 것을 선별하는 것이 가능하다.
본 발명의 항체의 아이소타입으로서의 제한은 없고, 예를 들어 IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA (IgA1, IgA2), IgD 혹은 IgE 등을 들 수 있지만, 바람직하게는 IgG 또는 IgM, 더욱 바람직하게는 IgG1 또는 IgG2 를 들 수 있다.
또한 본 발명의 항체는, 항체의 항원 결합부를 갖는 항체의 항원 결합성 단편 또는 그 수식물이어도 된다. 항체를 파파인, 펩신 등의 단백질 분해 효소로 처리하거나, 혹은 항체 유전자를 유전자 공학적 수법에 의해 개변하여 적당한 배양 세포에 있어서 발현시키는 것에 의해, 그 항체의 단편을 얻을 수 있다. 이와 같은 항체 단편 중에서, 항체 전체 길이 분자가 가지는 기능의 모두 또는 일부를 유지하고 있는 단편을 항체의 항원 결합성 단편이라고 부를 수 있다.
항체의 기능으로는, 일반적으로는 항원 결합 활성, 항원의 활성을 중화하는 활성, 항원의 활성을 증강시키는 활성, 항체 의존성 세포 상해 활성, 보체 의존성 세포 상해 활성 및 보체 의존성 세포성 세포 상해 활성을 들 수 있다. 본 발명에 있어서의 항체의 항원 결합성 단편이 유지하는 기능은, Orai1 에 대한 결합 활성이고, 바람직하게는 T 세포의 활성화를 억제하는 활성이고, 보다 바람직하게는 T 세포에 의한 IL-2 및/또는 인터페론 γ 의 생산을 억제하는 활성이다.
예를 들어, 항체의 단편으로는, Fab, F(ab')2, Fv, 또는 중사슬 및 경사슬의 Fv 를 적당한 링커로 연결시킨 싱글 체인 Fv (scFv), diabody (diabodies), 선상 항체, 및 항체 단편으로부터 형성된 다특이성 항체 등을 들 수 있다. 또한, F(ab')2 를 환원 조건하에서 처리한 항체의 가변 영역의 1 가의 단편인 Fab' 도 항체의 단편에 포함된다.
또한, 본 발명의 항체는 적어도 2 종류의 상이한 항원에 대하여 특이성을 갖는 다특이성 항체여도 된다. 통상적으로 이와 같은 분자는 2 종류의 항원에 결합하는 것이지만 (즉, 이중 특이성 항체 (bispecific antibody)), 본 발명에 있어서의 「다특이성 항체」 는, 그 이상 (예를 들어, 3 종류) 의 항원에 대하여 특이성을 갖는 항체를 포함하는 것이다.
본 발명의 다특이성 항체는, 전체 길이로 이루어지는 항체, 또는 그러한 항체의 단편 (예를 들어, F(ab')2 이중 특이성 항체) 이어도 된다. 이중 특이성 항체는 2 종류의 항체의 중사슬과 경사슬 (HL 쌍) 을 결합시켜 제작할 수도 있고, 상이한 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 융합시켜, 이중 특이성 항체 생산 융합 세포를 제작하는 것에 의해서도, 제작할 수 있다 (Millstein et al., Nature (1983) 305, p.537-539).
본 발명의 항체는 1 개 사슬 항체 (scFv 라고도 기재한다) 여도 된다. 1 개 사슬 항체는, 항체의 중사슬 가변 영역과 경사슬 가변 영역을 폴리펩타이드의 링커로 연결함으로써 얻어진다 (Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113 (Rosenberg 및 Moore 편, Springer Verlag, New York, p.269-315 (1994), Nature Biotechnology (2005), 23, p.1126-1136). 또한, 2 개의 scFv 를 폴리펩타이드 링커로 결합시켜 제작되는 BiscFv 단편을 이중 특이성 항체로서 사용할 수도 있다.
1 개 사슬 항체를 제작하는 방법은 당 기술 분야에 있어서 주지이다 (예를 들어, 미국 특허 제4,946,778호, 미국 특허 제5,260,203호, 미국 특허 제5,091,513호, 미국 특허 제5,455,030호 등을 참조). 이 scFv 에 있어서, 중사슬 가변 영역과 경사슬 가변 영역은, 콘주게이트를 만들지 않는 것과 같은 링커, 바람직하게는 폴리펩타이드 링커를 개재하여 연결된다 (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (1988), 85, p.5879-5883). scFv 에 있어서의 중사슬 가변 영역 및 경사슬 가변 영역은, 동일한 항체에서 유래해도 되고, 별도의 항체에서 유래해도 된다. 가변 영역을 연결하는 폴리펩타이드 링커로는, 예를 들어 12 ∼ 19 잔기로 이루어지는 임의의 1 개 사슬 펩타이드가 사용된다.
scFv 를 코드하는 DNA 는, 상기 항체의 중사슬 또는 중사슬 가변 영역을 코드하는 DNA, 및 경사슬 또는 경사슬 가변 영역을 코드하는 DNA 중, 그들의 배열 중 전부 또는 원하는 아미노산 배열을 코드하는 DNA 부분을 주형으로 하고, 그 양단을 규정하는 프라이머쌍을 사용하여 PCR 법에 의해 증폭하고, 이어서, 추가로 폴리펩타이드 링커 부분을 코드하는 DNA, 및 그 양단이 각각 중사슬, 경사슬과 연결되도록 규정하는 프라이머쌍을 조합하여 증폭함으로써 얻어진다.
또한, 일단 scFv 를 코드하는 DNA 가 제작되면, 그것들을 함유하는 발현 벡터, 및 그 발현 벡터에 의해 형질 전환된 숙주를 통상적인 방법에 따라 얻을 수 있고, 또한, 그 숙주를 사용하는 것에 의해, 통상적인 방법에 따라 scFv 를 얻을 수 있다. 이들 항체 단편은, 상기와 동일하게 하여 유전자를 취득하여 발현시키고, 숙주에 의해 생산시킬 수 있다.
본 발명의 항체는, 다량화하여 항원에 대한 친화성을 높인 것이어도 된다. 다량화하는 항체로는, 1 종류의 항체여도 되고, 동일한 항원의 복수의 에피토프를 인식하는 복수의 항체여도 된다. 항체를 다량화하는 방법으로는, IgG CH3 도메인과 2 개의 scFv 의 결합, 스트렙트아비딘과의 결합, 헬릭스-턴-헬릭스 모티프의 도입 등을 들 수 있다.
본 발명의 항체는, 아미노산 배열이 상이한 복수 종류의 항 Orai1 항체의 혼합물인, 폴리클로날 항체여도 된다. 폴리클로날 항체의 일례로는, CDR 이 상이한 복수 종류의 항체의 혼합물을 들 수 있다. 그러한 폴리클로날 항체로는, 상이한 항체를 생산하는 세포의 혼합물을 배양하고, 그 배양물로부터 정제된 항체를 사용할 수 있다 (WO2004/061104호 참조).
항체의 수식물로서, 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 등의 각종 분자와 결합한 항체를 사용할 수도 있다.
본 발명의 항체는, 추가로 이들 항체와 다른 약제가 콘주게이트를 형성하고 있는 것 (Immunoconjugate) 이어도 된다. 이와 같은 항체의 예로는, 그 항체가 방사성 물질이나 약리 작용을 갖는 화합물과 결합하고 있는 것을 들 수 있다 (Nature Biotechnology (2005) 23, p.1137-1146).
얻어진 항체는, 균일하게까지 정제할 수 있다. 항체의 분리, 정제는 통상적인 단백질에서 사용되고 있는 분리, 정제 방법을 사용하면 된다. 예를 들어 칼럼 크로마토그래피, 필터 여과, 한외 여과, 염석, 투석, 조제용 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동, 등전 점전기 영동 등을 적절히 선택, 조합하면, 항체를 분리, 정제할 수 있지만 (Strategies for Protein Purification and Characterization : A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996) ; Antibodies : A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), 이들에 한정되는 것은 아니다.
크로마토그래피로는, 어피니티 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피 등을 들 수 있다. 이들 크로마토그래피는, HPLC 나 FPLC 등의 액체 크로마토그래피를 사용하여 실시할 수 있다. 어피니티 크로마토그래피에 사용하는 칼럼으로는, 프로테인 A 칼럼, 프로테인 G 칼럼을 들 수 있다. 예를 들어 프로테인 A 칼럼을 사용한 칼럼으로서, Hyper D, POROS, Sepharose F.F. (파마시아) 등을 들 수 있다. 또한, 항원을 고정화한 담체를 사용하여, 항원에 대한 결합성을 이용하여 항체를 정제하는 것도 가능하다.
3. 항 Orai1 항체를 함유하는 의약
상기 서술한 「2. 항 Orai1 항체의 제조」 의 항에 기재된 방법으로 얻어지는 항 Orai1 항체 중에서, Orai1 의 생물 활성을 중화하는 항체를 얻을 수 있다. 이들 Orai1 의 생물 활성을 중화하는 항체는, 생체 내에서의 Orai1 의 생물 활성, 즉, T 세포나 매스트 세포로 대표되는 Orai1 발현 세포의 칼슘 방출 의존성 칼슘 채널 (CRAC 채널) 의 활성화를 저해할 수 있는 점에서, 의약으로서, 이들 세포의 CRAC 채널 활성화에서 기인하는 질환에 대한 치료 및/또는 예방제로서 사용할 수 있다.
CRAC 채널 활성화에서 기인하는 질환이나 상태에는, 이식물의 거절, 면역 관련 질환, 알레르기성 질환, 염증성 질환, 혈전증 또는 암 등이 포함된다.
이식물 거절의 치료 및/또는 예방의 예로는, 심장, 신장, 간장, 골수, 피부 등의 장기 혹은 조직의 이식에 대한 거절 반응 및 숙주 대 이식편 반응, 그리고 조혈 세포 (골수, 말초혈, 제대혈 등) 의 이식에 의해 일어나는 이식편 대 숙주병의 치료 및/또는 예방을 들 수 있다.
면역 관련 질환의 예로는, 결합 조직이나 근골격계 (관절 류머티즘, 강직성 척추염, 전신성 에리테마토수스, 강피증, 다발 근염, 피부 근염 등), 혈액계 (재생 불량성 빈혈, 특발성 혈소판 감소성 자반병 등), 소화기계 (크론병, 궤양성 대장염 등), 신경계 (다발성 경화증, 중증 근무력증 등), 시각계 (포도막염 등), 혈관계 (베체트병, 베게너 육아종증 등), 표피계 (건선, 천포창, 백반 등), 내분비계 (1 형 당뇨병, 자기 면역 갑상선염, 바세도우병, 하시모토병 등) 등을 들 수 있다.
알레르기성 질환의 예로는, 아토피성 피부염, 천식, 아나필락시스, 아나필락시스 유사 반응, 음식 알레르기, 비염, 중이염, 약물 반응, 곤충 자상 반응, 식물 반응, 라텍스 알레르기, 결막염, 두드러기 등을 들 수 있다.
염증성 질환의 예로는, 염증성 신장 질환 (사구체신염, 네프로제 등), 염증성 폐질환 (만성 폐색성 폐질환, 낭포성 섬유증, 간질성 폐렴 등), 염증성 장질환 (궤양성 대장염, 회장염 등), 염증성 간질환 (자기 면역 간염, 바이러스 간염 등), 염증성 심질환 (심근염, 허혈성 심질환, 아테롬성 동맥 경화증 등), 염증성 피부 질환 (접촉성 피부염, 습진 등), 염증성 안질환 (트라코마, 안내염 등), 염증성 중추 신경 질환 (수막염, 뇌척수염, 자기 면역 뇌염 등), 관절의 염증성 질환 (예를 들어 관절염, 골관절염 등), 전신성 염증 (패혈증, 출혈, 과민증, 암 화학 요법 등에서 기인하는 쇼크 증상 등) 등을 들 수 있다.
항혈소판 또는 항혈전 활성이 치료 및/또는 예방에 도움이 되는 예로는, 심근경색, 뇌졸중, 허혈성 심질환, 혈전증 등을 들 수 있다.
암 치료의 예로는 유방암, 폐암, 피부암, 백혈병 등을 들 수 있다.
또한 매스트 세포 및 호염기구가 관여하는 병태, 매스트 세포 백혈병, 매스트 세포증, 호염기성 백혈병, 자궁 내막증 등이, 그리고 CRAC 채널의 유전적 기능 항진에 의해 발증하거나, 또는 발증의 리스크가 높아지는 소관 집합성 마이오패티, 스토르모르켄증, 관절 류머티즘, 강직성 척추염, 아토피성 피부염 등을 본 항체에 의해 치료할 수 있는 질환으로서 들 수 있다.
상기의 의약으로서의 항 Orai1 항체의 예로서, R118 항체 및/또는 R198 로부터 제작된 인간화 항체 및 이것의 CDR 개변체를 들 수 있다.
in vitro 에서의 항 Orai1 항체에 의한 Orai1 의 생물 활성의 중화 활성은, 예를 들어 Orai1 을 발현하고 있는 T 세포의 활성화 억제 활성으로 측정할 수 있다. 예를 들어, 인간 T 세포 유래 세포주인 Jurkat 세포에 다양한 농도로 항 Orai1 항체를 첨가함으로써, PMA 및 A23187 자극에 의한 Jurkat 세포로부터의 IL-2 방출에 대한 억제 활성을 측정할 수 있다. 또한, 인간 말초혈 단핵구 (PBMC) 에 다양한 농도로 항 Orai1 항체를 첨가함으로써, PMA 및 A23187 자극에 의한 PBMC 로부터의 IL-2 및 인터페론 γ 방출에 대한 억제 활성을 측정할 수 있다.
이식편 대 숙주병 발증의 책임 세포가 T 세포인 것은, 실험적으로도 증명된 사실이고, 널리 인식되어 있다. 이식된 T 세포가 피이식자를 이물질로 인식하면, 자체에서 생산하는 인터류킨 2 (IL-2) 에 의한 자기 증식이나, 활성화에 의한 인터페론 감마 (IFN-γ) 등의 염증성 사이토카인류의 방출에 의해, 전신성의 면역 염증 반응을 발생시켜, 이식편 대 숙주병을 발증한다. 따라서, 이들 사이토카인류의 생산을 억제하는 것은, 이식편 대 숙주병의 예방이나 치료에 연결됨과 함께, 그 억제 활성을 지표로 함으로써, 항 Orai1 항체의 치료약으로서의 유용성을 판단할 수 있다.
본 발명에 있어서의 바람직한 항체로서, 배열 번호 2 에 기재된 아미노산 배열에 특이적으로 결합하고, PMA 및 A23187 처리된 Jurkat 세포가 방출하는 IL-2 량을 50 ％ 저해하는 농도가 80 ng/㎖ 이하인 것을 특징으로 하는, 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 들 수 있다. 상기의 항체에 있어서 더욱 바람직한 것으로서, PMA 및 A23187 처리된 Jurkat 세포가 방출하는 IL-2 량을 50 ％ 저해하는 농도가 10 ng/㎖ 이하인 것을 특징으로 하는, 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 들 수 있다. 또한, PMA 및 A23187 처리된 Jurkat 세포가 방출하는 IL-2 량을 80 ％ 저해하는 농도가 60000 ng/㎖ 이하인 것을 특징으로 하는, 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 그리고 80 ％ 저해하는 농도가 200 ng/㎖ 이하인 것을 특징으로 하는, 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편도 본 발명의 항체에 포함된다.
본 발명에 있어서의 다른 바람직한 항체로서, 배열 번호 2 에 기재된 아미노산 배열에 특이적으로 결합하고, PMA 및 A23187 처리된 인간 PBMC 가 방출하는 IL-2 량을 50 ％ 저해하는 농도가 100 ng/㎖ 이하인 것을 특징으로 하는, 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 들 수 있다. 상기의 항체에 있어서 더욱 바람직한 것으로서, PMA 및 A23187 처리된 인간 PBMC 가 방출하는 IL-2 량을 50 ％ 저해하는 농도가 20 ng/㎖ 이하인 것을 특징으로 하는, 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 들 수 있다. 또한, PMA 및 A23187 처리된 인간 PBMC 가 방출하는 IL-2 량을 80 ％ 저해하는 농도가 17000 ng/㎖ 이하인 것을 특징으로 하는, 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 그리고 80 ％ 저해하는 농도가 400 ng/㎖ 이하인 것을 특징으로 하는, 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편도 본 발명의 항체에 포함된다.
본 발명에 있어서의 또 다른 바람직한 항체로서, 배열 번호 2 에 기재된 아미노산 배열에 특이적으로 결합하고, PMA 및 A23187 처리된 인간 PBMC 가 방출하는 IFN-γ 량을 50 ％ 저해하는 농도가 800 ng/㎖ 이하인 것을 특징으로 하는, 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 들 수 있다. 상기의 항체에 있어서 더욱 바람직한 것으로서, PMA 및 A23187 처리된 인간 PBMC 가 방출하는 IFN-γ 량을 50 ％ 저해하는 농도가 40 ng/㎖ 이하인 것을 특징으로 하는, 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 들 수 있다. 또한, PMA 및 A23187 처리된 인간 PBMC 가 방출하는 IFN-γ 량을 80 ％ 저해하는 농도가 300000 ng/㎖ 이하인 것을 특징으로 하는, 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 그리고 80 ％ 저해하는 농도가 2000 ng/㎖ 이하인 것을 특징으로 하는, 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편도 본 발명의 항체에 포함된다.
또한 실험 동물을 이용한 in vivo 에서의 항 Orai1 항체의 이식편 대 숙주병에 대한 치료 또는 예방 효과는, 예를 들어 인간 PBMC 이입 마우스 이식편 대 숙주병 모델에 있어서의 체중 감소의 억제를 측정함으로써 확인할 수 있다. 즉, 중증 면역 부전 마우스인 NOG 마우스 혹은 NSG 마우스에 2.0 Gy 의 X 선을 조사한 다음날에, 1 ㎖ 중에 15 백만개 내지 50 백만개의 인간 PBMC 를 포함하는 PBS 용액을, 꼬리 정맥으로부터 마우스 1 마리 당 200 ㎕ 이입한다. 인간 PBMC 를 이입하지 않은 X 선 조사 마우스군을 비이식편 대 숙주병군, 인간 PBMC 를 이입하여 항체의 기재액만을 투여한 군을 이식편 대 숙주병군으로 하고, 인간 PBMC 이입 전이나 이입 후에 항 Orai1 항체를 꼬리 정맥 내 투여 혹은 복강 내 투여함으로써, 이식편 대 숙주병군의 체중 감소에 대한 억제 효과를 측정한다.
또한 항 Orai1 항체의 각종 질환에 대한 치료 또는 예방 효과는, 인간 Orai1 노크인 마우스를 사용한 이하의 in vivo 평가계에 의해서도 확인할 수 있다.
피부염에 대한 효과는, 마우스의 복강 내나 정맥 내에 단백 항원액을 투여하고, 또한 2 주일 후에 추가 면역을 실시한 후, 동일 단백 항원액을 귀 또는 배부에 3 일 ∼ 2 주일마다 3 ∼ 6 회 반복 도포함으로써 발증시킨 피부염에 있어서, 귓바퀴의 두께, 배부의 피부염의 육안적 스코어, 혈액이나 조직 중의 항체·사이토카인·혈중 바이오 마커 농도, 피부·말초혈·흉선·비장·림프절·골수로부터 얻은 세포의 증식 활성·사이토카인 생산능·표면 항원을 항 Orai1 항체군과 비투여군 사이에서 비교하는 것에 의해 평가한다.
소양 (搔痒) 에 대한 효과는, 진드기 항원 크림을 귓바퀴 또는 배부에 3 일 ∼ 2 주일마다 3 ∼ 6 회 반복 도포하거나, 혹은 합텐류를 귓바퀴나 복부나 배부에 연일 ∼ 주 1 회 도포하거나, 혹은 소양 유발 물질을 귓바퀴 피내나 배부 피하나 지주막하강 내에 투여하는 등의 방법으로 유도한 소양 행동을, 마우스의 양 발등에 장착한 마그넷과 소양 행동 측정 장치에 의한 소양 횟수의 측정이나, 피부·말초혈·척수 조직의 병리적 특징을 검사함으로써 정량화하여, 항 Orai1 항체군과 비투여군 사이에서 비교하는 것에 의해 평가한다.
건선에 대한 효과는, 이미퀴모드 (Imiquimod) 를 귓바퀴 양측 또는 편면 및 체모가 완료된 배부에 도포하거나, 지모산 (Zymosan) 현탁액을 복강 내 투여하거나, IL-23 등의 사이토카인을 마우스 귓바퀴 편면에 피내 투여하는 등의 방법으로 유도한 건선성 피부염을, 염증 부위의 중량, 두께, 그 부위에 침윤한 호중구의 미엘로퍼옥시다아제 활성, 침윤한 세포의 플로우 사이토메트리 해석, 유전자 해석, 사이토카인 농도 등의 측정에 의해 정량화하여, 항 Orai1 항체군과 비투여군 사이에서 비교하는 것에 의해 평가한다.
다발성 경화증에 대한 효과는, 마이엘린 희소돌기아교세포 당단백질 (Myelin oligodendrocyte glycoprotein) 또는 그 부분 펩타이드 항원 용액을 등량의 프로인트의 완전 아쥬반트 수용액과 혼합하여 유화시키고, 마우스의 옆구리 또는 복부 피내에 투여하고, 그 후 백일해 독소 수용액을 꼬리 정맥에 투여, 추가로 수일 후에 재차 백일해 독소액을 꼬리 정맥에 투여함으로써 유도한 실험적 뇌척수염을, 실험 개시 1 주일 내지 2 주일 후부터 발증하는 꼬리로부터 하지, 앞다리로 확대되는 마비 증상의 육안적 관찰로 스코어화하여, 항 Orai1 항체군과 비투여군 사이에서 비교하는 것에 의해 평가한다.
관절염에 대한 효과는, 소 II 형 콜라겐과 프로인트의 완전 아쥬반트를 혼합하여 유화한 것을 마우스의 미근부 피내에 투여하고, 2 ∼ 3 주일 후에 동일한 투여를 실시하여, 그 후의 관절 종창의 스코어화, 혈액이나 조직 중의 항체·사이토카인·혈중 바이오 마커 농도, 피부·말초혈·흉선·비장·림프절·골수로부터 얻은 세포의 증식 활성·사이토카인 생산능·표면 항원 등을, 항 Orai1 항체군과 비투여군 사이에서 비교하는 것에 의해 평가한다.
대장염에 대한 효과는, 트리니트로벤젠술폰산을 24 시간 절식하의 마우스 장관 내에 투여하거나, 1 - 10 ％ 의 덱스트란 황산나트륨 수용액을 급수병으로부터 4 일 내지 2 주일 자유 음수시키거나, 인간 Orai1 노크인 마우스의 림프절과 비장으로부터 채취하여 정제한 CD4＋CD25-CD45RBhi T-세포를 Rag2-／- 마우스의 복강 내에 이입하는 등의 방법으로 대장염을 유도하고, 관찰 기간 중의 체중, 시험 종료 후의 부검에 의한 장관의 비후도·폴립의 개수와 크기·병리적 특징, 혈액이나 조직 중의 항체·사이토카인·혈중 바이오 마커 농도, 장관·말초혈·흉선·비장·림프절·골수로부터 얻은 세포의 증식 활성·사이토카인 생산능·표면 항원 등을, 항 Orai1 항체군과 비투여군 사이에서 비교하는 것에 의해 평가한다.
전신성 에리테마토수스에 대한 효과는, 난백 알부민 혹은 다른 비자극성의 항원을 복강 내 혹은 피하에 5 ∼ 10 일 간격으로 최대 15 회 투여함으로써 전신성 에리테마토수스 유사 증상을 유도하고, 관찰 기간 중에 시간 경과적으로 채취한 혈액이나 조직 중의 항체·사이토카인·혈중 바이오 마커 농도, 뇨 중의 항체가나 바이오 마커 농도, 시험 종료 후에 채취한 비장·림프절 등의 장기로부터 세포를 조제하여 무처치의 마우스에 이입함으로써 야기시킨 증상 등을, 항 Orai1 항체군과 비투여군 사이에서 비교하는 것에 의해 평가한다.
간염에 대한 효과는, D-갈락토오스아민을 단독 또는 리포폴리사카라이드와의 조합으로 마우스의 복강 내에 투여하거나, 콘카나발린 A 를 단독으로 꼬리 정맥 내에 투여하는 등의 방법으로 간염을 유도하고, 기인 물질 투여의 1 시간 ∼ 1 주일 후에 채취한 혈액 중의 GOT 및 GPT 농도나 간병변의 조직 병리학적 상태를 항 Orai1 항체군과 비투여군 사이에서 비교하는 것에 의해 평가한다.
골수 세포 이식에 있어서의 생착률이나 이식편 대 숙주병 예방에 대한 효과는, 인간 Orai1 노크인 마우스의 대퇴골이나 경골로부터 채취한 골수 내의 세포를, 단독 혹은 인간 Orai1 노크인 마우스의 비장에서 채취한 비세포와 조합하고, X 선 조사 레시피언트 마우스에 이입, 4 내지 16 주일의 체중 변화나 생존률, 시험 종료시의 혈액이나 조직 중의 항체·사이토카인·혈중 바이오 마커 농도, 장관·말초혈·흉선·비장·림프절·골수로부터 얻은 세포의 표면 항원·증식 활성·사이토카인 생산능을 항 Orai1 항체군과 비투여군 사이에서 비교하는 것에 의해 평가한다.
이식 장기의 생착률에 대한 효과는, 호스트 마우스의 미근부로부터 채취한 피부를, 피부를 절제하여 노출시킨 인간 Orai1 노크인 마우스의 배부 피근층에 고정시키고, 이식 후 4 내지 16 주일의 이식편의 크기와 생착 상태를 스코어화하여, 항 Orai1 항체군과 비투여군 사이에서 비교하는 것에 의해 평가한다.
이와 같이 하여 얻어진 Orai1 의 생물 활성을 중화하는 항체는, 의약으로서, 특히 이식물의 거절, 면역 관련 질환, 알레르기성 질환, 염증성 질환, 혈전증 또는 암 등을 예방 또는 치료하기 위한 항체로서 유용하다.
항 Orai1 항체는, 하나의 예로는, 이식물의 거절, 면역 관련 질환, 알레르기성 질환, 염증성 질환, 혈전증 또는 암의 치료 또는 예방에 대해서는 그 항체 단독으로, 혹은 적어도 1 개의 다른 치료제와 병용하여 투여할 수 있다. 항 Orai1 항체와 병용하여 투여할 수 있는 다른 치료제로는, 엽산 대사 길항제, 칼시뉴린 저해제, 부신피질 스테로이드제, 항흉선 세포 글로불린제, 핵산 대사 길항제, 핵산 합성 저해제, 세포 표면 항원을 표적으로 하는 생물 제제, 또는 사이토카인 혹은 사이토카인 수용체를 표적으로 하는 생물 제제 등을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.
상기의 치료제의 구체예로는, 엽산 대사 길항제로는 Methotrexate, 칼시뉴린 저해제로는 Cyclosporin, Taclorims, 부신피질 스테로이드제로는 Methylprednisolone, 핵산 합성 저해제로는 Cyclophosphamide, 항흉선 세포 글로불린제로는 Zetbulin, Lymphoglobuline, Thymoglobulin, 핵산 대사 길항제로는 Mycophenolate mofetil, 세포 표면 항원을 표적으로 하는 생물 제제로는 Alemtuzumab, Rituximab, 사이토카인 혹은 사이토카인 수용체를 표적으로 하는 생물 제제로는 Infliximab, Etanercept, Rituximab 등을 들 수 있다.
이식물의 거절, 면역 관련 질환, 알레르기성 질환, 염증성 질환, 혈전증 또는 암의 상태나 어느 정도의 치료 및/또는 예방을 목표로 하는지에 따라, 2, 3 혹은 그 이상의 종류의 다른 치료제를 투여할 수도 있고, 그들 다른 치료제는 동일한 제제 중에 봉입함으로써 동시에 투여할 수 있다. 다른 치료제와 항 Orai1 항체는 동일한 제제 중에 봉입함으로써 동시에 투여할 수도 있다. 또한, 항 Orai1 항체와 다른 치료제를 별도의 제제에 봉입하여 동시에 투여할 수도 있다. 또한, 다른 치료제와 항 Orai1 항체를 잇따라 별도로 투여할 수도 있다. 즉, 다른 치료제를 투여한 후에 항 Orai1 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 유효 성분으로서 함유하는 치료제를 투여하거나, 혹은 항 Orai1 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 유효 성분으로서 함유하는 치료제를 투여한 후에 다른 치료제를 투여해도 된다. 유전자 치료에 있어서 투여하는 경우에는, 단백질성의 치료제의 유전자와 항 Orai1 항체의 유전자는, 별도의 혹은 동일한 프로모터 영역의 하류에 삽입할 수 있고, 별도의 혹은, 동일한 벡터에 도입할 수 있다.
항 Orai1 항체, 혹은 그 프래그먼트에 대하여 치료제를 결합시킴으로써, M. C. Garnet 「Targeted drug conjugates : principles and progress」, Advanced Drug Delivery Reviews, (2001) 53, 171 - 216 에 기재된 표적형 약물 복합체를 제조할 수 있다. 이 목적에는, 항체 분자 외에, T 세포의 인식성을 완전 소실하고 있지 않은 한, 어느 항체 프래그먼트도 적용 가능하지만, 예를 들어, Fab, F(ab')2, Fv 등의 프래그먼트를 예로서 들 수 있고, 본 발명에 있어서도 동일하게, 항체 및 그 프래그먼트를 사용할 수 있다. 항 Orai1 항체 또는 그 항체의 프래그먼트와 치료제의 결합 양식은, M. C. Garnet 「Targeted drug conjugates : principles and progress」, Advanced Drug Delivery Reviews, (2001) 53, 171 - 216, G. T. Hermanson 「Bioconjugate Techniques」 Academic Press, California (1996), Putnam and J. Kopecek 「Polymer Conjugates with Anticancer Activity」 Advances in Polymer Science (1995) 122, 55 - 123 등에 기재되는 다양한 형태가 있을 수 있다. 즉, 항 Orai1 항체와 치료제가 화학적으로 직접 혹은 올리고 펩타이드 등의 스페이서를 개재하여 결합되는 양식이나, 적당한 약물 담체를 개재하여 결합되는 양식을 들 수 있다. 약물 담체의 예로는, 리포솜이나 수용성 고분자를 들 수 있다. 이들 약물 담체가 개재되는 양식으로는, 보다 구체적으로는, 항체와 치료제가 리포솜에 포함되고, 그 리포솜과 항체가 결합한 양식, 및, 치료제가 수용성 고분자 (분자량 1000 내지 10 만 정도의 화합물) 에 화학적으로 직접 혹은 올리고 펩타이드 등의 스페이서를 개재시켜 결합되고, 그 수용성 고분자에 항체가 결합한 양식을 예로서 들 수 있다. 항체 (또는 그 프래그먼트) 와 치료제, 리포솜 및 수용성 고분자 등의 약물 담체의 결합은, G. T. Hermanson 「Bioconjugate Techniques」 Academic Press, California (1996), Putnam and J. Kopecek 「Polymer Conjugates with Anticancer Activity」 Advances in Polymer Science (1995) 122, 55 - 123 에 기재된 방법 등의 당업자 주지의 방법에 의해 실시할 수 있다. 치료제의 리포솜에 대한 포함은, D. D. Lasic 「Liposomes : From Physics to Applications」, Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam (1993) 등에 기재된 방법 등의 당업자 주지의 방법에 의해 실시할 수 있다. 치료제의 수용성 고분자에 대한 결합은, D. Putnam and J Kopecek 「Polymer Conjugates with Anticancer Activity」 Advances in Polymer Science (1995) 122, 55-123 에 기재된 방법 등의 당업자 주지의 방법에 의해, 실시할 수 있다. 항체 (또는 그 프래그먼트) 와 단백질성의 치료제 (또는 그 프래그먼트) 의 복합체는, 상기의 방법 외에, 유전자 공학적으로, 당업자 주지의 방법에 의해 제작할 수 있다.
본 발명은, 치료 및/또는 예방에 유효한 양의 항 Orai1 항체와 약학상 허용되는 희석제, 담체, 가용화제, 유화제, 보존제 및/또는 보조제를 포함하는 의약 조성물도 제공한다.
본 발명은, 치료 및/또는 예방에 유효한 양의 항 Orai1 항체와 치료 및/또는 예방에 유효한 양의 적어도 1 개의 치료제와 약학상 허용되는 희석제, 담체, 가용화제, 유화제, 보존제 및/또는 보조제를 포함하는 의약 조성물도 제공한다. 치료제로는, 상기 서술한 엽산 대사 길항제, 칼시뉴린 저해제, 부신피질 스테로이드제, 항흉선 세포 글로불린제, 핵산 대사 길항제, 핵산 합성 저해제, 세포 표면 항원을 표적으로 하는 생물 제제, 또는 사이토카인 혹은 사이토카인 수용체를 표적으로 하는 생물 제제 등을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.
본 발명의 의약 조성물에 있어서 허용되는 제제에 사용하는 물질로는 바람직하게는 투여량이나 투여 농도에 있어서, 의약 조성물이 투여되는 자에 대하여 비독성인 것이 바람직하다.
본 발명의 의약 조성물은, pH, 침투압, 점도, 투명도, 색, 등장성, 무균성, 안정성, 용해율, 서방률, 흡수율, 침투율을 바꾸거나, 유지하기 위한 제제용의 물질을 포함할 수 있다. 제제용의 물질로서 이하의 것을 들 수 있지만, 이들에 제한되지 않는다 : 글리신, 알라닌, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신 등의 아미노산류, 항균제, 아스코르브산, 황산나트륨 또는 아황산수소나트륨 등의 항산화제, 인산, 시트르산, 붕산 버퍼, 탄산수소나트륨, 트리스-염산 (Tris-Hcl) 용액 등의 완충제, 만니톨이나 글리신 등의 충전제, 에틸렌디아민사아세트산 (EDTA) 등의 킬레이트제, 카페인, 폴리비닐피롤리딘, β-시클로덱스트린이나 하이드록시프로필-β-시클로덱스트린 등의 착화제, 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린 등의 증량제, 단당류, 이당류 등의 다른 탄수화물, 착색제, 향미제, 희석제, 유화제나 폴리비닐피롤리딘 등의 친수 폴리머, 저분자량 폴리펩타이드, 염 형성 카운터 이온, 염화벤즈알코늄, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 페네틸알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산 또는 과산화수소 등의 방부제, 글리세린, 프로필렌·글리콜 또는 폴리에틸렌글리콜 등의 용매, 만니톨 또는 소르비톨 등의 당알코올, 현탁제, 소르비탄에스테르, 폴리소르베이트 20 이나 폴리소르베이트 80 등의 폴리소르베이트, 트리톤 (triton), 트로메타민 (tromethamine), 레시틴 또는 콜레스테롤 등의 계면 활성제, 수크로오스나 소르비톨 등의 안정화 증강제, 염화나트륨, 염화칼륨이나 만니톨·소르비톨 등의 탄성 증강제, 수송제, 부형제, 및/또는 약학상의 보조제. 이들 제제용의 물질의 첨가량은, 항 Orai1 항체의 중량에 대하여 0.01 ∼ 100 배, 특히 0.1 ∼ 10 배 첨가하는 것이 바람직하다. 제제 중의 바람직한 의약 조성물의 조성은 당업자에 의해, 적용 질환, 적용 투여 경로 등에 따라 적절히 결정할 수 있다.
의약 조성물 중의 부형제나 담체는 액체여도 되고 고체여도 된다. 적당한 부형제나 담체는 주사용의 물이나 생리 식염수, 인공 뇌척수액이나 비경구 투여에 통상적으로 이용되고 있는 다른 물질이어도 된다. 중성의 생리 식염수나 혈청 알부민을 포함하는 생리 식염수를 담체로 사용할 수도 있다. 의약 조성물에는 pH 7.0 - 8.5 의 Tris 버퍼, pH 4.0 - 5.5 의 아세트산 버퍼, pH 3.0 - 6.2 의 시트르산 버퍼를 포함할 수 있다. 또한, 이들 버퍼에 소르비톨이나 다른 화합물을 포함할 수도 있다. 본 발명의 의약 조성물에는 항 Orai1 항체를 포함하는 의약 조성물 그리고, 항 Orai1 항체 및 적어도 1 개의 치료제를 포함하는 의약 조성물을 들 수 있고, 본 발명의 의약 조성물은 선택된 조성과 필요한 순도를 가지는 약제로서, 동결 건조품 혹은 액체로서 준비된다. 항 Orai1 항체를 포함하는 의약 조성물 그리고, 항 Orai1 항체 및 적어도 1 개의 치료약제를 포함하는 의약 조성물은 수크로오스와 같은 적당한 부형제를 사용한 동결 건조품으로서 성형될 수도 있다.
본 발명의 의약 조성물은 비경구 투여용으로 조제할 수도 있고, 경구에 의한 소화관 흡수용으로 조제할 수도 있다. 제제의 조성 및 농도는 투여 방법에 따라 결정할 수 있고, 본 발명의 의약 조성물에 포함되는, 항 Orai1 항체의 Orai1 에 대한 친화성, 즉, Orai1 에 대한 해리 정수 (Kd 치) 에 대하여, 친화성이 높을 (Kd 치가 낮을) 수록, 인간에 대한 투여량을 적게 해도 약효를 발휘할 수 있기 때문에, 이 결과에 기초하여 본 발명의 의약 조성물의 인간에 대한 투여량을 결정할 수도 있다. 투여량은, 인간형 항 Orai1 항체를 인간에 대하여 투여할 때에는, 약 0.1 ∼ 100 ㎎/㎏ 을 1 ∼ 180 일간 1 회 투여하면 된다.
본 발명의 의약 조성물의 형태로는, 점적을 포함하는 주사제, 좌제, 경비제, 설하제, 경피 흡수제 등을 들 수 있다.
승인되어 있는 항체 제제의 대부분은 정맥 내 투여이지만, 많은 의료 현장에서는 피하 투여가 보다 선호된다. 그 경우에는 용량이 1.0 ∼ 1.5 ㎖ 로 제한되기 때문에, 투여량에 따라서는 고농도의 항체 용액이 요구된다. 그러나, 고농도화하면 약액의 점성이 증가하기 때문에, 상용되는 주사 바늘의 굵기에서는, 그 높은 점성으로 인하여 주사할 수 없다는 사태가 발생할 수 있다. 요컨대, 의약 조성물의 형태로는, 주사제를 선택하는 경우, 점도가 낮다는 성질은 우선되어야 하는 중요한 의미가 있어, 점도를 지표로 바람직한 항체를 선택할 수 있다.
실시예
이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다. 또한, 하기 실시예에 있어서 유전자 조작에 관한 각 조작은 특별히 명시가 없는 한, 「몰레큘러 클로닝 (Molecular Cloning)」 (Sambrook, J., Fritsch, E. F. 및 Maniatis, T. 저, Cold Spring Harbor Laboratory Press 로부터 1989년에 발간) 에 기재된 방법에 의해 실시하거나, 또는, 시판되는 시약이나 키트를 사용하는 경우에는 시판품의 지시서에 따라 사용하였다.
[실시예 1] 래트 항인간 Orai1 항체의 제작
1)-1 면역
1)-1-1 인간 Orai1 발현 벡터 (pcDNA3.1-hOrai1) 의 구축
인간 Orai1 의 유전자 배열은 pDONR221 (Life Technologies 사) 에 클로닝된 Ultimate ORF clone (Clone No. IOH40869, Life Technologies 사) 을 구입하여 사용하였다. 유전자 배열을 배열표의 배열 번호 1 에, 또한 아미노산 배열을 배열표의 배열 번호 2 에 나타낸다. 또한, pcDNA3.1 (＋) 를 Gateway Vector Conversion System (Life Technologies 사) 에 의해 Destination Vector 로 개변한 pcDNA3.1-DEST 를 제작하였다. Gateway LR Clonase Enzyme mix (Life Technologies 사) 를 사용하여, pcDNA3.1-DEST 와 att 배열 내를 재조합하여, 인간 Orai1 발현 벡터 pcDNA3.1-hOrai1 을 제작하였다. 인간 Orai1 발현 벡터의 대량 조제에는, EndoFree Plasmid Giga Kit (QIAGEN 사) 를 사용하였다.
1)-1-2 래트 면역
면역에는 WKY/Izm 래트의 암컷 (니혼 에스엘시사) 을 사용하였다. 먼저 래트 양 다리 종아리부를 Hyaluronidase (SIGMA-ALDRICH 사) 로 전처리 후, 동일 부위에 pcDNA3.1-hOrai1 을 근주하였다. 계속해서, ECM830 (BTX 사) 을 사용하여, 2 니들 전극을 사용하여, 동일 부위에 인비보 일렉트로포레이션을 실시하였다. 2 주일에 1 번, 동일한 인비보 일렉트로포레이션을 반복한 후, 래트의 림프절을 채취하여 하이브리도마 제작에 사용하였다.
1)-2 하이브리도마 제작
림프절 세포와 마우스 미엘로마 SP2/0-ag14 세포를 Hybrimune Hybridoma Production System (Cyto Pulse Sciences 사) 을 사용하여 전기 세포 융합하고, Clona Cell-HY Selection Medium D (StemCell Technologies 사) 에 희석하여 배양하였다. 출현한 하이브리도마 콜로니를 회수함으로써 모노 클론 하이브리도마를 제작하였다. 회수된 각 하이브리도마 콜로니를 배양하고, 얻어진 하이브리도마 배양 상청을 사용하여 항인간 Orai1 항체 생산 하이브리도마의 스크리닝을 실시하였다.
1)-3 Cell-ELISA 법에 의한 1 차 스크리닝
1)-3-1 Cell-ELISA 용 항원 유전자 발현 세포의 조제
HEK293 세포를 10 ％ FBS 함유 DMEM 배지 중 7.5 x 105 세포/㎖ 가 되도록 조제하였다. 그에 대하여, 리포펙타민 2000 을 사용한 형질 이입 순서에 따라, pcDNA3.1-hOrai1 혹은 컨트롤로서 pcDNA3.1-DEST 를 도입하고, 96-웰 플레이트 (Corning 사) 에 50 ㎕ 씩 분주하고, 10 ％ FBS 함유 DMEM 배지 중에서 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 이틀 밤 배양하였다. 얻어진 도입 세포를 접착 상태인 채로, Cell-ELISA 에 사용하였다.
1)-3-2 Cell-ELISA
실시예 1)-1-1 에서 조제한 발현 벡터 도입 HEK293 세포의 배양 상청을 제거 후, pcDNA3.1-hOrai1 또는 pcDNA3.1-DEST 도입 HEK293 세포의 각각에 대하여 하이브리도마 배양 상청을 첨가하고, 4 ℃ 에서 1 시간 정치 (靜置) 하였다. 웰 중의 세포를 5 ％ FBS 함유 PBS 로 1 회 세정 후, 5 ％ FBS 함유 PBS 로 500 배로 희석한 래빗에서 생산된 항-래트 IgG-페록시다아제 항체 (SIGMA 사) 를 첨가하여, 4 ℃ 에서 1 시간 정치하였다. 웰 중의 세포를 5 ％ FBS 함유 PBS 로 6 회 세정한 후, OPD 발색액 (OPD 용해액 (0.05 M 시트르산삼나트륨, 0.1 M 인산수소이나트륨·12 수 pH 4.5) 에 o-페닐렌디아민이염산염 (와코 순약사), H2O2 를 각각 0.4 ㎎/㎖, 0.6 ％ (v/v) 가 되도록 용해) 을 25 ㎕/웰로 첨가하였다. 가끔 교반하면서 발색 반응을 실시하여, 1 M HCl 을 25 ㎕/웰을 첨가하여 발색 반응을 정지시킨 후, 플레이트 리더 (ENVISION : Perkin Elmer 사) 로 490 ㎚ 의 흡광도를 측정하였다. 세포막 표면 상에 발현하는 인간 Orai1 에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 선택하기 위해서, 컨트롤의 pcDNA3.1-DEST 도입 HEK293 세포와 비교하여, pcDNA3.1-hOrai1 발현 벡터 도입 HEK293 세포 쪽에서 보다 높은 흡광도를 나타내는 배양 상청을 생산하는 하이브리도마를 항인간 Orai1 항체 생산 양성으로서 선택하였다.
1)-4 플로우 사이토메트리에 의한 2 차 스크리닝
1)-4-1 플로우 사이토메트리 해석용 항원 유전자 발현 세포의 조제
HEK293T 세포를 5 × 104 세포/㎠ 가 되도록 225 평방 cm 플라스크에 파종하고, 10 ％ FBS 함유 DMEM 배지 중에서 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 하룻밤 배양하였다. 다음날, pcDNA3.1-hOrai1 과 컨트롤로서 pcDNA3.1-DEST 를 각각 HEK293T 세포에 리포펙타민 2000 을 사용하여 도입하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 추가로 이틀 밤 배양하였다. 다음날, 발현 벡터 도입 HEK293T 세포를 TrypLE Express (Life Technologies 사) 로 처리하고, 10 ％ FBS 함유 DMEM 으로 세포를 세정한 후, 5 ％ FBS 함유 PBS 에 현탁하였다. 얻어진 세포 현탁액을 플로우 사이토메트리 해석에 사용하였다.
1)-4-2 플로우 사이토메트리 해석
실시예 1)-3 의 Cell-ELISA 에서 양성으로 판정된 하이브리도마가 생산하는 항체의 인간 Orai1 에 대한 결합 특이성을 플로우 사이토메트리법에 의해 추가로 확인하였다. 실시예 1)-4-1 에서 조제한 HEK293T 세포 현탁액을 원심하고, 상청을 제거한 후, pcDNA3.1-DEST 도입 HEK293T 세포 및 pcDNA3.1-hOrai1 도입 HEK293T 세포의 각각에 대하여 하이브리도마 배양 상청을 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 1 시간 정치하였다. 5 ％ FBS 함유 PBS 로 1 회 세정한 후, 5 ％ FBS 함유 PBS 로 500 배로 희석한 항-래트 IgG FITC 콘주게이트 (SIGMA 사) 를 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 1 시간 정치하였다. 5 ％ FBS 함유 PBS 로 3 회 세정한 후, 2 ㎍/㎖ 7-아미노액티모머이신 D (7-aminoactinomycin) D (Molecular Probes 사) 를 포함하는 5 ％ FBS 함유 PBS 에 재현탁하고, 플로우 사이토미터 (FC500 : Beckman Coulter 사) 로 검출을 실시하였다. 데이터 해석은 Flowjo (Tree Star 사) 로 실시하였다. 7-아미노액티모머이신 D 양성의 사세포를 게이트로 제외한 후, 생세포의 FITC 형광 강도의 히스토그램을 작성하였다. 컨트롤인 pcDNA3.1-DEST 도입 HEK293T 세포의 형광 강도 히스토그램에 대하여 pcDNA3.1-hOrai1 도입 HEK293T 세포의 히스토그램이 강형광 강도측에 시프트하고 있는 샘플을 생산하는 하이브리도마를 항인간 Orai1 항체 생산 하이브리도마로서 취득하였다. 결과적으로 유의하게 시프트한 하이브리도마가 225 개 취득되었다.
1)-5 항체의 아이소타입 결정
1)-4 에서 취득된 래트 항인간 Orai1 항체 생산 하이브리도마 중에서, 강하게 인간 Orai1 에 결합하는 것이 시사된 R118 및 R198 을 선발하여, 항체 아이소타입을 동정하였다. 아이소타입은, 래트 모노클로널 이소타이핑 테스트 키트 (Rat monoclonal isotyping test kit)(AbD Serotec 사) 에 의해 결정되었다. 그 결과, 래트 항인간 Orai1 모노클로날 항체 R118 및 R198 의 아이소타입은 모두 IgG2a, κ 사슬인 것이 나타났다.
1)-6 래트 항인간 Orai1 항체의 조제
래트 항인간 Orai1 모노클로날 항체는, 하이브리도마 배양 상청으로부터 정제하였다.
먼저, R118 및 R198 생산 하이브리도마를 ClonaCell-HY Selection Medium E 로 충분한 양까지 증식시킨 후, Ultra Low IgG FBS (Life Technologies 사) 를 20 ％ 첨가한 Hybridoma SFM (Life Technologies 사) 으로 배지 교환하고, 5 일간 배양하였다. 본 배양 상청을 회수하여 0.45 ㎛ 의 필터를 통과시켜 멸균하였다.
항체는, 상기의 하이브리도마 상청으로부터 프로테인 G 어피니티 크로마토그래피 (4 ∼ 6 ℃ 하) 1 단계 공정으로 정제하였다. 프로테인 G 어피니티 크로마토그래피 정제 후의 버퍼 치환 공정은 4 ∼ 6 ℃ 하에서 실시하였다. 먼저, PBS 로 평형화한 프로테인 G (GE Healthcare Bioscience 사) 가 충전된 칼럼에 하이브리도마의 배양 상청을 어플라이하였다. 배양 상청액이 칼럼에 모두 들어간 후, 칼럼 용량 2 배 이상의 PBS 로 칼럼을 세정하였다. 다음으로 0.1 M 글리신/염산 수용액 (pH 2.7) 으로 용출하고, 항체가 포함되는 획분을 수집하였다. 수집한 획분에 1 M Tris-HCl (pH 9.0) 을 첨가하여 pH 7.0 ∼ 7.5 로 조제한 후에, Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20 (분획 분자량 UF30K, Sartorius 사, 4 ∼ 6 ℃ 하) 으로 PBS 에 대한 버퍼 치환을 실시함과 함께 농축을 실시하여, 항체 농도를 0.2 ㎎/㎖ 이상으로 조제하였다. 마지막으로 Minisart-Plus filter (Sartorius 사) 로 여과하여, 정제 샘플로 하였다.
[실시예 2] 래트 항인간 Orai1 항체의 in vitro 평가
2)-1 플로우 사이토메트리에 의한 래트 항인간 Orai1 항체의 결합능 평가
Orai1 에 대한 결합 특이성을 평가하기 위해서, 1)-4-1 에서 나타내는 방법에 의해 제작한 pcDNA3.1-DEST 도입 HEK293T 세포 현탁액 혹은 pcDNA3.1-hOrai1 도입 HEK293T 세포 현탁액을 원심하고, 상청을 제거한 후, 각각에 대하여 1)-6 에서 제작한 래트 항인간 Orai1 모노클로날 항체인 R118, R198 혹은 래트 IgG 컨트롤 항체 (Beckman Coulter 사) 를 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 30 분 정치하였다. 5 ％ FBS 함유 PBS 로 2 회 세정한 후, 5 ％ FBS 함유 PBS 로 320 배로 희석한 항-래트 IgG FITC 콘주게이트를 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 30 분 정치하였다. 5 ％ FBS 함유 PBS 로 2 회 세정한 후, 1 ㎍/㎖ 프로피디움 요오드화물 (Life Technologies 사) 를 포함하는 5 ％ FBS 함유 PBS 에 재현탁하고, 플로우 사이토미터 (FC500) 로 검출을 실시하였다. 데이터 해석은 Flowjo 로 실시하였다. 프로피디움 요오드화물 양성의 사세포를 게이트로 제외한 후, 생세포의 FITC 형광 강도의 히스토그램을 작성하고, 평균 형광 강도 (MFI) 를 산출하였다. R118 및 R198 은, pcDNA3.1-DEST 도입 HEK293T 세포에는 결합하지 않고, 도 1 에 나타내는 바와 같이 pcDNA3.1-hOrai1 도입 HEK293T 세포에만 농도 의존적으로 결합한 것으로부터, 특이적으로 인간 Orai1 에 결합하는 것이 나타났다. 한편, 래트 IgG 컨트롤 항체에서는 결합은 관찰되지 않았다.
2)-2 래트 항인간 Orai1 항체의 T 세포 활성화 억제 작용
인간 T 세포주인 Jurkat 세포를, 10 ％ FBS, 100 U/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 (Life Technologies 사) 를 포함하는 RPMI1640 (Life Technologies 사) 로 1.5 x 106 세포/㎖ 의 농도로 조제하고, 96-웰 세포 배양 플레이트에 80 ㎕ 씩 파종하고, 래트 항인간 Orai1 모노클로날 항체인 R118, R198, 혹은 래트 IgG 컨트롤 항체를 10 ㎕/웰 첨가하여 37 ℃, 5 ％ CO2 하에서 60 분간 전처치하였다. 그 후, 100 ng/㎖ PMA (SIGMA 사) 및 1 ㎍/㎖ A23187 (SIGMA 사) 를 10 ㎕/웰 첨가하고 (최종 농도 10 ng/㎖ PMA 및 100 ng/㎖ A23187), 잘 교반한 후, 약 16 시간 37 ℃, 5 ％ CO2 하에서 배양하였다. 플레이트를 잘 교반한 후, 600 g 으로 3 분간 원심하고, 상청에 포함되는 인터류킨-2 (IL-2) 농도를 ELISA 법 (R＆D 사) 으로 측정하였다. 도 2 는 취득한 래트 항인간 Orai1 모노클로날 항체가 PMA 및 A23187 처리된 Jurkat 세포로부터의 IL-2 의 방출을 첨가 농도 의존적으로 억제하는 것을 나타낸다. R118 및 R198 은 Jurkat 세포로부터의 IL-2 의 방출을 첨가 농도 의존적으로 저해하였다. 한편, 래트 IgG 컨트롤 항체에서는 저해는 관찰되지 않았다.
[실시예 3] 래트 항인간 Orai1 항체의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 배열의 결정
3)-1 cDNA 합성
R118 및 R198 의 각 항체 생생 하이브리도마의 세포 용해액 (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 250 mM LiCl, 5 mM EDTA (pH 8), 0.5 ％ 도데실황산 Li (LiDS), 2.5 mM 디티오트레이톨 (DTT)) 을, 올리고 dT25 가 결합한 자기 비즈 (Dynabeads mRNA DIRECT Kit, Invitrogen 사) 와 혼합하고, mRNA 를 자기 비즈에 결합시켰다. 다음으로 자기 비즈를 mRNA 세정 용액 A (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.15 M LiCl, 1 mM EDTA, 0.1 ％ LiDS, 0.1 ％ 트리톤X-100) 와 cDNA 합성용 용액 (50 mM Tris-HCl (pH 8.3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl2, 5 mM DTT, 0.5 mM dNTP, 0.2 ％ 트리톤X-100, 1.2 유닛 RNase 저해제 (Life Technologies 사) 로 1 회씩 세정한 후, 12 unit SuperScriptIII Reverse Transcriptase (Life Technologies 사) 를 첨가한 cDNA 합성용 용액으로 cDNA 합성을 실시하였다. 계속해서 3' 테일링 반응 용액 (50 mM 인산칼륨, 4 mM MgCl2, 0.5 mM dGTP, 0.2 ％ 트리톤X-100, 1.2 유닛 RNase 저해제 (Life Technologies 사)) 로 세정한 후, 48 유닛 터미널 트랜스페라아제 (Terminal Transferase), 리컴비넌트 (recombinant) (Roche 사) 를 첨가한 반응 용액으로 3' 테일링 반응을 실시하였다.
3)-2 래트 면역 글로불린 중, 경사슬 가변 영역 유전자 단편의 증폭 및 배열 결정
자기 비즈를 TE 용액 (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.1 ％ 트리톤X-100) 으로 세정 후, 5'-RACE PCR 법을 사용하여 래트 면역 글로불린 중사슬 및 경사슬 유전자의 증폭을 실시하였다. 즉, 자기 비즈를 PCR 반응 용액 (0.2 μM 프라이머, 0.2 mM dNTP, 0.25 unit PrimeSTAR HS DNA 폴리메라아제 (TAKARA 사)) 으로 옮겨, 94 ℃ 30 초 - 68 ℃ 90 초의 반응을 35 사이클 실시하였다. 사용한 프라이머 세트는 하기와 같다.
PCR 프라이머 세트 (중사슬용)
5'-GCTAGCGCTACCGGACTCAGATCCCCCCCCCCCCCDN-3' (Nhe-polyC-S) (배열 번호 3)
5'-TCACTGAGCTGGTGAGAGTGTAGAGCCC-3' (rIgγ-AS1) (배열 번호 4)
5'-TCACCGAGCTGCTGAGGGTGTAGAGCCC-3' (rIgγ-AS2) (배열 번호 5)
PCR 프라이머 세트 (경사슬용)
5'-GCTAGCGCTACCGGACTCAGATCCCCCCCCCCCCCDN-3' (Nhe-polyC-S) (배열 번호 6) (중사슬용과 동일)
5'-TCAGTAACACTGTCCAGGACACCATCTC-3' (rIgκ-AS) (배열 번호 7)
상기 PCR 반응에 의해 증폭한 단편에 대하여, 염기 배열의 시퀀스 해석을 실시하였다. 중사슬용 시퀀스 프라이머로서 5'-CTGGCTCAGGGAAATAGCC-3' (rIgγ-seq) (배열 번호 8), 경사슬용 시퀀스 프라이머로서 5'-TCCAGTTGCTAACTGTTCC-3' (rIgκ-seq) (배열 번호 9) 의 염기 배열을 갖는 올리고 뉴클레오티드를 각각 사용하였다.
시퀀스 해석은 유전자 배열 해석 장치 (「ABI PRISM 3700 DNA Analyzer ; Applied Biosystems」 혹은 「Applied Biosystems 3730xl Analyzer ; Applied Biosystems」) 를 사용하여 실시하고, 시퀀스 반응은, Dye Terminator Cycle Sequencing System with AmpliTaq DNA polymerase (Life Technologies 사) 및 GeneAmp 9700 (Applied Biosystems 사) 을 사용하였다.
결정된 R118 및 R198 의 중, 경사슬의 가변 영역을 코드하는 뉴클레오티드 배열을 배열표의 배열 번호 10 (R118 경사슬), 12 (R118 중사슬) 배열 번호 14 (R198 경사슬) 및 16 (R198 중사슬) 에 각각 나타냈다. 또한, 그 가변 영역의 아미노산 배열을, 배열표의 배열 번호 11 (R118 경사슬), 13 (R118 중사슬), 배열 번호 15 (R198 경사슬) 및 17 (R198 중사슬) 에 각각 나타냈다. 배열 번호 10 및 11 은 도 14 에, 배열 번호 12 및 13 은 도 15 에, 배열 번호 14 및 15 는 도 16 에, 배열 번호 16 및 17 은 도 17 에, 각각 기재되어 있다.
[실시예 4] 인간 키메라화 항인간 Orai1 항체의 제작
4)-1 키메라화 및 인간화 경사슬 발현 벡터 pCMA-LK 의 구축
플라스미드 pcDNA 3.3-TOPO/LacZ (Life Technologies 사) 를 제한 효소 XbaI 및 PmeI 로 소화하여 얻어지는 약 5.4 kb 의 프래그먼트와, 배열표의 배열 번호 18 에 나타내는 인간 κ 사슬 분비 시그널 및 인간 κ 사슬 정상 영역을 코드하는 배열을 포함하는 DNA 단편을 In-Fusion Advantage PCR 클로닝 키트 (CLONTECH 사) 를 사용하여 결합하여, pcDNA 3.3/LK 를 제작하였다.
pcDNA 3.3/LK 를 주형으로 하여, 하기 프라이머 세트로 PCR 을 실시하고, 얻어진 약 3.8 kb 의 프래그먼트를 인산화 후 셀프 라이게이션함으로써 CMV 프로모터의 하류에 시그널 배열, 클로닝 사이트, 및 인간 κ 사슬 정상 영역을 가지는, 키메라화 및 인간화 항체 경사슬 발현 벡터 pCMA-LK 를 구축하였다.
프라이머 세트
5'-TATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGC-3' (배열 번호 19 : 프라이머 3.3-F1)
5'-GCTATGGCAGGGCCTGCCGCCCCGACGTTG-3' (배열 번호 20 : 프라이머 3.3-R1)
4)-2 키메라화 및 인간화 IgG1 타입 중사슬 발현 벡터 pCMA-G1 의 구축
pCMA-LK 를 XbaI 및 PmeI 로 소화하여 κ 사슬 분비 시그널 및 인간 κ 사슬 정상 영역을 제거한 DNA 단편과, 배열표의 배열 번호 21 에 나타내는 인간 중사슬 시그널 배열 및 인간 IgG1 정상 영역의 아미노산을 코드하는 배열을 포함하는 DNA 단편을 In-Fusion Advantage PCR 클로닝 키트를 사용하여 결합하여, CMV 프로모터의 하류에 시그널 배열, 클로닝 사이트, 인간 IgG1 중사슬 정상 영역을 가지는 키메라 및 인간화 항체 IgG1 타입 중사슬 발현 벡터 pCMA-G1 을 구축하였다.
4)-3 인간 키메라화 항인간 Orai1 항체 경사슬 발현 벡터의 구축
4)-3-1 인간 키메라화 R118 경사슬 cR118＿L 발현 벡터의 구축
실시예 3)-2 에서 얻어진 R118 경사슬의 가변 영역을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사 인공 유전자 합성 서비스). 키메라화 및 인간화 항체 경사슬 발현 범용 벡터 pCMA-LK 를 제한 효소 XbaI 및 PmeI 로 절단하여 얻은 약 3.4 kb 의 DNA 단편에, R118 경사슬의 가변 영역을 포함하는 DNA 단편을 동일한 제한 효소로 절단하여 얻은 약 0.7 kb 의 DNA 단편을 Ligation High ver.2 (TOYOBO 사) 를 사용하여 삽입함으로써, 인간 키메라화 R118 경사슬 (cR118＿L) 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pCMA-LK/cR118＿L」 이라고 명명하였다. 인간 키메라화 cR118 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 그 경사슬의 아미노산 배열을, 배열표의 배열 번호 22 및 23 (도 18) 에 각각 나타낸다.
4)-3-2 인간 키메라화 R198 경사슬 cR198＿L 발현 벡터의 구축
실시예 3)-2 에서 얻어진 R198 경사슬의 가변 영역을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사 인공 유전자 합성 서비스). 키메라화 및 인간화 항체 경사슬 발현 범용 벡터 pCMA-LK 를 제한 효소 XbaI 및 PmeI 로 절단하여 얻은 약 3.4 kb 의 DNA 단편에, R198 경사슬의 가변 영역을 포함하는 DNA 단편을 동일한 제한 효소로 절단하여 얻은 약 0.7 kb 의 DNA 단편을 Ligation High ver.2 (TOYOBO 사) 를 사용하여 삽입함으로써, 인간 키메라화 R198 경사슬 (cR198＿L) 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pCMA-LK/cR198＿L」 이라고 명명하였다. 인간 키메라화 cR198 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 그 경사슬의 아미노산 배열을, 배열표의 배열 번호 24 및 25 (도 19) 에 각각 나타낸다.
4)-4 인간 키메라화 항인간 Orai1 항체 중사슬 발현 벡터의 구축
4)-4-1 인간 키메라화 R118 중사슬 cR118＿H 발현 벡터의 구축
실시예 3)-2 에서 얻어진 R118 중사슬의 가변 영역을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사 인공 유전자 합성 서비스). 키메라화 및 인간화 IgG1 타입 중사슬 발현 벡터 pCMA-G1 을 제한 효소 BlpI 로 절단하여 얻은 약 4.5 kb 의 DNA 단편에, R118 중사슬의 가변 영역을 포함하는 DNA 단편을 동일한 제한 효소로 절단하여 얻은 약 0.3 kb 의 DNA 단편을 Ligation High ver.2 를 사용하여 삽입함으로써, 인간 키메라화 R118 중사슬 (cR118＿H) 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pCMA-G1/cR118＿H」 라고 명명하였다. 인간 키메라화 cR118 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 그 중사슬의 아미노산 배열을, 배열표의 배열 번호 26 및 27 (도 20) 에 각각 나타낸다.
4)-4-2 인간 키메라화 R198 중사슬 cR198＿H 발현 벡터의 구축
실시예 3)-2 에서 얻어진 R198 중사슬의 가변 영역을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사 인공 유전자 합성 서비스). 키메라화 및 인간화 IgG1 타입 중사슬 발현 벡터 pCMA-G1 을 제한 효소 BlpI 로 절단하여 얻은 약 4.5 kb 의 DNA 단편에, R198 중사슬의 가변 영역을 포함하는 DNA 단편을 동일한 제한 효소로 절단하여 얻은 약 0.3 kb 의 DNA 단편을 Ligation High ver.2 를 사용하여 삽입함으로써, 인간 키메라화 R198 중사슬 (cR198＿H) 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pCMA-G1/cR198＿H」 라고 명명하였다. 인간 키메라화 cR198 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 그 중사슬의 아미노산 배열을, 배열표의 배열 번호 28 및 29 (도 21) 에 각각 나타낸다.
4)-5 인간 키메라화 항인간 Orai1 항체의 조제
4)-5-1 인간 키메라화 항인간 Orai1 항체의 생산
FreeStyle 293F 세포 (Life Technologies 사) 는 매뉴얼에 따라, 계대, 배양을 실시하였다.
대수 증식기의 107 개의 FreeStyle 293F 세포 (Life Technologies 사) 를 30 ㎖ 보틀 (Thermo Fisher 사) 에 파종하고, FreeStyle293 expression medium (Life Technologies 사) 으로 희석하여 9 ㎖ 로 조제한 후에, 37 ℃, 8 ％ CO2 인큐베이터 내에서 135 rpm 으로 1 시간 진탕 배양하였다. Polyethyleneimine (폴리에틸렌이민)(Polyscience ＃24765) 30 ㎍ 을 Opti-Pro SFM (Life Technologies 사) 500 ㎕ 에 용해시키고, 다음으로 QIAGEN Plasmid Maxi Kit (QIAGEN 사) 를 사용하여 조제한 인간 키메라화 항인간 Orai1 항체 중사슬 발현 벡터 (4 ㎍) 및 인간 키메라화 항인간 Orai1 항체 경사슬 발현 벡터 (6 ㎍) 를 500 ㎕ 의 Opti-Pro SFM 에 현탁하였다. 폴리에틸렌이민/Opti-Pro SFM 혼합액 500 ㎕ 에, 발현 벡터/Opti-Pro SFM 혼합액 500 ㎕ 를 첨가하여 조심스럽게 교반하고, 추가로 5 분간 방치한 후에 FreeStyle 293F 세포에 첨가하였다. 37 ℃, 8 ％ CO2 인큐베이터로 5 - 7 일간, 95 rpm 으로 진탕 배양하여 얻어진 배양 상청을 0.22 ㎛ 마일렉스 필터 (Millipore 사) 로 여과하였다.
pCMA-G1/cR118＿H 와 pCMA-LK/cR118＿L 의 조합에 의해 취득된 인간 키메라화 R118 을 「cR118」 이라고 명명하였다. 동일하게 pCMA-G1/cR198＿H 와 pCMA-LK/cR198＿L 의 조합에 의해 취득된 인간 키메라화 R198 을 「cR198」 이라고 명명하였다.
4)-5-2 인간 키메라화 항인간 Orai1 항체의 정제
4)-5-1 에서 얻어진 배양 상청을, r프로테인 A 어피니티 크로마토그래피 1 단계 공정으로 정제하였다. 먼저, 배양 상청 10 ㎖ 를, PBS 로 평형화한 MabSelectSuRe (GE Healthcare Bioscience 사) 에 어플라이하였다. 배양액이 칼럼에 모두 들어간 후, PBS 7 ㎖ 로 칼럼을 세정하였다. 다음으로 2 M Arginine-HCl pH 4.0 5 ㎖ 로 용출하고, 그 용출액을, PD-10 탈염 칼럼 (GE Healthcare Bioscience 사) 으로 히스티딘 버퍼 (25 mM Histidine, 5 ％ Sorbitor, pH 6.0) 4 ㎖ 로 치환하였다. 마지막으로 Amicon Ultracel 30K (분획 분자량 30 K, Millipore 사) 로 약 100 ㎕ 로 농축하여, 정제 샘플로 하였다.
[실시예 5] 인간 키메라화 항인간 Orai1 항체의 in vitro 활성
5)-1 플로우 사이토메트리에 의한 인간 키메라화 항인간 Orai1 항체의 항원 결합 활성
인간 Orai1 에 대한 결합 특이성을 평가하기 위해서, 1)-4-1 에서 나타내는 방법에 의해 제작한 pcDNA3.1-DEST 도입 HEK293T 세포 현탁액 혹은 pcDNA3.1-hOrai1 도입 HEK293T 세포 현탁액을 원심하고, 상청을 제거한 후, 각각에 대하여 4)-5 에서 제작한, 인간 키메라화 항인간 Orai1 항체인 cR118, cR198, 혹은 인간 IgG 컨트롤 항체 (Jackson Immunoresearch 사) 를 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 30 분 정치하였다. 5 ％ FBS 함유 PBS 로 2 회 세정한 후, 5 ％ FBS 함유 PBS 로 100 배로 희석한 항-인간 IgG FITC 콘주게이트 (conjugate) (Jackson Immunoresearch 사) 를 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 30 분 정치하였다. 5 ％ FBS 함유 PBS 로 2 회 세정한 후, 1 ㎍/㎖ 프로피디움 요오드화물 (Propidium iodide) (Invitrogen 사) 을 포함하는 5 ％ FBS 함유 PBS 에 재현탁하고, 플로우 사이토미터 (FC500) 로 검출을 실시하였다. 데이터 해석은 Flowjo 로 실시하였다. 프로피디움 요오드화물 양성의 사세포를 게이트로 제외한 후, 생세포의 FITC 형광 강도의 히스토그램을 작성하고, 평균 형광 강도 (MFI) 를 산출하였다. cR118 및 cR198 은, pcDNA3.1-DEST 도입 HEK293T 세포에는 결합하지 않고, 도 3 에 나타내는 바와 같이 pcDNA3.1-hOrai1 도입 HEK293T 세포에만 농도 의존적으로 결합한 것으로부터, 특이적으로 인간 Orai1 에 결합하는 것이 나타났다. 한편, 인간 IgG 컨트롤 항체에서는 결합은 관찰되지 않았다.
5)-2 인간 키메라화 항인간 Orai1 항체의 인간 T 세포주 활성화 억제 작용
인간 T 세포주인 Jurkat 세포를, 10 ％ FBS, 100 U/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 포함하는 RPMI1640 으로 1.5 x 106 세포/㎖ 의 농도로 조제하고, 96-웰 세포 배양 플레이트에 80 ㎕ 씩 파종하고, 인간 키메라화 항인간 Orai1 항체인 cR198 및 cR118 과 모항체인 R198, 혹은 인간 IgG 컨트롤 항체를 10 ㎕/웰 첨가하여 37 ℃, 5 ％ CO2 하에서 60 분간 전처치하였다. 그 후, 100 ng/㎖ PMA 및 1 ㎍/㎖ A23187 을 10 ㎕/웰 첨가하고, 잘 교반한 후, 약 16 시간 37 ℃, 5 ％ CO2 하에서 배양하였다. 플레이트를 잘 교반한 후, 600 g 으로 3 분간 원심하고, 상청에 포함되는 IL-2 농도를 ELISA 법으로 측정하였다. 도 4 는 제작한 인간 키메라화 항인간 Orai1 항체가 PMA 및 A23187 처리된 Jurkat 세포로부터의 IL-2 의 방출을 첨가 농도 의존적으로 억제하는 것을 나타낸다. cR118 및 cR198 은 Jurkat 세포로부터의 IL-2 의 방출을 첨가 농도 의존적으로 저해하고, 그 저해 강도는 모항체인 R198 과 동등하였다. 한편, 인간 IgG 컨트롤 항체에서는 저해는 관찰되지 않았다.
[실시예 6] 인간 키메라화 항인간 Orai1 항체 cR198 의 인간화 버젼 hR198 의 설계
6)-1 R198 의 가변 영역의 분자 모델링
cR198 의 가변 영역의 분자 모델링은, 상동성 모델링으로서 일반적으로 공지된 방법 (Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991)) 에 의해 실행되었다. 프로테인 데이터 벵크 (Protein Data Bank) (Nuc. Acid Res. 28, 235-242 (2000)) 에 등록되는 인간 면역 글로불린의 가변 영역의 1 차 배열 (X 선 결정 구조로부터 유도되는 삼차원 구조가 입수 가능하다) 을, 상기에서 결정된 R198 의 가변 영역과 비교하였다. 결과적으로, 1AJ7 이, cR198 의 경사슬의 가변 영역에 대하여 가장 높은 배열 상동성을 갖는 것으로서 선택되었다. 또한, 1XGY 가, cR198 의 중사슬의 가변 영역에 대하여 가장 높은 배열 상동성을 갖는 것으로서 선택되었다. 프레임 워크 영역의 삼차원 구조는, cR198 의 경사슬 및 중사슬에 대응하는 1AJ7 및 1XGY 의 좌표를 조합하여, 「프레임 워크 모델」 을 얻는 것에 의해 제작되었다. cR198 의 CDR 은, Thornton et al. (J. Mol. Biol., 263, 800-815, (1996)) 의 분류에 따라, CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1 및 CDRH2 는, 각각 클러스터 11A, 7A, 9A, 10A, 10A 에 할당되었다. CDRH3 은, H3 룰 (FEBS letter 399, 1-8 (1996)) 을 사용하여, k(6)- 로 분류되었다. 이어서, 각각의 CDR 에 대한 대표적인 콘포메이션이 프레임 워크 모델에 조립되었다.
마지막으로, 에너지의 점에서 cR198 의 가변 영역의 가능성이 있는 분자 모델을 얻기 위해서, 불리한 원자 간 접촉을 제외하기 위한 에너지 계산을 실시하였다. 상기 순서를, 시판되는 단백질 입체 구조 예측 프로그램 Prime 및 배좌 탐색 프로그램 MacroModel (Schrodinger, LLC) 을 사용하여 실시하였다.
6)-2 인간화 R198 에 대한 아미노산 배열의 설계
인간화 R198 항체의 구축을, CDR 그래프팅 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)) 으로서 일반적으로 공지된 방법에 의해 실시하였다. 억셉터 항체는, 프레임 워크 영역 내의 아미노산 상동성에 기초하여 선택되었다.
cR198 의 프레임 워크 영역의 배열을, 항체의 아미노산 배열의 Kabat 데이터베이스 (Nuc. Acid Res. 29, 205-206 (2001)) 의 모든 인간 프레임 워크와 비교하여, 결과적으로, 1C10'CL 항체가 프레임 워크 영역에 대한 71 ％ 의 배열 상동성에서 기인하여, 억셉터로서 선택되었다. 1C10'CL 에 대한 프레임 워크 영역의 아미노산 잔기를, cR198 에 대한 아미노산 잔기와 정렬시켜, 상이한 아미노산이 사용되는 위치를 동정하였다. 이들 잔기의 위치는, 상기에서 구축된 cR198 의 삼차원 모델을 사용하여 분석되고, 그리고 억셉터 상에 그래프팅되어야 하는 도너 잔기가, Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)) 에 의해 부여되는 기준에 의해 선택되었다.
선택된 몇 개의 도너 잔기를 억셉터 항체에 이입함으로써, 인간화 R198 배열을 이하의 실시예에 기재되는 바와 같이 구축하였다.
또한, cR198 의 각 CDR, FR 중의 1 내지 5 개의 아미노산 잔기를 cR118 의 아미노산 잔기로 치환한 CDR 개변 인간화 R198 배열에 대해서도 이하의 실시예에 기재되는 바와 같이 구축하였다.
6)-3 인간화 R198 경사슬 hR198＿L 의 설계
6)-3-1 hR198＿L1 타입 경사슬 :
배열표의 배열 번호 25 에 나타내는 cR198 경사슬의 아미노산 번호 30 번째의 트레오닌 잔기를 세린 잔기로, 32 번째의 프롤린 잔기를 세린 잔기로, 35 번째의 류신 잔기를 발린 잔기로, 37 번째의 글루타민산 잔기를 아스파르트산 잔기로, 42 번째의 세린 잔기를 트레오닌 잔기로, 61 번째의 아스파르트산 잔기를 글리신 잔기로, 62 번째의 글리신 잔기를 리신 잔기로, 63 번째의 세린 잔기를 알라닌 잔기로, 64 번째의 발린 잔기를 프롤린 잔기로, 92 번째의 세린 잔기를 트레오닌 잔기로, 94 번째의 세린 잔기를 트레오닌 잔기로, 96 번째의 트레오닌 잔기를 세린 잔기로, 99 번째의 글루타민산 잔기를 글루타민 잔기로, 100 번째의 세린 잔기를 프롤린 잔기로, 120 번째의 트레오닌 잔기를 글루타민 잔기로, 124 번째의 류신 잔기를 발린 잔기로, 126 번째의 류신 잔기를 이소류신 잔기로, 127 번째의 아르기닌 잔기를 리신 잔기로, 129 번째의 알라닌 잔기를 트레오닌 잔기로 치환하는 것을 수반하여 설계된 인간화 R198 경사슬을 「hR198＿L1 타입 경사슬」 이라고 명명하였다.
hR198＿L1 타입 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열은, 배열표의 배열 번호 30 이고, 시그널 배열이 절제된 성숙 경사슬을 코드하는 것은 뉴클레오티드 번호 61 내지 702 이고, 가변 영역을 코드하는 것은 뉴클레오티드 번호 61 내지 378 이다. 또한, hR198＿L1 타입 경사슬의 아미노산 배열은, 배열표의 배열 번호 31 이고, 시그널 배열이 절제된 성숙 경사슬은 그 아미노산 번호 21 내지 234 로 이루어지고, 가변 영역은 그 아미노산 번호 21 내지 126 으로 이루어진다. 또한, 배열 번호 30 및 31 의 배열은, 각각 도 22 에도 기재되어 있다. 각 CDR 배열 및 대응하는 배열 번호는 도 38 에 나타나 있다.
6)-3-2 hR198＿L2 타입 경사슬 :
배열표의 배열 번호 25 에 나타내는 cR198 경사슬의 아미노산 번호 30 번째의 트레오닌 잔기를 세린 잔기로, 32 번째의 프롤린 잔기를 세린 잔기로, 35 번째의 류신 잔기를 발린 잔기로, 37 번째의 글루타민산 잔기를 아스파르트산 잔기로, 42 번째의 세린 잔기를 트레오닌 잔기로, 61 번째의 아스파르트산 잔기를 글리신 잔기로, 62 번째의 글리신 잔기를 리신 잔기로, 63 번째의 세린 잔기를 알라닌 잔기로, 92 번째의 세린 잔기를 트레오닌 잔기로, 94 번째의 세린 잔기를 트레오닌 잔기로, 96 번째의 트레오닌 잔기를 세린 잔기로, 99 번째의 글루타민산 잔기를 글루타민 잔기로, 100 번째의 세린 잔기를 프롤린 잔기로, 120 번째의 트레오닌 잔기를 글루타민 잔기로, 124 번째의 류신 잔기를 발린 잔기로, 126 번째의 류신 잔기를 이소류신 잔기로, 127 번째의 아르기닌 잔기를 리신 잔기로, 129 번째의 알라닌 잔기를 트레오닌 잔기로 치환하는 것을 수반하여 설계된 인간화 R198 경사슬을 「hR198＿L2 타입 경사슬」 이라고 명명하였다.
hR198＿L2 타입 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열은, 배열표의 배열 번호 32 이고, 시그널 배열이 절제된 성숙 경사슬을 코드하는 것은 뉴클레오티드 번호 61 내지 702 이고, 가변 영역을 코드하는 것은 뉴클레오티드 번호 61 내지 378 이다. 또한, hR198＿L2 타입 경사슬의 아미노산 배열은, 배열표의 배열 번호 33 이고, 시그널 배열이 절제된 성숙 경사슬은 그 아미노산 번호 21 내지 234 로 이루어지고, 가변 영역은 그 아미노산 번호 21 내지 126 으로 이루어진다. 또한, 배열 번호 32 및 33 의 배열은, 각각 도 23 에도 기재되어 있다. 각 CDR 배열 및 대응하는 배열 번호는 도 38 에 나타나 있다.
6)-3-3 hR198＿L3 타입 경사슬 :
배열표의 배열 번호 25 에 나타내는 cR198 경사슬의 아미노산 번호 30 번째의 트레오닌 잔기를 세린 잔기로, 32 번째의 프롤린 잔기를 세린 잔기로, 35 번째의 류신 잔기를 발린 잔기로, 37 번째의 글루타민산 잔기를 아스파르트산 잔기로, 42 번째의 세린 잔기를 트레오닌 잔기로, 61 번째의 아스파르트산 잔기를 글리신 잔기로, 62 번째의 글리신 잔기를 리신 잔기로, 63 번째의 세린 잔기를 알라닌 잔기로, 64 번째의 발린 잔기를 프롤린 잔기로, 92 번째의 세린 잔기를 트레오닌 잔기로, 94 번째의 세린 잔기를 트레오닌 잔기로, 96 번째의 트레오닌 잔기를 세린 잔기로, 99 번째의 글루타민산 잔기를 글루타민 잔기로, 100 번째의 세린 잔기를 프롤린 잔기로, 114 번째의 타이로신 잔기를 페닐알라닌 잔기로, 120 번째의 트레오닌 잔기를 글루타민 잔기로, 124 번째의 류신 잔기를 발린 잔기로, 126 번째의 류신 잔기를 이소류신 잔기로, 127 번째의 아르기닌 잔기를 리신 잔기로, 129 번째의 알라닌 잔기를 트레오닌 잔기로 치환하는 것을 수반하여 설계된 인간화 R198 경사슬을 「hR198＿L3 타입 경사슬」 이라고 명명하였다.
hR198＿L3 타입 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열은, 배열표의 배열 번호 34 이고, 시그널 배열이 절제된 성숙 경사슬을 코드하는 것은 뉴클레오티드 번호 61 내지 702 이고, 가변 영역을 코드하는 것은 뉴클레오티드 번호 61 내지 378 이다. 또한, hR198＿L3 타입 경사슬의 아미노산 배열은, 배열표의 배열 번호 35 이고, 시그널 배열이 절제된 성숙 경사슬은 그 아미노산 번호 21 내지 234 로 이루어지고, 가변 영역은 그 아미노산 번호 21 내지 126 으로 이루어진다. 또한, 배열 번호 34 및 35 의 배열은, 각각 도 24 에도 기재되어 있다. 각 CDR 배열 및 대응하는 배열 번호는 도 38 에 나타나 있다.
6)-3-4 hR198＿L4 타입 경사슬 :
배열표의 배열 번호 25 에 나타내는 cR198 경사슬의 아미노산 번호 30 번째의 트레오닌 잔기를 세린 잔기로, 32 번째의 프롤린 잔기를 세린 잔기로, 35 번째의 류신 잔기를 발린 잔기로, 37 번째의 글루타민산 잔기를 아스파르트산 잔기로, 42 번째의 세린 잔기를 트레오닌 잔기로, 61 번째의 아스파르트산 잔기를 글리신 잔기로, 62 번째의 글리신 잔기를 리신 잔기로, 63 번째의 세린 잔기를 알라닌 잔기로, 92 번째의 세린 잔기를 트레오닌 잔기로, 94 번째의 세린 잔기를 트레오닌 잔기로, 96 번째의 트레오닌 잔기를 세린 잔기로, 99 번째의 글루타민산 잔기를 글루타민 잔기로, 100 번째의 세린 잔기를 프롤린 잔기로, 114 번째의 타이로신 잔기를 페닐알라닌 잔기로, 120 번째의 트레오닌 잔기를 글루타민 잔기로, 124 번째의 류신 잔기를 발린 잔기로, 126 번째의 류신 잔기를 이소류신 잔기로, 127 번째의 아르기닌 잔기를 리신 잔기로, 129 번째의 알라닌 잔기를 트레오닌 잔기로 치환하는 것을 수반하여 설계된 인간화 R198 경사슬을 「hR198＿L4 타입 경사슬」 이라고 명명하였다.
hR198＿L4 타입 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열은, 배열표의 배열 번호 36 이고, 시그널 배열이 절제된 성숙 경사슬을 코드하는 것은 뉴클레오티드 번호 61 내지 702 이고, 가변 영역을 코드하는 것은 뉴클레오티드 번호 61 내지 378 이다. 또한, hR198＿L4 타입 경사슬의 아미노산 배열은, 배열표의 배열 번호 37 이고, 시그널 배열이 절제된 성숙 경사슬은 그 아미노산 번호 21 내지 234 로 이루어지고, 가변 영역은 그 아미노산 번호 21 내지 126 으로 이루어진다. 또한, 배열 번호 36 및 37 의 배열은, 각각 도 25 에도 기재되어 있다. 각 CDR 배열 및 대응하는 배열 번호는 도 38 에 나타나 있다.
6)-4 인간화 R198 중사슬 hR198＿H 의 설계
6)-4-1 hR198＿H1 타입 중사슬 :
배열표의 배열 번호 29 에 나타내는 cR198 중사슬의 아미노산 번호 24 번째의 글루타민 잔기를 발린 잔기로, 30 번째의 류신 잔기를 발린 잔기로, 31 번째의 알라닌 잔기를 리신 잔기로, 35 번째의 세린 잔기를 알라닌 잔기로, 37 번째의 메티오닌 잔기를 발린 잔기로, 39 번째의 이소류신 잔기를 발린 잔기로, 56 번째의 이소류신 잔기를 발린 잔기로, 57 번째의 리신 잔기를 아르기닌 잔기로, 59 번째의 트레오닌 잔기를 알라닌 잔기로, 60 번째의 트레오닌 잔기를 프롤린 잔기로, 86 번째의 리신 잔기를 아르기닌 잔기로, 95 번째의 세린 잔기를 트레오닌 잔기로, 99 번째의 페닐알라닌 잔기를 타이로신 잔기로, 101 번째의 글루타민 잔기를 글루타민산 잔기로, 106 번째의 트레오닌 잔기를 아르기닌 잔기로, 107 번째의 프롤린 잔기를 세린 잔기로, 108 번째의 아스파르트산 잔기를 글루타민산 잔기로, 110 번째의 세린 잔기를 트레오닌 잔기로, 130 번째의 발린 잔기를 트레오닌 잔기로, 131 번째의 메티오닌 잔기를 류신 잔기로 치환하는 것을 수반하여 설계된 인간화 R198 중사슬을 「hR198＿H1 타입 중사슬」 이라고 명명하였다.
hR198＿H1 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열은, 배열표의 배열 번호 38 이고, 시그널 배열이 절제된 성숙 중사슬을 코드하는 것은 뉴클레오티드 번호 58 내지 1398 이고, 가변 영역을 코드하는 것은 뉴클레오티드 번호 58 내지 408 이다. 또한, hR198＿H1 타입 중사슬의 아미노산 배열은, 배열표의 배열 번호 39 이고, 시그널 배열이 절제된 성숙 중사슬은 그 아미노산 번호 20 내지 466 으로 이루어지고, 가변 영역은 그 아미노산 번호 20 내지 136 으로 이루어진다. 또한, 배열 번호 38 및 39 의 배열은, 각각 도 26 에도 기재되어 있다. 각 CDR 배열 및 대응하는 배열 번호는 도 38 에 나타나 있다.
6)-4-2 hR198＿H2 타입 중사슬 :
배열표의 배열 번호 29 에 나타내는 cR198 중사슬의 아미노산 번호 24 번째의 글루타민 잔기를 발린 잔기로, 30 번째의 류신 잔기를 발린 잔기로, 31 번째의 알라닌 잔기를 리신 잔기로, 35 번째의 세린 잔기를 알라닌 잔기로, 37 번째의 메티오닌 잔기를 발린 잔기로, 39 번째의 이소류신 잔기를 발린 잔기로, 57 번째의 리신 잔기를 아르기닌 잔기로, 59 번째의 트레오닌 잔기를 알라닌 잔기로, 60 번째의 트레오닌 잔기를 프롤린 잔기로, 86 번째의 리신 잔기를 아르기닌 잔기로, 95 번째의 세린 잔기를 트레오닌 잔기로, 99 번째의 페닐알라닌 잔기를 타이로신 잔기로, 101 번째의 글루타민 잔기를 글루타민산 잔기로, 106 번째의 트레오닌 잔기를 아르기닌 잔기로, 107 번째의 프롤린 잔기를 세린 잔기로, 108 번째의 아스파르트산 잔기를 글루타민산 잔기로, 110 번째의 세린 잔기를 트레오닌 잔기로, 130 번째의 발린 잔기를 트레오닌 잔기로, 131 번째의 메티오닌 잔기를 류신 잔기로 치환하는 것을 수반하여 설계된 인간화 R198 중사슬을 「hR198＿H2 타입 중사슬」 이라고 명명하였다.
hR198＿H2 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열은, 배열표의 배열 번호 40 이고, 시그널 배열이 절제된 성숙 중사슬을 코드하는 것은 뉴클레오티드 번호 58 내지 1398 이고, 가변 영역을 코드하는 것은 뉴클레오티드 번호 58 내지 408 이다. 또한, hR198＿H2 타입 중사슬의 아미노산 배열은, 배열표의 배열 번호 41 이고, 시그널 배열이 절제된 성숙 중사슬은 그 아미노산 번호 20 내지 466 으로 이루어지고, 가변 영역은 그 아미노산 번호 20 내지 136 으로 이루어진다. 또한, 배열 번호 40 및 41 의 배열은, 각각 도 27 에도 기재되어 있다. 각 CDR 배열 및 대응하는 배열 번호는 도 38 에 나타나 있다.
6)-4-3 hR198＿H3 타입 중사슬 :
배열표의 배열 번호 29 에 나타내는 cR198 중사슬의 아미노산 번호 24 번째의 글루타민 잔기를 발린 잔기로, 30 번째의 류신 잔기를 발린 잔기로, 31 번째의 알라닌 잔기를 리신 잔기로, 35 번째의 세린 잔기를 알라닌 잔기로, 37 번째의 메티오닌 잔기를 발린 잔기로, 39 번째의 이소류신 잔기를 발린 잔기로, 50 번째의 세린 잔기를 알라닌 잔기로, 56 번째의 이소류신 잔기를 발린 잔기로, 57 번째의 리신 잔기를 아르기닌 잔기로, 59 번째의 트레오닌 잔기를 알라닌 잔기로, 60 번째의 트레오닌 잔기를 프롤린 잔기로, 67 번째의 이소류신 잔기를 발린 잔기로, 70 번째의 발린 잔기를 이소류신 잔기로, 81 번째의 글루타민산 잔기를 알라닌 잔기로, 82 번째의 리신 잔기를 아르기닌 잔기로, 86 번째의 리신 잔기를 아르기닌 잔기로, 95 번째의 세린 잔기를 트레오닌 잔기로, 99 번째의 페닐알라닌 잔기를 타이로신 잔기로, 101 번째의 글루타민 잔기를 글루타민산 잔기로, 106 번째의 트레오닌 잔기를 아르기닌 잔기로, 107 번째의 프롤린 잔기를 세린 잔기로, 108 번째의 아스파르트산 잔기를 글루타민산 잔기로, 110 번째의 세린 잔기를 트레오닌 잔기로, 130 번째의 발린 잔기를 트레오닌 잔기로, 131 번째의 메티오닌 잔기를 류신 잔기로 치환하는 것을 수반하여 설계된 인간화 R198 중사슬을 「hR198＿H3 타입 중사슬」 이라고 명명하였다.
hR198＿H3 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열은, 배열표의 배열 번호 42 이고, 시그널 배열이 절제된 성숙 중사슬을 코드하는 것은 뉴클레오티드 번호 58 내지 1398 이고, 가변 영역을 코드하는 것은 뉴클레오티드 번호 58 내지 408 이다. 또한, hR198＿H3 타입 중사슬의 아미노산 배열은, 배열표의 배열 번호 43 이고, 시그널 배열이 절제된 성숙 중사슬은 그 아미노산 번호 20 내지 466 으로 이루어지고, 가변 영역은 그 아미노산 번호 20 내지 136 으로 이루어진다. 또한, 배열 번호 42 및 43 의 배열은, 각각 도 28 에도 기재되어 있다. 각 CDR 배열 및 대응하는 배열 번호는 도 38 에 나타나 있다.
6)-4-4 hR198＿H4 타입 중사슬 :
배열표의 배열 번호 29 에 나타내는 cR198 중사슬의 아미노산 번호 24 번째의 글루타민 잔기를 발린 잔기로, 30 번째의 류신 잔기를 발린 잔기로, 31 번째의 알라닌 잔기를 리신 잔기로, 35 번째의 세린 잔기를 알라닌 잔기로, 37 번째의 메티오닌 잔기를 발린 잔기로, 39 번째의 이소류신 잔기를 발린 잔기로, 50 번째의 세린 잔기를 알라닌 잔기로, 57 번째의 리신 잔기를 아르기닌 잔기로, 59 번째의 트레오닌 잔기를 알라닌 잔기로, 60 번째의 트레오닌 잔기를 프롤린 잔기로, 67 번째의 이소류신 잔기를 발린 잔기로, 70 번째의 발린 잔기를 이소류신 잔기로, 81 번째의 글루타민산 잔기를 알라닌 잔기로, 82 번째의 리신 잔기를 아르기닌 잔기로, 86 번째의 리신 잔기를 아르기닌 잔기로, 95 번째의 세린 잔기를 트레오닌 잔기로, 99 번째의 페닐알라닌 잔기를 타이로신 잔기로, 101 번째의 글루타민 잔기를 글루타민산 잔기로, 106 번째의 트레오닌 잔기를 아르기닌 잔기로, 107 번째의 프롤린 잔기를 세린 잔기로, 108 번째의 아스파르트산 잔기를 글루타민산 잔기로, 110 번째의 세린 잔기를 트레오닌 잔기로, 130 번째의 발린 잔기를 트레오닌 잔기로, 131 번째의 메티오닌 잔기를 류신 잔기로 치환하는 것을 수반하여 설계된 인간화 R198 중사슬을 「hR198＿H4 타입 중사슬」 이라고 명명하였다.
hR198＿H4 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열은, 배열표의 배열 번호 44 이고, 시그널 배열이 절제된 성숙 중사슬을 코드하는 것은 뉴클레오티드 번호 58 내지 1398 이고, 가변 영역을 코드하는 것은 뉴클레오티드 번호 58 내지 408 이다. 또한, hR198＿H4 타입 중사슬의 아미노산 배열은, 배열표의 배열 번호 45 이고, 시그널 배열이 절제된 성숙 중사슬은 그 아미노산 번호 20 내지 466 으로 이루어지고, 가변 영역은 그 아미노산 번호 20 내지 136 으로 이루어진다. 또한, 배열 번호 44 및 45 의 배열은, 각각 도 29 에도 기재되어 있다. 각 CDR 배열 및 대응하는 배열 번호는 도 38 에 나타나 있다.
[실시예 7] 인간화 항인간 Orai1 항체의 제작
7)-1 인간화 항인간 Orai1 항체 경사슬 hR198＿L 발현 벡터의 구축
7)-1-1 hR198＿L1 발현 벡터의 구축
배열표의 배열 번호 30 에 나타내는 hR198＿L1 의 뉴클레오티드 배열의 뉴클레오티드 번호 38 내지 402 에 나타내는 hR198＿L1 의 가변 영역을 코드하는 배열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사 인공 유전자 합성 서비스). 합성한 DNA 단편을 제한 효소 AvaI 및 EcoRV 로 절단하고, 키메라 및 인간화 항체 경사슬 발현 벡터 pCMA-LK 를 동일한 제한 효소로 절단한 지점에 삽입함으로써 hR198＿L1 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pCMA-LK/hR198＿L1」 이라고 명명하였다.
7)-1-2 hR198＿L2 발현 벡터의 구축
배열표의 배열 번호 32 에 나타내는 hR198＿L2 의 뉴클레오티드 배열의 뉴클레오티드 번호 38 내지 402 에 나타내는 L2 의 가변 영역을 코드하는 배열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사 인공 유전자 합성 서비스). 합성한 DNA 단편을 템플레이트로 하여, KOD -플러스- (TOYOBO 사) 로 L2 의 가변 영역을 코드하는 배열을 포함하는 DNA 단편을 증폭하여 제한 효소 BsiWI 로 절단하고, 키메라 및 인간화 항체 경사슬 발현 벡터 pCMA-LK 를 제한 효소 BsiWI 로 절단한 지점에 삽입함으로써 L2 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pCMA-LK/hR198＿L2」 라고 명명하였다.
7)-1-3 hR198＿L3 및 hR198＿L4 발현 벡터의 구축
배열표의 배열 번호 36 에 나타내는 hR198＿L4 의 뉴클레오티드 배열의 뉴클레오티드 번호 38 내지 402 에 나타내는 hR198＿L4 의 가변 영역을 코드하는 배열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사 인공 유전자 합성 서비스). 실시예 7)-1-2 와 동일한 방법에 의해 hR198＿L4 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pCMA-LK/hR198＿L4」 라고 명명하였다.
pCMA-LK/hR198＿L4 를 템플레이트로 하여, QuikChange 위치 다이렉트 뮤타제네시스 키트 (Site-Directed Mutagenesis Kit) (Stratagene 사) 를 사용하여, 아미노산 번호 64 번째의 발린 잔기를 프롤린 잔기로 치환하는 변이를 도입하였다. 배열표의 배열 번호 34 에 나타내는 뉴클레오티드 배열을 포함하는 얻어진 발현 벡터를 「pCMA-LK/hR198＿L3」 이라고 명명하였다.
7)-2 인간화 항인간 Orai1 항체 중사슬 hR198＿H 발현 벡터의 구축
7)-2-1 hR198＿H1 및 hR198＿H2 발현 벡터의 구축
항 Orai1 항체 중사슬 hR198 의 인간화 후보로 한 배열표의 배열 번호 111 에 나타내는 H0 의 뉴클레오티드 배열의 뉴클레오티드 번호 36 내지 425 에 나타내는 H0 의 가변 영역을 코드하는 배열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사 인공 유전자 합성 서비스). 합성한 DNA 단편을 템플레이트로 하여, KOD -플러스- 로 H0 의 가변 영역을 코드하는 배열을 포함하는 DNA 단편을 증폭하고, 키메라 및 인간화 항체 IgG1 타입 중사슬 발현 벡터 pCMA-G1 을 제한 효소 BlpI 로 절단한 지점에 In-Fusion HD PCR 클로닝 키트 (CLONTECH 사) 를 사용하여 삽입함으로써 H0 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pCMA-G1/hR198＿H0」 이라고 명명하였다. H0 의 아미노산 배열은, 배열 번호 112 에 나타나 있다.
다음으로 pCMA-G1/hR198＿H0 을 템플레이트로 하여, KOD -키트- 뮤타제네시스 키트 (Mutagenesis kit) (TOYOBO 사) 를 사용하여, 아미노산 번호 66 번째의 트립토판 잔기를 타이로신 잔기로 치환하는 변이를 도입하였다. 배열표의 배열 번호 40 에 나타내는 뉴클레오티드 배열을 포함하는 얻어진 발현 벡터를 「pCMA-G1/hR198＿H2」 라고 명명하였다.
다음으로 pCMA-G1/hR198＿H2 를 템플레이트로 하여, QuikChange 위치 다이렉트 뮤타제네시스 키트 (Site-Directed Mutagenesis Kit) (Stratagene 사) 와 하기 프라이머 세트를 사용하여 아미노산 번호 56 번째의 이소류신 잔기를 발린 잔기로 치환하는 변이를 도입하였다. 배열표의 배열 번호 38 에 나타내는 뉴클레오티드 배열을 포함하는 얻어진 발현 벡터를 「pCMA-G1/hR198＿H1」 이라고 명명하였다.
7)-2-2 hR198＿H3, hR198＿H4 및 hR198＿H5 발현 벡터의 구축
항 Orai1 항체 중사슬 hR198 의 인간화 후보로 한 배열표의 배열 번호 113 에 나타내는 H5 의 뉴클레오티드 배열의 뉴클레오티드 번호 36 내지 425 에 나타내는 H5 의 가변 영역을 코드하는 배열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사 인공 유전자 합성 서비스). 실시예 7)-2-1 과 동일한 방법으로 H5 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pCMA-G1/hR198＿H5」 라고 명명하였다. H5 의 아미노산 배열은, 배열 번호 114 에 나타나 있다.
다음으로 pCMA-G1/H5 를 템플레이트로 하여, KOD -플러스- 뮤타제네시스 키트를 사용하여, 아미노산 번호 66 번째의 트립토판 잔기, 67 번째의 이소류신 잔기를 각각 타이로신 잔기, 발린 잔기로 치환하는 변이를 도입하였다. 배열 번호 44 에 나타내는 뉴클레오티드 배열을 포함하는 얻어진 발현 벡터를 「pCMA-G1/hR198＿H4」 라고 명명하였다.
다음으로 pCMA-G1/hR198＿H4 를 템플레이트로 하여, 실시예 7)-2-1 과 동일한 방법으로 아미노산 번호 56 번째의 이소류신 잔기를 발린 잔기로 치환하는 변이를 도입하고, 배열표의 배열 번호 44 에 나타내는 뉴클레오티드 배열을 포함하는 얻어진 발현 벡터를 「pCMA-G1/hR198＿H3」 이라고 명명하였다.
7)-3 인간화 항인간 Orai1 항체 hR198 의 조제
4)-5-1 과 동일한 방법에 의해, 인간화 항인간 Orai1 항체 중사슬 발현 벡터와 인간화 항인간 Orai1 항체 경사슬 발현 벡터를 FreeStyle 293F 세포에 유전자 도입하고, 항체를 포함하는 배양 상청을 얻었다.
pCMA-G1/hR198＿H1 과 pCMA-LK/hR198＿L1, pCMA-G1/hR198＿H2 와 pCMA-LK/hR198＿L2, pCMA-G1/hR198＿H3 과 pCMA-LK/hR198＿L3, pCMA-G1/hR198＿H4 와 pCMA-LK/hR198＿L4 의 조합에 의해 취득된 인간화 항인간 Orai1 항체를 각각, 「hR198＿H1/L1」, 「hR198＿H2/L2」, 「hR198＿H3/L3」, 「hR198＿H4/L4」 라고 명명하였다.
4)-5-2 와 동일한 방법에 의해, 얻어진 배양 상청을 r프로테인 A 어피니티 크로마토그래피로 정제하여, 정제 항체 샘플을 얻었다.
[실시예 8] 인간화 항인간 Orai1 항체의 in vitro 활성
8)-1 플로우 사이토메트리에 의한 인간화 항인간 Orai1 항체의 항원 결합 활성
인간 Orai1 에 대한 결합 특이성을 평가하기 위해서, 1)-4-1 에서 나타내는 방법에 의해 제작한 pcDNA3.1-DEST 도입 HEK293T 세포 현탁액 혹은 pcDNA3.1-hOrai1 도입 HEK293T 세포 현탁액을 원심하고, 상청을 제거한 후, 각각에 대하여 7)-5 에서 제작한 인간화항 Orai1 항체 hR198＿H1/L1, hR198＿H2/L2, hR198＿H3/L3, hR198＿H4/L4 와, 모항체인 cR118, cR198 을 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 30 분 정치하였다. 5 ％ FBS 함유 PBS 로 2 회 세정한 후, 5 ％ FBS 함유 PBS 로 100 배로 희석한 항-인간 IgG FITC 콘주게이트를 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 30 분 정치하였다. 5 ％ FBS 함유 PBS 로 2 회 세정한 후, 1 ㎍/㎖ 프로피디움 요오드화물을 포함하는 5 ％ FBS 함유 PBS 에 재현탁하고, 플로우 사이토미터 (FC500) 로 검출을 실시하였다. 데이터 해석은 Flowjo 로 실시하였다. 프로피디움 요오드화물 양성의 사세포를 게이트로 제외한 후, 생세포의 FITC 형광 강도의 히스토그램을 작성하고, 평균 형광 강도 (MFI) 를 산출하였다. 인간화 항인간 Orai1 항체 hR198＿H1/L1, hR198＿H2/L2, hR198＿H3/L3, hR198＿H4/L4 는 모항체인 cR118, cR198 과 마찬가지로, pcDNA3.1-DEST 도입 HEK293T 세포에는 결합하지 않고, 도 5 에 나타내는 바와 같이 pcDNA3.1-hOrai1 도입 HEK293T 세포에만 농도 의존적으로 결합한 것으로부터, 특이적으로 인간 Orai1 에 결합하는 것이 나타났다.
8)-2 인간화 항인간 Orai1 항체의 인간 T 세포주 활성화 억제 작용
인간 T 세포주인 Jurkat 세포를, 10 ％ FBS, 100 U/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 포함하는 RPMI1640 으로 1.5 x 106 세포/㎖ 의 농도로 조제하고, 96-웰 세포 배양 플레이트에 80 ㎕ 씩 파종하고, 인간화 항인간 Orai1 항체인 hR198＿H1/L1, hR198＿H2/L2, hR198＿H3/L3, hR198＿H4/L4, 및 인간 키메라화 항인간 Orai1 항체인 cR118 및 cR198 을 10 ㎕/웰 첨가하여 37 ℃, 5 ％ CO2 하에서 60 분간 전처치하였다. 그 후, 100 ng/㎖ PMA 및 1 ㎍/㎖ A23187 을 10 ㎕/웰 첨가하고, 잘 교반한 후, 약 16 시간 37 ℃, 5 ％ CO2 하에서 배양하였다. 플레이트를 잘 교반한 후, 600 g 으로 3 분간 원심하고, 상청에 포함되는 IL-2 농도를 ELISA 법으로 측정하였다. 도 6 은 인간화 항인간 Orai1 항체가 PMA 및 A23187 처리된 Jurkat 세포로부터의 IL-2 의 방출을 첨가 농도 의존적으로 억제하는 것을 나타낸다. 인간화 항인간 Orai1 항체는 Jurkat 세포로부터의 IL-2 의 방출을 첨가 농도 의존적으로 저해하고, hR198＿H1/L1 및 hR198＿H2/L2 의 저해 활성은 인간 키메라화 항인간 Orai1 항체 cR118 및 cR198 과 동등하였다. 한편 hR198＿H3/L3 및 hR198＿H4/L4 는, cR118 및 cR198 보다 저농도에서 저해 활성을 나타냈다.
[실시예 9] 리보솜 디스플레이에 의한 활성 증강 변이의 동정
9)-1 H 사슬 및 L 사슬 라이브러리의 제작
인간화 항인간 Orai1 항체 hR198＿H4/L4 를 주형으로 하여, H 사슬 또는 L 사슬에 변이를 도입한 라이브러리를 구축하고, 리보솜 디스플레이에 의한 활성 증강 변이의 동정에 제공하였다.
9)-1-1 H 사슬 라이브러리의 제작
hR198＿H4 유전자를 주형으로 하여 이하의 프라이머 세트와 rTaq DNA 폴리메라아제 (TOYOBO 사) 를 사용하여 80 사이클의 PCR 을 실시하여, 당해 유전자 영역에 랜덤하게 변이를 도입하였다.
프라이머 세트
5'-ATGCAAGTCCAACTGGTTCAATC-3' (배열 번호 46 : 프라이머 Orai1 HF)
5'-TGACGGAGCCAGCGGGAAGAC-3' (배열 번호 47 : 프라이머 Orai1 CH FR)
다음으로 랜덤하게 변이를 도입한 H 사슬 유전자와 T7 프로모터를 포함하는 5'UTR 부위, 및 5' 측에 c-Myc 를 3' 측에 SecM 배열을 부가한 TolA 유전자 단편을 주형으로 하여, 이하의 프라이머 세트를 사용하여 오버랩 PCR 을 실시하여, H 사슬 라이브러리를 조제하였다.
프라이머 세트
5'-CAGGAAACAGCTATGACCATG-3' (배열 번호 48 : 프라이머 M13 rev long)
5'-CTCGAGTTATTCATTAGGTGAGGCGTTGAGG-3' (배열 번호 49 : 프라이머 SecM Stop R)
9)-1-2 L 사슬 라이브러리의 제작
hR198＿L4 유전자를 주형으로 하여 이하의 프라이머 세트와 rTaq DNA 폴리메라아제를 사용하여 80 사이클의 PCR 을 실시하여, 당해 유전자 영역에 랜덤하게 변이를 도입하였다.
프라이머 세트
5'-ATGGACATTCAACTGACCCAAAGC-3' (배열 번호 50 : 프라이머 Orai1 Lc F)
5'-GATAAAAACACTCGGGGCCGCCAC-3' (배열 번호 51 : 프라이머 Orai1 CL-FR)
9)-1-1 의 기재와 동일하게 랜덤하게 변이를 도입한 L 사슬 유전자와 상기 2 개의 유전자 단편을 주형으로 하여, 오버랩 PCR 을 실시하여, L 사슬 라이브러리를 조제하였다.
9)-1-3 H 사슬 유전자 단편의 제작
hR198＿H4 유전자를 주형으로 하여 이하의 프라이머 세트와 KOD -플러스- 를 사용하여 PCR 을 실시하여, H 사슬 유전자 영역을 증폭하였다.
프라이머 세트
5'-ATGCAAGTCCAACTGGTTCAATC-3' (배열 번호 46 : 프라이머 Orai1 HF)
5'-TCATTATTTGTCATCGTCATCTTTATAGTCGAATTCTTCGCCACGATTAAAGGATTTGGTGAC-3' (배열 번호 52 : 프라이머 Orai1 HR-FLAG R)
다음으로 당해 유전자 단편과 T7 프로모터를 포함하는 5'UTR 부위를 주형으로 하여 이하의 프라이머 세트를 사용하여 오버랩 PCR 을 실시하여, H 사슬 유전자 단편을 조제하였다.
프라이머 세트
5'-CAGGAAACAGCTATGACCATG-3' (배열 번호 48 : 프라이머 M13 rev long)
5'-TCATTATTTGTCATCGTCATCTTTATAGTCGAATTCTTCGCCACGATTAAAGGATTTGGTGAC-3' (배열 번호 52 : 프라이머 Orai1 HR-FLAG R)
9)-1-4 L 사슬 유전자 단편의 제작
hR198＿L4 유전자를 주형으로 하여 이하의 프라이머 세트와 KOD -플러스- 를 사용하여 PCR 을 실시하여, L 사슬 유전자 영역을 증폭하였다.
프라이머 세트
5'-ATGGACATTCAACTGACCCAAAGC-3' (배열 번호 50 : 프라이머 Orai1 Lc F)
5'-TCATTATTTGTCATCGTCATCTTTATAGTCGAATTCTTCGCCACGATTAAAGGATTTGGTGAC-3' (배열 번호 53 : 프라이머 Orai1 CL-FLAG R)
다음으로 9)-1-3 의 기재와 동일하게 오버랩 PCR 을 실시하여, L 사슬 유전자 단편을 조제하였다.
프라이머 세트
5'-CAGGAAACAGCTATGACCATG-3' (배열 번호 48 : 프라이머 M13 rev long)
5'-TCATTATTTGTCATCGTCATCTTTATAGTCGAATTCTTCGCCACGATTAAAGGATTTGGTGAC-3' (배열 번호 53 : 프라이머 Orai1 CL-FLAG R)
9)-1-5 mRNA 의 조제
실시예 9)-1-1 내지 9)-1-4 에서 제작한 라이브러리 및 유전자 단편을 주형으로 하여, T7 RiboMax Express Large Scale RNA Production System (Promega 사) 으로 각각의 mRNA 를 합성하였다.
9)-2 리보솜 디스플레이에 의한 스크리닝
H 사슬 라이브러리와 L 사슬 유전자 단편을 조합하여 H 사슬 리보솜 디스플레이 Fab 를, L 사슬 라이브러리와 H 사슬 유전자 단편을 조합하여 L 사슬 리보솜 디스플레이 Fab 를 조제하였다. PUREfrex 반응액 (GeneFrontier 사) 에 20 pmol 의 H 사슬 (또는 L 사슬) 라이브러리 mRNA 와 100 pmol 의 리보솜을 첨가하여, 30 ℃ 에서 45 분간 보온하였다. 동일하게 PUREfrex 반응액에 40 pmol 의 L 사슬 (또는 H 사슬) mRNA 와 200 pmol 의 리보솜을 첨가하여, 30 ℃ 에서 45 분간 인큐베이트하였다. 다음으로 H 사슬 (또는 L 사슬) 라이브러리 및 L 사슬 (또는 H 사슬) 의 번역 후의 반응액을 혼합하고, 30 ℃ 에서 추가로 90 분간 보온함으로써, H 사슬 (또는 L 사슬) 리보솜 디스플레이 Fab 를 조제하고, 그 후 4 ℃ 로 냉각시킴으로써 반응을 정지하였다. 계속해서 당해 반응액에 항원을 첨가하여, 4 ℃ 에서 1 시간 조심스럽게 교반함으로써 Fab 와 항원의 결합을 실시하였다. 또한, 항원으로는, 1)-1-1 에서 제작한 pcDNA3.1-hOrai1 을 이용하여 수립한 인간 Orai1 항상 발현 CHO 세포를 포르말린 고정 처리한 샘플, 혹은 이하에 나타내는 비오틴 PEG 화 인간 Orai1 루프 영역 펩타이드 (SIGMA 사) 를 사용하였다.
비오틴 PEG 화 인간 Orai1 루프 영역 펩타이드
Biotin-PEG-SGSGFLPLKKQPGQPRPTSKPPASGAAANVSTSGITPGQAAAIASTTI (배열 번호 115)
항원과 결합한 리보솜 디스플레이 Fab 를 Nonolink Streptavidin magnetic beads (SoluLink 사) 로 회수하였다. 계속해서 항원을 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 15 mM Mg (OAc)2, 0.05 ％ Tween20, 1 ㎎/㎖ yeast RNA 및 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 15 mM Mg (OAc)2, 0.05 ％ Tween20 으로 세정하였다. 그 후 항원에 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 15 mM Mg (OAc)2, 50 mM EDTA 를 첨가하고, 실온에서 10 분간 정치 후 원심에 의해 mRNA 를 포함하는 상청을 회수하였다. 회수한 mRNA 는 Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit (Roche 사) 에 의해 cDNA 로 한 후, 하기 프라이머 세트 및 KOD -플러스- 를 사용하여 PCR 을 실시하여 DNA 로서 증폭하였다. 당해 DNA 를 주형으로 하여 mRNA 를 합성하고, 또한 동일한 스크리닝에 제공하였다. 당해 스크리닝 사이클을 복수회 실시함으로써, 항원에 강하게 결합하는 항체 유전자를 선발하였다.
프라이머 세트
5'-ATGGACATTCAACTGACCCAAAGC-3' (배열 번호 50 : 프라이머 Orai1-LcF)
5'-CAGATCCTCCTCAGAGATCAGCTTCTGCTC-3' (배열 번호 54 : 프라이머 Myc-R)
9)-3 Fab 단백질의 조제
선발한 유전자를 대장균 발현용 벡터에 서브 클로닝하고, 인간 Orai1 항상 발현 CHO 세포에 대한 결합성이 향상된 클론을 Cell ELISA 로 스크리닝하였다. 먼저 선발 후의 DNA 를 제한 효소 EcoRV 및 XhoI 로 절단하고, 동일한 효소로 절단한 Fab 발현용 벡터 (GeneFrontier 사) 에 삽입 후 대장균 BL21 (DE3) 에 도입하였다. 당해 형질 전환체를 환저 96 웰 플레이트 상에서, 1 웰 당 150 ㎕ 의 카르베니실린/0.1 ％ 글루코오스/2 x YT 로 37 ℃ 에서 4 - 5 시간 배양하였다. 다음으로 플레이트를 4 ℃ 까지 냉각시킨 후, 종농도 0.5 mM 이 되도록 IPTG 를 첨가하고, 30 ℃ 에서 하룻밤 진탕 배양하였다. 다음으로 원심에 의해 균체를 회수한 후, 라이시스 버퍼 (Lysis buffer)(2.5 ㎎/㎖ Lysotyme, 100 U DNaseI) 를 첨가하여, 실온에서 60 분간 진탕하였다. 계속해서 원심에 의해 상청을 회수하고, Fab 검체로 하였다.
9)-4 Cell ELISA 에 의한 스크리닝
인간 Orai1 발현 세포를 384 플레이트에 풀 시트로 배양 후, 세정 버퍼 (PBS (-), 20 mM MgSO4, 2.5 ％ FBS) 로 세정하였다. 다음으로 Fab 검체를 당해 플레이트에 첨가하고, 4 ℃ 에서 1 시간 진탕하였다. 세정 버퍼로 4 회 세정 후, 퍼옥시다아제 표지 항인간 F(ab')2 염소 항체 (Jackson Immuno Research 사) 를 첨가하여, 4 ℃ 에서 30 분간 진탕하였다. 세정 버퍼로 3 회 세정 후, PBS (-), 20 mM MgSO4 로 3 회 세정하였다. 그 후 발색 시약 (0.4 ㎎/㎖ 테트라메틸 벤지마인 (Tetramethyl-benzimine), 200 mM 아세트산나트륨 (pH 3.4), 0.01 ％ 과산화수소수) 을 첨가하여, 실온에서 15 분간 진탕하였다. 그 후 2 N HCl 을 첨가한 후, OD450 을 측정하였다. 컨트롤의 CHO 세포와 비교하여, 인간 Orai1 항상 발현 CHO 세포 쪽에서 보다 높은 OD450 을 나타내는 Fab 검체를 선발하였다.
9)-5 플로우 사이토메트리에 의한 항인간 Orai1 항체 Fab 의 항원 결합 활성
인간 Orai1 에 대한 결합 특이성을 평가하기 위해서, 1)-4-1 에서 나타내는 방법에 의해 제작한 pcDNA3.1-DEST 도입 HEK293T 세포 현탁액 혹은 pcDNA3.1-hOrai1 도입 HEK293T 세포 현탁액을 원심하고, 상청을 제거한 후, 각각에 대하여 9)-4 에서 선발된 경사슬 변이 클론 LCDR60, LCDR67, LCDR83, CE151, PE057 그리고 중사슬 변이 클론 HCDR046, HCDR047, HEP087, HEP124, HEP237 과, 모항체 Fab 의 hR198＿H4/L4-Fab 를 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 30 분 정치하였다. 5 ％ FBS 함유 PBS 로 2 회 세정한 후, 5 ％ FBS 함유 PBS 로 100 배로 희석한 항-인간 IgG FITC 콘주게이트 (conjugate) 를 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 30 분 정치하였다. 5 ％ FBS 함유 PBS 로 2 회 세정한 후, 1 ㎍/㎖ 프로피디움 요오드화물을 포함하는 5 ％ FBS 함유 PBS 에 재현탁하고, 플로우 사이토미터 (FC500) 로 검출을 실시하였다. 데이터 해석은 Flowjo 로 실시하였다. Propidium iodide 양성의 사세포를 게이트로 제외한 후, 생세포의 FITC 형광 강도의 히스토그램을 작성하고, 평균 형광 강도 (MFI) 를 산출하였다. 경사슬 변이 클론 LCDR60, LCDR67, LCDR83, CE151, PE057 그리고 중사슬 변이 클론 HCDR046, HCDR047, HEP087, HEP124, HEP237 은 모항체 Fab 의 hR198＿H4/L4-Fab 와 마찬가지로, pcDNA3.1-DEST 도입 HEK293T 세포에는 결합하지 않고, 도 7 에 나타내는 바와 같이 pcDNA3.1-hOrai1 도입 HEK293T 세포에 대해서는, 모항체 Fab 와 비교하여 동등 이상으로 인간 Orai1 에 결합하는 경향을 볼 수 있었다.
[실시예 10] 인간화 항인간 Orai1 항체의 어피니티 매츄레이션 항체의 제작
실시예 9) 에 의해 선택된 경사슬 변이 클론 LCDR60, LCDR67, LCDR83, CE151, PE057 그리고 중사슬 변이 클론 HCDR046, HCDR047, HEP087, HEP124, HEP237 에서 확인된 활성을 증강시키는 변이 중, 몇 개를 hR198＿H3/L3 에 이입함으로써, 100 종류 이상의 개변 hR198＿H3/L3 항체를 제작하고, 결합 친화성, in vitro 활성, 생산성, 인간에 대한 이종 항원성의 관점에서 평가하였다. 결과적으로, 이하에 나타내는 항체를 선발하였다.
10)-1 인간화 항인간 Orai1 항체의 어피니티 매츄레이션 항체의 설계
10)-1-1 hR198＿LG1 타입 경사슬 :
배열표의 배열 번호 35 에 나타내는 hR198＿L3 경사슬의 아미노산 번호 51 번째의 아스파라긴 잔기를 글리신 잔기로, 113 번째의 트레오닌 잔기를 이소류신 잔기로, 117 번째의 트레오닌 잔기를 세린 잔기로 치환하는 것을 수반하여 설계된 인간화 R198 경사슬을 「hR198＿LG1 타입 경사슬」 이라고 명명하였다.
hR198＿LG1 타입 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열은, 배열표의 배열 번호 55 이고, 시그널 배열이 절제된 성숙 경사슬을 코드하는 것은 뉴클레오티드 번호 61 내지 702 이고, 가변 영역을 코드하는 것은 뉴클레오티드 번호 61 내지 378 이다. 또한, hR198＿LG1 타입 경사슬의 아미노산 배열은, 배열표의 배열 번호 56 이고, 시그널 배열이 절제된 성숙 경사슬은 그 아미노산 번호 21 내지 234 로 이루어지고, 가변 영역은 그 아미노산 번호 21 내지 126 으로 이루어진다. 또한, 배열 번호 55 및 56 의 배열은, 각각 도 30 에도 기재되어 있다. 각 CDR 배열 및 대응하는 배열 번호는 도 38 에 나타나 있다.
10)-1-2 hR198＿LG2 타입 경사슬 :
배열표의 배열 번호 35 에 나타내는 hR198＿L3 경사슬의 아미노산 번호 44 번째의 아르기닌 잔기를 히스티딘 잔기로, 48 번째의 세린 잔기를 아스파라긴 잔기로, 51 번째의 아스파라긴 잔기를 글리신 잔기로, 70 번째의 세린 잔기를 류신 잔기로, 75 번째의 글루타민산 잔기를 아스파르트산 잔기로, 76 번째의 세린 잔기를 트립토판 잔기로, 113 번째의 트레오닌 잔기를 이소류신 잔기로, 117 번째의 트레오닌 잔기를 세린 잔기로 치환하는 것을 수반하여 설계된 인간화 R198 경사슬을 「hR198＿LG2 타입 경사슬」 이라고 명명하였다.
hR198＿LG2 타입 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열은, 배열표의 배열 번호 57 이고, 시그널 배열이 절제된 성숙 경사슬을 코드하는 것은 뉴클레오티드 번호 61 내지 702 이고, 가변 영역을 코드하는 것은 뉴클레오티드 번호 61 내지 378 이다. 또한, hR198＿LG2 타입 경사슬의 아미노산 배열은, 배열표의 배열 번호 58 이고, 시그널 배열이 절제된 성숙 경사슬은 그 아미노산 번호 21 내지 234 로 이루어지고, 가변 영역은 그 아미노산 번호 21 내지 126 으로 이루어진다. 또한, 배열 번호 57 및 58 의 배열은, 각각 도 31 에도 기재되어 있다. 각 CDR 배열 및 대응하는 배열 번호는 도 38 에 나타나 있다.
10)-1-3 hR198＿LG3 타입 경사슬 :
배열표의 배열 번호 35 에 나타내는 hR198＿L3 경사슬의 아미노산 번호 44 번째의 아르기닌 잔기를 히스티딘 잔기로, 47 번째의 글루타민 잔기를 아르기닌 잔기로, 48 번째의 세린 잔기를 아스파라긴 잔기로, 51 번째의 아스파라긴 잔기를 글리신 잔기로, 70 번째의 세린 잔기를 류신 잔기로, 73 번째의 트레오닌 잔기를 세린 잔기로, 75 번째의 글루타민산 잔기를 아스파르트산 잔기로, 76 번째의 세린 잔기를 트립토판 잔기로, 113 번째의 트레오닌 잔기를 이소류신 잔기로, 117 번째의 트레오닌 잔기를 세린 잔기로 치환하는 것을 수반하여 설계된 인간화 R198 경사슬을 「hR198＿LG3 타입 경사슬」 이라고 명명하였다.
hR198＿LG3 타입 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열은, 배열표의 배열 번호 59 이고, 시그널 배열이 절제된 성숙 경사슬을 코드하는 것은 뉴클레오티드 번호 61 내지 702 이고, 가변 영역을 코드하는 것은 뉴클레오티드 번호 61 내지 378 이다. 또한, hR198＿LG3 타입 경사슬의 아미노산 배열은, 배열표의 배열 번호 60 이고, 시그널 배열이 절제된 성숙 경사슬은 그 아미노산 번호 21 내지 234 로 이루어지고, 가변 영역은 그 아미노산 번호 21 내지 126 으로 이루어진다. 또한, 배열 번호 59 및 60 의 배열은, 각각 도 32 에도 기재되어 있다. 각 CDR 배열 및 대응하는 배열 번호는 도 38 에 나타나 있다.
10)-1-4 hR198＿HG1 타입 중사슬 :
배열표의 배열 번호 43 에 나타내는 hR198＿H3 중사슬의 아미노산 번호 78 번째의 아스파라긴 잔기를 아스파르트산 잔기로, 123 번째의 발린 잔기를 알라닌 잔기로 치환하는 것을 수반하여 설계된 인간화 R198 중사슬을 「hR198＿HG1 타입 중사슬」 이라고 명명하였다.
hR198＿HG1 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열은, 배열표의 배열 번호 61 이고, 시그널 배열이 절제된 성숙 중사슬을 코드하는 것은 뉴클레오티드 번호 58 내지 1398 이고, 가변 영역을 코드하는 것은 뉴클레오티드 번호 58 내지 408 이다. 또한, hR198＿HG1 타입 중사슬의 아미노산 배열은, 배열표의 배열 번호 62 이고, 시그널 배열이 절제된 성숙 중사슬은 그 아미노산 번호 20 내지 466 으로 이루어지고, 가변 영역은 그 아미노산 번호 20 내지 135 로 이루어진다. 또한, 배열 번호 61 및 62 의 배열은, 각각 도 33 에도 기재되어 있다. 각 CDR 배열 및 대응하는 배열 번호는 도 38 에 나타나 있다.
10)-1-5 hR198＿HG2 타입 중사슬 :
배열표의 배열 번호 43 에 나타내는 hR198＿H3 중사슬의 아미노산 번호 48 번째의 발린 잔기를 이소류신 잔기로, 78 번째의 아스파라긴 잔기를 아스파르트산 잔기로, 81 번째의 알라닌 잔기를 글리신 잔기로, 123 번째의 발린 잔기를 알라닌 잔기로 치환하는 것을 수반하여 설계된 인간화 R198 중사슬을 「hR198＿HG2 타입 중사슬」 이라고 명명하였다.
hR198＿HG2 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열은, 배열표의 배열 번호 63 이고, 시그널 배열이 절제된 성숙 중사슬을 코드하는 것은 뉴클레오티드 번호 58 내지 1398 이고, 가변 영역을 코드하는 것은 뉴클레오티드 번호 58 내지 408 이다. 또한, hR198＿HG2 타입 중사슬의 아미노산 배열은, 배열표의 배열 번호 64 이고, 시그널 배열이 절제된 성숙 중사슬은 그 아미노산 번호 20 내지 466 으로 이루어지고, 가변 영역은 그 아미노산 번호 20 내지 135 로 이루어진다. 또한, 배열 번호 63 및 64 의 배열은, 각각 도 34 에도 기재되어 있다. 각 CDR 배열 및 대응하는 배열 번호는 도 38 에 나타나 있다.
10)-1-6 hR198＿HG3 타입 중사슬 :
배열표의 배열 번호 43 에 나타내는 hR198＿H3 중사슬의 아미노산 번호 48 번째의 발린 잔기를 이소류신 잔기로, 78 번째의 아스파라긴 잔기를 아스파르트산 잔기로, 81 번째의 알라닌 잔기를 메티오닌 잔기로, 123 번째의 발린 잔기를 알라닌 잔기로 치환하는 것을 수반하여 설계된 인간화 R198 중사슬을 「hR198＿HG3 타입 중사슬」 이라고 명명하였다.
hR198＿HG3 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열은, 배열표의 배열 번호 65 이고, 시그널 배열이 절제된 성숙 중사슬을 코드하는 것은 뉴클레오티드 번호 58 내지 1398 이고, 가변 영역을 코드하는 것은 뉴클레오티드 번호 58 내지 408 이다. 또한, hR198＿HG3 타입 중사슬의 아미노산 배열은, 배열표의 배열 번호 66 이고, 시그널 배열이 절제된 성숙 중사슬은 그 아미노산 번호 20 내지 466 으로 이루어지고, 가변 영역은 그 아미노산 번호 20 내지 135 로 이루어진다. 또한, 배열 번호 65 및 66 의 배열은, 각각 도 35 에도 기재되어 있다. 각 CDR 배열 및 대응하는 배열 번호는 도 38 에 나타나 있다.
10)-2 인간화 항인간 Orai1 항체의 어피니티 매츄레이션 항체 발현 벡터의 제작
10)-2-1 hR198＿LG1 타입 경사슬 발현 벡터의 구축
pCMA-LK/hR198＿L3 을 템플레이트로 하여, KOD -플러스- 뮤타제네시스를 사용하여, 아미노산 번호 51 번째의 아스파라긴 잔기를 글리신 잔기로, 113 번째의 트레오닌 잔기를 이소류신 잔기로, 117 번째의 트레오닌 잔기를 세린 잔기로 치환하는 변이를 도입하였다. 배열표의 배열 번호 55 에 나타내는 뉴클레오티드 배열을 포함하는 얻어진 발현 벡터를 「pCMA-LK/hR198＿LG1」 이라고 명명하였다.
10)-2-2 hR198＿LG2 및 LG3 타입 경사슬 발현 벡터의 구축
배열표의 배열 번호 59 에 나타내는 LG3 의 뉴클레오티드 배열의 뉴클레오티드 번호 38 내지 402 에 나타내는 hR198＿LG3 의 가변 영역을 코드하는 배열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사 인공 유전자 합성 서비스). 합성한 DNA 단편을 제한 효소 EcoRV 및 AvaI 로 절단하고, 동일한 제한 효소로 절단한 pCMA-LK/hR198＿LG1 에 삽입함으로써 hR198＿LG3 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pCMA-LK/hR198＿LG3」 이라고 명명하였다.
pCMA-LK/hR198＿LG3 을 템플레이트로 하여, KOD -플러스- 뮤타제네시스를 사용하여, 아미노산 번호 47 번째의 아르기닌 잔기를 글루타민 잔기로, 73 번째의 세린 잔기를 트레오닌 잔기로 치환하는 변이를 도입하였다. 배열표의 배열 번호 57 에 나타내는 뉴클레오티드 배열을 포함하는 얻어진 발현 벡터를 「pCMA-LK/hR198＿LG2」 라고 명명하였다.
10)-2-3 hR198＿HG1 타입 중사슬 발현 벡터의 구축
pCMA-G1/hR198＿H3 을 템플레이트로 하여, KOD -플러스- 뮤타제네시스를 사용하여, 아미노산 번호 78 번째의 아스파라긴 잔기를 아스파르트산 잔기로, 123 번째의 발린 잔기를 알라닌 잔기로 치환하는 변이를 도입하였다. 배열표의 배열 번호 61 에 나타내는 뉴클레오티드 배열을 포함하는 얻어진 발현 벡터를 「pCMA-G1/hR198＿HG1」 이라고 명명하였다.
10)-2-4 hR198＿HG2 타입 중사슬 발현 벡터의 구축
pCMA-G1/hR198＿HG1 을 템플레이트로 하여, KOD -플러스- 뮤타제네시스를 사용하여, 아미노산 번호 48 번째의 발린 잔기를 이소류신 잔기로, 81 번째의 알라닌 잔기를 글리신 잔기로 치환하는 변이를 도입하였다. 배열표의 배열 번호 63 에 나타내는 뉴클레오티드 배열을 포함하는 얻어진 발현 벡터를 「pCMA-G1/hR198＿HG2」 라고 명명하였다.
10)-2-5 hR198＿HG3 타입 중사슬 발현 벡터의 구축
pCMA-G1/hR198＿HG2 를 템플레이트로 하여, KOD -플러스- 뮤타제네시스를 사용하여, 아미노산 번호 81 번째의 글리신 잔기를 메티오닌 잔기로 치환하는 변이를 도입하였다. 배열표의 배열 번호 65 에 나타내는 뉴클레오티드 배열을 포함하는 얻어진 발현 벡터를 「pCMA-G1/hR198＿HG3」 이라고 명명하였다.
10)-3 인간화 항인간 Orai1 항체의 어피니티 매츄레이션 항체의 조제
4)-5-1 과 동일한 방법에 의해, 10)-2 에서 제작한 인간화 항인간 Orai1 항체 중사슬 발현 벡터와 인간화 항인간 Orai1 항체 경사슬 발현 벡터를 FreeStyle 293F 세포에 유전자 도입하여, 항체를 포함하는 배양 상청을 얻었다.
주형으로 한 pCMA-G1/hR198＿H3, 변이를 도입한 pCMA-G1/hR198＿HG1, pCMA-G1/hR198＿HG2, pCMA-G1/hR198＿HG3 과, pCMA-LK/hR198＿LG1, pCMA-LK/hR198＿LG2, pCMA-LK/hR198＿LG3 의 조합에 의해 취득된 인간화 항인간 Orai1 항체를 각각, 「hR198＿H3/LG1」, 「hR198＿HG1/LG1」, 「hR198＿HG1/LG2」, 「hR198＿HG1/LG3」, 「hR198＿HG2/LG1」, 「hR198＿HG3/LG1」 이라고 명명하였다.
4)-5-2 와 동일한 방법에 의해, 얻어진 배양 상청을 r프로테인 A 어피니티 크로마토그래피로 정제하여, 정제 항체 샘플을 얻었다.
[실시예 11] 어피니티 매츄레이션 항체의 in vitro 활성
11)-1 플로우 사이토메트리에 의한 어피니티 매츄레이션 항체의 결합능 평가
인간 Orai1 에 대한 결합 특이성을 평가하기 위해서, 1)-4-1 에서 나타내는 방법에 의해 제작한 pcDNA3.1-DEST 도입 HEK293T 세포 현탁액 혹은 pcDNA3.1-hOrai1 도입 HEK293T 세포 현탁액을 원심하고, 상청을 제거한 후, 각각에 대하여 10)-3 에서 제작한 어피니티 매츄레이션 항체의 hR198＿H3/LG1, hR198＿HG1/LG1, hR198＿HG1/LG2, hR198＿HG1/LG3, hR198＿HG2/LG1, hR198＿HG3/LG1 과, 모항체인 hR198＿H3/L3, hR198＿H4/L4 를 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 30 분 정치하였다. 5 ％ FBS 함유 PBS 로 2 회 세정한 후, 5 ％ FBS 함유 PBS 로 100 배로 희석한 항-인간 IgG FITC 콘주게이트를 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 30 분 정치하였다. 5 ％ FBS 함유 PBS 로 2 회 세정한 후, 1 ㎍/㎖ 프로피디움 요오드화물을 포함하는 5 ％ FBS 함유 PBS 에 재현탁하고, 플로우 사이토미터 (FC500) 로 검출을 실시하였다. 데이터 해석은 Flowjo 로 실시하였다. 프로피디움 요오드화물 양성의 사세포를 게이트로 제외한 후, 생세포의 FITC 형광 강도의 히스토그램을 작성하고, 평균 형광 강도 (MFI) 를 산출하였다. 어피니티 매츄레이션 항체 hR198＿H3/LG1, hR198＿HG1/LG1, hR198＿HG1/LG2, hR198＿HG1/LG3, hR198＿HG2/LG1, hR198＿HG3/LG1 은, 모항체인 hR198＿H3/L3, hR198＿H4/L4 와 마찬가지로, pcDNA3.1-DEST 도입 HEK293T 세포에는 결합하지 않고, 도 8 에 나타내는 바와 같이 pcDNA3.1-hOrai1 도입 HEK293T 세포에 대해서는, 모항체와 비교하여 동등 이상으로 인간 Orai1 에 결합하는 경향을 볼 수 있었다.
11)-2 어피니티 매츄레이션 항체의 T 세포 활성화 억제 작용
인간 T 세포주인 Jurkat 세포를, 10 ％ FBS, 100 U/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 포함하는 RPMI1640 으로 1.5 x 106 세포/㎖ 의 농도로 조제하고, 96-웰 세포 배양 플레이트에 80 ㎕ 씩 파종하고, 어피니티 매츄레이션 항체인 hR198＿H3/LG1, hR198＿HG1/LG1, hR198＿HG1/LG2, hR198＿HG1/LG3, hR198＿HG2/LG1, hR198＿HG3/LG1, 인간화 항인간 Orai1 항체인 hR198＿H3/L3, hR198＿H4/L4 를 10 ㎕/웰 첨가하여 37 ℃, 5 ％ CO2 하에서 60 분간 전처치하였다. 그 후, 100 ng/㎖ PMA 및 1 ㎍/㎖ A23187 을 10 ㎕/웰 첨가하고, 잘 교반한 후, 약 16 시간 37 ℃, 5 ％ CO2 하에서 배양하였다. 플레이트를 잘 교반한 후, 600 g 으로 3 분간 원심하고, 상청에 포함되는 IL-2 농도를 ELISA 법으로 측정하였다. 도 9 는 어피니티 매츄레이션 항체가 PMA 및 A23187 처리된 Jurkat 세포로부터의 IL-2 의 방출을 첨가 농도 의존적으로 억제하는 것을 나타낸다. 어피니티 매츄레이션 항체는 Jurkat 세포로부터의 IL-2 의 방출을 첨가 농도 의존적으로 저해하고, 그 저해 활성은 모두 모항체인 인간화 항인간 Orai1 항체 hH3/L3, hH4/L4 를 상회하는 것이었다.
[실시예 12] 어피니티 매츄레이션 항체의 이팩터 활성 저감 개변체의 제작
hR198＿HG1 의 정상 영역의 2 개의 아미노산 잔기를 치환한 정상 영역 개변 hR198＿HG1-LALA 배열을 이하의 실시예에 기재되는 바와 같이 구축하였다.
12)-1 LALA 타입 중사슬 발현 벡터의 설계
정상의 인간 Orai1 발현 세포에 대한 세포 상해를 회피하기 위해서, 항체의 이팩터 활성은 낮은 것이 바람직하다. 이팩터 활성은 항체의 서브 클래스에 따라 상이한 것이 알려져 있다. IgG4 는 ADCC, CDC 활성이 낮고, IgG2 는 CDC 활성을 갖지만, ADCC 활성은 낮은, 등의 특징을 볼 수 있다. 이 특징으로부터, IgG1 의 정상 영역의 일부의 배열을 IgG2, 4 를 참고로 하여 치환함으로써, ADCC, CDC 활성이 저감된 IgG1 항체를 제작하는 것이 가능하다. 일례로서, Marjan Hezareh et. al. Journal of Virology, 75(24) : 12161-12168 (2001) 에 의하면, IgG1 의 234 번째, 235 번째의 류신 잔기 (숫자는 Kabat 등에 의한 EU 인덱스) 를 각각 알라닌 잔기로 치환하면, ADCC, CDC 활성이 저하하는 것이 나타나 있다. 그래서, 10)-1 에서 제작된 hR198＿HG1 타입 중사슬에 대하여, 아미노산 번호 253 번째의 류신 잔기를 알라닌 잔기로, 254 번째의 류신 잔기를 알라닌 잔기로 치환하는 것을 수반하여 설계된 인간화 항인간 Orai1 항체 중사슬을 「hR198＿HG1-LALA 타입 중사슬」 이라고 명명하였다.
12)-2 LALA 타입 중사슬 발현 벡터의 구축
12)-2-1 hR198＿HG1-LALA 타입 중사슬 발현 벡터의 구축
7)-2 에서 제작된, hR198＿H4 타입 중사슬 pCMA-G1/hR198＿H4 를 템플레이트로 하여, KOD -플러스- 뮤타제네시스 키트를 사용하여, 변이를 도입함으로써 hR198＿H4-LALA 타입 중사슬 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pCMA-G1-LALA/hR198＿H4」 라고 명명하였다. hR198＿H4-LALA 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 그 중사슬의 아미노산 배열을, 배열표의 배열 번호 67 및 68 (도 36) 에 각각 나타낸다.
pCMA-G1-LALA/hR198＿H4 를 제한 효소 PstI 및 XbaI 로 소화하여 얻어지는 약 4.2 kb 의 DNA 단편에, 10)-2 에서 제작된 pCMA-G1/hR198＿HG1 을 동일한 제한 효소로 소화하여 얻어지는 항체 가변 영역을 포함하는 약 0.6 kb 의 DNA 단편을, Ligation High ver.2 를 사용하여 삽입함으로써, hR198＿HG1-LALA 타입 중사슬 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pCMA-G1-LALA/hR198＿HG1」 이라고 명명하였다. hR198＿HG1-LALA 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 및 그 중사슬의 아미노산 배열을, 배열표의 배열 번호 69 및 70 (도 37) 에 각각 나타낸다.
12)-3 어피니티 매츄레이션 항체의 이팩터 활성 저감 개변체의 조제
12)-3-1 어피니티 매츄레이션 항체의 이팩터 활성 저감 개변체의 생산
FreeStyle 293F 세포 (Life Technologies 사) 는 매뉴얼에 따라, 계대, 배양을 실시하였다. 대수 증식기의 1.2 × 109 개의 FreeStyle 293F 세포 (Life Technologies 사) 를 3L Fernbach Erlenmeyer Flask (CORNING 사) 에 파종하고, FreeStyle293 expression medium (Invitrogen 사) 로 희석하여 1.0 × 106 세포/㎖ 로 조제한 후에, 37 ℃, 8 ％ CO2 인큐베이터 내에서 90 rpm 으로 1 시간 진탕 배양하였다. 폴리에틸렌이민 (Polyethyleneimine) (Polyscience ＃24765) 3.6 ㎎ 을 Opti-Pro SFM (Life Technologies 사) 20 ㎖ 에 용해시키고, 다음으로 PureLink HiPure Plasmid 키트 (Life Technologies 사) 를 사용하여 조제한 경사슬 발현 벡터 (0.8 ㎎) 및 중사슬 발현 벡터 (0.4 ㎎) 를 20 ㎖ 의 Opti-Pro SFM (Life Technologies 사) 에 첨가하였다. 폴리에틸렌이민/Opti-Pro SFM 혼합액 20 ㎖ 에, 발현 벡터/Opti-Pro SFM 혼합액 20 ㎖ 를 첨가하고 조심스럽게 교반하고, 추가로 5 분간 방치한 후에 FreeStyle 293F 세포에 첨가하였다. 37 ℃, 8 ％ CO2 인큐베이터에서 7 일간, 90 rpm 으로 진탕 배양하여 얻어진 배양 상청을 Disposable Capsule Filter (ADVANTEC 사 ＃CCS-045-E1H) 로 여과하였다. hR198＿HG1/LG1 은 pCMA-G1/hR198＿HG1 과 pCMA-LK/hR198＿LG1 의 조합에 의해 생산하고, hR198＿HG1-LALA/LG1 은 pCMA-G1-LALA/hR198＿HG1 과 pCMA-LK/hR198＿LG1 의 조합에 의해 생산하였다.
12)-3-2 어피니티 매츄레이션 항체의 이팩터 활성 저감 개변체의 2 단계 공정 정제
실시예 12)-3-1 에서 얻어진 배양 상청으로부터 항체를, r프로테인 A 어피니티 크로마토그래피 (4 - 6 ℃ 하) 와 세라믹 하이드록시 어퍼타이트 (실온하) 의 2 단계 공정으로 정제하였다. r프로테인 A 어피니티 크로마토그래피 정제 후와 세라믹 하이드록시 어퍼타이트 정제 후의 버퍼 치환 공정은 4 - 6 ℃ 하에서 실시하였다. PBS 로 평형화한 MabSelectSuRe (GE Healthcare Bioscience 사, HiTrap 칼럼) 에 배양 상청을 어플라이하였다. 배양 상청이 칼럼에 모두 들어간 후, 칼럼 용량 2 배 이상의 PBS 로 칼럼을 세정하였다. 다음으로 2 M 아르기닌 염산염 용액 (pH 4.0) 으로 용출하여, 항체가 포함되는 획분을 수집하였다. 그 획분을 투석 (Thermo Scientific 사, Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette) 에 의해 PBS 로 치환한 후, 5 mM 인산나트륨/50 mM MES/pH 7.0 의 버퍼로 5 배 희석한 항체 용액을, 5 mM NaPi/50 mM MES/30 mM NaCl/pH 7.0 의 버퍼로 평형화된 세라믹 하이드록시 어퍼타이트 칼럼 (닛폰 바이오래드사, Bio-Scale CHT Type-1 Hydroxyapatite Column) 에 어플라이하였다. 염화나트륨에 의한 직선적 농도 구배 용출을 실시하여, 항체가 포함되는 획분을 수집하였다. 그 획분을 투석 (Thermo Scientific 사, Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette) 에 의해 HBSor (25 mM 히스티딘/5 ％ 소르비톨, pH 6.0) 에 대한 액 치환을 실시하였다. Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20 (분획 분자량 UF10K, Sartorius 사, 4 ℃ 하) 으로 농축하고, IgG 농도를 5 ㎎/㎖ 이상으로 조제하였다. 마지막으로 Minisart-Plus filter (Sartorius 사) 로 여과하여, 정제 샘플로 하였다.
[실시예 13] 인간 항인간 Orai1 항체 2C1.1 및 5H3.1 의 발현 벡터의 제작
2C1.1 항체 및 5H3.1 항체는 WO2011063277A1 에 기재되어 있는 경사슬, 및 중사슬의 아미노산 배열을 기초로 제작하였다.
13)-1 키메라화 및 인간화 IgG2 타입 중사슬 발현 벡터 pCMA-G2 의 구축
pCMA-LK 를 XbaI 및 PmeI 로 소화하여 κ 사슬 분비 시그널 및 인간 κ 사슬 정상 영역을 제거한 DNA 단편과, 배열표의 배열 번호 71 에 나타내는 인간 중사슬 분비 시그널 및 인간 IgG2 정상 영역의 아미노산을 코드하는 배열을 포함하는 DNA 단편을 In-Fusion Advantage PCR 클로닝 키트를 사용하여 결합하여, CMV 프로모터의 하류에 시그널 배열, 클로닝 사이트, 인간 IgG2 중사슬 정상 영역을 가지는 키메라 및 인간화 IgG2 타입 중사슬 발현 벡터 pCMA-G2 를 구축하였다.
13)-2 2C1.1 항체 중사슬 발현 벡터의 구축
배열표의 배열 번호 72 에 나타내는 2C1.1 항체 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열의 뉴클레오티드 번호 36 내지 434 에 나타내는 2C1.1 항체 중사슬의 가변 영역을 코드하는 배열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사 인공 유전자 합성 서비스). 합성한 DNA 단편을 템플레이트로 하여, KOD -플러스- 로 2C1.1 항체 중사슬의 가변 영역을 코드하는 배열을 포함하는 DNA 단편을 증폭하고, 키메라 및 인간화 항체 IgG2 타입 중사슬 발현 벡터 pCMA-G2 를 제한 효소 BlpI 로 절단한 지점에 In-Fusion HD PCR 클로닝 키트를 사용하여 삽입함으로써 2C1.1 항체 중사슬 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pCMA-G2/2C1.1」 이라고 명명하였다.
2C1.1 항체 중사슬의 아미노산 배열을 배열표의 배열 번호 73 에 나타냈다.
13)-3 2C1.1 항체 경사슬 발현 벡터의 구축
배열표의 배열 번호 74 에 나타내는 2C1.1 항체 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열의 뉴클레오티드 번호 38 내지 739 에 나타내는 2C1.1 항체 경사슬의 가변 영역과 정상 영역 (λ 사슬) 을 코드하는 배열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사 인공 유전자 합성 서비스). 합성한 DNA 단편을 템플레이트로 하여, KOD -플러스- 로 2C1.1 항체 경사슬의 가변 영역과 정상 영역을 코드하는 배열을 포함하는 DNA 단편을 증폭하고, 키메라 및 인간화 항체 경사슬 발현 벡터 pCMA-LK 를 제한 효소 BsiWI 및 PmeI 로 절단한 지점에 In-fusion HD PCR 클로닝 키트를 사용하여 삽입함으로써 2C1.1 항체 경사슬 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pCMA-L/2C1.1」 이라고 명명하였다.
2C1.1 항체 경사슬의 아미노산 배열을 배열표의 배열 번호 75 에 나타냈다.
13)-4 5H3.1 항체 중사슬 발현 벡터의 구축
배열표의 배열 번호 76 에 나타내는 5H3.1 항체 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열의 뉴클레오티드 번호 36 내지 434 에 나타내는 5H3.1 항체 중사슬의 가변 영역을 코드하는 배열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사 인공 유전자 합성 서비스). 실시예 13)-2 와 동일한 방법으로 5H3.1 항체 중사슬 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pCMA-G2/5H3.1」 이라고 명명하였다.
5H3.1 항체 중사슬의 아미노산 배열을 배열표의 배열 번호 77 에 나타냈다.
13)-5 5H3.1 항체 경사슬 발현 벡터의 구축
배열표의 배열 번호 78 에 나타내는 5H3.1 항체 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열의 뉴클레오티드 번호 38 내지 742 에 나타내는 5H3.1 항체 경사슬의 가변 영역과 정상 영역을 코드하는 배열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사 인공 유전자 합성 서비스). 실시예 13)-3 과 동일한 방법으로 5H3.1 항체 경사슬 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pCMA-L/5H3.1」 이라고 명명하였다.
5H3.1 항체 경사슬의 아미노산 배열을 배열표의 배열 번호 79 에 나타냈다.
13)-6 2C1.1 항체 및 5H3.1 항체의 조제
13)-6-1 2C1.1 항체 및 5H3.1 항체의 생산
실시예 12)-3-1 과 동일한 방법으로, 항체를 생산하였다. 2C1.1 항체는 pCMA-G2/2C1.1 과 pCMA-L/2C1.1 의 조합에 의해 생산하고, 5H3.1 항체는 pCMA-G2/5H3.1 과 pCMA-L/5H3.1 의 조합에 의해 생산하였다.
13)-6-2 2C1.1 항체 및 5H3.1 항체의 2 단계 공정 정제
실시예 12)-3-2 와 동일한 방법으로, 실시예 13)-6-1 에서 생산된 배양 상청에 대하여 항체의 2 단계 공정 정제를 실시하였다.
[실험예 14] 마우스 항인간 Orai1 항체 10F8, 14F74, 및 17F6 의 제작
10F8 항체, 14F74 항체, 및 17F6 항체는 WO2013091903A1 에 기재되어 있는 경사슬, 및 중사슬의 아미노산 배열을 기초로 제작하였다.
14)-1 10F8 항체 중사슬 발현 벡터의 구축
배열표의 배열 번호 80 에 나타내는 10F8 항체 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사 인공 유전자 합성 서비스). 합성한 DNA 단편을 템플레이트로 하여, KOD -플러스- 로 10F8 항체 중사슬을 코드하는 배열을 포함하는 DNA 단편을 증폭하고, 키메라 및 인간화 항체 경사슬 발현 벡터 pCMA-LK 를 제한 효소 XbaI 및 PmeI 로 소화하여 κ 사슬 분비 시그널 및 인간 κ 사슬 정상 영역을 제거한 지점에 In-Fusion HD PCR 클로닝 키트를 사용하여 삽입함으로써 10F8 항체 중사슬 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pCMA/10F8H」 라고 명명하였다.
10F8 항체 중사슬의 아미노산 배열을 배열표의 배열 번호 81 에 나타냈다.
14)-2 10F8 항체 경사슬 발현 벡터의 구축
배열표의 배열 번호 82 에 나타내는 10F8 항체 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사 Strings DNA Fragments). 합성한 DNA 단편을, 키메라 및 인간화 항체 경사슬 발현 벡터 pCMA-LK 를 제한 효소 XbaI 및 PmeI 로 소화하여 κ 사슬 분비 시그널 및 인간 κ 사슬 정상 영역을 제거한 지점에 In-Fusion HD PCR 클로닝 키트를 사용하여 삽입함으로써 10F8 항체 경사슬 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pCMA/10F8L」 이라고 명명하였다.
10F8 항체 경사슬의 아미노산 배열을 배열표의 배열 번호 83 에 나타냈다.
14)-3 14F74 항체 중사슬 발현 벡터의 구축
배열표의 배열 번호 84 에 나타내는 14F74 항체 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사 인공 유전자 합성 서비스). 실시예 14)-1 과 동일한 방법에 의해 14F74 항체 중사슬 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pCMA/14F74H」 라고 명명하였다.
14F74 항체 중사슬의 아미노산 배열을 배열표의 배열 번호 85 에 나타냈다.
14)-4 14F74 항체 경사슬 발현 벡터의 구축
배열표의 배열 번호 86 에 나타내는 14F74 항체 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사 Strings DNA Fragments). 실시예 14)-2 와 동일한 방법에 의해 14F74 항체 경사슬 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pCMA/14F74L」 이라고 명명하였다.
14F74 항체 경사슬의 아미노산 배열을 배열표의 배열 번호 87 에 나타냈다.
14)-5 17F6 항체 중사슬 발현 벡터의 구축
배열표의 배열 번호 88 에 나타내는 17F6 항체 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사 인공 유전자 합성 서비스). 실시예 14)-1 과 동일한 방법에 의해 17F6 항체 중사슬 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pCMA/17F6H」 라고 명명하였다.
17F6 항체 중사슬의 아미노산 배열을 배열표의 배열 번호 89 에 나타냈다.
14)-6 17F6 항체 경사슬 발현 벡터의 구축
배열표의 배열 번호 90 에 나타내는 17F6 항체 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사 Strings DNA Fragments). 실시예 14)-2 와 동일한 방법에 의해 17F6 항체 경사슬 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pCMA/17F6L」 이라고 명명하였다.
17F6 항체 경사슬의 아미노산 배열을 배열표의 배열 번호 91 에 나타냈다.
14)-7 10F8 항체, 14F74 항체, 및 17F6 항체의 조제
14)-7-1 10F8 항체, 14F74 항체, 및 17F6 항체의 생산
실시예 12)-3-1 과 동일한 방법으로 생산하였다. 10F8 항체는 pCMA/10F8H 와 pCMA/10F8L 의 조합에 의해 생산하고, 14F74 항체는 pCMA/14F74H 와 pCMA/14F74L 의 조합에 의해 생산하고, 17F6 항체는 pCMA/17F6H 와 pCMA/17F6L 의 조합에 의해 생산하였다.
14)-7-2 10F8 항체, 14F74 항체, 및 17F6 항체의 2 단계 공정 정제
실시예 12)-3-2 와 동일한 방법으로, 실시예 14)-7-1 에서 얻어진 배양 상청에 대하여 항체의 2 단계 공정 정제를 실시하였다.
[실시예 15] 어피니티 매츄레이션 항체의 이팩터 활성 저감 개변체와 그 밖의 항인간 Orai1 항체의 in vitro 활성 비교
15)-1 플로우 사이토메트리에 의한 항인간 Orai1 항체의 항원 결합 활성
1)-1-1 에서 구축한 인간 Orai1 발현 벡터를 1)-4-2 에서 나타내는 방법에 의해 HEK293T 세포에 도입한 세포 현탁액을 원심하고, 상청을 제거한 후, pcDNA3.1-hOrai1 도입 HEK293T 세포 및 pcDNA3.1-DEST 도입 HEK293T 세포의 각각에 대하여, 12)-3 에서 제작한 hR198＿HG1/LG1, hR198＿HG1/LG1-LALA, 13)-6 에서 제작한 2C1.1, 5H3.1, 14)-7 에서 제작한 10F8, 14F74, 17F6, 및 컨트롤로서 인간 IgG 컨트롤 항체와 마우스 IgG 컨트롤 항체를 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 30 분 정치하였다. 5 ％ FBS 함유 PBS 로 2 회 세정한 후, 인간 항체에 관해서는, 5 ％ FBS 함유 PBS 로 100 배로 희석한 항-인간 IgG FITC 콘주게이트, 마우스 항체에 관해서는 항-마우스 IgG FITC 콘주게이트 (Cappel 사) 를 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 30 분 정치하였다. 5 ％ FBS 함유 PBS 로 2 회 세정한 후, 1 ㎍/㎖ 프로피디움 요오드화물을 포함하는 5 ％ FBS 함유 PBS 에 재현탁하고, 플로우 사이토미터 (FC500) 로 검출을 실시하였다. 데이터 해석은 Flowjo 로 실시하였다. 프로피디움 요오드화물 양성의 사세포를 게이트로 제외한 후, 생세포의 FITC 형광 강도의 히스토그램을 작성하고, 평균 형광 강도 (MFI) 를 산출하였다. hR198＿HG1/LG1, hR198＿HG1-LALA/LG1, 2C1.1, 5H3.1, 10F8, 14F74, 17F6 은 pcDNA3.1-DEST 도입 HEK293T 세포에는 결합하지 않고, 도 10 (인간 항체), 도 11 (마우스 항체) 에 나타내는 바와 같이, pcDNA3.1-hOrai1 도입 HEK293T 세포에 대해서는, 결합을 볼 수 있었던 것으로부터, 어느 항체도 특이적으로 인간 Orai1 에 결합하는 것이 나타났다. 한편, 마우스 IgG 컨트롤 항체에서는 결합은 관찰되지 않았다.
15)-2 항인간 Orai1 항체의 인간 T 세포주 활성화 억제 작용
인간 T 세포주인 Jurkat 세포를, RPMI1640 (10 ％ FBS, 100 U/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 포함한다) 으로 1.5 x 106 세포/㎖ 의 농도로 조제하고, 96-웰 세포 배양 플레이트에 80 ㎕ 씩 파종하고, hR198＿HG1/LG1, hR198＿HG1-LALA/LG1, 2C1.1, 5H3.1, 10F8, 14F74, 17F6 을 10 ㎕/웰 첨가하여 37 ℃, 5 ％ CO2 하에서 60 분간 전처치하였다. 그 후, 100 ng/㎖ PMA 및 1 ㎍/㎖ A23187 을 10 ㎕/웰 첨가하고 (최종 농도 10 ng/㎖ PMA 및 100 ng/㎖ A23187), 잘 교반한 후, 약 16 시간 37 ℃, 5 ％ CO2 하에서 배양하였다. 플레이트를 잘 교반한 후, 600 g 으로 3 분간 원심하고, 상청에 포함되는 IL-2 농도를 ELISA 법으로 측정하였다. 도 12 는 항인간 Orai1 항체가 PMA 및 A23187 처리된 Jurkat 세포로부터의 IL-2 의 방출을 첨가 농도 의존적으로 억제하는 것을 나타낸다. 도 13 은 항체 비첨가시의 IL-2 농도를 100 ％ 로 했을 때의, hR198＿HG1/LG1, hR198＿HG1-LALA/LG1, 2C1.1, 5H3.1, 10F8, 14F74, 17F6 의 반수 저해 농도 (IC50) 및 80 ％ 저해 농도 (IC80) 를 나타낸다. 선행 기술의 항체의 IC50 은 80 ng/㎖ 이상인 한편으로, 본 발명의 대표적인 항체의 IC50 은 10 ng/㎖ 이하이다. 또한 선행 기술의 항체의 IC80 은 60000 ng/㎖ 이상인 한편으로, 본 발명의 대표적인 항체의 IC80 은 200 ng/㎖ 이하이다.
15)-3 어피니티 매츄레이션 항체의 이팩터 활성 저감 개변체와 그 밖의 항인간 Orai1 항체의 인간 말초혈 단핵구 활성화 억제 작용
인간 말초혈 단핵구 (PBMC) 는 Cellular Technology 사로부터 동결품으로서 구입하고, 지시서에 따라 해동하여 사용하였다. 10 ％ FBS, 100 U/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 포함하는 RPMI1640 으로 2.0 x106 세포/㎖ 의 농도로 조제한 PBMC 를 96-웰 세포 배양 플레이트에 80 ㎕ 씩 파종하고, 각종 항인간 Orai1 항체를 10 ㎕/웰 첨가하여 37 ℃ 인큐베이터 내에서 60 분간 전처치하였다. 그 후, 100 ng/㎖ PMA 및 1 ㎍/㎖ A23187 을 10 ㎕/웰 첨가하고, 잘 교반한 후, 약 16 시간 37 ℃, 5 ％ CO2 하에서 배양하였다. 플레이트를 잘 교반한 후, 600 g 으로 3 분간 원심하고, 상청에 포함되는 IL-2 농도 및 인터페론 감마 (IFN-γ) 농도 (MABTECH 사) 를 ELISA 법으로 측정하였다. 도 51 은 항인간 Orai1 항체가 PMA 및 A23187 처리된 인간 PBMC 로부터의 IL-2 의 방출을 첨가 농도 의존적으로 억제하는 것을 나타낸다. 도 52 는 항체 비첨가시의 IL-2 농도를 100 ％ 로 했을 때의, hR198＿HG1/LG1, hR198＿HG1-LALA/LG1, 2C1.1, 5H3.1, 10F8, 14F74, 17F6 의 반수 저해 농도 (IC50) 및 80 ％ 저해 농도 (IC80) 를 나타낸다. 선행 기술의 항체의 IC50 은 100 ng/㎖ 이상인 한편으로, 본 발명의 대표적인 항체의 IC50 은 20 ng/㎖ 이하이다. 또한 선행 기술의 항체의 IC80 은 17000 ng/㎖ 이상인 한편으로, 본 발명의 대표적인 항체의 IC80 은 400 ng/㎖ 이하이다. 도 53 은 항인간 Orai1 항체가 PMA 및 A23187 처리된 인간 PBMC 로부터의 IFN-γ 의 방출을 첨가 농도 의존적으로 억제하는 것을 나타낸다. 도 54 는 항체 비첨가시의 IFN-γ 농도를 100 ％ 로 했을 때의, hR198＿HG1/LG1, hR198＿HG1-LALA/LG1, 2C1.1, 5H3.1, 10F8, 14F74, 17F6 의 반수 저해 농도 (IC50) 및 80 ％ 저해 농도 (IC80) 를 나타낸다. 선행 기술의 항체의 IC50 은 800 ng/㎖ 이상인 한편으로, 본 발명의 대표적인 항체의 IC50 은 40 ng/㎖ 이하이다. 또한 선행 기술의 항체의 IC80 은 300000 ng/㎖ 이상인 한편으로, 본 발명의 대표적인 항체의 IC80 은 2000 ng/㎖ 이하이다.
[실시예 16] hR198＿HG1/LG1 의 in vivo 활성
16)-1 인간 PBMC 이입 마우스 이식편 대 숙주병 모델에 대한 hR198＿HG1/LG1 의 투여 효과
중증 복합 면역 부전 마우스인 NSG 마우스 (NOD. Cg-Prkdc ＜scid＞ Il2rg ＜tm1Wjl＞/SzJ) 에 인간 PBMC 를 이입함으로써, 인간 이식편 대 숙주병 유사의 반응을 유도할 수 있는 것이 알려져 있다 (Clinical and Experimental Immunology, 157 : 104-118 (2009)). 니혼 찰스·리버사로부터 구입한 6 주령의 웅성 NSG 마우스 17 마리에 2.0 Gy 의 X 선을 조사한 후 (히타치 X 선 조사 장치 MBR-1520R-4), 마우스를 2 마리의 1 군과 5 마리의 3 군으로 분할하였다. HBSor (25 mM hystidine/5 ％ sorbitol, pH 6.0) 로 3 ㎎/㎖ 및 6 ㎎/㎖ 가 되도록 조제한 hR198＿HG1/LG1 을 10 ㎖/㎏, 즉 30 ㎎/㎏ 및 60 ㎎/㎏ 이 되도록 2 군 (n = 5) 의 마우스에 꼬리 정맥 내 투여하였다. 1 군 (n = 5) 은 비이클 (Vehicle) 군으로서 HBSor 만을 투여하였다. 다음날, 동결 인간 PBMC (Cellular Technology 사) 를 CTL-antiaggrigate (Cellular Technology 사) 를 사용하여 프로토콜에 따라 해동하고, 3 백만개의 인간 PBMC 를 200 ㎕ 의 PBS 에 부유시켜 3 군 (n = 5) 의 마우스에 이입, 1 군 (n = 2) 은 인간 PBMC 를 이입하지 않고 X 선 조사 컨트롤군으로서 경과를 관찰하였다. 투여군에 있어서는, X 조사 후 제 0 일, 7 일, 14 일, 21 일에 동일 용량의 hR198＿HG1/LG1 혹은 HBSor 을 투여하였다. 각 마우스의 체중은 제 0 일, 1 일, 4 일, 7 일, 9 일, 10 일, 11 일과 13 일 이후 매일 계측하고, 제 0 일의 체중을 100 ％ 로 하여 체중 변화를 퍼센트 환산하고, 각 군의 평균 체중 변화를 도 55 에 나타냈다. 비이클 (Vehicle) 투여군의 평균 체중의 감소는 제 16 일 정도부터 관찰되기 시작하였다. 실험은 비이클 투여군의 평균 체중이 80 ％ 를 하회한 제 21 일에 종료하였다. 이 시점에 있어서, 인간 PBMC 를 이입하지 않은 X 선 조사 컨트롤군은 체중 감소를 나타내지 않았다. hR198＿HG1/LG1 을 30 ㎎/㎏ 및 60 ㎎/㎏ 투여한 마우스도 체중은 감소하지 않아, 평균 체중은 인간 PBMC 비이입 마우스와 동등하였다. 본 계에 있어서 인간 PBMC 의 활성화에 의한 이식편 대 숙주병의 증상을 현저하게 억제한 hR198＿HG1/LG1 (항 Orai1 항체) 에는, 인간 이식편 대 숙주병에 대한 치료 및/또는 예방 효과가 기대된다.
16)-2 인간 Orai1 노크인 마우스를 사용한 hR198＿HG1/LG1 의 in vivo 활성 평가
16)-2-1 인간 Orai1 노크인 마우스의 작출
마우스 Orai1 의 제 2 세포 외 루프 도메인의 아미노산 배열을 인간 Orai1 배열로 치환한 인간 Orai1 노크인 마우스는, 유전자 개변 마우스 제작의 정법에 따라 주식회사 톡슈 면역 연구소에서 작출되었다. 개요를 기술하면, 마우스 Orai1 유전자좌를 포함하는 BAC 클론의 코드 영역의 DNA 배열을 인간 Orai1 유전자좌로 치환함과 함께, lo x P 배열로 끼워진 네오 내성 유전자를 도입하여, 인간 Orai1 유전자의 녹크인 타게팅 벡터를 구축하였다. 이 타게팅 벡터를 마우스 ES 세포에 도입하여, G418 내성주를 수립하였다. 서던 하이브리다이제이션법에 의해, 표적 유전자좌가 특이적으로 재조합된 ES 세포주를 스크리닝하였다. 또한, Cre 발현 벡터를 도입하여 셀렉션 마커를 제거하고, 그 ES 세포주를 이용하여 키메라 F1 마우스를 작출하였다. 서던 하이브리다이제이션으로 제노 타이핑을 실시하여, F1 마우스 중에서 헤테로 변이체 개체를 선별하고, 이 F1 헤테로 변이체 개체의 교배에 의해, F2 호모 변이체인 인간 Orai1 노크인 마우스를 작출하였다.
16)-2-2 hR198＿HG1/LG1 의 수동 피부 아나필락시스 (PCA) 반응 억제 효과
마우스 PCA 반응은, 정법에 따라 실시하였다. 톡슈 면역 연구소에서 생산된 8 주령의 인간 Orai1 노크인 마우스 혹은 야생형의 동복 형제 마우스를 보정기로 보정 후, HBSor 로 6 ㎎/㎖ 가 되도록 조제한 hR198＿HG1/LG1 을 10 ㎖/㎏, 즉 60 ㎎/㎏ 이 되도록 꼬리 정맥 내 투여하였다. 비이클 (Vehicle) 군에는 HBSor 만을 투여하였다. 다음날 이소플루란 (파이저사) 흡입 마취하, 생리 식염수로 10 ug/㎖ 로 조정한 모토클로널 (Monoclonal) 항-OVA IgE (chondrex 사) 를 10 ㎕ 씩 귓바퀴 피내에 투여하였다. 24 시간 후, 2 ㎎/㎖ 의 OVA (Albumin from chicken egg white, SIGMA 사) 및 20 ㎎/㎖ 의 에반스 블루 (Evans blue) (Merck 사) 를 포함하는 생리 식염수를, 5 ㎎/㎏ OVA 및 100 ㎎/㎏ 에반스 블루 (Evans blue) 가 되도록 꼬리 정맥 내 투여하였다. 30 분 후에 이소플루란 심마취하, 방혈 치사시켜 귓바퀴를 절제하고, 0.5 ㎖ 의 DMSO 에 담가, 에반스 블루 (Evans blue) 를 추출하였다 (37 ℃, 72 시간). 에반스 블루 (Evans blue) 가 추출된 DMSO 용액은, 200 ㎕ 씩 96 웰 마이크로 플레이트로 옮기고, O.D. 650 ㎚ 를 마이크로 플레이트 리더 (Molecular devices 사, SpectraMax M5e) 로 측정하였다. 침출한 에반스 블루 (Evans blue) 의 흡광도는 이하의 계산법에 따라, 비이클 (Vehicle) 투여군의 평균치를 100 ％ 로 하여 나타냈다. Blank 에는, DMSO 용액의 흡광도를 구하였다. ％ = (OD650 샘플 - OD650 블랭크)/(OD650 비이클 - OD650 블랭크). 도 56 은, 인간 Orai1 노크인 마우스에 유도한 PCA 반응을 hR198＿HG1/LG1 이 억제하는 것을 나타내고 있다. 마우스 PCA 반응은 인간의 I 형 알레르기 반응인 아나필락시스를 재현한 즉시형 알레르기의 기본적인 모델계이고, 본 계가 항알레르기약의 평가에 사용 가능하다는 것이 알려져 있다 (Archives internationals de pharmacodynamie et de therapie, 165 : 92-102 (1967), International archives of allergy and applied immunology, 78 : 113-117 (1985)). 본 계에 있어서 IgE 의존적인 매스트 세포 탈과립에 대한 억제 활성이 확인된 hR198＿HG1/LG1 (항 Orai1 항체) 에는, 기존의 매스트 세포 탈과립 저해약에서 확인되는 기관지 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 또한 동일한 인간의 I 형 알레르기 질환, 예를 들어 알레르기성 천식 등에 대한 치료 및/또는 예방 효과가 기대된다.
16)-2-3 hR198＿HG1/LG1 의 지연형 과민 (DTH) 반응 억제 효과
마우스 DTH 반응은, 정법에 따라 실시하였다. 톡슈 면역 연구소에서 생산된 8 주령의 인간 Orai1 노크인 마우스 혹은 야생형의 동복 형제 마우스를 보정기로 보정 후, HBSor 로 6 ㎎/㎖ 가 되도록 조제한 hR198＿HG1/LG1 을 10 ㎖/㎏, 즉 60 ㎎/㎏ 이 되도록 꼬리 정맥 내 투여하였다. 비이클 (Vehicle) 군에는 HBSor 만을 투여하였다. 다음날 생리 식염수로 5 ㎎/㎖ 로 희석한 mBSA (Albumin Bovine Methylated, SIGMA 사) 와 Freund's Complete Adjuvant (DIFCO 사) 를 등량 혼합하여 조제한 에멀션 50 ㎕ 씩을 양 액하에 피하 투여하여 면역을 실시하였다. 6 일 후, 다시 hR198＿HG1/LG1 을 60 ㎎/㎏ 이 되도록 꼬리 정맥 내 투여하였다. 다음날 생리 식염수로 0.5 ㎎/㎖ 로 조제한 mBSA 와 생리 식염수를 각각 이소플루란 흡입 마취하 한쪽 다리에 피내 투여하고, 투여 후 6, 24, 48 시간 후의 다리의 붓기를 다이얼 게이지로 측정하였다. 다리의 붓기는 0 시간을 0 (10-2 ㎜) 으로 하고, 시간 경과적으로 변화하는 붓기의 두께를 계산하여, 비이클 (Vehicle) 투여군의 평균치를 100 ％ 로 하여 구하였다. 도 57 은, 인간 Orai1 노크인 마우스에 유도한 DTH 반응을, 항원 투여 후 6 시간 (A) 24 시간 (B) 48 시간 (C) 의 각 시점에서 hR198＿HG1/LG1 이 억제되어 있는 것을 나타낸다. 마우스 DTH 반응은 T 세포 의존적인 면역의 성립과 응답을 보는 계이고, 본 계에 있어서 활성을 나타낸 약제가 강력한 면역 억제제로서 개발된 것은 잘 알려져 있다 (Clinical and Experimental Immunology, 52 : 599-606 (1983)). 본 계에 있어서 T 세포 면역의 억제 활성이 확인된 hR198＿HG1/LG1 (항 Orai1 항체) 에는, T 세포 활성에서 기인하는 인간의 생체 반응이나 질환, 예를 들어 이식물의 거절, 면역 질환, 염증성 질환에 대한 치료 및/또는 예방 효과가 기대된다.
16)-2-4 항 Orai1 항체의 피부염에 대한 억제 활성의 검토
피부염은 이하의 어느 방법으로 야기한다. 즉 마우스의 복강 내에 알부민 항원액을 0.5 ㎖ 투여하고, 또한 2 주일 후에 동량의 항원으로 추가 면역을 실시한 후, 알부민 항원액을 귀 (20 ㎕) 또는 배부 (100 ㎕) 에 3 일 ∼ 2 주일 마다 3 ∼ 6 회 반복 도포한다. 혹은 진드기 항원 크림을 귀 (20 ㎕) 또는 배부 (100 ㎕) 에 3 일 ∼ 2 주일 마다 3 ∼ 6 회 반복 도포한다. 혹은 합텐인 피크릴클로라이드 또는 디니트로플루오로벤젠 (Dinitrofluorobenzene) 을 프로토콜에 따라 조제하고, 귀 (20 ㎕) 또는 배부 (100 ㎕) 에 주 1 회 또는 2 회, 최대 8 주일간 도포한다. 혹은 피부 반응 유발 물질인 히스타민 (Histamine), 컴파운드 (Compound) 40/80, 5- (및 6-) 카복시플루오레신 다이아세테이트 석신이미딜 에스터 (5- (and 6-) carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester), 플루오레세인 이소티오시안산염 (Fluorescein isothiocyanate), 봄베신 (Bombesin) 유사 펩타이드를 귀 (20 ㎕), 배부 (100 ㎕), 척수 내 (5 ㎕) 에 투여한다. 항 Orai1 항체는 피부염 유도의 전날 혹은 1 시간 내지 4 시간 전에 정맥 내 혹은 피하에 투여한다. 그 후, 투여 빈도를 7 일 내지 28 일 간격으로 하여 항체 투여를 계속한다. 피부염 유발 후, 시간 경과적으로 다이얼 시크니스 게이지를 사용하여 귓바퀴의 두께의 측정이나 피부염의 육안적 스코어화를 실시한다. 또한 시험 기간 종료 후, 혈액이나 조직 중의 항체·사이토카인·혈중 바이오 마커 농도의 정량, 피부·말초혈·흉선·비장·림프절·골수로부터 얻은 세포의 증식 활성이나 사이토카인 생산능, 표면 항원 등의 검토나, 병리 조직 해석 등을 실시하여, 항 Orai1 항체의 피부염에 대한 억제 활성을 판정한다.
16)-2-5 항 Orai1 항체의 건선에 대한 억제 활성의 검토
이미퀴모드 (Imiquimod) 를 사용하는 경우에는, 귓바퀴 양측 또는 편면 (5 ∼ 30 ㎎) 및 체모가 완료된 배부 (50 ∼ 100 ㎎) 에 도포하여 건선성 피부염을 유도한다. 혹은 10 ㎎/㎖ 의 지모산 (Zymosan) 인산 완충액 중 현탁액을 200 uL 복강 내 투여하여 피부염을 유도한다. 기염 물질로서 사이토카인 (IL-23 등) 을 사용하는 경우에는, 1 ∼ 5 ％ 이소플루란 심마취하에서, 마우스 귓바퀴 편면에 사이토카인 0.1 ∼ 2 ㎍ 을 포함하는 용액을 20 ∼ 50 ㎕ 피내 투여하여 건선성 피부염을 유도한다. 항 Orai1 항체는 피부염 유도의 전날 혹은 1 시간 내지 4 시간 전에 정맥 내 혹은 피하에 투여한다. 그 후, 투여 빈도를 7 일 내지 28 일 간격으로 하여 항체 투여를 계속한다. 피부염 유발 후, 시간 경과적으로 다이얼 시크니스 게이지를 사용하여 귓바퀴의 두께 측정이나 피부염의 육안적 스코어화를 실시한다. 또한 시험 기간 종료 후, 염증 부위의 중량 및 그 부위에 침윤한 호중구의 미엘로퍼옥시다아제 활성, 침윤한 세포의 플로우 사이토메트리 해석, 유전자 해석, 사이토카인 농도 측정 등을 하여, 항 Orai1 항체의 건선 억제 활성을 판정한다.
16)-2-6 항 Orai1 항체의 다발성 경화증에 대한 억제 활성의 검토
마이엘린 희소돌기아교세포 당단백질 (Myelin oligodendrocyte glycoprotein) 또는 그 펩타이드 항원을 생리 식염수로 4 ㎎/㎖ 로 조정하고, 생리 식염수로 8 ㎎/㎖ 로 조정한 프로인트의 완전 아쥬반트와 등량 혼합하여 유화시키고, 이 혼합액 200 ㎕ 를 마우스의 옆구리 또는 복부의 피내에 투여, 그 직후에 동일 마우스에 2 ㎍/㎖ 의 백일해 독소 수용액을 100 ㎕ 꼬리 정맥으로부터 투여한다. 또한 2 일 후에 상기 서술한 백일해 독소액을 재차 꼬리 정맥으로부터 투여함으로써 실험적 뇌척수염을 유도한다. 실험 개시 1 주일 내지 2 주일 후부터 뇌척수염이 발증하여, 꼬리로부터 하지, 앞다리로 마비가 확대되어 간다. 이 마비의 정도를 사지·꼬리의 움직임을 육안적으로 관찰함으로써 스코어화한다. 항 Orai1 항체는 뇌척수염 유도의 전날 혹은 1 시간 내지 4 시간 전에 정맥 내 혹은 피하에 투여한다. 그 후, 투여 빈도를 7 일 내지 28 일 간격으로 하여 항체 투여를 계속하고, 항 Orai1 항체의 다발성 경화증에 대한 투여 효과를 판정한다.
16)-2-7 항 Orai1 항체의 관절염에 대한 억제 활성의 검토
2 ㎎/㎖ 의 소 II 형 콜라겐과 프로인트의 완전 아쥬반트를 체적 비 1 : 1.3 으로 혼합하여 유화한 것을, 1 ㎖ 의 주사통과 투베르쿨린 바늘을 사용하여 마우스의 미근부 피내에 100 ㎕ 투여한다. 2 ∼ 3 주일 후에 동일한 처치를 실시하고, 그 후의 사지의 관절 종창을 육안적 혹은 다이얼 시크니스 게이지를 사용하여 스코어화한다. 시험 기간 종료시에는, 혈액이나 조직 중의 항체·사이토카인·혈중 바이오 마커 농도, 피부·말초혈·흉선·비장·림프절·골수로부터 얻은 세포의 증식 활성·사이토카인 생산능·표면 항원 등을 측정한다. 항 Orai1 항체는 관절염 유도의 전날 혹은 1 시간 내지 4 시간 전에 정맥 내 혹은 피하에 투여한다. 그 후, 투여 빈도를 7 일 내지 28 일 간격으로 하여 항체 투여를 계속하여, 항 Orai1 항체의 관절염에 대한 투여 효과를 판정한다.
16)-2-8 항 Orai1 항체의 대장염에 대한 억제 활성의 검토
인간 Orai1 노크인 마우스의 림프절과 비장으로부터 채취하여 정제한 림프구를, 항 CD4 항체 GK1.5, 항 CD25 항체 PC61.5, 항 CD45R 항체 C363.16A (모두 eBioscience 사) 를 사용하여 셀 소터에 의해 단리한다. 이 방법으로 얻어진 세포가 순도 95 ％ 이상의 CD4＋CD25-CD45RBhi T-세포인 것을 플로우 사이트 미터로 확인한 후, 0.5 백만개를 12 내지 16 주령의 Rag2-／- 마우스의 복강 내에 이입한다. 그 후 12 주일, 체중 측정과 설사 등의 증상을 관찰하고, 관찰 기간 종료 후에 부검에 의해 장관의 비후도, 폴립의 개수와 크기, 병리적 특징의 유무를 검토한다. 또한 혈액이나 조직 중의 항체·사이토카인·혈중 바이오 마커 농도의 정량, 장관·말초혈·흉선·비장·림프절·골수로부터 얻은 세포의 증식 활성이나 사이토카인 생산능, 표면 항원 등을 해석한다. 항 Orai1 항체는 세포 이입의 전날 혹은 1 시간 내지 4 시간 전에 정맥 내 혹은 피하에 투여한다. 그 후, 투여 빈도를 7 일 내지 28 일 간격으로 하여 항체 투여를 계속하여, 항 Orai1 항체의 대장염에 대한 투여 효과를 판정한다.
16)-2-9 항 Orai1 항체의 골수 세포 이식계에 대한 작용의 검토
인간 Orai1 노크인 마우스의 대퇴골 및 경골을 적출하고, 바늘이 부착된 주사통을 사용하여 골단으로부터 10 ％ FBS-RPMI1640 배지 1 ∼ 5 ㎖ 를 주입하여 골수 내의 세포를 압출하고, 셀 스트레이너 처리 후의 원심 회수로 골수 세포를 회수, 10 mM HEPES, 0.5 mM EDTA, 0.5 ％ 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 ㅇ이인젝션 버퍼 (ction buffer) 에 200 ㎕ 중 10 백만개의 골수 세포가 포함되도록 조정한다. 동시에 인간 Orai1 노크인 마우스의 비장으로부터 정법에 따라 비세포를 채취한다. 레시피언트인 10 ∼ 13 주령의 BALB/c 마우스에 2.0 ∼ 8.0 Gy 의 X 선을 조사한 후, 200 ㎕ 의 도너 골수 세포에 0 ∼ 4 백만개의 도너 비장 세포를 첨가하고, 이 세포 혼합액을 레시피언트의 꼬리 정맥으로부터 주입한다. 그 후, 4 내지 16 주일의 체중 변화나 생존률, 시험 종료시의 레시피언트 마우스의 혈액이나 조직 중의 항체·사이토카인·혈중 바이오 마커 농도, 장관·말초혈·흉선·비장·림프절·골수로부터 얻은 세포의 표면 항원·증식 활성·사이토카인 생산능을 측정한다. 항 Orai1 항체는 골수 이식의 전날 혹은 1 시간 내지 4 시간 전에 정맥 내 혹은 피하로부터 레시피언트 마우스에 투여한다. 그 후, 투여 빈도를 7 일 내지 28 일 간격으로 하여 항체 투여를 계속하여, 항 Orai1 항체의 이식 세포의 생착이나 이식편 대 숙주병의 발생율에 대한 작용을 판정한다.
[실시예 17] 어피니티 매츄레이션 항체와 그 밖의 항인간 Orai1 항체의 물리 화학적 성질의 비교
m-VROC 에 의한 점도 측정
10)-3 에서 제작한 hR198＿HG1/LG1, hR198＿H3/LG1, 12)-3 에서 제작한 hR198＿HG1-LALA/LG1, 및 13)-6 에서 제작한 2C1.1 을, VIVAPORE 5 (Sartorius 사) 로 150 ㎎/㎖ 이상으로 농축 후, HBSor 로 90, 120 및 150 ㎎/㎖ 로 조제하였다. m-VROC (RheoSense 사) 를 사용하여 25 ℃ 에 있어서의 점도를 각 농도 3 회 측정하고, 평균 점도 (Viscosity) (mPa·s) 를 산출하였다. 결과를 도 58 및 표 1 에 나타낸다. hR198＿HG1/LG1, hR198＿H3/LG1, hR198＿HG1-LALA/LG1 의 점도는 어느 농도에 있어서도 2C1.1 의 점도보다 낮았다. 특히, 150 ㎎/㎖ 에서는, hR198＿HG1/LG1, hR198＿H3/LG1, hR198＿HG1-LALA/LG1 의 점도는 각각 11.4, 10.0, 10.8 mPa·s 인 데에 반하여, 2C1.1 은 21.0 mPa·s 로, 2C1.1 과 비교하여, 어피니티 매츄레이션 항체는 고농도화해도 점도가 낮은 것이 나타났다.
Figure 112017012255917-pct00001
본 발명의 인간화 항 Orai1 항체는, 공지된 항체보다 강력한 T 세포 활성 억제 작용을 가지고 있어, 이식 거절 등의 치료 또는 예방제가 될 수 있다.
배열표 프리텍스트
배열 번호 1 : 인간 Orai1 의 유전자 배열
배열 번호 2 : 인간 Orai1 의 아미노산 배열
배열 번호 3 : PCR 프라이머 Nhe-polyC-S
배열 번호 4 : PCR 프라이머 rIgγ-AS1
배열 번호 5 : PCR 프라이머 rIgγ-AS2
배열 번호 6 : PCR 프라이머 Nhe-polyC-S
배열 번호 7 : PCR 프라이머 rIgκ-AS
배열 번호 8 : 시퀀스 프라이머 rIgγ-seq
배열 번호 9 : 시퀀스 프라이머 rIgκ-seq
배열 번호 10 : R118 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열
배열 번호 11 : R118 경사슬의 아미노산 배열
배열 번호 12 : R118 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열
배열 번호 13 : R118 중사슬의 아미노산 배열
배열 번호 14 : R198 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열
배열 번호 15 : R198 경사슬의 아미노산 배열
배열 번호 16 : R198 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열
배열 번호 17 : R198 중사슬의 아미노산 배열
배열 번호 18 : 인간 κ 사슬 분비 시그널 및 인간 κ 사슬 정상 영역을 코드하는 배열을 포함하는 DNA 단편
배열 번호 19 : PCR 프라이머 3.3-F1
배열 번호 20 : PCR 프라이머 3.3-R1
배열 번호 21 : 인간 중사슬 시그널 배열 및 인간 IgG1 정상 영역의 아미노산을 코드하는 배열을 포함하는 DNA 단편
배열 번호 22 : 인간 키메라화 cR118 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열
배열 번호 23 : 인간 키메라화 cR118 경사슬의 아미노산 배열
배열 번호 24 : 인간 키메라화 cR198 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열
배열 번호 25 : 인간 키메라화 cR198 경사슬의 아미노산 배열
배열 번호 26 : 인간 키메라화 cR118 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열
배열 번호 27 : 인간 키메라화 cR118 중사슬의 아미노산 배열
배열 번호 28 : 인간 키메라화 cR198 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열
배열 번호 29 : 인간 키메라화 cR198 중사슬의 아미노산 배열
배열 번호 30 : hR198＿L1 타입 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열
배열 번호 31 : hR198＿L1 타입 경사슬의 아미노산 배열
배열 번호 32 : hR198＿L2 타입 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열
배열 번호 33 : hR198＿L2 타입 경사슬의 아미노산 배열
배열 번호 34 : hR198＿L3 타입 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열
배열 번호 35 : hR198＿L3 타입 경사슬의 아미노산 배열
배열 번호 36 : hR198＿L4 타입 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열
배열 번호 37 : hR198＿L4 타입 경사슬의 아미노산 배열
배열 번호 38 : hR198＿H1 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열
배열 번호 39 : hR198＿H1 타입 중사슬의 아미노산 배열
배열 번호 40 : hR198＿H2 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열
배열 번호 41 : hR198＿H2 타입 중사슬의 아미노산 배열
배열 번호 42 : hR198＿H3 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열
배열 번호 43 : hR198＿H3 타입 중사슬의 아미노산 배열
배열 번호 44 : hR198＿H4 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열
배열 번호 45 : hR198＿H4 타입 중사슬의 아미노산 배열
배열 번호 46 : PCR 프라이머 Orai1 HF
배열 번호 47 : PCR 프라이머 Orai1 CH FR
배열 번호 48 : PCR 프라이머 M13 rev long
배열 번호 49 : PCR 프라이머 SecM Stop R
배열 번호 50 : PCR 프라이머 Orai1 Lc F
배열 번호 51 : PCR 프라이머 Orai1 CL-FR
배열 번호 52 : PCR 프라이머 Orai1 HR-FLAG R
배열 번호 53 : PCR 프라이머 Orai1 CL-FLAG R
배열 번호 54 : PCR 프라이머 Myc-R
배열 번호 55 : hR198＿LG1 타입 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열
배열 번호 56 : hR198＿LG1 타입 경사슬의 아미노산 배열
배열 번호 57 : hR198＿LG2 타입 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열
배열 번호 58 : hR198＿LG2 타입 경사슬의 아미노산 배열
배열 번호 59 : hR198＿LG3 타입 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열
배열 번호 60 : hR198＿LG3 타입 경사슬의 아미노산 배열
배열 번호 61 : hR198＿HG1 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열
배열 번호 62 : hR198＿HG1 타입 중사슬의 아미노산 배열
배열 번호 63 : hR198＿HG2 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열
배열 번호 64 : hR198＿HG2 타입 중사슬의 아미노산 배열
배열 번호 65 : hR198＿HG3 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열
배열 번호 66 : hR198＿HG3 타입 중사슬의 아미노산 배열
배열 번호 67 : hR198＿H4-LALA 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열
배열 번호 68 : hR198＿H4-LALA 타입 중사슬의 아미노산 배열
배열 번호 69 : hR198＿HG1-LALA 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열
배열 번호 70 : hR198＿HG1-LALA 타입 중사슬의 아미노산 배열
배열 번호 71 : 인간 중사슬 분비 시그널 및 인간 IgG2 정상 영역의 아미노산을 코드하는 배열을 포함하는 DNA 단편
배열 번호 72 : 2C1.1 항체 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열
배열 번호 73 : 2C1.1 항체 중사슬의 아미노산 배열
배열 번호 74 : 2C1.1 항체 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열
배열 번호 75 : 2C1.1 항체 경사슬의 아미노산 배열
배열 번호 76 : 5H3.1 항체 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열
배열 번호 77 : 5H3.1 항체 중사슬의 아미노산 배열
배열 번호 78 : 5H3.1 항체 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열
배열 번호 79 : 5H3.1 항체 경사슬의 아미노산 배열
배열 번호 80 : 10F8 항체 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열
배열 번호 81 : 10F8 항체 중사슬의 아미노산 배열
배열 번호 82 : 10F8 항체 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열
배열 번호 83 : 10F8 항체 경사슬의 아미노산 배열
배열 번호 84 : 14F74 항체 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열
배열 번호 85 : 14F74 항체 중사슬의 아미노산 배열
배열 번호 86 : 14F74 항체 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열
배열 번호 87 : 14F74 항체 경사슬의 아미노산 배열
배열 번호 88 : 17F6 항체 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열
배열 번호 89 : 17F6 항체 중사슬의 아미노산 배열
배열 번호 90 : 17F6 항체 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열
배열 번호 91 : 17F6 항체 경사슬의 아미노산 배열
배열 번호 92 : 래트 CDRL1 (R198 에서 유래하고, hR198＿L1 내지 L4 타입 경사슬에 사용)
배열 번호 93 : 개변형 CDRL1 (hR198＿LG1 타입 경사슬에 사용)
배열 번호 94 : 개변형 CDRL1 (hR198＿LG2 타입 경사슬에 사용)
배열 번호 95 : 개변형 CDRL1 (hR198＿LG3 타입 경사슬에 사용)
배열 번호 96 : 래트 CDRL2 (R118 및 R198 에서 공통이고, hR198＿L1 내지 L4 및 LG1 타입 경사슬에 사용)
배열 번호 97 : 개변형 CDRL2 (hR198＿LG2 타입 경사슬에 사용)
배열 번호 98 : 개변형 CDRL2 (hR198＿LG3 타입 경사슬에 사용)
배열 번호 99 : 래트 CDRL3 (R118 에서 유래하고, hR198＿L3 및 L4 타입 경사슬에 사용)
배열 번호 100 : 래트 CDRL3 (R198 에서 유래하고, hR198＿L1 및 L2 타입 경사슬에 사용)
배열 번호 101 : 개변형 CDRL3 (hR198＿LG1 내지 LG3 타입 경사슬에 사용)
배열 번호 102 : 래트 CDRH1 (R118 에서 유래하고, hR198＿H3, H4 및 HG1 내지 HG3 타입 중사슬에 사용)
배열 번호 103 : 래트 CDRH1 (R198 에서 유래하고, hR198＿H1 및 H2 타입 중사슬에 사용)
배열 번호 104 : 래트 CDRH2 (R118 에서 유래하고, hR198＿H3 및 H4 타입 중사슬에 사용)
배열 번호 105 : 래트 CDRH2 (R198 에서 유래하고, hR198＿H1 및 H2 타입 중사슬에 사용)
배열 번호 106 : 개변형 CDRH2 (hR198＿HG1 타입 중사슬에 사용)
배열 번호 107 : 개변형 CDRH2 (hR198＿HG2 타입 중사슬에 사용)
배열 번호 108 : 개변형 CDRH2 (hR198＿HG3 타입 중사슬에 사용)
배열 번호 109 : 래트 CDRH3 (R118 및 R198 에서 공통이고, hR198＿H1 내지 H4 타입 중사슬에 사용)
배열 번호 110 : 개변형 CDRH3 (hR198＿HG1 내지 HG3 타입 중사슬에 사용)
배열 번호 111 : hR198＿H0 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열
배열 번호 112 : hR198＿H0 타입 중사슬의 아미노산 배열
배열 번호 113 : hR198＿H5 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열
배열 번호 114 : hR198＿H5 타입 중사슬의 아미노산 배열
배열 번호 115 : 비오틴 PEG 화 인간 Orai1 루프 영역 펩타이드 배열
배열 번호 116 : 래트 CDRL1 (R118 에서 유래하지만, 인간화 항체에서는 사용되고 있지 않다.)
SEQUENCE LISTING <110> Daiichi Sankyo Co., Ltd. <120> Anti Orai1 antibodies <130> FP1522 <160> 116 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 906 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgcatccgg agcccgcccc gcccccgagc cgtagcagtc ccgagcttcc cccaagcggc 60 ggcagcacca ccagcggcag ccgccggagc cgccgccgca gcggggacgg ggagcccccg 120 ggggccccgc caccgccgcc gtccgccgtc acctacccgg actggatcgg ccagagttac 180 tccgaggtga tgagcctcaa cgagcactcc atgcaggcgc tgtcctggcg caagctctac 240 ttgagccgcg ccaagcttaa agcctccagc cggacctcgg ctctgctctc cggcttcgcc 300 atggtggcaa tggtggaggt gcagctggac gctgaccacg actacccacc ggggctgctc 360 atcgccttca gtgcctgcac cacagtgctg gtggctgtgc acctgtttgc gctcatgatc 420 agcacctgca tcctgcccaa catcgaggcg gtgagcaacg tgcacaatct caactcggtc 480 aaggagtccc cccatgagcg catgcaccgc cacatcgagc tggcctgggc cttctccacc 540 gtcattggca cgctgctctt cctagctgag gtggtgctgc tctgctgggt caagttcttg 600 cccctcaaga agcagccagg ccagccaagg cccaccagca agccccccgc cagtggcgca 660 gcagccaacg tcagcaccag cggcatcacc ccgggccagg cagctgccat cgcctcgacc 720 accatcatgg tgcccttcgg cctgatcttt atcgtcttcg ccgtccactt ctaccgctca 780 ctggttagcc ataagaccga ccgacagttc caggagctca acgagctggc ggagtttgcc 840 cgcttacagg accagctgga ccacagaggg gaccaccccc tgacgcccgg cagccactat 900 gcctag 906 <210> 2 <211> 301 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met His Pro Glu Pro Ala Pro Pro Pro Ser Arg Ser Ser Pro Glu Leu 1 5 10 15 Pro Pro Ser Gly Gly Ser Thr Thr Ser Gly Ser Arg Arg Ser Arg Arg 20 25 30 Arg Ser Gly Asp Gly Glu Pro Pro Gly Ala Pro Pro Pro Pro Pro Ser 35 40 45 Ala Val Thr Tyr Pro Asp Trp Ile Gly Gln Ser Tyr Ser Glu Val Met 50 55 60 Ser Leu Asn Glu His Ser Met Gln Ala Leu Ser Trp Arg Lys Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Ser Arg Ala Lys Leu Lys Ala Ser Ser Arg Thr Ser Ala Leu Leu 85 90 95 Ser Gly Phe Ala Met Val Ala Met Val Glu Val Gln Leu Asp Ala Asp 100 105 110 His Asp Tyr Pro Pro Gly Leu Leu Ile Ala Phe Ser Ala Cys Thr Thr 115 120 125 Val Leu Val Ala Val His Leu Phe Ala Leu Met Ile Ser Thr Cys Ile 130 135 140 Leu Pro Asn Ile Glu Ala Val Ser Asn Val His Asn Leu Asn Ser Val 145 150 155 160 Lys Glu Ser Pro His Glu Arg Met His Arg His Ile Glu Leu Ala Trp 165 170 175 Ala Phe Ser Thr Val Ile Gly Thr Leu Leu Phe Leu Ala Glu Val Val 180 185 190 Leu Leu Cys Trp Val Lys Phe Leu Pro Leu Lys Lys Gln Pro Gly Gln 195 200 205 Pro Arg Pro Thr Ser Lys Pro Pro Ala Ser Gly Ala Ala Ala Asn Val 210 215 220 Ser Thr Ser Gly Ile Thr Pro Gly Gln Ala Ala Ala Ile Ala Ser Thr 225 230 235 240 Thr Ile Met Val Pro Phe Gly Leu Ile Phe Ile Val Phe Ala Val His 245 250 255 Phe Tyr Arg Ser Leu Val Ser His Lys Thr Asp Arg Gln Phe Gln Glu 260 265 270 Leu Asn Glu Leu Ala Glu Phe Ala Arg Leu Gln Asp Gln Leu Asp His 275 280 285 Arg Gly Asp His Pro Leu Thr Pro Gly Ser His Tyr Ala 290 295 300 <210> 3 <211> 37 <212> DNA <213> artificial <220> <223> PCR Primer Nhe-polyC-S <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> n is a, c, g, or t <400> 3 gctagcgcta ccggactcag atcccccccc cccccdn 37 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> artificial <220> <223> PCR Primer rIg gamma-AS1 <400> 4 tcactgagct ggtgagagtg tagagccc 28 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> artificial <220> <223> PCR Primer rIG gamma-AS2 <400> 5 tcaccgagct gctgagggtg tagagccc 28 <210> 6 <211> 37 <212> DNA <213> artificial <220> <223> PCR Primer Nhe-polyC-S <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> n is a, c, g, or t <400> 6 gctagcgcta ccggactcag atcccccccc cccccdn 37 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> artificial <220> <223> rIg kappa-AS <400> 7 tcagtaacac tgtccaggac accatctc 28 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> artificial <220> <223> rIG gamma-seq <400> 8 ctggctcagg gaaatagcc 19 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> artificial <220> <223> rIG kappa-seq <400> 9 tccagttgct aactgttcc 19 <210> 10 <211> 405 <212> DNA <213> Rattus rattus <220> <221> misc_feature <222> (382)..(382) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (403)..(403) <223> n is a, c, g, or t <400> 10 atgaaaatga cgacacctgc tcagttcctt gggcttctgt tgctctggtt tccaggtgcc 60 aggtgtgaca tccagttgac ccagtctcca tccacattgc ctgcatccct gggagagaga 120 gtcaccatca gttgcagagc aagtcagagt attagcaata gtttaagctg gtttcaacag 180 aaaccagatg gaactgttaa acgcctgatc tattctacat ccactttaga atctggtgtc 240 ccatcaaggt tcagtggcag tgggtctggg acagattatt ctctctccat caccagtctt 300 gagtctgaag attttgcaat gtattactgt ctacagtttg ctacttttcc ggacacgttt 360 ggaactggga ccaaactgga antgagacgg gctgatgctg canca 405 <210> 11 <211> 135 <212> PRT <213> Rattus rattus <220> <221> misc_feature <222> (128)..(128) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (135)..(135) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 11 Met Lys Met Thr Thr Pro Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr 20 25 30 Leu Pro Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gln Ser Ile Ser Asn Ser Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Asp Gly 50 55 60 Thr Val Lys Arg Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Ser 85 90 95 Ile Thr Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Leu Gln 100 105 110 Phe Ala Thr Phe Pro Asp Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Xaa 115 120 125 Arg Arg Ala Asp Ala Ala Xaa 130 135 <210> 12 <211> 468 <212> DNA <213> Rattus rattus <220> <221> misc_feature <222> (467)..(467) <223> n is a, c, g, or t <400> 12 atggaatgga actgggtctt tctcctcctc ctgtcagtaa ctgcagaagt ccagtcccag 60 gtccagctgc agcagtctgg agcggagctg gcaaagcctg gctcctcagt gaagatttcc 120 tgcaaggctt ccggctacac cgtcaccgcc tattatataa gttggataag gcagacgatt 180 ggacagggcc ttgagtatgt tggatatatt gacatgggaa atggaaggac taactacaat 240 gcgaggttca agggcaaggc cacattgact gtggacaaat cctccagcac agccttcatg 300 caactcagca gcctgacacc tgacgactct gcggtctatt actgtgcaag ggactccaac 360 tggggggttg attactgggg ccaaggagtc atggtcacag tctcctcagc tgaaacaaca 420 gccccatctg tctatccact ggctcctgga actgcttctc aaaagtna 468 <210> 13 <211> 156 <212> PRT <213> Rattus rattus <220> <221> misc_feature <222> (156)..(156) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 13 Met Glu Trp Asn Trp Val Phe Leu Leu Leu Leu Ser Val Thr Ala Glu 1 5 10 15 Val Gln Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys 20 25 30 Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Val 35 40 45 Thr Ala Tyr Tyr Ile Ser Trp Ile Arg Gln Thr Ile Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Tyr Val Gly Tyr Ile Asp Met Gly Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Ala Arg Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Phe Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Pro Asp Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Asn Trp Gly Val Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser Ala Glu Thr Thr Ala Pro Ser Val 130 135 140 Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Thr Ala Ser Gln Lys Xaa 145 150 155 <210> 14 <211> 408 <212> DNA <213> Rattus rattus <220> <221> misc_feature <222> (403)..(403) <223> n is a, c, g, or t <400> 14 atgaaaatga cgacacctgc tcagttcctt gggcttctgt tgctctggtt tccaggtgcc 60 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occurring amino acid <400> 17 Met Glu Trp Asn Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Glu 1 5 10 15 Val Gln Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys 20 25 30 Pro Gly Ser Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Val 35 40 45 Thr Ser Tyr Tyr Ile Ser Trp Ile Lys Gln Thr Thr Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Tyr Ile Gly Tyr Val Asp Met Gly Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Phe Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Pro Asp Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Asn Trp Gly Val Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser Ala Glu Thr Thr Ala Pro Ser Val 130 135 140 Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Thr Ala Leu Lys Ser Asn Xaa 145 150 155 <210> 18 <211> 449 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Nucleotide Sequence coding Human Light Chain Secretory Signal and Human Kappa Constant Region <400> 18 gcctccggac tctagagcca ccatggtgct gcagacccag gtgttcatct ccctgctgct 60 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tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcagggcaac 1020 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacaccca gaagagcctc 1080 tccctgtctc ccggcaaatg agatatcggg cccgtttaaa cgggggaggc ta 1132 <210> 22 <211> 705 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Nucleotide Sequence coding cR118_L <400> 22 atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcgtacggc 60 gacatccagt tgacccagtc tccatccaca ttgcctgcat ccctgggaga gagagtcacc 120 atcagttgca gagcaagtca gagtattagc aatagtttaa gctggtttca acagaaacca 180 gatggaactg ttaaacgcct gatctattct acatccactt tagaatctgg tgtcccatca 240 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagat tattctctct ccatcaccag tcttgagtct 300 gaagattttg caatgtatta ctgtctacag tttgctactt ttccggacac gtttggaact 360 gggaccaaac tggaactgag acgggctgtg gccgccccct ccgtgttcat cttccccccc 420 tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtggtgt gcctgctgaa taacttctac 480 cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg gaactcccag 540 gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 600 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gccctgacca gcggcgtgca caccttcccc gctgtcctgc agtcctcagg actctactcc 600 ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 660 gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag ttgagcccaa atcttgtgac 720 aaaactcaca catgcccacc ctgcccagca cctgaagccg cggggggacc ctcagtcttc 780 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 840 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 900 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccc cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgg 960 gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 1020 aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggc 1080 cagccccggg aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 1140 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1200 gagagcaatg gccagcccga gaacaactac aagaccaccc ctcccgtgct ggactccgac 1260 ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcagggcaac 1320 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacaccca gaagagcctc 1380 tccctgtctc ccggcaaatg a 1401 <210> 70 <211> 466 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino Acid Sequence of hR198_HG1-LALA <400> 70 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Val 35 40 45 Thr Ala Tyr Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Tyr Val Gly Tyr Ile Asp Met Gly Asn Gly Arg Thr Asp Tyr Asn 65 70 75 80 Ala Arg Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Asn Trp Gly Ala Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 130 135 140 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 145 150 155 160 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 165 170 175 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 180 185 190 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 195 200 205 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 210 215 220 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 225 230 235 240 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly 245 250 255 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 260 265 270 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 275 280 285 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 290 295 300 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 305 310 315 320 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 325 330 335 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 340 345 350 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 355 360 365 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 370 375 380 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 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cttgtcctgc ccctcctgtg gccggacctt ccgtgttcct tttccctcct 480 aagcctaagg acaccctgat gatcagccgt acccctgagg tgacctgtgt ggtggtggac 540 gtgtcccacg aggaccctga ggtgcagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcac 600 aacgccaaga ccaagcctcg tgaggagcaa ttcaacagca ccttccgtgt ggtgtccgtg 660 cttaccgtgg tgcaccaaga ctggctgaac ggcaaggagt acaagtgtaa ggtgagcaac 720 aagggacttc ctgcccctat cgagaagacc atctccaaga ccaagggcca acctcgtgag 780 cctcaagtgt acacccttcc tcctagccgt gaggagatga ccaagaacca agtgtccctt 840 acctgtctgg tgaagggctt ctaccctagc gacatcgccg tggagtggga gtccaacgga 900 caacctgaga acaactacaa gaccacccct cctatgcttg acagcgacgg ctccttcttc 960 ctgtacagca agctgaccgt ggacaagtcc cgttggcaac aaggcaacgt gttcagctgt 1020 tccgtgatgc acgaggccct gcacaaccac tacacccaaa agagcctttc cctgagccct 1080 ggaaagtgat atcgggcccg tttaaacggg ggaggcta 1118 <210> 72 <211> 1395 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Nucleotide Sequence coding Heavy Chain of 2C1.1 <400> 72 atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagccag 60 gtgcagctgc agcagtgggg agccggcctg ctgaagccca gcgagacact gagcctgacc 120 tgcgctgtgt acggaggcag cttcagcggc tactactggt cctggatccg gcagccccct 180 ggcaagggcc tggaatggat cggcgagatc gaccacagcg gcagcaccaa ctacaacccc 240 gccctgaagt cccggctgac catcagcgtg gacaccagca agaaccagtt cagcctgaag 300 ctgagcagcg tgacagccgc cgacaccgcc gtgtactact gtgccagagc cggcagcggc 360 ggctacgagg attggttcga tccttggggc cagggcaccc tggtgaccgt cagctcagcc 420 agcaccaagg gcccttccgt gttccctctg gccccttgta gccgttccac cagcgagtcc 480 accgccgccc ttggctgtct ggtgaaggac tacttccctg agcctgtgac cgtgagctgg 540 aactccggag cccttaccag cggcgtgcac accttccctg ccgtgctgca gtccagcggc 600 ctttactccc tgagctccgt ggtgaccgtg cctagctcca acttcggcac ccaaacctac 660 acctgtaacg tggaccacaa gcctagcaac accaaggtgg acaagaccgt ggagcgtaag 720 tgttgtgtgg agtgtcctcc ttgtcctgcc cctcctgtgg ccggaccttc cgtgttcctt 780 ttccctccta agcctaagga caccctgatg atcagccgta cccctgaggt gacctgtgtg 840 gtggtggacg tgtcccacga ggaccctgag gtgcagttca actggtacgt ggacggcgtg 900 gaggtgcaca acgccaagac caagcctcgt gaggagcaat tcaacagcac cttccgtgtg 960 gtgtccgtgc ttaccgtggt gcaccaagac tggctgaacg gcaaggagta caagtgtaag 1020 gtgagcaaca agggacttcc tgcccctatc gagaagacca tctccaagac caagggccaa 1080 cctcgtgagc ctcaagtgta cacccttcct cctagccgtg aggagatgac caagaaccaa 1140 gtgtccctta cctgtctggt gaagggcttc taccctagcg acatcgccgt ggagtgggag 1200 tccaacggac aacctgagaa caactacaag accacccctc ctatgcttga cagcgacggc 1260 tccttcttcc tgtacagcaa gctgaccgtg gacaagtccc gttggcaaca aggcaacgtg 1320 ttcagctgtt ccgtgatgca cgaggccctg cacaaccact acacccaaaa gagcctttcc 1380 ctgagccctg gaaag 1395 <210> 73 <211> 465 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino Acid Sequence of Heavy Chain of 2C1.1 <400> 73 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys 20 25 30 Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe 35 40 45 Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly 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Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 275 280 285 Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 290 295 300 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val 305 310 315 320 Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 325 330 335 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 340 345 350 Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 355 360 365 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 370 375 380 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 385 390 395 400 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu 405 410 415 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 420 425 430 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 435 440 445 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 450 455 460 Lys 465 <210> 74 <211> 739 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Nucleotide Sequence coding Light Chain of 2C1.1 <400> 74 atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcgtacggc 60 cagtccgtgc tgacccagcc tccttccgtg tctggcgccc ctggccagag agtgaccatc 120 agctgtaccg gcagcagcag caacatcgga gccggctaca acgtgcactg gtatcagcag 180 ttcccccgga ccgaccccaa gctgctgatc tacgtgtaca acatccggcc cagcggcgtg 240 cccgaccggt tttctggcag cagaagcggc acaagcgcca gcctggccat caccggcctg 300 cagaccgagg acgaggccga ctactactgc cagagctacg acagcagcct gagcggcgtg 360 gtgttcggcg gaggcaccaa gctgacagtg ctgggccagc ccaaggccaa ccccaccgtg 420 accctgttcc ccccaagcag cgaggaactg caggccaaca aggccaccct ggtgtgcctg 480 atcagcgact tctaccctgg cgccgtgaca gtggcctgga aggccgatgg atctcccgtg 540 aaggccggcg tggaaaccac caagcccagc aagcagagca acaacaaata cgccgccagc 600 agctacctga gcctgacccc cgagcagtgg aagtcccacc ggtcctacag ctgccaggtg 660 acacacgagg gcagcaccgt ggaaaagacc gtggccccca ccgagtgcag ctaggggccc 720 gtttaaacgg gggaggcta 739 <210> 75 <211> 237 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino Acid Sequence of Light Chain of 2C1.1 <400> 75 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly 20 25 30 Ala Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn 35 40 45 Ile Gly Ala Gly Tyr Asn Val His Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Arg Thr 50 55 60 Asp Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Val Tyr Asn Ile Arg Pro Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala 85 90 95 Ile Thr Gly Leu Gln Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser 100 105 110 Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro 130 135 140 Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu 145 150 155 160 Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp 165 170 175 Gly Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln 180 185 190 Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu 195 200 205 Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly 210 215 220 Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 225 230 235 <210> 76 <211> 1395 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Nucleotide Sequence coding Heavy Chain of 5H3.1 <400> 76 atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagccag 60 gtgcagctgg tgcagtctgg cgccgaagtg aagaaacctg gcgctagcgt gaaggtgtcc 120 tgcaaggcca gcggctacac cttcaccgac tactacatga actgggtgcg ccaggctcca 180 ggacagggcc tggaatggat gggctggatc aaccccaaca gcggcggcac caaatacgcc 240 cagaaattcc agggcagagt gaccatgacc cgggacacca gcatccggac cgcctacatg 300 gaactgagcc ggctgagaag cgacgacacc gccgtgtact actgcgccag agagtacggc 360 ggcaacagcg attggttcga cccctggggc cagggcaccc tggtgaccgt cagctcagcc 420 agcaccaagg gcccttccgt gttccctctg gccccttgta gccgttccac cagcgagtcc 480 accgccgccc ttggctgtct ggtgaaggac tacttccctg agcctgtgac cgtgagctgg 540 aactccggag cccttaccag cggcgtgcac accttccctg ccgtgctgca gtccagcggc 600 ctttactccc tgagctccgt ggtgaccgtg cctagctcca acttcggcac ccaaacctac 660 acctgtaacg tggaccacaa gcctagcaac accaaggtgg acaagaccgt ggagcgtaag 720 tgttgtgtgg agtgtcctcc ttgtcctgcc cctcctgtgg ccggaccttc cgtgttcctt 780 ttccctccta agcctaagga caccctgatg atcagccgta cccctgaggt gacctgtgtg 840 gtggtggacg tgtcccacga ggaccctgag gtgcagttca actggtacgt ggacggcgtg 900 gaggtgcaca acgccaagac caagcctcgt gaggagcaat tcaacagcac cttccgtgtg 960 gtgtccgtgc ttaccgtggt gcaccaagac tggctgaacg gcaaggagta caagtgtaag 1020 gtgagcaaca agggacttcc tgcccctatc gagaagacca tctccaagac caagggccaa 1080 cctcgtgagc ctcaagtgta cacccttcct cctagccgtg aggagatgac caagaaccaa 1140 gtgtccctta cctgtctggt gaagggcttc taccctagcg acatcgccgt ggagtgggag 1200 tccaacggac aacctgagaa caactacaag accacccctc ctatgcttga cagcgacggc 1260 tccttcttcc tgtacagcaa gctgaccgtg gacaagtccc gttggcaaca aggcaacgtg 1320 ttcagctgtt ccgtgatgca cgaggccctg cacaaccact acacccaaaa gagcctttcc 1380 ctgagccctg gaaag 1395 <210> 77 <211> 465 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino Acid Sequence of Heavy Chain of 5H3.1 <400> 77 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Lys Tyr Ala 65 70 75 80 Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Arg 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Tyr Gly Gly Asn Ser Asp Trp Phe Asp Pro 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser 145 150 155 160 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 165 170 175 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 180 185 190 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 195 200 205 Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln 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atacgccgcc 600 agcagctacc tgagcctgac ccccgagcag tggaagtccc accggtccta cagctgccag 660 gtgacacacg agggcagcac cgtggaaaag accgtggccc ccaccgagtg cagctagggg 720 cccgtttaaa cgggggaggc ta 742 <210> 79 <211> 238 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino Acid Sequence of Light Chain of 5H3.1 <400> 79 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly 20 25 30 Ala Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn 35 40 45 Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr 50 55 60 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala 85 90 95 Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser 100 105 110 Tyr Asp Asn Arg Leu Ser Asp Ser Val Val Ile Gly Gly Gly Thr Lys 115 120 125 Leu Ala Val Gln Gly Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe 130 135 140 Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala 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PRT <213> artificial <220> <223> Amino Acid Sequence of Heavy Chain of 17F6 <400> 89 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg 20 25 30 Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly His Ile Tyr Pro Gly Asp Ala Asp Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Phe Cys Ser Arg Gln Leu Gly Phe Arg Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 115 120 125 Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro 130 135 140 Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met 145 150 155 160 Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 165 170 175 Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro 180 185 190 Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val 195 200 205 Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His 210 215 220 Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys 225 230 235 240 Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe 245 250 255 Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro 260 265 270 Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val 275 280 285 Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr 290 295 300 Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu 305 310 315 320 Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys 325 330 335 Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 340 345 350 Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro 355 360 365 Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile 370 375 380 Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly 385 390 395 400 Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp 405 410 415 Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp 420 425 430 Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His 435 440 445 Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 90 <211> 767 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Nucleotide Sequence coding Light Chain of 17F6 <400> 90 ccagcctccg gactctagag ccaccatggt gctgcagacc caggtgttca tcagcctgct 60 gctgtggatc agcggcgcct acggcgacat cgtgatgagc cagagcccta gcagcctggc 120 cgtgtctgcc ggcgagaaag tgaccatgag ctgcaagagc agccagtccc tgctgaacag 180 ccggacccgg aagaactacc tggcctggta tcagcagaag cccggccagt cccccaagct 240 gctgatctac tgggccagca ccagagaaag cggcgtgccc gatagattca ccggcagcgg 300 ctctggcacc gacttcaccc tgacaatcag cagcgtgcag gccgaggacc tggctgtgta 360 ctactgcaag cagagctaca acctgcggac cttcggcgga ggcaccaagc tggaaatcaa 420 gagagccgac gccgctccca ccgtgtccat ctttccacct agcagcgagc agctgaccag 480 cggcggagct agcgtcgtgt gcttcctgaa caacttctac cccaaggaca tcaacgtgaa 540 gtggaagatc gacggcagcg agcggcagaa cggcgtgctg aatagctgga ccgaccagga 600 cagcaaggac tccacctaca gcatgtccag caccctgacc ctgaccaagg acgagtacga 660 gcggcacaac agctacacat gcgaggccac ccacaagacc agcacctccc ccatcgtgaa 720 gtccttcaac cggaacgagt gctgagttta aacgggggag gctaact 767 <210> 91 <211> 239 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino Acid Sequence of Light Chain of 17F6 <400> 91 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala 20 25 30 Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 50 55 60 Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 65 70 75 80 Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 115 120 125 Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro 130 135 140 Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe 145 150 155 160 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp 165 170 175 Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp 180 185 190 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys 195 200 205 Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys 210 215 220 Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 225 230 235 <210> 92 <211> 11 <212> PRT <213> Rattus rattus <400> 92 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asn Ser Leu Ser 1 5 10 <210> 93 <211> 11 <212> PRT <213> artificial <220> <223> CDRL1 of hR198_LG1 <400> 93 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Gly Ser Leu Ser 1 5 10 <210> 94 <211> 11 <212> PRT <213> artificial <220> <223> CDRL1 of hR198_LG2 <400> 94 His Ala Ser Gln Asn Ile Gly Gly Ser Leu Ser 1 5 10 <210> 95 <211> 11 <212> PRT <213> artificial <220> <223> CDRL1 of hR198_LG3 <400> 95 His Ala Ser Arg Asn Ile Gly Gly Ser Leu Ser 1 5 10 <210> 96 <211> 7 <212> PRT <213> Rattus rattus <400> 96 Ser Thr Ser Thr Leu Glu Ser 1 5 <210> 97 <211> 7 <212> PRT <213> artificial <220> <223> CDRL2 of hR198_LG2 <400> 97 Leu Thr Ser Thr Leu Asp Trp 1 5 <210> 98 <211> 7 <212> PRT <213> artificial <220> <223> CDRL2 of hR198_LG3 <400> 98 Leu Thr Ser Ser Leu Asp Trp 1 5 <210> 99 <211> 9 <212> PRT <213> Rattus rattus <400> 99 Leu Gln Phe Ala Thr Phe Pro Asp Thr 1 5 <210> 100 <211> 9 <212> PRT <213> Rattus rattus <400> 100 Leu Gln Phe Ala Thr Tyr Pro Asp Thr 1 5 <210> 101 <211> 9 <212> PRT <213> artificial <220> <223> CDRL3 of hR198_LG1 to LG3 <400> 101 Leu Gln Phe Ala Ile Phe Pro Asp Ser 1 5 <210> 102 <211> 5 <212> PRT <213> Rattus rattus <400> 102 Ala Tyr Tyr Ile Ser 1 5 <210> 103 <211> 5 <212> PRT <213> Rattus rattus <400> 103 Ser Tyr Tyr Ile Ser 1 5 <210> 104 <211> 17 <212> PRT <213> Rattus rattus <400> 104 Tyr Ile Asp Met Gly Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Ala Arg Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 105 <211> 17 <212> PRT <213> Rattus rattus <400> 105 Tyr Val Asp Met Gly Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 106 <211> 17 <212> PRT <213> artificial <220> <223> CDRH2 of hR198_HG1 <400> 106 Tyr Ile Asp Met Gly Asn Gly Arg Thr Asp Tyr Asn Ala Arg Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 107 <211> 17 <212> PRT <213> artificial <220> <223> CDRH2 of hR198_HG2 <400> 107 Tyr Ile Asp Met Gly Asn Gly Arg Thr Asp Tyr Asn Gly Arg Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 108 <211> 17 <212> PRT <213> artificial <220> <223> CDRH2 of hR198_HG3 <400> 108 Tyr Ile Asp Met Gly Asn Gly Arg Thr Asp Tyr Asn Met Arg Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 109 <211> 8 <212> PRT <213> Rattus rattus <400> 109 Asp Ser Asn Trp Gly Val Asp Tyr 1 5 <210> 110 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <223> CDRH3 of hR198_HG1 to HG3 <400> 110 Asp Ser Asn Trp Gly Ala Asp Tyr 1 5 <210> 111 <211> 1401 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Nucleotide Sequence coding hR198_H0 <400> 111 atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagccag 60 gtgcagctgg tgcagtctgg cgccgaagtg aagaaaccag gcgccagcgt gaaggtgtcc 120 tgcaaggcct ctggctaccc cgtgaccagc tactacatca gctggatcag acaggcccca 180 ggccagggcc tggaatggat cggctatgtg gacatgggca acggccggac caactacaac 240 gagaagttca agggcagagc caccctgacc gtggacaaga gcaccagcac cgcctacatg 300 gaactgagca gcctgcggag cgaggacacc gccgtgtact actgcgccag agacagcaac 360 tggggcgtgg actattgggg ccagggcaca ctcgtgaccg tcagctcagc ctccaccaag 420 ggcccaagcg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggcgg cacagccgcc 480 ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaacccgtga ccgtgagctg gaactcaggc 540 gccctgacca gcggcgtgca caccttcccc gctgtcctgc agtcctcagg actctactcc 600 ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 660 gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag ttgagcccaa atcttgtgac 720 aaaactcaca catgcccacc ctgcccagca cctgaactcc tggggggacc ctcagtcttc 780 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 840 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 900 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccc cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgg 960 gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 1020 aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggc 1080 cagccccggg aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 1140 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1200 gagagcaatg gccagcccga gaacaactac aagaccaccc ctcccgtgct ggactccgac 1260 ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcagggcaac 1320 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacaccca gaagagcctc 1380 tccctgtctc ccggcaaatg a 1401 <210> 112 <211> 466 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino Acid Sequence of hR198_H0 <400> 112 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Val 35 40 45 Thr Ser Tyr Tyr Ile Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Tyr Val Asp Met Gly Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Glu Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Asn Trp Gly Val Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 130 135 140 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 145 150 155 160 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 165 170 175 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 180 185 190 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 195 200 205 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 210 215 220 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 225 230 235 240 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 245 250 255 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 260 265 270 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 275 280 285 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 290 295 300 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 305 310 315 320 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 325 330 335 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 340 345 350 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 355 360 365 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 370 375 380 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 385 390 395 400 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 405 410 415 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 420 425 430 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 435 440 445 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 450 455 460 Gly Lys 465 <210> 113 <211> 1401 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Nucleotide Sequence coding hR198_H5 <400> 113 atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagccag 60 gtgcagctgg tgcagtctgg cgccgaagtg aagaaaccag gcgccagcgt gaaggtgtcc 120 tgcaaggcct ctggctaccc cgtgaccgcc tactacatca gctggatcag acaggcccca 180 ggccagggcc tggaatggat cggctacatc gacatgggca acggccggac caactacaac 240 gcccggttta agggcagagc caccctgacc gtggacaaga gcaccagcac cgcctacatg 300 gaactgagca gcctgcggag cgaggacacc gccgtgtact actgcgccag agacagcaac 360 tggggcgtgg actattgggg ccagggcaca ctcgtgaccg tcagctcagc ctccaccaag 420 ggcccaagcg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggcgg cacagccgcc 480 ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaacccgtga ccgtgagctg gaactcaggc 540 gccctgacca gcggcgtgca caccttcccc gctgtcctgc agtcctcagg actctactcc 600 ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 660 gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag ttgagcccaa atcttgtgac 720 aaaactcaca catgcccacc ctgcccagca cctgaactcc tggggggacc ctcagtcttc 780 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 840 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 900 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccc cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgg 960 gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 1020 aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggc 1080 cagccccggg aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 1140 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1200 gagagcaatg gccagcccga gaacaactac aagaccaccc ctcccgtgct ggactccgac 1260 ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcagggcaac 1320 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacaccca gaagagcctc 1380 tccctgtctc ccggcaaatg a 1401 <210> 114 <211> 466 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino Acid Sequence of hR198_H5 <400> 114 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Val 35 40 45 Thr Ala Tyr Tyr Ile Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asp Met Gly Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Ala Arg Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Asn Trp Gly Val Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 130 135 140 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 145 150 155 160 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 165 170 175 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 180 185 190 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 195 200 205 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 210 215 220 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 225 230 235 240 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 245 250 255 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 260 265 270 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 275 280 285 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 290 295 300 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 305 310 315 320 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 325 330 335 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 340 345 350 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 355 360 365 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 370 375 380 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 385 390 395 400 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 405 410 415 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 420 425 430 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 435 440 445 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 450 455 460 Gly Lys 465 <210> 115 <211> 48 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 115 Ser Gly Ser Gly Phe Leu Pro Leu Lys Lys Gln Pro Gly Gln Pro Arg 1 5 10 15 Pro Thr Ser Lys Pro Pro Ala Ser Gly Ala Ala Ala Asn Val Ser Thr 20 25 30 Ser Gly Ile Thr Pro Gly Gln Ala Ala Ala Ile Ala Ser Thr Thr Ile 35 40 45 <210> 116 <211> 11 <212> PRT <213> Rattus rattus <400> 116 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Ser Leu Ser 1 5 10

Claims (38)

  1. 배열 번호 2 에 기재된 아미노산 배열에 특이적으로 결합하고, 중사슬 배열이, CDRH1, CDRH2, CDRH3 을 갖는 가변 영역을 포함하고, 상기 CDRH1 은 배열 번호 102 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRH2 는 배열 번호 104, 106, 107 또는 108 중 어느 1 개에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRH3 은, 배열 번호 109 또는 110 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것 ; 및
    경사슬 배열이 CDRL1, CDRL2, CDRL3 을 갖는 가변 영역을 포함하고, 상기 CDRL1 은 배열 번호 93, 94 또는 95 중 어느 1 개에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRL2 는 배열 번호 96, 97 또는 98 의 어느 1 개에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRL3 은, 배열 번호 101 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것 ;
    을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
  2. 제 1 항에 있어서,
    중사슬 배열이, CDRH1, CDRH2, CDRH3 을 갖는 가변 영역을 포함하고, 상기 CDRH1 은 배열 번호 102 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRH2 는 배열 번호 106 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRH3 은, 배열 번호 110 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것 ; 및
    경사슬 배열이 CDRL1, CDRL2, CDRL3 을 갖는 가변 영역을 포함하고, 상기 CDRL1 은 배열 번호 93 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRL2 는 배열 번호 96 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRL3 은, 배열 번호 101 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것 ;
    을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
  3. 제 1 항에 있어서,
    중사슬 배열이, CDRH1, CDRH2, CDRH3 을 갖는 가변 영역을 포함하고, 상기 CDRH1 은 배열 번호 102 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRH2 는 배열 번호 106 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRH3 은, 배열 번호 110 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것 ; 및
    경사슬 배열이 CDRL1, CDRL2, CDRL3 을 갖는 가변 영역을 포함하고, 상기 CDRL1 은 배열 번호 94 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRL2 는 배열 번호 97 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRL3 은, 배열 번호 101 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것 ;
    을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
  4. 제 1 항에 있어서,
    중사슬 배열이, CDRH1, CDRH2, CDRH3 을 갖는 가변 영역을 포함하고, 상기 CDRH1 은 배열 번호 102 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRH2 는 배열 번호 106 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRH3 은, 배열 번호 110 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것 ; 및
    경사슬 배열이 CDRL1, CDRL2, CDRL3 을 갖는 가변 영역을 포함하고, 상기 CDRL1 은 배열 번호 95 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRL2 는 배열 번호 98 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRL3 은, 배열 번호 101 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것 ;
    을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
  5. 제 1 항에 있어서,
    중사슬 배열이, CDRH1, CDRH2, CDRH3 을 갖는 가변 영역을 포함하고, 상기 CDRH1 은 배열 번호 102 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRH2 는 배열 번호 107 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRH3 은, 배열 번호 110 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것 ; 및
    경사슬 배열이 CDRL1, CDRL2, CDRL3 을 갖는 가변 영역을 포함하고, 상기 CDRL1 은 배열 번호 93 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRL2 는 배열 번호 96 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRL3 은, 배열 번호 101 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것 ;
    을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
  6. 제 1 항에 있어서,
    중사슬 배열이, CDRH1, CDRH2, CDRH3 을 갖는 가변 영역을 포함하고, 상기 CDRH1 은 배열 번호 102 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRH2 는 배열 번호 108 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRH3 은, 배열 번호 110 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것 ; 및
    경사슬 배열이 CDRL1, CDRL2, CDRL3 을 갖는 가변 영역을 포함하고, 상기 CDRL1 은 배열 번호 93 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRL2 는 배열 번호 96 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRL3 은, 배열 번호 101 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것 ;
    을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
  7. 제 1 항에 있어서,
    중사슬 배열이, CDRH1, CDRH2, CDRH3 을 갖는 가변 영역을 포함하고, 상기 CDRH1 은 배열 번호 102 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRH2 는 배열 번호 104 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRH3 은, 배열 번호 109 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것 ; 및
    경사슬 배열이 CDRL1, CDRL2, CDRL3 을 갖는 가변 영역을 포함하고, 상기 CDRL1 은 배열 번호 93 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRL2 는 배열 번호 96 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRL3 은, 배열 번호 101 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것 ;
    을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
  8. 제 1 항에 있어서,
    배열 번호 62 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 136 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역 배열 및 배열 번호 56 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 126 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 가변 영역 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
  9. 제 8 항에 있어서,
    배열 번호 62 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 465 번째 또는 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 배열 및 배열 번호 56 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 배열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
  10. 제 8 항에 있어서,
    배열 번호 70 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 465 번째 또는 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 배열 및 배열 번호 56 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 배열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
  11. 제 1 항에 있어서,
    배열 번호 62 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 136 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역 배열 및 배열 번호 58 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 126 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 가변 영역 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
  12. 제 11 항에 있어서,
    배열 번호 62 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 465 번째 또는 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 배열 및 배열 번호 58 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 배열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
  13. 제 1 항에 있어서,
    배열 번호 62 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 136 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역 배열 및 배열 번호 60 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 126 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 가변 영역 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
  14. 제 13 항에 있어서,
    배열 번호 62 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 465 번째 또는 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 배열 및 배열 번호 60 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 배열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
  15. 제 1 항에 있어서,
    배열 번호 64 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 136 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역 배열 및 배열 번호 56 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 126 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 가변 영역 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
  16. 제 15 항에 있어서,
    배열 번호 64 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 465 번째 또는 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 배열 및 배열 번호 56 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 배열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
  17. 제 1 항에 있어서,
    배열 번호 66 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 136 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역 배열 및 배열 번호 56 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 126 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 가변 영역 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
  18. 제 17 항에 있어서,
    배열 번호 66 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 465 번째 또는 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 배열 및 배열 번호 56 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 배열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
  19. 제 1 항에 있어서,
    배열 번호 43 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 136 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역 배열 및 배열 번호 56 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 126 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 가변 영역 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
  20. 제 19 항에 있어서,
    배열 번호 43 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 465 번째 또는 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 배열 및 배열 번호 56 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 235 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 배열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
  21. 제 1 항에 있어서,
    항원 결합성 단편이 Fab, F(ab')2, Fab' 및 Fv 로 이루어지는 군에서 선택되는, 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
  22. 제 1 항에 있어서,
    항체가 scFv 인 것을 특징으로 하는, 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
  23. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편의 적어도 어느 1 개를 함유하는 것을 특징으로 하는 의약 조성물로서,
    관절 류머티즘, 강직성 척추염, 전신성 에리테마토수스, 강피증, 다발 근염, 피부 근염, 재생 불량성 빈혈, 특발성 혈소판 감소성 자반병, 크론병, 궤양성 대장염, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 포도막염, 베체트병, 베게너 육아종증, 건선, 천포창, 백반, 1 형 당뇨병, 자기 면역 갑상선염, 바세도우병, 하시모토병, 매스트 세포 백혈병, 매스트 세포증, 호염기성 백혈병, 자궁 내막증, 스토르모르켄증, 소관 집합성 마이오패티, 아토피성 피부염, 이식물의 거절, 알레르기성 질환, 염증성 질환 또는 암의 치료 및/또는 예방제, 또는 항혈소판 또는 항혈전 활성제인, 의약 조성물.
  24. 삭제
  25. 제 23 항에 있어서,
    이식물의 거절이, 심장, 신장, 간장, 골수, 피부, 장기 또는 조직의 이식에 대한 거절 반응 또는 숙주 대 이식편 반응이거나, 또는 조혈 세포, 골수, 말초혈 또는 제대혈의 이식에 의해 발생하는 이식편 대 숙주병인 것을 특징으로 하는, 의약 조성물.
  26. 제 23 항에 있어서,
    알레르기성 질환이 아토피성 피부염, 천식, 아나필락시스, 아나필락시스 유사 반응, 음식 알레르기, 비염, 중이염, 약물 반응, 곤충 자상 반응, 식물 반응, 라텍스 알레르기, 결막염 또는 두드러기이고, 염증성 질환이 염증성 신장 질환, 사구체신장염, 네프로제, 염증성 폐질환, 만성 폐색성 폐질환, 낭포성 섬유증, 간질성 폐렴, 염증성 장질환, 궤양성 대장염, 회장염, 염증성 간질환, 자기 면역 간염, 바이러스 간염, 염증성 심 질환, 심근염, 허혈성 심질환, 아테롬성 동맥 경화증, 염증성 피부 질환, 접촉성 피부염, 습진, 염증성 안질환, 트라코마, 안내염, 염증성 중추 신경 질환, 수막염, 뇌척수염, 자기 면역 뇌염, 관절의 염증성 질환, 관절염, 골관절염, 전신성 염증, 패혈증, 출혈, 과민증 또는 암 화학 요법에서 기인하는 쇼크 증상인 것을 특징으로 하는, 의약 조성물.
  27. 제 23 항에 있어서,
    암이 유방암, 폐암, 피부암 또는 백혈병이고, 항혈소판 또는 항혈전 활성이 치료 및/또는 예방에 도움이 되는 질환이 심근경색, 뇌졸중, 허혈성 심질환 또는 혈전증인 것을 특징으로 하는, 의약 조성물.
  28. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
  29. 제 28 항에 기재된 어느 1 개의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  30. 제 28 항에 기재된 어느 1 개의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 분리된 형질 전환 숙주 세포.
  31. 제 29 항에 기재된 벡터를 포함하는, 분리된 형질 전환 숙주 세포.
  32. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질 전환 숙주 세포를 배양하고, 배양 산물로부터 항체를 정제하는 공정을 포함하는 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편의 생산 방법.
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 삭제
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190035863A (ko) 2016-08-05 2019-04-03 알라코스 인크. 암 치료를 위한 항Siglec-7 항체
JP7342005B2 (ja) 2018-01-11 2023-09-11 アラコス，インコーポレイティド エフェクター機能が減少した抗ｓｉｇｌｅｃ－７抗体
CN108562748A (zh) * 2018-03-28 2018-09-21 深圳承启生物科技有限公司 Orai1蛋白和/或STIM1蛋白作为脑卒中生物标志物的用途
DE102019106711A1 (de) 2019-03-15 2020-09-17 Grob-Werke Gmbh & Co. Kg Verfahren und Vorrichtung zum mehrlagigen Einfügen einer Spulenmatte in ein Bauteil einer elektrischen Maschine
CN111273015B (zh) * 2020-04-13 2023-04-11 北京维德维康生物技术有限公司 一种检测短裸甲藻毒素的酶联免疫试剂盒及其制备和应用
WO2023049867A1 (en) * 2021-09-24 2023-03-30 Seeker Biologics, Inc. Orai1 multispecific antibodies and methods of use

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011063277A1 (en) * 2009-11-20 2011-05-26 Amgen Inc. Anti-orai1 antigen binding proteins and uses thereof

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2368912B1 (en) 2006-01-05 2017-05-03 Children's Medical Center Corporation Regulators of NFAT
WO2007121186A2 (en) * 2006-04-10 2007-10-25 The Queen's Medical Center Crac modulators and use of same for drug discovery
EP1854810A1 (en) 2006-05-09 2007-11-14 PanGenetics B.V. Deimmunized antagonistic anti-human CD40 monoclonal antibody from the ch5D12 antibody
GB0801888D0 (en) * 2008-02-01 2008-03-12 Isis Innovation Treatment of mast cell related disorders
WO2013091903A1 (en) 2011-12-22 2013-06-27 Novo Nordisk A/S Anti-crac channel antibodies

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011063277A1 (en) * 2009-11-20 2011-05-26 Amgen Inc. Anti-orai1 antigen binding proteins and uses thereof

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