TWI671316B - 抗ｏｒａｉ1抗體及其生產方法 - Google Patents

抗ｏｒａｉ1抗體及其生產方法 Download PDF

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Abstract

提供以人類Orai1為標的之移植物之排斥、免疫疾病、過敏性疾病、炎症性疾病、血栓、癌症等之治療及/或預防劑。
含具有特異性地辨識人類Orai1、抑制人類T細胞活性化的活性的抗體之醫藥組成物之提供等。

Description

抗ORAI1抗體及其生產方法
本發明係關於用以治療失調及疾病之更強活性之抗Orai1抗體的取得。
鈣釋放活性化鈣(CRAC)通道係對細胞內內質網中之鈣儲存之枯竭反應而打開的儲存感受性通道(store-operated Ca2+channels，SOC)的亞群(subset)，於特定之非興奮性細胞，尤其是於包含T細胞或肥大細胞的免疫系統之細胞，負責細胞外鈣的流入與伴隨其之細胞的活性化。CRAC通道活性之抑制劑為本項技術領域周知，彼等之鑑定及治療可能性已被Feske等人記載(非專利文獻1-2)。
Orai1(CRACM1：鈣釋放-活性化鈣調節器1，跨膜蛋白142A：TMEM142A)係包含301個胺基酸殘基的4次跨膜型蛋白質，被特定為藉由形成均4聚體，而構成CRAC通道之孔次單元的成分(專利文獻1、非專利文獻3-5)。人類Orai1基因係與具有90%以上同源性的人類Orai2及人類Orai3一起構成Orai基因家族(非專利文獻6)，亦報告有於一部分情形，形成含有Orai2及/或Orai3蛋白及Orai1的雜4聚體或6聚體的可能性(非專利文獻7-8) 。Orai1係由下列所構成：與感知細胞內內質網中之鈣儲存枯竭的蛋白質之STIM-1(基質交互作用分子1(Stromal interaction molecule 1)或STIM-2共軛的N末端及C末端之細胞質內區域、4處跨細胞膜功能域、及包含約20個胺基酸殘基的第1細胞外環(loop)功能域與包含約40個胺基酸殘基的第2細胞外環功能域(非專利文獻9)。Orai1之DNA序列及胺基酸序列已被公開於公共的資料庫上，可藉由例如NM_032790、NP_116179(NCBI)等之登錄號而參考。
由於人類Orai1基因之先天的機能缺損，CRAC通道活性喪失，活體對免疫原的反應會消失，而呈現陷入重度免疫不全狀態，故Orai1之分子機能被特定為於CRAC通道之活性化所必須者(非專利文獻10-11)。因此將Orai1分子作為標的的機能抑制抗體可成為CRAC通道活性之抑制劑。
由暗示CRAC通道活性之抑制劑可使用於治療免疫疾病、過敏性疾病、炎症性疾病、細胞或臟器之移植、血栓、癌症等的患者的情報(非專利文獻12)，已嘗試以Orai1之分子機能抑制為目標的抗Orai1抗體之取得，並檢討其效果(非專利文獻2-3、專利文獻13-14)。此等顯示單獨以抗體雖抑制T細胞之活性化，但其抑制活性強度並非充足，作為以Orai1為標的之生物製劑而臨床應用的情形，於需要高的用量或頻繁投予、或者投予方法被限定等之觀點，被認為存有未充足的醫療需求。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]國際公開第WO07/081804號小冊
[專利文獻2]國際公開第WO11/063277號小冊
[專利文獻3]國際公開第WO13/091903號小冊
[非專利文獻]
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[非專利文獻3]Prakriya M, et al., Nature 443, p. 230-233(2006)
[非專利文獻4]Vig M, et al., Science 312, p.1220-1223(2006)
[非專利文獻5]Park CY, et al., Cell 136, p.876-890(2008)
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[非專利文獻10]Feske S, Nature 441, p.179-185(2006)
[非專利文獻11]McCarl CA, et al., J.Allergy Clin. Immunol. 124, p.1311-1318(2009)
[非專利文獻12]McCarl CA, et al., J.Immunol. 185, p.5845-5858(2010)
[非專利文獻13]Lin F, et al., J.Pharmacol.Exp.Ther.345, p.225-238(2013)
[非專利文獻14]Cox JH, et al., PLOS ONE 8(12), e82944(2013)
本發明之目的在於提供移植物之排斥、免疫疾病、過敏性疾病、炎症性疾病、血栓、癌症等之治療及/或預防劑。
本發明者們以探索具有移植物之排斥、免疫疾病、過敏性疾病、炎症性疾病、血栓、癌症之治療及/或預防效果的物質的目的，取得大鼠抗Orai1抗體。將獲得的大鼠抗Orai1抗體人化，再將該人化抗體之CDR、框架及可變區加以改變而完成本發明。
即，本發明包含以下之發明。
(1)一種抗體或該抗體之抗原結合性片段，其特徵為與序列識別號2記載之胺基酸序列特異性地結合，重鏈序列包含具有CDRH1、CDRH2、及CDRH3的可變區，且前 述CDRH1包含序列識別號102所示的胺基酸序列，前述CDRH2包含序列識別號104、106、107或108中任一者所示的胺基酸序列，前述CDRH3包含序列識別號109或110所示的胺基酸序列；及輕鏈序列包含具有CDRL1、CDRL2、及CDRL3的可變區，且前述CDRL1包含序列識別號93、94或95中任一者所示的胺基酸序列，前述CDRL2包含序列識別號96、97或98中任一者所示的胺基酸序列，前述CDRL3包含序列識別號101所示的胺基酸序列。
(2)如(1)記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其中重鏈序列包含具有CDRH1、CDRH2、及CDRH3的可變區，且前述CDRH1包含序列識別號102所示的胺基酸序列，前述CDRH2包含序列識別號106所示的胺基酸序列，前述CDRH3包含序列識別號110所示的胺基酸序列；及輕鏈序列包含具有CDRL1、CDRL2、及CDRL3的可變區，且前述CDRL1包含序列識別號93所示的胺基酸序列，前述CDRL2包含序列識別號96所示的胺基酸序列，前述CDRL3包含序列識別號101所示的胺基酸序列。
(3)如(1)記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其中重鏈序列包含具有CDRH1、CDRH2、及CDRH3的可變區，且前述CDRH1包含序列識別號102所示的胺基酸序列，前述CDRH2包含序列識別號106所示的胺基酸序列，前述CDRH3包含序列識別號110所示的胺基酸序列；及輕鏈序列包含具有CDRL1、CDRL2、及CDRL3的可變區，且前述CDRL1包含序列識別號94所示的胺基酸序 列，前述CDRL2包含序列識別號97所示的胺基酸序列，前述CDRL3包含序列識別號101所示的胺基酸序列。
(4)如(1)記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其中重鏈序列包含具有CDRH1、CDRH2、及CDRH3的可變區，且前述CDRH1包含序列識別號102所示的胺基酸序列，前述CDRH2包含序列識別號106所示的胺基酸序列，前述CDRH3包含序列識別號110所示的胺基酸序列；及輕鏈序列包含具有CDRL1、CDRL2、及CDRL3的可變區，且前述CDRL1包含序列識別號95所示的胺基酸序列，前述CDRL2包含序列識別號98所示的胺基酸序列，前述CDRL3包含序列識別號101所示的胺基酸序列。
(5)如(1)記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其中重鏈序列包含具有CDRH1、CDRH2、及CDRH3的可變區，且前述CDRH1包含序列識別號102所示的胺基酸序列，前述CDRH2包含序列識別號107所示的胺基酸序列，前述CDRH3包含序列識別號110所示的胺基酸序列；及輕鏈序列包含具有CDRL1、CDRL2、及CDRL3的可變區，且前述CDRL1包含序列識別號93所示的胺基酸序列，前述CDRL2包含序列識別號96所示的胺基酸序列，前述CDRL3包含序列識別號101所示的胺基酸序列。
(6)如(1)記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其中重鏈序列包含具有CDRH1、CDRH2、及CDRH3的可變區，且前述CDRH1包含序列識別號102所示的胺基酸序列，前述CDRH2包含序列識別號108所示的胺基酸序列，前述CDRH3包含序列識別號110所示的胺基酸序列；及 輕鏈序列包含具有CDRL1、CDRL2、及CDRL3的可變區，且前述CDRL1包含序列識別號93所示的胺基酸序列，前述CDRL2包含序列識別號96所示的胺基酸序列，前述CDRL3包含序列識別號101所示的胺基酸序列。
(7)如(1)記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其中重鏈序列包含具有CDRH1、CDRH2、及CDRH3的可變區，且前述CDRH1包含序列識別號102所示的胺基酸序列，前述CDRH2包含序列識別號104所示的胺基酸序列，前述CDRH3包含序列識別號109所示的胺基酸序列；及輕鏈序列包含具有CDRL1、CDRL2、及CDRL3的可變區，且前述CDRL1包含序列識別號93所示的胺基酸序列，前述CDRL2包含序列識別號96所示的胺基酸序列，前述CDRL3包含序列識別號101所示的胺基酸序列。
(8)如(1)或(2)記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含：包含序列識別號62所示的胺基酸序列之第20至136號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列及包含序列識別號56所示的胺基酸序列之第21至126號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列。
(9)如(8)記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含：包含序列識別號62所示的胺基酸序列之第20至465號或第20至466號之胺基酸殘基的重鏈序列及包含序列識別號56所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的輕鏈序列。
(10)如(8)記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含：包含序列識別號70所示的胺基酸序列之第20至 465號或第20至466號之胺基酸殘基的重鏈序列及包含序列識別號56所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的輕鏈序列。
(11)如(1)或(3)記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含：包含序列識別號62所示的胺基酸序列之第20至136號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列及包含序列識別號58所示的胺基酸序列之第21至126號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列。
(12)如(11)記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含：包含序列識別號62所示的胺基酸序列之第20至465號或第20至466號之胺基酸殘基的重鏈序列及包含序列識別號58所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的輕鏈序列。
(13)如(1)或(4)記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含：包含序列識別號62所示的胺基酸序列之第20至136號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列及包含序列識別號60所示的胺基酸序列之第21至126號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列。
(14)如(13)記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含：包含序列識別號62所示的胺基酸序列之第20至465號或第20至466號之胺基酸殘基的重鏈序列及包含序列識別號60所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的輕鏈序列。
(15)如(1)或(5)記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含：包含序列識別號64所示的胺基酸序列之 第20至136號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列及包含序列識別號56所示的胺基酸序列之第21至126號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列。
(16)如(15)記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含：包含序列識別號64所示的胺基酸序列之第20至465號或第20至466號之胺基酸殘基的重鏈序列及包含序列識別號56所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的輕鏈序列。
(17)如(1)或(6)記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含：包含序列識別號66所示的胺基酸序列之第20至136號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列及包含序列識別號56所示的胺基酸序列之第21至126號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列。
(18)如(17)記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含：包含序列識別號66所示的胺基酸序列之第20至465號或第20至466號之胺基酸殘基的重鏈序列及包含序列識別號56所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的輕鏈序列。
(19)如(1)或(7)記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含：包含序列識別號43所示的胺基酸序列之第20至136號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列及包含序列識別號56所示的胺基酸序列之第21至126號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列。
(20)如(19)記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含：包含序列識別號43所示的胺基酸序列之第20 至465號或第20至466號之胺基酸殘基的重鏈序列及包含序列識別號56所示的胺基酸序列之第21至235號之胺基酸殘基的輕鏈序列。
(21)如(1)至(20)中任一項記載之抗體之抗原結合性片段，其選自包含Fab、F(ab’)2、Fab’及Fv的群組。
(22)如(1)至(8)、(11)、(13)、(15)、(17)或(19)中任一項記載之抗體，其係scFv。
(23)一種醫藥組成物，其特徵為含有如(1)至(22)記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段之至少一者。
(24)如(23)記載之醫藥組成物，其係移植物之排斥、免疫相關疾病、過敏性疾病、炎症性疾病、癌症之治療及/或預防劑、抗血小板或抗血栓活性劑、Orai1表現細胞活性化抑制劑。
(25)如(24)記載之醫藥組成物，其中移植物之排斥係對心臟、腎臟、肝臟、骨髓、皮膚等之臟器或組織的移植的排斥反應及宿主抗移植物反應(host versus graft reaction)、及由於造血細胞(骨髓、末梢血、臍帶血等)之移植所引起的移植物抗宿主病(graft versus host disease)。
(26)如(24)記載之醫藥組成物，其中免疫相關疾病為結締組織或肌肉骨骼系統(類風濕性關節炎、僵直性脊椎炎、全身性紅斑狼瘡、硬皮症、多發性肌炎、皮肌炎等)、血液系統(再生不良性貧血、自發性血小板減少紫瘢等)、消化器官系統(克隆氏症(Crohn's disease)、潰瘍性大腸炎等)、神經系統(多發性硬化症、重症肌無力症等)、 視覺系統(葡萄膜炎等)、血管系統(貝塞氏症(Behcet's disease)、華格納氏肉芽腫病(Wegener’s granulomatosis)等)、表皮系統(乾癬、天疱瘡、白斑等)、內分泌系統(1型糖尿病、自體免疫甲狀腺炎、葛瑞夫茲氏症(Graves’ disease)、橋本氏病(Hashimoto’s disease)等)等；過敏性疾病為異位性皮膚炎、氣喘、重度過敏(anaphylaxis)、類過敏反應、食物過敏、鼻炎、中耳炎、藥物反應、昆蟲刺傷反應、植物反應、乳膠過敏(latex allergy)、結膜炎、蕁麻疹等；炎症性疾病為炎症性腎疾病(絲球體腎炎、腎病等)、炎症性肺疾病(慢性阻塞性肺病、囊性纖維變性(cystic fibrosis)、間質性肺炎等)、炎症性腸疾病(潰瘍性大腸炎、迴腸炎等)、炎症性肝疾病(自體免疫肝炎、病毒性肝炎等)、炎症性心疾病(心肌炎、缺血性心臟病、動脈粥狀硬化症(atherosclerosis)等)、炎症性皮膚疾病(接觸性皮膚炎、濕疹等)、炎症性眼疾病(砂眼、眼內炎等)、炎症性中樞神經疾病(髓膜炎、腦脊髓炎、自體免疫腦炎等)、關節之炎症性疾病(例如關節炎、骨關節炎等)、全身性炎症(敗血症、出血、過敏症、起因於癌症化學療法等的休克症狀等)等。
(27)如(24)記載之醫藥組成物，其中癌症之治療及/或預防為乳癌、肺癌、皮膚癌、白血病等；抗血小板或抗血栓活性為有用之治療及/或預防之例為心肌梗塞、腦中風、缺血性心臟病、血栓症等；Orai1表現細胞活性化抑制為有用之治療及/或預防之例為肥大細胞白血病、肥大細胞症、嗜鹼性球白血病、子宮內膜症、管狀聚集性 肌肉病變(tubular aggregate myopathy)、斯托莫肯症(Stormorken syndrome)、類風濕性關節炎、僵直性脊椎炎、異位性皮膚炎等。
(28)一種多核苷酸，其編碼如(1)至(22)中任一者記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段。
(29)一種載體，其包含如(28)記載之任一種之多核苷酸。
(30)一種轉形宿主細胞，其包含如(28)記載之任一種之多核苷酸。
(31)一種轉形宿主細胞，其包含如(29)記載之載體。
(32)一種如(1)至(22)中任一項記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段之生產方法，其包含培養如(30)或(32)記載之宿主細胞，而自培養產物純化抗體的步驟。
(33)一種抗體或該抗體之抗原結合性片段，其特徵為與序列識別號2記載之胺基酸序列特異性地結合，且抑制50%之經PMA及A23187處理的Jurkat細胞所放出的IL-2量的濃度為80ng/mL以下。
(34)如(33)記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其抑制50%之經PMA及A23187處理的Jurkat細胞所放出的IL-2量的濃度為10ng/mL以下。
(35)一種抗體或該抗體之抗原結合性片段，其特徵為與序列識別號2記載之胺基酸序列特異性地結合，且抑制50%之經PMA及A23187處理的人類末梢血液單核球(PBMC)所放出的IL-2量的濃度為100ng/mL以下。
(36)如(35)記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段 ，其抑制50%之經PMA及A23187處理的人類PBMC所放出的IL-2量的濃度為20ng/mL以下。
(37)一種抗體或該抗體之抗原結合性片段，其特徵為與序列識別號2記載之胺基酸序列特異性地結合，且抑制50%之經PMA及A23187處理的人類PBMC所放出的IFN-γ量的濃度為800ng/mL以下。
(38)如(37)記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其抑制50%之經PMA及A23187處理的人類PBMC所放出的IFN-γ量的濃度為40ng/mL以下。
依據本發明，可獲得以CRAC通道之活性抑制作為作用機制之移植物之排斥、免疫疾病、過敏性疾病、炎症性疾病、血栓、癌症之治療劑及/或預防劑。
[第1圖]
第1圖係表示R118及R198與pcDNA3.1-hOrai1導入HEK293T細胞為濃度依存性結合的圖。
[第2圖]
第2圖係表示R118及R198係添加濃度依存性抑制自經PMA及A23187處理的Jurkat細胞之IL-2的釋放的圖。
[第3圖]
第3圖係表示cR118及cR198與pcDNA3.1-hOrai1導入HEK293T細胞為濃度依存性結合的圖。
[第4圖]
第4圖係表示cR118及cR198對自經PMA及A23187處理的Jurkat細胞之IL-2的放出為添加濃度依存性抑制的圖。
[第5圖]
第5圖係表示人化抗人類Orai1抗體hR198_H1/L1、hR198_H2/L2、hR198_H3/L3、hR198_H4/L4與親代抗體(parent antibody)之cR118、cR198同樣地與pcDNA3.1-hOrai1導入HEK293T細胞為濃度依存性結合的圖。
[第6圖]
第6圖係表示人化抗人類Orai1抗體對自經PMA及A23187處理的Jurkat細胞之IL-2的放出為添加濃度依存性抑制的圖。
[第7圖]
第7圖係表示藉由核醣體展示(ribosome display)所獲得的變異導入Fab選殖株LCDR60、LCDR67、LCDR83、CE151、PE057、HCDR046、HCDR047、HEP087、HEP124及HEP237與為親代抗體Fab的hR198_H4/L4-Fab比較，與pcDNA3.1-hOrai1導入HEK293T細胞強烈地結合的圖。
[第8圖]
第8圖係表示親和性成熟(affinity maturation)抗體hR198_H3/LG1、hR198_HG1/LG1、hR198_HG1/LG2、hR198_HG1/LG3、hR198_HG2/LG1及hR198_HG3/LG1與為親代抗體的hR198_H3/L3及hR198_H4/L4比較，與pcDNA3.1-hOrai1導入HEK293T細胞為同等以上結合的 圖。
[第9圖]
第9圖係表示親和性成熟抗體對經PMA及A23187處理的Jurkat細胞之IL-2之放出為添加濃度依存性抑制的圖。
[第10圖]
第10圖係表示10F8、14F74、17F6抗體與pcDNA3.1-hOrai1導入HEK293T細胞結合的圖。
[第11圖]
第11圖係表示hR198_HG1/LG1、hR198_HG1-LALA/LG1、2C1.1、及5H3.1抗體與pcDNA3.1-hOrai1導入HEK293T細胞結合的圖。
[第12圖]
第12圖係表示抗Orai1單株抗體對自經PMA及A23187處理的Jurkat細胞之IL-2的放出為添加濃度依存性抑制的圖。
[第13圖]
第13圖係表示對自hR198_HG1/LG1、hR198_HG1-LALA/LG1、2C1.1、5H3.1、10F8、14F74、及17F6之Jurkat細胞之IL-2放出的半數抑制濃度(IC50)及80%抑制濃度(IC80)的圖。
[第14圖]
第14圖係表示編碼R118輕鏈可變區的核苷酸序列及該可變區之胺基酸序列的圖。
[第15圖]
第15圖係表示編碼R118重鏈可變區的核苷酸序列及該可變區之胺基酸序列的圖。
[第16圖]
第16圖係表示編碼R198輕鏈可變區的核苷酸序列及該可變區之胺基酸序列的圖。
[第17圖]
第17圖係表示編碼R198重鏈可變區的核苷酸序列及該可變區之胺基酸序列的圖。
[第18圖]
第18圖係表示編碼人類嵌合化cR118輕鏈的核苷酸序列及該輕鏈之胺基酸序列的圖。
[第19圖]
第19圖係表示編碼人類嵌合化cR198輕鏈的核苷酸序列及該輕鏈之胺基酸序列的圖。
[第20圖]
第20圖係表示編碼人類嵌合化cR118重鏈的核苷酸序列及重輕鏈之胺基酸序列的圖。
[第21圖]
第21圖係表示編碼人類嵌合化cR198重鏈的核苷酸序列及重輕鏈之胺基酸序列的圖。
[第22圖]
第22圖係表示編碼hR198_L1型輕鏈的核苷酸序列及該輕鏈之胺基酸序列的圖。
[第23圖]
第23圖係表示編碼hR198_L2型輕鏈的核苷酸序列 及該輕鏈之胺基酸序列的圖。
[第24圖]
第24圖係表示編碼hR198_L3型輕鏈的核苷酸序列及該輕鏈之胺基酸序列的圖。
[第25圖]
第25圖係表示編碼hR198_L4型輕鏈的核苷酸序列及該輕鏈之胺基酸序列的圖。
[第26圖]
第26圖係表示編碼hR198_H1型重鏈的核苷酸序列及該重鏈之胺基酸序列的圖。
[第27圖]
第27圖係表示編碼hR198_H2型重鏈的核苷酸序列及該重鏈之胺基酸序列的圖。
[第28圖]
第28圖係表示編碼hR198_H3型重鏈的核苷酸序列及該重鏈之胺基酸序列的圖。
[第29圖]
第29圖係表示編碼hR198_H4型重鏈的核苷酸序列及該重鏈之胺基酸序列的圖。
[第30圖]
第30圖係表示編碼hR198_LG1型輕鏈的核苷酸序列及該輕鏈之胺基酸序列的圖。
[第31圖]
第31圖係表示編碼hR198_LG2型輕鏈的核苷酸序列及該輕鏈之胺基酸序列的圖。
[第32圖]
第32圖係表示編碼hR198_LG3型輕鏈的核苷酸序列及該輕鏈之胺基酸序列的圖。
[第33圖]
第33圖係表示編碼hR198_HG1型重鏈的核苷酸序列及該輕重鏈之胺基酸序列的圖。
[第34圖]
第34圖係表示編碼hR198_HG2型重鏈的核苷酸序列及該輕重鏈之胺基酸序列的圖。
[第35圖]
第35圖係表示編碼hR198_HG3型重鏈的核苷酸序列及該輕重鏈之胺基酸序列的圖。
[第36圖]
第36圖係表示編碼hR198_H4-LALA型重鏈的核苷酸序列及該輕重鏈之胺基酸序列的圖。
[第37圖]
第37圖係表示編碼hR198_HG1-LALA型重鏈的核苷酸序列及該輕重鏈之胺基酸序列的圖。
[第38圖]
第38圖係表示對應於cR118、cR198、hR198_L1至L4及hR198_LG1至Lg3之各輕鏈、以及cR118、cR198、hR198_H1至H4、hR198_HG1至HG3、hR198_H4-LALA及hR198_HG1-LALA之各重鏈所含的CDR序列的序列識別號的圖。
[第39圖]
第39圖係表示編碼2C1.1抗體重鏈的核苷酸序列及該輕重鏈之胺基酸序列的圖。
[第40圖]
第40圖係表示編碼2C1.1抗體輕鏈的核苷酸序列及該輕鏈之胺基酸序列的圖。
[第41圖]
第41圖係表示編碼5H3.1抗體重鏈的核苷酸序列及該輕重鏈之胺基酸序列的圖。
[第42圖]
第42圖係表示編碼5H3.1抗體輕鏈的核苷酸序列及該輕鏈之胺基酸序列的圖。
[第43圖]
第43圖係表示編碼10F8抗體重鏈的核苷酸序列及該輕重鏈之胺基酸序列的圖。
[第44圖]
第44圖係表示編碼10F8抗體輕鏈的核苷酸序列及該輕鏈之胺基酸序列的圖。
[第45圖]
第45圖係表示編碼14F74抗體重鏈的核苷酸序列及該輕重鏈之胺基酸序列的圖。
[第46圖]
第46圖係表示編碼14F74抗體輕鏈的核苷酸序列及該輕鏈之胺基酸序列的圖。
[第47圖]
第47圖係表示編碼17F6抗體重鏈的核苷酸序列及該 輕重鏈之胺基酸序列的圖。
[第48圖]
第48圖係表示編碼17F6抗體輕鏈的核苷酸序列及該輕鏈之胺基酸序列的圖。
[第49圖]
第49圖係表示編碼hR198_H0型重鏈的核苷酸序列及該重鏈之胺基酸序列的圖。
[第50圖]
第50圖係表示編碼hR198_H5型重鏈的核苷酸序列及該重鏈之胺基酸序列的圖。
[第51圖]
第51圖係表示抗Orai1單株抗體對自經PMA及A23187處理的人類PBMC之IL-2的放出為添加濃度依存性抑制的圖。
[第52圖]
第52圖係表示hR198_HG1/LG1、hR198_HG1-LALA/LG1、2C1.1、5H3.1、10F8、14F74、及17F6之對自人類PBMC的IL-2放出的半數抑制濃度(IC50)及80%抑制濃度(IC80)的圖。
[第53圖]
第53圖係表示抗Orai1單株抗體對自經PMA及A23187處理的人類PBMC之IFNγ的放出為添加濃度依存性抑制的圖。
[第54圖]
第54圖係表示hR198_HG1/LG1、hR198_HG1-LALA/ LG1、2C1.1、5H3.1、10F8、14F74、及17F6之對自人類PBMC的IFNγ放出的半數抑制濃度(IC50)及80%抑制濃度(IC80)的圖。
[第55圖]
第55圖係表示伴隨藉由於重度複合免疫不全小鼠中移入人類PBMC而發病的移植物抗宿主病的體重減少，被hR198_HG1/LG1抑制的圖。
[第56圖]
第56圖係表示人類Orai1植入(knock-in)小鼠誘導的被動皮膚重度過敏反應(passive cutaneous anaphylaxis reaction)，被hR198_HG1/LG1抑制的圖。
[第57圖]
第57圖係表示人類Orai1植入小鼠誘導的延遲型過敏反應，於抗原投予後6小時(A)24小時(B)48小時(C)之各時點，被hR198_HG1/LG1抑制的圖。
[第58圖]
第58圖係表示hR198_HG1/LG1、hR198_H3/LG1、hR198_HG1-LALA/LG1、及2C1.1抗體之以90mg/mL、120mg/mL、150mg/mL之各濃度測定的黏度的圖。
[實施發明之形態]
於本說明書中，所謂「基因」的用語不僅包含DNA，亦包含mRNA、cDNA及cRNA。
於本說明書中，所謂「多核苷酸」的用語係以與核酸為相同的意義來使用，亦包含DNA、RNA、探 針、寡核苷酸、及引子。
於本說明書中，「多胜肽」與「蛋白質」並未區別地使用。
於本說明書中，「RNA劃分」係指包含RNA的劃分。
於本說明書中，「細胞」包含動物個體內之細胞，亦包含培養細胞。
於本說明書中，「Orai1」係以與Orai1蛋白質相同的意義來使用。
本說明書中的「抗體之抗原結合性片段」係意指具有與抗原之結合活性的抗體之部分片段，包含Fab、F(ab’)2、Fv、scFv、雙體抗體(diabody)、線狀抗體、及由抗體片段所形成的多特異性抗體等。又，將F(ab’)2於還原條件下處理的抗體之可變區之一價片段的Fab’亦包含於抗體之抗原結合性片段。惟，只要具有與抗原之結合能力即可，並未限於此等之分子。又，此等之抗原結合性片段不僅包含將抗體蛋白質之全長分子以適當酵素處理者，亦包含使用經基因工程改變的抗體基因而於適當宿主細胞中所產生的蛋白質。
已知抗體分子之重鏈及輕鏈各自有3處互補性決定區(CDR：Complementarity determining region)。互補性決定區亦稱為高度變異區(hypervariable region)，位於抗體之重鏈及輕鏈可變區內，為一次構造的變異性特高的部位，於重鏈及輕鏈之多胜肽鏈之一次構造上，各自分離於3處。於本說明書中，關於抗體之互補性決 定區，將重鏈之互補性決定區自重鏈胺基酸序列之胺基末端側標記為CDRH1、CDRH2、CDRH3，將輕鏈之互補性決定區自輕鏈胺基酸序列之胺基末端側標記為CDRL1、CDRL2、CDRL3。此等之部位係於立體構造上相互地近接，決定對結合的抗原的特異性。
於本發明，「於嚴格條件下雜交」係指於可藉由下述而鑑定的條件或與其同等的條件下雜交：於市售之雜交溶液ExpressHyb Hybridization Solution(CLONTECH公司)中，於68℃進行雜交，或使用經固定DNA的濾紙，於0.7-1.0M之NaCl存在下於68℃進行雜交後，使用0.1-2倍濃度之SSC溶液(1倍濃度SSC係包含150mM NaCl、15mM檸檬酸鈉)，於68℃洗淨。
於本發明，「宿主抗移植物反應」係指臟器移植後被觀察的被移植者之免疫亢進狀態及由其所致的移植臟器的傷害。
於本發明，「移植物抗宿主病」係指造血細胞移植後之藉由因移植細胞所致的對被移植者的免疫的攻撃而發病的症狀。
1.Orail
於本發明所使用的Orai1係可自人類、人類以外之哺乳動物(例如，豚鼠、大鼠、小鼠、兔、豬、綿羊、牛、猴等)或者雞之T細胞或肥大細胞直接純化來使用，或者可調製上述之細胞之細胞膜劃分來使用，又可藉由活體外合成Orai1或利用基因操作使其於宿主細胞產生而獲得。基因操作具體而言，藉由將Orai1 cDNA組入可表現 的載體後，於含有轉錄及轉譯所需要的酵素、基質及能量物質的溶液中進行合成，或者藉由利用使其他原核生物、或真核生物之宿主細胞轉形來使Orai1表現，而可獲得該蛋白質。
人類Orai1之cDNA之核苷酸序列已以登錄號NM_032790登錄於GenBank。小鼠Orai1之cDNA之核苷酸序列已以登錄號NM_175423登錄於GenBank。編碼人類Orai1的核苷酸序列係記載於序列表之序列識別號1，人類Orai1之胺基酸序列係記載於序列表之序列識別號2。 又，Orai1有被稱為鈣釋放-活性化鈣調節器(Calcium Release-Activated Calcium Modulator 1)(CRACM1)或跨膜蛋白(Transmembrane Protein)142A(TMEM142A)的情形，此等皆表示相同分子。
Orai1之cDNA係例如，藉由將表現Orai1之mRNA的臟器之cDNA庫作為模板，使用特異性放大Orai1之cDNA的引子而進行聚合酶連鎖反應(以下稱為「PCR」)(Saiki，R.K.，et al.，Science，(1988)239，487-49)，即所謂的PCR法而可加以取得。
又，與包含「與編碼人類或小鼠之Orai1的核苷酸序列互補的核苷酸序列」的多核苷酸於嚴格條件下雜交、且編碼「具有與Orai1同等之生物活性的蛋白質」的多核苷酸亦包含於Orai1之cDNA。再者，為自人類或小鼠Orai1基因座被轉錄的剪接變異體(splicing variant)或與其於嚴格條件下雜交的多核苷酸，且編碼「與Orai1具有同等之生物活性的蛋白質」的多核苷酸亦包 含於Orai1之cDNA。
又，包含「於人類或小鼠之Orai1之胺基酸序列、或自此等之序列去除訊息序列的胺基酸序列中，有1個、2個或3個或4個或5個之胺基酸被取代、刪除、或添加的胺基酸序列」、且具有與Orai1同等之生物活性的蛋白質亦包含於Orai1。再者，包含「自人類或小鼠Orai1基因座被轉錄的剪接變異體所編碼的胺基酸序列」或「於該胺基酸序列中，有1個、2個或3個或4個或5個之胺基酸被取代、刪除、或添加的胺基酸序列」、且具有與Orai1同等之生物活性的蛋白質亦包含於Orai1。
2.抗Orai1抗體之製造
本發明之抗Orai1的抗體係可使用通常方法，藉由將Orai1或選自Orai1之胺基酸序列的任意多胜肽對動物進行免疫，採取、純化活體內所產生的抗體而獲得。作為抗原的Orai1之生物種類並未限定於人類，亦可將來自小鼠、大鼠等之人類以外的動物的Orai1對動物進行免疫。於此情形，藉由試驗與取得的異種Orai1結合的抗體及人類Orai1之交叉性，可篩選可應用於人類疾病的抗體。又，作為抗原的Orai1可藉由將Orai1基因利用基因操作而使其於宿主細胞中產生而獲得。具體而言，製作可表現Orai1基因的載體，將其導入宿主細胞而使該基因表現，純化表現的Orai1即可。
本發明之抗Orai1的抗體亦可使用DNA免疫法而獲得。DNA免疫法係指藉由將抗原表現質體，基因導入至小鼠或大鼠等之動物個體，使抗原於個體內表現 ，而誘導對抗原的免疫的手法。於基因導入之手法存有直接將質體注射至肌肉的方法，或將質體與微脂體(liposome)或聚乙亞胺(polyethyleneimine)等之複合體作靜脈注射的方法、使用病毒載體的手法、將經質體附著的金粒子藉由基因槍射入的手法、急速地將大量質體溶液作靜脈注射的流體動力法等。關於利用表現質體的肌肉注射的基因導入法，已知將質體進行肌肉注射後，於同部位施加電穿孔之所謂的活體內電穿孔(in vivo electroporation)的技術作為使表現量提升的手法(Aihara H,Miyazaki J.Nat Biotechnol.1998 Sep；16(9)：867-70或Mir LM,Bureau MF,Gehl J,Rangara R,Rouy D,Caillaud JM,Delaere P,Branellec D,Schwartz B,Scherman D.Proc Natl Acad Sci U S A.1999 Apr 13；96(8)：4262-7)。本手法係藉由於質體之肌肉注射前以玻尿酸酶(hyaluronidase)處理肌肉，進一步提升表現量(McMahon JM1,Signori E,Wells KE,Fazio VM,Wells DJ.Gene Ther.2001 Aug；8(16)：1264-70)。
又，亦可依據周知之方法(例如，Kohler and Milstein,Nature(1975)256,p.495-497、Kennet,R.ed.,Monoclonal Antibodies,p.365-367,Plenum Press,N.Y.(1980))，使產生抗Orai1的抗體的抗體產生細胞與骨髓瘤細胞融合來建立融合瘤，而獲得單株抗體。此種方法之具體例已記載於國際公開第WO09/48072號小冊(2009年4月16日公開)及第WO10/117011號(2010年10月14日公開)小冊。
就如此建立的大鼠抗人類Orai1抗體之實例而言，可列舉R118抗體及R198抗體。各自將R118抗體之輕鏈可變區之胺基酸序列示於序列表之序列識別號11、R118抗體之重鏈可變區之序列示於序列表之序列識別號13。又，各自將R198抗體之輕鏈可變區之胺基酸序列示於序列表之序列識別號15、R198抗體之重鏈可變區之序列示於序列表之序列識別號17。
本發明之抗體除了包含上述之抗Orai1的單株抗體之外，亦包含以使對人類之異種抗原性降低等為目的而人為地改變的基因重組型抗體，例如，嵌合(Chimeric)抗體、人化(Humanized)抗體、人類抗體等。此等之抗體可使用已知方法來製造。
就嵌合抗體而言，可列舉抗體之可變區與恆定區彼此為異種的抗體，例如將來自小鼠或大鼠的抗體之可變區與來自人類之恆定區接合的嵌合抗體(參照Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81,6851-6855,(1984))。
來自大鼠抗人類Orai1抗體R118之嵌合抗體可列舉包含下列輕鏈及重鏈之抗體：包含「含有序列識別號23之第21至126號之胺基酸殘基的輕鏈可變區」的輕鏈及包含「含有序列識別號27之第20至136號之胺基酸殘基的重鏈可變區」的重鏈。就此種來自R118之嵌合抗體之一例而言，可列舉：包含「含有序列識別號23之第21至234號之胺基酸殘基的輕鏈」及「含有序列識別號27之第20至466號之胺基酸殘基的重鏈」的抗體。於本說明書，將前述抗體稱為「cR118」或「cR118抗體」。
又，來自大鼠抗人類Orai1抗體R198之嵌合抗體可列舉包含下列輕鏈及重鏈之抗體：包含「含有序列識別號25之第21至126號之胺基酸殘基的輕鏈可變區」的輕鏈、及包含「含有序列識別號29之第20至136號之胺基酸殘基的重鏈可變區」的重鏈。就此種來自R198之嵌合抗體之一例而言，可列舉：包含「含有序列識別號25之第21至234號之胺基酸殘基的輕鏈」及「含有序列識別號29之第20至466號之胺基酸殘基的重鏈」的抗體。於本說明書，將前述之抗體稱為「cR198」或「cR198抗體」。
可將上述之抗Orai1的嵌合抗體之序列，以使對人類的異種抗原性降低等為目的而人為地改變，製作基因重組型抗體的人化(Humanized)抗體。本發明之抗體包含將前述人化抗體之CDR改變的抗體。此等抗體可使用已知方法來製造。
就人化抗體而言，可列舉：僅將互補性決定區(CDR；complementarity determining region)組入來自人類之抗體的抗體(參照Nature(1986)321,p.522-525)；除了CDR之序列之外，亦將一部分之框架的胺基酸殘基移植至人類抗體的抗體(國際公開第WO90/07861號小冊)。
來自cR118及cR198抗體之人化抗體係保持來自cR118或cR198的6種全部的CDR序列，且具有抑制T細胞之活性化的活性。又，前述之人化抗體之輕鏈可變區係保有：由序列識別號92所示的胺基酸序列而成的CDRL1(RASQSIGNSLS)或由序列識別號116所示的胺基酸序列而成的CDRL1(RASQSISNSLS)之任一者；由序列 識別號96所示的胺基酸序列而成的CDRL2(STSTLES)、及由序列識別號99所示的胺基酸序列而成的CDRL3(LQFATFPDT)或序列識別號100所示CDRL3(LQFATYPDT)之任一者。又，人化抗體之重鏈可變區保有：由序列識別號102所示的胺基酸序列而成的CDRH1(AYYIS)或序列識別號103所示的CDRH1(SYYIS)之任一者；由序列識別號104所示的胺基酸序列而成的CDRH2(YIDMGNGRTNYNARFKG)或序列識別號105所示的CDRH2(YVDMGNGRTNYNEKFKG)之任一者；及由序列識別號109所示的胺基酸序列而成的CDRH3(DSNWGVDY)。又，上述之CDR之胺基酸序列亦記載於第38圖。
就具有適合的CDR之組合的抗體而言，可列舉：包含由序列識別號92所示的胺基酸序列而成的CDRL1、由序列識別號96所示的胺基酸序列而成的CDRL2、由序列識別號100所示的胺基酸序列而成的CDRL3、由序列識別號103所示的胺基酸序列而成的CDRH1、由序列識別號105所示的胺基酸序列而成的CDRH2、及由序列識別號109所示的胺基酸序列而成的CDRH3的抗體，以及包含由序列識別號92所示的胺基酸序列而成的CDRL1、由序列識別號96所示的胺基酸序列而成的CDRL2、由序列識別號99所示的胺基酸序列而成的CDRL3、由序列識別號102所示的胺基酸序列而成的CDRH1、由序列識別號104所示的胺基酸序列而成的CDRH2、及由序列識別號109所示的胺基酸序列而成的 CDRH3的抗體。
就上述之人化抗體之適合的實例而言，可列舉包含下列輕鏈及重鏈之抗體：包含「含有序列識別號31之第21至126號之胺基酸殘基的輕鏈可變區」的輕鏈及包含「含有序列識別號39之第20至136號之胺基酸殘基的重鏈可變區」的重鏈；包含「含有序列識別號33之第21至126號之胺基酸殘基的輕鏈可變區」的輕鏈及包含「含有序列識別號41之第20至136號之胺基酸殘基的重鏈可變區」的重鏈；包含「含有序列識別號35之第21至126號之胺基酸殘基的輕鏈可變區」的輕鏈及包含「含有序列識別號43之第20至136號之胺基酸殘基的重鏈可變區」的重鏈；以及包含「含有序列識別號37之第21至126號之胺基酸殘基的輕鏈可變區」的輕鏈及包含「含有序列識別號45之第20至136號之胺基酸殘基的重鏈可變區」的重鏈。
就更適合的實例而言，可列舉：包含「含有序列識別號31之第21至234號之胺基酸殘基的輕鏈」及「含有序列識別號39之第20至466號之胺基酸殘基的重鏈」的抗體；包含「含有序列識別號33之第21至234號之胺基酸殘基的輕鏈」及「含有序列識別號41之第20至466號之胺基酸殘基的重鏈」的抗體；包含「含有序列識別號35之第21至234號之胺基酸殘基的輕鏈」及「含有序列識別號43之第20至466號之胺基酸殘基的重鏈」的抗體；以及包含「含有序列識別號37之第21至234號之胺基酸殘基的輕鏈」及「含有序列識別號45之第20至466號之胺基酸殘 基的重鏈」的抗體。
本發明之抗體亦可為於上述之人化抗體進一步導入變異，而使抗Orai1的結合能力更新者。此種手法被稱為親和性成熟，但就具體的方法而言，可列舉核醣體展示法。核醣體展示法係使用將蛋白質與作為其基因情報的mRNA經由核醣體而結合的三者複合體，將與標的分子結合的蛋白質之基因序列加以單離的方法(Stafford RL.et.al.Protein Eng.Des.Sel.2014(4)：97-109)。
藉由上述之方法，施加基因改造的抗體之輕鏈可變區保有：由序列識別號93所示的胺基酸序列而成的CDRL1(RASQSIGGSLS)、由序列識別號94所示的胺基酸序列而成的CDRL1(HASQNIGGSLS)或由序列識別號95所示的胺基酸序列而成的CDRL1(HASRNIGGSLS)之任一者；由序列識別號96所示的胺基酸序列而成的CDRL2(STSTLES)、由序列識別號97所示的胺基酸序列而成的CDRL2(LTSTLDW)或由序列識別號98所示的胺基酸序列而成的CDRL2(LTSSLDW)之任一者；及由序列識別號101所示的胺基酸序列而成的CDRL3(LQFAIFPDS)。又，施加基因改造的抗體之重鏈可變區保有：由序列識別號102所示的胺基酸序列而成的CDRH1(AYYIS)；由序列識別號104所示的胺基酸序列而成的CDRH2(YIDMGNGRTNYNARFKG)、由序列識別號106所示的胺基酸序列而成的CDRH2(YIDMGNGRTDYNARFKG)、由序列識別號107所示的胺基酸序列而成的CDRH2(YIDMGNGRTDYNGRFKG)或序列識別號108所示的CDRH2(YIDMGNGRTDYNMRF KG)之任一者；及由序列識別號109所示的胺基酸序列而成的CDRH3(DSNWGVDY)或由序列識別號110所示的胺基酸序列而成的CDRH3(DSNWGADY)。又，上述之CDR之胺基酸序列亦記載於第38圖。
就具有適合的CDR之組合的抗體而言，可列舉：包含由序列識別號93所示的胺基酸序列而成的CDRL1、由序列識別號96所示的胺基酸序列而成的CDRL2、由序列識別號101所示的胺基酸序列而成的CDRL3、由序列識別號102所示的胺基酸序列而成的CDRH1、由序列識別號106所示的胺基酸序列而成的CDRH2、及由序列識別號110所示的胺基酸序列而成的CDRH3的抗體；包含由序列識別號94所示的胺基酸序列而成的CDRL1、由序列識別號97所示的胺基酸序列而成的CDRL2、由序列識別號101所示的胺基酸序列而成的CDRL3、由序列識別號102所示的胺基酸序列而成的CDRH1、由序列識別號106所示的胺基酸序列而成的CDRH2、及由序列識別號110所示的胺基酸序列而成的CDRH3的抗體；包含由序列識別號95所示的胺基酸序列而成的CDRL1、由序列識別號98所示的胺基酸序列而成的CDRL2、由序列識別號101所示的胺基酸序列而成的CDRL3、由序列識別號102所示的胺基酸序列而成的CDRH1、由序列識別號106所示的胺基酸序列而成的CDRH2、及由序列識別號110所示的胺基酸序列而成的CDRH3的抗體；包含由序列識別號93所示的胺基酸序列而成的CDRL1、由序列識別號96所示的胺基酸序列而成 的CDRL2、由序列識別號101所示的胺基酸序列而成的CDRL3、由序列識別號102所示的胺基酸序列而成的CDRH1、由序列識別號107所示的胺基酸序列而成的CDRH2、及由序列識別號110所示的胺基酸序列而成的CDRH3的抗體；包含由序列識別號93所示的胺基酸序列而成的CDRL1、由序列識別號96所示的胺基酸序列而成的CDRL2、由序列識別號101所示的胺基酸序列而成的CDRL3、由序列識別號102所示的胺基酸序列而成的CDRH1、由序列識別號108所示的胺基酸序列而成的CDRH2、及由序列識別號110所示的胺基酸序列而成的CDRH3的抗體；以及包含由序列識別號93所示的胺基酸序列而成的CDRL1、由序列識別號96所示的胺基酸序列而成的CDRL2、由序列識別號101所示的胺基酸序列而成的CDRL3、由序列識別號102所示的胺基酸序列而成的CDRH1、由序列識別號104所示的胺基酸序列而成的CDRH2、由序列識別號109所示的胺基酸序列而成的CDRH3的抗體。
就上述之CDR抗體之適合的實例而言，可列舉包含下列輕鏈及重鏈之抗體：包含「含有序列識別號56之第21至126號之胺基酸殘基的輕鏈可變區」的輕鏈及包含「含有序列識別號62之第20至136號之胺基酸殘基的重鏈可變區」的重鏈；包含「含有序列識別號58之第21至126號之胺基酸殘基的輕鏈可變區」的輕鏈及包含「含有序列識別號62之第20至136號之胺基酸殘基的重鏈可變區」的重鏈；包含「含有序列識別號60之第21至126 號之胺基酸殘基的輕鏈可變區」的輕鏈及包含「含有序列識別號62之第20至136號之胺基酸殘基的重鏈可變區」的重鏈；包含「含有序列識別號56之第21至126號之胺基酸殘基的輕鏈可變區」的輕鏈及包含「含有序列識別號64之第20至136號之胺基酸殘基的重鏈可變區」的重鏈；包含「含有序列識別號56之第21至126號之胺基酸殘基的輕鏈可變區」的輕鏈及包含「含有序列識別號66之第20至136號之胺基酸殘基的重鏈可變區」的重鏈；以及包含「含有序列識別號56之第21至126號之胺基酸殘基的輕鏈可變區」的輕鏈及包含「含有序列識別號43之第20至136號之胺基酸殘基的重鏈可變區」的重鏈。
就上述之含有輕鏈可變區及重鏈可變區的適合抗體而言，可列舉：包含「含有序列識別號56之第21至234號之胺基酸殘基的輕鏈」及「含有序列識別號62之第20至466號之胺基酸殘基的重鏈」的抗體；包含「含有序列識別號58之第21至234號之胺基酸殘基的輕鏈」及「含有序列識別號62之第20至466號之胺基酸殘基的重鏈」的抗體；包含「含有序列識別號60之第21至234號之胺基酸殘基的輕鏈」及「含有序列識別號62之第20至466號之胺基酸殘基的重鏈」的抗體；包含「含有序列識別號56之第21至234號之胺基酸殘基的輕鏈」及「含有序列識別號64之第20至466號之胺基酸殘基的重鏈」的抗體；包含「含有序列識別號56之第21至234號之胺基酸殘基的輕鏈」及「含有序列識別號66之第20至466號之胺基酸殘基的重鏈」的抗體；以及包含「含有序列識別號56之第 21至234號之胺基酸殘基的輕鏈」及「含有序列識別號43之第20至466號之胺基酸殘基的重鏈」的抗體。
為了迴避對正常之人類Orai1表現細胞的細胞毒殺(cytotoxicity)，抗體之效應物(effector)活性低者為理想的。已知效應物活性依抗體之次型(subclass)而不同。可見IgG4係ADCC、CDC活性低；IgG2雖具有CDC活性，但ADCC活性低等之特徵。由此特徵，藉由將IgG1之恆定區取代為IgG2、4之恆定區，可製作使ADCC、CDC活性減低的抗體。又，藉由將IgG1之恆定區之一部份序列參考IgG2、4而取代，可製作使ADCC、CDC活性減少的IgG1抗體。作為一例，依據Marjan Hezareh et.al.Journal of Virology,75(24)：12161-12168(2001)，將IgG1之第234號、第235號之白胺酸殘基(數字係依Kabat等人的EU索引)各自取代為丙胺酸殘基時，顯示ADCC、CDC活性降低。
就藉由上述方法所製作的抗Orai1抗體之例而言，可列舉序列識別號68或70記載之重鏈序列。序列識別號70或72記載之重鏈，可與本說明書記載之各輕鏈序列組合，而作為治療用抗體來使用。作為可組合的輕鏈之具體例而言，可列舉序列識別號31、33、35、37、56、58或60記載之抗體。就適合的輕鏈與重鏈之組合的抗體而言，可列舉：包含「含有序列識別號56之第21至234號之胺基酸殘基的輕鏈」及「含有序列識別號70之第20至466號之胺基酸殘基的重鏈」的抗體、包含「含有序列識別號58之第21至234號之胺基酸殘基的輕鏈」及「含 有序列識別號70之第20至466號之胺基酸殘基的重鏈」的抗體、以及包含「含有序列識別號60之第21至234號之胺基酸殘基的輕鏈」及「含有序列識別號70之第20至466號之胺基酸殘基的重鏈」的抗體。
又，已知哺乳類培養細胞所生產的抗體之重鏈之羧基末端的離胺酸殘基會缺失(Journal of Chromatography A,705：129-134(1995))，又已知相同重鏈羧基末端之甘胺酸、離胺酸之2個胺基酸殘基會缺失，且新位於羧基末端的脯胺酸殘基被醯胺化(Analytical Biochemistry,360：75-83(2007))。然而，此等重鏈序列之缺失及修飾並未影響抗體之抗原結合能力及效應物功能(effector function)(補體之活性化或抗體依存性細胞毒殺作用等)。因此，本發明亦包含接受該修飾的抗體，可列舉於重鏈羧基末端有1或2個胺基酸缺失的缺失體、及經醯胺化的該缺失體(例如，羧基末端部位之脯胺酸殘基經醯胺化的重鏈)等。惟，只要保有抗原結合能力及效應物功能即可，與本發明有關的抗體之重鏈之羧基末端的缺失體並未限於上述種類。構成與本發明有關的抗體的雙股之重鏈可為選自包含完全長度及上述缺失體的群組的重鏈之任一種，亦可為將任二種組合者。各缺失體之量比可受產生與本發明有關的抗體的哺乳類培養細胞之種類及培養條件而影響，但就與本發明有關的抗體之主成分而言，可列舉於雙股之重鏈兩者，羧基末端的1個胺基酸殘基有缺失的情形。即，含有序列表記載之序列識別號27、29、39、41、43、45、62、64、66、68、 及70所示的各重鏈序列之第20至465號之胺基酸殘基的重鏈、或含有第20至464號之胺基酸殘基的重鏈亦可使用於本發明之抗體。
藉由以上方法所獲得的抗體可評價對抗原的結合性，而篩選適合的抗體。就比較抗體之性質之際的另一指標之一例而言，可列舉抗體之安定性。示差掃描熱卡計(DSC)係可快速又正確地測量作為蛋白質之相對的構造安定性的良好指標的熱變性中點(Tm)的方法。藉由使用DSC來測量Tm值，並比較其值，可比較熱安定性的差異。已知抗體之保存安定性係顯示與抗體的熱安定性有某程度的相關(Lori Burton,et.al.,Pharmaceutical Development and Technology(2007)12,p.265-273)，將熱安定性作為指標，可篩選適當的抗體。就用以篩選抗體的其他指標而言，可列舉適當宿主細胞中的產量為高的、及於水溶液中之凝集性為低的。例如產量最高的抗體並不一定顯示最高的熱安定性，故有必要基於以上所述的指標而綜合性地判斷，而篩選對人類投予為最適合的抗體。
又，亦已知將抗體之重鏈及輕鏈之全長序列使用適當連結物(linker)連結，而取得單鏈免疫球蛋白(single chain immunoglobulin)的方法(Lee,H-S,et.al.,Molecular Immunology(1999)36,p.61-71；Shirrmann,T.et.al.,mAbs(2010),2,(1)p.1-4)。此種單鏈免疫球蛋白藉由二聚體化，而可能保持與本來為四聚體的抗體類似的構造及活性。又，本發明之抗體可為具有單一之重鏈 可變區，且可不具有輕鏈序列的抗體。此種抗體被稱為單一功能域抗體(single domain antibody：sdAb)或奈米抗體(nanobody)，已有報告實際上於駱駝或駱馬中被觀察到，且保持有抗原結合能力(Muyldemans S.et.al.,Protein Eng.(1994)7(9),1129-35，Hamers-Casterman C.et.al.,Nature(1993)363(6428)446-8)。上述之抗體亦可解釋為本發明中的抗體之抗原結合性片段之一種。
又，藉由調節與本發明之抗體結合的糖鏈修飾，可增強抗體依存性細胞毒殺活性。就抗體之糖鏈修飾之調節技術而言，已知有WO99/54342、WO00/61739、WO02/31140等，但未限定於此等。
於將抗體基因一度單離後，導入適當宿主而製作抗體的情形，可使用適當宿主與表現載體之組合。就抗體基因之具體例而言，可列舉將編碼本說明書記載的抗體之重鏈序列的基因、及編碼輕鏈序列的基因組合者。將宿主細胞轉形之際，重鏈序列基因與輕鏈序列基因可被插入相同之表現載體，亦可被插入各別之表現載體。使用真核細胞作為宿主的情形，可使用動物細胞、植物細胞、真核微生物。就動物細胞而言，可列舉(1)哺乳類細胞，例如，猴之細胞的COS細胞(Gluzman,Y.Cell(1981)23,p.175-182、ATCC CRL-1650)、小鼠纖維母細胞NIH3T3(ATCC No.CRL-1658)或中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞、ATCC CCL-61)之二氫葉酸還原酵素缺損株(Urlaub,G.and Chasin,L.A.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1980)77,p.4126-4220)。又，使用原核細胞的情形，例 如，可列舉大腸菌、枯草菌。於此等之細胞藉由轉形而導入作為目的之抗體基因，藉由於活體外培養經轉形的細胞而獲得抗體。於以上之培養法，依抗體之序列而有產量不同的情形，可自具有同等結合活性的抗體中，以產量為指標挑選生產容易者作為醫藥。
作為本發明之抗體之同型(isotype)並無限制，例如可列舉IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA(IgA1、IgA2)、IgD或IgE等，但較佳可列舉IgG或IgM，更佳可列舉IgG1或IgG2。
又本發明之抗體可為具有抗體之抗原結合部的抗體之抗原結合性片段或其修飾物。藉由將抗體以木瓜酵素、胃蛋白酶等之蛋白質分解酵素處理、或者藉由將抗體基因利用基因工程的手法改變而使其於適當培養細胞中表現，可獲得該抗體之片段。此種抗體片段之中，可將保持抗體全長分子之具有的機能的全部或一部分的片段稱為抗體之抗原結合性片段。
就抗體之機能而言，一般可列舉抗原結合活性、將抗原之活性加以中和的活性、將抗原之活性加以增強的活性、抗體依存性細胞毒殺活性、補體依存性細胞毒殺活性及補體依存性細胞性細胞毒殺活性。本發明中的抗體之抗原結合性片段所保持的機能係對Orai1的結合活性，較佳為抑制T細胞之活性化的活性，更佳為抑制由T細胞所致的IL-2及/或干擾素γ的產生的活性。
例如，就抗體之片段而言，可列舉Fab、F(ab’)2、Fv、或將重鏈及輕鏈之Fv以適當連結物連結的單鏈 Fv(scFv)、diabody(diabodies)、線狀抗體、及由抗體片段所形成的多特異性抗體等。又，將F(ab’)2於還原條件下處理的抗體之可變區之一價片段的Fab’亦包含於抗體之片段。
再者，本發明之抗體可為對至少2種類之相異抗原具有特異性的多特異性抗體。通常此種分子係與2種類之抗原結合者(即，雙特異性抗體(bispecific antibody))，但本發明中的「多特異性抗體」包含對此以上(例如，3種類)之抗原具有特異性的抗體。
本發明之多特異性抗體可為包含全長的抗體、或此種抗體之片段(例如，F(ab’)2雙特異性抗體)。雙特異性抗體可使2種類之抗體之重鏈與輕鏈(HL對)結合而製作，亦可藉由使產生相異單株抗體的融合瘤融合來製作雙特異性抗體產生融合細胞而製作(Millstein et al.,Nature(1983)305,p.537-539)。
本發明之抗體可為單鏈抗體(亦記載為scFv)。單鏈抗體可藉由將抗體之重鏈可變區與輕鏈可變區以多胜肽之連結物連結而獲得(Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,113(Rosenberg及Moore編、Springer Verlag,New York,p.269-315(1994)、Nature Biotechnology(2005),23,p.1126-1136)。又，亦可將使2個scFv以多胜肽連結物結合而製作的BiscFv片段作為雙特異性抗體來使用。
製作單鏈抗體的方法係該技術領域所周知(例如，參照美國專利第4,946,778號、美國專利第5,260,2 03號、美國專利第5,091,513號、美國專利第5,455,030號等)。於此scFv，重鏈可變區與輕鏈可變區係經由不作成共軛物的連結物，較佳為經由多胜肽連結物而連結(Huston,J.S.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988),85,p.5879-5883)。scFv中的重鏈可變區及輕鏈可變區可來自同一抗體，亦可來自各別抗體。就將可變區連結的多胜肽連結物而言，例如可使用包含12~19個殘基的任意單鏈胜肽。
編碼scFv的DNA係可藉由下列獲得：編碼前述抗體之重鏈或重鏈可變區的DNA、及編碼輕鏈或輕鏈可變區的DNA之中，將編碼彼等序列中之全部或所望之胺基酸序列的DNA部分作為模板，使用規定其兩端的引子對而藉由PCR法加以放大，其次，再藉由組合以將編碼多胜肽連結物部分的DNA、及其兩端各自與重鏈、輕鏈連結的方式規定的引子對進行放大而可獲得。
又，一旦編碼scFv的DNA被製作時，可依據通常方法而獲得含有彼等的表現載體、及藉由該表現載體轉形的宿主，又藉由使用其宿主，可依據通常方法而獲得scFv。此等之抗體片段可與前述同樣地，取得基因並使其表現，藉由宿主而產生。
本發明之抗體可多量化而提高對抗原的親和性。就多量化的抗體而言，可為1種類之抗體，亦可為辨識同一抗原之複數個抗原決定位的複數個抗體。就將抗體多量化的方法而言，可列舉IgG CH3功能域與2個scFv之結合、與鏈黴親和素(streptavidin)之結合、螺旋-轉折-螺旋模體(Helix turn helix motif)之導入等。
本發明之抗體可為胺基酸序列為相異的複數種類的抗Orai1抗體之混合物的多株抗體。就多株抗體之一例而言，可列舉CDR為相異的複數種類的抗體之混合物。就此種多株抗體而言，可使用培養生產相異抗體的細胞之混合物，而自該培養物純化的抗體(參照WO2004/061104號)。
作為抗體之修飾物，亦可使用與聚乙二醇(PEG)等之各種分子結合的抗體。
再者，本發明之抗體可為此等之抗體與其他藥劑形成結合物者(免疫結合物(Immunoconjugate))。就此等抗體之例而言，可列舉該抗體與放射性物質或具有藥理作用的化合物結合的物質(Nature Biotechnology(2005)23,p.1137-1146)。
獲得的抗體可純化至均一。抗體之分離、純化只要使用通常之蛋白質所使用的分離、純化方法即可。例如只要適當選擇、組合管柱層析、過濾器過濾、超過濾、鹽析、透析、調製用聚丙烯醯胺膠體電泳、等電點電泳等，即可將抗體分離、純化(Strategies for Protein Purification and Characterization：A Laboratory Course Manual,Daniel R.Marshak et al.eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996)；Antibodies：A Laboratory Manual.Ed Harlow and David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988))，但並未限定於此等。
就層析而言，可列舉親和性層析、離子交換層析、疏水性層析、膠體過濾層析、逆相層析、吸附層 析等。此等之層析可使用HPLC或FPLC等之液體層析來進行。就用於親和性層析的管柱而言，可列舉Protein A管柱、Protein G管柱。例如作為使用Protein A管柱的管柱，可列舉Hyper D、POROS、Sepharose F.F.(Pharmacia)等。又，亦可使用將抗原固定化的擔體(carrier)，利用對抗原的結合性而純化抗體。
3.含有抗Orai1抗體的醫藥
由以上述之「2.抗Orai1抗體之製造」項目所記載的方法獲得的抗Orai1抗體之中，可獲得中和Orai1之生物活性的抗體。由於此等中和Orai1之生物活性的抗體可抑制活體內Orai1之生物活性，即，T細胞或肥大細胞所代表的Orai1表現細胞之鈣釋放依存性鈣通道(CRAC通道)之活性化，故作為醫藥可使用作為起因於此等細胞之CRAC通道活性化的疾病的治療及/或預防劑。
起因於CRAC通道活性化引起的疾病或狀態係包含移植物之排斥、免疫相關疾病、過敏性疾病、炎症性疾病、抗血小板或抗血栓活性、或癌症等。
就移植物排斥之治療及/或預防之例而言，可列舉對心臟、腎臟、肝臟、骨髓、皮膚等之臟器或組織的移植的排斥反應及宿主抗移植物反應、以及造血細胞(骨髓、末梢血、臍帶血等)之移植所引起的移植物抗宿主病之治療及/或預防。
就免疫相關疾病之例而言，可列舉結締組織或肌肉骨骼系統(類風濕性關節炎、僵直性脊椎炎、全身性紅斑狼瘡、硬皮症、多發性肌炎、皮肌炎等)、血液系 統(再生不良性貧血、自發性血小板減少紫瘢等)、消化器官系統(克隆氏症、潰瘍性大腸炎等)、神經系統(多發性硬化症、重症肌無力症等)、視覺系統(葡萄膜炎等)、血管系統(貝塞氏症、華格納氏肉芽腫病等)、表皮系統(乾癬、天疱瘡、白斑等)、內分泌系統(1型糖尿病、自體免疫甲狀腺炎、葛瑞夫茲氏症、橋本氏病等)等。
就過敏性疾病之例而言，可列舉異位性皮膚炎、氣喘、重度過敏、類過敏反應、食物過敏、鼻炎、中耳炎、藥物反應、昆蟲刺傷反應、植物反應、乳膠過敏、結膜炎、蕁麻疹等。
就炎症性疾病之例而言，可列舉炎症性腎疾病(絲球體腎炎、腎病等)、炎症性肺疾病(慢性阻塞性肺病、囊性纖維變性、間質性肺炎等)、炎症性腸疾病(潰瘍性大腸炎、迴腸炎等)、炎症性肝疾病(自體免疫肝炎、病毒性肝炎等)、炎症性心疾病(心肌炎、缺血性心臟病、動脈粥狀硬化症等)、炎症性皮膚疾病(接觸性皮膚炎、濕疹等)、炎症性眼疾病(砂眼、眼內炎等)、炎症性中樞神經疾病(髓膜炎、腦脊髓炎、自體免疫腦炎等)、關節之炎症性疾病(例如關節炎、骨關節炎等)、全身性炎症(敗血症、出血、過敏症、起因於癌症化學療法等的休克症狀等)等。
就有利於抗血小板或抗血栓活性之治療及/或預防之例而言，可列舉心肌梗塞、腦中風、缺血性心臟病、血栓症等。
就癌症治療之例而言，可列舉乳癌、肺癌、 皮膚癌、白血病等。
再者，作為可藉由本抗體治療的疾病，可列舉肥大細胞及嗜鹼性球所關連的病態、肥大細胞白血病、肥大細胞症、嗜鹼性球白血病、子宮內膜症等，以及由於CRAC通道之遺傳性機能亢進而發病的、或發病風險高的管狀聚集性肌肉病變、斯托莫肯症、類風濕性關節炎、僵直性脊椎炎、異位性皮膚炎等。
就作為上述醫藥之抗Orai1抗體之例而言，可列舉由R118抗體及/或R198製作的人化抗體及其CDR變異體。
活體外之由抗Orai1抗體所致的Orai1之生物活性的中和活性係例如可藉由表現Orai1的T細胞之活性化抑制活性來測定。例如，可藉由對來自人類T細胞之細胞株的Jurkat細胞以各種濃度添加抗Orai1抗體，測量對於自PMA及A23187刺激所致的Jurkat細胞的IL-2放出的抑制活性。又，可藉由對人類末梢血單核球(PBMC)以各種濃度添加抗Orai1抗體，測量對於自PMA及A23187刺激所致的PBMC之IL-2及干擾素γ放出的抑制活性。
移植物抗宿主病發病的責任細胞為T細胞係亦被實驗證明的事實，且被廣泛了解。被移植的T細胞將被移植者辨識為異物時，藉由由自身生產的介白素2(IL-2)所致的自體增殖、或由活性化所致的干擾素γ(IFN-γ)等之炎症性細胞激素(inflammatory cytokine)類之放出，而使全身性免疫炎症反應發生，而移植物抗宿主病發作。據此，可判斷抑制此等之細胞激素類之產生 與移植物抗宿主病之預防或治療有關，同時可判斷藉由將其抑制活性作為指標，而作為Orai1抗體之治療藥的有用性。
就本發明中的適合的抗體而言，可列舉特徵為與序列識別號2記載之胺基酸序列特異性地結合，而抑制50%之經PMA及A23187處理的Jurkat細胞所放出的IL-2量的濃度為80ng/mL以下之抗體或該抗體之抗原結合性片段。就於前述之抗體中更適合者而言，可列舉將抑制50%之經PMA及A23187處理的Jurkat細胞所放出的IL-2量的濃度為10ng/mL以下作為特徵的抗體或該抗體之抗原結合性片段。又，將抑制80%之經PMA及A23187處理的Jurkat細胞所放出的IL-2量的濃度為60000ng/mL以下作為特徵的抗體或該抗體之抗原結合性片段、以及將80%抑制濃度為200ng/mL以下作為特徵之抗體或該抗體之抗原結合性片段亦包含於本發明之抗體。
就本發明中其他適合的抗體而言，可列舉特徵為與序列識別號2記載之胺基酸序列特異性地結合，而抑制50%之經PMA及A23187處理的人類PBMC所放出的IL-2量的濃度為100ng/mL以下之抗體或該抗體之抗原結合性片段。就於前述之抗體中更適合者而言，可列舉將抑制50%之經PMA及A23187處理的人類PBMC所放出的IL-2量的濃度為20ng/mL以下作為特徵之抗體或該抗體之抗原結合性片段。又，將抑制80%之經PMA及A23187處理的人類PBMC所放出的IL-2量的濃度為17000ng/mL以下作為特徵之抗體或該抗體之抗原結合性片段、以及 將80%抑制濃度為400ng/mL以下作為特徵之抗體或該抗體之抗原結合性片段亦包含於本發明之抗體。
就本發明中其他適合的抗體而言，可列舉特徵為與序列識別號2記載之胺基酸序列特異性結合，而抑制50%之經PMA及A23187處理的人類PBMC所放出的IFN-γ量的濃度為800ng/mL以下之抗體或該抗體之抗原結合性片段。就於前述之抗體中更適合者而言，可列舉將抑制50%之經PMA及A23187處理的人類PBMC所放出的IFN-γ量的濃度為40ng/mL以下作為特徵之抗體或該抗體之抗原結合性片段。又，將抑制80%之經PMA及A23187處理的人類PBMC所放出的IFN-γ量的濃度為300000ng/mL以下作為特徵之抗體或該抗體之抗原結合性片段、以及將80%抑制濃度為2000ng/mL以下作為特徵之抗體或該抗體之抗原結合性片段亦包含於本發明之抗體。
又利用實驗動物的活體內之抗Orai1抗體之對移植物抗宿主病的治療或預防效果，例如可藉由測定人類PBMC移入小鼠移植物抗宿主病模型中的體重減少之抑制來確認。即，於對為重度免疫不全小鼠的NOG小鼠或NSG小鼠照射2.0Gy之X射線的翌日，將1mL中含有1千5百萬個至5千萬個之人類PBMC的PBS溶液，自尾靜脈於每一隻小鼠移入200μL。將未移入人類PBMC的X射線照射小鼠組作為非移植物抗宿主病組，將移入人類PBMC且僅投予抗體之基材液的組作為移植物抗宿主病組，藉由於人類PBMC移入前或移入後將抗Orai1抗體作尾靜脈 內投予或腹腔內投予，而測定對移植物抗宿主病組之體重減少的抑制效果。
再者，抗Orai1抗體之對各種疾病的治療或預防效果亦可藉由使用人類Orai1植入(knock-in)小鼠的以下之活體內評價系統來確認。
對皮膚炎的效果係於藉由下述而發病的皮膚炎，在抗Orai1抗體組與非投予組間以比較耳殼之厚度、背部之皮膚炎的肉眼分數、血液或組織中之抗體‧細胞激素‧血中生物標記濃度、自皮膚‧末梢血‧胸腺‧脾臟‧淋巴節‧骨髓所獲得的細胞之增殖活性‧細胞激素產生能力‧表面抗原來評價：對小鼠之腹腔內或靜脈內投予蛋白質抗原液，再於2週後施予追加免疫後，藉由將相同蛋白質抗原液以每3日~2週重複3~6次塗布於耳或背部而使其發病的皮膚炎。
對搔癢的效果係將以每3日~2週重複3~6次塗布蟎蜱(mite)抗原乳霜於耳殼或背部、或者以每日~每週1次塗布半抗原類於耳殼或腹部或背部、或者於耳殼皮內或背部皮下或蜘蛛膜下腔內投予搔癢誘發物質等之方法而誘導的搔癢行動，藉由裝載於小鼠之兩腳背的磁石與搔癢行動測定裝置的搔癢次數的測定、或檢查皮膚‧末梢血‧脊髓組織之病理特徵而加以定量化，於抗Orai1抗體組與非投予組間加以比較來評價。
對乾癬的效果係將以於耳殼兩側或單側及及已剃毛的背部塗布咪喹莫特(Imiquimod)、腹腔內投予酵母聚糖(Zymosan)懸浮液、對小鼠耳殼單側皮內投予 IL-23等之細胞激素等之方法而誘導的乾癬性皮膚炎，藉由炎症部位之重量、厚度、浸潤於此部位的嗜中性球之髓過氧化酶(myeloperoxidase)活性、浸潤的細胞之流式細胞儀解析、基因解析、細胞激素濃度等之測定加以定量化，於抗Orai1抗體組與非投予組間加以比較而評價。
對多發性硬化症的效果係將藉由下述而誘導的實驗性腦脊髓炎，將由實驗開始1週至2週後發病的尾巴擴散至下肢、前肢的麻痺症狀以肉眼的觀察加以分數化，於抗Orai1抗體組與非投予組間加以比較而評價：藉由使髓磷質寡樹突膠細胞醣蛋白(Myelin oligodendrocyte glycoprotein)或其部分胜肽抗原溶液與等量之弗氏完全佐劑水溶液混合而乳化，對小鼠之脇腹或腹部作皮內投予，之後將百日咳毒素水溶液對尾靜脈投予，再數日後再次將百日咳毒素液對尾靜脈投予而誘導的實驗性腦脊髓炎。
對關節炎的效果係將牛II型膠原蛋白與弗氏完全佐劑混合而乳化者投予至小鼠之尾根部皮內，2~3週後進行相同投予，之後之關節腫脹之分數化、血液或組織中之抗體‧細胞激素‧血中生物標記濃度、自皮膚‧末梢血‧胸腺‧脾臟‧淋巴節‧骨髓所獲得的細胞之增殖活性‧細胞激素產生能力‧表面抗原等，於抗Orai1抗體組與非投予組間加以比較而評價。
對大腸炎的效果係藉由將三硝基苯磺酸投予至24小時斷食下之小鼠腸管內、將1-10%之葡聚糖硫酸鈉水溶液由給水瓶使其自由飲水4日至2週、將自人類Orai1 植入小鼠之淋巴節與脾臟所採取純化的CD4+CD25-CD45RBhi T-細胞移入至Rag2-/-小鼠之腹腔內等之方法而誘導大腸炎，將觀察期間中之體重、利用試驗結束後之剖檢的腸管之肥厚度‧息肉個數及大小‧病理的特徵、血液或組織中之抗體‧細胞激素‧血中生物標記濃度、自腸管‧末梢血‧胸腺‧脾臟‧淋巴節‧骨髓所獲得的細胞之增殖活性‧細胞激素產生能力‧表面抗原等，於抗Orai1抗體組與非投予組間加以比較而評價。
對全身性紅斑狼瘡的效果係藉由將卵白蛋白或其他非刺激性之抗原以5~10日間隔最大15次投予至腹腔內或皮下而誘導全身性紅斑狼瘡樣症狀，將觀察期間中經時採取的血液或組織中之抗體‧細胞激素‧血中生物標記濃度、尿中之抗體價或生物標記濃度、自試驗結束後採取的脾臟‧淋巴節等之臟器調製細胞而移入無處置之小鼠所引起的症狀等，於抗Orai1抗體組與非投予組間加以比較而評價。
對肝炎的效果係藉由將D-半乳糖胺單獨或與脂多醣(lipopolysaccharide)組合而投予至小鼠之腹腔內、將伴刀豆球蛋白A(concanavalin A)單獨投予至尾靜脈內等之方法而誘導肝炎，將於起因物質投予之1小時~1週後採取的血液中之GOT及GPT濃度或肝病變之組織病理學的狀態，於抗Orai1抗體組與非投予組間加以比較而評價。
對骨髓細胞移植中的生著率或移植物抗宿主 病預防的效果係將自人類Orai1植入小鼠之大腿骨或脛骨所採取的骨髓內之細胞，單獨或與由人類Orai1植入小鼠之脾臟所採取的脾臟細胞組合，移入X射線照射接受者小鼠，將4至16週之體重變化或生存率、試驗結束時之血液或組織中之抗體‧細胞激素‧血中生物標記濃度、自腸管‧末梢血‧胸腺‧脾臟‧淋巴節‧骨髓所獲得的細胞之表面抗原‧增殖活性‧細胞激素產生能力於抗Orai1抗體組與非投予組間加以比較來評價。
對移植臟器之生著率的效果係將自宿主小鼠之尾根部採取的皮膚，固定於將皮膚切除而使露出的人類Orai1植入小鼠之背部皮肌層，將自移植後4至16週之移植片之大小與生著狀態分數化，於抗Orai1抗體組與非投予組間加以比較而評價。
如此獲得的中和Orai1之生物活性的抗體有用於作為醫藥，尤其是有用於作為用以預防或治療移植物之排斥、免疫相關疾病、過敏性疾病、炎症性疾病、抗血小板或抗血栓活性、或癌症等之抗體。
抗Orai1抗體就一例而言，對移植物之排斥、免疫相關疾病、過敏性疾病、炎症性疾病、抗血小板或抗血栓活性、或癌症之治療或預防，可以該抗體單獨、或者與至少一種之其他治療劑併用而投予。就可與抗Orai1抗體併用而投予的其他治療劑而言，可列舉葉酸代謝拮抗劑、鈣調神經磷酸酶(calcineurin)抑制劑、副腎皮質類固醇劑、抗胸腺細胞球蛋白劑、核酸代謝拮抗劑、核酸合成抑制劑、以細胞表面抗原為標的的生物製劑、 或者以細胞激素或細胞激素受體為標的的生物製劑等，但未限定於此等。
就上述之治療劑之具體例而言，作為葉酸代謝拮抗劑，可列舉胺甲喋呤(Methotrexate)，作為鈣調神經磷酸酶抑制劑，可列舉環孢素(Cyclosporin)、他克莫司(Taclorims)，作為副腎皮質類固醇劑，可列舉甲基培尼皮質醇(Methylprednisolone)，作為核酸合成抑制劑，可列舉環磷醯胺(Cyclophosphamide)，作為抗胸腺細胞球蛋白劑，可列舉Zetbulin、桑斯達馬抗人類胸腺細胞免疫球蛋白(Lymphoglobuline)、兔抗胸腺細胞免疫球蛋白(Thymoglobulin)，作為核酸代謝拮抗劑，可列舉黴酚酸酯(Mycophenolate mofetil)，作為以細胞表面抗原為標的的生物製劑，可列舉阿來組單抗(Alemtuzumab)、利妥昔單抗(Rituximab)，作為以細胞激素或細胞激素受體為標的的生物製劑，可列舉英夫利昔單抗(Infliximab)、恩博(Etanercept)、利妥昔單抗等等。
依據針對移植物之排斥、免疫相關疾病、過敏性疾病、炎症性疾病、抗血小板或抗血栓活性、或癌症之狀態或何種程度之治療及/或預防，亦可投予2、3或其以上之種類之其他治療劑，彼等之其他治療劑可藉由封入相同製劑中而同時地投予。亦可藉由將其他治療劑與抗Orai1抗體封入相同製劑中而同時投予。又，亦可將抗Orai1抗體與其他治療劑封入各別製劑而同時投予。再者，亦可將其他治療劑與抗Orai1抗體互為前後地各別投予。即，於投予其他治療劑後，投予含有抗Orai1抗體或 該抗體之抗原結合性片段作為有效成分的治療劑，或者可於投予含有抗Orai1抗體或該抗體之抗原結合性片段作為有效成分的治療劑後投予其他治療劑。於基因治療進行投予的情形，蛋白質性之治療劑之基因與抗Orai1抗體之基因可插入各別或相同啟動子區域之下游，而可導入至各別或相同載體。
藉由使治療劑對於抗Orai1抗體、或其片段結合，可製造M.C.Garnet「Targeted drug conjugates：principles and progress」,Advanced Drug Delivery Reviews,(2001)53,171-216記載之標的型藥物複合體。於此目的，除了抗體分子，只要T細胞之辨識性未完全消失，亦可適用任一種之抗體片段，但例如，可列舉Fab、F(ab’)2、Fv等之片段作為例子，於本發明亦同樣地，可使用抗體及該片段。抗Orai1抗體或該抗體之片段與治療劑之結合樣式可為M.C.Garnet「Targeted drug conjugates：principles and progress」,Advanced Drug Delivery Reviews,(2001)53,171-216、G.T.Hermanson「Bioconjugate Techniques」Academic Press,California(1996)、Putnam and J.Kopecek「Polymer Conjugates with Anticancer Activity」Advances in Polymer Science(1995)122,55-123等記載的各種形態。即，可列舉使抗Orai1抗體與治療劑為化學性地直接結合或隔著寡肽等之間隔物而結合的樣式、或者隔著適當藥物擔體(drug carrier)而結合的樣式。就藥物擔體之例而言，可列舉微脂體或水溶性高分子。作為此等隔著藥物擔體的 樣式，更具體而言，可列舉抗體與治療劑被包含於微脂體，且該微脂體與抗體結合的樣式；及治療劑與水溶性高分子(分子量1000至10萬左右之化合物)化學性地直接結合或者隔著寡肽等之間隔物而結合，而該水溶性高分子與抗體結合的樣式作為例子。抗體(或該片段)與治療劑、微脂體及水溶性高分子等之藥物擔體之結合，可藉由G.T.Hermanson「Bioconjugate Techniques」Academic Press,California(1996)、Putnam and J.Kopecek「Polymer Conjugates with Anticancer Activity」Advances in Polymer Science(1995)122,55-123記載之方法等之本技術領域中具有通常知識者周知之方法而實施。將治療劑包含於微脂體，可藉由D.D.Lasic「Liposomes：From Physics to Applications」,Elsevier Science Publishers B.v.,Amsterdam(1993)等記載之方法等之本技術領域中具有通常知識者周知之方法來實施。治療劑之對水溶性高分子之結合，可藉由D.Putnam and J Kopecek「Polymer Conjugates with Anticancer Activity」Advances in Polymer Science(1995)122,55-123記載之方法等之本技術領域中具有通常知識者周知之方法來實施。抗體(或該片段)與蛋白質性之治療劑(或該片段)之複合體，除了上述之方法外，亦可藉由基因工程上本技術領域中具有通常知識者周知之方法來製作。
本發明亦提供含有治療及/或預防上有效量之抗Orai1抗體與藥學上可容許的稀釋劑、載劑(carrier)、可溶化劑、乳化劑、保存劑及/或輔助劑的醫藥組成物。
本發明亦提供含有治療及/或預防上有效量之抗Orai1抗體與治療及/或預防上有效量之至少一種之治療劑與藥學上可容許的稀釋劑、載劑、可溶化劑、乳化劑、保存劑及/或輔助劑的醫藥組成物。就治療劑而言，可列舉先前所述的葉酸代謝拮抗劑、鈣調神經磷酸酶抑制劑、副腎皮質類固醇劑、抗胸腺細胞球蛋白劑、核酸代謝拮抗劑、核酸合成抑制劑、以細胞表面抗原為標的的生物製劑、或者以細胞激素或細胞激素受體為標的的生物製劑等，但未限定於此等。
就於本發明之醫藥組成物可容許的製劑所使用的物質而言，較佳於投予量或投予濃度，對被投予醫藥組成物者為非毒性者為較佳。
本發明之醫藥組成物可含有用以改變、或保持pH、滲透壓、黏度、透明度、顏色、等張性、無菌性、安定性、溶解率、緩釋率、吸收率、浸透率之製劑用之物質。就製劑用之物質而言，可列舉以下各者，但未限定於此等：甘胺酸、丙胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、精胺酸或離胺酸等之胺基酸類、抗菌劑、抗壞血酸、硫酸鈉或亞硫酸氫鈉等之抗氧化劑、磷酸、檸檬酸、硼酸緩衝液、碳酸氫鈉、參(羥甲)胺甲烷-鹽酸(Tris-HCl)溶液等之緩衝劑、甘露醇或甘胺酸等之填充劑、乙二胺四乙酸(EDTA)等之螯合劑、咖啡因、聚乙烯吡咯啶(polyvinylpyrrolidine)、β-環糊精或羥丙基-β-環糊精等之錯合劑、葡萄糖、甘露糖或糊精等之增量劑、單糖類、雙糖類等之其他碳水化合物、著色劑、香味劑、稀釋劑 、乳化劑或聚乙烯吡咯啶等之親水聚合物、低分子量多胜肽、鹽形成對離子、氯化苄烷銨(benzalkonium chloride)、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙醇、對羥苯甲酸甲酯(methylparaben)、對羥苯甲酸丙酯、洛赫西定(chlorhexidine)、山梨酸或過氧化氫等之防腐劑、甘油、丙二醇或聚乙二醇等之溶媒、甘露醇或山梨醇等之糖醇、懸浮劑、山梨醇酐酯(sorbitan ester)、聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80等之聚山梨醇酯、Triton、三木甲胺克妥洛(tromethamine)、卵磷脂或膽固醇等之界面活性劑、蔗糖或山梨醇等之安定化增強劑、氯化鈉、氯化鉀或甘露醇‧山梨醇等之彈性增強劑、輸送劑、賦形劑、及/或藥學上之輔助劑。此等之製劑用之物質之添加量較佳為相對於抗Orai1抗體之重量添加0.01~100倍，特加為添加0.1~10倍。製劑中之適合的醫藥組成物之組成可由本技術領域中具有通常知識者因應適用疾病、適用投予路徑等而適宜決定。
醫藥組成物中之賦形劑或載劑可為液體或為固體。適當的賦形劑或載劑可為注射用之水或生理食鹽水、人工腦脊髓液或非經口投予所通常使用的其他物質。亦可於載劑使用中性之生理食鹽水或含血清白蛋白的生理食鹽水。醫藥組成物中可含有pH7.0-8.5之Tris緩衝液、pH4.0-5.5之乙酸緩衝液、pH3.0-6.2之檸檬酸緩衝液。又，此等之緩衝液中亦可含有山梨醇或其他化合物。於本發明之醫藥組成物可列舉含有抗Orai1抗體的醫藥組成物以及含有抗Orai1抗體及至少一種之治療劑的醫 藥組成物，本發明之醫藥組成物就具有所選擇的組成與必要純度的藥劑而言，可製備為冷凍乾燥品或液體。含抗Orai1抗體的醫藥組成物以及含抗Orai1抗體及至少一種之骨代謝異常治療藥劑的醫藥組成物亦可成型為使用蔗糖之類的適當賦形劑的冷凍乾燥品。
本發明之醫藥組成物可調製為非經口投予用，亦可調製為藉由經口之消化道吸收用。製劑之組成及濃度可依投予方法來決定，本發明之醫藥組成物中所含的抗Orai1抗體之對Orai1的親和性，即，相對於對Orai1的解離常數(Kd值)，親和性越高(Kd值越低)者，即使減少對人類的投予量亦可發揮藥效，故基於此結果亦可決定本發明之醫藥組成物之對人的投予量。投予量於將人型抗Orai1抗體對人類投予之際，將約0.1~100mg/kg於1~180日投予1次即可。
就本發明之醫藥組成物之形態而言，可列舉含點滴的注射劑、栓劑、經鼻劑、舌下劑、經皮吸收劑等。
雖然被承認的抗體製劑大部分為靜脈內投予，但於多數之醫療現場，皮下投予為更佳。於此情形，因容量被限制於1.0~1.5mL，依投予量而要求高濃度之抗體溶液。然而，因高濃度化時，藥液之黏性會增加，產生所謂以通常使用的注射針的寬度，由於其高黏性而無法注射的事態。即，就醫藥組成物之形態而言，選擇注射劑的情形，有所謂黏度低的性質應被優先的重要意義，而可將黏度作為指標來選擇適合的抗體。
[實施例]
以下，藉由實施例而具體說明本發明，但本發明並未限定於此等。又，於下述實施例，關於基因操作之各操作只要未特別明示，係藉由「分子選殖(Molecular Cloning)」(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.及Maniatis,T.著，Cold Spring Harbor Laboratory Press於1989年發行)記載之方法來進行，或者於使用市售試藥或套組的情形，係依據市售品之指示書來使用。
[實施例1]大鼠抗人類Orai1抗體之製作
1)-1 免疫
1)-1-1 人類Orai1表現載體(pcDNA3.1-hOrai1)之構築
人類Orai1之基因序列係購入被選殖於pDONR221(Life Technologies公司)的Ultimate ORF選殖株(選殖株No.IOH40869，Life Technologies公司)來使用。將基因序列示於序列表之序列識別號1，又將胺基酸序列示於序列表之序列識別號2。又，將pcDNA3.1(+)藉由Gateway Vector Conversion System(Life Technologies公司)製作經改變成目的載體(Destination Vector)的pcDNA3.1-DEST。使用Gateway LR Clonase Enzyme mix(Life Technologies公司)，將pcDNA3.1-DEST與att序列內重組，而製作人類Orai1表現載體pcDNA3.1-hOrai1。於人類Orai1表現載體之大量調製，使用EndoFree Plasmid Giga套組(QIAGEN公司)。
1)-1-2 大鼠免疫
於免疫係使用WKY/Izm大鼠之雌鼠(Japan SLC公司) 。首先，將大鼠雙足下腿部以玻尿酸酶(SIGMA-ALDRICH公司)前處理後，於同部位將pcDNA3.1-hOrai1進行肌肉注射。接著，使用ECM830(BTX公司)，使用2針電極，於同部位實施活體內電穿孔。二週一次，重複相同之活體內電穿孔後，採取大鼠淋巴節而用於融合瘤製作。
1)-2 融合瘤製作
將淋巴節細胞與小鼠骨髓瘤SP2/0-ag14細胞，使用Hybrimune Hybridoma Production System(Cyto Pulse Sciences公司)而電細胞融合，稀釋於ClonaCell-HY Selection Medium D(StemCell Technologies公司)而培養。藉由回收出現的融合瘤株而製作單株融合瘤。培養所回收的各融合瘤株，使用獲得的融合瘤培養上清液而進行抗人類Orai1抗體產生融合瘤之篩選。
1)-3 利用Cell-ELISA法之一次篩選
1)-3-1 Cell-ELISA用抗原基因表現細胞之調製
將HEK293細胞以於含10% FBS的DMEM培養基中成為7.5x105個細胞/mL的方式調製。對此，依據使用Lipofectamine 2000的轉染順序，導入pcDNA3.1-hOrai1或作為對照組之pcDNA3.1-DEST，各分注50μl於96-孔盤(Corning公司)，於含10% FBS的DMEM培養基中、37℃、5% CO2之條件下培養二晚。將獲得的導入細胞直接以接著狀態，使用於Cell-ELISA。
1)-3-2 Cell-ELISA
去除實施例1)-1-1所調製的表現載體導入HEK293細胞之培養上清液後，各自對pcDNA3.1-hOrai1或pcDNA3.1 -DEST導入HEK293細胞添加融合瘤培養上清液，於4℃靜置1小時。將孔中之細胞以含有5% FBS的PBS洗淨1次後，添加以含5% FBS的PBS稀釋500倍的於兔生產的抗大鼠IgG-過氧化酶抗體(Anti-Rat IgG-Peroxidase antibody produced in rabbit(SIGMA公司))，於4℃靜置1小時。將孔中之細胞以含5% FBS的PBS洗淨6次後，以25μL/孔添加OPD顯色液(於OPD溶解液(0.05M檸檬酸3鈉、0.1M磷酸氫2鈉‧12水pH4.5)溶解o-伸苯二胺二鹽酸鹽(和光純藥公司)、H2O2使各成為0.4mg/mL、0.6%(v/v))。一邊不時地攪拌一邊進行顯色反應，以25μL/孔添加1M HCl而使顯色反應停止後，以平盤讀取機(plate reader)(ENVISION：PerkinElmer公司)測量490nm之吸光度。為了選擇產生與細胞膜表面上表現的人類Orai1特異性地結合的抗體之融合瘤，與對照組之pcDNA3.1-DEST導入HEK293細胞作比較，將產生「顯示較pcDNA3.1-hOrai1表現載體導入HEK293細胞者顯示更高吸光度的培養上清液」的融合瘤，選擇作為抗人類Orai1抗體產生陽性。
1)-4 利用流式細胞儀的二次篩選
1)-4-1 流式細胞儀解析用抗原基因表現細胞之調製
將HEK293T細胞以成為5×104個細胞/cm2的方式接種於225平方cm燒瓶，於含10% FBS的DMEM培養基中，於37℃、5% CO2之條件下培養一晚。翌日，各自將pcDNA3.1-hOrai1及作為對照組之pcDNA3.1-DEST，使用Lipofectamine 2000導入至HEK293T細胞，於37℃、5% CO2之條件下再培養二晚。翌日，將表現載體導入 HEK293T細胞以TrypLE Express(Life Technologies公司)處理，以含10%FBS的DMEM將細胞洗淨後，懸浮於含5% FBS的PBS。將獲得的細胞懸浮液使用於流式細胞儀解析。
1)-4-2 流式細胞儀解析
將於實施例1)-3之Cell-ELISA判定為陽性的融合瘤所產生的抗體之對人類Orai1的結合特異性，藉由流式細胞儀法而進一步確認。將實施例1)-4-1調製的HEK293T細胞懸浮液離心，去除上清液後，各自對pcDNA3.1-DEST導入HEK293T細胞及pcDNA3.1-hOrai1導入HEK293T細胞添加融合瘤培養上清液而懸浮，於4℃靜置1小時。以含5% FBS的PBS洗淨1次後，添加以含5% FBS的PBS稀釋500倍的抗大鼠IgG FITC結合物(Anti-Rat IgG FITC conjugate)(SIGMA公司)而懸浮，並於4℃靜置1小時。以含5% FBS的PBS洗淨3次後，再懸浮於含2μg/mL 7-胺基放線菌素D(Molecular Probes公司)的含5% FBS的PBS，以流式細胞儀(FC500：BeckmanCoulter公司)進行檢測。資料解析係以Flowjo(TreeStar公司)進行。將7-胺基放線菌素D陽性之死細胞以柵門除外後，作成活細胞之FITC螢光強度的直方圖。取得產生「相對於為對照組的pcDNA3.1-DEST導入HEK293T細胞之螢光強度直方圖，pcDNA3.1-hOrai1導入HEK293T細胞之直方圖位移至強螢光強度側的樣品」的融合瘤，作為抗人類Orai1抗體產生融合瘤。作為結果，取得有意義地位移的融合瘤225個。
1)-5 抗體之同型確定
自1)-4取得的大鼠抗人類Orai1抗體產生融合瘤之中，篩選強烈暗示與人類Orai1結合的R118及R198，鑑定抗體同型。同型係藉由大鼠單株分型試驗套組(Rat monoclonal isotyping test kit)(AbD Serotec公司)而確定。其結果顯示，大鼠抗人類Orai1單株抗體R118及R198之同型皆為IgG2a、κ鏈。
1)-6 大鼠抗人類Orai1抗體之調製
大鼠抗人類Orai1單株抗體係自融合瘤培養上清液純化。
首先，將R118及R198產生融合瘤，以ClonaCell-HY Selection Medium E使增殖至充分量後，將添加20%之Ultra Low IgG FBS(Life Technologies公司)的Hybridoma SFM(Life Technologies公司)作培養基交換，並培養5日。回收本培養上清液，並通過0.45μm之過濾器滅菌。
抗體係自上述之融合瘤上清液藉由Protein G親和性層析(4~6℃下)1階段步驟而純化。Protein G親和性層析純化後之緩衝液取代步驟係於4~6℃下實施。最初，於經PBS平衡化的填充Protein G(GE Healthcare Bioscience公司)之管柱中施加融合瘤之培養上清液。培養上清液全部置入管柱後，以管柱容量2倍以上之PBS將管柱洗淨。其次，以0.1M甘胺酸/鹽酸水溶液(pH2.7)洗提，收集含抗體的劃分。於收集的劃分中添加1M Tris-HCl(pH9.0)而調製為pH7.0~7.5後，以Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20(分劃分子量UF30K、Sartorius公司，4~6℃下)進行將緩衝液取代成PBS的同時，進行濃縮，將抗體 濃度調製為0.2mg/mL以上。最後，以Minisart-Plus filter(Sartorius公司)過濾，作為純化樣品。
[實施例2]大鼠抗人類Orai1抗體之活體外評價
2)-1 利用流式細胞儀的大鼠抗人類Orai1抗體之結合能力評價
為了評價對Orai1的結合特異性，將藉由1)-4-1所示方法製作的pcDNA3.1-DEST導入HEK293T細胞懸浮液或pcDNA3.1-hOrai1導入HEK293T細胞懸浮液離心，去除上清液後，對各別添加1)-6製作的為大鼠抗人類Orai1單株抗體的R118、R198或大鼠IgG對照組抗體(Beckman Coulter公司)而懸浮，並於4℃靜置30分鐘。以含5% FBS的PBS洗淨2次後，添加以含5% FBS的PBS稀釋320倍的抗大鼠IgG FITC結合物而懸浮，並於4℃靜置30分鐘。以含5% FBS的PBS洗淨2次後，再懸浮於含1μg/mL碘化丙啶(Propidium iodide)(Life Technologies公司)的含5% FBS的PBS，以流式細胞儀(FC500)進行檢測。資料解析係以Flowjo進行。將碘化丙啶陽性之死細胞以柵門除外後，作成活細胞之FITC螢光強度之直方圖，算出平均螢光強度(MFI)。R118及R198未與pcDNA3.1-DEST導入HEK293T細胞結合，如第1圖所示，因僅對pcDNA3.1-hOrai1導入HEK293T細胞濃度依存性地結合，顯示特異性地與人類Orai1結合。另一方面，於大鼠IgG對照組抗體並未觀察到結合。
2)-2 大鼠抗人類Orai1抗體之T細胞活性化抑制作用
將為人類T細胞株的Jurkat細胞以含10% FBS、100U/mL盤尼西林及100μg/mL鏈黴素(Life Technologies公司)的RPMI1640(Life Technologies公司)調製為1.5x106個細胞/mL之濃度，各接種80μL於96-孔細胞培養盤，添加10μL/孔之為大鼠抗人類Orai1單株抗體的R118、R198、或大鼠IgG對照組抗體，並於37℃、5% CO2下作前處理60分鐘。之後，添加10μL/孔之100ng/mL PMA(SIGMA公司)及1μg/mL A23187(SIGMA公司)(最終濃度10ng/mL PMA及100ng/mL A23187)，充分攪拌後，於37℃、5% CO2下培養約16小時。將平盤充分攪拌後，以600g離心3分鐘，將含於上清液的介白素-2(IL-2)濃度以ELISA法(R & D公司)測定。第2圖表示取得的大鼠抗人類Orai1單株抗體係添加濃度依存性地抑制由經PMA及A23187處理的Jurkat細胞之IL-2的放出。R118及R198係添加濃度依存性地抑制自Jurkat細胞之IL-2的放出。另一方面，於大鼠IgG對照組抗體並未觀察到抑制。
[實施例3]編碼大鼠抗人類Orai1抗體之可變區的cDNA之核苷酸序列之確定
3)-1 cDNA合成
將R118及R198之各抗體產生融合瘤之細胞溶解液(50mM Tris-HCl(pH7.5)、250mM LiCl、5mM EDTA(pH8)、0.5%十二基硫酸Li(LiDS)、2.5mM二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT))，與結合有寡dT25的磁珠(Dynabeads mRNA DIRECT Kit、Invitrogen公司)混合，使mRNA與磁珠結合。其次，將磁珠以mRNA洗淨溶液 A(10mM Tris-HCl(pH7.5)、0.15M LiCl、1mM EDTA、0.1% LiDS、0.1% TritonX-100)及cDNA合成用溶液(50mM Tris-HCl(pH8.3)、75mM KCl、3mM MgC12、5mM DTT、0.5mM dNTP、0.2% TritonX-100、1.2單位RNase抑制劑(Life Technologies公司)各洗淨1次後，以添加12單位SuperScriptIII反轉錄酶(Life Technologies公司)的cDNA合成用溶液進行cDNA合成。接著，以3’加尾(tailing)反應溶液(50mM磷酸鉀、4mM MgCl2、0.5mM dGTP、0.2% TritonX-100、1.2單位RNase抑制劑(Life Technologies公司))洗淨後，以添加48單位末端轉移酶(Terminal Transferase，重組物(Roche公司))的反應溶液進行3’加尾反應。
3)-2 大鼠免疫球蛋白重、輕鏈可變區基因片段之放大及序列確定
將磁珠以TE溶液(10mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM EDTA、0.1% TritonX-100)洗淨後，使用5’-RACE PCR法而進行大鼠免疫球蛋白重鏈及輕鏈基因之放大。即，將磁珠移至PCR反應溶液(0.2μM引子、0.2mM dNTP、0.25單位PrimeSTAR HS DNA聚合酶(TAKARA公司))，將94℃ 30秒-68℃ 90秒之反應進行35次循環。使用的引子組如下述。
PCR引子組(重鏈用)
5’-GCTAGCGCTACCGGACTCAGATCCCCCCCCCCCCCDN-3’(Nhe-polyC-S)(序列識別號3)
5’-TCACTGAGCTGGTGAGAGTGTAGAGCCC-3’(rIg γ-AS1)(序列識別號4)
5’-TCACCGAGCTGCTGAGGGTGTAGAGCCC-3’(rIgγ-AS2)(序列識別號5)
PCR引子組(輕鏈用)
5’-GCTAGCGCTACCGGACTCAGATCCCCCCCCCCCCCDN-3’(Nhe-polyC-S)(序列識別號6)(與重鏈用相同)
5’-TCAGTAACACTGTCCAGGACACCATCTC-3’(rIgκ-AS)(序列識別號7)
針對藉由上述PCR反應放大的片段，實施鹼基序列之序列解析。各自使用作為重鏈用定序引子之具有5’-CTGGCTCAGGGAAATAGCC-3’(rIgγ-seq)(序列識別號8)的鹼基序列的寡核苷酸、作為輕鏈用定序引子之具有5’-TCCAGTTGCTAACTGTTCC-3’(rIgκ-seq)(序列識別號9)的鹼基序列的寡核苷酸。
序列解析係使用基因序列解析裝置(「ABI PRISM 3700 DNA Analyzer；Applied Biosystems」或「Applied Biosystems 3730xl Analyzer；Applied Biosystems」)來實施，定序反應係使用具有AmpliTaq DNA聚合酶之Dye Terminator Cycle Sequencing System(Life Technologies公司)及GeneAmp 9700(Applied Biosystems公司)。
將經確定的編碼R118及R198之重、輕鏈之可變區的核苷酸序列各自示於序列表之序列識別號10(R118輕鏈)、12(R118重鏈)序列識別號14(R198輕鏈)及16(R198重鏈)。又，將該可變區之胺基酸序列各自示 於序列表之序列識別號11(R118輕鏈)、13(R118重鏈)、序列識別號15(R198輕鏈)及17(R198重鏈)。各自將序列識別號10及11記載於第14圖，序列識別號12及13記載於第15圖，序列識別號14及15記載於第16圖，序列識別號16及17記載於第17圖。
[實施例4]人類嵌合化抗人類Orai1抗體之製作
4)-1嵌合化及人化輕鏈表現載體pCMA-LK之構築
將「使質體pcDNA3.3-TOPO/LacZ(Life Technologies公司)以限制酵素XbaI及PmeI消化而獲得的約5.4kb之片段」、及「含編碼序列表之序列識別號18所示的人類κ鏈分泌訊息及人類κ鏈恆定區的序列的DNA片段」，使用In-Fusion Advantage PCR選殖套組(CLONTECH公司)而結合，而製作pcDNA3.3/LK。
將pcDNA3.3/LK作為模板，以下述引子組進行PCR，將獲得的約3.8kb之片段磷酸化後，藉由自我連結(self-ligation)，構築於CMV啟動子之下游具有訊息序列、選殖位、及人類κ鏈恆定區的嵌合及人化抗體輕鏈表現載體pCMA-LK。
引子組
5‘-TATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGC-3’(序列識別號19：引子3.3-F1)
5‘-GCTATGGCAGGGCCTGCCGCCCCGACGTTG-3’(序列識別號20：引子3.3-R1)
4)-2 嵌合化及人化IgG1型重鏈表現載體pCMA-G1之構築
將「使pCMA-LK以XbaI及PmeI消化而去除κ鏈分泌訊息及人類κ鏈恆定區的DNA片段」、及「包含編碼序列表之序列識別號21所示人類重鏈訊息序列及人類IgG1恆定區之胺基酸的序列的DNA片段」，使用In-Fusion Advantage PCR選殖套組而結合，構築於CMV啟動子之下游具有訊息序列、選殖位、人類IgG1重鏈恆定區的嵌合及人化抗體IgG1型重鏈表現載體pCMA-G1。
4)-3 人類嵌合化抗人類Orai1抗體輕鏈表現載體之構築
4)-3-1 人類嵌合化R118輕鏈cR118_L表現載體之構築
合成含有實施例3)-2所獲得的R118輕鏈之可變區的DNA片段(GENEART公司 人工基因合成服務)。藉由於將嵌合化及人化抗體輕鏈表現泛用載體pCMA-LK以限制酵素XbaI及PmeI切斷而獲得的約3.4kb之DNA片段，使用Ligation High ver.2(TOYOBO公司)，使將含R118輕鏈之可變區的DNA片段以相同限制酵素切斷而獲得的約0.7kb之DNA片段插入，而構築人類嵌合化R118輕鏈(cR118_L)表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA-LK/cR118_L」。各自將編碼人類嵌合化cR118輕鏈的核苷酸序列及該輕鏈之胺基酸序列示於序列表之序列識別號22及23(第18圖)。
4)-3-2 人類嵌合化R198輕鏈cR198_L表現載體之構築
合成含有實施例3)-2所獲得的R198輕鏈之可變區的DNA片段(GENEART公司 人工基因合成服務)。藉由於將嵌合化及人化抗體輕鏈表現泛用載體pCMA-LK以限 制酵素XbaI及PmeI切斷而獲得的約3.4kb之DNA片段，使用Ligation High ver.2(TOYOBO公司)，使將含R198輕鏈之可變區的DNA片段以相同限制酵素切斷而獲得的約0.7kb之DNA片段插入，而構築人類嵌合化R198輕鏈(cR198_L)表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA-LK/cR198_L」。各自將編碼人類嵌合化cR198輕鏈的核苷酸序列及該輕鏈之胺基酸序列示於序列表之序列識別號24及25(第19圖)。
4)-4 人類嵌合化抗人類Orai1抗體重鏈表現載體之構築
4)-4-1 人類嵌合化R118重鏈cR118_H表現載體之構築
合成含實施例3)-2所獲得的R118重鏈之可變區的DNA片段(GENEART公司 人工基因合成服務)。藉由於將嵌合化及人化IgG1型重鏈表現載體pCMA-G1以限制酵素BlpI切斷而獲得的約4.5kb之DNA片段，使用Ligation High ver.2，使將含R118重鏈之可變區的DNA片段以相同限制酵素切斷而獲得的約0.3kb之DNA片段插入，而構築人類嵌合化R118重鏈(cR118_H)表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA-G1/cR118_H」。各自將編碼人類嵌合化cR118重鏈的核苷酸序列及該重鏈之胺基酸序列示於序列表之序列識別號26及27(第20圖)。
4)-4-2 人類嵌合化R198重鏈cR198_H表現載體之構築
合成含實施例3)-2所獲得的R198重鏈之可變區的DNA片段(GENEART公司 人工基因合成服務)。藉由於將嵌合化及人化IgG1型重鏈表現載體pCMA-G1以限制酵 素BlpI切斷而獲得的約4.5kb之DNA片段，使用Ligation High ver.2，使將含R198重鏈之可變區的DNA片段以相同限制酵素切斷而獲得的約0.3kb之DNA片段插入，而構築人類嵌合化R198重鏈(cR198_H)表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA-G1/cR198_H」。各自將編碼人類嵌合化cR198重鏈的核苷酸序列及該重鏈之胺基酸序列示於序列表之序列識別號28及29(第21圖)。
4)-5 人類嵌合化抗人類Orai1抗體之調製
4)-5-1 人類嵌合化抗人類Orai1抗體之生產
FreeStyle 293F細胞(Life Technologies公司)係依據手冊進行繼代、培養。
將對數增殖期之107個之FreeStyle 293F細胞(Life Technologies公司)接種於30mL瓶(Thermo Fisher公司)，以FreeStyle293表現培養基(Life Technologies公司)稀釋而調製為9mL後，於37℃、8% CO2培養箱內以135rpm振盪培養一小時。將聚乙亞胺(Polyscience # 24765)30μg溶解於Opti-Pro SFM(Life Technologies公司)500μL，其次將使用QIAGEN Plasmid Maxi Kit(QIAGEN公司)而調製的人類嵌合化抗人類Orai1抗體重鏈表現載體(4μg)及人類嵌合化抗人類Orai1抗體輕鏈表現載體(6μg)懸浮於500μL之Opti-Pro SFM。於聚乙亞胺/Opti-Pro SFM混合液500μL中，添加表現載體/Opti-Pro SFM混合液500μL並溫和地攪拌，再放置5分鐘後，添加至FreeStyle 293F細胞。將於37℃、8% CO2培養箱中以95rpm振盪培養5-7日而獲得的培養上清液以0.22μm Millex過濾器(Millipore公 司)過濾。
將藉由pCMA-G1/cR118_H與pCMA-LK/cR118_L之組合而取得的人類嵌合化R118命名為「cR118」。同樣地將藉由pCMA-G1/cR198_H與pCMA-LK/cR198_H之組合而取得的人類嵌合化R198命名為「cR198」。
4)-5-2 人類嵌合化抗人類Orai1抗體之純化
將4)-5-1所獲得的培養上清液以rProteinA親和性層析一階段步驟純化。最初，將培養上清液10mL施加於以PBS平衡化的MabSelectSuRe(GE Healthcare Bioscience公司)。培養液全部置入管柱後，以PBS 7mL將管柱洗淨。其次，以2M精胺酸-HCl pH4.0 5mL洗提，將其洗提液以PD-10脫鹽管柱(GE Healthcare Bioscience公司)取代為組胺酸緩衝液(25mM組胺酸、5%山梨糖醇(Sorbitor)、pH6.0)4mL。最後，以Amicon Ultracel 30K(分劃分子量30K，Millipore公司)濃縮至約100μL，並作為純化樣品。
[實施例5]人類嵌合化抗人類Orai1抗體之活體外活性
5)-1 利用流式細胞儀之人類嵌合化抗人類Orai1抗體的抗原結合活性
為了評價對人類Orai1的結合特異性，將依1)-4-1所示方法製作的pcDNA3.1-DEST導入HEK293T細胞懸浮液或pcDNA3.1-hOrai1導入HEK293T細胞懸浮液離心，去除上清液後，各自對其添加4)-5所製作的為人類嵌合化抗人類Orai1抗體的cR118、cR198、或人類IgG對照組抗體(Jackson Immunoresearch公司)而懸浮，並於4℃靜置30 分鐘。以含5% FBS的PBS洗淨2次後，添加以含5% FBS的PBS稀釋100倍的抗人類IgG FITC結合物(Anti-human IgG FITC conjugate)(Jackson Immunoresearch公司)而懸浮，並於4℃靜置30分鐘。以含5% FBS的PBS洗淨2次後，再懸浮於含1μg/mL碘化丙啶(Invitrogen公司)的含5% FBS的PBS，以流式細胞儀(FC500)進行檢測。資料解析係以Flowjo進行。將碘化丙啶陽性之死細胞以柵門除外後，作成活細胞之FITC螢光強度的直方圖，而算出平均螢光強度(MFI)。cR118及cR198未與pcDNA3.1-DEST導入HEK293T細胞結合，如第3圖所示，因僅與pcDNA3.1-hOrai1導入HEK293T細胞濃度依存性地結合，而顯示特異性地與人類Orai1結合。另一方面，於人類IgG對照組抗體未觀察到結合。
5)-2 人類嵌合化抗人類Orai1抗體之人類T細胞株活性化抑制作用
將為人類T細胞株的Jurkat細胞以含10% FBS、100U/mL盤尼西林及100μg/mL鏈黴素的RPMI1640調製為1.5x106個細胞/mL之濃度，於96-孔細胞培養盤中各接種80μL，以10μL/孔添加為人類嵌合化抗人類Orai1抗體的cR198及cR118及親代抗體之R198、R118、或人類IgG對照組抗體，並於37℃、5% CO2下作60分鐘前處理。之後，以10μL/孔添加100ng/mL PMA及1μg/mL A23187，並充分攪拌後，於37℃、5% CO2下培養約16小時。將平盤充分攪拌後，以600g離心3分鐘，並將上清液所含的IL-2濃度以ELISA法測定。第4圖表示製作的人類嵌合化抗人 類Orai1抗體係添加濃度依存性地抑制自經PMA及A23187處理的Jurkat細胞之IL-2的放出。cR118及cR198係添加濃度依存性地抑制自Jurkat細胞之IL-2的放出，其抑制強度與為親代抗體的R198相等。另一方面，於人類IgG對照組抗體未觀察到抑制。
[實施例6]人類嵌合化抗人類Orai1抗體cR198之人化改型hR198之設計
6)-1 R198之可變區之分子模擬
cR198之可變區之分子模擬係藉由作為同源性模擬之一般周知之方法(Methods in Enzymology,203,121-153,(1991))來實行。將於蛋白質資料庫(Protein Data Bank)(Nuc.Acid Res.28,235-242(2000))登錄的人類免疫球蛋白之可變區之1次序列(由X射線結晶構造可取得誘導的三維結構係)，與上述確定的R198之可變區比較。作為結果，1AJ7對cR198之輕鏈之可變區具有最高序列同源性而被選擇。又，1XGY對cR198之重鏈之可變區具有最高序列同源性而被選擇。框架區域之三維結構係藉由下述而製作：組合對應於cR198之輕鏈及重鏈的1AJ7及1XGY之座標，而獲得「框架模型」。cR198之CDR係依據Thornton et al.(J.Mol.Biol.,263,800-815,(1996))之分類，CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1及CDRH2被各自分類為群集(cluster)11A、7A、9A、10A、10A。CDRH3係使用H3規則(FEBS letter 399,1-8(1996))，被分類為k(6)-。其次，將關於各自之CDR之代表的構形組入框架模型。
最後，於能量的觀點，為了獲得具有cR198之可變區的可能性的分子模型，進行用以去除不利的原子間接觸的能量計算。將上述順序使用市售之蛋白質立體構造預測程式Prime及構形探索程式MacroModel(Schrödinger，LLC)來進行。
6)-2 對於人化R198的胺基酸序列之設計
將人化R198抗體之構築，藉由作為CDR接枝(CDR grafting)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029-10033(1989))之一般周知方法來進行。接受者抗體係基於框架區域內之胺基酸同源性而被選擇。
將cR198之框架區域的序列，與抗體之胺基酸序列之Kabat資料庫(Nuc.Acid Res.29,205-206(2001))全部之人類框架作比較，作為結果，1C10’CL抗體係由於關於框架區域之71%之序列同源性而被選擇作為接受者。使關於1C10’CL之框架區域之胺基酸殘基，與關於cR198之胺基酸殘基並列，鑑定出使用相異的胺基酸的位置。此等之殘基之位置，使用上述構築的cR198之三維模型而被分析，而且應被接枝於接受者上的供給者殘基係依據Queen等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029-10033(1989))賦予的基準而被選擇。
藉由將經選擇的一些供給者殘基移入至接受者抗體，將人化R198序列以如以下實施例記載的方式構築。
又，將cR198之各CDR、FR中之1至5個之胺基酸殘基，取代為cR118之胺基酸殘基的CDR改造人化R198序列亦以如以下之實施例記載的方式構築。
6)-3 人化R198輕鏈hR198_L之設計
6)-3-1 hR198_L1型輕鏈：
將伴隨下列設計的人化R198輕鏈命名為「hR198_L1型輕鏈」：將序列表之序列識別號25所示的cR198輕鏈之胺基酸編號第30號之蘇胺酸殘基取代為絲胺酸殘基、第32號之脯胺酸殘基取代為絲胺酸殘基、第35號之白胺酸殘基取代為纈胺酸殘基、第37號之麩胺酸殘基取代為天冬胺酸殘基、第42號之絲胺酸殘基取代為蘇胺酸殘基、第61號之天冬胺酸殘基取代為甘胺酸殘基、第62號之甘胺酸殘基取代為離胺酸殘基、第63號之絲胺酸殘基取代為丙胺酸殘基、第64號之纈胺酸殘基取代為脯胺酸殘基、第92號之絲胺酸殘基取代為蘇胺酸殘基、第94號之絲胺酸殘基取代為蘇胺酸殘基、第96號之蘇胺酸殘基取代為絲胺酸殘基、第99號之麩胺酸殘基取代為麩醯胺酸殘基、第100號之絲胺酸殘基取代為脯胺酸殘基、第120號之蘇胺酸殘基取代為麩醯胺酸殘基、第124號之白胺酸殘基取代為纈胺酸殘基、第126號之白胺酸殘基取代為異白胺酸殘基、第127號之精胺酸殘基取代為離胺酸殘基、第129號之丙胺酸殘基取代為蘇胺酸殘基。
編碼hR198_L1型輕鏈的核苷酸序列係序列表之序列識別號30，編碼訊息序列被切除的成熟輕鏈者為核苷酸編號61至702，編碼可變區者為核苷酸編號61至378。又，hR198_L1型輕鏈之胺基酸序列係序列表之序列識別號31，訊息序列被切除的成熟輕鏈係包含其胺基酸編號21至234，可變區係包含其胺基酸編號21至126。再者， 序列識別號30及31之序列亦各自記載於第22圖。各CDR序列及對應的序列識別號係示於第38圖。
6)-3-2 hR198_L2型輕鏈：
將伴隨下列設計的人化R198輕鏈命名為「hR198_L2型輕鏈」：將序列表之序列識別號25所示的cR198輕鏈之胺基酸編號胺基酸編號第30號之蘇胺酸殘基取代為絲胺酸殘基、第32號之脯胺酸殘基取代為絲胺酸殘基、第35號之白胺酸殘基取代為纈胺酸殘基、第37號之麩胺酸殘基取代為天冬胺酸殘基、第42號之絲胺酸殘基取代為蘇胺酸殘基、第61號之天冬胺酸殘基取代為甘胺酸殘基、第62號之甘胺酸殘基取代為離胺酸殘基、第63號之絲胺酸殘基取代為丙胺酸殘基、第92號之絲胺酸殘基取代為蘇胺酸殘基、第94號之絲胺酸殘基取代為蘇胺酸殘基、第96號之蘇胺酸殘基取代為絲胺酸殘基、第99號之麩胺酸殘基取代為麩醯胺酸殘基、第100號之絲胺酸殘基取代為脯胺酸殘基、第120號之蘇胺酸殘基取代為麩醯胺酸殘基、第124號之白胺酸殘基取代為纈胺酸殘基、第126號之白胺酸殘基取代為異白胺酸殘基、第127號之精胺酸殘基取代為離胺酸殘基、第129號之丙胺酸殘基取代為蘇胺酸殘基。
編碼hR198_L2型輕鏈的核苷酸序列為序列表之序列識別號32，編碼訊息序列被切除的成熟輕鏈者為核苷酸編號61至702，編碼可變區者為核苷酸編號61至378。又，hR198_L2型輕鏈之胺基酸序列為序列表之序列識別號33，訊息序列被切除的成熟輕鏈包含其胺基酸編號21 至234，可變區包含其胺基酸編號21至126。再者，序列識別號32及33之序列亦各自記載於第23圖。各CDR序列及對應的序列識別號係示於第38圖。
6)-3-3 hR198_L3型輕鏈：
將伴隨下列設計的人化R198輕鏈命名為「hR198_L3型輕鏈」：將序列表之序列識別號25所示的cR198輕鏈之胺基酸編號胺基酸編號第30號之蘇胺酸殘基取代為絲胺酸殘基、第32號之脯胺酸殘基取代為絲胺酸殘基、第35號之白胺酸殘基取代為纈胺酸殘基、第37號之麩胺酸殘基取代為天冬胺酸殘基、第42號之絲胺酸殘基取代為蘇胺酸殘基、第61號之天冬胺酸殘基取代為甘胺酸殘基、第62號之甘胺酸殘基取代為離胺酸殘基、第63號之絲胺酸殘基取代為丙胺酸殘基、第64號之纈胺酸殘基取代為脯胺酸殘基、第92號之絲胺酸殘基取代為蘇胺酸殘基、第94號之絲胺酸殘基取代為蘇胺酸殘基、第96號之蘇胺酸殘基取代為絲胺酸殘基、第99號之麩胺酸殘基取代為麩醯胺酸殘基、第100號之絲胺酸殘基取代為脯胺酸殘基、第114號之酪胺酸殘基取代為苯丙胺酸殘基、第120號之蘇胺酸殘基取代為麩醯胺酸殘基、第124號之白胺酸殘基取代為纈胺酸殘基、第126號之白胺酸殘基取代為異白胺酸殘基、第127號之精胺酸殘基取代為離胺酸殘基、第129號之丙胺酸殘基取代為蘇胺酸殘基。
編碼hR198_L3型輕鏈的核苷酸序列為序列表之序列識別號34，編碼訊息序列被切除的成熟輕鏈者為核苷酸編號61至702，編碼可變區者為核苷酸編號61至378。 又，hR198_L3型輕鏈之胺基酸序列為序列表之序列識別號35，訊息序列被切除的成熟輕鏈包含其胺基酸編號21至234，可變區包含其胺基酸編號21至126。再者，序列識別號34及35之序列亦各自記載於第24圖。各CDR序列及對應的序列識別號係示於第38圖。
6)-3-4 hR198_L4型輕鏈：
將伴隨下列設計的人化R198輕鏈命名為「hR198_L4型輕鏈」：將序列表之序列識別號25所示的cR198輕鏈之胺基酸編號胺基酸編號第30號之蘇胺酸殘基取代為絲胺酸殘基、第32號之脯胺酸殘基取代為絲胺酸殘基、第35號之白胺酸殘基取代為纈胺酸殘基、第37號之麩胺酸殘基取代為天冬胺酸殘基、第42號之絲胺酸殘基取代為蘇胺酸殘基、第61號之天冬胺酸殘基取代為甘胺酸殘基、第62號之甘胺酸殘基取代為離胺酸殘基、第63號之絲胺酸殘基取代為丙胺酸殘基、第92號之絲胺酸殘基取代為蘇胺酸殘基、第94號之絲胺酸殘基取代為蘇胺酸殘基、第96號之蘇胺酸殘基取代為絲胺酸殘基、第99號之麩胺酸殘基取代為麩醯胺酸殘基、第100號之絲胺酸殘基取代為脯胺酸殘基、第114號之酪胺酸殘基取代為苯丙胺酸殘基、第120號之蘇胺酸殘基取代為麩醯胺酸殘基、第124號之白胺酸殘基取代為纈胺酸殘基、第126號之白胺酸殘基取代為異白胺酸殘基、第127號之精胺酸殘基取代為離胺酸殘基、第129號之丙胺酸殘基取代為蘇胺酸殘基。
編碼hR198_L4型輕鏈的核苷酸序列為序列表之序列識別號36，編碼訊息序列被切除的成熟輕鏈者為核苷 酸編號61至702，編碼可變區者為核苷酸編號61至378。又，hR198_L4型輕鏈之胺基酸序列為序列表之序列識別號37，訊息序列被切除的成熟輕鏈包含其胺基酸編號21至234，可變區包含其胺基酸編號21至126。再者，序列識別號36及37之序列亦各自記載於第25圖。各CDR序列及對應的序列識別號係示於第38圖。
6)-4 人化R198重鏈hR198_H之設計
6)-4-1 hR198_H1型重鏈：
將伴隨下列設計的人化R198重鏈命名為「hR198_H1型重鏈」：將序列表之序列識別號29所示的cR198重鏈之胺基酸編號第24號之麩醯胺酸殘基取代為纈胺酸殘基、第30號之白胺酸殘基取代為纈胺酸殘基、第31號之丙胺酸殘基取代為離胺酸殘基、第35號之絲胺酸殘基取代為丙胺酸殘基、第37號之甲硫胺酸殘基取代為纈胺酸殘基、第39號之異白胺酸殘基取代為纈胺酸殘基、第56號之異白胺酸殘基取代為纈胺酸殘基、第57號之離胺酸殘基取代為精胺酸殘基、第59號之蘇胺酸殘基取代為丙胺酸殘基、第60號之蘇胺酸殘基取代為脯胺酸殘基、第86號之離胺酸殘基取代為精胺酸殘基、第95號之絲胺酸殘基取代為蘇胺酸殘基、第99號之苯丙胺酸殘基取代為酪胺酸殘基、第101號之麩醯胺酸殘基取代為麩胺酸殘基、第106號之蘇胺酸殘基取代為精胺酸殘基、第107號之脯胺酸殘基取代為絲胺酸殘基、第108號之天冬胺酸殘基取代為麩胺酸殘基、第110號之絲胺酸殘基取代為蘇胺酸殘基、第130號之纈胺酸殘基取代為蘇胺酸殘基、第131號之 甲硫胺酸殘基取代為白胺酸殘基。
編碼hR198_H1型重鏈的核苷酸序列為序列表之序列識別號38，編碼訊息序列被切除的成熟重鏈者為核苷酸編號58至1398，編碼可變區者為核苷酸編號58至408。又，hR198_H1型重鏈之胺基酸序列為序列表之序列識別號39，訊息序列被切除的成熟重鏈包含其胺基酸編號20至466，可變區包含其胺基酸編號20至136。再者，序列識別號38及39之序列亦各自被記載於第26圖。各CDR序列及對應的序列識別號係示於第38圖。
6)-4-2 hR198_H2型重鏈：
將伴隨下列設計的人化R198重鏈命名為「hR198_H2型重鏈」：將序列表之序列識別號29所示的cR198重鏈之胺基酸編號第24號之麩醯胺酸殘基取代為纈胺酸殘基、第30號之白胺酸殘基取代為纈胺酸殘基、第31號之丙胺酸殘基取代為離胺酸殘基、第35號之絲胺酸殘基取代為丙胺酸殘基、第37號之甲硫胺酸殘基取代為纈胺酸殘基、第39號之異白胺酸殘基取代為纈胺酸殘基、第57號之離胺酸殘基取代為精胺酸殘基、第59號之蘇胺酸殘基取代為丙胺酸殘基、第60號之蘇胺酸殘基取代為脯胺酸殘基、第86號之離胺酸殘基取代為精胺酸殘基、第95號之絲胺酸殘基取代為蘇胺酸殘基、第99號之苯丙胺酸殘基取代為酪胺酸殘基、第101號之麩醯胺酸殘基取代為麩胺酸殘基、第106號之蘇胺酸殘基取代為精胺酸殘基、第107號之脯胺酸殘基取代為絲胺酸殘基、第108號之天冬胺酸殘基取代為麩胺酸殘基、第110號之絲胺酸殘基取代為蘇 胺酸殘基、第130號之纈胺酸殘基取代為蘇胺酸殘基、第131號之甲硫胺酸殘基取代為白胺酸殘基。
編碼hR198_H2型重鏈的核苷酸序列為序列表之序列識別號40，編碼訊息序列被切除的成熟重鏈者為核苷酸編號58至1398，編碼可變區者為核苷酸編號58至408。又，hR198_H2型重鏈之胺基酸序列為序列表之序列識別號41，訊息序列被切除的成熟重鏈包含其胺基酸編號20至466，可變區包含其胺基酸編號20至136。再者，序列識別號40及41之序列亦各自被記載於第27圖。各CDR序列及對應的序列識別號係示於第38圖。
6)-4-3 hR198_H3型重鏈：
將伴隨下列設計的人化R198重鏈命名為「hR198_H3型重鏈」：將序列表之序列識別號29所示的cR198重鏈之胺基酸編號第24號之麩醯胺酸殘基取代為纈胺酸殘基、第30號之白胺酸殘基取代為纈胺酸殘基、第31號之丙胺酸殘基取代為離胺酸殘基、第35號之絲胺酸殘基取代為丙胺酸殘基、第37號之甲硫胺酸殘基取代為纈胺酸殘基、第39號之異白胺酸殘基取代為纈胺酸殘基、第50號之絲胺酸殘基取代為丙胺酸殘基、第56號之異白胺酸殘基取代為纈胺酸殘基、第57號之離胺酸殘基取代為精胺酸殘基、第59號之蘇胺酸殘基取代為丙胺酸殘基、第60號之蘇胺酸殘基取代為脯胺酸殘基、第67號之異白胺酸殘基取代為纈胺酸殘基、第70號之纈胺酸殘基取代為異白胺酸殘基、第81號之麩胺酸取代為丙胺酸殘基、第82號之離胺酸殘基取代為精胺酸殘基、第86號之離胺酸殘基 取代為精胺酸殘基、第95號之絲胺酸殘基取代為蘇胺酸殘基、第99號之苯丙胺酸殘基取代為酪胺酸殘基、第101號之麩醯胺酸殘基取代為麩胺酸殘基、第106號之蘇胺酸殘基取代為精胺酸殘基、第107號之脯胺酸殘基取代為絲胺酸殘基、第108號之天冬胺酸殘基取代為麩胺酸殘基、第110號之絲胺酸殘基取代為蘇胺酸殘基、第130號之纈胺酸殘基取代為蘇胺酸殘基、第131號之甲硫胺酸殘基取代為白胺酸殘基。
編碼hR198_H3型重鏈的核苷酸序列為序列表之序列識別號42，編碼訊息序列被切除的成熟重鏈者為核苷酸編號58至1398，編碼可變區者為核苷酸編號58至408。又，hR198_H3型重鏈之胺基酸序列為序列表之序列識別號43，訊息序列被切除的成熟重鏈包含其胺基酸編號20至466，可變區包含其胺基酸編號20至136。再者，序列識別號42及43之序列亦各自記載於第28圖。各CDR序列及對應的序列識別號係示於第38圖。
6)-4-4 hR198_H4型重鏈：
將伴隨下列設計的人化R198重鏈命名為「hR198_H4型重鏈」：將序列表之序列識別號29所示的cR198重鏈之胺基酸編號第24號之麩醯胺酸殘基取代為纈胺酸殘基、第30號之白胺酸殘基取代為纈胺酸殘基、第31號之丙胺酸殘基取代為離胺酸殘基、第35號之絲胺酸殘基取代為丙胺酸殘基、第37號之甲硫胺酸殘基取代為纈胺酸殘基、第39號之異白胺酸殘基取代為纈胺酸殘基、第50號之絲胺酸殘基取代為丙胺酸殘基、第57號之離胺酸殘基取 代為精胺酸殘基、第59號之蘇胺酸殘基取代為丙胺酸殘基、第60號之蘇胺酸殘基取代為脯胺酸殘基、第67號之異白胺酸殘基取代為纈胺酸殘基、第70號之纈胺酸殘基取代為異白胺酸殘基、第81號之麩胺酸取代為丙胺酸殘基、第82號之離胺酸殘基取代為精胺酸殘基、第86號之離胺酸殘基取代為精胺酸殘基、第95號之絲胺酸殘基取代為蘇胺酸殘基、第99號之苯丙胺酸殘基取代為酪胺酸殘基、第101號之麩醯胺酸殘基取代為麩胺酸殘基、第106號之蘇胺酸殘基取代為精胺酸殘基、第107號之脯胺酸殘基取代為絲胺酸殘基、第108號之天冬胺酸殘基取代為麩胺酸殘基、第110號之絲胺酸殘基取代為蘇胺酸殘基、第130號之纈胺酸殘基取代為蘇胺酸殘基、第131號之甲硫胺酸殘基取代為白胺酸殘基。
編碼hR198_H4型重鏈的核苷酸序列為序列表之序列識別號44，編碼訊息序列被切除的成熟重鏈者為核苷酸編號58至1398，編碼可變區者為核苷酸編號58至408。又，hR198_H4型重鏈之胺基酸序列為序列表之序列識別號45，訊息序列被切除的成熟重鏈包含其胺基酸編號20至466，可變區包含其胺基酸編號20至136。再者，序列識別號44及45之序列亦被各自記載於第29圖。各CDR序列及對應的序列識別號係示於第38圖。
[實施例7]人化抗人類Orai1抗體之製作
7)-1人化抗人類Orai1抗體輕鏈hR198_L表現載體之構築
7)-1-1 hR198_L1表現載體之構築
合成含有序列表之序列識別號30所示的hR198_L1之核苷酸序列之核苷酸編號38至402所示的編碼hR198_L1的可變區的序列的DNA片段(GENEART公司 人工基因合成服務)。藉由將合成的DNA片段以限制酵素AvaI及EcoRV切斷，插入至將嵌合及人化抗體輕鏈表現載體pCMA-LK以相同限制酵素切斷處，而構築hR198_L1表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA-LK/hR198_L1」。
7)-1-2 hR198_L2表現載體之構築
合成含序列表之序列識別號32所示的hR198_L2之核苷酸序列的核苷酸編號38至402所示的編碼L2可變區的序列的DNA片段(GENEART公司 人工基因合成服務)。將合成的DNA片段作為模板，以KOD-Plus-(TOYOBO公司)將含編碼L2可變區的序列的DNA片段放大並以限制酵素BsiWI切斷，插入至將嵌合及人化抗體輕鏈表現載體pCMA-LK以限制酵素BsiWI切斷處，藉此構築L2表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA-LK/L2」。
7)-1-3 hR198_L3及hR198_L4表現載體之構築
合成包含序列表之序列識別號36所示的hR198_L4之核苷酸序列之核苷酸編號38至402所示的編碼hR198_L4之可變區的序列的DNA片段(GENEART公司人工基因合成服務)。藉由與實施例7-1-2)相同之方法而構築hR198_L4表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA-LK/hR198_L4」。
將pCMA-G1/hR198_L4作為模板，使用QuikChange定點突變套組(QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit)(Stratagene公司)，導入將胺基酸編號第64號之纈胺酸殘基取代為脯胺酸殘基的變異。將包含序列表之序列識別號34所示的核苷酸序列所獲得的表現載體命名為「pCMA-G1/hR198_L3」。
7)-2 人化抗人類Orai1抗體重鏈hR198_H表現載體之構築
7)-2-1 hR198_H1及hR198_H2表現載體之構築
合成含有作為抗Orai1抗體重鏈hR198之人化候補的序列表之序列識別號111所示的H0之核苷酸序列之核苷酸編號36至425所示的編碼H0之可變區的序列的DNA片段(GENEART公司 人工基因合成服務)。將合成的DNA片段作為模板，以KOD-Plus-將含編碼H0之可變區的序列的DNA片段放大，使用In-Fusion HD PCR選殖套組(CLONTECH公司)插入至將嵌合及人化抗體IgG1型重鏈表現載體pCMA-G1以限制酵素BlpI切斷處，藉此構築H0表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA-G1/R198_H0」。H0之胺基酸序列係示於序列識別號112。
其次，將pCMA-G1/R198_H0作為模板，使用KOD-Plus-mutagenesis kit(TOYOBO公司)，導入將胺基酸編號第66號之色胺酸殘基取代為酪胺酸殘基的變異。將包含序列表之序列識別號40所示的核苷酸序列而獲得的表現載體命名為「pCMA-G1/hR198_H2」。
其次，將pCMA-G1/R198_H2作為模板，使用QuikChange定點突變套組(Stratagene公司)及下述引子組，導入將胺基酸編號第56號之異白胺酸殘基取代為纈胺酸殘基的變 異。將含有序列表之序列識別號38所示的核苷酸序列而獲得的表現載體命名為「pCMA-G1/hR198_H1」。
7)-2-2 hR198_H3及hR198_H4表現載體之構築
合成含有作為抗Orai1抗體重鏈hR198之人化候補的序列表之序列識別號113所示的H5之核苷酸序列之核苷酸編號36至425所示的編碼H5之可變區的序列的DNA片段(GENEART公司 人工基因合成服務)。以與實施例7)-2-1相同之方法而構築H5表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA-G1/hR198_H5」。H5之胺基酸序列係示於序列識別號114。
其次，將pCMA-G1/H5作為模板，使用KOD-Plus-mutagenesis kit，導入將胺基酸編號第66號之色胺酸殘基、第67號之異白胺酸殘基各自取代為酪胺酸殘基、纈胺酸殘基的變異。將含有序列識別號44所示的核苷酸序列而獲得的表現載體命名為「pCMA-G1/hR198_H4」。
其次，將pCMA-G1/hR198_H4作為模板，以與實施例7)-2-1相同之方法導入將胺基酸編號第56號之異白胺酸殘基取代為纈胺酸殘基的變異，將含有序列表之序列識別號44所示的核苷酸序列而獲得的表現載體命名為「pCMA-G1/hR198_H3」。
7)-3 人化抗人類Orai1抗體hR198之調製
藉由與4)-5-1相同之方法，將人化抗人類Orai1抗體重鏈表現載體與人化抗人類Orai1抗體輕鏈表現載體基因導入至FreeStyle 293F細胞，而獲得含有抗體的培養上 清液。
將藉由pCMA-G1/hR198_H1與pCMA-LK/hR198_L1、pCMA-G1/hR198_H2與pCMA-LK/hR198_L2、pCMA-G1/hR198_H3與pCMA-LK/hR198_L3、pCMA-G1/hR198_H4與pCMA-LK/hR198_L4之組合而取得的人化抗人類Orai1抗體各自命名為「hR198_H1/L1」、「hR198_H2/L2」、「hR198_H3/L3」、「hR198_H4/L4」。
將藉由與4)-5-2相同之方法而獲得的培養上清液以rProteinA親和性層析加以純化，獲得純化抗體樣品。
[實施例8]人化抗人類Orai1抗體之活體外活性
8)-1利用流式細胞儀之人化抗人類Orai1抗體之抗原結合活性
為了評價對人類Orai1的結合特異性，將藉由1)-4-1所示的方法製作的pcDNA3.1-DEST導入HEK293T細胞懸浮液或pcDNA3.1-hOrai1導入HEK293T細胞懸浮液加以離心，去除上清液後，對各自添加7)-5所製作的人化抗Orai1抗體hR198_H1/L1、hR198_H2/L2、hR198_H3/L3、hR198_H4/L4、及親代抗體之cR118、cR198而懸浮，並於4℃靜置30分鐘。以含5% FBS的PBS洗淨2次後，添加以含5% FBS的PBS作100倍稀釋的抗人類IgG FITC結合物而懸浮，並於4℃靜置30分鐘。以含5% FBS的PBS洗淨2次後，再懸浮於含有1μg/mL碘化丙啶的含5% FBS的PBS，以流式細胞儀(FC500)進行檢測。資料解析係以Flowjo進行。將碘化丙啶陽性之死細胞以柵門除外後，作成活細胞之FITC螢光強度的直方圖，而算出平均螢光 強度(MFI)。人化抗人類Orai1抗體hR198_H1/L1、hR198_H2/L2、hR198_H3/L3、hR198_H4/L4係與親代抗體之cR118、cR198同樣地，未與pcDNA3.1-DEST導入HEK293T細胞結合，如第5圖所示，因僅與pcDNA3.1-hOrai1導入HEK293T細胞濃度依存性地結合，而顯示特異性地與人類Orai1結合。
8)-2 人化抗人類Orai1抗體之人類T細胞株活性化抑制作用
將為人類T細胞株的Jurkat細胞，以含10% FBS、100U/mL盤尼西林及100μg/mL鏈黴素的RPMI1640調製為1.5x106個細胞/mL之濃度，於96-孔細胞培養盤中各接種80μL，將為人化抗人類Orai1抗體的hH1/L1、hH2/L2、hH3/L3、hH4/L4、及為人類嵌合化抗人類Orai1抗體的cR118及cR198以10μL/孔添加並於37℃、5% CO2下前處理60分鐘。之後，將100ng/mL PMA及1μg/mL A23187以10μL/孔添加，充分攪拌後，於37℃、5% CO2下培養約16小時。將平盤充分攪拌後，以600g離心3分鐘，將含於上清液的IL-2濃度以ELISA法測定。第6圖表示人化抗人類Orai1抗體係添加濃度依存性地抑制自經PMA及A23187處理的Jurkat細胞的IL-2的放出。人化抗人類Orai1抗體係添加濃度依存性地抑制自Jurkat細胞的IL-2的放出，hH1/L1及hH2/L2之抑制活性係與人類嵌合化抗人類Orai1抗體cR118及cR198同等。另一方面，hH3/L3及hH4/L4於較cR118及cR198更低濃度下顯示抑制活性。
[實施例9]利用核醣體展示的活性增強變異 之鑑定
9)-1 H鏈及L鏈庫之製作
將人化抗人類Orai1抗體hR198_H4/L4作為模板，構築於H鏈或L鏈導入變異的庫，供給於利用核醣體展示的活性增強變異之鑑定。
9)-1-1 H鏈庫之製作
將hR198_H4基因作為模板，使用以下之引子組與rTaq DNA聚合酶(TOYOBO公司)，進行80次循環之PCR，而於該基因區域隨機導入變異。
引子組
5’-ATGCAAGTCCAACTGGTTCAATC-3’(序列識別號46：引子Orai1 HF)
5’-TGACGGAGCCAGCGGGAAGAC-3’(序列識別號47：引子Orai1 CH FR)
其次，將隨機導入變異的H鏈基因與將含有T7啟動子的5’UTR部位、及於5’側加成c-Myc且於3’側加成SecM序列的TolA基因片段作為模板，使用以下之引子組進行重疊PCR(Overlap PCR)，而調製H鏈庫。
引子組
5’-CAGGAAACAGCTATGACCATG-3’(序列識別號48：引子M13 rev long)
5’-CTCGAGTTATTCATTAGGTGAGGCGTTGAGG-3’(序列識別號49：引子SecM Stop R)
9)-1-2 L鏈庫之製作
將hR198_L4基因作為模板，使用以下之引子組與 rTaq DNA聚合酶而進行80次循環的PCR，於該基因區域隨機導入變異。
引子組
5’-ATGGACATTCAACTGACCCAAAGC-3’(序列識別號50：引子Orai1 Lc F)
5’-GATAAAAACACTCGGGGCCGCCAC-3’(序列識別號51：引子Orai1 CL-FR)
與9)-1-1之記載同樣地將隨機導入變異的L鏈基因與上述2個基因片段作為模板，進行重疊PCR，而調製L鏈庫。
9)-1-3 H鏈基因片段之製作
將hR198_H4基因作為模板，使用以下之引子組與KOD-Plus-而進行PCR，將H鏈基因區域放大。
引子組
5’-ATGCAAGTCCAACTGGTTCAATC-3’(序列識別號46：引子Orai1 HF)
5’-TCATTATTTGTCATCGTCATCTTTATAGTCGAATTCTTCGCCACGATTAAAGGATTTGGTGAC-3’(序列識別號52：引子Orai1 HR-FLAG R)
其次，將該基因片段與含T7啟動子的5’UTR部位作為模板，使用以下之引子組而進行重疊PCR，調製H鏈基因片段。
引子組
5’-CAGGAAACAGCTATGACCATG-3’(序列識別號48：引子M13 rev long)
5’-TCATTATTTGTCATCGTCATCTTTATAGTCGAATTCTTCGCCACGATTAAAGGATTTGGTGAC-3’(序列識別號52：引子Orai1 HR-FLAG R)
9)-1-4 L鏈基因片段之製作
將hR198_L4基因作為模板，使用以下之引子組與KOD-Plus-而進行PCR，將L鏈基因區域放大。
引子組
5’-ATGGACATTCAACTGACCCAAAGC-3’(序列識別號50：引子Orai1 Lc F)
5’-TCATTATTTGTCATCGTCATCTTTATAGTCGAATTCTTCGCCACGATTAAAGGATTTGGTGAC-3’(序列識別號53：引子Orai1 CL-FLAG R)
其次，與9)-1-1之記載同樣地，進行重疊PCR，調製L鏈基因片段。
引子組
5’-CAGGAAACAGCTATGACCATG-3’(序列識別號48：引子M13 rev long)
5’-TCATTATTTGTCATCGTCATCTTTATAGTCGAATTCTTCGCCACGATTAAAGGATTTGGTGAC-3’(序列識別號53：引子Orai1 CL-FLAG R)
9)-1-5 mRNA之調製
將實施例9)-1-1至9)-1-4所製作的庫及基因片段作為模板，以T7 RiboMax Express Large Scale RNA Production System(Promega公司)合成各自之mRNA。
9)-2 利用核醣體展示的篩選
將H鏈庫與L鏈基因片段組合而調製H鏈核醣體展示Fab，將L鏈庫與H鏈基因片段組合而調製L鏈核醣體展示Fab。於PUREfrex反應液(GeneFrontier公司)中添加20pmol之H鏈(或L鏈)庫mRNA與100pmol之核醣體，並於30℃保溫45分鐘。同樣地，於PUREfrex反應液中添加40pmol之L鏈(或H鏈)mRNA與200pmol之核醣體，並於30℃溫育45分鐘。其次藉由將H鏈(或L鏈)庫及L鏈(或H鏈)之轉譯後之反應液混合，於30℃再保溫90分鐘，而調製H鏈(或L鏈)核醣體展示Fab，之後藉由冷卻至4℃而停止反應。接著，藉由於該反應液中添加抗原，並於4℃緩緩攪拌1小時而進行Fab與抗原之結合。又，作為抗原，使用：將利用1)-1-1所製作的pcDNA3.1-hOrai1而建立的人類Orai1恆定表現CHO細胞以福馬林固定處理的樣品、或以下所示的生物素PEG化人類Orai1環區域胜肽(SIGMA公司)。
生物素PEG化人類Orai1環區域胜肽
生物素-PEG-SGSGFLPLKKQPGQPRPTSKPPASGAAANVSTSGITPGQAAAIASTTI(序列識別號115)
將與抗原結合的核醣體展示Fab以Nonolink鏈黴抗生物素蛋白磁珠(Nonolink Streptavidin magnetic beads(SoluLink公司))回收。接著將抗原以50mM Tris-HCl(pH7.4)、150mM NaCl、15mM Mg(OAc)2、0.05% Tween20、1mg/mL酵母RNA及50mM Tris-HCl(pH7.4)、150mM NaCl、15mM Mg(OAc)2、0.05% Tween20洗淨。之後於抗原中添加50mM Tris-HCl(pH7.4)、150mM NaCl 、15mM Mg(OAc)2、50mM EDTA，並於室溫靜置10分鐘後藉由離心回收含mRNA的上清液。經回收的mRNA係藉由Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit(Roche公司)作成cDNA後，使用下述引子組及KOD-Plus-而進行PCR而呈DNA加以放大。將該DNA作為模板，而合成mRNA，再供給於同樣之篩選。藉由實施複數次該篩選循環，而選篩出與抗原強烈結合的抗體基因。
引子組
5’-ATGGACATTCAACTGACCCAAAGC-3’(序列識別號50：引子Orai1-LcF)
5’-CAGATCCTCCTCAGAGATCAGCTTCTGCTC-3’(序列識別號54：引子Myc-R)
9)-3 Fab蛋白質之調製
將篩選出的基因於大腸菌表現用載體進行次選殖，而以Cell ELISA篩選對人類Orai1恆定表現CHO細胞的結合性提升的選殖株。首先，將篩選後之DNA以限制酵素EcoRV及XhoI切斷，插入以相同酵素切斷的Fab表現用載體(GeneFrontier公司)後，導入大腸菌BL21(DE3)。將該轉形體於圓底96孔盤上，於每1孔150μL之卡苯尼西林(carbenicillin)/0.1%葡萄糖/2xYT，於37℃培養4-5小時。其次將平盤冷卻至4℃後，以終濃度成為0.5Mm的方式添加IPTG，並於30℃震盪培養一晚。其次藉由離心回收菌體後，添加溶胞緩衝液(lysis buffer)(2.5mg/mL溶菌酶(Lysotyme)、100U DNaseI)，並於室溫震盪60分鐘。接著藉由離心回收上清液，而作為Fab檢體。
9)-4 利用細胞ELISA的篩選
將人類Orai1表現細胞於384平盤整盤地培養後，以洗淨緩衝液(PBS(-)、20mM MgSO4、2.5% FBS)洗淨。其次將Fab檢體添加至該平盤，並於4℃震盪1小時。以洗淨緩衝液洗淨4次後，添加過氧化酶標識抗人F(ab’)2山羊抗體(Jackson Immuno Research公司)，並於4℃震盪30分鐘。以洗淨緩衝液洗淨3次後，以PBS(-)、20mM MgSO4洗淨3次。之後添加顯色試藥(0.4mg/mL四甲基-苯甲亞胺(Tetramethyl-benzimine)、200mM乙酸鈉(pH3.4)、0.01%過氧化氫水)，並於室溫震盪15分鐘。之後，添加2N HCl後，測量OD450。與對照組之CHO細胞比較，篩選於人類Orai1恆常表現CHO細胞顯示更高OD450的Fab檢體。
9)-5 利用流式細胞儀之抗人類Orai1抗體Fab之抗原結合活性
為了評價對人類Orai1的結合特異性，將藉由1)-4-1所示法所製作的pcDNA3.1-DEST導入HEK293T細胞懸浮液或pcDNA3.1-hOrai1導入HEK293T細胞懸浮液離心，去除上清液後，對各自添加9)-4所篩選的輕鏈變異株LCDR60、LCDR67、LCDR83、CE151、PE057及重鏈變異株HCDR046、HCDR047、HEP087、HEP124、HEP237、及親代抗體Fab之hR198_H4/L4-Fab而懸浮，並於4℃靜置30分鐘。以含5% FBS的PBS洗淨2次後，添加以含5% FBS的PBS作100倍稀釋的抗人類IgG FITC結合物而懸浮，並於4℃靜置30分鐘。以含5% FBS的PBS洗淨2次後，再懸浮於含1μg/mL碘化丙啶的含5% FBS的PBS，以流式 細胞儀(FC500)進行檢測。資料解析係以Flowjo進行。將碘化丙啶陽性之死細胞以柵門除外後，作成活細胞之FITC螢光強度的直方圖，而算出平均螢光強度(MFI)。輕鏈變異株LCDR60、LCDR67、LCDR83、CE151、PE057及重鏈變異株HCDR046、HCDR047、HEP087、HEP124、HEP237係與親代抗體Fab之hR198_H4/L4-Fab同樣地，未與pcDNA3.1-DEST導入HEK293T細胞結合，如第7圖所示，對於pcDNA3.1-hOrai1導入HEK293T細胞，與親代抗體Fab相比，可見同等以上與人類Orai1結合的傾向。
[實施例10]人化抗人類Orai1抗體之親和性成熟抗體之製作
於藉由實施例9)所篩選的輕鏈變異株LCDR60、LCDR67、LCDR83、CE151、PE057以及重鏈變異株HCDR046、HCDR047、HEP087、HEP124、HEP237所見到之增強活性的變異中，藉由將一些移入至hR198_H3/L3，而製作100種類以上之改造hR198_H3/L3抗體，由結合親和性、活體外活性、生產性、對人類的異種抗原性之觀點加以評價。作為結果，篩選以下所示的抗體。
10)-1 人化抗人類Orai1抗體之親和性成熟抗體之設計
10)-1-1 hR198_LG1型輕鏈：
將伴隨下列設計的人化R198輕鏈命名為「hR198_LG1型輕鏈」：將序列表之序列識別號35所示的hR198_L3輕鏈之胺基酸編號第51號之天冬醯胺酸殘基 取代為甘胺酸殘基、第113號之蘇胺酸殘基取代為異白胺酸殘基、第117號之蘇胺酸殘基取代為絲胺酸殘基。
編碼hR198_LG1型輕鏈的核苷酸序列為序列表之序列識別號55，編碼訊息序列被切除的成熟輕鏈者為核苷酸編號61至702，編碼可變區者為核苷酸編號61至378。又，hR198_LG1型輕鏈之胺基酸序列為序列表之序列識別號56，訊息序列被切除的成熟輕鏈包含其胺基酸編號21至234，可變區包含其胺基酸編號21至126。再者，序列識別號55及56之序列亦各自記載於第30圖。各CDR序列及對應的序列識別號係示於第38圖。
10)-1-2 hR198_LG2型輕鏈：
將伴隨下列設計的人化R198輕鏈命名為「hR198_LG2型輕鏈」：將序列表之序列識別號35所示的hR198_L3輕鏈之胺基酸編號第44號之精胺酸殘基取代為組胺酸殘基、第48號之絲胺酸殘基取代為天冬醯胺酸殘基、第51號之天冬醯胺酸殘基取代為甘胺酸殘基、第70號之絲胺酸殘基取代為白胺酸殘基、第75號之麩胺酸殘基取代為天冬胺酸殘基、第76號之絲胺酸殘基取代為色胺酸殘基、第113號之蘇胺酸殘基取代為異白胺酸殘基、第117號之蘇胺酸殘基取代為絲胺酸殘基。
編碼hR198_LG2型輕鏈的核苷酸序列為序列表之序列識別號57，編碼訊息序列被切除的成熟輕鏈者為核苷酸編號61至702，編碼可變區者為核苷酸編號61至378。又，hR198_LG2型輕鏈之胺基酸序列為序列表之序列識別號58，訊息序列被切除的成熟輕鏈包含其胺基酸編號 21至234，可變區包含其胺基酸編號21至126。再者，序列識別號57及58之序列亦各自記載於第31圖。各CDR序列及對應的序列識別號係示於第38圖。
10)-1-3 hR198_LG3型輕鏈：
將伴隨下列設計的人化R198輕鏈命名為「hR198_LG3型輕鏈」：將序列表之序列識別號35所示的hR198_L3輕鏈之胺基酸編號第44號之精胺酸殘基取代為組胺酸殘基、第47號之麩醯胺酸殘基取代為精胺酸殘基、第48號之絲胺酸殘基取代為天冬醯胺酸殘基、第51號之天冬醯胺酸殘基取代為甘胺酸殘基、第70號之絲胺酸殘基取代為白胺酸殘基、第73號之蘇胺酸殘基取代為絲胺酸殘基、第75號之麩胺酸殘基取代為天冬胺酸殘基、第76號之絲胺酸殘基取代為色胺酸殘基、第113號之蘇胺酸殘基取代為異白胺酸殘基、第117號之蘇胺酸殘基取代為絲胺酸殘基。
編碼hR198_LG3型輕鏈的核苷酸序列為序列表之序列識別號59，編碼訊息序列被切除的成熟輕鏈者為核苷酸編號61至702，編碼可變區者為核苷酸編號61至378。又，hR198_LG3型輕鏈之胺基酸序列為序列表之序列識別號60，訊息序列被切除的成熟輕鏈包含其胺基酸編號21至234，可變區包含其胺基酸編號21至126。再者，序列識別號59及60之序列亦各自記載於第32圖。各CDR序列及對應的序列識別號係示於第38圖。
10)-1-4 hR198_HG1型重鏈：
將伴隨下列設計的人化R198重鏈命名為「 hR198_HG1型輕鏈」：將序列表之序列識別號43所示的hR198_H3重鏈之胺基酸編號第78號之天冬醯胺酸殘基取代為天冬胺酸殘基、將第123號之纈胺酸殘基取代為丙胺酸殘基。
編碼hR198_HG1型重鏈的核苷酸序列為序列表之序列識別號61，編碼訊息序列被切除的成熟重鏈者為核苷酸編號58至1398，編碼可變區者為核苷酸編號58至408。又，hR198_HG1型重鏈之胺基酸序列為序列表之序列識別號62，訊息序列被切除的成熟重鏈包含其胺基酸編號20至466，可變區包含其胺基酸編號20至135。再者，序列識別號61及62之序列亦各自記載於第33圖。各CDR序列及對應的序列識別號係示於第38圖。
10)-1-5 hR198_HG2型重鏈：
將伴隨下列設計的人化R198重鏈命名為「hR198_HG2型輕鏈」：將序列表之序列識別號43所示的hR198_H3重鏈之胺基酸編號第48號之纈胺酸殘基取代為異白胺酸殘基、第78號之天冬醯胺酸殘基取代為天冬胺酸殘基、第81號之丙胺酸殘基取代為甘胺酸殘基、第123號之纈胺酸殘基取代為丙胺酸殘基。
編碼hR198_HG2型重鏈的核苷酸序列為序列表之序列識別號63，編碼訊息序列被切除的成熟重鏈者為核苷酸編號58至1398，編碼可變區者為核苷酸編號58至408。又，hR198_HG2型重鏈之胺基酸序列為序列表之序列識別號64，訊息序列被切除的成熟重鏈包含其胺基酸編號20至466，可變區包含其胺基酸編號20至135。再者， 序列識別號63及64之序列亦各自記載於第34圖。各CDR序列及對應的序列識別號係示於第38圖。
10)-1-6 hR198_HG3型重鏈：
將伴隨下列設計的人化R198重鏈命名為「hR198_HG3型輕鏈」：將序列表之序列識別號43所示的hR198_H3重鏈之胺基酸編號第48號之纈胺酸殘基取代為異白胺酸殘基、第78號之天冬醯胺酸殘基取代為天冬胺酸殘基、第81號之丙胺酸殘基取代為甲硫胺酸殘基、第123號之纈胺酸殘基取代為丙胺酸殘基。
編碼hR198_HG3型重鏈的核苷酸序列為序列表之序列識別號65，編碼訊息序列被切除的成熟重鏈者為核苷酸編號58至1398，編碼可變區者為核苷酸編號58至408。又，hR198_HG3型重鏈之胺基酸序列為序列表之序列識別號66，訊息序列被切除的成熟重鏈包含其胺基酸編號20至466，可變區包含其胺基酸編號20至135。再者，序列識別號65及66之序列亦各自記載於第35圖。各CDR序列及對應的序列識別號係示於第38圖。
10)-2 人化抗人類Orai1抗體之親和性成熟抗體表現載體之製作
10)-2-1 hR198_LG1型輕鏈表現載體之構築
將pCMA-LK/hR198_L3作為模板，使用KOD-Plus-mutagenesis，導入將胺基酸編號第51號之天冬醯胺酸殘基取代為甘胺酸殘基、第113號之蘇胺酸殘基取代為異白胺酸殘基、第117號之蘇胺酸殘基取代為絲胺酸殘基的變異。將含有序列表之序列識別號55所示的核苷酸序列而 獲得的表現載體命名為「pCMA-LK/hR198_LG1」。
10)-2-2 hR198_LG2及LG3型輕鏈表現載體之構築
合成含有序列表之序列識別號59所示LG3之核苷酸序列之核苷酸編號38至402所示的編碼hR198_LG3的可變區的序列的DNA片段(GENEART公司 人工基因合成服務)。將合成的DNA片段以限制酵素EcoRV及AvaI切斷，藉由插入以相同限制酵素切斷的pCMA-LK/hR198_LG1而構築hR198_LG3表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA-LK/hR198_LG3」。
將pCMA-LK/hR198_LG3作為模板，使用KOD-Plus-mutagenesis，導入將胺基酸編號第47號之精胺酸殘基取代為麩醯胺酸殘基、第73號之絲胺酸殘基取代為蘇胺酸殘基的變異。將包含序列表之序列識別號57所示的核苷酸序列所獲得的表現載體命名為「pCMA-LK/hR198_LG2」。
10)-2-3 hR198_HG1型重鏈表現載體之構築
將pCMA-G1/hR198_H3作為模板，使用KOD-Plus-mutagenesis，導入將胺基酸編號第78號之天冬醯胺酸殘基取代為天冬胺酸殘基、第123號之纈胺酸殘基取代為丙胺酸殘基的變異。將含有序列表之序列識別號61所示核苷酸序列而獲得的表現載體命名為「pCMA-G1/hR198_HG1」。
10)-2-4 hR198_HG2型重鏈表現載體之構築
將pCMA-G1/hR198_HG1作為模板，使用KOD-Plus-mutagenesis，導入將胺基酸編號第48號之纈胺酸殘基取 代為異白胺酸殘基、第81號之丙胺酸殘基取代為甘胺酸殘基的變異。將含序列表之序列識別號63所示的核苷酸序列而獲得的表現載體命名為「pCMA-G1/hR198_HG2」。
10)-2-5 hR198_HG3型重鏈表現載體之構築
將pCMA-G1/hR198_HG2作為模板，使用KOD-Plus-mutagenesis，導入將胺基酸編號第81號之甘胺酸殘基取代為甲硫胺酸殘基的變異。將含有序列表之序列識別號65所示的核苷酸序列而獲得的表現載體命名為「pCMA-G1/hR198_HG3」。
10)-3 人化抗人類Orai1抗體之親和性成熟抗體之調製
藉由與4)-5-1相同之方法，將10)-2製作的人化抗人類Orai1抗體重鏈表現載體與人化抗人類Orai1抗體輕鏈表現載體基因導入至FreeStyle 293F細胞，獲得含有抗體的培養上清液。
將藉由作為模板之pCMA-G1/hR198_H3、導入變異的pCMA-G1/hR198_HG1、pCMA-G1/hR198_HG2、pCMA-G1/hR198_HG3、與pCMA-LK/hR198_LG1、pCMA-LK/hR198_LG2、pCMA-LK/hR198_LG3之組合而取得的人化抗人類Orai1抗體各自命名為「hR198_H3/LG1」、「hR198_HG1/LG1」、「hR198_HG1/LG2」、「hR198_HG1/LG3」、「hR198_HG2/LG1」、「hR198_HG3/LG1」。
藉由與4)-5-2相同之方法，將獲得的培養上清液以rProteinA親和性層析進行純化，獲得純化抗體樣品。
[實施例11]親和性成熟抗體之活體外活性
11)-1 利用流式細胞儀之親和性成熟抗體之結合能力評價
為了評價對人類Orai1的結合特異性，將藉由1)-4-1所示方法製作的pcDNA3.1-DEST導入HEK293T細胞懸浮液或pcDNA3.1-hOrai1導入HEK293T細胞懸浮液離心，去除上清液後，對各自添加10)-3所製作的親和性成熟抗體之hR198_H3/LG1、hR198_HG1/LG1、hR198_HG1/LG2、hR198_HG1/LG3、hR198_HG2/LG1、hR198_HG3/LG1、與親代抗體之hR198_H3/L3、hR198_H4/L4而懸浮，並於4℃靜置30分鐘。以含5% FBS的PBS洗淨2次後，添加以含5% FBS的PBS稀釋100倍的抗人類IgG FITC結合物而懸浮，並於4℃靜置30分鐘。以含5% FBS的PBS洗淨2次後，再懸浮於含1μg/mL碘化丙啶的含5% FBS的PBS中，以流式細胞儀(FC500)進行檢測。資料解析係以Flowjo進行。將碘化丙啶陽性之死細胞以柵門除外後，作成活細胞之FITC螢光強度的直方圖，而算出平均螢光強度(MFI)。親和性成熟抗體hR198_H3/LG1、hR198_HG1/LG1、hR198_HG1/LG2、hR198_HG1/LG3、hR198_HG2/LG1、hR198_HG3/LG1係與為親代抗體的hR198_H3/L3、hR198_H4/L4同樣地，未與pcDNA3.1-DEST導入HEK293T細胞結合，且如第8圖所示，對pcDNA3.1-hOrai1導入HEK293T細胞，與親代抗體相比，可見同等以上與人類Orai1結合的傾向。
11)-2 親和性成熟抗體之T細胞活性化抑制作用
將為人類T細胞株的Jurkat細胞，以含10% FBS、100U/mL盤尼西林及100μg/mL鏈黴素的RPMI1640調製為1.5x106個細胞/mL之濃度，於96-孔細胞培養盤中各接種80μL，添加10μL/孔之為親和性成熟抗體的hR198_H3/LG1、hR198_HG1/LG1、hR198_HG1/LG2、hR198_HG1/LG3、hR198_HG2/LG1、hR198_HG3/LG1、為人化抗人類Orai1抗體的hR198_H3/L3、hR198_H4/L4，並於37℃、5% CO2下前處理60分鐘。之後，添加10μL/孔之100ng/mL PMA及1μg/mL A23187，充分攪拌後，於37℃、5% CO2下培養約16小時。將平盤充分攪拌後，以600g離心3分鐘，將含於上清液的IL-2濃度以ELISA法測定。第9圖表示親和性成熟抗體係添加濃度依存性地抑制自經PMA及A23187處理的Jurkat細胞之IL-2的放出。親和性成熟抗體係添加濃度依存性地抑制自Jurkat細胞之IL-2的放出，其抑制活性係任一者皆超過為親代抗體的人化抗人類Orai1抗體hH3/L3、hH4/L4。
[實施例12]親和性成熟抗體之效應物活性減低變異體之製作
將hR198_HG1之恆定區之2個胺基酸殘基經取代的恆定區改造hR198_HG1-LALA序列，如以下實施例記載的方式構築。
12)-1 LALA型重鏈表現載體之設計
為了迴避對正常人類Orai1表現細胞之細胞毒殺，希望抗體的效應物活性為低的。已知效應物活性依抗體的次型而不同。可見IgG4係ADCC、CDC活性低；IgG2雖具 有CDC活性，但ADCC活性低等之特徵。由此特徵，藉由將IgG1之恆定區之一部份的序列參考IgG2、4而取代，可製作ADCC、CDC活性減低的IgG1抗體。作為一例，依據Marjan Hezareh et.al.Journal of Virology,75(24)：12161-12168(2001)，將IgG1之第234號、第235號之白胺酸殘基(數字係依Kabat等人的EU索引)各自取代為丙胺酸殘基時，顯示ADCC、CDC活性減低。因此，將伴隨「對10)-1製作的hR198_HG1型重鏈，將胺基酸編號第253號之白胺酸殘基取代為丙胺酸殘基、第254號之白胺酸殘基取代為丙胺酸殘基」所設計的人化抗人類Orai1抗體重鏈命名為「hR198_HG1-LALA型重鏈」。
12)-2 LALA型重鏈表現載體之構築
12)-2-1 hR198_HG1-LALA型重鏈表現載體之構築
將7)-2所製作的hR198_H4型重鏈pCMA-G1/hR198_H4作為模板，藉由使用KOD-Plus-mutagenesis kit，導入變異，而構築hR198_H4-LALA型重鏈表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA-G1-LALA/hR198_H4」。將編碼hR198_H4-LALA型重鏈的核苷酸序列及該重鏈之胺基酸序列各自示於序列表之序列識別號67及68(第36圖)。
於將pCMA-G1-LALA/hR198_H4以限制酵素PstI及XbaI消化而獲得的約4.2kb之DNA片段，使用Ligation High ver.2插入含有將10)-2所製作的pCMA-G1/hR198_HG1以相同之限制酵素消化而獲得的抗體可變區的約0.6kb之DNA片段，藉此構築hR198_HG1-LALA型重鏈表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA-G1-LALA/hR198_ HG1」。將編碼hR198_HG1-LALA型重鏈的核苷酸序列及該重鏈之胺基酸序列各自示於序列表之序列識別號69及70(第37圖)。
12)-3親和性成熟抗體之效應物活性減低變異體之調製
12)-3-1親和性成熟抗體之效應物活性減低變異體之生產
FreeStyle 293F細胞(Life Technologies公司)係依據手冊進行繼代、培養。將對數增殖期之1.2×109個之FreeStyle 293F細胞(Life Technologies公司)接種於3L Fernbach Erlenmeyer Flask(CORNING公司)，以FreeStyle 293表現培養基(Invitrogen公司)稀釋而調製為1.0×106個細胞/mL後，於37℃、8% CO2培養箱內以90rpm振盪培養一小時。將聚乙亞胺(Polyscience # 24765)3.6mg溶解於Opti-Pro SFM(Life Technologies公司)20mL，其次，使用PureLink HiPure Plasmid套組(Life Technologies公司)，將調製的輕鏈表現載體(0.8mg)及重鏈表現載體(0.4mg)添加於20mL之Opti-Pro SFM(Life Technologies公司)。於聚乙亞胺/Opti-Pro SFM混合液20ml中，添加表現載體/Opti-Pro SFM混合液20mL並溫和地攪拌，再放置5分鐘後，添加至FreeStyle 293F細胞。將於37℃、8%CO2培養箱中以90rpm振盪培養7日而獲得的培養上清液以拋棄式膠囊過濾器(Disposable Capsule Filter)(ADVANTEC公司，# CCS-045-E1H)過濾。hR198_HG1/LG1係藉由pCMA-G1/hR198_HG1與pCMA-LK/hR198_LG1之 組合而生產，hR198_HG1-LALA/LG1係藉由pCMA-G1-LALA/hR198_HG1與pCMA-LK/hR198_LG1之組合而生產。
12)-3-2親和性成熟抗體之效應物活性減低變異體之二階段步驟純化
自實施例12)-3-1所獲得的培養上清液將抗體以rProteinA親和性層析(4-6℃下)與陶瓷羥基磷灰石(Ceramic Hydroxyapatite)(室溫下)之二階段步驟加以純化。rProteinA親和性層析純化後與陶瓷羥基磷灰石純化後之緩衝液取代步驟係於4-6℃下實施。將培養上清液施加於以PBS平衡化的MabSelectSuRe(GE Healthcare Bioscience公司，HiTrap管柱)。培養上清液全部置入管柱後，以管柱容量2倍以上之PBS將管柱洗淨。其次以2M精胺酸鹽酸鹽溶液(pH4.0)洗提，收集含有抗體的劃分。將其劃分藉由透析(Thermo Scientific公司，Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)取代為PBS後，將以5mM磷酸鈉/50mM MES/pH7.0之緩衝液作5倍稀釋的抗體溶液，施加於以5mM NaPi/50mM MES/30mM NaCl/pH7.0之緩衝液平衡化的陶瓷羥基磷灰石管柱(日本Bio-Rad公司，Bio-Scale CHT Type-1 Hydroxyapatite Column)。實施利用氯化鈉的線性濃度梯度洗提，收集含抗體之劃分。將其劃分藉由透析(Thermo Scientific公司，Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)進行液取代為HBSor(25mM組胺酸/5%山梨醇、pH6.0)。以Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20(分劃分子量UF10K，Sartorius公司，4℃下)加以濃縮，將IgG濃度 調製為5mg/mL以上。最後，以Minisart-Plus filter(Sartorius公司)過濾，作為純化樣品。
[實施例13]人類抗人類Orai1抗體2C1.1及5H3.1之表現載體之製作
2C1.1抗體及5H3.1抗體係基於WO2011063277A1記載的輕鏈、及重鏈之胺基酸序列而製作。
13)-1 嵌合化及人化IgG2型重鏈表現載體pCMA-G2之構築
將「使pCMA-LK以XbaI及PmeI消化而移除κ鏈分泌訊息及人類κ鏈恆定區的DNA片段」、及「含有編碼序列表之序列識別號71所示的人類重鏈分泌訊息及人類IgG2恆定區之胺基酸的序列的DNA片段」，使用In-Fusion Advantage PCR選殖套組而結合，構築於CMV啟動子之下游具有訊息序列、選殖位、人類IgG2重鏈恆定區的嵌合及人化IgG2型重鏈表現載體pCMA-G2。
13)-2 2C1.1抗體重鏈表現載體之構築
合成含有序列表之序列識別號72所示的編碼2C1.1抗體重鏈的核苷酸序列之核苷酸編號36至434所示的編碼2C1.1抗體重鏈之可變區的序列的DNA片段(GENEART公司 人工基因合成服務)。將合成的DNA片段作為模板，以KOD-Plus-將含編碼2C1.1抗體重鏈之可變區的序列的DNA片段加以放大，藉由使用In-Fusion HD PCR選殖套組插入至將嵌合及人化抗體IgG2型重鏈表現載體pCMA-G2以限制酵素BlpI切斷處，而構築2C1.1抗體重鏈表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA-G2/2C1.1」。
將2C1.1抗體重鏈之胺基酸序列示於序列表之序列識別號73。
13)-3 2C1.1抗體輕鏈表現載體之構築
合成含有序列表之序列識別號74所示的編碼2C1.1抗體輕鏈的核苷酸序列之核苷酸編號38至739所示的編碼2C1.1抗體輕鏈之可變區與恆定區(λ鏈)的序列的DNA片段(GENEART公司 人工基因合成服務)。將合成的DNA片段作為模板，以KOD-Plus-將含有編碼2C1.1抗體輕鏈之可變區與恆定區的序列的DNA片段加以放大，藉由使用In-Fusion HD PCR選殖套組插入於將嵌合及人化抗體輕鏈表現載體pCMA-LK以限制酵素BsiWI及PmeI切斷處，而構築2C1.1抗體輕鏈表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA-L/2C1.1」。
將2C1.1抗體輕鏈之胺基酸序列示於序列表之序列識別號75。
13)-4 5H3.1抗體重鏈表現載體之構築
合成含有序列表之序列識別號76所示的編碼5H3.1抗體重鏈的核苷酸序列之核苷酸編號36至434所示的編碼5H3.1抗體重鏈之可變區的序列的DNA片段(GENEART公司 人工基因合成服務)。以與實施例13)-2相同之方法構築5H3.1抗體重鏈表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA-G2/5H3.1」。
將5H3.1抗體重鏈之胺基酸序列示於序列表之序列識別號77。
13)-5 5H3.1抗體輕鏈表現載體之構築
合成含有序列表之序列識別號78所示的編碼5H3.1抗體輕鏈的核苷酸序列之核苷酸編號38至742所示的編碼5H3.1抗體輕鏈之可變區與恆定區的序列的DNA片段(GENEART公司 人工基因合成服務)。以與實施例13)-3相同之方法構築5H3.1抗體輕鏈表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA-L/5H3.1」。
將5H3.1抗體輕鏈之胺基酸序列示於序列表之序列識別號79。
13)-6 2C1.1抗體及5H3.1抗體之調製
13)-6-1 2C1.1抗體及5H3.1抗體之生產
以與實施例12)-3-1相同之方法，生產抗體。2C1.1抗體係藉由pCMA-G2/2C1.1與pCMA-L/2C1.1之組合而生產，5H3.1抗體係藉由pCMA-G2/5H3.1與pCMA-L/5H3.1之組合而生產。
13)-6-2 2C1.1抗體及5H3.1抗體之二階段步驟純化
以與實施例12)-3-2相同之方法，對實施例13)-6-1所生產的培養上清液進行抗體之二階段步驟純化。
[實驗例14]小鼠抗人類Orai1抗體10F8、14F74、及17F6之製作
10F8抗體、14F74抗體、及17F6抗體係基於WO2013091903A1記載的輕鏈、及重鏈之胺基酸序列而製作。
14)-1 10F8抗體重鏈表現載體之構築
合成含序列表之序列識別號80所示的編碼10F8抗體重鏈的核苷酸序列的DNA片段(GENEART公司 人工基 因合成服務)。將合成的DNA片段作為模板，以KOD-Plus-將含編碼10F8抗體重鏈的序列的DNA片段加以放大，藉由使用In-Fusion HD PCR選殖套組插入至將嵌合及人化抗體輕鏈表現載體pCMA-LK以限制酵素XbaI及PmeI消化而移除κ鏈分泌訊息及人類κ鏈恆定區處，而構築10F8抗體重鏈表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA/10F8H」。
將10F8抗體重鏈之胺基酸序列示於序列表之序列識別號81。
14)-2 10F8抗體輕鏈表現載體之構築
合成含序列表之序列識別號82所示的編碼10F8抗體輕鏈的核苷酸序列的DNA片段(GENEART公司Strings DNA Fragments)。將合成的DNA片段，藉由使用In-Fusion HD PCR選殖套組插入至將嵌合及人化抗體輕鏈表現載體pCMA-LK以限制酵素XbaI及PmeI消化而移除κ鏈分泌訊息及人類κ鏈恆定區處，而構築10F8抗體輕鏈表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA/10F8L」。
將10F8抗體輕鏈之胺基酸序列示於序列表之序列識別號83。
14)-3 14F74抗體重鏈表現載體之構築
合成含序列表之序列識別號84所示的編碼14F74抗體重鏈的核苷酸序列的DNA片段(GENEART公司 人工基因合成服務)。藉由與實施例14)-1相同之方法而構築14F74抗體重鏈表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA/14F74H」。
將14F74抗體重鏈之胺基酸序列示於序列表之序列識別號85。
14)-4 14F74抗體輕鏈表現載體之構築
合成含序列表之序列識別號86所示的編碼14F74抗體輕鏈的核苷酸序列的DNA片段(GENEART公司Strings DNA Fragments)。藉由與實施例14)-2相同之方法，構築14F74抗體輕鏈表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA/14F74L」。
將14F74抗體輕鏈之胺基酸序列示於序列表之序列識別號87。
14)-5 17F6抗體重鏈表現載體之構築
合成含序列表之序列識別號88所示的編碼17F6抗體重鏈的核苷酸序列的DNA片段(GENEART公司 人工基因合成服務)。藉由與實施例14)-1相同之方法而構築17F6抗體重鏈表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA/17F6H」。
將17F6抗體重鏈之胺基酸序列示於序列表之序列識別號89。
14)-6 17F6抗體輕鏈表現載體之構築
合成含序列表之序列識別號90所示的編碼17F6抗體輕鏈的核苷酸序列的DNA片段(GENEART公司Strings DNA Fragments)。藉由與實施例14)-2相同之方法構築17F6抗體輕鏈表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA/17F6L」。
將17F6抗體輕鏈之胺基酸序列示於序列表之序列識 別號91。
14)-7 10F8抗體、14F74抗體、及17F6抗體之調製
14)-7-1 10F8抗體、14F74抗體、及17F6抗體之生產
以與實施例12)-3-1相同之方法生產。10F8抗體係藉由pCMA/10F8H與pCMA/10F8L之組合而生產，14F74抗體係藉由pCMA/14F74H與pCMA/14F74L之組合而生產，17F6抗體係藉由pCMA/17F6H與pCMA/17F6L之組合而生產。
14)-7-2 10F8抗體、14F74抗體、及17F6抗體之二階段步驟純化
以與實施例12)-3-2相同之方法，對實施例14)-7-1所獲得的培養上清進行抗體之二階段步驟純化。
[實施例15]親和性成熟抗體之效應物活性減低變異體與其他抗人類Orai1抗體之活體外活性比較
15)-1 利用流式細胞儀之抗人類Orai1抗體之抗原結合活性
將使1)-1-1構築的人類Orai1表現載體藉由1)-4-2所示方法導入至HEK293T細胞的細胞懸浮液加以離心，並去除上清液後，各自對pcDNA3.1-hOrai1導入HEK293T細胞及pcDNA3.1-DEST導入HEK293T細胞，添加12)-3所製作的hR198_HG1/LG1、hR198_HG1/LG1-LALA、13)-6所製作的2C1.1、5H3.1、14)-7所製作的10F8、14F74、17F6、及作為對照組之人類IgG對照組抗體與小鼠IgG對照組抗體而懸浮，並於4℃靜置30分鐘。以含5% FBS的 PBS洗淨2次後，關於人類抗體，係添加以含5% FBS的PBS稀釋100倍的抗人類IgG FITC結合物，關於小鼠抗體，係添加抗小鼠IgG FITC結合物(Anti-mouse IgG FITC conjugate)(Cappel公司)而懸浮，並於4℃靜置30分鐘。以含5% FBS的PBS洗淨2次後，再懸浮於含1μg/mL碘化丙啶的含5% FBS的PBS，以流式細胞儀(FC500)進行檢測。資料解析係以Flowjo進行。將碘化丙啶陽性之死細胞以柵門除外後，作成活細胞之FITC螢光強度的直方圖，而算出平均螢光強度(MFI)。hR198_HG1/LG1、hR198_HG1-LALA/LG1、2C1.1、5H3.1、10F8、14F74、17F6並未與pcDNA3.1-DEST導入HEK293T細胞結合，且如第10圖(人類抗體)、第11圖(小鼠抗體)所示，因對pcDNA3.1-hOrai1導入HEK293T細胞可見到結合，故顯示任一種抗體皆特異性地與人類Orai1結合。另一方面，於小鼠IgG對照組抗體並未觀察到結合。
15)-2 抗人類Orai1抗體之人類T細胞株活性化抑制作用
將為人類T細胞株的Jurkat細胞，以RPMI1640(含10% FBS、100U/mL盤尼西林及100μg/mL鏈黴素)調製成1.5x106個細胞/mL之濃度，於96-孔細胞培養盤中各接種80μL，以10μL/孔添加hR198_HG1/LG1、hR198_HG1-LALA/LG1、2C1.1、5H3.1、10F8、14F74、17F6，並於37℃、5% CO2下前處理60分鐘。之後，以10μL/孔添加100ng/mL PMA及1μg/mL A23187(最終濃度10ng/mL PMA及100ng/mL A23187)，充分攪拌後，於37℃、5% CO2下 培養約16小時。將平盤充分攪拌後，以600g離心3分鐘，將上清液所含的IL-2濃度以ELISA法測定。第12圖表示抗人類Orai1抗體係添加濃度依存性地抑制自經PMA及A23187處理的Jurkat細胞的IL-2之放出。第13圖表示將抗體非添加時之IL-2濃度作為100%時之hR198_HG1/LG1、hR198_HG1-LALA/LG1、2C1.1、5H3.1、10F8、14F74、17F6的半數抑制濃度(IC50)及80%抑制濃度(IC80)。先前技術之抗體之IC50為80ng/mL以上，另一方面，本發明之代表性抗體之IC50為10ng/mL以下。又先前技術之抗體之IC80為60000ng/mL以上，另一方面，本發明之代表性抗體之IC80為200ng/mL以下。
15)-3 親和性成熟抗體之效應物活性減低變異體與其他抗人類Orai1抗體之人類末梢血單核球活性化抑制作用
人類末梢血單核球(PBMC)係自Cellular Technology公司購入冷凍品，依據指示書而解凍來使用。將以含10% FBS、100U/mL盤尼西林及100μg/mL鏈黴素的RPMI1640調製為2.0x106個細胞/mL之濃度的PBMC，各接種80μL於96-孔細胞培養盤中，添加各種抗人類Orai1抗體10μL/孔，並於37℃培養箱內前處理60分鐘。之後，將100ng/mLPMA及1μg/mL A23187以10μL/孔添加，充分攪拌後，於37℃、5% CO2下培養約16小時。將平盤充分攪拌後，以600g離心3分鐘，將上清液所含的IL-2濃度及干擾素γ(IFN-γ)濃度(MABTECH公司)以ELISA法來測定。第51圖表示抗人類Orai1抗體係添加濃度依存性地抑制自經 PMA及A23187處理的人類PBMC之IL-2的放出。第52圖表示將抗體非添加時之IL-2濃度作為100%時之hR198_HG1/LG1、hR198_HG1-LALA/LG1、2C1.1、5H3.1、10F8、14F74、17F6之半數抑制濃度(IC50)及80%抑制濃度(IC80)。先前技術之抗體之IC50為100ng/mL以上，另一方面，本發明之代表性抗體之IC50為20ng/mL以下。又先前技術之抗體之IC80為17000ng/mL以上，另一方面，本發明之代表性抗體之IC80為400ng/mL以下。第53圖表示抗人類Orai1抗體係添加濃度依存性地抑制自經PMA及A23187處理的人類PBMC之IFN-γ的放出。第54圖表示將抗體非添加時之IFN-γ濃度作為100%時之hR198_HG1/LG1、hR198_HG1-LALA/LG1、2C1.1、5H3.1、10F8、14F74、17F6之半數抑制濃度(IC50)及80%抑制濃度(IC80)。先前技術之抗體之IC50為800ng/mL以上，另一方面，本發明之代表性抗體之IC50為40ng/mL以下。又先前技術之抗體之IC80為300000ng/mL以上，另一方面，本發明之代表性抗體之IC80為2000ng/mL以下。
[實施例16]hR198_HG1/LG1之活體內活性
16)-1 對人類PBMC移入小鼠移植物抗宿主病模型之hR198_HG1/LG1的投予效果
已知藉由於為重度複合免疫不全小鼠的NSG小鼠(NOD.Cg-Prkdc<scid>Il2rg<tm1Wjl>/SzJ)移入人類PBMC，可誘導人類移植物抗宿主病樣之反應(Clinical and Experimental Immunology,157：104-118(2009))。對購自日本Charles River公司的6週齡之雄性NSG小鼠17隻 照射2.0Gy之X射線後(日立X射線照射裝置MBR-1520R-4)，將小鼠分成每組2隻的1組與每組5隻的3組。將以HBSor(25mM組胺酸/5%山梨醇，pH6.0)調製成3mg/mL及6mg/mL的hR198_HG1/LG1以10mL/kg，即成為30mg/kg及60mg/kg的方式，尾靜脈內投予至2組(n=5)之小鼠。1組(n=5)僅投予HBSor作為媒劑(vehicle)組。翌日，將冷凍的人類PBMC(Cellular Technology公司)，使用CTL-antiaggrigate(Cellular Technology公司)而依據手冊解凍，使3百萬個人類PBMC游離於200μL之PBS而移入至3組(n=5)之小鼠，1組(n=2)係未移入人類PBMC並作為X射線照射對照組群而觀察經過。對於投予組，係於X照射後第0日、7日、14日、21日投予同用量之hR198_HG1/LG1或HBSor。各小鼠之體重係第0日、1日、4日、7日、9日、10日、11日與13日以後的每一日進行計測，將第0日之體重作為100%而將體重變化換算百分比，將各組之平均體重變化示於第55圖。媒劑投予組之平均體重的減少自約第16日起開始被觀察到。實驗係於媒劑投予組之平均體重低於80%的第21日結束。於此時點，未移入人類PBMC的X射線照射對照組群未顯示體重減少。將hR198_HG1/LG1以30mg/kg及60mg/kg投予的小鼠體重亦未減少，且平均體重與人類PBMC非移入小鼠同等。對於在本系統顯著地抑制「利用人類PBMC之活性化的移植物抗宿主病之症狀」的hR198_HG1/LG1(抗Orai1抗體)，期待對人類移植物抗宿主病的治療及/或預防效果。
16)-2 使用人類Orai1植入小鼠的hR198_HG1/LG1之活體內活性評價
16)-2-1 人類Orai1植入小鼠之作出
將小鼠Orai1之第2細胞外環功能域之胺基酸序列取代為人類Orai1序列的人類Orai1植入小鼠，係依據基因改造小鼠製作的通用方法，由特殊免疫研究所股份有限公司作出。記載概要時，將含小鼠Orai1基因座的BAC株之編碼區域的DNA序列取代為人類Orai1基因座的同時，導入以loxP序列包夾的新耐性基因，而構築人類Orai1基因之植入標靶載體。將此標靶載體導入小鼠ES細胞，而建立G418耐性株。藉由南方氏雜交法，篩選標的基因座被特異性重組的ES細胞株。再者，導入Cre表現載體而去除選擇標記，利用其ES細胞株而作出嵌合F1小鼠。以南方氏雜交進行基因分型(genotyping)，自F1小鼠之中篩選雜變異體個體，藉由與此F1雜變異體個體之交配，作出為F2同源變異體(homomutant)的人類Human Orai1植入小鼠。
16)-2-2 hR198_HG1/LG1之被動皮膚重度過敏(PCA)反應抑制效果
小鼠PCA反應係依據通用方法進行。將特殊免疫研究所所生產的8週齡人類Orai1植入小鼠或野生型之同胎兄弟小鼠以保定器保定後，將以HBSor調製成6mg/mL的hR198_HG1/LG1以成為10mL/kg、即成為60mg/kg的方式作尾靜脈內投予。媒劑組僅投予HBSor。翌日於異氟烷(isoflurane)(Pfizer公司)吸入麻醉下，將以生理食鹽水調 整為10ug/mL的單株抗OVA IgE(chondrex公司)以各10μL投予耳殼皮內。24小時後，將含2mg/mL之OVA(來自雞蛋白的白蛋白，SIGMA公司)及20mg/mL之伊凡氏藍(Evans blue，Merck公司)的生理食鹽水，以成為5mg/kgOVA及100mg/kg伊凡氏藍的方式作尾靜脈內投予。30分鐘後，於異氟烷深麻醉下，使其放血致死而切除耳殼，浸漬於0.5mL之DMSO，提取伊凡氏藍(37℃、72小時)。將伊凡氏藍被提取的DMSO溶液各200μL移至96孔微量盤，以微量盤讀取器(Molecular devices公司，SpectraMax M5e)測量O.D.650nm。浸出的伊凡氏藍之吸光度係依據以下之計算法，將媒劑投予組之平均值作為100%來表示。對於空白組係求得DMSO溶液之吸光度。%=(OD650樣品-OD650空白組)/(OD650媒劑組-OD650空白組)。第56圖表示hR198_HG1/LG1抑制於人類Orai1植入小鼠誘導的PCA反應。小鼠PCA反應係再現人類之I型過敏反應的重度過敏的即時型過敏之基本的模型系統，已知本系統可使用於抗過敏藥之評價(Archives internationales de pharmacodynamie et de therapie,165：92-102(1967)、International archives of allergy and applied immunology,78：113-117(1985))。對於在本系統對IgE依存性肥大細胞去顆粒(degranulation)的抑制活性被認可的hR198_HG1/LG1(抗Orai1抗體)，期待對於原有的肥大細胞去顆粒抑制藥被認可的支氣管氣喘、過敏性鼻炎、異位性皮膚炎，進而對於相同的人類之I型過敏疾病，例如過敏性氣喘等的治療及/或預防效果。
16)-2-3 hR198_HG1/LG1之延遲型過敏(DTH)反應抑制效果
小鼠DTH反應係依據通用方法進行。將特殊免疫研究所所生產的8週齡人類Orai1植入小鼠或野生型之同胎兄弟小鼠以保定器保定後，將以HBSor調製成6mg/mL的hR198_HG1/LG1以成為10mL/kg、即成為60mg/kg的方式作尾靜脈內投予。媒劑組僅投予HBSor。翌日將以生理食鹽水稀釋為5mg/mL的mBSA(甲基化牛白蛋白(Albumin Bovine Methylated)，SIGMA公司)與弗氏完全佐劑(Freund‘s Complete Adjuvant(DIFCO公司))等量混合而調製的乳劑各50μL皮下投予至兩腋下而進行免疫。6日後，再次將hR198_HG1/LG1以成為60mg/kg的方式作尾靜脈內投予。翌日將以生理食鹽水調製為0.5mg/mL的mBSA與生理食鹽水各自皮內投予至異氟烷吸入麻醉下方肢，投予後6、24、48小時後之肢之腫脹以針盤量規(dial gauge)測定。肢之腫脹係將0小時作為0(10-2mm)，計算經時變化的腫脹的厚度，並將媒劑投予組之平均值作為100%而求得。第57圖係表示於抗原投予後小6時(A)24小時(B)48小時(C)之各時點，hR198_HG1/LG1係抑制於人類Orai1植入小鼠誘導的DTH反應。小鼠DTH反應係觀察T細胞依存性免疫之成立與反應的系統，已知於本系統顯示活性的藥劑被開發作為強力免疫抑制劑(Clinical and Experimental Immunology,52：599-606(1983))。對於在本系統T細胞免疫之抑制活性被認可的hR198_HG1/LG1(抗Orai1抗體)，期待對起因於T細胞活性的人類之活體反 應或疾病，例如移植物之排斥、免疫疾病、炎症性疾病的治療及/或預防效果。
16)-2-4 抗Orai1抗體之對皮膚炎的抑制活性之檢討
皮膚炎係藉由以下任一種之方法引起。即於小鼠之腹腔內投予0.5mL白蛋白抗原液，再於2週後以同量之抗原施予追加免疫後，將白蛋白抗原液於每3日~2週重複3~6次塗布於耳(20μL)或背部(100μL)。或者將蟎蜱抗原乳霜於每3日~2週重複3~6次塗布於耳(20μL)或背部(100μL)。或依據程序調製為半抗原(hapten)的2,4,6-三硝氯苯(picryl chloride)或二硝氟苯(Dinitrofluorobenzene)，每週1次或2次，最大8週塗布於耳(20μL)或背部(100μL)。或者將為皮膚反應誘發物質的組胺酸、化合物40/80、5-(及6-)羧基螢光素二乙酸酯琥珀醯亞胺酯(carboxyfluorescein diacetate succinimydyl ester)、異硫氰酸螢光素酯(Fluorescein isothiocyanate)、鈴蟾素(Bombesin)樣胜肽投予至耳(20μL)、背部(100μL)、脊髓內(5μL)。抗Orai1抗體係於皮膚炎誘導之前日或1小時間至4小時前投予至靜脈內或皮下。之後，將投予頻率採7日至28日間隔而繼續抗體投予。皮膚炎誘發後，經時地使用針盤式厚度量規(dial thickness gauge)，進行耳殼厚度的測定或皮膚炎之肉眼的分數化。又試驗期間結束後，實施血液或組織中之抗體‧細胞激素‧血中生物標記濃度之定量、自皮膚‧末梢血‧胸腺‧脾臟‧淋巴節‧骨髓所獲得的細胞之增殖活性或細胞激素產生能力、表 面抗原等之檢討、或病理組織解析等，而判定抗Orai1抗體之對皮膚炎的抑制活性。
16)-2-5 抗Orai1抗體之對乾癬的抑制活性之檢討
使用咪喹莫特的情形，係塗布於耳殼兩側或單側(5~30mg)及已剃毛的背部(50~100mg)而誘導乾癬性皮膚炎。或者將10mg/mL之酵母聚醣磷酸緩衝液中懸浮液200uL作腹腔內投予而誘導皮膚炎。使用細胞激素(IL-23等)作為造成發炎的物質的情形，係於1~5%異氟烷深麻醉下，對小鼠耳殼單側皮內投予20~50μL之含細胞激素0.1~2μg的溶液而誘導乾癬性皮膚炎。抗Orai1抗體係於皮膚炎誘導之前日或1小時至4小時前於靜脈內或皮下投予。之後，採投予頻率為7日至28日間隔而繼續抗體投予。皮膚炎誘發後，經時地使用針盤式厚度量規而進行耳殼之厚度測定或皮膚炎之肉眼的分數化。又試驗期間結束後，實施炎症部位之重量及浸潤於其部位的嗜中性球之髓過氧化酶(myeloperoxidase)活性、浸潤的細胞之流式細胞儀解析、基因解析、細胞激素濃度測定等，而判定抗Orai1抗體之乾癬抑制活性。
16)-2-6 抗Orai1抗體之對多發性硬化症的抑制活性之檢討
將髓磷質寡樹突膠細胞醣蛋白或其胜肽抗原以生理食鹽水調整為4mg/mL，與以生理食鹽水調整為8mg/mL的弗氏完全佐劑等量混合而乳化，將此混合液投予200μL至小鼠之脇腹或腹部之皮內，之後立即於同一小鼠自尾 靜脈投予2μg/mL之百日咳毒素水溶液100μL。再者，藉由2日後將上述之百日咳毒素液再度自尾靜脈投予而誘導實驗性腦脊髓炎。實驗開始1週至2週後，腦脊髓炎發病，自尾至下肢、前肢的麻痺擴大。將此麻痺之程度藉由肉眼觀察四肢‧尾之活動而分數化。抗Orai1抗體係於腦脊髓炎誘導之前日或1小時至4小時投予至靜脈內或皮下。之後，採投予頻率為7日至28日間隔而繼續抗體投予，判定抗Orai1抗體之對多發性硬化症的投予效果。
16)-2-7 抗Orai1抗體之對關節炎的抑制活性之檢討
將使2mg/mL之牛II型膠原蛋白與弗氏完全佐劑以體積比1：1.3混合而乳化者，使用1mL之注射筒與結核菌素針而投予100μL至小鼠之尾根部皮內。2~3週後實施相同處置，之後將四肢之關節腫脹使用肉眼或針盤式厚度量規而分數化。試驗期間結束時，測定血液或組織中之抗體‧細胞激素‧血中生物標記濃度、自皮膚‧末梢血‧胸腺‧脾臟‧淋巴節‧骨髓所獲得的細胞之增殖活性‧細胞激素產生能力‧表面抗原等。抗Orai1抗體係於關節炎誘導之前日或1小時至4小時前投予至靜脈內或皮下。之後，將投予頻率採取7日至28日間隔而繼續抗體投予，而判定抗Orai1抗體之對關節炎的投予效果。
16)-2-8 抗Orai1抗體之對大腸炎的抑制活性之檢討
將自人類Orai1植入小鼠之淋巴節與脾臟採取的純化淋巴球，使用抗CD4抗體GK1.5、抗CD25抗體PC61.5 、抗CD45R抗體C363.16A(任一者皆為eBioscience公司)而藉由細胞分選儀(cell sorter)單離。將此方法所獲得的細胞以流式細胞儀確認為純度95%以上之CD4+CD25-CD45RBhi T-細胞後，將50萬個移入至12至16週齡之Rag2-/-小鼠之腹腔內。之後12週，體重測定及觀察下痢等之症狀，觀察期間結束後經由剖檢檢討腸管之肥厚度、息肉個數及大小、病理的特徵之有無。又解析血液或組織中之抗體‧細胞激素‧血中生物標記濃度之定量、自腸管‧末梢血‧胸腺‧脾臟‧淋巴節‧骨髓所獲得的細胞之增殖活性或細胞激素產生能力、表面抗原等。抗Orai1抗體係於細胞移入之前日或1小時至4小時前投予至靜脈內或皮下。之後，採取投予頻率為7日至28日間隔而繼續抗體投予，而判定抗Orai1抗體之對大腸炎的投予效果。
16)-2-9 抗Orai1抗體之對骨髓細胞移植系統的作用之檢討
摘出人類Orai1植入小鼠之大腿骨及脛骨，使用附針注射筒而自骨端注入10%FBS-RPMI1640培養基1~5mL，將骨髓內之細胞壓出，藉由細胞過濾器(Cell Strainer)處理後之離心沉澱回收將骨髓細胞回收，於含有10mMHEPES、0.5mMEDTA、0.5%盤尼西林/鏈黴素的注射緩衝液中以200μL中含有1千萬個骨髓細胞的方式來調整。同時，由人類Orai1植入小鼠之脾臟，依據通用方法來採取脾臟細胞。對為接受者的10~13週齡之BALB/c小鼠照射2.0~8.0Gy之X射線後，於200μL之供給者骨髓細 胞中添加0~4百萬個之供給者脾臟細胞，將此細胞混合液自接受者之尾靜脈注入。之後，測量4至16週之體重變化或生存率、試驗結束時之接受者小鼠之血液或組織中之抗體‧細胞激素‧血中生物標記濃度、自腸管‧末梢血‧胸腺‧脾臟‧淋巴節‧骨髓獲得的細胞之表面抗原‧增殖活性‧細胞激素產生能力。抗Orai1抗體係於骨髓移植之前日或1小時至4小時前經靜脈內或皮下投予至接受者小鼠。之後，採投予頻率7日至28日間隔而繼續抗體投予，判定抗Orai1抗體之對移植細胞之生著或移植物抗宿主病之發生率的作用。
[實施例17]親和性成熟抗體與其他抗人類Orai1抗體之物理化學的性質之比較
利用m-VROC的黏度測定
將10)-3所製作的hR198_HG1/LG1、hR198_H3/LG1、12)-3所製作的hR198_HG1-LALA/LG1、及13)-6所製作的2C1.1，以VIVAPORE 5(Sartorius公司)濃縮至150mg/mL以上後，以HBSor調製為90、120及150mg/mL。各濃度使用m-VROC(RheoSense公司)而測量25℃中的黏度3次，而算出平均黏度(mPa．s)。將結果示於第58圖及表1。hR198_HG1/LG1、hR198_H3/LG1、hR198_HG1-LALA/LG1之黏度係於任一濃度皆較2C1.1之黏度為更低。尤其，於150mg/mL，相對於hR198_HG1/LG1、hR198_H3/LG1、hR198_HG1-LALA/LG1之黏度各別為11.4、10.0、10.8mPa．s，2C1.1為21.0mPa．s，與2C1.1比較，顯示親和性成熟抗體即使高濃度化黏度亦低。
[產業上之可利用性]
本發明之人化抗Orai1抗體具有較周知之抗體更強力的T細胞活性抑制作用，可成為移植排斥等之治療或預防劑。
[序列表非關鍵詞文字]
序列識別號1：人類Orai1之基因序列
序列識別號2：人類Orai1之胺基酸序列
序列識別號3：PCR引子Nhe-polyC-S
序列識別號4：PCR引子rIgγ-AS1
序列識別號5：PCR引子rIgγ-AS2
序列識別號6：PCR引子Nhe-polyC-S
序列識別號7：PCR引子rIgκ-AS
序列識別號8：定序引子rIgγ-seq
序列識別號9：定序引子rIgκ-seq
序列識別號10：編碼R118輕鏈的核苷酸序列
序列識別號11：R118輕鏈之胺基酸序列
序列識別號12：編碼R118重鏈的核苷酸序列
序列識別號13：R118重鏈之胺基酸序列
序列識別號14：編碼R198輕鏈的核苷酸序列
序列識別號15：R198輕鏈之胺基酸序列
序列識別號16：編碼R198重鏈的核苷酸序列
序列識別號17：R198重鏈之胺基酸序列
序列識別號18：包含編碼人類κ鏈分泌訊息及人類κ鏈恆定區的序列的DNA片段
序列識別號19：PCR引子3.3-F1
序列識別號20：PCR引子3.3-R1
序列識別號21：包含編碼人類重鏈訊息序列及人類IgG1恆定區之胺基酸的序列的DNA片段
序列識別號22：編碼人類嵌合化cR118輕鏈的核苷酸序列
序列識別號23：人類嵌合化cR118輕鏈之胺基酸序列
序列識別號24：編碼人類嵌合化cR198輕鏈的核苷酸序列
序列識別號25：人類嵌合化cR198輕鏈之胺基酸序列
序列識別號26：編碼人類嵌合化cR118重鏈的核苷酸序列
序列識別號27：人類嵌合化cR118重鏈之胺基酸序列
序列識別號28：編碼人類嵌合化cR198重鏈的核苷酸序列
序列識別號29：人類嵌合化cR198重鏈之胺基酸序列
序列識別號30：編碼hR198_L1型輕鏈的核苷酸序列
序列識別號31：hR198_L1型輕鏈之胺基酸序列
序列識別號32：編碼hR198_L2型輕鏈的核苷酸序列
序列識別號33：hR198_L2型輕鏈之胺基酸序列
序列識別號34：編碼hR198_L3型輕鏈的核苷酸序列
序列識別號35：hR198_L3型輕鏈之胺基酸序列
序列識別號36：編碼hR198_L4型輕鏈的核苷酸序列
序列識別號37：hR198_L4型輕鏈之胺基酸序列
序列識別號38：編碼hR198_H1型重鏈的核苷酸序列
序列識別號39：hR198_H1型重鏈之胺基酸序列
序列識別號40：編碼hR198_H2型重鏈的核苷酸序列
序列識別號41：hR198_H2型重鏈之胺基酸序列
序列識別號42：編碼hR198_H3型重鏈的核苷酸序列
序列識別號43：hR198_H3型重鏈之胺基酸序列
序列識別號44：編碼hR198_H4型重鏈的核苷酸序列
序列識別號45：hR198_H4型重鏈之胺基酸序列
序列識別號46：PCR引子Orai1 HF
序列識別號47：PCR引子Orai1 CH FR
序列識別號48：PCR引子M13 rev long
序列識別號49：PCR引子SecM Stop R
序列識別號50：PCR引子Orai1 Lc F
序列識別號51：PCR引子Orai1 CL-FR
序列識別號52：PCR引子Orai1 HR-FLAG R
序列識別號53：PCR引子Orai1 CL-FLAG R
序列識別號54：PCR引子Myc-R
序列識別號55：編碼hR198_LG1型輕鏈的核苷酸序列
序列識別號56：hR198_LG1型輕鏈之胺基酸序列
序列識別號57：編碼hR198_LG2型輕鏈的核苷酸序列
序列識別號58：hR198_LG2型輕鏈之胺基酸序列
序列識別號59：編碼hR198_LG3型輕鏈的核苷酸序列
序列識別號60：hR198_LG3型輕鏈之胺基酸序列
序列識別號61：編碼hR198_HG1型重鏈的核苷酸序列
序列識別號62：hR198_HG1型重鏈之胺基酸序列
序列識別號63：編碼hR198_HG2型重鏈的核苷酸序列
序列識別號64：hR198_HG2型重鏈之胺基酸序列
序列識別號65：編碼hR198_HG3型重鏈的核苷酸序列
序列識別號66：hR198_HG3型重鏈之胺基酸序列
序列識別號67：編碼hR198_H4-LALA型重鏈的核苷酸序列
序列識別號68：hR198_H4-LALA型重鏈之胺基酸序列
序列識別號69：編碼hR198_HG1-LALA型重鏈的核苷酸序列
序列識別號70：hR198_HG1-LALA型重鏈之胺基酸序列
序列識別號71：包含編碼人類重鏈分泌訊息及人類IgG2恆定區之胺基酸的序列的DNA片段
序列識別號72：編碼2C1.1抗體重鏈的核苷酸序列
序列識別號73：2C1.1抗體重鏈之胺基酸序列
序列識別號74：編碼2C1.1抗體輕鏈的核苷酸序列
序列識別號75：2C1.1抗體輕鏈之胺基酸序列
序列識別號76：編碼5H3.1抗體重鏈的核苷酸序列
序列識別號77：5H3.1抗體重鏈之胺基酸序列
序列識別號78：編碼5H3.1抗體輕鏈的核苷酸序列
序列識別號79：5H3.1抗體輕鏈之胺基酸序列
序列識別號80：編碼10F8抗體重鏈的核苷酸序列
序列識別號81：10F8抗體重鏈之胺基酸序列
序列識別號82：編碼10F8抗體輕鏈的核苷酸序列
序列識別號83：10F8抗體輕鏈之胺基酸序列
序列識別號84：編碼14F74抗體重鏈的核苷酸序列
序列識別號85：14F74抗體重鏈之胺基酸序列
序列識別號86：編碼14F74抗體輕鏈的核苷酸序列
序列識別號87：14F74抗體輕鏈之胺基酸序列
序列識別號88：編碼17F6抗體重鏈的核苷酸序列
序列識別號89：17F6抗體重鏈之胺基酸序列
序列識別號90：編碼17F6抗體輕鏈的核苷酸序列
序列識別號91：17F6抗體輕鏈之胺基酸序列
序列識別號92：大鼠CDRL1(來自R198，使用於hR198_L1至L4型輕鏈)
序列識別號93：改造型CDRL1(使用於hR198_LG1型輕鏈)
序列識別號94：改造型CDRL1(使用於hR198_LG2型輕鏈)
序列識別號95：改造型CDRL1(使用於hR198_LG3型輕鏈)
序列識別號96：大鼠CDRL2(於R118及R198為共通，使用於hR198_L1至L4及LG1型輕鏈)
序列識別號97：改造型CDRL2(使用於hR198_LG2型輕鏈)
序列識別號98：改造型CDRL2(使用於hR198_LG3型輕鏈)
序列識別號99：大鼠CDRL3(來自R118，使用於hR198_L3及L4型輕鏈)
序列識別號100：大鼠CDRL3(來自R198，使用於hR198_L1及L2型輕鏈)
序列識別號101：改造型CDRL3(使用於hR198_LG1至LG3型輕鏈)
序列識別號102：大鼠CDRH1(來自R118，使用於hR198_H3、H4及HG1至HG4型重鏈)
序列識別號103：大鼠CDRH1(來自R198，使用於hR198_H1及H2型重鏈)
序列識別號104：大鼠CDRH2(來自R118，使用於hR198_H3及H4型重鏈)
序列識別號105：大鼠CDRH2(來自R198，使用於hR198_H1及H2型重鏈)
序列識別號106：改造型CDRH2(使用於hR198_HG1型重鏈)
序列識別號107：改造型CDRH2(使用於hR198_HG2型重鏈)
序列識別號108：改造型CDRH2(使用於hR198_HG3型重鏈)
序列識別號109：大鼠CDRH3(於R118及R198為共通 ，使用於hR198_H1至H4型重鏈)
序列識別號110：改造型CDRH3(使用於hR198_HG1至HG3型重鏈)
序列識別號111：編碼hR198_H0型重鏈的核苷酸序列
序列識別號112：hR198_H0型重鏈之胺基酸序列
序列識別號113：編碼hR198_H5型重鏈的核苷酸序列
序列識別號114：hR198_H5型重鏈之胺基酸序列
序列識別號115：生物素PEG化人類Orai1環區域胜肽序列
序列識別號116：大鼠CDRL1(來自R118，但於人化抗體並未被使用)
<110> 第一三共股份有限公司
<120> 抗Orai1抗體
<130> FP1522
<160> 116
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 906
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
<210> 2
<211> 301
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
<210> 3
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PCR引子Nhe-polyC-S
<220>
<221> 未歸類的特徵(misc_feature)
<222> (37)..(37)
<223> n為a、c、g或t
<400> 3
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PCR引子rIg gamma-AS1
<400> 4
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PCR引子rIG gamma-AS2
<400> 5
<210> 6
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PCR引子Nhe-polyC-S
<220>
<221> 未歸類的特徵
<222> (37)..(37)
<223> n為a、c、g或t
<400> 6
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> rIg kappa-AS
<400> 7
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> rIG gamma-seq
<400> 8
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> rIG kappa-seq
<400> 9
<210> 10
<211> 405
<212> DNA
<213> 玄鼠(Rattus rattus)
<220>
<221> 未歸類的特徵
<222> (382)..(382)
<223> n為a、c、g或t
<220>
<221> 未歸類的特徵
<222> (403)..(403)
<223> n為a、c、g或t
<400> 10
<210> 11
<211> 135
<212> PRT
<213> 玄鼠
<220>
<221> 未歸類的特徵
<222> (128)..(128)
<223> Xaa可為任一自然發生的胺基酸
<220>
<221> 未歸類的特徵
<222> (135)..(135)
<223> Xaa可為任一自然發生的胺基酸
<400> 11
<210> 12
<211> 468
<212> DNA
<213> 玄鼠
<220>
<221> 未歸類的特徵
<222> (467)..(467)
<223> n為a、c、g或t
<400> 12
<210> 13
<211> 156
<212> PRT
<213> 玄鼠
<220>
<221> 未歸類的特徵
<222> (156)..(156)
<223> Xaa可為任一自然發生的胺基酸
<400> 13
<210> 14
<211> 408
<212> DNA
<213> 玄鼠
<220>
<221> 未歸類的特徵
<222> (403)..(403)
<223> n為a、c、g或t
<400> 14
<210> 15
<211> 136
<212> PRT
<213> 玄鼠
<220>
<221> 未歸類的特徵
<222> (135)..(135)
<223> Xaa可為任一自然發生的胺基酸
<400> 15
<210> 16
<211> 471
<212> DNA
<213> 玄鼠
<220>
<221> 未歸類的特徵
<222> (469)..(469)
<223> n為a、c、g或t
<400> 16
<210> 17
<211> 157
<212> PRT
<213> 玄鼠
<220>
<221> 未歸類的特徵
<222> (157)..(157)
<223> Xaa可為任一自然發生的胺基酸
<400> 17
<210> 18
<211> 449
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 編碼人類輕鏈分泌訊息及人類Kappa恆定區的核苷酸序列
<400> 18
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PCR引子3.3-F1
<400> 19
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PCR引子3.3-R1
<400> 20
<210> 21
<211> 1132
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 編碼人類重鏈分泌訊息及人類IgG1恆定區的核苷酸序列
<400> 21
<210> 22
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 編碼cR118_L的核苷酸序列
<400> 22
<210> 23
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> cR118_L之胺基酸序列
<400> 23
<210> 24
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 編碼cR198_L的核苷酸序列
<400> 24
<210> 25
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> cR198_L之胺基酸序列
<400> 25
<210> 26
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 編碼cR118_H的核苷酸序列
<400> 26
<210> 27
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> cR118_H之胺基酸序列
<400> 27
<210> 28
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 編碼cR198_H的核苷酸序列
<400> 28
<210> 29
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> cR198_H之胺基酸序列
<400> 29
<210> 30
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 編碼hR198_L1的核苷酸序列
<400> 30
<210> 31
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> hR198_L1之胺基酸序列
<400> 31
<210> 32
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 編碼hR198_L2的核苷酸序列
<400> 32
<210> 33
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> hR198_L2之胺基酸序列
<400> 33
<210> 34
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 編碼hR198_L3的核苷酸序列
<400> 34
<210> 35
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> hR198_L3之胺基酸序列
<400> 35
<210> 36
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 編碼hR198_L4的核苷酸序列
<400> 36
<210> 37
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> hR198_L4之胺基酸序列
<400> 37
<210> 38
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 編碼hR198_H1的核苷酸序列
<400> 38
<210> 39
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> hR198_H1之胺基酸序列
<400> 39
<210> 40
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 編碼hR198_H2的核苷酸序列
<400> 40
<210> 41
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> hR198_H2之胺基酸序列
<400> 41
<210> 42
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 編碼hR198_H3的核苷酸序列
<400> 42
<210> 43
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> hR198_H3之胺基酸序列
<400> 43
<210> 44
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 編碼hR198_H4的核苷酸序列
<400> 44
<210> 45
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> hR198_H4之胺基酸序列
<400> 45
<210> 46
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PCR引子Orai1 HF
<400> 46
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PCR引子Orai1 CH FR
<400> 47
<210> 48
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PCR引子M13 rev long
<400> 48
<210> 49
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PCR引子SecM Stop R
<400> 49
<210> 50
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PCR引子Orai1 Lc F
<400> 50
<210> 51
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PCR引子Orai1 CL-FR
<400> 51
<210> 52
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PCR引子Orai1 HR-FLAG R
<400> 52
<210> 53
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PCR引子Orai1 CL-FLAG R
<400> 53
<210> 54
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PCR引子Myc-R
<400> 54
<210> 55
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 編碼hR198_LG1的核苷酸序列
<400> 55
<210> 56
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> hR198_LG1之胺基酸序列
<400> 56
<210> 57
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 編碼hR198_LG2的核苷酸序列
<400> 57
<210> 58
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> hR198_LG2之胺基酸序列
<400> 58
<210> 59
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 編碼hR198_LG3的核苷酸序列
<400> 59
<210> 60
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> hR198_LG3之胺基酸序列
<400> 60
<210> 61
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 編碼hR198_HG1的核苷酸序列
<400> 61
<210> 62
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> hR198_HG1之胺基酸序列
<400> 62
<210> 63
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 編碼hR198_HG2的核苷酸序列
<400> 63
<210> 64
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> hR198_HG2之胺基酸序列
<400> 64
<210> 65
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 編碼hR198_HG3的核苷酸序列
<400> 65
<210> 66
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> hR198_HG3之胺基酸序列
<400> 66
<210> 67
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 編碼hR198_H4-LALA的核苷酸序列
<400> 67
<210> 68
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> hR198_H4-LALA之胺基酸序列
<400> 68
<210> 69
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 編碼hR198_HG1-LALA的核苷酸序列
<400> 69
<210> 70
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> hR198_HG1-LALA之胺基酸序列
<400> 70
<210> 71
<211> 1118
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 編碼人類重鏈分泌訊息及人類IgG2恆定區的核苷酸序列
<400> 71
<210> 72
<211> 1395
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 編碼2C1.1之重鏈的核苷酸序列
<400> 72
<210> 73
<211> 465
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 2C1.1之重鏈之胺基酸序列
<400> 73
<210> 74
<211> 739
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 編碼2C1.1之輕鏈之核苷酸序列
<400> 74
<210> 75
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 2C1.1之輕鏈之胺基酸序列
<400> 75
<210> 76
<211> 1395
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 編碼5H3.1之重鏈之核苷酸序列
<400> 76
<210> 77
<211> 465
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 5H3.1之重鏈之胺基酸序列
<400> 77
<210> 78
<211> 742
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 編碼5H3.1之輕鏈之核苷酸序列
<400> 78
<210> 79
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 5H3.1之輕鏈之胺基酸序列
<400> 79
<210> 80
<211> 1433
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 編碼10F8之重鏈之核苷酸序列
<400> 80
<210> 81
<211> 461
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 10F8之重鏈之胺基酸序列
<400> 81
<210> 82
<211> 770
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 編碼10F8之輕鏈之核苷酸序列
<400> 82
<210> 83
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 10F8之輕鏈之胺基酸序列
<400> 83
<210> 84
<211> 1436
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 編碼14F74之重鏈之核苷酸序列
<400> 84
<210> 85
<211> 462
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 14F74之重鏈之胺基酸序列
<400> 85
<210> 86
<211> 767
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 編碼14F74之輕鏈之核苷酸序列
<400> 86
<210> 87
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 14F74之輕鏈之胺基酸序列
<400> 87
<210> 88
<211> 1436
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 編碼17F6之重鏈之核苷酸序列
<400> 88
<210> 89
<211> 462
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 17F6之重鏈之胺基酸序列
<400> 89
<210> 90
<211> 767
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 編碼17F6之輕鏈之核苷酸序列
<400> 90
<210> 91
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 17F6之輕鏈之胺基酸序列
<400> 91
<210> 92
<211> 11
<212> PRT
<213> 玄鼠
<400> 92
<210> 93
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> hR198_LG1之CDRL1
<400> 93
<210> 94
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> hR198_LG2之CDRL1
<400> 94
<210> 95
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> hR198_LG3之CDRL1
<400> 95
<210> 96
<211> 7
<212> PRT
<213> 玄鼠
<400> 96
<210> 97
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> hR198_LG2之CDRL2
<400> 97
<210> 98
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> hR198_LG3之CDRL2
<400> 98
<210> 99
<211> 9
<212> PRT
<213> 玄鼠
<400> 99
<210> 100
<211> 9
<212> PRT
<213> 玄鼠
<400> 100
<210> 101
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> hR198_LG1至LG3之CDRL3
<400> 101
<210> 102
<211> 5
<212> PRT
<213> 玄鼠
<400> 102
<210> 103
<211> 5
<212> PRT
<213> 玄鼠
<400> 103
<210> 104
<211> 17
<212> PRT
<213> 玄鼠
<400> 104
<210> 105
<211> 17
<212> PRT
<213> 玄鼠
<400> 105
<210> 106
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> hR198_HG1之CDRH2
<400> 106
<210> 107
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> hR198_HG2之CDRH2
<400> 107
<210> 108
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> hR198_HG3之CDRH2
<400> 108
<210> 109
<211> 8
<212> PRT
<213> 玄鼠
<400> 109
<210> 110
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> hR198_HG1至HG3之CDRH3
<400> 110
<210> 111
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 編碼hR198_H0的核苷酸序列
<400> 111
<210> 112
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> hR198_H0之胺基酸序列
<400> 112
<210> 113
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 編碼hR198_H5的核苷酸序列
<400> 113
<210> 114
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> hR198_H5之胺基酸序列
<400> 114
<210> 115
<211> 48
<212> PRT
<213> 智人
<400> 115
<210> 116
<211> 11
<212> PRT
<213> 玄鼠
<400> 116

Claims (32)

  1. 一種抗體或該抗體之抗原結合性片段，其特徵為與序列識別號2記載之胺基酸序列特異性地結合，其中重鏈序列包含具有CDRH1、CDRH2、及CDRH3的可變區，且前述CDRH1包含序列識別號102所示的胺基酸序列，前述CDRH2包含序列識別號104、106、107或108中任一者所示的胺基酸序列，前述CDRH3包含序列識別號109或110所示的胺基酸序列；及輕鏈序列包含具有CDRL1、CDRL2、及CDRL3的可變區，且前述CDRL1包含序列識別號93、94或95中任一者所示的胺基酸序列，前述CDRL2包含序列識別號96、97或98中任一者所示的胺基酸序列，前述CDRL3包含序列識別號101所示的胺基酸序列。
  2. 如請求項1之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其中重鏈序列包含具有CDRH1、CDRH2、及CDRH3的可變區，且前述CDRH1包含序列識別號102所示的胺基酸序列，前述CDRH2包含序列識別號106所示的胺基酸序列，前述CDRH3包含序列識別號110所示的胺基酸序列；及輕鏈序列包含具有CDRL1、CDRL2、及CDRL3的可變區，且前述CDRL1包含序列識別號93所示的胺基酸序列，前述CDRL2包含序列識別號96所示的胺基酸序列，前述CDRL3包含序列識別號101所示的胺基酸序列。
  3. 如請求項1之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其中重鏈序列包含具有CDRH1、CDRH2、及CDRH3的可變區，且前述CDRH1包含序列識別號102所示的胺基酸序列，前述CDRH2包含序列識別號106所示的胺基酸序列，前述CDRH3包含序列識別號110所示的胺基酸序列；及輕鏈序列包含具有CDRL1、CDRL2、及CDRL3的可變區，且前述CDRL1包含序列識別號94所示的胺基酸序列，前述CDRL2包含序列識別號97所示的胺基酸序列，前述CDRL3包含序列識別號101所示的胺基酸序列。
  4. 如請求項1之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其中重鏈序列包含具有CDRH1、CDRH2、及CDRH3的可變區，且前述CDRH1包含序列識別號102所示的胺基酸序列，前述CDRH2包含序列識別號106所示的胺基酸序列，前述CDRH3包含序列識別號110所示的胺基酸序列；及輕鏈序列包含具有CDRL1、CDRL2、及CDRL3的可變區，且前述CDRL1包含序列識別號95所示的胺基酸序列，前述CDRL2包含序列識別號98所示的胺基酸序列，前述CDRL3包含序列識別號101所示的胺基酸序列。
  5. 如請求項1之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其中重鏈序列包含具有CDRH1、CDRH2、及CDRH3的可變區，且前述CDRH1包含序列識別號102所示的胺基酸序列，前述CDRH2包含序列識別號107所示的胺基酸序列，前述CDRH3包含序列識別號110所示的胺基酸序列；及輕鏈序列包含具有CDRL1、CDRL2、及CDRL3的可變區，且前述CDRL1包含序列識別號93所示的胺基酸序列，前述CDRL2包含序列識別號96所示的胺基酸序列，前述CDRL3包含序列識別號101所示的胺基酸序列。
  6. 如請求項1之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其中重鏈序列包含具有CDRH1、CDRH2、及CDRH3的可變區，且前述CDRH1包含序列識別號102所示的胺基酸序列，前述CDRH2包含序列識別號108所示的胺基酸序列，前述CDRH3包含序列識別號110所示的胺基酸序列；及輕鏈序列包含具有CDRL1、CDRL2、及CDRL3的可變區，且前述CDRL1包含序列識別號93所示的胺基酸序列，前述CDRL2包含序列識別號96所示的胺基酸序列，前述CDRL3包含序列識別號101所示的胺基酸序列。
  7. 如請求項1之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其中重鏈序列包含具有CDRH1、CDRH2、及CDRH3的可變區，且前述CDRH1包含序列識別號102所示的胺基酸序列，前述CDRH2包含序列識別號104所示的胺基酸序列，前述CDRH3包含序列識別號109所示的胺基酸序列；及輕鏈序列包含具有CDRL1、CDRL2、及CDRL3的可變區，且前述CDRL1包含序列識別號93所示的胺基酸序列，前述CDRL2包含序列識別號96所示的胺基酸序列，前述CDRL3包含序列識別號101所示的胺基酸序列。
  8. 如請求項1或2之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含：包含序列識別號62所示的胺基酸序列之第20至136號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列及包含序列識別號56所示的胺基酸序列之第21至126號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列。
  9. 如請求項8之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含：包含序列識別號62所示的胺基酸序列之第20至465號或第20至466號之胺基酸殘基的重鏈序列及包含序列識別號56所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的輕鏈序列。
  10. 如請求項8之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含：包含序列識別號70所示的胺基酸序列之第20至465號或第20至466號之胺基酸殘基的重鏈序列及包含序列識別號56所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的輕鏈序列。
  11. 如請求項1或3之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含：包含序列識別號62所示的胺基酸序列之第20至136號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列及包含序列識別號58所示的胺基酸序列之第21至126號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列。
  12. 如請求項11之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含：包含序列識別號62所示的胺基酸序列之第20至465號或第20至466號之胺基酸殘基的重鏈序列及包含序列識別號58所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的輕鏈序列。
  13. 如請求項1或4之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含：包含序列識別號62所示的胺基酸序列之第20至136號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列及包含序列識別號60所示的胺基酸序列之第21至126號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列。
  14. 如請求項13之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含：包含序列識別號62所示的胺基酸序列之第20至465號或第20至466號之胺基酸殘基的重鏈序列及包含序列識別號60所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的輕鏈序列。
  15. 如請求項1或5之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含：包含序列識別號64所示的胺基酸序列之第20至136號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列及包含序列識別號56所示的胺基酸序列之第21至126號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列。
  16. 如請求項15之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含：包含序列識別號64所示的胺基酸序列之第20至465號或第20至466號之胺基酸殘基的重鏈序列及包含序列識別號56所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的輕鏈序列。
  17. 如請求項1或6之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含：包含序列識別號66所示的胺基酸序列之第20至136號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列及包含序列識別號56所示的胺基酸序列之第21至126號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列。
  18. 如請求項17之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含：包含序列識別號66所示的胺基酸序列之第20至465號或第20至466號之胺基酸殘基的重鏈序列及包含序列識別號56所示的胺基酸序列之第21至234號之胺基酸殘基的輕鏈序列。
  19. 如請求項1或7之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含：包含序列識別號43所示的胺基酸序列之第20至136號之胺基酸殘基的重鏈可變區序列及包含序列識別號56所示的胺基酸序列之第21至126號之胺基酸殘基的輕鏈可變區序列。
  20. 如請求項19之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含：包含序列識別號43所示的胺基酸序列之第20至465號或第20至466號之胺基酸殘基的重鏈序列及包含序列識別號56所示的胺基酸序列之第21至235號之胺基酸殘基的輕鏈序列。
  21. 如請求項1至7中任一項之抗體之抗原結合性片段，其係選自包含Fab、F(ab’)2、Fab’及Fv的群組。
  22. 如請求項1至7中任一項之抗體，其係scFv。
  23. 一種醫藥組成物，其特徵為含有如請求項1至22之抗體或該抗體之抗原結合性片段之至少一者。
  24. 如請求項23之醫藥組成物，其係移植物之排斥、免疫相關疾病、過敏性疾病、炎症性疾病、癌症之治療及/或預防劑；抗血小板或抗血栓活性劑；或Orai1表現細胞活性化抑制劑。
  25. 如請求項24之醫藥組成物，其中移植物之排斥係對為臟器或組織之心臟、腎臟、肝臟、骨髓、皮膚之移植的排斥反應及宿主抗移植物反應(host versus graft reaction)、及由於為造血細胞之骨髓、末梢血液、臍帶血之移植所引起的移植物抗宿主病(graft versus host disease)。
  26. 如請求項24之醫藥組成物，其中免疫相關疾病為結締組織、肌肉骨骼系統之類風濕性關節炎、僵直性脊椎炎、全身性紅斑狼瘡、硬皮症、多發性肌炎、皮肌炎；血液系統之再生不良性貧血、自發性血小板減少紫瘢；消化器官系統之克隆氏症(Crohn's disease)、潰瘍性大腸炎；神經系統之多發性硬化症、重症肌無力症；視覺系統之葡萄膜炎；血管系統之貝塞氏症(Behcet's disease)、華格納氏肉芽腫病(Wegener’s granulomatosis)；表皮系統之乾癬、天疱瘡、白斑；內分泌系統之1型糖尿病、自體免疫甲狀腺炎、葛瑞夫茲氏症(Graves’ disease)、橋本氏病(Hashimoto’s disease)之免疫相關疾病，過敏性疾病為異位性皮膚炎、氣喘、重度過敏(anaphylaxis)、類過敏反應、食物過敏、鼻炎、中耳炎、藥物反應、昆蟲刺傷反應、植物反應、乳膠過敏(latex allergy)、結膜炎、蕁麻疹之過敏性疾病，炎症性疾病為炎症性腎疾病之絲球體腎炎、腎病；炎症性肺疾病之慢性阻塞性肺病、囊性纖維變性(cystic fibrosis)、間質性肺炎；炎症性腸疾病之潰瘍性大腸炎、迴腸炎；炎症性肝疾病之自體免疫肝炎、病毒性肝炎；炎症性心疾病之心肌炎、缺血性心臟病、動脈粥狀硬化症(atherosclerosis)；炎症性皮膚疾病之接觸性皮膚炎、濕疹；炎症性眼疾病之砂眼、眼內炎；炎症性中樞神經疾病之髓膜炎、腦脊髓炎、自體免疫腦炎；為關節之炎症性疾病之關節炎、骨關節炎；全身性炎症之敗血症、出血、過敏症、起因於癌症化學療法的休克症狀。
  27. 如請求項24之醫藥組成物，其中癌症為乳癌、肺癌、皮膚癌、或白血病；抗血小板或抗血栓活性劑有用於心肌梗塞、腦中風、缺血性心臟病、血栓症之治療及/或預防；及Orai1表現細胞活性化抑制劑有用於肥大細胞白血病、肥大細胞症、嗜鹼性球白血病、子宮內膜症、斯托莫肯症(Stormorken syndrome)、管狀聚集性肌肉病變(tubular aggregate myopathy)、類風濕性關節炎、僵直性脊椎炎、異位性皮膚炎之治療及/或預防。
  28. 一種多核苷酸，其編碼如請求項1至22中任一項之抗體或該抗體之抗原結合性片段。
  29. 一種載體，其包含如請求項28中記載之任一種之多核苷酸。
  30. 一種轉形宿主細胞，其包含如請求項28中記載之任一種之多核苷酸。
  31. 一種轉形宿主細胞，其包含如請求項29之載體。
  32. 一種如請求項1至22中任一項之抗體或該抗體之抗原結合性片段之生產方法，其包含培養如請求項30或31之宿主細胞，而自培養產物純化抗體的步驟。
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