JP2017137310A - 抗Orai1抗体 - Google Patents
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Abstract
【課題】ヒトOrai1を標的とする、移植物の拒絶、免疫疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、血栓、癌などの治療及び/又は予防剤の提供。
【解決手段】ヒトOrai1を特異的に認識し、PMA及びA23187処理されたJurkat細胞が放出するIL−2量を50%阻害する濃度が80ng/mL以下、好ましくは10ng/mL以下である、抗体又は該抗体の抗原結合性断片。亦、PMA及びA23187処理されたヒト末梢血単核球が方出するIL−2量を50%阻害する濃度が100ng/mL以下、好ましくは20ng/mL以下であり、IFN−γ量を50%阻外する濃度が800ng/mL以下、好まくは40ng/mL以下である、抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
【選択図】なし
【解決手段】ヒトOrai1を特異的に認識し、PMA及びA23187処理されたJurkat細胞が放出するIL−2量を50%阻害する濃度が80ng/mL以下、好ましくは10ng/mL以下である、抗体又は該抗体の抗原結合性断片。亦、PMA及びA23187処理されたヒト末梢血単核球が方出するIL−2量を50%阻害する濃度が100ng/mL以下、好ましくは20ng/mL以下であり、IFN−γ量を50%阻外する濃度が800ng/mL以下、好まくは40ng/mL以下である、抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
【選択図】なし
Description
本発明は障害および疾患を治療するための、より強活性の抗Orai1抗体取得に関する。
カルシウム放出活性化カルシウム(CRAC)チャネルは、細胞内小胞体中のカルシウムストアの枯渇に反応して開かれるストア感受性チャネル(SOC)のサブセットであり、特定の非興奮性細胞、特にT細胞や肥満細胞を包含する免疫系の細胞において、細胞外カルシウムの流入とそれに伴う細胞の活性化を担っている。CRACチャネル活性の阻害剤は当該技術分野で公知であり、それらの同定および治療可能性は、Feskeらによって記載されている(非特許文献1−2)。
Orai1(CRACM1:カルシウム放出−活性化カルシウムモジュレーター1, 膜貫通蛋白142A:TMEM142A)は、301アミノ残基酸からなる4回膜貫通型の蛋白質で、ホモ4量体を形成することでCRACチャネルの孔サブユニットを構成する成分として特定されている(特許文献1、非特許文献3−5)。ヒトOrai1遺伝子は90%以上の相同性を持つヒトOrai2およびヒトOrai3と共にOrai遺伝子ファミリーを構成しており(非特許文献6)、一部の場合においてはOrai2および/またはOrai3蛋白とOrai1を含有するヘテロ4量体や6量体が形成される可能性も報告されている(非特許文献7−8)。Orai1は、細胞内小胞体中のカルシウムストア枯渇を感知する蛋白であるSTIM−1(Stromal interaction molecule 1)またはSTIM−2と共役するN末端およびC末端の細胞質内領域、4カ所の細胞膜貫通ドメイン、そして約20アミノ酸残基からなる第1細胞外ループドメインと約40アミノ酸残基からなる第2細胞外ループドメインで構成されている(非特許文献9)。Orai1のDNA配列およびアミノ酸配列は公的データベース上に公開されており、例えばNM_032790、NP_116179(NCBI)等のアクセッション番号により参照可能である。
ヒトOrai1遺伝子の先天的な機能欠損により、CRACチャネル活性が失われ、免疫原に対する生体の反応が消失し、重度の免疫不全状態に陥ることが示されていることから、Orai1の分子機能はCRACチャネルの活性化に必須であると特定されている(非特許文献10−11)。従ってOrai1分子を標的とした機能阻害抗体はCRACチャネル活性の阻害剤となり得る。
CRACチャネル活性の阻害剤が免疫疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、細胞や臓器の移植、血栓、癌などの患者を治療するために使用され得ることを示唆する情報から(非特許文献12)、Orai1の分子機能阻害を目指した抗Orai1抗体の取得が試みられ、その効果が検討されている(非特許文献2−3、特許文献13−14)。これらは抗体単独でT細胞の活性化を抑制することを示しているが、その阻害活性強度はまだ十分ではなく、Orai1を標的とする生物製剤として臨床適用する場合には、高い用量や頻回投与が必要となる、あるいは投与方法が限定されるなどの点において未充足医療ニーズが存在すると考えられる。
Feske S,Nature Rev.Immunol. 7,p.690−702(2007)
Derler I,et al.,Expert Opin.Drug Discovery 3(7),p.787−800(2008)
Prakriya M,et al.,Nature 443,p.230−233(2006)
Vig M,et al.,Science 312,p.1220−1223(2006)
Park CY,et al.,Cell 136,p.876−890(2008)
Mercer JC,et al.,J.Biol.Chem. 281,p.24979−24990(2006)
Gwack Y,et al.,J.Biol.Chem. 282,p.16232−16243(2007)
Hou X,et al.,Science 338,p.1308−1313(2012)
Vig M,et al.,Curr.Biol. 16,p.2073−2079(2006)
Feske S,Nature 441,p.179−185(2006)
McCarl CA,et al.,J.Allergy Clin.Immunol. 124,p.1311−1318(2009)
McCarl CA,et al.,J.Immunol. 185,p.5845-5858(2010)
Lin F,et al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.345,p.225−238(2013)
Cox JH,et al.,PLOS ONE 8(12),e82944(2013)
本発明の目的は、移植物の拒絶、免疫疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、血栓、癌等の治療および/または予防剤を提供することにある。
本発明者らは、移植物の拒絶、免疫疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、血栓、癌の治療および/または予防効果を有する物質を探索する目的で、ラット抗Orai1抗体を取得した。得られたラット抗Orai1抗体をヒト化し、さらに当該ヒト化抗体のCDR、フレームワークおよび可変領域を改変して本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
(1)配列番号2に記載のアミノ酸配列に特異的に結合し、重鎖配列が、CDRH1、CDRH2、CDRH3を有する可変領域を含み、前記CDRH1は配列番号102に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRH2は配列番号104、106、107または108のいずれか一つに示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRH3は、配列番号109または110に示されるアミノ酸配列からなること;および
軽鎖配列がCDRL1、CDRL2、CDRL3を有する可変領域を含み、前記CDRL1は配列番号93、94または95のいずれか一つに示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRL2は配列番号96、97または98のいずれか一つに示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRL3は、配列番号101に示されるアミノ酸配列からなること;
を特徴とする抗体または該抗体の抗原結合性断片。
(1)配列番号2に記載のアミノ酸配列に特異的に結合し、重鎖配列が、CDRH1、CDRH2、CDRH3を有する可変領域を含み、前記CDRH1は配列番号102に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRH2は配列番号104、106、107または108のいずれか一つに示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRH3は、配列番号109または110に示されるアミノ酸配列からなること;および
軽鎖配列がCDRL1、CDRL2、CDRL3を有する可変領域を含み、前記CDRL1は配列番号93、94または95のいずれか一つに示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRL2は配列番号96、97または98のいずれか一つに示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRL3は、配列番号101に示されるアミノ酸配列からなること;
を特徴とする抗体または該抗体の抗原結合性断片。
(2)重鎖配列が、CDRH1、CDRH2、CDRH3を有する可変領域を含み、前記CDRH1は配列番号102に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRH2は配列番号106に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRH3は、配列番号110に示されるアミノ酸配列からなること;および
軽鎖配列がCDRL1、CDRL2、CDRL3を有する可変領域を含み、前記CDRL1は配列番号93に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRL2は配列番号96に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRL3は、配列番号101に示されるアミノ酸配列からなること;
を特徴とする(1)に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片。
軽鎖配列がCDRL1、CDRL2、CDRL3を有する可変領域を含み、前記CDRL1は配列番号93に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRL2は配列番号96に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRL3は、配列番号101に示されるアミノ酸配列からなること;
を特徴とする(1)に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片。
(3)重鎖配列が、CDRH1、CDRH2、CDRH3を有する可変領域を含み、前記CDRH1は配列番号102に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRH2は配列番号106に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRH3は、配列番号110に示されるアミノ酸配列からなること;および
軽鎖配列がCDRL1、CDRL2、CDRL3を有する可変領域を含み、前記CDRL1は配列番号94に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRL2は配列番号97に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRL3は、配列番号101に示されるアミノ酸配列からなること;
を特徴とする(1)に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片。
軽鎖配列がCDRL1、CDRL2、CDRL3を有する可変領域を含み、前記CDRL1は配列番号94に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRL2は配列番号97に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRL3は、配列番号101に示されるアミノ酸配列からなること;
を特徴とする(1)に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片。
(4)重鎖配列が、CDRH1、CDRH2、CDRH3を有する可変領域を含み、前記CDRH1は配列番号102に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRH2は配列番号106に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRH3は、配列番号110に示されるアミノ酸配列からなること;および
軽鎖配列がCDRL1、CDRL2、CDRL3を有する可変領域を含み、前記CDRL1は配列番号95に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRL2は配列番号98に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRL3は、配列番号101に示されるアミノ酸配列からなること;
を特徴とする(1)に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片。
軽鎖配列がCDRL1、CDRL2、CDRL3を有する可変領域を含み、前記CDRL1は配列番号95に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRL2は配列番号98に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRL3は、配列番号101に示されるアミノ酸配列からなること;
を特徴とする(1)に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片。
(5)重鎖配列が、CDRH1、CDRH2、CDRH3を有する可変領域を含み、前記CDRH1は配列番号102に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRH2は配列番号107に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRH3は、配列番号110に示されるアミノ酸配列からなること;および
軽鎖配列がCDRL1、CDRL2、CDRL3を有する可変領域を含み、前記CDRL1は配列番号93に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRL2は配列番号96に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRL3は、配列番号101に示されるアミノ酸配列からなること;
を特徴とする(1)に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片。
軽鎖配列がCDRL1、CDRL2、CDRL3を有する可変領域を含み、前記CDRL1は配列番号93に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRL2は配列番号96に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRL3は、配列番号101に示されるアミノ酸配列からなること;
を特徴とする(1)に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片。
(6)重鎖配列が、CDRH1、CDRH2、CDRH3を有する可変領域を含み、前記CDRH1は配列番号102に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRH2は配列番号108に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRH3は、配列番号110に示されるアミノ酸配列からなること;および
軽鎖配列がCDRL1、CDRL2、CDRL3を有する可変領域を含み、前記CDRL1は配列番号93に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRL2は配列番号96に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRL3は、配列番号101に示されるアミノ酸配列からなること;
を特徴とする(1)に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片。
軽鎖配列がCDRL1、CDRL2、CDRL3を有する可変領域を含み、前記CDRL1は配列番号93に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRL2は配列番号96に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRL3は、配列番号101に示されるアミノ酸配列からなること;
を特徴とする(1)に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片。
(7)重鎖配列が、CDRH1、CDRH2、CDRH3を有する可変領域を含み、前記CDRH1は配列番号102に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRH2は配列番号104に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRH3は、配列番号109に示されるアミノ酸配列からなること;および
軽鎖配列がCDRL1、CDRL2、CDRL3を有する可変領域を含み、前記CDRL1は配列番号93に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRL2は配列番号96に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRL3は、配列番号101に示されるアミノ酸配列からなること;
を特徴とする(1)に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片。
軽鎖配列がCDRL1、CDRL2、CDRL3を有する可変領域を含み、前記CDRL1は配列番号93に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRL2は配列番号96に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRL3は、配列番号101に示されるアミノ酸配列からなること;
を特徴とする(1)に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片。
(8)配列番号62に示されるアミノ酸配列の20乃至136番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列および配列番号56に示されるアミノ酸配列の21乃至126番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする(1)または(2)に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片。
(9)配列番号62に示されるアミノ酸配列の20乃至465番目または20乃至466番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列および配列番号56に示されるアミノ酸配列の21乃至234番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする(8)に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片。
(10)配列番号70に示されるアミノ酸配列の20乃至465番目または20乃至466番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列および配列番号56に示されるアミノ酸配列の21乃至234番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする(8)に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片。
(11)配列番号62に示されるアミノ酸配列の20乃至136番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列および配列番号58に示されるアミノ酸配列の21乃至126番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする(1)または(3)に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片。
(12)配列番号62に示されるアミノ酸配列の20乃至465番目または20乃至466のアミノ酸残基からなる重鎖配列および配列番号58に示されるアミノ酸配列の21乃至234番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする(11)に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片。
(13)配列番号62に示されるアミノ酸配列の20乃至136番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列および配列番号60に示されるアミノ酸配列の21乃至126番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする(1)または(4)に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片。
(14)配列番号62に示されるアミノ酸配列の20乃至465番目または20乃至466番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列および配列番号60に示されるアミノ酸配列の21乃至234番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする(13)に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片。
(15)配列番号64に示されるアミノ酸配列の20乃至136番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列および配列番号56に示されるアミノ酸配列の21乃至126番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする(1)または(5)に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片。
(16)配列番号64に示されるアミノ酸配列の20乃至465番目または20乃至466番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列および配列番号56に示されるアミノ酸配列の21乃至234番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする(15)に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片。
(17)配列番号66に示されるアミノ酸配列の20乃至136番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列および配列番号56に示されるアミノ酸配列の21乃至126番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする(1)または(6)に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片。
(18)配列番号66に示されるアミノ酸配列の20乃至465番目または20乃至466番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列および配列番号56に示されるアミノ酸配列の21乃至234番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする(17)に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片。
(19)配列番号43に示されるアミノ酸配列の20乃至136番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列および配列番号56に示されるアミノ酸配列の21乃至126番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする(1)または(7)に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片。
(20)配列番号43に示されるアミノ酸配列の20乃至465番目または20乃至466番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列および配列番号56に示されるアミノ酸配列の21乃至235番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする(19)に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片。
(21)Fab、F(ab’)2、Fab’およびFvからなる群から選択される、(1)乃至(20)のいずれか一つに記載の抗体の抗原結合性断片。
(22)scFvであることを特徴とする、(1)乃至(8)、(11)、(13)、(15)、(17)または(19)のいずれか一つに記載の抗体。
(23)(1)乃至(22)に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片の少なくともいずれか一つを含有することを特徴とする、医薬組成物。
(24)移植物の拒絶、免疫関連疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、癌の治療および/または予防剤、抗血小板または抗血栓活性剤、Orai1発現細胞活性化抑制剤であることを特徴とする、(23)に記載の医薬組成物。
(25)移植物の拒絶が、心臓、腎臓、肝臓、骨髄、皮膚等の臓器もしくは組織の移植に対する拒絶反応および宿主対移植片反応、そして造血細胞(骨髄、末梢血、臍帯血等)の移植によって起こる移植片対宿主病であることを特徴とする、(24)に記載の医薬組成物。
(26)免疫関連疾患が、結合組織や筋骨格系(関節リウマチ、強直性脊椎炎、全身性エリテマトーデス、強皮症、多発筋炎、皮膚筋炎など)、血液系(再生不良性貧血、特発性血小板減少性紫斑病など)、消化器系(クローン病、潰瘍性大腸炎など)、神経系(多発性硬化症、重症筋無力症など)、視覚系(ブドウ膜炎など)、血管系(ベーチェット病、ヴェゲナー肉芽腫症など)、表皮系(乾癬、天疱瘡、白斑など)、内分泌系(1型糖尿病、自己免疫甲状腺炎、バセドウ病、橋本病など)等であること、アレルギー性疾患がアトピー性皮膚炎、喘息、アナフィラキシー、アナフィラキシー様反応、食物アレルギー、鼻炎、中耳炎、薬物反応、昆虫刺傷反応、植物反応、ラテックスアレルギー、結膜炎、じんま疹等であること、炎症性疾患が炎症性腎疾患(糸球体腎炎、ネフローゼなど)、炎症性肺疾患(慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性線維症、間質性肺炎など)、炎症性腸疾患(潰瘍性大腸炎、回腸炎など)、炎症性肝疾患(自己免疫肝炎、ウイルス肝炎など)、炎症性心疾患(心筋炎、虚血性心疾患、アテローム性動脈硬化症など)、炎症性皮膚疾患(接触性皮膚炎、湿疹など)、炎症性眼疾患(トラコーマ、眼内炎など)、炎症性中枢神経疾患(髄膜炎、脳脊髄炎、自己免疫脳炎など)、関節の炎症性疾患(例えば関節炎、骨関節炎など)、全身性炎症(敗血症、出血、過敏症、癌化学療法などに起因するショック症状など)等であることを特徴とする、(24)に記載の医薬組成物。
(27)癌の治療および/または予防が乳癌、肺癌、皮膚癌、白血病等であること、抗血小板または抗血栓活性が治療および/または予防に役立つ例が心筋梗塞、脳卒中、虚血性心疾患、血栓症等であること、Orai1発現細胞活性化抑制が治療および/または予防に役立つ例がマスト細胞白血病、マスト細胞症、好塩基性白血病、子宮内膜症、小管集合性ミオパチー、ストールモルケン症、関節リウマチ、強直性脊椎炎、アトピー性皮膚炎等であることを特徴とする、(24)記載の医薬組成物。
(28)(1)乃至(22)のいずれか一つに記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片をコードするポリヌクレオチド。
(29)(28)に記載のいずれか一つのポリヌクレオチドを含むベクター。
(30)(28)に記載のいずれか一つのポリヌクレオチドを含む形質転換宿主細胞。
(31)(29)に記載のベクターを含む形質転換宿主細胞。
(30)(28)に記載のいずれか一つのポリヌクレオチドを含む形質転換宿主細胞。
(31)(29)に記載のベクターを含む形質転換宿主細胞。
(32)(30)または(32)に記載の宿主細胞を培養し、培養産物から抗体を精製する工程を含む(1)乃至(22)のいずれか一つに記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片の生産方法。
(33)配列番号2に記載のアミノ酸配列に特異的に結合し、PMAおよびA23187処理されたJurkat細胞が放出するIL−2量を50%阻害する濃度が80ng/mL以下であることを特徴とする、抗体または該抗体の抗原結合性断片。
(34)PMAおよびA23187処理されたJurkat細胞が放出するIL−2量を50%阻害する濃度が10ng/mL以下であることを特徴とする、(33)に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片。
(35)配列番号2に記載のアミノ酸配列に特異的に結合し、PMAおよびA23187処理されたヒト末梢血単核球(PBMC)が放出するIL−2量を50%阻害する濃度が100ng/mL以下であることを特徴とする、抗体または該抗体の抗原結合性断片。
(36)PMAおよびA23187処理されたヒトPBMCが放出するIL−2量を50%阻害する濃度が20ng/mL以下であることを特徴とする、(35)に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片。
(37)配列番号2に記載のアミノ酸配列に特異的に結合し、PMAおよびA23187処理されたヒトPBMCが放出するIFN−γ量を50%阻害する濃度が800ng/mL以下であることを特徴とする、抗体または該抗体の抗原結合性断片。
(38)PMAおよびA23187処理されたヒトPBMCが放出するIFN−γ量を50%阻害する濃度が40ng/mL以下であることを特徴とする、(37)に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片。
本発明によれば、CRACチャネルの活性阻害を作用機序とする、移植物の拒絶、免疫疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、血栓、癌の治療剤および/または予防剤を得ることができる。
本明細書中において、「遺伝子」という語には、DNAのみならずmRNA、cDNAおよびcRNAも含まれるものとする。
本明細書中において、「ポリヌクレオチド」という語は核酸と同じ意味で用いており、DNA、RNA、プローブ、オリゴヌクレオチド、およびプライマーも含まれている。
本明細中においては、「ポリペプチド」と「蛋白質」は区別せずに用いている。
本明細書中において、「RNA画分」とは、RNAを含んでいる画分をいう。
本明細書中において、「細胞」には、動物個体内の細胞、培養細胞も含んでいる。
本明細書中において、「Orai1」は、Orai1蛋白質と同じ意味で用いている。
本明細書中において、「RNA画分」とは、RNAを含んでいる画分をいう。
本明細書中において、「細胞」には、動物個体内の細胞、培養細胞も含んでいる。
本明細書中において、「Orai1」は、Orai1蛋白質と同じ意味で用いている。
本明細書中における「抗体の抗原結合性断片」とは、抗原との結合活性を有する抗体の部分断片を意味しており、Fab、F(ab’)2、Fv、scFv、diabody、線状抗体、および抗体断片より形成された多特異性抗体等を含む。また、F(ab’)2を還元条件下で処理した抗体の可変領域の一価の断片であるFab’も抗体の抗原結合性断片に含まれる。但し、抗原との結合能を有している限りこれらの分子に限定されない。また、これらの抗原結合性断片には、抗体蛋白質の全長分子を適当な酵素で処理したもののみならず、遺伝子工学的に改変された抗体遺伝子を用いて適当な宿主細胞において産生された蛋白質も含まれる。
抗体分子の重鎖および軽鎖にはそれぞれ3箇所の相補性決定領域(CDR:Complementarity determining region)があることが知られている。相補性決定領域は、超可変領域(hypervariable region)とも呼ばれ、抗体の重鎖および軽鎖の可変領域内にあって、一次構造の変異性が特に高い部位であり、重鎖および軽鎖のポリペプチド鎖の一次構造上において、それぞれ3ヶ所に分離している。本明細書中においては、抗体の相補性決定領域について、重鎖の相補性決定領域を重鎖アミノ酸配列のアミノ末端側からCDRH1、CDRH2、CDRH3と表記し、軽鎖の相補性決定領域を軽鎖アミノ酸配列のアミノ末端側からCDRL1、CDRL2、CDRL3と表記する。これらの部位は立体構造の上で相互に近接し、結合する抗原に対する特異性を決定している。
本発明において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、市販のハイブリダイゼーション溶液ExpressHyb Hybridization Solution(CLONTECH社)中、68℃でハイブリダイズすること、または、DNAを固定したフィルターを用いて0.7−1.0MのNaCl存在下68℃でハイブリダイゼーションを行った後、0.1−2倍濃度のSSC溶液(1倍濃度SSCとは150 mM NaCl、15 mM クエン酸ナトリウムからなる)を用い、68℃で洗浄することにより同定することができる条件またはそれと同等の条件でハイブリダイズすることをいう。
本発明において、「宿主対移植片反応」とは、臓器移植後に観察される被移植者の免疫亢進状態およびこれによる移植臓器の傷害をいう。
本発明において、「移植片対宿主病」とは、造血細胞移植後の移植細胞による被移植者への免疫的攻撃によって発症する症状をいう。
1.Orai1
本発明で用いるOrai1は、ヒト、ヒト以外の哺乳動物(例えば、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど)あるいはニワトリのT細胞あるいは肥満細胞から直接精製して使用するか、あるいは上記の細胞の細胞膜画分を調製して使用することができ、また、Orai1をin vitroにて合成する、あるいは遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。遺伝子操作では、具体的には、Orai1 cDNAを発現可能なベクターに組み込んだ後、転写と翻訳に必要な酵素、基質およびエネルギー物質を含む溶液中で合成する、あるいは他の原核生物、または真核生物の宿主細胞を形質転換させることによってOrai1を発現させることにより、該蛋白質を得ることが出来る。
本発明で用いるOrai1は、ヒト、ヒト以外の哺乳動物(例えば、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど)あるいはニワトリのT細胞あるいは肥満細胞から直接精製して使用するか、あるいは上記の細胞の細胞膜画分を調製して使用することができ、また、Orai1をin vitroにて合成する、あるいは遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。遺伝子操作では、具体的には、Orai1 cDNAを発現可能なベクターに組み込んだ後、転写と翻訳に必要な酵素、基質およびエネルギー物質を含む溶液中で合成する、あるいは他の原核生物、または真核生物の宿主細胞を形質転換させることによってOrai1を発現させることにより、該蛋白質を得ることが出来る。
ヒトOrai1のcDNAのヌクレオチド配列は、GenBankにアクセッション番号:NM_032790で登録されている。マウスOrai1のcDNAのヌクレオチド配列は、GenBankにアクセッション番号:NM_175423で登録されている。ヒトOrai1をコードするヌクレオチド配列は配列表の配列番号1に記載されており、ヒトOrai1のアミノ酸配列は配列表の配列番号2に記載されている。なお、Orai1は、Calcium Release−Activated Calcium Modulator 1(CRACM1)またはTransmembrane Protein 142A(TMEM142A)と呼ばれることがあり、これらは全て同じ分子を示している。
Orai1のcDNAは例えば、Orai1のmRNAを発現している臓器のcDNAライブラリーを鋳型として、Orai1のcDNAを特異的に増幅するプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応(以下「PCR」という)(Saiki,R. K.,et al.,Science,(1988)239,487−49)を行なう、いわゆるPCR法により取得することができる。
なお、ヒトまたはマウスのOrai1をコードするヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、Orai1と同等の生物活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドもOrai1のcDNAに含まれる。さらに、ヒトもしくはマウスOrai1遺伝子座から転写されるスプライシングバリアントまたはこれにストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつ、Orai1と同等の生物活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドもOrai1のcDNAに含まれる。
また、ヒトまたはマウスのOrai1のアミノ酸配列、またはこれらの配列からシグナル配列が除かれたアミノ酸配列において、1個、2もしくは3個または4もしくは5個のアミノ酸が置換、欠失、または付加されたアミノ酸配列からなり、Orai1と同等の生物活性を有する蛋白質もOrai1に含まれる。さらに、ヒトまたはマウスOrai1遺伝子座から転写されるスプライシングバリアントにコードされるアミノ酸配列または該アミノ酸配列において、1個、2もしくは3個または4もしくは5個のアミノ酸が置換、欠失、または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Orai1と同等の生物活性を有する蛋白質もOrai1に含まれる。
2.抗Orai1抗体の製造
本発明のOrai1に対する抗体は、常法を用いて、Orai1またはOrai1のアミノ酸配列から選択される任意のポリペプチドを動物に免疫し、生体内に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる。抗原となるOrai1の生物種はヒトに限定されず、マウス、ラット等のヒト以外の動物に由来するOrai1を動物に免疫することもできる。この場合には、取得された異種Orai1に結合する抗体とヒトOrai1との交差性を試験することによって、ヒトの疾患に適用可能な抗体を選別できる。なお、抗原となるOrai1はOrai1遺伝子を遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。具体的には、Orai1遺伝子を発現可能なベクターを作製し、これを宿主細胞に導入して該遺伝子を発現させ、発現したOrai1を精製すればよい。
本発明のOrai1に対する抗体は、常法を用いて、Orai1またはOrai1のアミノ酸配列から選択される任意のポリペプチドを動物に免疫し、生体内に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる。抗原となるOrai1の生物種はヒトに限定されず、マウス、ラット等のヒト以外の動物に由来するOrai1を動物に免疫することもできる。この場合には、取得された異種Orai1に結合する抗体とヒトOrai1との交差性を試験することによって、ヒトの疾患に適用可能な抗体を選別できる。なお、抗原となるOrai1はOrai1遺伝子を遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。具体的には、Orai1遺伝子を発現可能なベクターを作製し、これを宿主細胞に導入して該遺伝子を発現させ、発現したOrai1を精製すればよい。
本発明のOrai1に対する抗体は、DNA免疫法を使用して得ることもできる。DNA免疫法とは、抗原発現プラスミドをマウスやラットなどの動物個体に遺伝子導入し、抗原を個体内で発現させることによって、抗原に対する免疫を誘導する手法である。遺伝子導入の手法には、直接プラスミドを筋肉に注射する方法や、プラスミドとリポソームやポリエチレンイミンなどの複合体を静脈注射する方法、ウイルスベクターを用いる手法、プラスミドを付着させた金粒子をGene Gunにより射ち込む手法、急速に大量のプラスミド溶液を静脈注射するHydrodynamic法などが存在する。発現プラスミドの筋注による遺伝子導入法に関して、発現量を向上させる手法として、プラスミドを筋注後、同部位にエレクトロポレーションを加えるin vivo electroporationという技術が知られている(Aihara H, Miyazaki J. Nat Biotechnol. 1998 Sep;16(9):867−70またはMir LM, Bureau MF, Gehl J, Rangara R, Rouy D, Caillaud JM, Delaere P, Branellec D, Schwartz B, Scherman D. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 Apr 13;96(8):4262−7.)。本手法はプラスミドの筋注前にヒアルロニダーゼで筋肉を処理することにより、さらに発現量が向上する(McMahon JM1, Signori E, Wells KE, Fazio VM, Wells DJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1264−70)。
また、公知の方法(例えば、Kohler and Milstein,Nature (1975)256,p.495−497、Kennet,R.ed.,Monoclonal Antibodies,p.365−367,Plenum Press,N.Y.(1980))に従って、Orai1に対する抗体を産生する抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることによりハイブリドーマを樹立し、モノクローナル抗体を得ることもできる。このような方法の具体的な例は、国際公開第WO09/48072号パンフレット(2009年4月16日公開)および第WO10/117011号(2010年10月14日公開)パンフレットに記載されている。
このようにして樹立されたラット抗ヒトOrai1抗体の実例としては、R118抗体およびR198抗体を挙げることができる。R118抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号11に、R118抗体の重鎖可変領域の配列は配列表の配列番号13にそれぞれ示されている。また、R198抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号15に、R198抗体の重鎖可変領域の配列は配列表の配列番号17にそれぞれ示されている。
本発明の抗体には、上記のOrai1に対するモノクローナル抗体に加え、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ(Chimeric)抗体、ヒト化(Humanized)抗体、ヒト抗体なども含まれる。これらの抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
キメラ抗体としては、抗体の可変領域と定常領域が互いに異種である抗体、例えばマウスまたはラット由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に接合したキメラ抗体を挙げることができる(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81,6851−6855,(1984)参照)。
ラット抗ヒトOrai1抗体R118由来のキメラ抗体は、配列番号23の21乃至126番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖および配列番号27の20乃至136番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域を含む重鎖からなる抗体を挙げることができる。このようなR118由来のキメラ抗体の一例としては、配列番号23の21乃至234番目のアミノ酸残基からなる軽鎖および配列番号27の20乃至466番目のアミノ酸残基からなる重鎖からなる抗体を挙げることができる。本明細書においては、前記の抗体を「cR118」あるいは「cR118抗体」と呼称する。
また、ラット抗ヒトOrai1抗体R198由来のキメラ抗体は、配列番号25の21乃至126番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖、および配列番号29の20乃至136番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域を含む重鎖からなる抗体を挙げることができる。このようなR198由来のキメラ抗体の一例としては、配列番号25の21乃至234番目のアミノ酸残基からなる軽鎖および配列番号29の20乃至466番目のアミノ酸残基からなる重鎖からなる抗体を挙げることができる。本明細書においては、前記の抗体を「cR198」あるいは「cR198抗体」と呼称する。
上記のOrai1に対するキメラ抗体の配列を、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変して、遺伝子組換え型抗体であるヒト化(Humanized)抗体を作製することができる。本発明の抗体には、前記ヒト化抗体のCDRを改変した抗体が含まれる。これらの抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
ヒト化抗体としては、相補性決定領域(CDR;complementarity determining region)のみをヒト由来の抗体に組み込んだ抗体(Nature(1986)321,p.522−525参照)、CDRの配列に加え一部のフレームワークのアミノ酸残基もヒト抗体に移植した抗体(国際公開第WO90/07861号パンフレット)を挙げることができる。
cR118およびcR198抗体由来のヒト化抗体は、cR118またはcR198に由来する6種全てのCDR配列を保持し、T細胞の活性化を抑制する活性を有している。なお、前記のヒト化抗体の軽鎖可変領域は、配列番号92に示されるアミノ酸配列からなるCDRL1(RASQSIGNSLS)または配列番号116に示されるアミノ酸配列からなるCDRL1(RASQSISNSLS)のいずれか一つ、配列番号96に示されるアミノ酸配列からなるCDRL2(STSTLES)、および配列番号99に示されるアミノ酸配列からなるCDRL3(LQFATFPDT)または配列番号100に示されるCDRL3(LQFATYPDT)のいずれか一つを保有している。また、ヒト化抗体の重鎖可変領域は、配列番号102に示されるアミノ酸配列からなるCDRH1(AYYIS)または配列番号103に示されるCDRH1(SYYIS)のいずれか一つ、配列番号104に示されるアミノ酸配列からなるCDRH2(YIDMGNGRTNYNARFKG)または配列番号105に示されるCDRH2(YVDMGNGRTNYNEKFKG)のいずれか一つ、および配列番号109に示されるアミノ酸配列からなるCDRH3(DSNWGVDY)を保有している。なお、上記のCDRのアミノ酸配列は、図38にも記載されている。
好適なCDRの組み合わせを有する抗体としては、配列番号92に示されるアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号96に示されるアミノ酸配列からなるCDRL2、配列番号100に示されるアミノ酸配列からなるCDRL3、配列番号103に示されるアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号105に示されるアミノ酸配列からなるCDRH2、および配列番号109に示されるアミノ酸配列からなるCDRH3を含む抗体、ならびに配列番号92に示されるアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号96に示されるアミノ酸配列からなるCDRL2、配列番号99に示されるアミノ酸配列からなるCDRL3、配列番号102に示されるアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号104に示されるアミノ酸配列からなるCDRH2、および配列番号109に示されるアミノ酸配列からなるCDRH3を含む抗体を挙げることができる。
上記のヒト化抗体の好適な事例としては、配列番号31の21乃至126番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖および配列番号39の20乃至136番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域を含む重鎖からなる抗体、配列番号33の21乃至126番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖および配列番号41の20乃至136番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域を含む重鎖からなる抗体、配列番号35の21乃至126番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖および配列番号43の20乃至136番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域を含む重鎖からなる抗体、ならびに配列番号37の21乃至126番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖および配列番号45の20乃至136番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域を含む重鎖からなる抗体を挙げることができる。
さらに好適な事例としては、配列番号31の21乃至234番目のアミノ酸残基からなる軽鎖および配列番号39の20乃至466番目のアミノ酸残基からなる重鎖からなる抗体、配列番号33の21乃至234番目のアミノ酸残基からなる軽鎖および配列番号41の20乃至466番目のアミノ酸残基からなる重鎖からなる抗体、配列番号35の21乃至234番目のアミノ酸残基からなる軽鎖および配列番号43の20乃至466番目のアミノ酸残基からなる重鎖からなる抗体、ならびに配列番号37の21乃至234番目のアミノ酸残基からなる軽鎖および配列番号45の20乃至466番目のアミノ酸残基からなる重鎖からなる抗体を挙げることができる。
本発明の抗体は、上記のヒト化抗体にさらに変異を導入して、Orai1に対する結合能を更新させたものであっても良い。このような手法はアフィニティマチュレーションと呼ばれるが、具体的な方法としてリボゾームディスプレイ法を挙げることができる。リボゾームディスプレイ法は、蛋白質とその遺伝子情報であるmRNAがリボソームを介して結合した三者複合体を用い、標的分子と結合する蛋白質の遺伝子配列を単離する方法である(Stafford RL. et. al. Protein Eng. Des. Sel. 2014(4):97−109.)。
上記の方法によって、遺伝子改変を加えた抗体の軽鎖可変領域は、配列番号93に示されるアミノ酸配列からなるCDRL1(RASQSIGGSLS)、配列番号94に示されるアミノ酸配列からなるCDRL1(HASQNIGGSLS)または配列番号95に示されるアミノ酸配列からなるCDRL1(HASRNIGGSLS)のいずれか一つ、配列番号96に示されるアミノ酸配列からなるCDRL2(STSTLES)、配列番号97に示されるアミノ酸配列からなるCDRL2(LTSTLDW)または配列番号98に示されるアミノ酸配列からなるCDRL2(LTSSLDW)のいずれか一つ、および配列番号101に示されるアミノ酸配列からなるCDRL3(LQFAIFPDS)を保有している。また、遺伝子改変を加えた抗体の重鎖可変領域は、配列番号102に示されるアミノ酸配列からなるCDRH1(AYYIS)、配列番号104に示されるアミノ酸配列からなるCDRH2(YIDMGNGRTNYNARFKG)、配列番号106に示されるアミノ酸配列からなるCDRH2(YIDMGNGRTDYNARFKG)、配列番号107に示されるアミノ酸配列からなるCDRH2(YIDMGNGRTDYNGRFKG)または配列番号108に示されるCDRH2(YIDMGNGRTDYNMRFKG)のいずれか一つ、および配列番号109に示されるアミノ酸配列からなるCDRH3(DSNWGVDY)または配列番号110に示されるアミノ酸配列からなるCDRH3(DSNWGADY)を保有している。なお、上記のCDRのアミノ酸配列は、図38にも記載されている。
好適なCDRの組み合わせを有する抗体としては、配列番号93に示されるアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号96に示されるアミノ酸配列からなるCDRL2、配列番号101に示されるアミノ酸配列からなるCDRL3、配列番号102に示されるアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号106に示されるアミノ酸配列からなるCDRH2、および配列番号110に示されるアミノ酸配列からなるCDRH3を含む抗体、配列番号94に示されるアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号97に示されるアミノ酸配列からなるCDRL2、配列番号101に示されるアミノ酸配列からなるCDRL3、配列番号102に示されるアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号106に示されるアミノ酸配列からなるCDRH2、および配列番号110に示されるアミノ酸配列からなるCDRH3を含む抗体、配列番号95に示されるアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号98に示されるアミノ酸配列からなるCDRL2、配列番号101に示されるアミノ酸配列からなるCDRL3、配列番号102に示されるアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号106に示されるアミノ酸配列からなるCDRH2、および配列番号110に示されるアミノ酸配列からなるCDRH3を含む抗体、配列番号93に示されるアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号96に示されるアミノ酸配列からなるCDRL2、配列番号101に示されるアミノ酸配列からなるCDRL3、配列番号102に示されるアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号107に示されるアミノ酸配列からなるCDRH2、および配列番号110に示されるアミノ酸配列からなるCDRH3を含む抗体、配列番号93に示されるアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号96に示されるアミノ酸配列からなるCDRL2、配列番号101に示されるアミノ酸配列からなるCDRL3、配列番号102に示されるアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号108に示されるアミノ酸配列からなるCDRH2、および配列番号110に示されるアミノ酸配列からなるCDRH3を含む抗体、ならびに配列番号93に示されるアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号96に示されるアミノ酸配列からなるCDRL2、配列番号101に示されるアミノ酸配列からなるCDRL3、配列番号102に示されるアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号104に示されるアミノ酸配列からなるCDRH2、配列番号109に示されるアミノ酸配列からなるCDRH3を含む抗体を挙げることができる。
上記のCDR抗体の好適な事例としては、配列番号56の21乃至126番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖および配列番号62の20乃至136番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域を含む重鎖からなる抗体、配列番号58の21乃至126番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖および配列番号62の20乃至136番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域を含む重鎖からなる抗体、配列番号60の21乃至126番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖および配列番号62の20乃至136番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域を含む重鎖からなる抗体、配列番号56の21乃至126番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖および配列番号64の20乃至136番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域を含む重鎖からなる抗体、配列番号56の21乃至126番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖および配列番号66の20乃至136番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域を含む重鎖からなる抗体、ならびに配列番号56の21乃至126番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖および配列番号43の20乃至136番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域を含む重鎖からなる抗体を挙げることができる。
上記の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む好適な抗体としては、配列番号56の21乃至234番目のアミノ酸残基からなる軽鎖および配列番号62の20乃至466番目のアミノ酸残基からなる重鎖からなる抗体、配列番号58の21乃至234番目のアミノ酸残基からなる軽鎖および配列番号62の20乃至466番目のアミノ酸残基からなる重鎖からなる抗体、配列番号60の21乃至234番目のアミノ酸残基からなる軽鎖および配列番号62の20乃至466番目のアミノ酸残基からなる重鎖からなる抗体、配列番号56の21乃至234番目のアミノ酸残基からなる軽鎖および配列番号64の20乃至466番目のアミノ酸残基からなる重鎖からなる抗体、配列番号56の21乃至234番目のアミノ酸残基からなる軽鎖および配列番号66の20乃至466番目のアミノ酸残基からなる重鎖からなる抗体、ならびに配列番号56の21乃至234番目のアミノ酸残基からなる軽鎖および配列番号43の20乃至466番目のアミノ酸残基からなる重鎖からなる抗体、を挙げることができる。
正常のヒトOrai1発現細胞への細胞傷害を回避するために、抗体のエフェクター活性は低いことが望ましい。エフェクター活性は抗体のサブクラスによって異なることが知られている。IgG4はADCC、CDC活性が低く、IgG2はCDC活性を有するが、ADCC活性は低い、などの特徴が見られる。この特徴より、IgG1の定常領域をIgG2、4の定常領域に置換することによってADCC,、CDC活性を低減させた抗体を作製することが可能である。また、IgG1の定常領域の一部の配列をIgG2、4を参考にして置換することにより、ADCC、CDC活性を低減させたIgG1抗体を作製することが可能である。一例として、Marjan Hezareh et. al. Journal of Virology, 75(24):12161−12168(2001)によれば、IgG1の234番目、235番目のロイシン残基(数字はKabatらによるEUインデックス)をそれぞれアラニン残基に置換すると、ADCC、CDC活性が低下することが示されている。
上記の方法によって作製された抗Orai1抗体の例として、配列番号68または70に記載の重鎖配列を挙げることができる。配列番号は70または72に記載の重鎖は、本明細書に記載の各軽鎖配列と組み合わせて、治療用抗体として使用することが可能である。組み合わせる軽鎖の具体例として、配列番号31、33、35、37、56、58または60に記載の抗体を挙げることができる。好適な軽鎖と重鎖の組み合わせた抗体としては、配列番号56の21乃至234番目のアミノ酸残基からなる軽鎖および配列番号70の20乃至466番目のアミノ酸残基からなる重鎖からなる抗体、配列番号58の21乃至234番目のアミノ酸残基からなる軽鎖および配列番号70の20乃至466番目のアミノ酸残基からなる重鎖からなる抗体、ならびに配列番号60の21乃至234番目のアミノ酸残基からなる軽鎖および配列番号70の20乃至466番目のアミノ酸残基からなる重鎖からなる抗体を挙げることができる。
なお、哺乳類培養細胞で生産される抗体の重鎖のカルボキシル末端のリシン残基が欠失することが知られており(Journal of Chromatography A,705:129−134(1995))、また、同じく重鎖カルボキシル末端のグリシン、リシンの2アミノ酸残基が欠失し、新たにカルボキシル末端に位置するプロリン残基がアミド化されることが知られている(Analytical Biochemistry,360:75−83(2007))。しかし、これらの重鎖配列の欠失および修飾は、抗体の抗原結合能及びエフェクター機能(補体の活性化や抗体依存性細胞傷害作用など)には影響を及ぼさない。従って、本発明には当該修飾を受けた抗体も含まれ、重鎖カルボキシル末端において1または2つのアミノ酸が欠失した欠失体、およびアミド化された当該欠失体(例えば、カルボキシル末端部位のプロリン残基がアミド化された重鎖)等を挙げることができる。但し、抗原結合能およびエフェクター機能が保たれている限り、本発明に係る抗体の重鎖のカルボキシル末端の欠失体は上記の種類に限定されない。本発明に係る抗体を構成する2本の重鎖は、完全長および上記の欠失体からなる群から選択される重鎖のいずれか一種であっても良いし、いずれか二種を組み合わせたものであっても良い。各欠失体の量比は本発明に係る抗体を産生する哺乳類培養細胞の種類および培養条件に影響を受け得るが、本発明に係る抗体の主成分としては2本の重鎖の双方でカルボキシル末端の1つのアミノ酸残基が欠失している場合を挙げることができる。すなわち配列表に記載の配列番号27、29、39、41、43、45、62、64、66、68、および70に示される各重鎖配列の20乃至465番目のアミノ酸残基からなる重鎖、または20乃至464番目のアミノ酸残基からなる重鎖も本発明の抗体に使用することができる。
以上の方法によって得られた抗体は、抗原に対する結合性を評価し、好適な抗体を選抜することができる。抗体の性質を比較する際の別の指標の一例としては、抗体の安定性を挙げることができる。示差走査カロリメトリー(DSC)は、蛋白の相対的構造安定性の良い指標となる熱変性中点(Tm)を素早く、また正確に測定することができる方法である。DSCを用いてTm値を測定し、その値を比較することによって、熱安定性の違いを比較することができる。抗体の保存安定性は、抗体の熱安定性とある程度の相関を示すことが知られており(Lori Burton,et. al.,Pharmaceutical Development and Technology(2007)12,p.265−273)、熱安定性を指標に、好適な抗体を選抜することができる。抗体を選抜するための他の指標としては、適切な宿主細胞における収量が高いこと、および水溶液中での凝集性が低いことを挙げることができる。例えば収量の最も高い抗体が最も高い熱安定性を示すとは限らないので、以上に述べた指標に基づいて総合的に判断して、ヒトへの投与に最も適した抗体を選抜する必要がある。
また、抗体の重鎖および軽鎖の全長配列を適切なリンカーを用いて連結し、一本鎖イムノグロブリン(single chain immunoglobulin)を取得する方法も知られている(Lee,H−S,et.al.,Molecular Immunology(1999)36,p.61−71;Shirrmann,T.et.al.,mAbs(2010),2,(1)p.1−4)。このような一本鎖イムノグロブリンは二量体化することによって、本来は四量体である抗体と類似した構造と活性を保持することが可能である。また、本発明の抗体は、単一の重鎖可変領域を有し、軽鎖配列を有さない抗体であっても良い。このような抗体は、単一ドメイン抗体(single domain antibody:sdAb)またはナノボディ(nanobody)と呼ばれており、実際にラクダまたはラマで観察され、抗原結合能が保持されていることが報告されている(Muyldemans S.et.al.,Protein Eng.(1994)7(9),1129−35,Hamers−Casterman C.et.al.,Nature(1993)363(6428)446−8)。上記の抗体は、本発明における抗体の抗原結合性断片の一種と解釈することも可能である。
また、本発明の抗体に結合している糖鎖修飾を調節することによって、抗体依存性細胞傷害活性を増強することが可能である。抗体の糖鎖修飾の調節技術としては、WO99/54342、WO00/61739、WO02/31140等が知られているが、これらに限定されるものではない。
抗体遺伝子を一旦単離した後、適当な宿主に導入して抗体を作製する場合には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。 抗体遺伝子の具体例としては、本明細書に記載された抗体の重鎖配列をコードする遺伝子、および軽鎖配列をコードする遺伝子を組み合わせたものを挙げることができる。宿主細胞を形質転換する際には、重鎖配列遺伝子と軽鎖配列遺伝子は、同一の発現ベクターに挿入されていることが可能であり、又別々の発現ベクターに挿入されていることも可能である。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、真核微生物を用いることができる。動物細胞としては、(1)哺乳類細胞、例えば、サルの細胞であるCOS細胞(Gluzman,Y.Cell(1981)23,p.175−182、ATCC CRL−1650)、マウス線維芽細胞NIH3T3(ATCC No.CRL−1658)やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞(CHO細胞、ATCC CCL−61)のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株(Urlaub,G.and Chasin,L.A.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1980)77,p.4126−4220)を挙げることができる。また、原核細胞を使用する場合は、例えば、大腸菌、枯草菌を挙げることができる。これらの細胞に目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をin vitroで培養することにより抗体が得られる。以上の培養法においては抗体の配列によって収量が異なる場合があり、同等な結合活性を持つ抗体の中から収量を指標に医薬としての生産が容易なものを選別することが可能である。
本発明の抗体のアイソタイプとしての制限はなく、例えばIgG(IgG1,IgG2,IgG3,IgG4)、IgM、IgA(IgA1,IgA2)、IgDあるいはIgE等を挙げることができるが、好ましくはIgGまたはIgM、さらに好ましくはIgG1またはIgG2を挙げることができる。
また本発明の抗体は、抗体の抗原結合部を有する抗体の抗原結合性断片またはその修飾物であってもよい。抗体をパパイン、ペプシン等の蛋白質分解酵素で処理するか、あるいは抗体遺伝子を遺伝子工学的手法によって改変し適当な培養細胞において発現させることによって、該抗体の断片を得ることができる。このような抗体断片のうちで、抗体全長分子の持つ機能の全てまたは一部を保持している断片を抗体の抗原結合性断片と呼ぶことができる。
抗体の機能としては、一般的には抗原結合活性、抗原の活性を中和する活性、抗原の活性を増強する活性、抗体依存性細胞傷害活性、補体依存性細胞傷害活性および補体依存性細胞性細胞傷害活性を挙げることができる。本発明における抗体の抗原結合性断片が保持する機能は、Orai1に対する結合活性であり、好ましくはT細胞の活性化を抑制する活性であり、より好ましくはT細胞によるIL−2および/またはインターフェロンγの産生を抑制する活性である。
例えば、抗体の断片としては、Fab、F(ab’)2、Fv、または重鎖および軽鎖のFvを適当なリンカーで連結させたシングルチェインFv(scFv)、diabody(diabodies)、線状抗体、および抗体断片より形成された多特異性抗体などを挙げることができる。また、F(ab’)2を還元条件下で処理した抗体の可変領域の一価の断片であるFab’も抗体の断片に含まれる。
さらに、本発明の抗体は少なくとも2種類の異なる抗原に対して特異性を有する多特異性抗体であってもよい。通常このような分子は2種類の抗原に結合するものであるが(即ち、二重特異性抗体(bispecific antibody))、本発明における「多特異性抗体」は、それ以上(例えば、3種類)の抗原に対して特異性を有する抗体を包含するものである。
本発明の多特異性抗体は、全長からなる抗体、またはそのような抗体の断片(例えば、F(ab’)2二重特異性抗体)でもよい。二重特異性抗体は2種類の抗体の重鎖と軽鎖(HL対)を結合させて作製することもできるし、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて、二重特異性抗体産生融合細胞を作製することによっても、作製することができる(Millstein et al.,Nature(1983)305,p.537−539)。
本発明の抗体は一本鎖抗体(scFvとも記載する)でもよい。一本鎖抗体は、抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域とをポリペプチドのリンカーで連結することにより得られる(Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,113(RosenbergおよびMoore編、Springer Verlag,New York,p.269−315(1994)、Nature Biotechnology(2005),23,p.1126−1136)。また、2つのscFvをポリペプチドリンカーで結合させて作製されるBiscFv断片を二重特異性抗体として使用することもできる。
一本鎖抗体を作製する方法は当技術分野において周知である(例えば、米国特許第4,946,778号、米国特許第5,260,203号、米国特許第5,091,513号、米国特許第5,455,030号等を参照)。このscFvにおいて、重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、コンジュゲートを作らないようなリンカー、好ましくはポリペプチドリンカーを介して連結される(Huston,J.S.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988),85,p.5879−5883)。scFvにおける重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、同一の抗体に由来してもよく、別々の抗体に由来してもよい。可変領域を連結するポリペプチドリンカーとしては、例えば12〜19残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
scFvをコードするDNAは、前記抗体の重鎖または重鎖可変領域をコードするDNA、および軽鎖または軽鎖可変領域をコードするDNAのうち、それらの配列のうちの全部または所望のアミノ酸配列をコードするDNA部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてPCR法により増幅し、次いで、さらにポリペプチドリンカー部分をコードするDNA、およびその両端が各々重鎖、軽鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合わせて増幅することにより得られる。
また、一旦scFvをコードするDNAが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従ってscFvを得ることができる。これらの抗体断片は、前記と同様にして遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。
本発明の抗体は、多量化して抗原に対する親和性を高めたものであってもよい。多量化する抗体としては、1種類の抗体であっても、同一の抗原の複数のエピトープを認識する複数の抗体であってもよい。抗体を多量化する方法としては、IgG CH3ドメインと2つのscFvとの結合、ストレプトアビジンとの結合、へリックスーターン‐へリックスモチーフの導入等を挙げることができる。
本発明の抗体は、アミノ酸配列が異なる複数種類の抗Orai1抗体の混合物である、ポリクローナル抗体であってもよい。ポリクローナル抗体の一例としては、CDRが異なる複数種類の抗体の混合物を挙げることができる。そのようなポリクローナル抗体としては、異なる抗体を産生する細胞の混合物を培養し、該培養物から精製された抗体を用いることが出来る(WO2004/061104号参照)。
抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール(PEG)等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。
本発明の抗体は、更にこれらの抗体と他の薬剤がコンジュゲートを形成しているもの(Immunoconjugate)でもよい。このような抗体の例としては、該抗体が放射性物質や薬理作用を有する化合物と結合している物を挙げることができる(Nature Biotechnology(2005)23,p.1137−1146)。
得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常の蛋白質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えばカラムクロマトグラフィー、フィルター濾過、限外濾過、塩析、透析、調製用ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる(Strategies for Protein Purification and Characterization:A Laboratory Course Manual,Daniel R.Marshak et al.eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996);Antibodies:A Laboratory Manual.Ed Harlow and David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988))が、これらに限定されるものではない。
クロマトグラフィーとしては、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等を挙げることができる。これらのクロマトグラフィーは、HPLCやFPLC等の液体クロマトグラフィーを用いて行うことができる。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインAカラム、プロテインGカラムを挙げることができる。例えばプロテインAカラムを用いたカラムとして、Hyper D,POROS,Sepharose F.F.(ファルマシア)等を挙げることができる。また、抗原を固定化した担体を用いて、抗原への結合性を利用して抗体を精製することも可能である。
3.抗Orai1抗体を含有する医薬
上述の「2.抗Orai1抗体の製造」の項に記載された方法で得られる抗Orai1抗体の中から、Orai1の生物活性を中和する抗体を得ることができる。これらOrai1の生物活性を中和する抗体は、生体内でのOrai1の生物活性、即ち、T細胞やマスト細胞に代表されるOrai1発現細胞のカルシウム放出依存性カルシウムチャネル(CRACチャネル)の活性化を阻害できることから、医薬として、これらの細胞のCRACチャネル活性化に起因する疾患に対する治療および/または予防剤として用いることができる。
上述の「2.抗Orai1抗体の製造」の項に記載された方法で得られる抗Orai1抗体の中から、Orai1の生物活性を中和する抗体を得ることができる。これらOrai1の生物活性を中和する抗体は、生体内でのOrai1の生物活性、即ち、T細胞やマスト細胞に代表されるOrai1発現細胞のカルシウム放出依存性カルシウムチャネル(CRACチャネル)の活性化を阻害できることから、医薬として、これらの細胞のCRACチャネル活性化に起因する疾患に対する治療および/または予防剤として用いることができる。
CRACチャネル活性化に起因する疾患や状態には、移植物の拒絶、免疫関連疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、抗血小板もしくは抗血栓活性、または癌などが含まれる。
移植物拒絶の治療および/または予防の例としては、心臓、腎臓、肝臓、骨髄、皮膚等の臓器もしくは組織の移植に対する拒絶反応および宿主対移植片反応、そして造血細胞(骨髄、末梢血、臍帯血等)の移植によって起こる移植片対宿主病の治療および/または予防が挙げられる。
免疫関連疾患の例としては、結合組織や筋骨格系(関節リウマチ、強直性脊椎炎、全身性エリテマトーデス、強皮症、多発筋炎、皮膚筋炎など)、血液系(再生不良性貧血、特発性血小板減少性紫斑病など)、消化器系(クローン病、潰瘍性大腸炎など)、神経系(多発性硬化症、重症筋無力症など)、視覚系(ブドウ膜炎など)、血管系(ベーチェット病、ヴェゲナー肉芽腫症など)、表皮系(乾癬、天疱瘡、白斑など)、内分泌系(1型糖尿病、自己免疫甲状腺炎、バセドウ病、橋本病など)等が挙げられる。
アレルギー性疾患の例としては、アトピー性皮膚炎、喘息、アナフィラキシー、アナフィラキシー様反応、食物アレルギー、鼻炎、中耳炎、薬物反応、昆虫刺傷反応、植物反応、ラテックスアレルギー、結膜炎、じんま疹などが挙げられる。
炎症性疾患の例としては、炎症性腎疾患(糸球体腎炎、ネフローゼなど)、炎症性肺疾患(慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性線維症、間質性肺炎など)、炎症性腸疾患(潰瘍性大腸炎、回腸炎など)、炎症性肝疾患(自己免疫肝炎、ウイルス肝炎など)、炎症性心疾患(心筋炎、虚血性心疾患、アテローム性動脈硬化症など)、炎症性皮膚疾患(接触性皮膚炎、湿疹など)、炎症性眼疾患(トラコーマ、眼内炎など)、炎症性中枢神経疾患(髄膜炎、脳脊髄炎、自己免疫脳炎など)、関節の炎症性疾患(例えば関節炎、骨関節炎など)、全身性炎症(敗血症、出血、過敏症、癌化学療法などに起因するショック症状など)等が挙げられる。
抗血小板または抗血栓活性が治療および/または予防に役立つ例としては、心筋梗塞、脳卒中、虚血性心疾患、血栓症等が挙げられる。
癌治療の例としては乳癌、肺癌、皮膚癌、白血病等が挙げられる。
さらにマスト細胞および好塩基球が関与する病態、マスト細胞白血病、マスト細胞症、好塩基性白血病、子宮内膜症等が、そしてCRACチャネルの遺伝的機能亢進により発症する、または発症のリスクが高まる小管集合性ミオパチー、ストールモルケン症、関節リウマチ、強直性脊椎炎、アトピー性皮膚炎等が本抗体によって治療することができる疾患として挙げられる。
上記の医薬としての抗Orai1抗体の例として、R118抗体および/またはR198から作製されたヒト化抗体およびこれのCDR改変体を挙げることができる。
in vitroでの抗Orai1抗体によるOrai1の生物活性の中和活性は、例えばOrai1を発現しているT細胞の活性化抑制活性で測定することができる。例えば、ヒトT細胞由来細胞株であるJurkat細胞に種々の濃度で抗Orai1抗体を添加することで、PMAおよびA23187刺激によるJurkat細胞からのIL−2放出に対する抑制活性を測定することができる。また、ヒト末梢血単核球(PBMC)に種々の濃度で抗Orai1抗体を添加することで、PMAおよびA23187刺激によるPBMCからのIL−2およびインターフェロンγ放出に対する抑制活性を測定することができる。
移植片対宿主病発症の責任細胞がT細胞であることは、実験的にも証明された事実であり、広く認識されている。移植されたT細胞が被移植者を異物と認識すると、自身で生産するインターロイキン2(IL−2)による自己増殖や、活性化によるインターフェロンガンマ(IFN−γ)などの炎症性サイトカイン類の放出によって、全身性の免疫炎症反応を生じさせ、移植片対宿主病を発症する。従って、これらのサイトカイン類の産生を抑制することは、移植片対宿主病の予防や治療に繋がるとともに、その抑制活性を指標とすることで、Orai1抗体の治療薬としての有用性を判断することが出来る。
本発明における好適な抗体として、配列番号2に記載のアミノ酸配列に特異的に結合し、PMAおよびA23187処理されたJurkat細胞が放出するIL−2量を50%阻害する濃度が80ng/mL以下であることを特徴とする、抗体または該抗体の抗原結合性断片を挙げることができる。前記の抗体においてさらに好適なものとして、PMAおよびA23187処理されたJurkat細胞が放出するIL−2量を50%阻害する濃度が10ng/mL以下であることを特徴とする、抗体または該抗体の抗原結合性断片を挙げることができる。また、PMAおよびA23187処理されたJurkat細胞が放出するIL−2量を80%阻害する濃度が60000ng/mL以下であることを特徴とする、抗体または該抗体の抗原結合性断片、ならびに80%阻害する濃度が200ng/mL以下であることを特徴とする、抗体または該抗体の抗原結合性断片も本発明の抗体に含まれる。
本発明における別の好適な抗体として、配列番号2に記載のアミノ酸配列に特異的に結合し、PMAおよびA23187処理されたヒトPBMCが放出するIL−2量を50%阻害する濃度が100ng/mL以下であることを特徴とする、抗体または該抗体の抗原結合性断片を挙げることができる。前記の抗体においてさらに好適なものとして、PMAおよびA23187処理されたヒトPBMCが放出するIL−2量を50%阻害する濃度が20ng/mL以下であることを特徴とする、抗体または該抗体の抗原結合性断片をあげることができる。また、PMAおよびA23187処理されたヒトPBMCが放出するIL−2量を80%阻害する濃度が17000ng/mL以下であることを特徴とする、抗体または該抗体の抗原結合性断片、ならびに80%阻害する濃度が400ng/mL以下であることを特徴とする、抗体または該抗体の抗原結合性断片も本発明の抗体に含まれる。
本発明におけるさらに別の好適な抗体として、配列番号2に記載のアミノ酸配列に特異的に結合し、PMAおよびA23187処理されたヒトPBMCが放出するIFN−γ量を50%阻害する濃度が800ng/mL以下であることを特徴とする、抗体または該抗体の抗原結合性断片を挙げることができる。前記の抗体においてさらに好適なものとして、PMAおよびA23187処理されたヒトPBMCが放出するIFN−γ量を50%阻害する濃度が40ng/mL以下であることを特徴とする、抗体または該抗体の抗原結合性断片を挙げることができる。また、PMAおよびA23187処理されたヒトPBMCが放出するIFN−γ量を80%阻害する濃度が300000ng/mL以下であることを特徴とする、抗体または該抗体の抗原結合性断片、ならびに80%阻害する濃度が2000ng/mL以下であることを特徴とする、抗体または該抗体の抗原結合性断片も本発明の抗体に含まれる。
また実験動物を利用したin vivoでの抗Orai1抗体の移植片対宿主病に対する治療または予防効果は、例えばヒトPBMC移入マウス移植片対宿主病モデルにおける体重減少の抑制を測定することで確認することができる。すなわち、重度免疫不全マウスであるNOGマウスあるいはNSGマウスに2.0GyのX線を照射した翌日に、1mL中に15百万個から50百万個のヒトPBMCを含むPBS溶液を、尾静脈よりマウス1匹あたり200μL移入する。ヒトPBMCを移入しなかったX線照射マウス群を非移植片対宿主病群、ヒトPBMCを移入し抗体の基材液のみを投与した群を移植片対宿主病群とし、ヒトPBMC移入前や移入後に抗Orai1抗体を尾静脈内投与もしくは腹腔内投与することで、移植片対宿主病群の体重減少に対する抑制効果を測定する。
さらに抗Orai1抗体の各種疾患に対する治療または予防効果は、Human Orai1ノックインマウスを用いた以下のin vivo評価系によっても確認できる。
皮膚炎に対する効果は、マウスの腹腔内や静脈内にタンパク抗原液を投与し、さらに2週間後に追加免疫を施した後、同タンパク抗原液を耳または背部に3日〜2週間ごとに3〜6回繰り返し塗布することで発症させた皮膚炎において、耳介の厚さ、背部の皮膚炎の肉眼的スコア、血液や組織中の抗体・サイトカイン・血中バイオマーカー濃度、皮膚・末梢血・胸腺・脾臓・リンパ節・骨髄から得た細胞の増殖活性・サイトカイン産生能・表面抗原を抗Orai1抗体群と非投与群間で比較することで評価する。
掻痒に対する効果は、ダニ抗原クリームを耳介または背部に3日〜2週間ごとに3〜6回繰り返し塗布する、あるいはハプテン類を耳介や腹部や背部に連日〜週1回塗布する、あるいは掻痒誘発物質を耳介皮内や背部皮下やくも膜下腔内に投与するなどの方法で誘導した掻痒行動を、マウスの両足甲に装着したマグネットと掻痒行動測定装置による掻痒回数の測定や、皮膚・末梢血・脊髄組織の病理的特徴を検査することで定量化し、抗Orai1抗体群と非投与群間で比較することで評価する。
乾癬に対する効果は、Imiquimodを耳介両側または片面および剃毛済み背部に塗布する、Zymosan懸濁液を腹腔内投与する、IL−23などのサイトカインをマウス耳介片面へ皮内投与するなどの方法で誘導した乾癬性皮膚炎を、炎症部位の重量、厚み、その部位に浸潤した好中球のミエロペルオキシダーゼ活性、浸潤した細胞のフローサイトメトリー解析、遺伝子解析、サイトカイン濃度などの測定により定量化し、抗Orai1抗体群と非投与群間で比較することで評価する。
多発性硬化症に対する効果は、Myelin oligodendrocyte glycoproteinまたはその部分ペプチド抗原溶液を等量のフロイントの完全アジュバント水溶液と混合して乳化させ、マウスの脇腹または腹部皮内に投与し、その後百日咳毒素水溶液を尾静脈へ投与、さらに数日後に再度百日咳毒素液を尾静脈へ投与することで誘導した実験的脳脊髄炎を、実験開始1週間から2週間後より発症する尾から下肢、前肢へと拡大する麻痺症状の肉眼的観察でスコア化し、抗Orai1抗体群と非投与群間で比較することで評価する。
関節炎に対する効果は、ウシII型コラーゲンとフロイントの完全アジュバントを混合し乳化したものをマウスの尾根部皮内に投与し、2〜3週間後に同じ投与を行い、その後の関節腫脹のスコア化、血液や組織中の抗体・サイトカイン・血中バイオマーカー濃度、皮膚・末梢血・胸腺・脾臓・リンパ節・骨髄から得た細胞の増殖活性・サイトカイン産生能・表面抗原などを、抗Orai1抗体群と非投与群間で比較することで評価する。
大腸炎に対する効果は、トリニトロベンゼンスルホン酸を24時間絶食下のマウス腸管内に投与する、1−10%のデキストラン硫酸ナトリウム水溶液を給水瓶より4日から2週間自由飲水させる、Human Orai1ノックインマウスのリンパ節と脾臓から採取し精製したCD4+CD25−CD45RBhi T−cellsをRag2−/−マウスの腹腔内に移入するなどの方法で大腸炎を誘導し、観察期間中の体重、試験終了後の剖検による腸管の肥厚度・ポリープの個数と大きさ・病理的特徴、血液や組織中の抗体・サイトカイン・血中バイオマーカー濃度、腸管・末梢血・胸腺・脾臓・リンパ節・骨髄から得た細胞の増殖活性・サイトカイン産生能・表面抗原などを、抗Orai1抗体群と非投与群間で比較することで評価する。
全身性エリテマトーデスに対する効果は、卵白アルブミンあるいは他の非刺激性の抗原を腹腔内あるいは皮下に5〜10日間隔で最大15回投与することで全身性エリテマトーデス様症状を誘導し、観察期間中に経時的に採取した血液や組織中の抗体・サイトカイン・血中バイオマーカー濃度、尿中の抗体価やバイオマーカー濃度、試験終了後に採取した脾臓・リンパ節などの臓器から細胞を調製して無処置のマウスに移入することで惹起させた症状などを、抗Orai1抗体群と非投与群間で比較することで評価する。
肝炎に対する効果は、D‐ガラクトースアミンを単独またはリポポリサッカライドとの組み合わせでマウスの腹腔内に投与する、コンカナバリンAを単独で尾静脈内に投与するなどの方法で肝炎を誘導し、起因物質投与の1時間〜1週間後に採取した血液中のGOTおよびGPT濃度や肝病変の組織病理学的状態を抗Orai1抗体群と非投与群間で比較することで評価する。
骨髄細胞移植における生着率や移植片対宿主病予防に対する効果は、Human Orai1ノックインマウスの大腿骨や脛骨から採取した骨髄内の細胞を、単独もしくはHuman Orai1ノックインマウスの脾臓より採取した脾細胞と組み合わせ、X線照射レシピエントマウスに移入、4から16週間の体重変化や生存率、試験終了時の血液や組織中の抗体・サイトカイン・血中バイオマーカー濃度、腸管・末梢血・胸腺・脾臓・リンパ節・骨髄から得た細胞の表面抗原・増殖活性・サイトカイン産生能を抗Orai1抗体群と非投与群間で比較することで評価する。
移植臓器の生着率に対する効果は、ホストマウスの尾根部から採取した皮膚を、皮膚を切除して露出させたHuman Orai1ノックインマウスの背部皮筋層に固定し、移植後4から16週間の移植片の大きさと生着状態をスコア化し、抗Orai1抗体群と非投与群間で比較することで評価する。
このようにして得られたOrai1の生物活性を中和する抗体は、医薬として、特に移植物の拒絶、免疫関連疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、抗血小板もしくは抗血栓活性、または癌などを予防または治療するための抗体として有用である。
抗Orai1抗体は、一つの例としては、移植物の拒絶、免疫関連疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、抗血小板もしくは抗血栓活性、または癌の治療または予防に対しては該抗体単独で、あるいは少なくとも一つの他の治療剤と併用して投与することができる。抗Orai1抗体と併用して投与できる他の治療剤としては、葉酸代謝拮抗剤、カルシニューリン阻害剤、副腎皮質ステロイド剤、抗胸腺細胞グロブリン剤、核酸代謝拮抗剤、核酸合成阻害剤、細胞表面抗原を標的とする生物製剤、またはサイトカインもしくはサイトカイン受容体を標的とする生物製剤等を挙げることができるがこれらに限定されない。
上記の治療剤の具体例としては、葉酸代謝拮抗剤としてはMethotrexate、カルシニューリン阻害剤としてはCyclosporin、Taclorims、副腎皮質ステロイド剤としてはMethylprednisolone、核酸合成阻害剤としてはCyclophosphamide、抗胸腺細胞グロブリン剤としてはZetbulin、Lymphoglobuline、Thymoglobulin、核酸代謝拮抗剤としてはMycophenolate mofetil、細胞表面抗原を標的とする生物製剤としてはAlemtuzumab、Rituximab、サイトカインあるいはサイトカイン受容体を標的とする生物製剤としてはInfliximab、Etanercept、Rituximabなどを挙げることができる。
移植物の拒絶、免疫関連疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、抗血小板もしくは抗血栓活性、または癌の状態やどの程度の治療および/または予防を目指すかによって、2、3あるいはそれ以上の種類の他の治療剤を投与することもできるし、それらの他の治療剤は同じ製剤の中に封入することによって同時に投与することができる。他の治療剤と抗Orai1抗体は同じ製剤の中に封入することによって同時に投与することもできる。また、抗Orai1抗体と他の治療剤を別々の製剤に封入して同時に投与することもできる。さらに、他の治療剤と抗Orai1抗体を相前後して別々に投与することもできる。すなわち、他の治療剤を投与した後に抗Orai1抗体または該抗体の抗原結合性断片を有効成分として含有する治療剤を投与するか、あるいは抗Orai1抗体または該抗体の抗原結合性断片を有効成分として含有する治療剤を投与した後に他の治療剤を投与しても良い。遺伝子治療において投与する場合には、蛋白質性の治療剤の遺伝子と抗Orai1抗体の遺伝子は、別々のあるいは同じプロモーター領域の下流に挿入することができ、別々のあるいは、同じベクターに導入することができる。
抗Orai1抗体、あるいはそのフラグメントに対し治療剤を結合させることにより、M.C.Garnet「Targeted drug conjugates: principles and progress」,Advanced Drug Delivery Reviews,(2001)53,171−216記載の標的型薬物複合体を製造することができる。この目的には、抗体分子のほか、T細胞の認識性を完全消失していない限り、いずれの抗体フラグメントも適用可能であるが、例えば、Fab、F(ab’)2、Fv等のフラグメントを例として挙げることができ、本発明においても同様に、抗体および該フラグメントを使用することができる。抗Orai1抗体または該抗体のフラグメントと治療剤との結合様式は、M.C.Garnet「Targeted drug conjugates:principles and progress」,Advanced Drug Delivery Reviews, (2001)53,171−216、G.T.Hermanson「Bioconjugate Techniques」Academic Press, California (1996)、Putnam and J.Kopecek「Polymer Conjugates with Anticancer Activity」Advances in Polymer Science(1995)122,55−123等に記載される種々の形態があり得る。すなわち、抗Orai1抗体と治療剤が化学的に直接あるいはオリゴペプチド等のスペーサーを介在して結合される様式や、適当な薬物担体を介在して結合される様式を挙げることができる。薬物担体の例としては、リポソームや水溶性高分子を挙げることができる。これら薬物担体が介在される様式としては、より具体的には、抗体と治療剤とがリポソームに包含され、該リポソームと抗体とが結合した様式、および、治療剤が水溶性高分子(分子量1000乃至10万程度の化合物)に化学的に直接あるいはオリゴペプチド等のスペーサーを介在させて結合され、該水溶性高分子に抗体が結合した様式、を例として挙げることができる。抗体(または該フラグメント)と治療剤、リポソームおよび水溶性高分子等の薬物担体との結合は、G.T.Hermanson「Bioconjugate Techniques」Academic Press, California(1996)、Putnam and J. Kopecek「Polymer Conjugates with Anticancer Activity」Advances in Polymer Science (1995)122, 55−123に記載の方法等の当業者周知の方法により実施することができる。治療剤のリポソームへの包含は、D.D.Lasic「Liposomes:From Physics to Applications」,Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam(1993)等に記載の方法等の当業者周知の方法により実施することができる。治療剤の水溶性高分子への結合は、D.Putnam and J Kopecek「Polymer Conjugates with Anticancer Activity」Advances in Polymer Science(1995)122,55−123記載の方法等の当業者周知の方法により、実施することができる。抗体(または該フラグメント)と蛋白質性の治療剤(または該フラグメント)との複合体は、上記の方法のほか、遺伝子工学的に、当業者周知の方法により作製することができる。
本発明は、治療および/または予防に有効な量の抗Orai1抗体と薬学上許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤および/または補助剤を含む医薬組成物も提供する。
本発明は、治療および/または予防に有効な量の抗Orai1抗体と治療および/または予防に有効な量の少なくとも一つの治療剤と薬学上許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤および/または補助剤を含む医薬組成物も提供する。治療剤としては、先に述べた葉酸代謝拮抗剤、カルシニューリン阻害剤、副腎皮質ステロイド剤、抗胸腺細胞グロブリン剤、核酸代謝拮抗剤、核酸合成阻害剤、細胞表面抗原を標的とする生物製剤、またはサイトカインもしくはサイトカイン受容体を標的とする生物製剤等を挙げることができるがこれらに限定されない。
本発明の医薬組成物において許容される製剤に用いる物質としては好ましくは投与量や投与濃度において、医薬組成物を投与される者に対して非毒性のものが好ましい。
本発明の医薬組成物は、pH、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、無菌性、安定性、溶解率、徐放率、吸収率、浸透率を変えたり、保持したりするための製剤用の物質を含むことができる。製剤用の物質として以下のものを挙げることができるが、これらに制限されない:グリシン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシン等のアミノ酸類、抗菌剤、アスコルビン酸、硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤、リン酸、クエン酸、ホウ酸バッファー、炭酸水素ナトリウム、トリス−塩酸(Tris−Hcl)溶液等の緩衝剤、マンニトールやグリシン等の充填剤、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)等のキレート剤、カフェイン、ポリビニルピロリジン、β−シクロデキストリンやヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン等の錯化剤、グルコース、マンノースまたはデキストリン等の増量剤、単糖類、二糖類等の他の炭水化物、着色剤、香味剤、希釈剤、乳化剤やポリビニルピロリジン等の親水ポリマー、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン、塩化ベンズアルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロレキシジン、ソルビン酸または過酸化水素等の防腐剤、グリセリン、プロピレン・グリコールまたはポリエチレングリコール等の溶媒、マンニトールまたはソルビトール等の糖アルコール、懸濁剤、ソルビタンエステル、ポリソルベート20やポリソルベート80等のポリソルベート、トリトン(triton)、トロメタミン(tromethamine)、レシチンまたはコレステロール等の界面活性剤、スクロースやソルビトール等の安定化増強剤、塩化ナトリウム、塩化カリウムやマンニトール・ソルビトール等の弾性増強剤、輸送剤、賦形剤、および/または薬学上の補助剤。これらの製剤用の物質の添加量は、抗Orai1抗体の重量に対して0.01〜100倍、特に0.1〜10倍添加するのが好ましい。製剤中の好適な医薬組成物の組成は当業者によって、適用疾患、適用投与経路などに応じて適宜決定することができる。
医薬組成物中の賦形剤や担体は液体でも固体でもよい。適当な賦形剤や担体は注射用の水や生理食塩水、人工脳脊髄液や非経口投与に通常用いられている他の物質でもよい。中性の生理食塩水や血清アルブミンを含む生理食塩水を担体に用いることもできる。医薬組成物にはpH7.0−8.5のTrisバッファー、pH4.0−5.5の酢酸バッファー、pH3.0−6.2のクエン酸バッファーを含むことができる。また、これらのバッファーにソルビトールや他の化合物を含むこともできる。本発明の医薬組成物には抗Orai1抗体を含む医薬組成物並びに、抗Orai1抗体および少なくとも一つの治療剤を含む医薬組成物を挙げることができ、本発明の医薬組成物は選択された組成と必要な純度を持つ薬剤として、凍結乾燥品あるいは液体として準備される。抗Orai1抗体を含む医薬組成物並びに、抗Orai1抗体および少なくとも一つの骨代謝異常治療薬剤を含む医薬組成物はスクロースのような適当な賦形剤を用いた凍結乾燥品として成型されることもできる。
本発明の医薬組成物は非経口投与用に調製することもできるし、経口による消化管吸収用に調製することもできる。製剤の組成および濃度は投与方法によって決定することができるし、本発明の医薬組成物に含まれる、抗Orai1抗体のOrai1に対する親和性、即ち、Orai1に対する解離定数(Kd値)に対し、親和性が高い(Kd値が低い)ほど、ヒトへの投与量を少なくしても薬効を発揮することができるので、この結果に基づいて本発明の医薬組成物の人に対する投与量を決定することもできる。投与量は、ヒト型抗Orai1抗体をヒトに対して投与する際には、約0.1〜100mg/kgを1〜180日間に1回投与すればよい。
本発明の医薬組成物の形態としては、点滴を含む注射剤、坐剤、経鼻剤、舌下剤、経皮吸収剤などを挙げることができる。
承認されている抗体製剤のほとんどは静脈内投与であるが、多くの医療現場では皮下投与がより好まれる。その場合には容量が1.0〜1.5mLに制限されるため、投与量によっては高濃度の抗体溶液が要求される。しかし、高濃度化すると薬液の粘性が増加するために、常用される注射針の太さでは、その高い粘性のために注射できないという事態が生じうる。つまり、医薬組成物の形態としては、注射剤を選ぶ場合、粘度が低いという性質は優先されるべき重要な意味があり、粘度を指標に好適な抗体を選択することができる。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、下記実施例において遺伝子操作に関する各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング(Molecular Cloning)」(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.およびManiatis,T.著,Cold Spring Harbor Laboratory Pressより1989年に発刊)に記載の方法により行うか、または、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。
[実施例1]ラット抗ヒトOrai1抗体の作製
1)−1 免疫
1)−1−1 ヒトOrai1発現ベクター(pcDNA3.1−hOrai1)の構築
ヒトOrai1の遺伝子配列はpDONR221(Life Technologies社)にクローニングされたUltimate ORF clone (Clone No. IOH40869、Life Technologies社)を購入して使用した。遺伝子配列を配列表の配列番号1に、またアミノ酸配列を配列表の配列番号2に示す。また、pcDNA3.1(+)をGateway Vector Conversion System(Life Technologies社)によりDestination Vectorに改変したpcDNA3.1−DESTを作製した。Gateway LR Clonase Enzyme mix(Life Technologies社)を用いて,pcDNA3.1−DESTとatt配列内を組み換え、ヒトOrai1発現ベクターpcDNA3.1−hOrai1を作製した。ヒトOrai1発現ベクターの大量調製には、EndoFree Plasmid Giga Kit(QIAGEN社)を用いた。
1)−1 免疫
1)−1−1 ヒトOrai1発現ベクター(pcDNA3.1−hOrai1)の構築
ヒトOrai1の遺伝子配列はpDONR221(Life Technologies社)にクローニングされたUltimate ORF clone (Clone No. IOH40869、Life Technologies社)を購入して使用した。遺伝子配列を配列表の配列番号1に、またアミノ酸配列を配列表の配列番号2に示す。また、pcDNA3.1(+)をGateway Vector Conversion System(Life Technologies社)によりDestination Vectorに改変したpcDNA3.1−DESTを作製した。Gateway LR Clonase Enzyme mix(Life Technologies社)を用いて,pcDNA3.1−DESTとatt配列内を組み換え、ヒトOrai1発現ベクターpcDNA3.1−hOrai1を作製した。ヒトOrai1発現ベクターの大量調製には、EndoFree Plasmid Giga Kit(QIAGEN社)を用いた。
1)−1−2 ラット免疫
免疫にはWKY/Izmラットの雌(日本エスエルシー社)を使用した。まずラット両足下腿部をHyaluronidase(SIGMA−ALDRICH社)にて前処理後、同部位にpcDNA3.1−hOrai1を筋注した。続けて、ECM830(BTX社)を使用し、2ニードル電極を用いて、同部位にインビボエレクトロポレーションを実施した。二週間に一度、同様のインビボエレクトロポレーションを繰り返した後、ラットのリンパ節を採取しハイブリドーマ作製に用いた。
免疫にはWKY/Izmラットの雌(日本エスエルシー社)を使用した。まずラット両足下腿部をHyaluronidase(SIGMA−ALDRICH社)にて前処理後、同部位にpcDNA3.1−hOrai1を筋注した。続けて、ECM830(BTX社)を使用し、2ニードル電極を用いて、同部位にインビボエレクトロポレーションを実施した。二週間に一度、同様のインビボエレクトロポレーションを繰り返した後、ラットのリンパ節を採取しハイブリドーマ作製に用いた。
1)−2 ハイブリドーマ作製
リンパ節細胞とマウスミエローマSP2/0−ag14細胞とをHybrimune Hybridoma Production System(Cyto Pulse Sciences社)を用いて電気細胞融合し、ClonaCell−HY Selection Medium D(StemCell Technologies社)に希釈して培養した。出現したハイブリドーマコロニーを回収することでモノクローンハイブリドーマを作製した。回収された各ハイブリドーマコロニーを培養し、得られたハイブリドーマ培養上清を用いて抗ヒトOrai1抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングを行った。
リンパ節細胞とマウスミエローマSP2/0−ag14細胞とをHybrimune Hybridoma Production System(Cyto Pulse Sciences社)を用いて電気細胞融合し、ClonaCell−HY Selection Medium D(StemCell Technologies社)に希釈して培養した。出現したハイブリドーマコロニーを回収することでモノクローンハイブリドーマを作製した。回収された各ハイブリドーマコロニーを培養し、得られたハイブリドーマ培養上清を用いて抗ヒトOrai1抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングを行った。
1)−3 Cell−ELISA法による一次スクリーニング
1)−3−1 Cell−ELISA用抗原遺伝子発現細胞の調製
HEK293細胞を10% FBS含有DMEM培地中7.5x105細胞/mLになるよう調製した。それに対し、Lipofectamine 2000を用いた形質移入手順に従い、pcDNA3.1−hOrai1もしくはコントロールとしてpcDNA3.1―DESTを導入し、96−well plate(Corning社)に50μlずつ分注し、10% FBS含有DMEM培地中で37℃、5% CO2の条件下で二晩培養した。得られた導入細胞を接着状態のまま、Cell−ELISAに使用した。
1)−3−1 Cell−ELISA用抗原遺伝子発現細胞の調製
HEK293細胞を10% FBS含有DMEM培地中7.5x105細胞/mLになるよう調製した。それに対し、Lipofectamine 2000を用いた形質移入手順に従い、pcDNA3.1−hOrai1もしくはコントロールとしてpcDNA3.1―DESTを導入し、96−well plate(Corning社)に50μlずつ分注し、10% FBS含有DMEM培地中で37℃、5% CO2の条件下で二晩培養した。得られた導入細胞を接着状態のまま、Cell−ELISAに使用した。
1)−3−2 Cell−ELISA
実施例1)−1−1で調製した発現ベクター導入HEK293細胞の培養上清を除去後、pcDNA3.1−hOrai1またはpcDNA3.1−DEST導入HEK293細胞のそれぞれに対しハイブリドーマ培養上清を添加し、4℃で1時間静置した。well中の細胞を5% FBS含有PBSで1回洗浄後、5% FBS含有PBSで500倍に希釈したAnti−Rat IgG−Peroxidase antibody produced in rabbit(SIGMA社)を加えて、4℃で1時間静置した。well中の細胞を5% FBS含有PBSで6回洗浄した後、OPD発色液(OPD溶解液(0.05 M クエン酸3ナトリウム、0.1M リン酸水素2ナトリウム・12水 pH4.5)にo−フェニレンジアミン二塩酸塩(和光純薬社)、H2O2をそれぞれ0.4mg/mL、0.6%(v/v)になるように溶解)を25μL/wellで添加した。時々攪拌しながら発色反応を行い、1M HClを25μL/wellを添加して発色反応を停止させた後、プレートリーダー(ENVISION:PerkinElmer社)で490nmの吸光度を測定した。細胞膜表面上に発現するヒトOrai1に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択するため、コントロールのpcDNA3.1−DEST導入HEK293細胞と比較し、pcDNA3.1−hOrai1発現ベクター導入HEK293細胞の方でより高い吸光度を示す培養上清を産生するハイブリドーマを抗ヒトOrai1抗体産生陽性として選択した。
実施例1)−1−1で調製した発現ベクター導入HEK293細胞の培養上清を除去後、pcDNA3.1−hOrai1またはpcDNA3.1−DEST導入HEK293細胞のそれぞれに対しハイブリドーマ培養上清を添加し、4℃で1時間静置した。well中の細胞を5% FBS含有PBSで1回洗浄後、5% FBS含有PBSで500倍に希釈したAnti−Rat IgG−Peroxidase antibody produced in rabbit(SIGMA社)を加えて、4℃で1時間静置した。well中の細胞を5% FBS含有PBSで6回洗浄した後、OPD発色液(OPD溶解液(0.05 M クエン酸3ナトリウム、0.1M リン酸水素2ナトリウム・12水 pH4.5)にo−フェニレンジアミン二塩酸塩(和光純薬社)、H2O2をそれぞれ0.4mg/mL、0.6%(v/v)になるように溶解)を25μL/wellで添加した。時々攪拌しながら発色反応を行い、1M HClを25μL/wellを添加して発色反応を停止させた後、プレートリーダー(ENVISION:PerkinElmer社)で490nmの吸光度を測定した。細胞膜表面上に発現するヒトOrai1に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択するため、コントロールのpcDNA3.1−DEST導入HEK293細胞と比較し、pcDNA3.1−hOrai1発現ベクター導入HEK293細胞の方でより高い吸光度を示す培養上清を産生するハイブリドーマを抗ヒトOrai1抗体産生陽性として選択した。
1)−4 フローサイトメトリーによる二次スクリーニング
1)−4−1 フローサイトメトリー解析用抗原遺伝子発現細胞の調製
HEK293T細胞を5×104細胞/cm2になるよう225平方cmフラスコに播種し、10% FBS含有DMEM培地中で37℃、5% CO2の条件下で一晩培養した。翌日、pcDNA3.1−hOrai1とコントロールとしてpcDNA3.1−DESTをそれぞれHEK293T細胞にLipofectamine 2000を用いて導入し、37℃、5% CO2の条件下でさらに二晩培養した。翌日、発現ベクター導入HEK293T細胞をTrypLE Express(Life Technologies社)で処理し、10% FBS含有DMEMで細胞を洗浄した後、5% FBS含有PBSに懸濁した。得られた細胞懸濁液をフローサイトメトリー解析に使用した。
1)−4−1 フローサイトメトリー解析用抗原遺伝子発現細胞の調製
HEK293T細胞を5×104細胞/cm2になるよう225平方cmフラスコに播種し、10% FBS含有DMEM培地中で37℃、5% CO2の条件下で一晩培養した。翌日、pcDNA3.1−hOrai1とコントロールとしてpcDNA3.1−DESTをそれぞれHEK293T細胞にLipofectamine 2000を用いて導入し、37℃、5% CO2の条件下でさらに二晩培養した。翌日、発現ベクター導入HEK293T細胞をTrypLE Express(Life Technologies社)で処理し、10% FBS含有DMEMで細胞を洗浄した後、5% FBS含有PBSに懸濁した。得られた細胞懸濁液をフローサイトメトリー解析に使用した。
1)−4−2 フローサイトメトリー解析
実施例1)−3のCell−ELISAで陽性と判定されたハイブリドーマが産生する抗体のヒトOrai1に対する結合特異性をフローサイトメトリー法によりさらに確認した。実施例1)−4−1で調製したHEK293T細胞懸濁液を遠心し、上清を除去した後、pcDNA3.1−DEST導入HEK293T細胞およびpcDNA3.1−hOrai1導入HEK293T細胞のそれぞれに対しハイブリドーマ培養上清を加えて懸濁し、4℃で1時間静置した。5% FBS含有PBSで1回洗浄した後、5% FBS含有PBSで500倍に希釈したAnti−Rat IgG FITC conjugate(SIGMA社)を加えて懸濁し、4℃で1時間静置した。5% FBS含有PBSで3回洗浄した後、2μg/mL 7−aminoactinomycin D(Molecular Probes社)を含む5% FBS含有PBSに再懸濁し、フローサイトメーター(FC500:BeckmanCoulter社)で検出を行った。データ解析はFlowjo(TreeStar社)で行った。7−aminoactinomycin D陽性の死細胞をゲートで除外した後、生細胞のFITC蛍光強度のヒストグラムを作成した。コントロールであるpcDNA3.1−DEST導入HEK293T細胞の蛍光強度ヒストグラムに対しpcDNA3.1−hOrai1導入HEK293T細胞のヒストグラムが強蛍光強度側にシフトしているサンプルを産生するハイブリドーマを抗ヒトOrai1抗体産生ハイブリドーマとして取得した。結果として有意にシフトしたハイブリドーマが225個取得された。
実施例1)−3のCell−ELISAで陽性と判定されたハイブリドーマが産生する抗体のヒトOrai1に対する結合特異性をフローサイトメトリー法によりさらに確認した。実施例1)−4−1で調製したHEK293T細胞懸濁液を遠心し、上清を除去した後、pcDNA3.1−DEST導入HEK293T細胞およびpcDNA3.1−hOrai1導入HEK293T細胞のそれぞれに対しハイブリドーマ培養上清を加えて懸濁し、4℃で1時間静置した。5% FBS含有PBSで1回洗浄した後、5% FBS含有PBSで500倍に希釈したAnti−Rat IgG FITC conjugate(SIGMA社)を加えて懸濁し、4℃で1時間静置した。5% FBS含有PBSで3回洗浄した後、2μg/mL 7−aminoactinomycin D(Molecular Probes社)を含む5% FBS含有PBSに再懸濁し、フローサイトメーター(FC500:BeckmanCoulter社)で検出を行った。データ解析はFlowjo(TreeStar社)で行った。7−aminoactinomycin D陽性の死細胞をゲートで除外した後、生細胞のFITC蛍光強度のヒストグラムを作成した。コントロールであるpcDNA3.1−DEST導入HEK293T細胞の蛍光強度ヒストグラムに対しpcDNA3.1−hOrai1導入HEK293T細胞のヒストグラムが強蛍光強度側にシフトしているサンプルを産生するハイブリドーマを抗ヒトOrai1抗体産生ハイブリドーマとして取得した。結果として有意にシフトしたハイブリドーマが225個取得された。
1)−5 抗体のアイソタイプ決定
1)−4で取得されたラット抗ヒトOrai1抗体産生ハイブリドーマの中から、強くヒトOrai1に結合することが示唆されたR118およびR198を選抜し、抗体アイソタイプを同定した。アイソタイプは、Rat monoclonal isotyping test kit(AbD Serotec社)により決定された。その結果、ラット抗ヒトOrai1モノクローナル抗体R118およびR198のアイソタイプはともにIgG2a、κ鎖であることが示された。
1)−4で取得されたラット抗ヒトOrai1抗体産生ハイブリドーマの中から、強くヒトOrai1に結合することが示唆されたR118およびR198を選抜し、抗体アイソタイプを同定した。アイソタイプは、Rat monoclonal isotyping test kit(AbD Serotec社)により決定された。その結果、ラット抗ヒトOrai1モノクローナル抗体R118およびR198のアイソタイプはともにIgG2a、κ鎖であることが示された。
1)−6 ラット抗ヒトOrai1抗体の調製
ラット抗ヒトOrai1モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養上清から精製した。
まず、R118およびR198産生ハイブリドーマをClonaCell−HY Selection Medium Eで十分量まで増殖させた後、Ultra Low IgG FBS(Life Technologies社)を20%添加したHybridoma SFM(Life Technologies社)に培地交換し、5日間培養した。本培養上清を回収し0.45μmのフィルターを通して滅菌した。
抗体は、上記のハイブリドーマ上清からProteinGアフィニティークロマトグラフィー(4〜6℃下)1段階工程で精製した。ProteinGアフィニティークロマトグラフィー精製後のバッファー置換工程は4〜6℃下で実施した。最初に、PBSで平衡化したProteinG(GE Healthcare Bioscience社)が充填されたカラムにハイブリドーマの培養上清をアプライした。培養上清液がカラムに全て入ったのち、カラム容量2倍以上のPBSでカラムを洗浄した。次に0.1 Mグリシン/塩酸水溶液(pH2.7)で溶出し、抗体の含まれる画分を集めた。集めた画分に1M Tris−HCl(pH9.0)を加えてpH7.0〜7.5に調製した後に、Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20(分画分子量UF30K、Sartorius社,4〜6℃下)にてPBSへのバッファー置換を行うとともに濃縮を行い、抗体濃度を0.2mg/mL以上に調製した。最後にMinisart−Plus filter(Sartorius社)でろ過し、精製サンプルとした。
ラット抗ヒトOrai1モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養上清から精製した。
まず、R118およびR198産生ハイブリドーマをClonaCell−HY Selection Medium Eで十分量まで増殖させた後、Ultra Low IgG FBS(Life Technologies社)を20%添加したHybridoma SFM(Life Technologies社)に培地交換し、5日間培養した。本培養上清を回収し0.45μmのフィルターを通して滅菌した。
抗体は、上記のハイブリドーマ上清からProteinGアフィニティークロマトグラフィー(4〜6℃下)1段階工程で精製した。ProteinGアフィニティークロマトグラフィー精製後のバッファー置換工程は4〜6℃下で実施した。最初に、PBSで平衡化したProteinG(GE Healthcare Bioscience社)が充填されたカラムにハイブリドーマの培養上清をアプライした。培養上清液がカラムに全て入ったのち、カラム容量2倍以上のPBSでカラムを洗浄した。次に0.1 Mグリシン/塩酸水溶液(pH2.7)で溶出し、抗体の含まれる画分を集めた。集めた画分に1M Tris−HCl(pH9.0)を加えてpH7.0〜7.5に調製した後に、Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20(分画分子量UF30K、Sartorius社,4〜6℃下)にてPBSへのバッファー置換を行うとともに濃縮を行い、抗体濃度を0.2mg/mL以上に調製した。最後にMinisart−Plus filter(Sartorius社)でろ過し、精製サンプルとした。
[実施例2]ラット抗ヒトOrai1抗体のin vitro評価
2)−1 フローサイトメトリーによるラット抗ヒトOrai1抗体の結合能評価
Orai1に対する結合特異性を評価するため、1)−4−1で示す方法により作製したpcDNA3.1−DEST導入HEK293T細胞懸濁液あるいはpcDNA3.1−hOrai1導入HEK293T細胞懸濁液を遠心し、上清を除去した後、それぞれに対し1)−6で作製したラット抗ヒトOrai1モノクローナル抗体であるR118、R198あるいはラットIgGコントロール抗体(Beckman Coulter社)を加えて懸濁し、4℃で30分静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、5% FBS含有PBSで320倍に希釈したAnti−Rat IgG FITC conjugateを加えて懸濁し、4℃で30分静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、1μg/mL Propidium iodide(Life Technologies社)を含む5% FBS含有PBSに再懸濁し、フローサイトメーター(FC500)で検出を行った。データ解析はFlowjoで行った。Propidium iodide陽性の死細胞をゲートで除外した後、生細胞のFITC蛍光強度のヒストグラムを作成し、平均蛍光強度(MFI)を算出した。R118およびR198は、pcDNA3.1−DEST導入HEK293T細胞には結合せず、図1に示すとおりにpcDNA3.1−hOrai1導入HEK293T細胞にのみ濃度依存的に結合したことから、特異的にヒトOrai1に結合することが示された。一方、ラットIgGコントロール抗体では結合は観察されなかった。
2)−1 フローサイトメトリーによるラット抗ヒトOrai1抗体の結合能評価
Orai1に対する結合特異性を評価するため、1)−4−1で示す方法により作製したpcDNA3.1−DEST導入HEK293T細胞懸濁液あるいはpcDNA3.1−hOrai1導入HEK293T細胞懸濁液を遠心し、上清を除去した後、それぞれに対し1)−6で作製したラット抗ヒトOrai1モノクローナル抗体であるR118、R198あるいはラットIgGコントロール抗体(Beckman Coulter社)を加えて懸濁し、4℃で30分静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、5% FBS含有PBSで320倍に希釈したAnti−Rat IgG FITC conjugateを加えて懸濁し、4℃で30分静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、1μg/mL Propidium iodide(Life Technologies社)を含む5% FBS含有PBSに再懸濁し、フローサイトメーター(FC500)で検出を行った。データ解析はFlowjoで行った。Propidium iodide陽性の死細胞をゲートで除外した後、生細胞のFITC蛍光強度のヒストグラムを作成し、平均蛍光強度(MFI)を算出した。R118およびR198は、pcDNA3.1−DEST導入HEK293T細胞には結合せず、図1に示すとおりにpcDNA3.1−hOrai1導入HEK293T細胞にのみ濃度依存的に結合したことから、特異的にヒトOrai1に結合することが示された。一方、ラットIgGコントロール抗体では結合は観察されなかった。
2)−2 ラット抗ヒトOrai1抗体のT細胞活性化抑制作用
ヒトT細胞株であるJurkat細胞を、10% FBS、100U/mL Penicillinおよび100μg/mL Streptomycin(Life Technologies社)を含むRPMI1640(Life Technologies社)で1.5x106cells/mLの濃度に調製し、96−wells細胞培養プレートに80μLずつ播種し、ラット抗ヒトOrai1モノクローナル抗体であるR118、R198、あるいはラットIgG コントロール抗体を10μL/well添加して37℃、5% CO2下で60分間前処置した。その後、100ng/mL PMA(SIGMA社)および1μg/mL A23187(SIGMA社)を10μL/well添加し(最終濃度10ng/mL PMAおよび100ng/mL A23187)、よく攪拌した後、約16時間37℃、5% CO2下で培養した。プレートをよく攪拌した後、600gにて3分間遠心し、上清に含まれるインターロイキン−2(IL−2)濃度をELISA法(R&D社)で測定した 。図2は取得したラット抗ヒトOrai1モノクローナル抗体がPMAおよびA23187処理されたJurkat細胞からのIL−2の放出を添加濃度依存的に抑制することを示す。R118およびR198はJurkat細胞からのIL−2の放出を添加濃度依存的に阻害した。一方、ラットIgGコントロール抗体では阻害は観察されなかった。
ヒトT細胞株であるJurkat細胞を、10% FBS、100U/mL Penicillinおよび100μg/mL Streptomycin(Life Technologies社)を含むRPMI1640(Life Technologies社)で1.5x106cells/mLの濃度に調製し、96−wells細胞培養プレートに80μLずつ播種し、ラット抗ヒトOrai1モノクローナル抗体であるR118、R198、あるいはラットIgG コントロール抗体を10μL/well添加して37℃、5% CO2下で60分間前処置した。その後、100ng/mL PMA(SIGMA社)および1μg/mL A23187(SIGMA社)を10μL/well添加し(最終濃度10ng/mL PMAおよび100ng/mL A23187)、よく攪拌した後、約16時間37℃、5% CO2下で培養した。プレートをよく攪拌した後、600gにて3分間遠心し、上清に含まれるインターロイキン−2(IL−2)濃度をELISA法(R&D社)で測定した 。図2は取得したラット抗ヒトOrai1モノクローナル抗体がPMAおよびA23187処理されたJurkat細胞からのIL−2の放出を添加濃度依存的に抑制することを示す。R118およびR198はJurkat細胞からのIL−2の放出を添加濃度依存的に阻害した。一方、ラットIgGコントロール抗体では阻害は観察されなかった。
[実施例3]ラット抗ヒトOrai1抗体の可変領域をコードするcDNAのヌクレオチド配列の決定
3)−1 cDNA合成
R118およびR198の各抗体産生ハイブリドーマの細胞溶解液(50mM Tris−HCl(pH7.5)、250mM LiCl、5mM EDTA(pH8)、0.5%ドデシル硫酸Li(LiDS)、2.5mM dithiothreitol(DTT))を、オリゴdT25が結合した磁気ビーズ(Dynabeads mRNA DIRECT Kit、Invitrogen社)と混合し、mRNAを磁気ビーズに結合させた。次に磁気ビーズをmRNA洗浄溶液A(10mM Tris−HCl(pH7.5)、0.15M LiCl、1mM EDTA、0.1% LiDS、0.1% TritonX−100)とcDNA合成用溶液(50mM Tris−HCl(pH8.3)、75mM KCl、3mM MgCl2、5mM DTT、0.5mM dNTP、0.2% TritonX−100、1.2unit RNase inhibitor(Life Technologies社)で1回ずつ洗浄した後、12unit SuperScriptIII Reverse Transcriptase(Life Technologies社)を加えたcDNA合成用溶液でcDNA合成を行った。続いて3’テーリング反応溶液(50mM リン酸カリウム、4mM MgCl2、0.5mM dGTP、0.2% TritonX−100、1.2unit RNase inhibitor(Life Technologies社))で洗浄した後、48unit Terminal Transferase, recombinant(Roche社)を加えた反応溶液で3’テーリング反応を行った。
3)−1 cDNA合成
R118およびR198の各抗体産生ハイブリドーマの細胞溶解液(50mM Tris−HCl(pH7.5)、250mM LiCl、5mM EDTA(pH8)、0.5%ドデシル硫酸Li(LiDS)、2.5mM dithiothreitol(DTT))を、オリゴdT25が結合した磁気ビーズ(Dynabeads mRNA DIRECT Kit、Invitrogen社)と混合し、mRNAを磁気ビーズに結合させた。次に磁気ビーズをmRNA洗浄溶液A(10mM Tris−HCl(pH7.5)、0.15M LiCl、1mM EDTA、0.1% LiDS、0.1% TritonX−100)とcDNA合成用溶液(50mM Tris−HCl(pH8.3)、75mM KCl、3mM MgCl2、5mM DTT、0.5mM dNTP、0.2% TritonX−100、1.2unit RNase inhibitor(Life Technologies社)で1回ずつ洗浄した後、12unit SuperScriptIII Reverse Transcriptase(Life Technologies社)を加えたcDNA合成用溶液でcDNA合成を行った。続いて3’テーリング反応溶液(50mM リン酸カリウム、4mM MgCl2、0.5mM dGTP、0.2% TritonX−100、1.2unit RNase inhibitor(Life Technologies社))で洗浄した後、48unit Terminal Transferase, recombinant(Roche社)を加えた反応溶液で3’テーリング反応を行った。
3)−2 ラット免疫グロブリン重、軽鎖可変領域遺伝子断片の増幅および配列決定
磁気ビーズをTE溶液(10mM Tris−HCl(pH7.5)、1mM EDTA、0.1% TritonX−100)にて洗浄後、5’−RACE PCR法を用いてラット免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子の増幅を行った。即ち、磁気ビーズをPCR反応溶液(0.2μM プライマー、0.2mM dNTP、0.25unit PrimeSTAR HS DNA Polymerase(TAKARA社))に移し、94℃30秒−68℃90秒の反応を35サイクル行った。用いたプライマーセットは下記の通り。
PCRプライマーセット(重鎖用)
5’−GCTAGCGCTACCGGACTCAGATCCCCCCCCCCCCCDN−3’(Nhe−polyC−S)(配列番号3)
5’−TCACTGAGCTGGTGAGAGTGTAGAGCCC−3’(rIgγ−AS1)(配列番号4)
5’−TCACCGAGCTGCTGAGGGTGTAGAGCCC−3’(rIgγ−AS2)(配列番号5)
PCRプライマーセット(軽鎖用)
5’−GCTAGCGCTACCGGACTCAGATCCCCCCCCCCCCCDN−3’(Nhe−polyC−S)(配列番号6)(重鎖用と同じ)
5’−TCAGTAACACTGTCCAGGACACCATCTC−3’(rIgκ−AS)(配列番号7)
上記PCR反応により増幅した断片について、塩基配列のシーケンス解析を実施した。重鎖用シーケンスプライマーとして5’−CTGGCTCAGGGAAATAGCC−3’(rIgγ−seq)(配列番号8)、軽鎖用シーケンスプライマーとして5’−TCCAGTTGCTAACTGTTCC−3’(rIgκ−seq)(配列番号9)の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをそれぞれ用いた。
シークエンス解析は遺伝子配列解析装置(「ABI PRISM 3700 DNA Analyzer;Applied Biosystems」あるいは「Applied Biosystems 3730xl Analyzer;Applied Biosystems」)を用いて実施し、シークエンス反応は、Dye Terminator Cycle Sequencing System with AmpliTaq DNA polymerase(Life Technologies社)およびGeneAmp 9700(Applied Biosystems社)を用いた。
決定されたR118およびR198の重、軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を配列表の配列番号10(R118軽鎖)、12(R118重鎖)配列番号14(R198軽鎖)および16(R198重鎖)にそれぞれ示した。また、該可変領域のアミノ酸配列を、配列表の配列番号11(R118軽鎖)、13(R118重鎖)、配列番号15(R198軽鎖)および17(R198重鎖)にそれぞれ示した。配列番号10および11は図14に、配列番号12および13は図15に、配列番号14および15は図16に、配列番号16および17は図17に、それぞれ記載されている。
磁気ビーズをTE溶液(10mM Tris−HCl(pH7.5)、1mM EDTA、0.1% TritonX−100)にて洗浄後、5’−RACE PCR法を用いてラット免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子の増幅を行った。即ち、磁気ビーズをPCR反応溶液(0.2μM プライマー、0.2mM dNTP、0.25unit PrimeSTAR HS DNA Polymerase(TAKARA社))に移し、94℃30秒−68℃90秒の反応を35サイクル行った。用いたプライマーセットは下記の通り。
PCRプライマーセット(重鎖用)
5’−GCTAGCGCTACCGGACTCAGATCCCCCCCCCCCCCDN−3’(Nhe−polyC−S)(配列番号3)
5’−TCACTGAGCTGGTGAGAGTGTAGAGCCC−3’(rIgγ−AS1)(配列番号4)
5’−TCACCGAGCTGCTGAGGGTGTAGAGCCC−3’(rIgγ−AS2)(配列番号5)
PCRプライマーセット(軽鎖用)
5’−GCTAGCGCTACCGGACTCAGATCCCCCCCCCCCCCDN−3’(Nhe−polyC−S)(配列番号6)(重鎖用と同じ)
5’−TCAGTAACACTGTCCAGGACACCATCTC−3’(rIgκ−AS)(配列番号7)
上記PCR反応により増幅した断片について、塩基配列のシーケンス解析を実施した。重鎖用シーケンスプライマーとして5’−CTGGCTCAGGGAAATAGCC−3’(rIgγ−seq)(配列番号8)、軽鎖用シーケンスプライマーとして5’−TCCAGTTGCTAACTGTTCC−3’(rIgκ−seq)(配列番号9)の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをそれぞれ用いた。
シークエンス解析は遺伝子配列解析装置(「ABI PRISM 3700 DNA Analyzer;Applied Biosystems」あるいは「Applied Biosystems 3730xl Analyzer;Applied Biosystems」)を用いて実施し、シークエンス反応は、Dye Terminator Cycle Sequencing System with AmpliTaq DNA polymerase(Life Technologies社)およびGeneAmp 9700(Applied Biosystems社)を用いた。
決定されたR118およびR198の重、軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を配列表の配列番号10(R118軽鎖)、12(R118重鎖)配列番号14(R198軽鎖)および16(R198重鎖)にそれぞれ示した。また、該可変領域のアミノ酸配列を、配列表の配列番号11(R118軽鎖)、13(R118重鎖)、配列番号15(R198軽鎖)および17(R198重鎖)にそれぞれ示した。配列番号10および11は図14に、配列番号12および13は図15に、配列番号14および15は図16に、配列番号16および17は図17に、それぞれ記載されている。
[実施例4]ヒトキメラ化抗ヒトOrai1抗体の作製
4)−1 キメラ化およびヒト化軽鎖発現ベクターpCMA−LKの構築
プラスミドpcDNA3.3−TOPO/LacZ(Life Technologies社)を制限酵素XbaIおよびPmeIで消化して得られる約5.4kbのフラグメントと、配列表の配列番号18に示されるヒトκ鎖分泌シグナルおよびヒトκ鎖定常領域をコードする配列を含むDNA断片をIn−Fusion Advantage PCRクローニングキット(CLONTECH社)を用いて結合して、pcDNA3.3/LKを作製した。
pcDNA3.3/LKを鋳型として、下記プライマーセットでPCRを行い、得られた約3.8kbのフラグメントをリン酸化後セルフライゲーションすることによりCMVプロモーターの下流にシグナル配列、クローニングサイト、およびヒトκ鎖定常領域を持つ、キメラおよびヒト化抗体軽鎖発現ベクターpCMA−LKを構築した。
プライマーセット
5‘−TATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGC−3’(配列番号19:プライマー 3.3−F1)
5‘−GCTATGGCAGGGCCTGCCGCCCCGACGTTG−3’(配列番号20:プライマー 3.3−R1)
4)−1 キメラ化およびヒト化軽鎖発現ベクターpCMA−LKの構築
プラスミドpcDNA3.3−TOPO/LacZ(Life Technologies社)を制限酵素XbaIおよびPmeIで消化して得られる約5.4kbのフラグメントと、配列表の配列番号18に示されるヒトκ鎖分泌シグナルおよびヒトκ鎖定常領域をコードする配列を含むDNA断片をIn−Fusion Advantage PCRクローニングキット(CLONTECH社)を用いて結合して、pcDNA3.3/LKを作製した。
pcDNA3.3/LKを鋳型として、下記プライマーセットでPCRを行い、得られた約3.8kbのフラグメントをリン酸化後セルフライゲーションすることによりCMVプロモーターの下流にシグナル配列、クローニングサイト、およびヒトκ鎖定常領域を持つ、キメラおよびヒト化抗体軽鎖発現ベクターpCMA−LKを構築した。
プライマーセット
5‘−TATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGC−3’(配列番号19:プライマー 3.3−F1)
5‘−GCTATGGCAGGGCCTGCCGCCCCGACGTTG−3’(配列番号20:プライマー 3.3−R1)
4)−2 キメラ化およびヒト化IgG1タイプ重鎖発現ベクターpCMA−G1の構築
pCMA−LKをXbaIおよびPmeIで消化してκ鎖分泌シグナルおよびヒトκ鎖定常領域を取り除いたDNA断片と、配列表の配列番号21に示されるヒト重鎖シグナル配列およびヒトIgG1定常領域のアミノ酸をコードする配列を含むDNA断片をIn−Fusion Advantage PCRクローニングキットを用いて結合して、CMVプロモーターの下流にシグナル配列、クローニングサイト、ヒトIgG1重鎖定常領域をもつキメラおよびヒト化抗体IgG1タイプ重鎖発現ベクターpCMA−G1を構築した。
pCMA−LKをXbaIおよびPmeIで消化してκ鎖分泌シグナルおよびヒトκ鎖定常領域を取り除いたDNA断片と、配列表の配列番号21に示されるヒト重鎖シグナル配列およびヒトIgG1定常領域のアミノ酸をコードする配列を含むDNA断片をIn−Fusion Advantage PCRクローニングキットを用いて結合して、CMVプロモーターの下流にシグナル配列、クローニングサイト、ヒトIgG1重鎖定常領域をもつキメラおよびヒト化抗体IgG1タイプ重鎖発現ベクターpCMA−G1を構築した。
4)−3 ヒトキメラ化抗ヒトOrai1抗体軽鎖発現ベクターの構築
4)−3−1 ヒトキメラ化R118軽鎖cR118_L発現ベクターの構築
実施例3)−2で得られたR118軽鎖の可変領域を含むDNA断片を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。キメラ化およびヒト化抗体軽鎖発現汎用ベクターpCMA−LKを制限酵素XbaIおよびPmeIで切断して得た約3.4kbのDNA断片に、R118軽鎖の可変領域を含むDNA断片を同様の制限酵素で切断して得た約0.7kbのDNA断片をLigation High ver.2(TOYOBO社)を用いて挿入することにより、ヒトキメラ化R118軽鎖(cR118_L)発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−LK/cR118_L」と命名した。ヒトキメラ化cR118軽鎖をコードするヌクレオチド配列および該軽鎖のアミノ酸配列を、配列表の配列番号22および23(図18)にそれぞれ示す。
4)−3−1 ヒトキメラ化R118軽鎖cR118_L発現ベクターの構築
実施例3)−2で得られたR118軽鎖の可変領域を含むDNA断片を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。キメラ化およびヒト化抗体軽鎖発現汎用ベクターpCMA−LKを制限酵素XbaIおよびPmeIで切断して得た約3.4kbのDNA断片に、R118軽鎖の可変領域を含むDNA断片を同様の制限酵素で切断して得た約0.7kbのDNA断片をLigation High ver.2(TOYOBO社)を用いて挿入することにより、ヒトキメラ化R118軽鎖(cR118_L)発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−LK/cR118_L」と命名した。ヒトキメラ化cR118軽鎖をコードするヌクレオチド配列および該軽鎖のアミノ酸配列を、配列表の配列番号22および23(図18)にそれぞれ示す。
4)−3−2 ヒトキメラ化R198軽鎖cR198_L発現ベクターの構築
実施例3)−2で得られたR198軽鎖の可変領域を含むDNA断片を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。キメラ化およびヒト化抗体軽鎖発現汎用ベクターpCMA−LKを制限酵素XbaIおよびPmeIで切断して得た約3.4kbのDNA断片に、R198軽鎖の可変領域を含むDNA断片を同様の制限酵素で切断して得た約0.7kbのDNA断片をLigation High ver.2(TOYOBO社)を用いて挿入することにより、ヒトキメラ化R198軽鎖(cR198_L)発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−LK/cR198_L」と命名した。ヒトキメラ化cR198軽鎖をコードするヌクレオチド配列および該軽鎖のアミノ酸配列を、配列表の配列番号24および25(図19)にそれぞれ示す。
実施例3)−2で得られたR198軽鎖の可変領域を含むDNA断片を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。キメラ化およびヒト化抗体軽鎖発現汎用ベクターpCMA−LKを制限酵素XbaIおよびPmeIで切断して得た約3.4kbのDNA断片に、R198軽鎖の可変領域を含むDNA断片を同様の制限酵素で切断して得た約0.7kbのDNA断片をLigation High ver.2(TOYOBO社)を用いて挿入することにより、ヒトキメラ化R198軽鎖(cR198_L)発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−LK/cR198_L」と命名した。ヒトキメラ化cR198軽鎖をコードするヌクレオチド配列および該軽鎖のアミノ酸配列を、配列表の配列番号24および25(図19)にそれぞれ示す。
4)−4 ヒトキメラ化抗ヒトOrai1抗体重鎖発現ベクターの構築
4)−4−1 ヒトキメラ化R118重鎖cR118_H発現ベクターの構築
実施例3)−2で得られたR118重鎖の可変領域を含むDNA断片を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。キメラ化およびヒト化IgG1タイプ重鎖発現ベクターpCMA−G1を制限酵素BlpIで切断して得た約4.5kbのDNA断片に、R118重鎖の可変領域を含むDNA断片を同様の制限酵素で切断して得た約0.3kbのDNA断片をLigation High ver.2を用いて挿入することにより、ヒトキメラ化R118重鎖(cR118_H)発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−G1/cR118_H」と命名した。ヒトキメラ化cR118重鎖をコードするヌクレオチド配列および該重鎖のアミノ酸配列を、配列表の配列番号26および27(図20)にそれぞれ示す。
4)−4−1 ヒトキメラ化R118重鎖cR118_H発現ベクターの構築
実施例3)−2で得られたR118重鎖の可変領域を含むDNA断片を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。キメラ化およびヒト化IgG1タイプ重鎖発現ベクターpCMA−G1を制限酵素BlpIで切断して得た約4.5kbのDNA断片に、R118重鎖の可変領域を含むDNA断片を同様の制限酵素で切断して得た約0.3kbのDNA断片をLigation High ver.2を用いて挿入することにより、ヒトキメラ化R118重鎖(cR118_H)発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−G1/cR118_H」と命名した。ヒトキメラ化cR118重鎖をコードするヌクレオチド配列および該重鎖のアミノ酸配列を、配列表の配列番号26および27(図20)にそれぞれ示す。
4)−4−2 ヒトキメラ化R198重鎖cR198_H発現ベクターの構築
実施例3)−2で得られたR198重鎖の可変領域を含むDNA断片を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。キメラ化およびヒト化IgG1タイプ重鎖発現ベクターpCMA−G1を制限酵素BlpIで切断して得た約4.5kbのDNA断片に、R198重鎖の可変領域を含むDNA断片を同様の制限酵素で切断して得た約0.3kbのDNA断片をLigation High ver.2を用いて挿入することにより、ヒトキメラ化R198重鎖(cR198_H)発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−G1/cR198_H」と命名した。ヒトキメラ化cR198重鎖をコードするヌクレオチド配列および該重鎖のアミノ酸配列を、配列表の配列番号28および29(図21)にそれぞれ示す。
実施例3)−2で得られたR198重鎖の可変領域を含むDNA断片を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。キメラ化およびヒト化IgG1タイプ重鎖発現ベクターpCMA−G1を制限酵素BlpIで切断して得た約4.5kbのDNA断片に、R198重鎖の可変領域を含むDNA断片を同様の制限酵素で切断して得た約0.3kbのDNA断片をLigation High ver.2を用いて挿入することにより、ヒトキメラ化R198重鎖(cR198_H)発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−G1/cR198_H」と命名した。ヒトキメラ化cR198重鎖をコードするヌクレオチド配列および該重鎖のアミノ酸配列を、配列表の配列番号28および29(図21)にそれぞれ示す。
4)−5 ヒトキメラ化抗ヒトOrai1抗体の調製
4)−5−1 ヒトキメラ化抗ヒトOrai1抗体の生産
FreeStyle 293F細胞(Life Technologies社)はマニュアルに従い、継代、培養を行った。
対数増殖期の107個のFreeStyle 293F細胞(Life Technologies社)を30mLボトル(Thermo Fisher社)に播種し、FreeStyle293 expression medium (Life Technologies社)で希釈して9mLに調製したのちに、37℃、8% CO2インキュベーター内にて135rpmで一時間振とう培養した。Polyethyleneimine(Polyscience #24765)30μgをOpti−Pro SFM(Life Technologies社)500μLに溶解し、次にQIAGEN Plasmid Maxi Kit(QIAGEN社)を用いて調製したヒトキメラ化抗ヒトOrai1抗体重鎖発現ベクター(4μg)およびヒトキメラ化抗ヒトOrai1抗体軽鎖発現ベクター(6μg)を500μLのOpti−Pro SFMに懸濁した。Polyethyleneimine/Opti−Pro SFM混合液500μLに、発現ベクター/Opti−Pro SFM混合液500μLを加え穏やかに攪拌し、さらに5分間放置した後にFreeStyle 293F細胞に添加した。37℃、8% CO2インキュベーターで5−7日間、95rpmで振とう培養して得られた培養上清を0.22μmマイレクスフィルター(Millipore社)でろ過した。
pCMA−G1/cR118_HとpCMA−LK/cR118_Lとの組合せによって取得されたヒトキメラ化R118を「cR118」と命名した。同様にpCMA−G1/cR198_HとpCMA−LK/cR198_Hとの組合せによって取得されたヒトキメラ化R198を「cR198」と命名した。
4)−5−1 ヒトキメラ化抗ヒトOrai1抗体の生産
FreeStyle 293F細胞(Life Technologies社)はマニュアルに従い、継代、培養を行った。
対数増殖期の107個のFreeStyle 293F細胞(Life Technologies社)を30mLボトル(Thermo Fisher社)に播種し、FreeStyle293 expression medium (Life Technologies社)で希釈して9mLに調製したのちに、37℃、8% CO2インキュベーター内にて135rpmで一時間振とう培養した。Polyethyleneimine(Polyscience #24765)30μgをOpti−Pro SFM(Life Technologies社)500μLに溶解し、次にQIAGEN Plasmid Maxi Kit(QIAGEN社)を用いて調製したヒトキメラ化抗ヒトOrai1抗体重鎖発現ベクター(4μg)およびヒトキメラ化抗ヒトOrai1抗体軽鎖発現ベクター(6μg)を500μLのOpti−Pro SFMに懸濁した。Polyethyleneimine/Opti−Pro SFM混合液500μLに、発現ベクター/Opti−Pro SFM混合液500μLを加え穏やかに攪拌し、さらに5分間放置した後にFreeStyle 293F細胞に添加した。37℃、8% CO2インキュベーターで5−7日間、95rpmで振とう培養して得られた培養上清を0.22μmマイレクスフィルター(Millipore社)でろ過した。
pCMA−G1/cR118_HとpCMA−LK/cR118_Lとの組合せによって取得されたヒトキメラ化R118を「cR118」と命名した。同様にpCMA−G1/cR198_HとpCMA−LK/cR198_Hとの組合せによって取得されたヒトキメラ化R198を「cR198」と命名した。
4)−5−2 ヒトキメラ化抗ヒトOrai1抗体の精製
4)−5−1で得られた培養上清を、rProteinAアフィニティークロマトグラフィー一段階工程で精製した。最初に、培養上清10mLを、PBSで平衡化したMabSelectSuRe(GE Healthcare Bioscience社)にアプライした。培養液がカラムに全て入ったのち、PBS 7mLでカラムを洗浄した。次に2M Arginine−HCl pH4.0 5mLで溶出し、その溶出液を、PD−10脱塩カラム(GE Healthcare Bioscience社)でヒスチジンバッファー(25mM Histidine、5% Sorbitor、pH6.0) 4mLに置換した。最後にAmicon Ultracel 30K(分画分子量30K,Millipore社)にて約100μLに濃縮し、精製サンプルとした。
4)−5−1で得られた培養上清を、rProteinAアフィニティークロマトグラフィー一段階工程で精製した。最初に、培養上清10mLを、PBSで平衡化したMabSelectSuRe(GE Healthcare Bioscience社)にアプライした。培養液がカラムに全て入ったのち、PBS 7mLでカラムを洗浄した。次に2M Arginine−HCl pH4.0 5mLで溶出し、その溶出液を、PD−10脱塩カラム(GE Healthcare Bioscience社)でヒスチジンバッファー(25mM Histidine、5% Sorbitor、pH6.0) 4mLに置換した。最後にAmicon Ultracel 30K(分画分子量30K,Millipore社)にて約100μLに濃縮し、精製サンプルとした。
[実施例5]ヒトキメラ化抗ヒトOrai1抗体のin vitro活性
5)−1 フローサイトメトリーによるヒトキメラ化抗ヒトOrai1抗体の抗原結合活性
ヒトOrai1に対する結合特異性を評価するため、1)−4−1で示す方法により作製したpcDNA3.1−DEST導入HEK293T細胞懸濁液あるいはpcDNA3.1−hOrai1導入HEK293T細胞懸濁液を遠心し、上清を除去した後、それぞれに対し4)−5で作製した、ヒトキメラ化抗ヒトOrai1抗体であるcR118、cR198、あるいはヒトIgGコントロール抗体(Jackson Immunoresearch社)を加えて懸濁し、4℃で30分静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、5% FBS含有PBSで100倍に希釈したAnti−human IgG FITC conjugate(Jackson Immunoresearch社)を加えて懸濁し、4℃で30分静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、1μg/mL Propidium iodide(Invitrogen社)を含む5% FBS含有PBSに再懸濁し、フローサイトメーター(FC500)で検出を行った。データ解析はFlowjoで行った。Propidium iodide陽性の死細胞をゲートで除外した後、生細胞のFITC蛍光強度のヒストグラムを作成し、平均蛍光強度(MFI)を算出した。cR118およびcR198は、pcDNA3.1−DEST導入HEK293T細胞には結合せず、図3に示すとおりpcDNA3.1−hOrai1導入HEK293T細胞にのみ濃度依存的に結合したことから、特異的にヒトOrai1に結合することが示された。一方、ヒトIgGコントロール抗体では結合は観察されなかった。
5)−1 フローサイトメトリーによるヒトキメラ化抗ヒトOrai1抗体の抗原結合活性
ヒトOrai1に対する結合特異性を評価するため、1)−4−1で示す方法により作製したpcDNA3.1−DEST導入HEK293T細胞懸濁液あるいはpcDNA3.1−hOrai1導入HEK293T細胞懸濁液を遠心し、上清を除去した後、それぞれに対し4)−5で作製した、ヒトキメラ化抗ヒトOrai1抗体であるcR118、cR198、あるいはヒトIgGコントロール抗体(Jackson Immunoresearch社)を加えて懸濁し、4℃で30分静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、5% FBS含有PBSで100倍に希釈したAnti−human IgG FITC conjugate(Jackson Immunoresearch社)を加えて懸濁し、4℃で30分静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、1μg/mL Propidium iodide(Invitrogen社)を含む5% FBS含有PBSに再懸濁し、フローサイトメーター(FC500)で検出を行った。データ解析はFlowjoで行った。Propidium iodide陽性の死細胞をゲートで除外した後、生細胞のFITC蛍光強度のヒストグラムを作成し、平均蛍光強度(MFI)を算出した。cR118およびcR198は、pcDNA3.1−DEST導入HEK293T細胞には結合せず、図3に示すとおりpcDNA3.1−hOrai1導入HEK293T細胞にのみ濃度依存的に結合したことから、特異的にヒトOrai1に結合することが示された。一方、ヒトIgGコントロール抗体では結合は観察されなかった。
5)−2 ヒトキメラ化抗ヒトOrai1抗体のヒトT細胞株活性化抑制作用
ヒトT細胞株であるJurkat細胞を、10% FBS、100U/mL Penicillinおよび100μg/mL Streptomycinを含むRPMI1640で1.5x106cells/mLの濃度に調製し、96−wells細胞培養プレートに80μLずつ播種し、ヒトキメラ化抗ヒトOrai1抗体であるcR198およびcR118と親抗体のR198、R118、あるいはヒトIgG コントロール抗体を10μL/well添加して37℃、5% CO2下で60分間前処置した。その後、100ng/mL PMAおよび1μg/mL A23187を10μL/well添加し、よく攪拌した後、約16時間37℃、5% CO2下で培養した。プレートをよく攪拌した後、600gにて3分間遠心し、上清に含まれるIL−2濃度をELISA法で測定した 。図4は作製したヒトキメラ化抗ヒトOrai1抗体がPMAおよびA23187処理されたJurkat細胞からのIL−2の放出を添加濃度依存的に抑制することを示す。cR118およびcR198はJurkat細胞からのIL−2の放出を添加濃度依存的に阻害し、その阻害強度は親抗体であるR198と同等であった。一方、ヒトIgGコントロール抗体では阻害は観察されなかった。
ヒトT細胞株であるJurkat細胞を、10% FBS、100U/mL Penicillinおよび100μg/mL Streptomycinを含むRPMI1640で1.5x106cells/mLの濃度に調製し、96−wells細胞培養プレートに80μLずつ播種し、ヒトキメラ化抗ヒトOrai1抗体であるcR198およびcR118と親抗体のR198、R118、あるいはヒトIgG コントロール抗体を10μL/well添加して37℃、5% CO2下で60分間前処置した。その後、100ng/mL PMAおよび1μg/mL A23187を10μL/well添加し、よく攪拌した後、約16時間37℃、5% CO2下で培養した。プレートをよく攪拌した後、600gにて3分間遠心し、上清に含まれるIL−2濃度をELISA法で測定した 。図4は作製したヒトキメラ化抗ヒトOrai1抗体がPMAおよびA23187処理されたJurkat細胞からのIL−2の放出を添加濃度依存的に抑制することを示す。cR118およびcR198はJurkat細胞からのIL−2の放出を添加濃度依存的に阻害し、その阻害強度は親抗体であるR198と同等であった。一方、ヒトIgGコントロール抗体では阻害は観察されなかった。
[実施例6]ヒトキメラ化抗ヒトOrai1抗体cR198のヒト化バージョンhR198の設計
6)−1 R198の可変領域の分子モデリング
cR198の可変領域の分子モデリングは、相同性モデリングとして一般的に公知の方法(Methods in Enzymology,203,121−153,(1991))によって実行された。Protein Data Bank(Nuc.Acid Res.28,235−242(2000))に登録されるヒト免疫グロブリンの可変領域の1次配列(X線結晶構造から誘導される三次元構造が入手可能である)を、上で決定されたR198の可変領域と比較した。結果として、1AJ7が、cR198の軽鎖の可変領域に対して最も高い配列相同性を有するとして選択された。また、1XGYが、cR198の重鎖の可変領域に対して最も高い配列相同性を有するとして選択された。フレームワーク領域の三次元構造は、cR198の軽鎖および重鎖に対応する1AJ7および1XGYの座標を組み合わせて、「フレームワークモデル」を得ることによって作製された。cR198のCDRは、Thornton et al.(J.Mol.Biol.,263,800−815,(1996))の分類に従って、CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1およびCDRH2は、それぞれクラスター11A、7A、9A、10A、10Aに割り当てられた。CDRH3は、H3ルール(FEBS letter 399,1−8(1996))を使用して、k(6)−に分類された。次いで、それぞれのCDRについての代表的なコンホメーションがフレームワークモデルに組み込まれた。
最後に、エネルギーの点でcR198の可変領域の可能性のある分子モデルを得るために、不利な原子間接触を除くためのエネルギー計算を行った。上記手順を、市販の蛋白質立体構造予測プログラムPrimeおよび配座探索プログラムMacroModel(Schrodinger,LLC)を使用して行った。
6)−1 R198の可変領域の分子モデリング
cR198の可変領域の分子モデリングは、相同性モデリングとして一般的に公知の方法(Methods in Enzymology,203,121−153,(1991))によって実行された。Protein Data Bank(Nuc.Acid Res.28,235−242(2000))に登録されるヒト免疫グロブリンの可変領域の1次配列(X線結晶構造から誘導される三次元構造が入手可能である)を、上で決定されたR198の可変領域と比較した。結果として、1AJ7が、cR198の軽鎖の可変領域に対して最も高い配列相同性を有するとして選択された。また、1XGYが、cR198の重鎖の可変領域に対して最も高い配列相同性を有するとして選択された。フレームワーク領域の三次元構造は、cR198の軽鎖および重鎖に対応する1AJ7および1XGYの座標を組み合わせて、「フレームワークモデル」を得ることによって作製された。cR198のCDRは、Thornton et al.(J.Mol.Biol.,263,800−815,(1996))の分類に従って、CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1およびCDRH2は、それぞれクラスター11A、7A、9A、10A、10Aに割り当てられた。CDRH3は、H3ルール(FEBS letter 399,1−8(1996))を使用して、k(6)−に分類された。次いで、それぞれのCDRについての代表的なコンホメーションがフレームワークモデルに組み込まれた。
最後に、エネルギーの点でcR198の可変領域の可能性のある分子モデルを得るために、不利な原子間接触を除くためのエネルギー計算を行った。上記手順を、市販の蛋白質立体構造予測プログラムPrimeおよび配座探索プログラムMacroModel(Schrodinger,LLC)を使用して行った。
6)−2 ヒト化R198に対するアミノ酸配列の設計
ヒト化R198抗体の構築を、CDRグラフティング(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029−10033(1989))として一般的に公知の方法によって行った。アクセプター抗体は、フレームワーク領域内のアミノ酸相同性に基づいて選択された。
cR198のフレームワーク領域の配列を、抗体のアミノ酸配列のKabatデータベース(Nuc.Acid Res.29,205−206(2001))の全てのヒトフレームワークと比較し、結果として、1C10’CL抗体がフレームワーク領域についての71%の配列相同性に起因して、アクセプターとして選択された。1C10’CLについてのフレームワーク領域のアミノ酸残基を、cR198についてのアミノ酸残基と整列させ、異なるアミノ酸が使用される位置を同定した。これらの残基の位置は、上で構築されたcR198の三次元モデルを使用して分析され、そしてアクセプター上にグラフティングされるべきドナー残基が、Queen et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029−10033(1989))によって与えられる基準によって選択された。
選択されたいくつかのドナー残基をアクセプター抗体に移入することによって、ヒト化R198配列を以下の実施例に記載されるように構築した。
また、cR198の各CDR、FR中の1乃至5個のアミノ酸残基をcR118のアミノ酸残基に置換したCDR改変ヒト化R198配列についても以下の実施例に記載されるように構築した。
ヒト化R198抗体の構築を、CDRグラフティング(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029−10033(1989))として一般的に公知の方法によって行った。アクセプター抗体は、フレームワーク領域内のアミノ酸相同性に基づいて選択された。
cR198のフレームワーク領域の配列を、抗体のアミノ酸配列のKabatデータベース(Nuc.Acid Res.29,205−206(2001))の全てのヒトフレームワークと比較し、結果として、1C10’CL抗体がフレームワーク領域についての71%の配列相同性に起因して、アクセプターとして選択された。1C10’CLについてのフレームワーク領域のアミノ酸残基を、cR198についてのアミノ酸残基と整列させ、異なるアミノ酸が使用される位置を同定した。これらの残基の位置は、上で構築されたcR198の三次元モデルを使用して分析され、そしてアクセプター上にグラフティングされるべきドナー残基が、Queen et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029−10033(1989))によって与えられる基準によって選択された。
選択されたいくつかのドナー残基をアクセプター抗体に移入することによって、ヒト化R198配列を以下の実施例に記載されるように構築した。
また、cR198の各CDR、FR中の1乃至5個のアミノ酸残基をcR118のアミノ酸残基に置換したCDR改変ヒト化R198配列についても以下の実施例に記載されるように構築した。
6)−3 ヒト化R198軽鎖hR198_Lの設計
6)−3−1 hR198_L1タイプ軽鎖:
配列表の配列番号25に示されるcR198軽鎖のアミノ酸番号30番目のトレオニン残基をセリン残基に、32番目のプロリン残基をセリン残基に、35番目のロイシン残基をバリン残基に、37番目のグルタミン酸残基をアスパラギン酸残基に、42番目のセリン残基をトレオニン残基に、61番目のアスパラギン酸残基をグリシン残基に、62番目のグリシン残基をリシン残基に、63番目のセリン残基をアラニン残基に、64番目のバリン残基をプロリン残基に、92番目のセリン残基をトレオニン残基に、94番目のセリン残基をトレオニン残基に、96番目のトレオニン残基をセリン残基に、99番目のグルタミン酸残基をグルタミン残基に、100番目のセリン残基をプロリン残基に、120番目のトレオニン残基をグルタミン残基に、124番目のロイシン残基をバリン残基に、126番目のロイシン残基をイソロイシン残基に、127番目のアルギニン残基をリシン残基に、129番目のアラニン残基をトレオニン残基に置き換えることを伴い設計されたヒト化R198軽鎖を「hR198_L1タイプ軽鎖」と命名した。
hR198_L1タイプ軽鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号30であり、シグナル配列が切除された成熟軽鎖をコードするのはヌクレオチド番号61乃至702であり、可変領域をコードするのはヌクレオチド番号61乃至378である。また、hR198_L1タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号31であり、シグナル配列が切除された成熟軽鎖はそのアミノ酸番号21乃至234からなり、可変領域はそのアミノ酸番号21乃至126からなる。さらに、配列番号30および31の配列は、それぞれ図22にも記載されている。各CDR配列および対応する配列番号は図38に示されている。
6)−3−1 hR198_L1タイプ軽鎖:
配列表の配列番号25に示されるcR198軽鎖のアミノ酸番号30番目のトレオニン残基をセリン残基に、32番目のプロリン残基をセリン残基に、35番目のロイシン残基をバリン残基に、37番目のグルタミン酸残基をアスパラギン酸残基に、42番目のセリン残基をトレオニン残基に、61番目のアスパラギン酸残基をグリシン残基に、62番目のグリシン残基をリシン残基に、63番目のセリン残基をアラニン残基に、64番目のバリン残基をプロリン残基に、92番目のセリン残基をトレオニン残基に、94番目のセリン残基をトレオニン残基に、96番目のトレオニン残基をセリン残基に、99番目のグルタミン酸残基をグルタミン残基に、100番目のセリン残基をプロリン残基に、120番目のトレオニン残基をグルタミン残基に、124番目のロイシン残基をバリン残基に、126番目のロイシン残基をイソロイシン残基に、127番目のアルギニン残基をリシン残基に、129番目のアラニン残基をトレオニン残基に置き換えることを伴い設計されたヒト化R198軽鎖を「hR198_L1タイプ軽鎖」と命名した。
hR198_L1タイプ軽鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号30であり、シグナル配列が切除された成熟軽鎖をコードするのはヌクレオチド番号61乃至702であり、可変領域をコードするのはヌクレオチド番号61乃至378である。また、hR198_L1タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号31であり、シグナル配列が切除された成熟軽鎖はそのアミノ酸番号21乃至234からなり、可変領域はそのアミノ酸番号21乃至126からなる。さらに、配列番号30および31の配列は、それぞれ図22にも記載されている。各CDR配列および対応する配列番号は図38に示されている。
6)−3−2 hR198_L2タイプ軽鎖:
配列表の配列番号25に示されるcR198軽鎖のアミノ酸番号アミノ酸番号30番目のトレオニン残基をセリン残基に、32番目のプロリン残基をセリン残基に、35番目のロイシン残基をバリン残基に、37番目のグルタミン酸残基をアスパラギン酸残基に、42番目のセリン残基をトレオニン残基に、61番目のアスパラギン酸残基をグリシン残基に、62番目のグリシン残基をリシン残基に、63番目のセリン残基をアラニン残基に、92番目のセリン残基をトレオニン残基に、94番目のセリン残基をトレオニン残基に、96番目のトレオニン残基をセリン残基に、99番目のグルタミン酸残基をグルタミン残基に、100番目のセリン残基をプロリン残基に、120番目のトレオニン残基をグルタミン残基に、124番目のロイシン残基をバリン残基に、126番目のロイシン残基をイソロイシン残基に、127番目のアルギニン残基をリシン残基に、129番目のアラニン残基をトレオニン残基に置き換えることを伴い設計されたヒト化R198軽鎖を「hR198_L2タイプ軽鎖」と命名した。
hR198_L2タイプ軽鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号32であり、シグナル配列が切除された成熟軽鎖をコードするのはヌクレオチド番号61乃至702であり、可変領域をコードするのはヌクレオチド番号61乃至378である。また、hR198_L2タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号33であり、シグナル配列が切除された成熟軽鎖はそのアミノ酸番号21乃至234からなり、可変領域はそのアミノ酸番号21乃至126からなる。さらに、配列番号32および33の配列は、それぞれ図23にも記載されている。各CDR配列および対応する配列番号は図38に示されている。
配列表の配列番号25に示されるcR198軽鎖のアミノ酸番号アミノ酸番号30番目のトレオニン残基をセリン残基に、32番目のプロリン残基をセリン残基に、35番目のロイシン残基をバリン残基に、37番目のグルタミン酸残基をアスパラギン酸残基に、42番目のセリン残基をトレオニン残基に、61番目のアスパラギン酸残基をグリシン残基に、62番目のグリシン残基をリシン残基に、63番目のセリン残基をアラニン残基に、92番目のセリン残基をトレオニン残基に、94番目のセリン残基をトレオニン残基に、96番目のトレオニン残基をセリン残基に、99番目のグルタミン酸残基をグルタミン残基に、100番目のセリン残基をプロリン残基に、120番目のトレオニン残基をグルタミン残基に、124番目のロイシン残基をバリン残基に、126番目のロイシン残基をイソロイシン残基に、127番目のアルギニン残基をリシン残基に、129番目のアラニン残基をトレオニン残基に置き換えることを伴い設計されたヒト化R198軽鎖を「hR198_L2タイプ軽鎖」と命名した。
hR198_L2タイプ軽鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号32であり、シグナル配列が切除された成熟軽鎖をコードするのはヌクレオチド番号61乃至702であり、可変領域をコードするのはヌクレオチド番号61乃至378である。また、hR198_L2タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号33であり、シグナル配列が切除された成熟軽鎖はそのアミノ酸番号21乃至234からなり、可変領域はそのアミノ酸番号21乃至126からなる。さらに、配列番号32および33の配列は、それぞれ図23にも記載されている。各CDR配列および対応する配列番号は図38に示されている。
6)−3−3 hR198_L3タイプ軽鎖:
配列表の配列番号25に示されるcR198軽鎖のアミノ酸番号アミノ酸番号30番目のトレオニン残基をセリン残基に、32番目のプロリン残基をセリン残基に、35番目のロイシン残基をバリン残基に、37番目のグルタミン酸残基をアスパラギン酸残基に、42番目のセリン残基をトレオニン残基に、61番目のアスパラギン酸残基をグリシン残基に、62番目のグリシン残基をリシン残基に、63番目のセリン残基をアラニン残基に、64番目のバリン残基をプロリン残基に、92番目のセリン残基をトレオニン残基に、94番目のセリン残基をトレオニン残基に、96番目のトレオニン残基をセリン残基に、99番目のグルタミン酸残基をグルタミン残基に、100番目のセリン残基をプロリン残基に、114番目のチロシン残基をフェニルアラニン残基に、120番目のトレオニン残基をグルタミン残基に、124番目のロイシン残基をバリン残基に、126番目のロイシン残基をイソロイシン残基に、127番目のアルギニン残基をリシン残基に、129番目のアラニン残基をトレオニン残基に置き換えることを伴い設計されたヒト化R198軽鎖を「hR198_L3タイプ軽鎖」と命名した。
hR198_L3タイプ軽鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号34であり、シグナル配列が切除された成熟軽鎖をコードするのはヌクレオチド番号61乃至702であり、可変領域をコードするのはヌクレオチド番号61乃至378である。また、hR198_L3タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号35であり、シグナル配列が切除された成熟軽鎖はそのアミノ酸番号21乃至234からなり、可変領域はそのアミノ酸番号21乃至126からなる。さらに、配列番号34および35の配列は、それぞれ図24にも記載されている。各CDR配列および対応する配列番号は図38に示されている。
配列表の配列番号25に示されるcR198軽鎖のアミノ酸番号アミノ酸番号30番目のトレオニン残基をセリン残基に、32番目のプロリン残基をセリン残基に、35番目のロイシン残基をバリン残基に、37番目のグルタミン酸残基をアスパラギン酸残基に、42番目のセリン残基をトレオニン残基に、61番目のアスパラギン酸残基をグリシン残基に、62番目のグリシン残基をリシン残基に、63番目のセリン残基をアラニン残基に、64番目のバリン残基をプロリン残基に、92番目のセリン残基をトレオニン残基に、94番目のセリン残基をトレオニン残基に、96番目のトレオニン残基をセリン残基に、99番目のグルタミン酸残基をグルタミン残基に、100番目のセリン残基をプロリン残基に、114番目のチロシン残基をフェニルアラニン残基に、120番目のトレオニン残基をグルタミン残基に、124番目のロイシン残基をバリン残基に、126番目のロイシン残基をイソロイシン残基に、127番目のアルギニン残基をリシン残基に、129番目のアラニン残基をトレオニン残基に置き換えることを伴い設計されたヒト化R198軽鎖を「hR198_L3タイプ軽鎖」と命名した。
hR198_L3タイプ軽鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号34であり、シグナル配列が切除された成熟軽鎖をコードするのはヌクレオチド番号61乃至702であり、可変領域をコードするのはヌクレオチド番号61乃至378である。また、hR198_L3タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号35であり、シグナル配列が切除された成熟軽鎖はそのアミノ酸番号21乃至234からなり、可変領域はそのアミノ酸番号21乃至126からなる。さらに、配列番号34および35の配列は、それぞれ図24にも記載されている。各CDR配列および対応する配列番号は図38に示されている。
6)−3−4 hR198_L4タイプ軽鎖:
配列表の配列番号25に示されるcR198軽鎖のアミノ酸番号アミノ酸番号30番目のトレオニン残基をセリン残基に、32番目のプロリン残基をセリン残基に、35番目のロイシン残基をバリン残基に、37番目のグルタミン酸残基をアスパラギン酸残基に、42番目のセリン残基をトレオニン残基に、61番目のアスパラギン酸残基をグリシン残基に、62番目のグリシン残基をリシン残基に、63番目のセリン残基をアラニン残基に、92番目のセリン残基をトレオニン残基に、94番目のセリン残基をトレオニン残基に、96番目のトレオニン残基をセリン残基に、99番目のグルタミン酸残基をグルタミン残基に、100番目のセリン残基をプロリン残基に、114番目のチロシン残基をフェニルアラニン残基に、120番目のトレオニン残基をグルタミン残基に、124番目のロイシン残基をバリン残基に、126番目のロイシン残基をイソロイシン残基に、127番目のアルギニン残基をリシン残基に、129番目のアラニン残基をトレオニン残基に置き換えることを伴い設計されたヒト化R198軽鎖を「hR198_L4タイプ軽鎖」と命名した。
hR198_L4タイプ軽鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号36であり、シグナル配列が切除された成熟軽鎖をコードするのはヌクレオチド番号61乃至702であり、可変領域をコードするのはヌクレオチド番号61乃至378である。また、hR198_L4タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号37であり、シグナル配列が切除された成熟軽鎖はそのアミノ酸番号21乃至234からなり、可変領域はそのアミノ酸番号21乃至126からなる。さらに、配列番号36および37の配列は、それぞれ図25にも記載されている。各CDR配列および対応する配列番号は図38に示されている。
配列表の配列番号25に示されるcR198軽鎖のアミノ酸番号アミノ酸番号30番目のトレオニン残基をセリン残基に、32番目のプロリン残基をセリン残基に、35番目のロイシン残基をバリン残基に、37番目のグルタミン酸残基をアスパラギン酸残基に、42番目のセリン残基をトレオニン残基に、61番目のアスパラギン酸残基をグリシン残基に、62番目のグリシン残基をリシン残基に、63番目のセリン残基をアラニン残基に、92番目のセリン残基をトレオニン残基に、94番目のセリン残基をトレオニン残基に、96番目のトレオニン残基をセリン残基に、99番目のグルタミン酸残基をグルタミン残基に、100番目のセリン残基をプロリン残基に、114番目のチロシン残基をフェニルアラニン残基に、120番目のトレオニン残基をグルタミン残基に、124番目のロイシン残基をバリン残基に、126番目のロイシン残基をイソロイシン残基に、127番目のアルギニン残基をリシン残基に、129番目のアラニン残基をトレオニン残基に置き換えることを伴い設計されたヒト化R198軽鎖を「hR198_L4タイプ軽鎖」と命名した。
hR198_L4タイプ軽鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号36であり、シグナル配列が切除された成熟軽鎖をコードするのはヌクレオチド番号61乃至702であり、可変領域をコードするのはヌクレオチド番号61乃至378である。また、hR198_L4タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号37であり、シグナル配列が切除された成熟軽鎖はそのアミノ酸番号21乃至234からなり、可変領域はそのアミノ酸番号21乃至126からなる。さらに、配列番号36および37の配列は、それぞれ図25にも記載されている。各CDR配列および対応する配列番号は図38に示されている。
6)−4 ヒト化R198重鎖hR198_Hの設計
6)−4−1 hR198_H1タイプ重鎖:
配列表の配列番号29に示されるcR198重鎖のアミノ酸番号24番目のグルタミン残基をバリン残基に、30番目のロイシン残基をバリン残基に、31番目のアラニン残基をリシン残基に、35番目のセリン残基をアラニン残基に、37番目のメチオニン残基をバリン残基に、39番目のイソロイシン残基をバリン残基に、56番目のイソロイシン残基をバリン残基に、57番目のリシン残基をアルギニン残基に、59番目のトレオニン残基をアラニン残基に、60番目のトレオニン残基をプロリン残基に、86番目のリシン残基をアルギニン残基に、95番目のセリン残基をトレオニン残基に、99番目のフェニルアラニン残基をチロシン残基に、101番目のグルタミン残基をグルタミン酸残基に、106番目のトレオニン残基をアルギニン残基に、107番目のプロリン残基をセリン残基に、108番目のアスパラギン酸残基をグルタミン酸残基に、110番目のセリン残基をトレオニン残基に、130番目のバリン残基をトレオニン残基に、131番目のメチオニン残基をロイシン残基に置き換えることを伴い設計されたヒト化R198重鎖を「hR198_H1タイプ重鎖」と命名した。
hR198_H1タイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号38であり、シグナル配列が切除された成熟重鎖をコードするのはヌクレオチド番号58乃至1398であり、可変領域をコードするのはヌクレオチド番号58乃至408である。また、hR198_H1タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号39であり、シグナル配列が切除された成熟重鎖はそのアミノ酸番号20乃至466からなり、可変領域はそのアミノ酸番号20乃至136からなる。さらに、配列番号38および39の配列は、それぞれ図26にも記載されている。各CDR配列および対応する配列番号は図38に示されている。
6)−4−1 hR198_H1タイプ重鎖:
配列表の配列番号29に示されるcR198重鎖のアミノ酸番号24番目のグルタミン残基をバリン残基に、30番目のロイシン残基をバリン残基に、31番目のアラニン残基をリシン残基に、35番目のセリン残基をアラニン残基に、37番目のメチオニン残基をバリン残基に、39番目のイソロイシン残基をバリン残基に、56番目のイソロイシン残基をバリン残基に、57番目のリシン残基をアルギニン残基に、59番目のトレオニン残基をアラニン残基に、60番目のトレオニン残基をプロリン残基に、86番目のリシン残基をアルギニン残基に、95番目のセリン残基をトレオニン残基に、99番目のフェニルアラニン残基をチロシン残基に、101番目のグルタミン残基をグルタミン酸残基に、106番目のトレオニン残基をアルギニン残基に、107番目のプロリン残基をセリン残基に、108番目のアスパラギン酸残基をグルタミン酸残基に、110番目のセリン残基をトレオニン残基に、130番目のバリン残基をトレオニン残基に、131番目のメチオニン残基をロイシン残基に置き換えることを伴い設計されたヒト化R198重鎖を「hR198_H1タイプ重鎖」と命名した。
hR198_H1タイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号38であり、シグナル配列が切除された成熟重鎖をコードするのはヌクレオチド番号58乃至1398であり、可変領域をコードするのはヌクレオチド番号58乃至408である。また、hR198_H1タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号39であり、シグナル配列が切除された成熟重鎖はそのアミノ酸番号20乃至466からなり、可変領域はそのアミノ酸番号20乃至136からなる。さらに、配列番号38および39の配列は、それぞれ図26にも記載されている。各CDR配列および対応する配列番号は図38に示されている。
6)−4−2 hR198_H2タイプ重鎖:
配列表の配列番号29に示されるcR198重鎖のアミノ酸番号24番目のグルタミン残基をバリン残基に、30番目のロイシン残基をバリン残基に、31番目のアラニン残基をリシン残基に、35番目のセリン残基をアラニン残基に、37番目のメチオニン残基をバリン残基に、39番目のイソロイシン残基をバリン残基に、57番目のリシン残基をアルギニン残基に、59番目のトレオニン残基をアラニン残基に、60番目のトレオニン残基をプロリン残基に、86番目のリシン残基をアルギニン残基に、95番目のセリン残基をトレオニン残基に、99番目のフェニルアラニン残基をチロシン残基に、101番目のグルタミン残基をグルタミン酸残基に、106番目のトレオニン残基をアルギニン残基に、107番目のプロリン残基をセリン残基に、108番目のアスパラギン酸残基をグルタミン酸残基に、110番目のセリン残基をトレオニン残基に、130番目のバリン残基をトレオニン残基に、131番目のメチオニン残基をロイシン残基に置き換えることを伴い設計されたヒト化R198重鎖を「hR198_H2タイプ重鎖」と命名した。
hR198_H2タイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号40であり、シグナル配列が切除された成熟重鎖をコードするのはヌクレオチド番号58乃至1398であり、可変領域をコードするのはヌクレオチド番号58乃至408である。また、hR198_H2タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号41であり、シグナル配列が切除された成熟重鎖はそのアミノ酸番号20乃至466からなり、可変領域はそのアミノ酸番号20乃至136からなる。さらに、配列番号40および41の配列は、それぞれ図27にも記載されている。各CDR配列および対応する配列番号は図38に示されている。
配列表の配列番号29に示されるcR198重鎖のアミノ酸番号24番目のグルタミン残基をバリン残基に、30番目のロイシン残基をバリン残基に、31番目のアラニン残基をリシン残基に、35番目のセリン残基をアラニン残基に、37番目のメチオニン残基をバリン残基に、39番目のイソロイシン残基をバリン残基に、57番目のリシン残基をアルギニン残基に、59番目のトレオニン残基をアラニン残基に、60番目のトレオニン残基をプロリン残基に、86番目のリシン残基をアルギニン残基に、95番目のセリン残基をトレオニン残基に、99番目のフェニルアラニン残基をチロシン残基に、101番目のグルタミン残基をグルタミン酸残基に、106番目のトレオニン残基をアルギニン残基に、107番目のプロリン残基をセリン残基に、108番目のアスパラギン酸残基をグルタミン酸残基に、110番目のセリン残基をトレオニン残基に、130番目のバリン残基をトレオニン残基に、131番目のメチオニン残基をロイシン残基に置き換えることを伴い設計されたヒト化R198重鎖を「hR198_H2タイプ重鎖」と命名した。
hR198_H2タイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号40であり、シグナル配列が切除された成熟重鎖をコードするのはヌクレオチド番号58乃至1398であり、可変領域をコードするのはヌクレオチド番号58乃至408である。また、hR198_H2タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号41であり、シグナル配列が切除された成熟重鎖はそのアミノ酸番号20乃至466からなり、可変領域はそのアミノ酸番号20乃至136からなる。さらに、配列番号40および41の配列は、それぞれ図27にも記載されている。各CDR配列および対応する配列番号は図38に示されている。
6)−4−3 hR198_H3タイプ重鎖:
配列表の配列番号29に示されるcR198重鎖のアミノ酸番号24番目のグルタミン残基をバリン残基に、30番目のロイシン残基をバリン残基に、31番目のアラニン残基をリシン残基に、35番目のセリン残基をアラニン残基に、37番目のメチオニン残基をバリン残基に、39番目のイソロイシン残基をバリン残基に、50番目のセリン残基をアラニン残基に、56番目のイソロイシン残基をバリン残基に、57番目のリシン残基をアルギニン残基に、59番目のトレオニン残基をアラニン残基に、60番目のトレオニン残基をプロリン残基に、67番目のイソロイシン残基をバリン残基に、70番目のバリン残基をイソロイシン残基に、81番目のグルタミン酸をアラニン残基に、82番目のリシン残基をアルギニン残基に、86番目のリシン残基をアルギニン残基に、95番目のセリン残基をトレオニン残基に、99番目のフェニルアラニン残基をチロシン残基に、101番目のグルタミン残基をグルタミン酸残基に、106番目のトレオニン残基をアルギニン残基に、107番目のプロリン残基をセリン残基に、108番目のアスパラギン酸残基をグルタミン酸残基に、110番目のセリン残基をトレオニン残基に、130番目のバリン残基をトレオニン残基に、131番目のメチオニン残基をロイシン残基に置き換えることを伴い設計されたヒト化R198重鎖を「hR198_H3タイプ重鎖」と命名した。 hR198_H3タイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号42であり、シグナル配列が切除された成熟重鎖をコードするのはヌクレオチド番号58乃至1398であり、可変領域をコードするのはヌクレオチド番号58乃至408である。また、hR198_H3タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号43であり、シグナル配列が切除された成熟重鎖はそのアミノ酸番号20乃至466からなり、可変領域はそのアミノ酸番号20乃至136からなる。さらに、配列番号42および43の配列は、それぞれ図28にも記載されている。各CDR配列および対応する配列番号は図38に示されている。
配列表の配列番号29に示されるcR198重鎖のアミノ酸番号24番目のグルタミン残基をバリン残基に、30番目のロイシン残基をバリン残基に、31番目のアラニン残基をリシン残基に、35番目のセリン残基をアラニン残基に、37番目のメチオニン残基をバリン残基に、39番目のイソロイシン残基をバリン残基に、50番目のセリン残基をアラニン残基に、56番目のイソロイシン残基をバリン残基に、57番目のリシン残基をアルギニン残基に、59番目のトレオニン残基をアラニン残基に、60番目のトレオニン残基をプロリン残基に、67番目のイソロイシン残基をバリン残基に、70番目のバリン残基をイソロイシン残基に、81番目のグルタミン酸をアラニン残基に、82番目のリシン残基をアルギニン残基に、86番目のリシン残基をアルギニン残基に、95番目のセリン残基をトレオニン残基に、99番目のフェニルアラニン残基をチロシン残基に、101番目のグルタミン残基をグルタミン酸残基に、106番目のトレオニン残基をアルギニン残基に、107番目のプロリン残基をセリン残基に、108番目のアスパラギン酸残基をグルタミン酸残基に、110番目のセリン残基をトレオニン残基に、130番目のバリン残基をトレオニン残基に、131番目のメチオニン残基をロイシン残基に置き換えることを伴い設計されたヒト化R198重鎖を「hR198_H3タイプ重鎖」と命名した。 hR198_H3タイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号42であり、シグナル配列が切除された成熟重鎖をコードするのはヌクレオチド番号58乃至1398であり、可変領域をコードするのはヌクレオチド番号58乃至408である。また、hR198_H3タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号43であり、シグナル配列が切除された成熟重鎖はそのアミノ酸番号20乃至466からなり、可変領域はそのアミノ酸番号20乃至136からなる。さらに、配列番号42および43の配列は、それぞれ図28にも記載されている。各CDR配列および対応する配列番号は図38に示されている。
6)−4−4 hR198_H4タイプ重鎖:
配列表の配列番号29に示されるcR198重鎖のアミノ酸番号24番目のグルタミン残基をバリン残基に、30番目のロイシン残基をバリン残基に、31番目のアラニン残基をリシン残基に、35番目のセリン残基をアラニン残基に、37番目のメチオニン残基をバリン残基に、39番目のイソロイシン残基をバリン残基に、50番目のセリン残基をアラニン残基に、57番目のリシン残基をアルギニン残基に、59番目のトレオニン残基をアラニン残基に、60番目のトレオニン残基をプロリン残基に、67番目のイソロイシン残基をバリン残基に、70番目のバリン残基をイソロイシン残基に、81番目のグルタミン酸をアラニン残基に、82番目のリシン残基をアルギニン残基に、86番目のリシン残基をアルギニン残基に、95番目のセリン残基をトレオニン残基に、99番目のフェニルアラニン残基をチロシン残基に、101番目のグルタミン残基をグルタミン酸残基に、106番目のトレオニン残基をアルギニン残基に、107番目のプロリン残基をセリン残基に、108番目のアスパラギン酸残基をグルタミン酸残基に、110番目のセリン残基をトレオニン残基に、130番目のバリン残基をトレオニン残基に、131番目のメチオニン残基をロイシン残基に置き換えることを伴い設計されたヒト化R198重鎖を「hR198_H4タイプ重鎖」と命名した。
hR198_H4タイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号44であり、シグナル配列が切除された成熟重鎖をコードするのはヌクレオチド番号58乃至1398であり、可変領域をコードするのはヌクレオチド番号58乃至408である。また、hR198_H4タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号45であり、シグナル配列が切除された成熟重鎖はそのアミノ酸番号20乃至466からなり、可変領域はそのアミノ酸番号20乃至136からなる。さらに、配列番号44および45の配列は、それぞれ図29にも記載されている。各CDR配列および対応する配列番号は図38に示されている。
配列表の配列番号29に示されるcR198重鎖のアミノ酸番号24番目のグルタミン残基をバリン残基に、30番目のロイシン残基をバリン残基に、31番目のアラニン残基をリシン残基に、35番目のセリン残基をアラニン残基に、37番目のメチオニン残基をバリン残基に、39番目のイソロイシン残基をバリン残基に、50番目のセリン残基をアラニン残基に、57番目のリシン残基をアルギニン残基に、59番目のトレオニン残基をアラニン残基に、60番目のトレオニン残基をプロリン残基に、67番目のイソロイシン残基をバリン残基に、70番目のバリン残基をイソロイシン残基に、81番目のグルタミン酸をアラニン残基に、82番目のリシン残基をアルギニン残基に、86番目のリシン残基をアルギニン残基に、95番目のセリン残基をトレオニン残基に、99番目のフェニルアラニン残基をチロシン残基に、101番目のグルタミン残基をグルタミン酸残基に、106番目のトレオニン残基をアルギニン残基に、107番目のプロリン残基をセリン残基に、108番目のアスパラギン酸残基をグルタミン酸残基に、110番目のセリン残基をトレオニン残基に、130番目のバリン残基をトレオニン残基に、131番目のメチオニン残基をロイシン残基に置き換えることを伴い設計されたヒト化R198重鎖を「hR198_H4タイプ重鎖」と命名した。
hR198_H4タイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号44であり、シグナル配列が切除された成熟重鎖をコードするのはヌクレオチド番号58乃至1398であり、可変領域をコードするのはヌクレオチド番号58乃至408である。また、hR198_H4タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号45であり、シグナル配列が切除された成熟重鎖はそのアミノ酸番号20乃至466からなり、可変領域はそのアミノ酸番号20乃至136からなる。さらに、配列番号44および45の配列は、それぞれ図29にも記載されている。各CDR配列および対応する配列番号は図38に示されている。
[実施例7]ヒト化抗ヒトOrai1抗体の作製
7)−1ヒト化抗ヒトOrai1抗体軽鎖hR198_L発現ベクターの構築
7)−1−1 hR198_L1発現ベクターの構築
配列表の配列番号30に示されるhR198_L1のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号38乃至402に示されるhR198_L1の可変領域をコードする配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。合成したDNA断片を制限酵素AvaIおよびEcoRVで切断し、キメラおよびヒト化抗体軽鎖発現ベクターpCMA−LKを同じ制限酵素で切断した箇所に挿入することによりhR198_L1発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−LK/hR198_L1」と命名した。
7)−1ヒト化抗ヒトOrai1抗体軽鎖hR198_L発現ベクターの構築
7)−1−1 hR198_L1発現ベクターの構築
配列表の配列番号30に示されるhR198_L1のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号38乃至402に示されるhR198_L1の可変領域をコードする配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。合成したDNA断片を制限酵素AvaIおよびEcoRVで切断し、キメラおよびヒト化抗体軽鎖発現ベクターpCMA−LKを同じ制限酵素で切断した箇所に挿入することによりhR198_L1発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−LK/hR198_L1」と命名した。
7)−1−2 hR198_L2発現ベクターの構築
配列表の配列番号32に示されるhR198_L2のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号38乃至402に示されるL2の可変領域をコードする配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。合成したDNA断片をテンプレートとして、KOD−Plus−(TOYOBO社)でL2の可変領域をコードする配列を含むDNA断片を増幅して制限酵素BsiWIで切断し、キメラおよびヒト化抗体軽鎖発現ベクターpCMA−LKを制限酵素BsiWIで切断した箇所に挿入することによりL2発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−LK/L2」と命名した。
配列表の配列番号32に示されるhR198_L2のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号38乃至402に示されるL2の可変領域をコードする配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。合成したDNA断片をテンプレートとして、KOD−Plus−(TOYOBO社)でL2の可変領域をコードする配列を含むDNA断片を増幅して制限酵素BsiWIで切断し、キメラおよびヒト化抗体軽鎖発現ベクターpCMA−LKを制限酵素BsiWIで切断した箇所に挿入することによりL2発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−LK/L2」と命名した。
7)−1−3 hR198_L3およびhR198_L4発現ベクターの構築
配列表の配列番号36に示されるhR198_L4のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号38乃至402に示されるhR198_L4の可変領域をコードする配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。実施例7−1−2)と同様の方法によりhR198_L4発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−LK/hR198_L4」と命名した。
pCMA−G1/hR198_L4をテンプレートにして、QuikChange Site−Directed Mutagenesis Kit(Stratagene社)を用いて、アミノ酸番号64番目のバリン残基をプロリン残基に置き換える変異を導入した。配列表の配列番号34に示されるヌクレオチド配列を含む得られた発現ベクターを「pCMA−G1/hR198_L3」と命名した。
配列表の配列番号36に示されるhR198_L4のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号38乃至402に示されるhR198_L4の可変領域をコードする配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。実施例7−1−2)と同様の方法によりhR198_L4発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−LK/hR198_L4」と命名した。
pCMA−G1/hR198_L4をテンプレートにして、QuikChange Site−Directed Mutagenesis Kit(Stratagene社)を用いて、アミノ酸番号64番目のバリン残基をプロリン残基に置き換える変異を導入した。配列表の配列番号34に示されるヌクレオチド配列を含む得られた発現ベクターを「pCMA−G1/hR198_L3」と命名した。
7)−2 ヒト化抗ヒトOrai1抗体重鎖hR198_H発現ベクターの構築
7)−2−1 hR198_H1およびhR198_H2発現ベクターの構築
抗Orai1抗体重鎖hR198のヒト化候補とした配列表の配列番号111に示されるH0のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号36乃至425に示されるH0の可変領域をコードする配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。合成したDNA断片をテンプレートとして、KOD−Plus−でH0の可変領域をコードする配列を含むDNA断片を増幅し、キメラおよびヒト化抗体IgG1タイプ重鎖発現ベクターpCMA−G1を制限酵素BlpIで切断した箇所にIn−Fusion HD PCRクローニングキット(CLONTECH社)を用いて挿入することによりH0発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−G1/R198_H0」と命名した。H0のアミノ酸配列は、配列番号112に示されている。
次にpCMA−G1/R198_H0をテンプレートにして、KOD −Plus− mutagenesis kit(TOYOBO社)を用いて、アミノ酸番号66番目のトリプトファン残基をチロシン残基に置き換える変異を導入した。配列表の配列番号40に示されるヌクレオチド配列を含む得られた発現ベクターを「pCMA−G1/hR198_H2」と命名した。
次にpCMA−G1/R198_H2をテンプレートにして、QuikChange Site−Directed Mutagenesis Kit(Stratagene社)と下記プライマーセットを用いてアミノ酸番号56番目のイソロイシン残基をバリン残基に置き換える変異を導入した。配列表の配列番号38に示されるヌクレオチド配列を含む得られた発現ベクターを「pCMA−G1/hR198_H1」と命名した。
7)−2−1 hR198_H1およびhR198_H2発現ベクターの構築
抗Orai1抗体重鎖hR198のヒト化候補とした配列表の配列番号111に示されるH0のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号36乃至425に示されるH0の可変領域をコードする配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。合成したDNA断片をテンプレートとして、KOD−Plus−でH0の可変領域をコードする配列を含むDNA断片を増幅し、キメラおよびヒト化抗体IgG1タイプ重鎖発現ベクターpCMA−G1を制限酵素BlpIで切断した箇所にIn−Fusion HD PCRクローニングキット(CLONTECH社)を用いて挿入することによりH0発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−G1/R198_H0」と命名した。H0のアミノ酸配列は、配列番号112に示されている。
次にpCMA−G1/R198_H0をテンプレートにして、KOD −Plus− mutagenesis kit(TOYOBO社)を用いて、アミノ酸番号66番目のトリプトファン残基をチロシン残基に置き換える変異を導入した。配列表の配列番号40に示されるヌクレオチド配列を含む得られた発現ベクターを「pCMA−G1/hR198_H2」と命名した。
次にpCMA−G1/R198_H2をテンプレートにして、QuikChange Site−Directed Mutagenesis Kit(Stratagene社)と下記プライマーセットを用いてアミノ酸番号56番目のイソロイシン残基をバリン残基に置き換える変異を導入した。配列表の配列番号38に示されるヌクレオチド配列を含む得られた発現ベクターを「pCMA−G1/hR198_H1」と命名した。
7)−2−2 hR198_H3およびhR198_H4発現ベクターの構築
抗Orai1抗体重鎖hR198のヒト化候補とした配列表の配列番号113に示されるH5のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号36乃至425に示されるH5の可変領域をコードする配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。実施例7)−2−1と同様の方法でH5発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−G1/hR198_H5」と命名した。H5のアミノ酸配列は、配列番号114に示されている。
次にpCMA−G1/H5をテンプレートにして、KOD −Plus− mutagenesis kitを用いて、アミノ酸番号66番目のトリプトファン残基、67番目のイソロイシン残基をそれぞれチロシン残基、バリン残基に置き換える変異を導入した。配列番号44に示されるヌクレオチド配列を含む得られた発現ベクターを「pCMA−G1/hR198_H4」と命名した。
次にpCMA−G1/hR198_H4をテンプレートにして、実施例7)−2−1と同様の方法でアミノ酸番号56番目のイソロイシン残基をバリン残基に置き換える変異を導入し、配列表の配列番号44に示されるヌクレオチド配列を含む得られた発現ベクターを「pCMA−G1/hR198_H3」と命名した。
抗Orai1抗体重鎖hR198のヒト化候補とした配列表の配列番号113に示されるH5のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号36乃至425に示されるH5の可変領域をコードする配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。実施例7)−2−1と同様の方法でH5発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−G1/hR198_H5」と命名した。H5のアミノ酸配列は、配列番号114に示されている。
次にpCMA−G1/H5をテンプレートにして、KOD −Plus− mutagenesis kitを用いて、アミノ酸番号66番目のトリプトファン残基、67番目のイソロイシン残基をそれぞれチロシン残基、バリン残基に置き換える変異を導入した。配列番号44に示されるヌクレオチド配列を含む得られた発現ベクターを「pCMA−G1/hR198_H4」と命名した。
次にpCMA−G1/hR198_H4をテンプレートにして、実施例7)−2−1と同様の方法でアミノ酸番号56番目のイソロイシン残基をバリン残基に置き換える変異を導入し、配列表の配列番号44に示されるヌクレオチド配列を含む得られた発現ベクターを「pCMA−G1/hR198_H3」と命名した。
7)−3 ヒト化抗ヒトOrai1抗体hR198の調製
4)−5−1と同様の方法によって、ヒト化抗ヒトOrai1抗体重鎖発現ベクターとヒト化抗ヒトOrai1抗体軽鎖発現ベクターをFreeStyle 293F細胞に遺伝子導入し、抗体を含む培養上清を得た。
pCMA−G1/hR198_H1とpCMA−LK/hR198_L1、pCMA−G1/hR198_H2とpCMA−LK/hR198_L2、pCMA−G1/hR198_H3とpCMA−LK/hR198_L3、pCMA−G1/hR198_H4とpCMA−LK/hR198_L4との組合せによって取得されたヒト化抗ヒトOrai1抗体をそれぞれ、「hR198_H1/L1」、「hR198_H2/L2」、「hR198_H3/L3」、「hR198_H4/L4」と命名した。
4)−5−1と同様の方法によって、ヒト化抗ヒトOrai1抗体重鎖発現ベクターとヒト化抗ヒトOrai1抗体軽鎖発現ベクターをFreeStyle 293F細胞に遺伝子導入し、抗体を含む培養上清を得た。
pCMA−G1/hR198_H1とpCMA−LK/hR198_L1、pCMA−G1/hR198_H2とpCMA−LK/hR198_L2、pCMA−G1/hR198_H3とpCMA−LK/hR198_L3、pCMA−G1/hR198_H4とpCMA−LK/hR198_L4との組合せによって取得されたヒト化抗ヒトOrai1抗体をそれぞれ、「hR198_H1/L1」、「hR198_H2/L2」、「hR198_H3/L3」、「hR198_H4/L4」と命名した。
4)−5−2と同様の方法によって、得られた培養上清をrProteinAアフィニティークロマトグラフィーで精製し、精製抗体サンプルを得た。
[実施例8]ヒト化抗ヒトOrai1抗体のin vitro活性
8)−1 フローサイトメトリーによるヒト化抗ヒトOrai1抗体の抗原結合活性
ヒトOrai1に対する結合特異性を評価するため、1)−4−1で示す方法により作製したpcDNA3.1−DEST導入HEK293T細胞懸濁液あるいはpcDNA3.1−hOrai1導入HEK293T細胞懸濁液を遠心し、上清を除去した後、それぞれに対し7)−5で作製したヒト化抗Orai1抗体hR198_H1/L1、hR198_H2/L2、hR198_H3/L3、hR198_H4/L4と、親抗体のcR118、cR198を加えて懸濁し、4℃で30分静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、5% FBS含有PBSで100倍に希釈したAnti−human IgG FITC conjugateを加えて懸濁し、4℃で30分静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、1μg/mL Propidium iodideを含む5% FBS含有PBSに再懸濁し、フローサイトメーター(FC500)で検出を行った。データ解析はFlowjoで行った。Propidium iodide陽性の死細胞をゲートで除外した後、生細胞のFITC蛍光強度のヒストグラムを作成し、平均蛍光強度(MFI)を算出した。ヒト化抗ヒトOrai1抗体hR198_H1/L1、hR198_H2/L2、hR198_H3/L3、hR198_H4/L4は親抗体のcR118、cR198と同様、pcDNA3.1−DEST導入HEK293T細胞には結合せず、図5に示すとおりpcDNA3.1−hOrai1導入HEK293T細胞にのみ濃度依存的に結合したことから、特異的にヒトOrai1に結合することが示された。
8)−1 フローサイトメトリーによるヒト化抗ヒトOrai1抗体の抗原結合活性
ヒトOrai1に対する結合特異性を評価するため、1)−4−1で示す方法により作製したpcDNA3.1−DEST導入HEK293T細胞懸濁液あるいはpcDNA3.1−hOrai1導入HEK293T細胞懸濁液を遠心し、上清を除去した後、それぞれに対し7)−5で作製したヒト化抗Orai1抗体hR198_H1/L1、hR198_H2/L2、hR198_H3/L3、hR198_H4/L4と、親抗体のcR118、cR198を加えて懸濁し、4℃で30分静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、5% FBS含有PBSで100倍に希釈したAnti−human IgG FITC conjugateを加えて懸濁し、4℃で30分静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、1μg/mL Propidium iodideを含む5% FBS含有PBSに再懸濁し、フローサイトメーター(FC500)で検出を行った。データ解析はFlowjoで行った。Propidium iodide陽性の死細胞をゲートで除外した後、生細胞のFITC蛍光強度のヒストグラムを作成し、平均蛍光強度(MFI)を算出した。ヒト化抗ヒトOrai1抗体hR198_H1/L1、hR198_H2/L2、hR198_H3/L3、hR198_H4/L4は親抗体のcR118、cR198と同様、pcDNA3.1−DEST導入HEK293T細胞には結合せず、図5に示すとおりpcDNA3.1−hOrai1導入HEK293T細胞にのみ濃度依存的に結合したことから、特異的にヒトOrai1に結合することが示された。
8)−2 ヒト化抗ヒトOrai1抗体のヒトT細胞株活性化抑制作用
ヒトT細胞株であるJurkat細胞を、10% FBS、100U/mL Penicillinおよび100μg/mL Streptomycinを含むRPMI1640で1.5x106cells/mLの濃度に調製し、96−wells細胞培養プレートに80μLずつ播種し、ヒト化抗ヒトOrai1抗体であるhH1/L1、hH2/L2、hH3/L3、hH4/L4、およびヒトキメラ化抗ヒトOrai1抗体であるcR118およびcR198を10μL/well添加して37℃、5% CO2下で60分間前処置した。その後、100ng/mL PMAおよび1μg/mL A23187を10μL/well添加し、よく攪拌した後、約16時間37℃、5% CO2下で培養した。プレートをよく攪拌した後、600gにて3分間遠心し、上清に含まれるIL−2濃度をELISA法で測定した 。図6はヒト化抗ヒトOrai1抗体がPMAおよびA23187処理されたJurkat細胞からのIL−2の放出を添加濃度依存的に抑制することを示す。ヒト化抗ヒトOrai1抗体はJurkat細胞からのIL−2の放出を添加濃度依存的に阻害し、hH1/L1およびhH2/L2の阻害活性はヒトキメラ化抗ヒトOrai1抗体cR118およびcR198と同等であった。一方hH3/L3およびhH4/L4は、cR118およびcR198よりも低濃度で阻害活性を示した。
ヒトT細胞株であるJurkat細胞を、10% FBS、100U/mL Penicillinおよび100μg/mL Streptomycinを含むRPMI1640で1.5x106cells/mLの濃度に調製し、96−wells細胞培養プレートに80μLずつ播種し、ヒト化抗ヒトOrai1抗体であるhH1/L1、hH2/L2、hH3/L3、hH4/L4、およびヒトキメラ化抗ヒトOrai1抗体であるcR118およびcR198を10μL/well添加して37℃、5% CO2下で60分間前処置した。その後、100ng/mL PMAおよび1μg/mL A23187を10μL/well添加し、よく攪拌した後、約16時間37℃、5% CO2下で培養した。プレートをよく攪拌した後、600gにて3分間遠心し、上清に含まれるIL−2濃度をELISA法で測定した 。図6はヒト化抗ヒトOrai1抗体がPMAおよびA23187処理されたJurkat細胞からのIL−2の放出を添加濃度依存的に抑制することを示す。ヒト化抗ヒトOrai1抗体はJurkat細胞からのIL−2の放出を添加濃度依存的に阻害し、hH1/L1およびhH2/L2の阻害活性はヒトキメラ化抗ヒトOrai1抗体cR118およびcR198と同等であった。一方hH3/L3およびhH4/L4は、cR118およびcR198よりも低濃度で阻害活性を示した。
[実施例9]リボソームディスプレイによる活性増強変異の同定
9)−1 H鎖およびL鎖ライブラリーの作製
ヒト化抗ヒトOrai1抗体hR198_H4/L4を鋳型として、H鎖またはL鎖に変異を導入したライブラリーを構築し、リボソームディスプレイによる活性増強変異の同定に供した。
9)−1 H鎖およびL鎖ライブラリーの作製
ヒト化抗ヒトOrai1抗体hR198_H4/L4を鋳型として、H鎖またはL鎖に変異を導入したライブラリーを構築し、リボソームディスプレイによる活性増強変異の同定に供した。
9)−1−1 H鎖ライブラリーの作製
hR198_H4遺伝子を鋳型にして以下のプライマーセットとrTaq DNA polymerase(TOYOBO社)を用いて80サイクルのPCRを行い、当該遺伝子領域にランダムに変異を導入した。
プライマーセット
5’−ATGCAAGTCCAACTGGTTCAATC−3’ (配列番号46:プライマー Orai1 HF)
5’−TGACGGAGCCAGCGGGAAGAC−3’ (配列番号47:プライマー Orai1 CH FR)
次にランダムに変異を導入したH鎖遺伝子とT7プロモーターを含む5’UTR部位、および5’側にc−Mycを3’側にSecM配列を付加したTolA遺伝子断片を鋳型にして、以下のプライマーセットを用いてオーバーラップPCRを行い、H鎖ライブラリーを調製した。
プライマーセット
5’−CAGGAAACAGCTATGACCATG−3’ (配列番号48:プライマー M13 rev long)
5’−CTCGAGTTATTCATTAGGTGAGGCGTTGAGG−3’ (配列番号49:プライマー SecM Stop R)
hR198_H4遺伝子を鋳型にして以下のプライマーセットとrTaq DNA polymerase(TOYOBO社)を用いて80サイクルのPCRを行い、当該遺伝子領域にランダムに変異を導入した。
プライマーセット
5’−ATGCAAGTCCAACTGGTTCAATC−3’ (配列番号46:プライマー Orai1 HF)
5’−TGACGGAGCCAGCGGGAAGAC−3’ (配列番号47:プライマー Orai1 CH FR)
次にランダムに変異を導入したH鎖遺伝子とT7プロモーターを含む5’UTR部位、および5’側にc−Mycを3’側にSecM配列を付加したTolA遺伝子断片を鋳型にして、以下のプライマーセットを用いてオーバーラップPCRを行い、H鎖ライブラリーを調製した。
プライマーセット
5’−CAGGAAACAGCTATGACCATG−3’ (配列番号48:プライマー M13 rev long)
5’−CTCGAGTTATTCATTAGGTGAGGCGTTGAGG−3’ (配列番号49:プライマー SecM Stop R)
9)−1−2 L鎖ライブラリーの作製
hR198_L4遺伝子を鋳型にして以下のプライマーセットとrTaq DNA polymeraseを用いて80サイクルのPCRを行い、当該遺伝子領域にランダムに変異を導入した。
プライマーセット
5’−ATGGACATTCAACTGACCCAAAGC−3’ (配列番号50:プライマー Orai1 Lc F)
5’−GATAAAAACACTCGGGGCCGCCAC−3’ (配列番号51:プライマー Orai1 CL−FR)
9)−1−1の記載と同様にランダムに変異を導入したL鎖遺伝子と上記2つの遺伝子断片を鋳型にして、オーバーラップPCRを行い、L鎖ライブラリーを調製した。
hR198_L4遺伝子を鋳型にして以下のプライマーセットとrTaq DNA polymeraseを用いて80サイクルのPCRを行い、当該遺伝子領域にランダムに変異を導入した。
プライマーセット
5’−ATGGACATTCAACTGACCCAAAGC−3’ (配列番号50:プライマー Orai1 Lc F)
5’−GATAAAAACACTCGGGGCCGCCAC−3’ (配列番号51:プライマー Orai1 CL−FR)
9)−1−1の記載と同様にランダムに変異を導入したL鎖遺伝子と上記2つの遺伝子断片を鋳型にして、オーバーラップPCRを行い、L鎖ライブラリーを調製した。
9)−1−3 H鎖遺伝子断片の作製
hR198_H4遺伝子を鋳型にして以下のプライマーセットとKOD−Plus−を用いてPCRを行い、H鎖遺伝子領域を増幅した。
プライマーセット
5’−ATGCAAGTCCAACTGGTTCAATC−3’ (配列番号46:プライマー Orai1 HF)
5’−TCATTATTTGTCATCGTCATCTTTATAGTCGAATTCTTCGCCACGATTAAAGGATTTGGTGAC−3’ (配列番号52:プライマー Orai1 HR−FLAG R)
次に当該遺伝子断片とT7プロモーターを含む5’UTR部位鋳型にして以下のプライマーセットを用いてオーバーラップPCRを行い、H鎖遺伝子断片を調製した。
プライマーセット
5’−CAGGAAACAGCTATGACCATG−3’ (配列番号48:プライマー M13 rev long)
5’−TCATTATTTGTCATCGTCATCTTTATAGTCGAATTCTTCGCCACGATTAAAGGATTTGGTGAC−3’ (配列番号52:プライマー Orai1 HR−FLAG R)
hR198_H4遺伝子を鋳型にして以下のプライマーセットとKOD−Plus−を用いてPCRを行い、H鎖遺伝子領域を増幅した。
プライマーセット
5’−ATGCAAGTCCAACTGGTTCAATC−3’ (配列番号46:プライマー Orai1 HF)
5’−TCATTATTTGTCATCGTCATCTTTATAGTCGAATTCTTCGCCACGATTAAAGGATTTGGTGAC−3’ (配列番号52:プライマー Orai1 HR−FLAG R)
次に当該遺伝子断片とT7プロモーターを含む5’UTR部位鋳型にして以下のプライマーセットを用いてオーバーラップPCRを行い、H鎖遺伝子断片を調製した。
プライマーセット
5’−CAGGAAACAGCTATGACCATG−3’ (配列番号48:プライマー M13 rev long)
5’−TCATTATTTGTCATCGTCATCTTTATAGTCGAATTCTTCGCCACGATTAAAGGATTTGGTGAC−3’ (配列番号52:プライマー Orai1 HR−FLAG R)
9)−1−4 L鎖遺伝子断片の作製
hR198_L4遺伝子を鋳型にして以下のプライマーセットとKOD−Plus−を用いてPCRを行い、L鎖遺伝子領域を増幅した。
プライマーセット
5’−ATGGACATTCAACTGACCCAAAGC−3’ (配列番号50:プライマー Orai1 Lc F)
5’−TCATTATTTGTCATCGTCATCTTTATAGTCGAATTCTTCGCCACGATTAAAGGATTTGGTGAC−3’ (配列番号53:プライマー Orai1 CL−FLAG R)
次に9)−1−1の記載と同様にオーバーラップPCRを行い、L鎖遺伝子断片を調製した。
プライマーセット
5’−CAGGAAACAGCTATGACCATG−3’ (配列番号48:プライマー M13 rev long)
5’−TCATTATTTGTCATCGTCATCTTTATAGTCGAATTCTTCGCCACGATTAAAGGATTTGGTGAC−3’ (配列番号53:プライマー Orai1 CL−FLAG R)
hR198_L4遺伝子を鋳型にして以下のプライマーセットとKOD−Plus−を用いてPCRを行い、L鎖遺伝子領域を増幅した。
プライマーセット
5’−ATGGACATTCAACTGACCCAAAGC−3’ (配列番号50:プライマー Orai1 Lc F)
5’−TCATTATTTGTCATCGTCATCTTTATAGTCGAATTCTTCGCCACGATTAAAGGATTTGGTGAC−3’ (配列番号53:プライマー Orai1 CL−FLAG R)
次に9)−1−1の記載と同様にオーバーラップPCRを行い、L鎖遺伝子断片を調製した。
プライマーセット
5’−CAGGAAACAGCTATGACCATG−3’ (配列番号48:プライマー M13 rev long)
5’−TCATTATTTGTCATCGTCATCTTTATAGTCGAATTCTTCGCCACGATTAAAGGATTTGGTGAC−3’ (配列番号53:プライマー Orai1 CL−FLAG R)
9)−1−5 mRNAの調製
実施例9)−1−1乃至9)−1−4にて作製したライブラリーおよび遺伝子断片を鋳型にして、T7 RiboMax Express Large Scale RNA Production System(Promega社)でそれぞれのmRNAを合成した。
実施例9)−1−1乃至9)−1−4にて作製したライブラリーおよび遺伝子断片を鋳型にして、T7 RiboMax Express Large Scale RNA Production System(Promega社)でそれぞれのmRNAを合成した。
9)−2 リボソームディスプレイによるスクリーニング
H鎖ライブラリーとL鎖遺伝子断片を組み合わせてH鎖リボソームディスプレイFabを、L鎖ライブラリーとH鎖遺伝子断片を組み合わせてL鎖リボソームディスプレイFabを調製した。PUREfrex反応液(GeneFrontier社)に20 pmolのH鎖(またはL鎖)ライブラリーmRNAと100 pmolのリボソームを加えて、30℃で45分間保温した。同様にPUREfrex反応液に40pmolのL鎖(またはH鎖)mRNAと200pmolのリボソームを加えて、30℃で45分間インキュベートした。次にH鎖(またはL鎖)ライブラリーおよびL鎖(またはH鎖)の翻訳後の反応液を混ぜ合わせ、30℃でさらに90分間保温することにより、H鎖(またはL鎖)リボソームディスプレイFabを調製し、その後4℃に冷却することで反応を停止した。続いて当該反応液に抗原を加え、4℃で1時間ゆるやかに攪拌することでFabと抗原との結合を行った。なお、抗原としては、1)−1−1で作製したpcDNA3.1−hOrai1を利用して樹立したヒトOrai1恒常発現CHO細胞をホルマリン固定処理したサンプル、もしくは以下に示されるビオチンPEG化ヒトOrai1ループ領域ペプチド(SIGMA社)を用いた。
ビオチンPEG化ヒトOrai1ループ領域ペプチド
Biotin−PEG−SGSGFLPLKKQPGQPRPTSKPPASGAAANVSTSGITPGQAAAIASTTI (配列番号115)
抗原と結合したリボソームディスプレイFabをNonolink Streptavidin magnetic beads (SoluLink社)にて回収した。続いて抗原を50mM Tris−HCl(pH7.4)、150mM NaCl、15mM Mg(OAc)2、0.05% Tween20、1mg/mL yeast RNAおよび50mM Tris−HCl(pH7.4)、150mM NaCl、15mM Mg(OAc)2、0.05% Tween20にて洗浄した。その後抗原に50mM Tris−HCl(pH7.4)、150mM NaCl、15mM Mg(OAc)2、50 mM EDTAを添加し、室温で10分間静置後遠心によってmRNAを含む上清を回収した。回収したmRNAはTranscriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit(Roche社)によってcDNAとした後、下記プライマーセットおよびKOD −Plus−を用いてPCRを行ないDNAとして増幅した。当該DNAを鋳型にしてmRNAを合成し、さらに同様のスクリーニングに供した。当該スクリーニングサイクルを複数回実施することにより、抗原に強く結合する抗体遺伝子を選抜した。
プライマーセット
5’−ATGGACATTCAACTGACCCAAAGC−3’ (配列番号50:プライマー Orai1−LcF)
5’−CAGATCCTCCTCAGAGATCAGCTTCTGCTC−3’ (配列番号54:プライマー Myc−R)
H鎖ライブラリーとL鎖遺伝子断片を組み合わせてH鎖リボソームディスプレイFabを、L鎖ライブラリーとH鎖遺伝子断片を組み合わせてL鎖リボソームディスプレイFabを調製した。PUREfrex反応液(GeneFrontier社)に20 pmolのH鎖(またはL鎖)ライブラリーmRNAと100 pmolのリボソームを加えて、30℃で45分間保温した。同様にPUREfrex反応液に40pmolのL鎖(またはH鎖)mRNAと200pmolのリボソームを加えて、30℃で45分間インキュベートした。次にH鎖(またはL鎖)ライブラリーおよびL鎖(またはH鎖)の翻訳後の反応液を混ぜ合わせ、30℃でさらに90分間保温することにより、H鎖(またはL鎖)リボソームディスプレイFabを調製し、その後4℃に冷却することで反応を停止した。続いて当該反応液に抗原を加え、4℃で1時間ゆるやかに攪拌することでFabと抗原との結合を行った。なお、抗原としては、1)−1−1で作製したpcDNA3.1−hOrai1を利用して樹立したヒトOrai1恒常発現CHO細胞をホルマリン固定処理したサンプル、もしくは以下に示されるビオチンPEG化ヒトOrai1ループ領域ペプチド(SIGMA社)を用いた。
ビオチンPEG化ヒトOrai1ループ領域ペプチド
Biotin−PEG−SGSGFLPLKKQPGQPRPTSKPPASGAAANVSTSGITPGQAAAIASTTI (配列番号115)
抗原と結合したリボソームディスプレイFabをNonolink Streptavidin magnetic beads (SoluLink社)にて回収した。続いて抗原を50mM Tris−HCl(pH7.4)、150mM NaCl、15mM Mg(OAc)2、0.05% Tween20、1mg/mL yeast RNAおよび50mM Tris−HCl(pH7.4)、150mM NaCl、15mM Mg(OAc)2、0.05% Tween20にて洗浄した。その後抗原に50mM Tris−HCl(pH7.4)、150mM NaCl、15mM Mg(OAc)2、50 mM EDTAを添加し、室温で10分間静置後遠心によってmRNAを含む上清を回収した。回収したmRNAはTranscriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit(Roche社)によってcDNAとした後、下記プライマーセットおよびKOD −Plus−を用いてPCRを行ないDNAとして増幅した。当該DNAを鋳型にしてmRNAを合成し、さらに同様のスクリーニングに供した。当該スクリーニングサイクルを複数回実施することにより、抗原に強く結合する抗体遺伝子を選抜した。
プライマーセット
5’−ATGGACATTCAACTGACCCAAAGC−3’ (配列番号50:プライマー Orai1−LcF)
5’−CAGATCCTCCTCAGAGATCAGCTTCTGCTC−3’ (配列番号54:プライマー Myc−R)
9)−3 Fab蛋白質の調製
選抜した遺伝子を大腸菌発現用ベクターにサブクローニングし、ヒトOrai1恒常発現CHO細胞に対する結合性が向上したクローンをCell ELISAにてスクリーニングした。まず選抜後のDNAを制限酵素EcoRVおよびXhoIで切断し、同じ酵素で切断したFab発現用ベクター(GeneFrontier社)に挿入後大腸菌BL21(DE3)に導入した。当該形質転換体を丸底96wellプレート上で、1 wellあたり150μLのカルベニシリ/0.1% グルコース/2xYTで37℃にて4−5時間培養した。次にプレートを4℃まで冷やした後、終濃度0.5mMになるようにIPTGを添加し、30℃で一晩振とう培養した。次に遠心により菌体を回収した後、Lysis buffer(2.5mg/mL Lysotyme、100U DNaseI)を加え、室温にて60分間振とうした。続いて遠心により上清を回収し、Fab検体とした。
選抜した遺伝子を大腸菌発現用ベクターにサブクローニングし、ヒトOrai1恒常発現CHO細胞に対する結合性が向上したクローンをCell ELISAにてスクリーニングした。まず選抜後のDNAを制限酵素EcoRVおよびXhoIで切断し、同じ酵素で切断したFab発現用ベクター(GeneFrontier社)に挿入後大腸菌BL21(DE3)に導入した。当該形質転換体を丸底96wellプレート上で、1 wellあたり150μLのカルベニシリ/0.1% グルコース/2xYTで37℃にて4−5時間培養した。次にプレートを4℃まで冷やした後、終濃度0.5mMになるようにIPTGを添加し、30℃で一晩振とう培養した。次に遠心により菌体を回収した後、Lysis buffer(2.5mg/mL Lysotyme、100U DNaseI)を加え、室温にて60分間振とうした。続いて遠心により上清を回収し、Fab検体とした。
9)−4 Cell ELISAによるスクリーニング
ヒトOrai1発現細胞を384プレートにフルシートに培養後、洗浄バッファー(PBS(−)、20mM MgSO4、2.5% FBS)にて洗浄した。次にFab検体を当該プレートに加え、4℃で1時間振とうした。洗浄バッファーにて4回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトF(ab’)2ヤギ抗体(Jackson Immuno Research社)を加え、4℃で30分間振とうした。洗浄バッファーにて3回洗浄後、PBS(−)、20mM MgSO4にて3回洗浄した。その後発色試薬(0.4mg/mL Tetramethyl−benzimine、 200mM 酢酸ナトリウム(pH3.4)、0.01% 過酸化水素水)を加え、室温で15分間振とうした。その後2N HClを加えた後、OD450を測定した。コントロールのCHO細胞と比較し、ヒトOrai1恒常発現CHO細胞の方でより高いOD450を示すFab検体を選抜した。
ヒトOrai1発現細胞を384プレートにフルシートに培養後、洗浄バッファー(PBS(−)、20mM MgSO4、2.5% FBS)にて洗浄した。次にFab検体を当該プレートに加え、4℃で1時間振とうした。洗浄バッファーにて4回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトF(ab’)2ヤギ抗体(Jackson Immuno Research社)を加え、4℃で30分間振とうした。洗浄バッファーにて3回洗浄後、PBS(−)、20mM MgSO4にて3回洗浄した。その後発色試薬(0.4mg/mL Tetramethyl−benzimine、 200mM 酢酸ナトリウム(pH3.4)、0.01% 過酸化水素水)を加え、室温で15分間振とうした。その後2N HClを加えた後、OD450を測定した。コントロールのCHO細胞と比較し、ヒトOrai1恒常発現CHO細胞の方でより高いOD450を示すFab検体を選抜した。
9)−5 フローサイトメトリーによる抗ヒトOrai1抗体Fabの抗原結合活性
ヒトOrai1に対する結合特異性を評価するため、1)−4−1で示す方法により作製したpcDNA3.1−DEST導入HEK293T細胞懸濁液あるいはpcDNA3.1−hOrai1導入HEK293T細胞懸濁液を遠心し、上清を除去した後、それぞれに対し9)−4で選抜された軽鎖変異クローンLCDR60、LCDR67、LCDR83、CE151、PE057ならびに重鎖変異クローンHCDR046、HCDR047、HEP087、HEP124、HEP237と、親抗体FabのhR198_H4/L4―Fabを加えて懸濁し、4℃で30分静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、5% FBS含有PBSで100倍に希釈したAnti−human IgG FITC conjugateを加えて懸濁し、4℃で30分静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、1μg/mL Propidium iodideを含む5% FBS含有PBSに再懸濁し、フローサイトメーター(FC500)で検出を行った。データ解析はFlowjoで行った。Propidium iodide陽性の死細胞をゲートで除外した後、生細胞のFITC蛍光強度のヒストグラムを作成し、平均蛍光強度(MFI)を算出した。軽鎖変異クローンLCDR60、LCDR67、LCDR83、CE151、PE057ならびに重鎖変異クローンHCDR046、HCDR047、HEP087、HEP124、HEP237は親抗体FabのhR198_H4/L4―Fabと同様、pcDNA3.1−DEST導入HEK293T細胞には結合せず、図7に示すとおりpcDNA3.1−hOrai1導入HEK293T細胞に対しては、親抗体Fabと比べて同等以上にヒトOrai1に結合する傾向が見られた。
ヒトOrai1に対する結合特異性を評価するため、1)−4−1で示す方法により作製したpcDNA3.1−DEST導入HEK293T細胞懸濁液あるいはpcDNA3.1−hOrai1導入HEK293T細胞懸濁液を遠心し、上清を除去した後、それぞれに対し9)−4で選抜された軽鎖変異クローンLCDR60、LCDR67、LCDR83、CE151、PE057ならびに重鎖変異クローンHCDR046、HCDR047、HEP087、HEP124、HEP237と、親抗体FabのhR198_H4/L4―Fabを加えて懸濁し、4℃で30分静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、5% FBS含有PBSで100倍に希釈したAnti−human IgG FITC conjugateを加えて懸濁し、4℃で30分静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、1μg/mL Propidium iodideを含む5% FBS含有PBSに再懸濁し、フローサイトメーター(FC500)で検出を行った。データ解析はFlowjoで行った。Propidium iodide陽性の死細胞をゲートで除外した後、生細胞のFITC蛍光強度のヒストグラムを作成し、平均蛍光強度(MFI)を算出した。軽鎖変異クローンLCDR60、LCDR67、LCDR83、CE151、PE057ならびに重鎖変異クローンHCDR046、HCDR047、HEP087、HEP124、HEP237は親抗体FabのhR198_H4/L4―Fabと同様、pcDNA3.1−DEST導入HEK293T細胞には結合せず、図7に示すとおりpcDNA3.1−hOrai1導入HEK293T細胞に対しては、親抗体Fabと比べて同等以上にヒトOrai1に結合する傾向が見られた。
[実施例10]ヒト化抗ヒトOrai1抗体のアフィニティマチュレーション抗体の作製
実施例9)により選択された軽鎖変異クローンLCDR60、LCDR67、LCDR83、CE151、PE057ならびに重鎖変異クローンHCDR046、HCDR047、HEP087、HEP124、HEP237で認められた活性を増強する変異のうち、いくつかをhR198_H3/L3に移入することによって、100種類以上の改変hR198_H3/L3抗体を作製し、結合親和性、in vitro活性、生産性、ヒトに対する異種抗原性の観点から評価した。結果として、以下に示す抗体を選抜した。
実施例9)により選択された軽鎖変異クローンLCDR60、LCDR67、LCDR83、CE151、PE057ならびに重鎖変異クローンHCDR046、HCDR047、HEP087、HEP124、HEP237で認められた活性を増強する変異のうち、いくつかをhR198_H3/L3に移入することによって、100種類以上の改変hR198_H3/L3抗体を作製し、結合親和性、in vitro活性、生産性、ヒトに対する異種抗原性の観点から評価した。結果として、以下に示す抗体を選抜した。
10)−1 ヒト化抗ヒトOrai1抗体のアフィニティマチュレーション抗体の設計
10)−1−1 hR198_LG1タイプ軽鎖:
配列表の配列番号35に示されるhR198_L3軽鎖のアミノ酸番号51番目のアスパラギン残基をグリシン残基に、113番目のトレオニン残基をイソロイシン残基に、117番目のトレオニン残基をセリン残基に置き換えることを伴い設計されたヒト化R198軽鎖を「hR198_LG1タイプ軽鎖」と命名した。
hR198_LG1タイプ軽鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号55であり、シグナル配列が切除された成熟軽鎖をコードするのはヌクレオチド番号61乃至702であり、可変領域をコードするのはヌクレオチド番号61乃至378である。また、hR198_LG1タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号56であり、シグナル配列が切除された成熟軽鎖はそのアミノ酸番号21乃至234からなり、可変領域はそのアミノ酸番号21乃至126からなる。さらに、配列番号55および56の配列は、それぞれ図30にも記載されている。各CDR配列および対応する配列番号は図38に示されている。
10)−1−1 hR198_LG1タイプ軽鎖:
配列表の配列番号35に示されるhR198_L3軽鎖のアミノ酸番号51番目のアスパラギン残基をグリシン残基に、113番目のトレオニン残基をイソロイシン残基に、117番目のトレオニン残基をセリン残基に置き換えることを伴い設計されたヒト化R198軽鎖を「hR198_LG1タイプ軽鎖」と命名した。
hR198_LG1タイプ軽鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号55であり、シグナル配列が切除された成熟軽鎖をコードするのはヌクレオチド番号61乃至702であり、可変領域をコードするのはヌクレオチド番号61乃至378である。また、hR198_LG1タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号56であり、シグナル配列が切除された成熟軽鎖はそのアミノ酸番号21乃至234からなり、可変領域はそのアミノ酸番号21乃至126からなる。さらに、配列番号55および56の配列は、それぞれ図30にも記載されている。各CDR配列および対応する配列番号は図38に示されている。
10)−1−2 hR198_LG2タイプ軽鎖:
配列表の配列番号35に示されるhR198_L3軽鎖のアミノ酸番号44番目のアルギニン残基をヒスチジン残基に、48番目のセリン残基をアスパラギン残基に、51番目のアスパラギン残基をグリシン残基に、70番目のセリン残基をロイシン残基に、75番目のグルタミン酸残基をアスパラギン酸残基に、76番目のセリン残基をトリプトファン残基に、113番目のトレオニン残基をイソロイシン残基に、117番目のトレオニン残基をセリン残基に置き換えることを伴い設計されたヒト化R198軽鎖を「hR198_LG2タイプ軽鎖」と命名した。
hR198_LG2タイプ軽鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号57であり、シグナル配列が切除された成熟軽鎖をコードするのはヌクレオチド番号61乃至702であり、可変領域をコードするのはヌクレオチド番号61乃至378である。また、hR198_LG2タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号58であり、シグナル配列が切除された成熟軽鎖はそのアミノ酸番号21乃至234からなり、可変領域はそのアミノ酸番号21乃至126からなる。さらに、配列番号57および58の配列は、それぞれ図31にも記載されている。各CDR配列および対応する配列番号は図38に示されている。
配列表の配列番号35に示されるhR198_L3軽鎖のアミノ酸番号44番目のアルギニン残基をヒスチジン残基に、48番目のセリン残基をアスパラギン残基に、51番目のアスパラギン残基をグリシン残基に、70番目のセリン残基をロイシン残基に、75番目のグルタミン酸残基をアスパラギン酸残基に、76番目のセリン残基をトリプトファン残基に、113番目のトレオニン残基をイソロイシン残基に、117番目のトレオニン残基をセリン残基に置き換えることを伴い設計されたヒト化R198軽鎖を「hR198_LG2タイプ軽鎖」と命名した。
hR198_LG2タイプ軽鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号57であり、シグナル配列が切除された成熟軽鎖をコードするのはヌクレオチド番号61乃至702であり、可変領域をコードするのはヌクレオチド番号61乃至378である。また、hR198_LG2タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号58であり、シグナル配列が切除された成熟軽鎖はそのアミノ酸番号21乃至234からなり、可変領域はそのアミノ酸番号21乃至126からなる。さらに、配列番号57および58の配列は、それぞれ図31にも記載されている。各CDR配列および対応する配列番号は図38に示されている。
10)−1−3 hR198_LG3タイプ軽鎖:
配列表の配列番号35に示されるhR198_L3軽鎖のアミノ酸番号44番目のアルギニン残基をヒスチジン残基に、47番目のグルタミン残基をアルギニン残基に、48番目のセリン残基をアスパラギン残基に、51番目のアスパラギン残基をグリシン残基に、70番目のセリン残基をロイシン残基に、73番目のトレオニン残基をセリン残基に、75番目のグルタミン酸残基をアスパラギン酸残基に、76番目のセリン残基をトリプトファン残基に、113番目のトレオニン残基をイソロイシン残基に、117番目のトレオニン残基をセリン残基に置き換えることを伴い設計されたヒト化R198軽鎖を「hR198_LG3タイプ軽鎖」と命名した。
hR198_LG3タイプ軽鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号59であり、シグナル配列が切除された成熟軽鎖をコードするのはヌクレオチド番号61乃至702であり、可変領域をコードするのはヌクレオチド番号61乃至378である。また、hR198_LG3タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号60であり、シグナル配列が切除された成熟軽鎖はそのアミノ酸番号21乃至234からなり、可変領域はそのアミノ酸番号21乃至126からなる。さらに、配列番号59および60の配列は、それぞれ図32にも記載されている。各CDR配列および対応する配列番号は図38に示されている。
配列表の配列番号35に示されるhR198_L3軽鎖のアミノ酸番号44番目のアルギニン残基をヒスチジン残基に、47番目のグルタミン残基をアルギニン残基に、48番目のセリン残基をアスパラギン残基に、51番目のアスパラギン残基をグリシン残基に、70番目のセリン残基をロイシン残基に、73番目のトレオニン残基をセリン残基に、75番目のグルタミン酸残基をアスパラギン酸残基に、76番目のセリン残基をトリプトファン残基に、113番目のトレオニン残基をイソロイシン残基に、117番目のトレオニン残基をセリン残基に置き換えることを伴い設計されたヒト化R198軽鎖を「hR198_LG3タイプ軽鎖」と命名した。
hR198_LG3タイプ軽鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号59であり、シグナル配列が切除された成熟軽鎖をコードするのはヌクレオチド番号61乃至702であり、可変領域をコードするのはヌクレオチド番号61乃至378である。また、hR198_LG3タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号60であり、シグナル配列が切除された成熟軽鎖はそのアミノ酸番号21乃至234からなり、可変領域はそのアミノ酸番号21乃至126からなる。さらに、配列番号59および60の配列は、それぞれ図32にも記載されている。各CDR配列および対応する配列番号は図38に示されている。
10)−1−4 hR198_HG1タイプ重鎖:
配列表の配列番号43に示されるhR198_H3重鎖のアミノ酸番号78番目のアスパラギン残基をアスパラギン酸残基に、123番目のバリン残基をアラニン残基に置き換えることを伴い設計されたヒト化R198重鎖を「hR198_HG1タイプ軽鎖」と命名した。
hR198_HG1タイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号61であり、シグナル配列が切除された成熟重鎖をコードするのはヌクレオチド番号58乃至1398であり、可変領域をコードするのはヌクレオチド番号58乃至408である。また、hR198_HG1タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号62であり、シグナル配列が切除された成熟重鎖はそのアミノ酸番号20乃至466からなり、可変領域はそのアミノ酸番号20乃至135からなる。さらに、配列番号61および62の配列は、それぞれ図33にも記載されている。各CDR配列および対応する配列番号は図38に示されている。
配列表の配列番号43に示されるhR198_H3重鎖のアミノ酸番号78番目のアスパラギン残基をアスパラギン酸残基に、123番目のバリン残基をアラニン残基に置き換えることを伴い設計されたヒト化R198重鎖を「hR198_HG1タイプ軽鎖」と命名した。
hR198_HG1タイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号61であり、シグナル配列が切除された成熟重鎖をコードするのはヌクレオチド番号58乃至1398であり、可変領域をコードするのはヌクレオチド番号58乃至408である。また、hR198_HG1タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号62であり、シグナル配列が切除された成熟重鎖はそのアミノ酸番号20乃至466からなり、可変領域はそのアミノ酸番号20乃至135からなる。さらに、配列番号61および62の配列は、それぞれ図33にも記載されている。各CDR配列および対応する配列番号は図38に示されている。
10)−1−5 hR198_HG2タイプ重鎖:
配列表の配列番号43に示されるhR198_H3重鎖のアミノ酸番号48番目のバリン残基をイソロイシン残基に、78番目のアスパラギン残基をアスパラギン酸残基に、81番目のアラニン残基をグリシン残基に、123番目のバリン残基をアラニン残基に置き換えることを伴い設計されたヒト化R198重鎖を「hR198_HG2タイプ軽鎖」と命名した。
hR198_HG2タイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号63であり、シグナル配列が切除された成熟重鎖をコードするのはヌクレオチド番号58乃至1398であり、可変領域をコードするのはヌクレオチド番号58乃至408である。また、hR198_HG2タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号64であり、シグナル配列が切除された成熟重鎖はそのアミノ酸番号20乃至466からなり、可変領域はそのアミノ酸番号20乃至135からなる。さらに、配列番号63および64の配列は、それぞれ図34にも記載されている。各CDR配列および対応する配列番号は図38に示されている。
配列表の配列番号43に示されるhR198_H3重鎖のアミノ酸番号48番目のバリン残基をイソロイシン残基に、78番目のアスパラギン残基をアスパラギン酸残基に、81番目のアラニン残基をグリシン残基に、123番目のバリン残基をアラニン残基に置き換えることを伴い設計されたヒト化R198重鎖を「hR198_HG2タイプ軽鎖」と命名した。
hR198_HG2タイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号63であり、シグナル配列が切除された成熟重鎖をコードするのはヌクレオチド番号58乃至1398であり、可変領域をコードするのはヌクレオチド番号58乃至408である。また、hR198_HG2タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号64であり、シグナル配列が切除された成熟重鎖はそのアミノ酸番号20乃至466からなり、可変領域はそのアミノ酸番号20乃至135からなる。さらに、配列番号63および64の配列は、それぞれ図34にも記載されている。各CDR配列および対応する配列番号は図38に示されている。
10)−1−6 hR198_HG3タイプ重鎖:
配列表の配列番号43に示されるhR198_H3重鎖のアミノ酸番号48番目のバリン残基をイソロイシン残基に、78番目のアスパラギン残基をアスパラギン酸残基に、81番目のアラニン残基をメチオニン残基に、123番目のバリン残基をアラニン残基に置き換えることを伴い設計されたヒト化R198重鎖を「hR198_HG3タイプ軽鎖」と命名した。
hR198_HG3タイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号65であり、シグナル配列が切除された成熟重鎖をコードするのはヌクレオチド番号58乃至1398であり、可変領域をコードするのはヌクレオチド番号58乃至408である。また、hR198_HG3タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号66であり、シグナル配列が切除された成熟重鎖はそのアミノ酸番号20乃至466からなり、可変領域はそのアミノ酸番号20乃至135からなる。さらに、配列番号65および66の配列は、それぞれ図35にも記載されている。各CDR配列および対応する配列番号は図38に示されている。
配列表の配列番号43に示されるhR198_H3重鎖のアミノ酸番号48番目のバリン残基をイソロイシン残基に、78番目のアスパラギン残基をアスパラギン酸残基に、81番目のアラニン残基をメチオニン残基に、123番目のバリン残基をアラニン残基に置き換えることを伴い設計されたヒト化R198重鎖を「hR198_HG3タイプ軽鎖」と命名した。
hR198_HG3タイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号65であり、シグナル配列が切除された成熟重鎖をコードするのはヌクレオチド番号58乃至1398であり、可変領域をコードするのはヌクレオチド番号58乃至408である。また、hR198_HG3タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号66であり、シグナル配列が切除された成熟重鎖はそのアミノ酸番号20乃至466からなり、可変領域はそのアミノ酸番号20乃至135からなる。さらに、配列番号65および66の配列は、それぞれ図35にも記載されている。各CDR配列および対応する配列番号は図38に示されている。
10)−2 ヒト化抗ヒトOrai1抗体のアフィニティマチュレーション抗体発現ベクターの作製
10)−2−1 hR198_LG1タイプ軽鎖発現ベクターの構築
pCMA−LK/hR198_L3をテンプレートにして、KOD−Plus−mutagenesisを用いて、アミノ酸番号51番目のアスパラギン残基をグリシン残基に、113番目のトレオニン残基をイソロイシン残基に、117番目のトレオニン残基をセリン残基に置き換える変異を導入した。配列表の配列番号55に示されるヌクレオチド配列を含む得られた発現ベクターを「pCMA−LK/hR198_LG1」と命名した。
10)−2−1 hR198_LG1タイプ軽鎖発現ベクターの構築
pCMA−LK/hR198_L3をテンプレートにして、KOD−Plus−mutagenesisを用いて、アミノ酸番号51番目のアスパラギン残基をグリシン残基に、113番目のトレオニン残基をイソロイシン残基に、117番目のトレオニン残基をセリン残基に置き換える変異を導入した。配列表の配列番号55に示されるヌクレオチド配列を含む得られた発現ベクターを「pCMA−LK/hR198_LG1」と命名した。
10)−2−2 hR198_LG2およびLG3タイプ軽鎖発現ベクターの構築
配列表の配列番号59に示されるLG3のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号38乃至402に示されるhR198_LG3の可変領域をコードする配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。合成したDNA断片を制限酵素EcoRVおよびAvaIで切断し、同じ制限酵素で切断したpCMA−LK/hR198_LG1に挿入することによりhR198_LG3発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−LK/hR198_LG3」と命名した。
pCMA−LK/hR198_LG3をテンプレートにして、KOD−Plus−mutagenesisを用いて、アミノ酸番号47番目のアルギニン残基をグルタミン残基に、73番目のセリン残基をトレオニン残基に置き換える変異を導入した。配列表の配列番号57に示されるヌクレオチド配列を含む得られた発現ベクターを「pCMA−LK/hR198_LG2」と命名した。
配列表の配列番号59に示されるLG3のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号38乃至402に示されるhR198_LG3の可変領域をコードする配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。合成したDNA断片を制限酵素EcoRVおよびAvaIで切断し、同じ制限酵素で切断したpCMA−LK/hR198_LG1に挿入することによりhR198_LG3発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−LK/hR198_LG3」と命名した。
pCMA−LK/hR198_LG3をテンプレートにして、KOD−Plus−mutagenesisを用いて、アミノ酸番号47番目のアルギニン残基をグルタミン残基に、73番目のセリン残基をトレオニン残基に置き換える変異を導入した。配列表の配列番号57に示されるヌクレオチド配列を含む得られた発現ベクターを「pCMA−LK/hR198_LG2」と命名した。
10)−2−3 hR198_HG1タイプ重鎖発現ベクターの構築
pCMA−G1/hR198_H3をテンプレートにして、KOD−Plus−mutagenesisを用いて、アミノ酸番号78番目のアスパラギン残基をアスパラギン酸残基に、123番目のバリン残基をアラニン残基に置き換える変異を導入した。配列表の配列番号61示されるヌクレオチド配列を含む得られた発現ベクターを「pCMA−G1/hR198_HG1」と命名した。
pCMA−G1/hR198_H3をテンプレートにして、KOD−Plus−mutagenesisを用いて、アミノ酸番号78番目のアスパラギン残基をアスパラギン酸残基に、123番目のバリン残基をアラニン残基に置き換える変異を導入した。配列表の配列番号61示されるヌクレオチド配列を含む得られた発現ベクターを「pCMA−G1/hR198_HG1」と命名した。
10)−2−4 hR198_HG2タイプ重鎖発現ベクターの構築
pCMA−G1/hR198_HG1をテンプレートにして、KOD−Plus−mutagenesisを用いて、アミノ酸番号48番目のバリン残基をイソロイシン残基に、81番目のアラニン残基をグリシン残基に置き換える変異を導入した。配列表の配列番号63に示されるヌクレオチド配列を含む得られた発現ベクターを「pCMA−G1/hR198_HG2」と命名した。
pCMA−G1/hR198_HG1をテンプレートにして、KOD−Plus−mutagenesisを用いて、アミノ酸番号48番目のバリン残基をイソロイシン残基に、81番目のアラニン残基をグリシン残基に置き換える変異を導入した。配列表の配列番号63に示されるヌクレオチド配列を含む得られた発現ベクターを「pCMA−G1/hR198_HG2」と命名した。
10)−2−5 hR198_HG3タイプ重鎖発現ベクターの構築
pCMA−G1/hR198_HG2をテンプレートにして、KOD−Plus−mutagenesisを用いて、アミノ酸番号81番目のグリシン残基をメチオニン残基に置き換える変異を導入した。配列表の配列番号65に示されるヌクレオチド配列を含む得られた発現ベクターを「pCMA−G1/hR198_HG3」と命名した。
pCMA−G1/hR198_HG2をテンプレートにして、KOD−Plus−mutagenesisを用いて、アミノ酸番号81番目のグリシン残基をメチオニン残基に置き換える変異を導入した。配列表の配列番号65に示されるヌクレオチド配列を含む得られた発現ベクターを「pCMA−G1/hR198_HG3」と命名した。
10)−3 ヒト化抗ヒトOrai1抗体のアフィニティマチュレーション抗体の調製
4)−5−1と同様の方法によって、10)−2で作製したヒト化抗ヒトOrai1抗体重鎖発現ベクターとヒト化抗ヒトOrai1抗体軽鎖発現ベクターをFreeStyle 293F細胞に遺伝子導入し、抗体を含む培養上清を得た。
鋳型としたpCMA−G1/hR198_H3、変異を導入したpCMA−G1/hR198_HG1、pCMA−G1/hR198_HG2、pCMA−G1/hR198_HG3と、pCMA−LK/hR198_LG1、pCMA−LK/hR198_LG2、pCMA−LK/hR198_LG3との組合せによって取得されたヒト化抗ヒトOrai1抗体をそれぞれ、「hR198_H3/LG1」、「hR198_HG1/LG1」、「hR198_HG1/LG2」、「hR198_HG1/LG3」、「hR198_HG2/LG1」、「hR198_HG3/LG1」と命名した。
4)−5−1と同様の方法によって、10)−2で作製したヒト化抗ヒトOrai1抗体重鎖発現ベクターとヒト化抗ヒトOrai1抗体軽鎖発現ベクターをFreeStyle 293F細胞に遺伝子導入し、抗体を含む培養上清を得た。
鋳型としたpCMA−G1/hR198_H3、変異を導入したpCMA−G1/hR198_HG1、pCMA−G1/hR198_HG2、pCMA−G1/hR198_HG3と、pCMA−LK/hR198_LG1、pCMA−LK/hR198_LG2、pCMA−LK/hR198_LG3との組合せによって取得されたヒト化抗ヒトOrai1抗体をそれぞれ、「hR198_H3/LG1」、「hR198_HG1/LG1」、「hR198_HG1/LG2」、「hR198_HG1/LG3」、「hR198_HG2/LG1」、「hR198_HG3/LG1」と命名した。
4)−5−2と同様の方法によって、得られた培養上清をrProteinAアフィニティークロマトグラフィーで精製し、精製抗体サンプルを得た。
[実施例11]アフィニティマチュレーション抗体のin vitro活性
11)−1 フローサイトメトリーによるアフィニティマチュレーション抗体の結合能評価
ヒトOrai1に対する結合特異性を評価するため、1)−4−1で示す方法により作製したpcDNA3.1−DEST導入HEK293T細胞懸濁液あるいはpcDNA3.1−hOrai1導入HEK293T細胞懸濁液を遠心し、上清を除去した後、それぞれに対し10)−3で作製したアフィニティマチュレーション抗体のhR198_H3/LG1、hR198_HG1/LG1、hR198_HG1/LG2、hR198_HG1/LG3、hR198_HG2/LG1、hR198_HG3/LG1と、親抗体のhR198_H3/L3、hR198_H4/L4を加えて懸濁し、4℃で30分静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、5% FBS含有PBSで100倍に希釈したAnti−human IgG FITC conjugateを加えて懸濁し、4℃で30分静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、1μg/mL Propidium iodideを含む5% FBS含有PBSに再懸濁し、フローサイトメーター(FC500)で検出を行った。データ解析はFlowjoで行った。Propidium iodide陽性の死細胞をゲートで除外した後、生細胞のFITC蛍光強度のヒストグラムを作成し、平均蛍光強度(MFI)を算出した。アフィニティマチュレーション抗体hR198_H3/LG1、hR198_HG1/LG1、hR198_HG1/LG2、hR198_HG1/LG3、hR198_HG2/LG1、hR198_HG3/LG1は、親抗体であるhR198_H3/L3、hR198_H4/L4と同様、pcDNA3.1−DEST導入HEK293T細胞には結合せず、図8に示すとおりpcDNA3.1−hOrai1導入HEK293T細胞に対しては、親抗体と比べて同等以上にヒトOrai1に結合する傾向が見られた。
11)−1 フローサイトメトリーによるアフィニティマチュレーション抗体の結合能評価
ヒトOrai1に対する結合特異性を評価するため、1)−4−1で示す方法により作製したpcDNA3.1−DEST導入HEK293T細胞懸濁液あるいはpcDNA3.1−hOrai1導入HEK293T細胞懸濁液を遠心し、上清を除去した後、それぞれに対し10)−3で作製したアフィニティマチュレーション抗体のhR198_H3/LG1、hR198_HG1/LG1、hR198_HG1/LG2、hR198_HG1/LG3、hR198_HG2/LG1、hR198_HG3/LG1と、親抗体のhR198_H3/L3、hR198_H4/L4を加えて懸濁し、4℃で30分静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、5% FBS含有PBSで100倍に希釈したAnti−human IgG FITC conjugateを加えて懸濁し、4℃で30分静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、1μg/mL Propidium iodideを含む5% FBS含有PBSに再懸濁し、フローサイトメーター(FC500)で検出を行った。データ解析はFlowjoで行った。Propidium iodide陽性の死細胞をゲートで除外した後、生細胞のFITC蛍光強度のヒストグラムを作成し、平均蛍光強度(MFI)を算出した。アフィニティマチュレーション抗体hR198_H3/LG1、hR198_HG1/LG1、hR198_HG1/LG2、hR198_HG1/LG3、hR198_HG2/LG1、hR198_HG3/LG1は、親抗体であるhR198_H3/L3、hR198_H4/L4と同様、pcDNA3.1−DEST導入HEK293T細胞には結合せず、図8に示すとおりpcDNA3.1−hOrai1導入HEK293T細胞に対しては、親抗体と比べて同等以上にヒトOrai1に結合する傾向が見られた。
11)−2 アフィニティマチュレーション抗体のT細胞活性化抑制作用
ヒトT細胞株であるJurkat細胞を、10% FBS、100U/mL Penicillinおよび100μg/mL Streptomycinを含むRPMI1640で1.5x106cells/mLの濃度に調製し、96−wells細胞培養プレートに80μLずつ播種し、アフィニティマチュレーション抗体であるhR198_H3/LG1、hR198_HG1/LG1、hR198_HG1/LG2、hR198_HG1/LG3、hR198_HG2/LG1、hR198_HG3/LG1、ヒト化抗ヒトOrai1抗体であるhR198_H3/L3、hR198_H4/L4を10μL/well添加して37℃、5% CO2下で60分間前処置した。その後、100ng/mL PMAおよび1μg/mL A23187を10μL/well添加し、よく攪拌した後、約16時間37℃、5% CO2下で培養した。プレートをよく攪拌した後、600gにて3分間遠心し、上清に含まれるIL−2濃度をELISA法で測定した 。図9はアフィニティマチュレーション抗体がPMAおよびA23187処理されたJurkat細胞からのIL−2の放出を添加濃度依存的に抑制することを示す。アフィニティマチュレーション抗体はJurkat細胞からのIL−2の放出を添加濃度依存的に阻害し、その阻害活性はいずれも親抗体であるヒト化抗ヒトOrai1抗体hH3/L3、hH4/L4を上回るものであった。
ヒトT細胞株であるJurkat細胞を、10% FBS、100U/mL Penicillinおよび100μg/mL Streptomycinを含むRPMI1640で1.5x106cells/mLの濃度に調製し、96−wells細胞培養プレートに80μLずつ播種し、アフィニティマチュレーション抗体であるhR198_H3/LG1、hR198_HG1/LG1、hR198_HG1/LG2、hR198_HG1/LG3、hR198_HG2/LG1、hR198_HG3/LG1、ヒト化抗ヒトOrai1抗体であるhR198_H3/L3、hR198_H4/L4を10μL/well添加して37℃、5% CO2下で60分間前処置した。その後、100ng/mL PMAおよび1μg/mL A23187を10μL/well添加し、よく攪拌した後、約16時間37℃、5% CO2下で培養した。プレートをよく攪拌した後、600gにて3分間遠心し、上清に含まれるIL−2濃度をELISA法で測定した 。図9はアフィニティマチュレーション抗体がPMAおよびA23187処理されたJurkat細胞からのIL−2の放出を添加濃度依存的に抑制することを示す。アフィニティマチュレーション抗体はJurkat細胞からのIL−2の放出を添加濃度依存的に阻害し、その阻害活性はいずれも親抗体であるヒト化抗ヒトOrai1抗体hH3/L3、hH4/L4を上回るものであった。
[実施例12]アフィニティマチュレーション抗体のエフェクター活性低減改変体の作製
hR198_HG1の定常領域の2個のアミノ酸残基を置換した定常領域改変hR198_HG1−LALA配列を以下の実施例に記載されるように構築した。
12)−1 LALAタイプ重鎖発現ベクターの設計
正常のヒトOrai1発現細胞への細胞傷害を回避するために、抗体のエフェクター活性は低いことが望ましい。エフェクター活性は抗体のサブクラスによって異なることが知られている。IgG4はADCC、CDC活性が低く、IgG2はCDC活性を有するが、ADCC活性は低い、などの特徴が見られる。この特徴より、IgG1の定常領域の一部の配列をIgG2,4を参考にして置換することにより、ADCC、CDC活性が低減されたIgG1抗体を作製することが可能である。一例として、Marjan Hezareh et. al. Journal of Virology, 75(24):12161−12168(2001)によれば、IgG1の234番目、235番目のロイシン残基(数字はKabatらによるEUインデックス)をそれぞれアラニン残基に置換すると、ADCC、CDC活性が低下することが示されている。そこで、10)−1で作製されたhR198_HG1タイプ重鎖に対して、アミノ酸番号253番目のロイシン残基をアラニン残基に、254番目のロイシン残基をアラニン残基に置き換えることを伴い設計されたヒト化抗ヒトOrai1抗体重鎖を「hR198_HG1−LALAタイプ重鎖」と命名した。
hR198_HG1の定常領域の2個のアミノ酸残基を置換した定常領域改変hR198_HG1−LALA配列を以下の実施例に記載されるように構築した。
12)−1 LALAタイプ重鎖発現ベクターの設計
正常のヒトOrai1発現細胞への細胞傷害を回避するために、抗体のエフェクター活性は低いことが望ましい。エフェクター活性は抗体のサブクラスによって異なることが知られている。IgG4はADCC、CDC活性が低く、IgG2はCDC活性を有するが、ADCC活性は低い、などの特徴が見られる。この特徴より、IgG1の定常領域の一部の配列をIgG2,4を参考にして置換することにより、ADCC、CDC活性が低減されたIgG1抗体を作製することが可能である。一例として、Marjan Hezareh et. al. Journal of Virology, 75(24):12161−12168(2001)によれば、IgG1の234番目、235番目のロイシン残基(数字はKabatらによるEUインデックス)をそれぞれアラニン残基に置換すると、ADCC、CDC活性が低下することが示されている。そこで、10)−1で作製されたhR198_HG1タイプ重鎖に対して、アミノ酸番号253番目のロイシン残基をアラニン残基に、254番目のロイシン残基をアラニン残基に置き換えることを伴い設計されたヒト化抗ヒトOrai1抗体重鎖を「hR198_HG1−LALAタイプ重鎖」と命名した。
12)−2 LALAタイプ重鎖発現ベクターの構築
12)−2−1 hR198_HG1−LALAタイプ重鎖発現ベクターの構築
7)−2で作製された、hR198_H4タイプ重鎖pCMA−G1/hR198_H4をテンプレートとし、KOD −Plus− Mutagenesis Kitを用いて、変異を導入することによりhR198_H4−LALAタイプ重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−G1−LALA/hR198_H4」と命名した。hR198_H4−LALAタイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列および該重鎖のアミノ酸配列を、配列表の配列番号67および68(図36)にそれぞれ示す。 pCMA−G1−LALA/hR198_H4を制限酵素PstIおよびXbaIで消化して得られる約4.2kbのDNA断片に、10)−2で作製されたpCMA−G1/hR198_HG1を同様の制限酵素で消化して得られる抗体可変領域を含む約0.6kbのDNA断片を、Ligation High ver.2を用いて挿入することにより、hR198_HG1−LALAタイプ重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−G1−LALA/hR198_HG1」と命名した。hR198_HG1−LALAタイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列および該重鎖のアミノ酸配列を、配列表の配列番号69および70(図37)にそれぞれ示す。
12)−2−1 hR198_HG1−LALAタイプ重鎖発現ベクターの構築
7)−2で作製された、hR198_H4タイプ重鎖pCMA−G1/hR198_H4をテンプレートとし、KOD −Plus− Mutagenesis Kitを用いて、変異を導入することによりhR198_H4−LALAタイプ重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−G1−LALA/hR198_H4」と命名した。hR198_H4−LALAタイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列および該重鎖のアミノ酸配列を、配列表の配列番号67および68(図36)にそれぞれ示す。 pCMA−G1−LALA/hR198_H4を制限酵素PstIおよびXbaIで消化して得られる約4.2kbのDNA断片に、10)−2で作製されたpCMA−G1/hR198_HG1を同様の制限酵素で消化して得られる抗体可変領域を含む約0.6kbのDNA断片を、Ligation High ver.2を用いて挿入することにより、hR198_HG1−LALAタイプ重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−G1−LALA/hR198_HG1」と命名した。hR198_HG1−LALAタイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列および該重鎖のアミノ酸配列を、配列表の配列番号69および70(図37)にそれぞれ示す。
12)−3 アフィニティマチュレーション抗体のエフェクター活性低減改変体の調製
12)−3−1 アフィニティマチュレーション抗体のエフェクター活性低減改変体の生産
FreeStyle 293F細胞(Life Technologies社)はマニュアルに従い、継代、培養をおこなった。対数増殖期の1.2×109個のFreeStyle 293F細胞(Life Technologies社)を3L Fernbach Erlenmeyer Flask(CORNING社)に播種し、FreeStyle293 expression medium (Invitrogen社)で希釈して1.0×106細胞/mLに調製したのちに、37℃、8%CO2インキュベーター内で90rpmで一時間振とう培養した。Polyethyleneimine(Polyscience #24765)3.6mgをOpti−Pro SFM(Life Technologies社)20mLに溶解し、次にPureLink HiPure Plasmidキット(Life Technologies社)を用いて調製した軽鎖発現ベクター(0.8mg)および重鎖発現ベクター(0.4mg)を20mLのOpti−Pro SFM(Life Technologies社)に添加した。Polyethyleneimine/Opti−Pro SFM混合液20mlに、発現ベクター/Opti−Pro SFM混合液20mLを加え穏やかに攪拌し、さらに5分間放置した後にFreeStyle 293F細胞に添加した。37℃、8%CO2インキュベーターで7日間、90rpmで振とう培養して得られた培養上清をDisposable Capsule Filter (ADVANTEC社 #CCS−045−E1H)でろ過した。hR198_HG1/LG1はpCMA−G1/hR198_HG1とpCMA−LK/hR198_LG1との組合せにより生産し、hR198_HG1−LALA/LG1はpCMA−G1−LALA/hR198_HG1とpCMA−LK/hR198_LG1との組合せにより生産した。
12)−3−1 アフィニティマチュレーション抗体のエフェクター活性低減改変体の生産
FreeStyle 293F細胞(Life Technologies社)はマニュアルに従い、継代、培養をおこなった。対数増殖期の1.2×109個のFreeStyle 293F細胞(Life Technologies社)を3L Fernbach Erlenmeyer Flask(CORNING社)に播種し、FreeStyle293 expression medium (Invitrogen社)で希釈して1.0×106細胞/mLに調製したのちに、37℃、8%CO2インキュベーター内で90rpmで一時間振とう培養した。Polyethyleneimine(Polyscience #24765)3.6mgをOpti−Pro SFM(Life Technologies社)20mLに溶解し、次にPureLink HiPure Plasmidキット(Life Technologies社)を用いて調製した軽鎖発現ベクター(0.8mg)および重鎖発現ベクター(0.4mg)を20mLのOpti−Pro SFM(Life Technologies社)に添加した。Polyethyleneimine/Opti−Pro SFM混合液20mlに、発現ベクター/Opti−Pro SFM混合液20mLを加え穏やかに攪拌し、さらに5分間放置した後にFreeStyle 293F細胞に添加した。37℃、8%CO2インキュベーターで7日間、90rpmで振とう培養して得られた培養上清をDisposable Capsule Filter (ADVANTEC社 #CCS−045−E1H)でろ過した。hR198_HG1/LG1はpCMA−G1/hR198_HG1とpCMA−LK/hR198_LG1との組合せにより生産し、hR198_HG1−LALA/LG1はpCMA−G1−LALA/hR198_HG1とpCMA−LK/hR198_LG1との組合せにより生産した。
12)−3−2 アフィニティマチュレーション抗体のエフェクター活性低減改変体の二段階工程精製
実施例12)−3−1で得られた培養上清から抗体を、rProteinAアフィニティークロマトグラフィー(4−6℃下)とセラミックハイドロキシアパタイト(室温下)の二段階工程で精製した。rProteinAアフィニティークロマトグラフィー精製後とセラミックハイドロキシアパタイト精製後のバッファー置換工程は4−6℃下で実施した。PBSで平衡化したMabSelectSuRe(GE Healthcare Bioscience社、HiTrapカラム)に培養上清をアプライした。培養上清がカラムに全て入ったのち、カラム容量2倍以上のPBSでカラムを洗浄した。次に2Mアルギニン塩酸塩溶液(pH4.0)で溶出し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を透析(Thermo Scientific社、Slide−A−Lyzer Dialysis Cassette)によりPBSに置換した後、5mMリン酸ナトリウム/50mM MES/pH7.0のバッファーで5倍希釈した抗体溶液を、5mM NaPi/50mM MES/30mM NaCl/pH7.0のバッファーで平衡化されたセラミックハイドロキシアパタイトカラム(日本バイオラッド社、Bio−Scale CHT Type―1 Hydroxyapatite Column)にアプライした。塩化ナトリウムによる直線的濃度勾配溶出を実施し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を透析(Thermo Scientific社,Slide−A−Lyzer Dialysis Cassette)によりHBSor(25mM ヒスチジン/5% ソルビトール、pH6.0)への液置換を行った。Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20(分画分子量UF10K,Sartorius社、4℃下)にて濃縮し、IgG濃度を5mg/mL以上に調製した。最後にMinisart−Plus filter(Sartorius社)でろ過し、精製サンプルとした。
実施例12)−3−1で得られた培養上清から抗体を、rProteinAアフィニティークロマトグラフィー(4−6℃下)とセラミックハイドロキシアパタイト(室温下)の二段階工程で精製した。rProteinAアフィニティークロマトグラフィー精製後とセラミックハイドロキシアパタイト精製後のバッファー置換工程は4−6℃下で実施した。PBSで平衡化したMabSelectSuRe(GE Healthcare Bioscience社、HiTrapカラム)に培養上清をアプライした。培養上清がカラムに全て入ったのち、カラム容量2倍以上のPBSでカラムを洗浄した。次に2Mアルギニン塩酸塩溶液(pH4.0)で溶出し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を透析(Thermo Scientific社、Slide−A−Lyzer Dialysis Cassette)によりPBSに置換した後、5mMリン酸ナトリウム/50mM MES/pH7.0のバッファーで5倍希釈した抗体溶液を、5mM NaPi/50mM MES/30mM NaCl/pH7.0のバッファーで平衡化されたセラミックハイドロキシアパタイトカラム(日本バイオラッド社、Bio−Scale CHT Type―1 Hydroxyapatite Column)にアプライした。塩化ナトリウムによる直線的濃度勾配溶出を実施し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を透析(Thermo Scientific社,Slide−A−Lyzer Dialysis Cassette)によりHBSor(25mM ヒスチジン/5% ソルビトール、pH6.0)への液置換を行った。Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20(分画分子量UF10K,Sartorius社、4℃下)にて濃縮し、IgG濃度を5mg/mL以上に調製した。最後にMinisart−Plus filter(Sartorius社)でろ過し、精製サンプルとした。
[実施例13]ヒト抗ヒトOrai1抗体2C1.1および5H3.1の発現ベクターの作製
2C1.1抗体および5H3.1抗体はWO2011063277A1に記載されている軽鎖、および重鎖のアミノ酸配列をもとに作製した。
13)−1 キメラ化およびヒト化IgG2タイプ重鎖発現ベクターpCMA−G2の構築
pCMA−LKをXbaIおよびPmeIで消化してκ鎖分泌シグナルおよびヒトκ鎖定常領域を取り除いたDNA断片と、配列表の配列番号71に示されるヒト重鎖分泌シグナルおよびヒトIgG2定常領域のアミノ酸をコードする配列を含むDNA断片をIn−Fusion Advantage PCRクローニングキットを用いて結合して、CMVプロモーターの下流にシグナル配列、クローニングサイト、ヒトIgG2重鎖定常領域をもつキメラおよびヒト化IgG2タイプ重鎖発現ベクターpCMA−G2を構築した。
2C1.1抗体および5H3.1抗体はWO2011063277A1に記載されている軽鎖、および重鎖のアミノ酸配列をもとに作製した。
13)−1 キメラ化およびヒト化IgG2タイプ重鎖発現ベクターpCMA−G2の構築
pCMA−LKをXbaIおよびPmeIで消化してκ鎖分泌シグナルおよびヒトκ鎖定常領域を取り除いたDNA断片と、配列表の配列番号71に示されるヒト重鎖分泌シグナルおよびヒトIgG2定常領域のアミノ酸をコードする配列を含むDNA断片をIn−Fusion Advantage PCRクローニングキットを用いて結合して、CMVプロモーターの下流にシグナル配列、クローニングサイト、ヒトIgG2重鎖定常領域をもつキメラおよびヒト化IgG2タイプ重鎖発現ベクターpCMA−G2を構築した。
13)−2 2C1.1抗体重鎖発現ベクターの構築
配列表の配列番号72に示される2C1.1抗体重鎖をコードするヌクレオチド配列のヌクレオチド番号36乃至434に示される2C1.1抗体重鎖の可変領域をコードする配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。合成したDNA断片をテンプレートとして、KOD−Plus−で2C1.1抗体重鎖の可変領域をコードする配列を含むDNA断片を増幅し、キメラおよびヒト化抗体IgG2タイプ重鎖発現ベクターpCMA−G2を制限酵素BlpIで切断した箇所にIn−Fusion HD PCRクローニングキットを用いて挿入することにより2C1.1抗体重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−G2/2C1.1」と命名した。
2C1.1抗体重鎖のアミノ酸配列を配列表の配列番号73に示した。
配列表の配列番号72に示される2C1.1抗体重鎖をコードするヌクレオチド配列のヌクレオチド番号36乃至434に示される2C1.1抗体重鎖の可変領域をコードする配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。合成したDNA断片をテンプレートとして、KOD−Plus−で2C1.1抗体重鎖の可変領域をコードする配列を含むDNA断片を増幅し、キメラおよびヒト化抗体IgG2タイプ重鎖発現ベクターpCMA−G2を制限酵素BlpIで切断した箇所にIn−Fusion HD PCRクローニングキットを用いて挿入することにより2C1.1抗体重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−G2/2C1.1」と命名した。
2C1.1抗体重鎖のアミノ酸配列を配列表の配列番号73に示した。
13)−3 2C1.1抗体軽鎖発現ベクターの構築
配列表の配列番号74に示される2C1.1抗体軽鎖をコードするヌクレオチド配列のヌクレオチド番号38乃至739に示される2C1.1抗体軽鎖の可変領域と定常領域(λ鎖)をコードする配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。合成したDNA断片をテンプレートとして、KOD−Plus−で2C1.1抗体軽鎖の可変領域と定常領域をコードする配列を含むDNA断片を増幅し、キメラおよびヒト化抗体軽鎖発現ベクターpCMA−LKを制限酵素BsiWIおよびPmeIで切断した箇所にIn−Fusion HD PCRクローニングキットを用いて挿入することにより2C1.1抗体軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−L/2C1.1」と命名した。
2C1.1抗体軽鎖のアミノ酸配列を配列表の配列番号75に示した。
配列表の配列番号74に示される2C1.1抗体軽鎖をコードするヌクレオチド配列のヌクレオチド番号38乃至739に示される2C1.1抗体軽鎖の可変領域と定常領域(λ鎖)をコードする配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。合成したDNA断片をテンプレートとして、KOD−Plus−で2C1.1抗体軽鎖の可変領域と定常領域をコードする配列を含むDNA断片を増幅し、キメラおよびヒト化抗体軽鎖発現ベクターpCMA−LKを制限酵素BsiWIおよびPmeIで切断した箇所にIn−Fusion HD PCRクローニングキットを用いて挿入することにより2C1.1抗体軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−L/2C1.1」と命名した。
2C1.1抗体軽鎖のアミノ酸配列を配列表の配列番号75に示した。
13)−4 5H3.1抗体重鎖発現ベクターの構築
配列表の配列番号76に示される5H3.1抗体重鎖をコードするヌクレオチド配列のヌクレオチド番号36乃至434に示される5H3.1抗体重鎖の可変領域をコードする配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。実施例13)−2と同様の方法で5H3.1抗体重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−G2/5H3.1」と命名した。
5H3.1抗体重鎖のアミノ酸配列を配列表の配列番号77に示した。
配列表の配列番号76に示される5H3.1抗体重鎖をコードするヌクレオチド配列のヌクレオチド番号36乃至434に示される5H3.1抗体重鎖の可変領域をコードする配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。実施例13)−2と同様の方法で5H3.1抗体重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−G2/5H3.1」と命名した。
5H3.1抗体重鎖のアミノ酸配列を配列表の配列番号77に示した。
13)−5 5H3.1抗体軽鎖発現ベクターの構築
配列表の配列番号78に示される5H3.1抗体軽鎖をコードするヌクレオチド配列のヌクレオチド番号38乃至742に示される5H3.1抗体軽鎖の可変領域と定常領域をコードする配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。実施例13)−3と同様の方法で5H3.1抗体軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−L/5H3.1」と命名した。
5H3.1抗体軽鎖のアミノ酸配列を配列表の配列番号79に示した。
配列表の配列番号78に示される5H3.1抗体軽鎖をコードするヌクレオチド配列のヌクレオチド番号38乃至742に示される5H3.1抗体軽鎖の可変領域と定常領域をコードする配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。実施例13)−3と同様の方法で5H3.1抗体軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA−L/5H3.1」と命名した。
5H3.1抗体軽鎖のアミノ酸配列を配列表の配列番号79に示した。
13)−6 2C1.1抗体および5H3.1抗体の調製
13)−6−1 2C1.1抗体および5H3.1抗体の生産
実施例12)−3−1と同様の方法で、抗体を生産した。2C1.1抗体はpCMA−G2/2C1.1とpCMA−L/2C1.1との組合せにより生産し、5H3.1抗体はpCMA−G2/5H3.1とpCMA−L/5H3.1との組合せにより生産した。
13)−6−1 2C1.1抗体および5H3.1抗体の生産
実施例12)−3−1と同様の方法で、抗体を生産した。2C1.1抗体はpCMA−G2/2C1.1とpCMA−L/2C1.1との組合せにより生産し、5H3.1抗体はpCMA−G2/5H3.1とpCMA−L/5H3.1との組合せにより生産した。
13)−6−2 2C1.1抗体および5H3.1抗体の二段階工程精製
実施例12)−3−2と同様の方法で、実施例13)−6−1で生産された培養上清について抗体の二段階工程精製を行った。
実施例12)−3−2と同様の方法で、実施例13)−6−1で生産された培養上清について抗体の二段階工程精製を行った。
[実験例14]マウス抗ヒトOrai1抗体10F8、14F74、および17F6の作製
10F8抗体、14F74抗体、および17F6抗体はWO2013091903A1に記載されている軽鎖、および重鎖のアミノ酸配列をもとに作製した。
14)−1 10F8抗体重鎖発現ベクターの構築
配列表の配列番号80に示される10F8抗体重鎖をコードするヌクレオチド配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。合成したDNA断片をテンプレートとして、KOD−Plus−で10F8抗体重鎖をコードする配列を含むDNA断片を増幅し、キメラおよびヒト化抗体軽鎖発現ベクターpCMA−LKを制限酵素XbaIおよびPmeIで消化してκ鎖分泌シグナルおよびヒトκ鎖定常領域を取り除いた箇所にIn−Fusion HD PCRクローニングキットを用いて挿入することにより10F8抗体重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA /10F8H」と命名した。
10F8抗体重鎖のアミノ酸配列を配列表の配列番号81に示した。
10F8抗体、14F74抗体、および17F6抗体はWO2013091903A1に記載されている軽鎖、および重鎖のアミノ酸配列をもとに作製した。
14)−1 10F8抗体重鎖発現ベクターの構築
配列表の配列番号80に示される10F8抗体重鎖をコードするヌクレオチド配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。合成したDNA断片をテンプレートとして、KOD−Plus−で10F8抗体重鎖をコードする配列を含むDNA断片を増幅し、キメラおよびヒト化抗体軽鎖発現ベクターpCMA−LKを制限酵素XbaIおよびPmeIで消化してκ鎖分泌シグナルおよびヒトκ鎖定常領域を取り除いた箇所にIn−Fusion HD PCRクローニングキットを用いて挿入することにより10F8抗体重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA /10F8H」と命名した。
10F8抗体重鎖のアミノ酸配列を配列表の配列番号81に示した。
14)−2 10F8抗体軽鎖発現ベクターの構築
配列表の配列番号82に示される10F8抗体軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社Strings DNA Fragments)。合成したDNA断片を、キメラおよびヒト化抗体軽鎖発現ベクターpCMA−LKを制限酵素XbaIおよびPmeIで消化してκ鎖分泌シグナルおよびヒトκ鎖定常領域を取り除いた箇所にIn−Fusion HD PCRクローニングキットを用いて挿入することにより10F8抗体軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA /10F8L」と命名した。
10F8抗体軽鎖のアミノ酸配列を配列表の配列番号83に示した。
配列表の配列番号82に示される10F8抗体軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社Strings DNA Fragments)。合成したDNA断片を、キメラおよびヒト化抗体軽鎖発現ベクターpCMA−LKを制限酵素XbaIおよびPmeIで消化してκ鎖分泌シグナルおよびヒトκ鎖定常領域を取り除いた箇所にIn−Fusion HD PCRクローニングキットを用いて挿入することにより10F8抗体軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA /10F8L」と命名した。
10F8抗体軽鎖のアミノ酸配列を配列表の配列番号83に示した。
14)−3 14F74抗体重鎖発現ベクターの構築
配列表の配列番号84に示される14F74抗体重鎖をコードするヌクレオチド配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。実施例14)−1と同様の方法により14F74抗体重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA /14F74H」と命名した。
14F74抗体重鎖のアミノ酸配列を配列表の配列番号85に示した。
配列表の配列番号84に示される14F74抗体重鎖をコードするヌクレオチド配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。実施例14)−1と同様の方法により14F74抗体重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA /14F74H」と命名した。
14F74抗体重鎖のアミノ酸配列を配列表の配列番号85に示した。
14)−4 14F74抗体軽鎖発現ベクターの構築
配列表の配列番号86に示される14F74抗体軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社Strings DNA Fragments)。実施例14)−2と同様の方法により14F74抗体軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA /14F74L」と命名した。
14F74抗体軽鎖のアミノ酸配列を配列表の配列番号87に示した。
配列表の配列番号86に示される14F74抗体軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社Strings DNA Fragments)。実施例14)−2と同様の方法により14F74抗体軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA /14F74L」と命名した。
14F74抗体軽鎖のアミノ酸配列を配列表の配列番号87に示した。
14)−5 17F6抗体重鎖発現ベクターの構築
配列表の配列番号88に示される17F6抗体重鎖をコードするヌクレオチド配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。実施例14)−1と同様の方法により17F6抗体重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA /17F6H」と命名した。
17F6抗体重鎖のアミノ酸配列を配列表の配列番号89に示した。
配列表の配列番号88に示される17F6抗体重鎖をコードするヌクレオチド配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。実施例14)−1と同様の方法により17F6抗体重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA /17F6H」と命名した。
17F6抗体重鎖のアミノ酸配列を配列表の配列番号89に示した。
14)−6 17F6抗体軽鎖発現ベクターの構築
配列表の配列番号90に示される17F6抗体軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社Strings DNA Fragments)。実施例14)−2と同様の方法により17F6抗体軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA /17F6L」と命名した。
17F6抗体軽鎖のアミノ酸配列を配列表の配列番号91に示した。
配列表の配列番号90に示される17F6抗体軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社Strings DNA Fragments)。実施例14)−2と同様の方法により17F6抗体軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA /17F6L」と命名した。
17F6抗体軽鎖のアミノ酸配列を配列表の配列番号91に示した。
14)−7 10F8抗体、14F74抗体、および17F6抗体の調製
14)−7−1 10F8抗体、14F74抗体、および17F6抗体の生産
実施例12)−3−1と同様の方法で生産した。10F8抗体はpCMA /10F8HとpCMA /10F8Lとの組合せにより生産し、14F74抗体はpCMA /14F74HとpCMA /14F74Lの組み合わせにより生産し、17F6抗体はpCMA /17F6HとpCMA /17F6Lの組み合わせにより生産した。
14)−7−1 10F8抗体、14F74抗体、および17F6抗体の生産
実施例12)−3−1と同様の方法で生産した。10F8抗体はpCMA /10F8HとpCMA /10F8Lとの組合せにより生産し、14F74抗体はpCMA /14F74HとpCMA /14F74Lの組み合わせにより生産し、17F6抗体はpCMA /17F6HとpCMA /17F6Lの組み合わせにより生産した。
14)−7−2 10F8抗体、14F74抗体、および17F6抗体の二段階工程精製
実施例12)−3−2と同様の方法で、実施例14)−7−1で得られた培養上清について抗体の二段階工程精製を行った。
実施例12)−3−2と同様の方法で、実施例14)−7−1で得られた培養上清について抗体の二段階工程精製を行った。
[実施例15]アフィニティマチュレーション抗体のエフェクター活性低減改変体とその他の抗ヒトOrai1抗体のin vitro活性比較
15)−1 フローサイトメトリーによる抗ヒトOrai1抗体の抗原結合活性
1)−1−1で構築したヒトOrai1発現ベクターを1)−4−2で示す方法によりHEK293T細胞に導入した細胞懸濁液を遠心し、上清を除去した後、pcDNA3.1−hOrai1導入HEK293T細胞およびpcDNA3.1−DEST導入HEK293T細胞のそれぞれに対し、12)−3で作製したhR198_HG1/LG1、hR198_HG1/LG1−LALA、13)−6で作製した2C1.1、5H3.1、14)−7で作製した10F8、14F74、17F6、およびコントロールとしてヒトIgGコントロール抗体とマウスIgGコントロール抗体を加えて懸濁し、4℃で30分静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、ヒト抗体に関しては、5% FBS含有PBSで100倍に希釈したAnti−human IgG FITC conjugate、マウス抗体に関してはAnti−mouse IgG FITC conjugate(Cappel社)を加えて懸濁し、4℃で30分静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、1μg/mL Propidium iodideを含む5% FBS含有PBSに再懸濁し、フローサイトメーター(FC500)で検出を行った。データ解析はFlowjoで行った。Propidium iodide陽性の死細胞をゲートで除外した後、生細胞のFITC蛍光強度のヒストグラムを作成し、平均蛍光強度(MFI)を算出した。hR198_HG1/LG1、hR198_HG1−LALA/LG1、2C1.1、5H3.1、10F8、14F74、17F6はpcDNA3.1−DEST導入HEK293T細胞には結合せず、図10(ヒト抗体)、図11(マウス抗体)に示すとおり、pcDNA3.1−hOrai1導入HEK293T細胞に対しては、結合が見られたことから、いずれの抗体も特異的にヒトOrai1に結合することが示された。一方、マウスIgGコントロール抗体では結合は観察されなかった。
15)−1 フローサイトメトリーによる抗ヒトOrai1抗体の抗原結合活性
1)−1−1で構築したヒトOrai1発現ベクターを1)−4−2で示す方法によりHEK293T細胞に導入した細胞懸濁液を遠心し、上清を除去した後、pcDNA3.1−hOrai1導入HEK293T細胞およびpcDNA3.1−DEST導入HEK293T細胞のそれぞれに対し、12)−3で作製したhR198_HG1/LG1、hR198_HG1/LG1−LALA、13)−6で作製した2C1.1、5H3.1、14)−7で作製した10F8、14F74、17F6、およびコントロールとしてヒトIgGコントロール抗体とマウスIgGコントロール抗体を加えて懸濁し、4℃で30分静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、ヒト抗体に関しては、5% FBS含有PBSで100倍に希釈したAnti−human IgG FITC conjugate、マウス抗体に関してはAnti−mouse IgG FITC conjugate(Cappel社)を加えて懸濁し、4℃で30分静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、1μg/mL Propidium iodideを含む5% FBS含有PBSに再懸濁し、フローサイトメーター(FC500)で検出を行った。データ解析はFlowjoで行った。Propidium iodide陽性の死細胞をゲートで除外した後、生細胞のFITC蛍光強度のヒストグラムを作成し、平均蛍光強度(MFI)を算出した。hR198_HG1/LG1、hR198_HG1−LALA/LG1、2C1.1、5H3.1、10F8、14F74、17F6はpcDNA3.1−DEST導入HEK293T細胞には結合せず、図10(ヒト抗体)、図11(マウス抗体)に示すとおり、pcDNA3.1−hOrai1導入HEK293T細胞に対しては、結合が見られたことから、いずれの抗体も特異的にヒトOrai1に結合することが示された。一方、マウスIgGコントロール抗体では結合は観察されなかった。
15)−2 抗ヒトOrai1抗体のヒトT細胞株活性化抑制作用
ヒトT細胞株であるJurkat細胞を、RPMI1640(10% FBS、100U/mL Penicillinおよび100μg/mL Streptomycinを含む)で1.5x106cells/mLの濃度に調製し、96−wells細胞培養プレートに80μLずつ播種し、hR198_HG1/LG1、hR198_HG1−LALA/LG1、2C1.1、5H3.1、10F8、14F74、17F6を10μL/well添加して37℃、5% CO2下で60分間前処置した。その後、100ng/mL PMAおよび1μg/mL A23187を10μL/well添加し(最終濃度10ng/mL PMAおよび100ng/mL A23187)、よく攪拌した後、約16時間37℃、5% CO2下で培養した。プレートをよく攪拌した後、600gにて3分間遠心し、上清に含まれるIL−2濃度をELISA法で測定した 。図12は抗ヒトOrai1抗体がPMAおよびA23187処理されたJurkat細胞からのIL−2の放出を添加濃度依存的に抑制することを示す。図13は抗体非添加時のIL−2濃度を100%とした時の、hR198_HG1/LG1、hR198_HG1−LALA/LG1、2C1.1、5H3.1、10F8、14F74、17F6の半数阻害濃度(IC50)および80%阻害濃度(IC80)を示す。先行技術の抗体のIC50は80ng/mL以上である一方で、本発明の代表的な抗体のIC50は10ng/mL以下である。また先行技術の抗体のIC80は60000ng/mL以上である一方で、本発明の代表的な抗体のIC80は200ng/mL以下である。
ヒトT細胞株であるJurkat細胞を、RPMI1640(10% FBS、100U/mL Penicillinおよび100μg/mL Streptomycinを含む)で1.5x106cells/mLの濃度に調製し、96−wells細胞培養プレートに80μLずつ播種し、hR198_HG1/LG1、hR198_HG1−LALA/LG1、2C1.1、5H3.1、10F8、14F74、17F6を10μL/well添加して37℃、5% CO2下で60分間前処置した。その後、100ng/mL PMAおよび1μg/mL A23187を10μL/well添加し(最終濃度10ng/mL PMAおよび100ng/mL A23187)、よく攪拌した後、約16時間37℃、5% CO2下で培養した。プレートをよく攪拌した後、600gにて3分間遠心し、上清に含まれるIL−2濃度をELISA法で測定した 。図12は抗ヒトOrai1抗体がPMAおよびA23187処理されたJurkat細胞からのIL−2の放出を添加濃度依存的に抑制することを示す。図13は抗体非添加時のIL−2濃度を100%とした時の、hR198_HG1/LG1、hR198_HG1−LALA/LG1、2C1.1、5H3.1、10F8、14F74、17F6の半数阻害濃度(IC50)および80%阻害濃度(IC80)を示す。先行技術の抗体のIC50は80ng/mL以上である一方で、本発明の代表的な抗体のIC50は10ng/mL以下である。また先行技術の抗体のIC80は60000ng/mL以上である一方で、本発明の代表的な抗体のIC80は200ng/mL以下である。
15)−3 アフィニティマチュレーション抗体のエフェクター活性低減改変体とその他の抗ヒトOrai1抗体のヒト末梢血単核球活性化抑制作用
ヒト末梢血単核球(PBMC)はCellular Technology社から凍結品として購入し、指示書に従って解凍して使用した。10% FBS、100U/mL Penicillinおよび100μg/mL Streptomycinを含むRPMI1640で2.0x106cells/mLの濃度に調製したPBMCを96−wells細胞培養プレートに80μLずつ播種し、各種抗ヒトOrai1抗体を10μL/well添加して37℃インキュベーター内で60分間前処置した。その後、100ng/mL PMAおよび1μg/mL A23187を10μL/well添加し、よく攪拌した後、約16時間37℃、5% CO2下で培養した。プレートをよく攪拌した後、600gにて3分間遠心し、上清に含まれるIL−2濃度およびインターフェロンガンマ(IFN−γ)濃度(MABTECH社)をELISA法で測定した 。図51は抗ヒトOrai1抗体がPMAおよびA23187処理されたヒトPBMCからのIL−2の放出を添加濃度依存的に抑制することを示す。図52は抗体非添加時のIL−2濃度を100%とした時の、hR198_HG1/LG1、hR198_HG1−LALA/LG1、2C1.1、5H3.1、10F8、14F74、17F6の半数阻害濃度(IC50)および80%阻害濃度(IC80)を示す。先行技術の抗体のIC50は100ng/mL以上である一方で、本発明の代表的な抗体のIC50は20ng/mL以下である。また先行技術の抗体のIC80は17000ng/mL以上である一方で、本発明の代表的な抗体のIC80は400ng/mL以下である。図53は抗ヒトOrai1抗体がPMAおよびA23187処理されたヒトPBMCからのIFN−γの放出を添加濃度依存的に抑制することを示す。図54は抗体非添加時のIFN−γ濃度を100%とした時の、hR198_HG1/LG1、hR198_HG1−LALA/LG1、2C1.1、5H3.1、10F8、14F74、17F6の半数阻害濃度(IC50)および80%阻害濃度(IC80)を示す。先行技術の抗体のIC50は800ng/mL以上である一方で、本発明の代表的な抗体のIC50は40ng/mL以下である。また先行技術の抗体のIC80は300000ng/mL以上である一方で、本発明の代表的な抗体のIC80は2000ng/mL以下である。
ヒト末梢血単核球(PBMC)はCellular Technology社から凍結品として購入し、指示書に従って解凍して使用した。10% FBS、100U/mL Penicillinおよび100μg/mL Streptomycinを含むRPMI1640で2.0x106cells/mLの濃度に調製したPBMCを96−wells細胞培養プレートに80μLずつ播種し、各種抗ヒトOrai1抗体を10μL/well添加して37℃インキュベーター内で60分間前処置した。その後、100ng/mL PMAおよび1μg/mL A23187を10μL/well添加し、よく攪拌した後、約16時間37℃、5% CO2下で培養した。プレートをよく攪拌した後、600gにて3分間遠心し、上清に含まれるIL−2濃度およびインターフェロンガンマ(IFN−γ)濃度(MABTECH社)をELISA法で測定した 。図51は抗ヒトOrai1抗体がPMAおよびA23187処理されたヒトPBMCからのIL−2の放出を添加濃度依存的に抑制することを示す。図52は抗体非添加時のIL−2濃度を100%とした時の、hR198_HG1/LG1、hR198_HG1−LALA/LG1、2C1.1、5H3.1、10F8、14F74、17F6の半数阻害濃度(IC50)および80%阻害濃度(IC80)を示す。先行技術の抗体のIC50は100ng/mL以上である一方で、本発明の代表的な抗体のIC50は20ng/mL以下である。また先行技術の抗体のIC80は17000ng/mL以上である一方で、本発明の代表的な抗体のIC80は400ng/mL以下である。図53は抗ヒトOrai1抗体がPMAおよびA23187処理されたヒトPBMCからのIFN−γの放出を添加濃度依存的に抑制することを示す。図54は抗体非添加時のIFN−γ濃度を100%とした時の、hR198_HG1/LG1、hR198_HG1−LALA/LG1、2C1.1、5H3.1、10F8、14F74、17F6の半数阻害濃度(IC50)および80%阻害濃度(IC80)を示す。先行技術の抗体のIC50は800ng/mL以上である一方で、本発明の代表的な抗体のIC50は40ng/mL以下である。また先行技術の抗体のIC80は300000ng/mL以上である一方で、本発明の代表的な抗体のIC80は2000ng/mL以下である。
[実施例16]hR198_HG1/LG1のin vivo活性
16)−1 ヒトPBMC移入マウス移植片対宿主病モデルに対するhR198_HG1/LG1の投与効果
重度複合免疫不全マウスであるNSGマウス(NOD.Cg−Prkdc<scid>Il2rg<tm1Wjl>/SzJ)にヒトPBMCを移入することで、ヒト移植片対宿主病様の反応が誘導できることが知られている(Clinical and Experimental Immunology, 157:104−118(2009))。日本チャールス・リバー社から購入した6週齢の雄性NSGマウス17匹に2.0GyのX線を照射した後(日立X線照射装置 MBR−1520R−4)、マウスを2匹の1群と5匹の3群に分割した。HBSor(25mM hystidine/5% sorbitol,pH6.0)にて3mg/mLおよび6mg/mLとなるよう調製したhR198_HG1/LG1を10mL/kg、即ち30mg/kgおよび60mg/kgとなるよう2群(n=5)のマウスに尾静脈内投与した。1群(n=5)はVehicle群としてHBSorのみを投与した。翌日、凍結ヒトPBMC(Cellular Technology社)をCTL−antiaggrigate(Cellular Technology社)を用いてプロトコールに従って解凍し、3百万個のヒトPBMCを200μLのPBSに浮遊させて3群(n=5)のマウスに移入、1群(n=2)はヒトPBMCを移入せずX線照射コントロール群として経過を観察した。投与群においては、X照射後第0日、7日、14日、21日に同用量のhR198_HG1/LG1もしくはHBSorを投与した。各マウスの体重は第0日、1日、4日、7日、9日、10日、11日と13日以降の毎日計測し、第0日の体重を100%として体重変化をパーセント換算し、各群の平均体重変化を図55に示した。Vehicle投与群の平均体重の減少は第16日くらいから観察され始めた。実験はVehicle投与群の平均体重が80%を下回った第21日に終了した。この時点において、ヒトPBMCを移入しなかったX線照射コントロール群は体重減少を示さなかった。hR198_HG1/LG1を30mg/kgおよび60mg/kg投与したマウスも体重は減少せず、平均体重はヒトPBMC非移入マウスと同等であった。本系においてヒトPBMCの活性化による移植片対宿主病の症状を顕著に抑制したhR198_HG1/LG1(抗Orai1抗体)には、ヒト移植片対宿主病に対する治療および/または予防効果が期待される。
16)−1 ヒトPBMC移入マウス移植片対宿主病モデルに対するhR198_HG1/LG1の投与効果
重度複合免疫不全マウスであるNSGマウス(NOD.Cg−Prkdc<scid>Il2rg<tm1Wjl>/SzJ)にヒトPBMCを移入することで、ヒト移植片対宿主病様の反応が誘導できることが知られている(Clinical and Experimental Immunology, 157:104−118(2009))。日本チャールス・リバー社から購入した6週齢の雄性NSGマウス17匹に2.0GyのX線を照射した後(日立X線照射装置 MBR−1520R−4)、マウスを2匹の1群と5匹の3群に分割した。HBSor(25mM hystidine/5% sorbitol,pH6.0)にて3mg/mLおよび6mg/mLとなるよう調製したhR198_HG1/LG1を10mL/kg、即ち30mg/kgおよび60mg/kgとなるよう2群(n=5)のマウスに尾静脈内投与した。1群(n=5)はVehicle群としてHBSorのみを投与した。翌日、凍結ヒトPBMC(Cellular Technology社)をCTL−antiaggrigate(Cellular Technology社)を用いてプロトコールに従って解凍し、3百万個のヒトPBMCを200μLのPBSに浮遊させて3群(n=5)のマウスに移入、1群(n=2)はヒトPBMCを移入せずX線照射コントロール群として経過を観察した。投与群においては、X照射後第0日、7日、14日、21日に同用量のhR198_HG1/LG1もしくはHBSorを投与した。各マウスの体重は第0日、1日、4日、7日、9日、10日、11日と13日以降の毎日計測し、第0日の体重を100%として体重変化をパーセント換算し、各群の平均体重変化を図55に示した。Vehicle投与群の平均体重の減少は第16日くらいから観察され始めた。実験はVehicle投与群の平均体重が80%を下回った第21日に終了した。この時点において、ヒトPBMCを移入しなかったX線照射コントロール群は体重減少を示さなかった。hR198_HG1/LG1を30mg/kgおよび60mg/kg投与したマウスも体重は減少せず、平均体重はヒトPBMC非移入マウスと同等であった。本系においてヒトPBMCの活性化による移植片対宿主病の症状を顕著に抑制したhR198_HG1/LG1(抗Orai1抗体)には、ヒト移植片対宿主病に対する治療および/または予防効果が期待される。
16)−2 Human Orai1ノックインマウスを用いたhR198_HG1/LG1のin vivo活性評価
16)−2−1 Human Orai1ノックインマウスの作出
マウスOrai1の第2細胞外ループドメインのアミノ酸配列をヒトOrai1配列に置換したHuman Orai1ノックインマウスは、遺伝子改変マウス作製の定法に従って株式会社特殊免疫研究所で作出された。概要を記すと、マウスOrai1遺伝子座を含むBACクローンのコード領域のDNA配列をヒトOrai1遺伝子座に置換するとともに、loxP配列で挟まれたネオ耐性遺伝子を導入し、ヒトOrai1遺伝子のノックインターゲティングベクターを構築した。このターゲティングベクターをマウスES細胞に導入し、G418耐性株を樹立した。サザンハイブリダイゼ?ション法により、標的遺伝子座が特異的に組み換えられたES細胞株をスクリーニングした。さらに、Cre発現ベクターを導入してセレクションマーカーを除去し、そのES細胞株を利用してキメラF1マウスを作出した。サザンハイブリダイゼーションでジェノタイピングを行ない、F1マウスの中からヘテロ変異体個体を選別し、このF1ヘテロ変異体個体の交配により、F2ホモ変異体であるHuman Orai1ノックインマウスを作出した。
16)−2−1 Human Orai1ノックインマウスの作出
マウスOrai1の第2細胞外ループドメインのアミノ酸配列をヒトOrai1配列に置換したHuman Orai1ノックインマウスは、遺伝子改変マウス作製の定法に従って株式会社特殊免疫研究所で作出された。概要を記すと、マウスOrai1遺伝子座を含むBACクローンのコード領域のDNA配列をヒトOrai1遺伝子座に置換するとともに、loxP配列で挟まれたネオ耐性遺伝子を導入し、ヒトOrai1遺伝子のノックインターゲティングベクターを構築した。このターゲティングベクターをマウスES細胞に導入し、G418耐性株を樹立した。サザンハイブリダイゼ?ション法により、標的遺伝子座が特異的に組み換えられたES細胞株をスクリーニングした。さらに、Cre発現ベクターを導入してセレクションマーカーを除去し、そのES細胞株を利用してキメラF1マウスを作出した。サザンハイブリダイゼーションでジェノタイピングを行ない、F1マウスの中からヘテロ変異体個体を選別し、このF1ヘテロ変異体個体の交配により、F2ホモ変異体であるHuman Orai1ノックインマウスを作出した。
16)−2−2 hR198_HG1/LG1の受動皮膚アナフィラキシー(PCA)反応抑制効果
マウスPCA反応は、定法に従って行った。特殊免疫研究所で生産された8週齢のHuman Orai1ノックインマウスあるいは野生型の同腹兄弟マウスを保定器にて保定後、HBSorにて6mg/mLとなるよう調製したhR198_HG1/LG1を10mL/kg、即ち60mg/kgとなるように尾静脈内投与した。Vehicle群にはHBSorのみを投与した。翌日イソフルラン(ファイザー社)吸入麻酔下、生理食塩水にて10ug/mLに調整したMonoclonal anti−OVA IgE(chondrex社)を10μLずつ耳介皮内に投与した。24時間後、2mg/mLのOVA(Albumin from chicken egg white、SIGMA社)および20mg/mLのEvans blue(Merck社)を含む生理食塩水を、5mg/kgOVAおよび100mg/kgEvans blueとなるように尾静脈内投与した。30分後にイソフルラン深麻酔下、放血致死させて耳介を切除し、0.5mLのDMSOに浸し、Evans blueを抽出した(37℃°、72時間)。Evans blueが抽出されたDMSO溶液は、200μLずつ96ウェルマイクロプレートに移し、O.D.650nmをマイクロプレートリーダー(Molecular devices社、SpectraMax M5e)で測定した。浸出したEvans blueの吸光度は以下の計算法に従い、Vehicle投与群の平均値を100%として表した。Blankには、DMSO溶液の吸光度を求めた。%=(OD650sample−OD650blank)/(OD650vehicle−OD650blank)。図56は、Human Orai1ノックインマウスに誘導したPCA反応をhR198_HG1/LG1が抑制することを示している。マウスPCA反応はヒトのI型アレルギー反応であるアナフィラキシーを再現した即時型アレルギーの基本的なモデル系であり、本系が抗アレルギー薬の評価に使用可能であることが知られている(Archives internationales de pharmacodynamie et de therapie, 165:92−102(1967)、International archives of allergy and applied immunology, 78:113−117(1985))。本系においてIgE依存的なマスト細胞脱顆粒に対する抑制活性が認められたhR198_HG1/LG1(抗Orai1抗体)には、既存のマスト細胞脱顆粒阻害薬に認められる気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、さらに同じヒトのI型アレルギー疾患、例えばアレルギー性喘息などに対する治療および/または予防効果が期待される。
マウスPCA反応は、定法に従って行った。特殊免疫研究所で生産された8週齢のHuman Orai1ノックインマウスあるいは野生型の同腹兄弟マウスを保定器にて保定後、HBSorにて6mg/mLとなるよう調製したhR198_HG1/LG1を10mL/kg、即ち60mg/kgとなるように尾静脈内投与した。Vehicle群にはHBSorのみを投与した。翌日イソフルラン(ファイザー社)吸入麻酔下、生理食塩水にて10ug/mLに調整したMonoclonal anti−OVA IgE(chondrex社)を10μLずつ耳介皮内に投与した。24時間後、2mg/mLのOVA(Albumin from chicken egg white、SIGMA社)および20mg/mLのEvans blue(Merck社)を含む生理食塩水を、5mg/kgOVAおよび100mg/kgEvans blueとなるように尾静脈内投与した。30分後にイソフルラン深麻酔下、放血致死させて耳介を切除し、0.5mLのDMSOに浸し、Evans blueを抽出した(37℃°、72時間)。Evans blueが抽出されたDMSO溶液は、200μLずつ96ウェルマイクロプレートに移し、O.D.650nmをマイクロプレートリーダー(Molecular devices社、SpectraMax M5e)で測定した。浸出したEvans blueの吸光度は以下の計算法に従い、Vehicle投与群の平均値を100%として表した。Blankには、DMSO溶液の吸光度を求めた。%=(OD650sample−OD650blank)/(OD650vehicle−OD650blank)。図56は、Human Orai1ノックインマウスに誘導したPCA反応をhR198_HG1/LG1が抑制することを示している。マウスPCA反応はヒトのI型アレルギー反応であるアナフィラキシーを再現した即時型アレルギーの基本的なモデル系であり、本系が抗アレルギー薬の評価に使用可能であることが知られている(Archives internationales de pharmacodynamie et de therapie, 165:92−102(1967)、International archives of allergy and applied immunology, 78:113−117(1985))。本系においてIgE依存的なマスト細胞脱顆粒に対する抑制活性が認められたhR198_HG1/LG1(抗Orai1抗体)には、既存のマスト細胞脱顆粒阻害薬に認められる気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、さらに同じヒトのI型アレルギー疾患、例えばアレルギー性喘息などに対する治療および/または予防効果が期待される。
16)−2−3 hR198_HG1/LG1の遅延型過敏(DTH)反応抑制効果
マウスDTH反応は、定法に従って行った。特殊免疫研究所で生産された8週齢のHuman Orai1ノックインマウスあるいは野生型の同腹兄弟マウスを保定機にて保定後、HBSorにて6mg/mLとなるよう調製したhR198_HG1/LG1を10mL/kg、即ち60mg/kgとなるように尾静脈内投与した。Vehicle群にはHBSorのみを投与した。翌日生理食塩水にて5mg/mLに希釈したmBSA(Albumin Bovine Methylated,SIGMA社)とFreund‘s Complete Adjuvant(DIFCO社)を等量混合して調製したエマルジョン50μLずつを両腋下に皮下投与し免疫を行った。6日後、再びhR198_HG1/LG1を60mg/kgとなるように尾静脈内投与した。翌日生理食塩水にて0.5mg/mLに調製したmBSAと生理食塩水をそれぞれイソフルラン吸入麻酔下方肢に皮内投与し、投与後6、24、48時間後の肢の腫れをダイアルゲージにて測定した。肢の腫れは0時間を0(10−2mm)とし、経時的に変化する腫れの厚みを計算し、Vehicle投与群の平均値を100%とし求めた。図57は、Human Orai1ノックインマウスに誘導したDTH反応を、抗原投与後6時間(A)24時間(B)48時間(C)の各時点でhR198_HG1/LG1が抑制していることを示す。マウスDTH反応はT細胞依存的な免疫の成立と応答を見る系であり、本系において活性を示した薬剤が強力な免疫抑制剤として開発されたことは良く知られている(Clinical and Experimental Immunology, 52:599−606(1983))。本系においてT細胞免疫の抑制活性が認めれたhR198_HG1/LG1(抗Orai1抗体)には、T細胞活性に起因するヒトの生体反応や疾患、例えば移植物の拒絶、免疫疾患、炎症性疾患に対する治療および/または予防効果が期待される。
マウスDTH反応は、定法に従って行った。特殊免疫研究所で生産された8週齢のHuman Orai1ノックインマウスあるいは野生型の同腹兄弟マウスを保定機にて保定後、HBSorにて6mg/mLとなるよう調製したhR198_HG1/LG1を10mL/kg、即ち60mg/kgとなるように尾静脈内投与した。Vehicle群にはHBSorのみを投与した。翌日生理食塩水にて5mg/mLに希釈したmBSA(Albumin Bovine Methylated,SIGMA社)とFreund‘s Complete Adjuvant(DIFCO社)を等量混合して調製したエマルジョン50μLずつを両腋下に皮下投与し免疫を行った。6日後、再びhR198_HG1/LG1を60mg/kgとなるように尾静脈内投与した。翌日生理食塩水にて0.5mg/mLに調製したmBSAと生理食塩水をそれぞれイソフルラン吸入麻酔下方肢に皮内投与し、投与後6、24、48時間後の肢の腫れをダイアルゲージにて測定した。肢の腫れは0時間を0(10−2mm)とし、経時的に変化する腫れの厚みを計算し、Vehicle投与群の平均値を100%とし求めた。図57は、Human Orai1ノックインマウスに誘導したDTH反応を、抗原投与後6時間(A)24時間(B)48時間(C)の各時点でhR198_HG1/LG1が抑制していることを示す。マウスDTH反応はT細胞依存的な免疫の成立と応答を見る系であり、本系において活性を示した薬剤が強力な免疫抑制剤として開発されたことは良く知られている(Clinical and Experimental Immunology, 52:599−606(1983))。本系においてT細胞免疫の抑制活性が認めれたhR198_HG1/LG1(抗Orai1抗体)には、T細胞活性に起因するヒトの生体反応や疾患、例えば移植物の拒絶、免疫疾患、炎症性疾患に対する治療および/または予防効果が期待される。
16)−2−4 抗Orai1抗体の皮膚炎に対する抑制活性の検討
皮膚炎は以下のいずれかの方法で惹起する。すなわちマウスの腹腔内にアルブミン抗原液を0.5mL投与し、さらに2週間後に同量の抗原で追加免疫を施した後、アルブミン抗原液を耳(20μL)または背部(100μL)に3日〜2週間ごとに3〜6回繰り返し塗布する。あるいはダニ抗原クリームを耳(20μL)または背部(100μL)に3日〜2週間ごとに3〜6回繰り返し塗布する。あるハプテンであるピクリルクロライドまたはDinitrofluorobenzeneをプロトコールに従い調製し、耳(20μL)または背部(100μL)に週1回または2回、最大8週間塗布する。あるいは皮膚反応誘発物質であるHistamine、Compound 40/80、5−(and 6−)carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester、Fluorescein isothiocyanate、Bombesin様ぺプチドを耳(20μL)、背部(100μL)、脊髄内(5μL)に投与する。抗Orai1抗体は皮膚炎誘導の前日もしくは1時間から4時間前に静脈内もしくは皮下に投与する。その後、投与頻度を7日から28日間隔として抗体投与を継続する。皮膚炎誘発後、経時的にダイアルシックネスゲージを用いて耳介の厚さの測定や皮膚炎の肉眼的スコア化を行う。また試験期間終了後、血液や組織中の抗体・サイトカイン・血中バイオマーカー濃度の定量、皮膚・末梢血・胸腺・脾臓・リンパ節・骨髄から得た細胞の増殖活性やサイトカイン産生能、表面抗原などの検討や、病理組織解析などを実施し、抗Orai1抗体の皮膚炎に対する抑制活性を判定する。
皮膚炎は以下のいずれかの方法で惹起する。すなわちマウスの腹腔内にアルブミン抗原液を0.5mL投与し、さらに2週間後に同量の抗原で追加免疫を施した後、アルブミン抗原液を耳(20μL)または背部(100μL)に3日〜2週間ごとに3〜6回繰り返し塗布する。あるいはダニ抗原クリームを耳(20μL)または背部(100μL)に3日〜2週間ごとに3〜6回繰り返し塗布する。あるハプテンであるピクリルクロライドまたはDinitrofluorobenzeneをプロトコールに従い調製し、耳(20μL)または背部(100μL)に週1回または2回、最大8週間塗布する。あるいは皮膚反応誘発物質であるHistamine、Compound 40/80、5−(and 6−)carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester、Fluorescein isothiocyanate、Bombesin様ぺプチドを耳(20μL)、背部(100μL)、脊髄内(5μL)に投与する。抗Orai1抗体は皮膚炎誘導の前日もしくは1時間から4時間前に静脈内もしくは皮下に投与する。その後、投与頻度を7日から28日間隔として抗体投与を継続する。皮膚炎誘発後、経時的にダイアルシックネスゲージを用いて耳介の厚さの測定や皮膚炎の肉眼的スコア化を行う。また試験期間終了後、血液や組織中の抗体・サイトカイン・血中バイオマーカー濃度の定量、皮膚・末梢血・胸腺・脾臓・リンパ節・骨髄から得た細胞の増殖活性やサイトカイン産生能、表面抗原などの検討や、病理組織解析などを実施し、抗Orai1抗体の皮膚炎に対する抑制活性を判定する。
16)−2−5 抗Orai1抗体の乾癬に対する抑制活性の検討
Imiquimodを用いる場合は、耳介両側または片面(5〜30mg)および剃毛済み背部(50〜100mg)に塗布し乾癬性皮膚炎を誘導する。あるいは10mg/mLのZymosanリン酸緩衝液中懸濁液を200uL腹腔内投与して皮膚炎を誘導する。起炎物質としてサイトカイン(IL−23など)を用いる場合は、1〜5%イソフルラン深麻酔下で、マウス耳介片面へサイトカイン0.1〜2μg含む溶液を20〜50μL皮内投与し乾癬性皮膚炎を誘導する。抗Orai1抗体は皮膚炎誘導の前日もしくは1時間から4時間前に静脈内もしくは皮下に投与する。その後、投与頻度を7日から28日間隔として抗体投与を継続する。皮膚炎誘発後、経時的にダイアルシックネスゲージを用いて耳介の厚さ測定や皮膚炎の肉眼的スコア化を行う。また試験期間終了後、炎症部位の重量およびその部位に浸潤した好中球のミエロペルオキシダーゼ活性、浸潤した細胞のフローサイトメトリー解析、遺伝子解析、サイトカイン濃度測定などをし、抗Orai1抗体の乾癬抑制活性を判定する。
Imiquimodを用いる場合は、耳介両側または片面(5〜30mg)および剃毛済み背部(50〜100mg)に塗布し乾癬性皮膚炎を誘導する。あるいは10mg/mLのZymosanリン酸緩衝液中懸濁液を200uL腹腔内投与して皮膚炎を誘導する。起炎物質としてサイトカイン(IL−23など)を用いる場合は、1〜5%イソフルラン深麻酔下で、マウス耳介片面へサイトカイン0.1〜2μg含む溶液を20〜50μL皮内投与し乾癬性皮膚炎を誘導する。抗Orai1抗体は皮膚炎誘導の前日もしくは1時間から4時間前に静脈内もしくは皮下に投与する。その後、投与頻度を7日から28日間隔として抗体投与を継続する。皮膚炎誘発後、経時的にダイアルシックネスゲージを用いて耳介の厚さ測定や皮膚炎の肉眼的スコア化を行う。また試験期間終了後、炎症部位の重量およびその部位に浸潤した好中球のミエロペルオキシダーゼ活性、浸潤した細胞のフローサイトメトリー解析、遺伝子解析、サイトカイン濃度測定などをし、抗Orai1抗体の乾癬抑制活性を判定する。
16)−2−6 抗Orai1抗体の多発性硬化症に対する抑制活性の検討
Myelin oligodendrocyte glycoproteinまたはそのペプチド抗原を生理食塩水で4mg/mLに調整し、生理食塩水で8mg/mLに調整したフロイントの完全アジュバントと等量混合して乳化させ、この混合液200μLをマウスの脇腹または腹部の皮内に投与、その直後に同マウスに2μg/mLの百日咳毒素水溶液を100μL尾静脈から投与する。さらに2日後に上述の百日咳毒素液を再度尾静脈から投与することで実験的脳脊髄炎を誘導する。実験開始1週間から2週間後より脳脊髄炎が発症し、尾から下肢、前肢へと麻痺が拡大していく。この麻痺の程度を四肢・尾の動きを肉眼的に観察することによりスコア化する。抗Orai1抗体は脳脊髄炎誘導の前日もしくは1時間から4時間前に静脈内もしくは皮下に投与する。その後、投与頻度を7日から28日間隔として抗体投与を継続し、抗Orai1抗体の多発性硬化症に対する投与効果を判定する。
Myelin oligodendrocyte glycoproteinまたはそのペプチド抗原を生理食塩水で4mg/mLに調整し、生理食塩水で8mg/mLに調整したフロイントの完全アジュバントと等量混合して乳化させ、この混合液200μLをマウスの脇腹または腹部の皮内に投与、その直後に同マウスに2μg/mLの百日咳毒素水溶液を100μL尾静脈から投与する。さらに2日後に上述の百日咳毒素液を再度尾静脈から投与することで実験的脳脊髄炎を誘導する。実験開始1週間から2週間後より脳脊髄炎が発症し、尾から下肢、前肢へと麻痺が拡大していく。この麻痺の程度を四肢・尾の動きを肉眼的に観察することによりスコア化する。抗Orai1抗体は脳脊髄炎誘導の前日もしくは1時間から4時間前に静脈内もしくは皮下に投与する。その後、投与頻度を7日から28日間隔として抗体投与を継続し、抗Orai1抗体の多発性硬化症に対する投与効果を判定する。
16)−2−7 抗Orai1抗体の関節炎に対する抑制活性の検討
2mg/mLのウシII型コラーゲンとフロイントの完全アジュバントを体積比1:1.3で混合し乳化したものを、1mLの注射筒とツベルクリン針を用いてマウスの尾根部皮内に100μL投与する。2〜3週間後に同じ処置を実施し、その後の四肢の関節腫脹をの肉眼的あるいはダイアルシックネスゲージを用いてスコア化する。試験期間終了時には、血液や組織中の抗体・サイトカイン・血中バイオマーカー濃度、皮膚・末梢血・胸腺・脾臓・リンパ節・骨髄から得た細胞の増殖活性・サイトカイン産生能・表面抗原などを測定する。抗Orai1抗体は関節炎誘導の前日もしくは1時間から4時間前に静脈内もしくは皮下に投与する。その後、投与頻度を7日から28日間隔として抗体投与を継続し、抗Orai1抗体の関節炎に対する投与効果を判定する。
2mg/mLのウシII型コラーゲンとフロイントの完全アジュバントを体積比1:1.3で混合し乳化したものを、1mLの注射筒とツベルクリン針を用いてマウスの尾根部皮内に100μL投与する。2〜3週間後に同じ処置を実施し、その後の四肢の関節腫脹をの肉眼的あるいはダイアルシックネスゲージを用いてスコア化する。試験期間終了時には、血液や組織中の抗体・サイトカイン・血中バイオマーカー濃度、皮膚・末梢血・胸腺・脾臓・リンパ節・骨髄から得た細胞の増殖活性・サイトカイン産生能・表面抗原などを測定する。抗Orai1抗体は関節炎誘導の前日もしくは1時間から4時間前に静脈内もしくは皮下に投与する。その後、投与頻度を7日から28日間隔として抗体投与を継続し、抗Orai1抗体の関節炎に対する投与効果を判定する。
16)−2−8 抗Orai1抗体の大腸炎に対する抑制活性の検討
Human Orai1ノックインマウスのリンパ節と脾臓から採取し精製したリンパ球を、抗CD4抗体GK1.5、抗CD25抗体PC61.5、抗CD45R抗体C363.16A(いずれもeBioscience社)を用いてセルソーターにより単離する。この方法で得られた細胞が純度95%以上のCD4+CD25−CD45RBhi T−cellsであることをフローサイトメーターで確認したのち、0.5百万個を12から16週齢のRag2−/−マウスの腹腔内に移入する。その後12週間、体重測定と下痢などの症状を観察し、観察期間終了後に剖検により腸管の肥厚度、ポリープの個数と大きさ、病理的特徴の有無を検討する。また血液や組織中の抗体・サイトカイン・血中バイオマーカー濃度の定量、腸管・末梢血・胸腺・脾臓・リンパ節・骨髄から得た細胞の増殖活性やサイトカイン産生能、表面抗原などを解析する。抗Orai1抗体は細胞移入の前日もしくは1時間から4時間前に静脈内もしくは皮下に投与する。その後、投与頻度を7日から28日間隔として抗体投与を継続し、抗Orai1抗体の大腸炎に対する投与効果を判定する。
Human Orai1ノックインマウスのリンパ節と脾臓から採取し精製したリンパ球を、抗CD4抗体GK1.5、抗CD25抗体PC61.5、抗CD45R抗体C363.16A(いずれもeBioscience社)を用いてセルソーターにより単離する。この方法で得られた細胞が純度95%以上のCD4+CD25−CD45RBhi T−cellsであることをフローサイトメーターで確認したのち、0.5百万個を12から16週齢のRag2−/−マウスの腹腔内に移入する。その後12週間、体重測定と下痢などの症状を観察し、観察期間終了後に剖検により腸管の肥厚度、ポリープの個数と大きさ、病理的特徴の有無を検討する。また血液や組織中の抗体・サイトカイン・血中バイオマーカー濃度の定量、腸管・末梢血・胸腺・脾臓・リンパ節・骨髄から得た細胞の増殖活性やサイトカイン産生能、表面抗原などを解析する。抗Orai1抗体は細胞移入の前日もしくは1時間から4時間前に静脈内もしくは皮下に投与する。その後、投与頻度を7日から28日間隔として抗体投与を継続し、抗Orai1抗体の大腸炎に対する投与効果を判定する。
16)−2−9 抗Orai1抗体の骨髄細胞移植系に対する作用の検討
Human Orai1ノックインマウスの大腿骨および脛骨を摘出し、針付き注射筒を用いて骨端から10%FBS−RPMI1640培地1〜5mLを注入して骨髄内の細胞を押し出し、セルストレイナー処理後の遠沈回収で骨髄細胞を回収、10mMHEPES、0.5mMEDTA、0.5%Penicillin/Streptomycinを含有するInjection bufferに200μL中10百万個の骨髄細胞が含まれるよう調整する。同時にHuman Orai1ノックインマウスの脾臓より定法に従って脾細胞を採取する。レシピエントである10〜13週齢のBALB/cマウスに2.0〜8.0GyのX線を照射した後、200μLのドナー骨髄細胞に0〜4百万個のドナー脾臓細胞を加え、この細胞混合液をレシピエントの尾静脈から注入する。その後、4から16週間の体重変化や生存率、試験終了時のレシピエントマウスの血液や組織中の抗体・サイトカイン・血中バイオマーカー濃度、腸管・末梢血・胸腺・脾臓・リンパ節・骨髄から得た細胞の表面抗原・増殖活性・サイトカイン産生能を測定する。抗Orai1抗体は骨髄移植の前日もしくは1時間から4時間前に静脈内もしくは皮下よりレシピエントマウスに投与する。その後、投与頻度を7日から28日間隔として抗体投与を継続し、抗Orai1抗体の移植細胞の生着や移植片対宿主病の発生率に対する作用を判定する。
Human Orai1ノックインマウスの大腿骨および脛骨を摘出し、針付き注射筒を用いて骨端から10%FBS−RPMI1640培地1〜5mLを注入して骨髄内の細胞を押し出し、セルストレイナー処理後の遠沈回収で骨髄細胞を回収、10mMHEPES、0.5mMEDTA、0.5%Penicillin/Streptomycinを含有するInjection bufferに200μL中10百万個の骨髄細胞が含まれるよう調整する。同時にHuman Orai1ノックインマウスの脾臓より定法に従って脾細胞を採取する。レシピエントである10〜13週齢のBALB/cマウスに2.0〜8.0GyのX線を照射した後、200μLのドナー骨髄細胞に0〜4百万個のドナー脾臓細胞を加え、この細胞混合液をレシピエントの尾静脈から注入する。その後、4から16週間の体重変化や生存率、試験終了時のレシピエントマウスの血液や組織中の抗体・サイトカイン・血中バイオマーカー濃度、腸管・末梢血・胸腺・脾臓・リンパ節・骨髄から得た細胞の表面抗原・増殖活性・サイトカイン産生能を測定する。抗Orai1抗体は骨髄移植の前日もしくは1時間から4時間前に静脈内もしくは皮下よりレシピエントマウスに投与する。その後、投与頻度を7日から28日間隔として抗体投与を継続し、抗Orai1抗体の移植細胞の生着や移植片対宿主病の発生率に対する作用を判定する。
[実施例17]アフィニティマチュレーション抗体とその他の抗ヒトOrai1抗体との物理化学的性質の比較
m−VROCによる粘度測定
10)−3で作製したhR198_HG1/LG1、hR198_H3/LG1、12)−3で作製したhR198_HG1−LALA/LG1、および13)−6で作製した2C1.1を、VIVAPORE 5(Sartorius社)で150mg/mL以上に濃縮後、HBSorで90、120および150mg/mLに調製した。m−VROC(RheoSense社)を用いて25℃における粘度を各濃度3回測定し、平均Viscosity(mPa・s)を算出した。結果を図58および表1に示す。hR198_HG1/LG1、hR198_H3/LG1、hR198_HG1−LALA/LG1の粘度はいずれの濃度においても2C1.1の粘度よりも低かった。特に、150mg/mLでは、hR198_HG1/LG1、hR198_H3/LG1、hR198_HG1−LALA/LG1の粘度はそれぞれ11.4、10.0、10.8mPa・sであるのに対し、2C1.1は21.0mPa・sであり、2C1.1と比較して、アフィニティマチュレーション抗体は高濃度化しても粘度が低いことが示された。
m−VROCによる粘度測定
10)−3で作製したhR198_HG1/LG1、hR198_H3/LG1、12)−3で作製したhR198_HG1−LALA/LG1、および13)−6で作製した2C1.1を、VIVAPORE 5(Sartorius社)で150mg/mL以上に濃縮後、HBSorで90、120および150mg/mLに調製した。m−VROC(RheoSense社)を用いて25℃における粘度を各濃度3回測定し、平均Viscosity(mPa・s)を算出した。結果を図58および表1に示す。hR198_HG1/LG1、hR198_H3/LG1、hR198_HG1−LALA/LG1の粘度はいずれの濃度においても2C1.1の粘度よりも低かった。特に、150mg/mLでは、hR198_HG1/LG1、hR198_H3/LG1、hR198_HG1−LALA/LG1の粘度はそれぞれ11.4、10.0、10.8mPa・sであるのに対し、2C1.1は21.0mPa・sであり、2C1.1と比較して、アフィニティマチュレーション抗体は高濃度化しても粘度が低いことが示された。
本発明のヒト化抗Orai1抗体は、公知の抗体より強力なT細胞活性抑制作用を有しており、移植拒絶等の治療または予防剤となり得る。
配列番号1:ヒトOrai1の遺伝子配列
配列番号2:ヒトOrai1のアミノ酸配列
配列番号3:PCRプライマー Nhe−polyC−S
配列番号4:PCRプライマー rIgγ−AS1
配列番号5:PCRプライマー rIgγ−AS2
配列番号6:PCRプライマー Nhe−polyC−S
配列番号7:PCRプライマー rIgκ−AS
配列番号8:シーケンスプライマー rIgγ−seq
配列番号9:シーケンスプライマー rIgκ−seq
配列番号10:R118軽鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号11:R118軽鎖のアミノ酸配列
配列番号12:R118重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号13:R118重鎖のアミノ酸配列
配列番号14:R198軽鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号15:R198軽鎖のアミノ酸配列
配列番号16:R198重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号17:R198重鎖のアミノ酸配列
配列番号18:ヒトκ鎖分泌シグナルおよびヒトκ鎖定常領域をコードする配列を含むDNA断片
配列番号19:PCRプライマー 3.3−F1
配列番号20:PCRプライマー 3.3−R1
配列番号21:ヒト重鎖シグナル配列およびヒトIgG1定常領域のアミノ酸をコードする配列を含むDNA断片
配列番号22:ヒトキメラ化cR118軽鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号23:ヒトキメラ化cR118軽鎖のアミノ酸配列
配列番号24:ヒトキメラ化cR198軽鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号25:ヒトキメラ化cR198軽鎖のアミノ酸配列
配列番号26:ヒトキメラ化cR118重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号27:ヒトキメラ化cR118重鎖のアミノ酸配列
配列番号28:ヒトキメラ化cR198重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号29:ヒトキメラ化cR198重鎖のアミノ酸配列
配列番号30:hR198_L1タイプ軽鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号31:hR198_L1タイプ軽鎖のアミノ酸配列
配列番号32:hR198_L2タイプ軽鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号33:hR198_L2タイプ軽鎖のアミノ酸配列
配列番号34:hR198_L3タイプ軽鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号35:hR198_L3タイプ軽鎖のアミノ酸配列
配列番号36:hR198_L4タイプ軽鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号37:hR198_L4タイプ軽鎖のアミノ酸配列
配列番号38:hR198_H1タイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号39:hR198_H1タイプ重鎖のアミノ酸配列
配列番号40:hR198_H2タイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号41:hR198_H2タイプ重鎖のアミノ酸配列
配列番号42:hR198_H3タイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号43:hR198_H3タイプ重鎖のアミノ酸配列
配列番号44:hR198_H4タイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号45:hR198_H4タイプ重鎖のアミノ酸配列
配列番号46:PCRプライマー Orai1 HF
配列番号47:PCRプライマー Orai1 CH FR
配列番号48:PCRプライマー M13 rev long
配列番号49:PCRプライマー SecM Stop R
配列番号50:PCRプライマー Orai1 Lc F
配列番号51:PCRプライマー Orai1 CL−FR
配列番号52:PCRプライマー Orai1 HR−FLAG R
配列番号53:PCRプライマー Orai1 CL−FLAG R
配列番号54:PCRプライマー Myc−R
配列番号55:hR198_LG1タイプ軽鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号56:hR198_LG1タイプ軽鎖のアミノ酸配列
配列番号57:hR198_LG2タイプ軽鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号58:hR198_LG2タイプ軽鎖のアミノ酸配列
配列番号59:hR198_LG3タイプ軽鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号60:hR198_LG3タイプ軽鎖のアミノ酸配列
配列番号61:hR198_HG1タイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号62:hR198_HG1タイプ重鎖のアミノ酸配列
配列番号63:hR198_HG2タイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号64:hR198_HG2タイプ重鎖のアミノ酸配列
配列番号65:hR198_HG3タイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号66:hR198_HG3タイプ重鎖のアミノ酸配列
配列番号67:hR198_H4−LALAタイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号68:hR198_H4−LALAタイプ重鎖のアミノ酸配列
配列番号69:hR198_HG1−LALAタイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号70:hR198_HG1−LALAタイプ重鎖のアミノ酸配列
配列番号71:ヒト重鎖分泌シグナルおよびヒトIgG2定常領域のアミノ酸をコードする配列を含むDNA断片
配列番号72:2C1.1抗体重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号73:2C1.1抗体重鎖のアミノ酸配列
配列番号74:2C1.1抗体軽鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号75:2C1.1抗体軽鎖のアミノ酸配列
配列番号76:5H3.1抗体重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号77:5H3.1抗体重鎖のアミノ酸配列
配列番号78:5H3.1抗体軽鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号79:5H3.1抗体軽鎖のアミノ酸配列
配列番号80:10F8抗体重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号81:10F8抗体重鎖のアミノ酸配列
配列番号82:10F8抗体軽鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号83:10F8抗体軽鎖のアミノ酸配列
配列番号84:14F74抗体重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号85:14F74抗体重鎖のアミノ酸配列
配列番号86:14F74抗体軽鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号87:14F74抗体軽鎖のアミノ酸配列
配列番号88:17F6抗体重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号89:17F6抗体重鎖のアミノ酸配列
配列番号90:17F6抗体軽鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号91:17F6抗体軽鎖のアミノ酸配列
配列番号92:ラットCDRL1(R198に由来し、hR198_L1乃至L4タイプ軽鎖に使用)
配列番号93:改変型CDRL1(hR198_LG1タイプ軽鎖に使用)
配列番号94:改変型CDRL1(hR198_LG2タイプ軽鎖に使用)
配列番号95:改変型CDRL1(hR198_LG3タイプ軽鎖に使用)
配列番号96:ラットCDRL2(R118およびR198で共通であり、hR198_L1乃至L4およびLG1タイプ軽鎖に使用)
配列番号97:改変型CDRL2(hR198_LG2タイプ軽鎖に使用)
配列番号98:改変型CDRL2(hR198_LG3タイプ軽鎖に使用)
配列番号99:ラットCDRL3(R118に由来し、hR198_L3およびL4タイプ軽鎖に使用)
配列番号100:ラットCDRL3(R198に由来し、hR198_L1およびL2タイプ軽鎖に使用)
配列番号101:改変型CDRL3(hR198_LG1乃至LG3タイプ軽鎖に使用)
配列番号102:ラットCDRH1(R118に由来し、hR198_H3、H4およびHG1乃至HG4タイプ重鎖に使用)
配列番号103:ラットCDRH1(R198に由来し、hR198_H1およびH2タイプ重鎖に使用)
配列番号104:ラットCDRH2(R118に由来し、hR198_H3およびH4タイプ重鎖に使用)
配列番号105:ラットCDRH2(R198に由来し、hR198_H1およびH2タイプ重鎖に使用)
配列番号106:改変型CDRH2(hR198_HG1タイプ重鎖に使用)
配列番号107:改変型CDRH2(hR198_HG2タイプ重鎖に使用)
配列番号108:改変型CDRH2(hR198_HG3タイプ重鎖に使用)
配列番号109:ラットCDRH3(R118およびR198で共通であり、hR198_H1乃至H4タイプ重鎖に使用
配列番号110:改変型CDRH3(hR198_HG1乃至HG3タイプ重鎖に使用)
配列番号111:hR198_H0タイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号112:hR198_H0タイプ重鎖のアミノ酸配列
配列番号113:hR198_H5タイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号114:hR198_H5タイプ重鎖のアミノ酸配列
配列番号115:ビオチンPEG化ヒトOrai1ループ領域ペプチド配列
配列番号116:ラットCDRL1(R118に由来するが、ヒト化抗体では使用されていない。)
配列番号2:ヒトOrai1のアミノ酸配列
配列番号3:PCRプライマー Nhe−polyC−S
配列番号4:PCRプライマー rIgγ−AS1
配列番号5:PCRプライマー rIgγ−AS2
配列番号6:PCRプライマー Nhe−polyC−S
配列番号7:PCRプライマー rIgκ−AS
配列番号8:シーケンスプライマー rIgγ−seq
配列番号9:シーケンスプライマー rIgκ−seq
配列番号10:R118軽鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号11:R118軽鎖のアミノ酸配列
配列番号12:R118重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号13:R118重鎖のアミノ酸配列
配列番号14:R198軽鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号15:R198軽鎖のアミノ酸配列
配列番号16:R198重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号17:R198重鎖のアミノ酸配列
配列番号18:ヒトκ鎖分泌シグナルおよびヒトκ鎖定常領域をコードする配列を含むDNA断片
配列番号19:PCRプライマー 3.3−F1
配列番号20:PCRプライマー 3.3−R1
配列番号21:ヒト重鎖シグナル配列およびヒトIgG1定常領域のアミノ酸をコードする配列を含むDNA断片
配列番号22:ヒトキメラ化cR118軽鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号23:ヒトキメラ化cR118軽鎖のアミノ酸配列
配列番号24:ヒトキメラ化cR198軽鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号25:ヒトキメラ化cR198軽鎖のアミノ酸配列
配列番号26:ヒトキメラ化cR118重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号27:ヒトキメラ化cR118重鎖のアミノ酸配列
配列番号28:ヒトキメラ化cR198重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号29:ヒトキメラ化cR198重鎖のアミノ酸配列
配列番号30:hR198_L1タイプ軽鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号31:hR198_L1タイプ軽鎖のアミノ酸配列
配列番号32:hR198_L2タイプ軽鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号33:hR198_L2タイプ軽鎖のアミノ酸配列
配列番号34:hR198_L3タイプ軽鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号35:hR198_L3タイプ軽鎖のアミノ酸配列
配列番号36:hR198_L4タイプ軽鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号37:hR198_L4タイプ軽鎖のアミノ酸配列
配列番号38:hR198_H1タイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号39:hR198_H1タイプ重鎖のアミノ酸配列
配列番号40:hR198_H2タイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号41:hR198_H2タイプ重鎖のアミノ酸配列
配列番号42:hR198_H3タイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号43:hR198_H3タイプ重鎖のアミノ酸配列
配列番号44:hR198_H4タイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号45:hR198_H4タイプ重鎖のアミノ酸配列
配列番号46:PCRプライマー Orai1 HF
配列番号47:PCRプライマー Orai1 CH FR
配列番号48:PCRプライマー M13 rev long
配列番号49:PCRプライマー SecM Stop R
配列番号50:PCRプライマー Orai1 Lc F
配列番号51:PCRプライマー Orai1 CL−FR
配列番号52:PCRプライマー Orai1 HR−FLAG R
配列番号53:PCRプライマー Orai1 CL−FLAG R
配列番号54:PCRプライマー Myc−R
配列番号55:hR198_LG1タイプ軽鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号56:hR198_LG1タイプ軽鎖のアミノ酸配列
配列番号57:hR198_LG2タイプ軽鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号58:hR198_LG2タイプ軽鎖のアミノ酸配列
配列番号59:hR198_LG3タイプ軽鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号60:hR198_LG3タイプ軽鎖のアミノ酸配列
配列番号61:hR198_HG1タイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号62:hR198_HG1タイプ重鎖のアミノ酸配列
配列番号63:hR198_HG2タイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号64:hR198_HG2タイプ重鎖のアミノ酸配列
配列番号65:hR198_HG3タイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号66:hR198_HG3タイプ重鎖のアミノ酸配列
配列番号67:hR198_H4−LALAタイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号68:hR198_H4−LALAタイプ重鎖のアミノ酸配列
配列番号69:hR198_HG1−LALAタイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号70:hR198_HG1−LALAタイプ重鎖のアミノ酸配列
配列番号71:ヒト重鎖分泌シグナルおよびヒトIgG2定常領域のアミノ酸をコードする配列を含むDNA断片
配列番号72:2C1.1抗体重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号73:2C1.1抗体重鎖のアミノ酸配列
配列番号74:2C1.1抗体軽鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号75:2C1.1抗体軽鎖のアミノ酸配列
配列番号76:5H3.1抗体重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号77:5H3.1抗体重鎖のアミノ酸配列
配列番号78:5H3.1抗体軽鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号79:5H3.1抗体軽鎖のアミノ酸配列
配列番号80:10F8抗体重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号81:10F8抗体重鎖のアミノ酸配列
配列番号82:10F8抗体軽鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号83:10F8抗体軽鎖のアミノ酸配列
配列番号84:14F74抗体重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号85:14F74抗体重鎖のアミノ酸配列
配列番号86:14F74抗体軽鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号87:14F74抗体軽鎖のアミノ酸配列
配列番号88:17F6抗体重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号89:17F6抗体重鎖のアミノ酸配列
配列番号90:17F6抗体軽鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号91:17F6抗体軽鎖のアミノ酸配列
配列番号92:ラットCDRL1(R198に由来し、hR198_L1乃至L4タイプ軽鎖に使用)
配列番号93:改変型CDRL1(hR198_LG1タイプ軽鎖に使用)
配列番号94:改変型CDRL1(hR198_LG2タイプ軽鎖に使用)
配列番号95:改変型CDRL1(hR198_LG3タイプ軽鎖に使用)
配列番号96:ラットCDRL2(R118およびR198で共通であり、hR198_L1乃至L4およびLG1タイプ軽鎖に使用)
配列番号97:改変型CDRL2(hR198_LG2タイプ軽鎖に使用)
配列番号98:改変型CDRL2(hR198_LG3タイプ軽鎖に使用)
配列番号99:ラットCDRL3(R118に由来し、hR198_L3およびL4タイプ軽鎖に使用)
配列番号100:ラットCDRL3(R198に由来し、hR198_L1およびL2タイプ軽鎖に使用)
配列番号101:改変型CDRL3(hR198_LG1乃至LG3タイプ軽鎖に使用)
配列番号102:ラットCDRH1(R118に由来し、hR198_H3、H4およびHG1乃至HG4タイプ重鎖に使用)
配列番号103:ラットCDRH1(R198に由来し、hR198_H1およびH2タイプ重鎖に使用)
配列番号104:ラットCDRH2(R118に由来し、hR198_H3およびH4タイプ重鎖に使用)
配列番号105:ラットCDRH2(R198に由来し、hR198_H1およびH2タイプ重鎖に使用)
配列番号106:改変型CDRH2(hR198_HG1タイプ重鎖に使用)
配列番号107:改変型CDRH2(hR198_HG2タイプ重鎖に使用)
配列番号108:改変型CDRH2(hR198_HG3タイプ重鎖に使用)
配列番号109:ラットCDRH3(R118およびR198で共通であり、hR198_H1乃至H4タイプ重鎖に使用
配列番号110:改変型CDRH3(hR198_HG1乃至HG3タイプ重鎖に使用)
配列番号111:hR198_H0タイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号112:hR198_H0タイプ重鎖のアミノ酸配列
配列番号113:hR198_H5タイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号114:hR198_H5タイプ重鎖のアミノ酸配列
配列番号115:ビオチンPEG化ヒトOrai1ループ領域ペプチド配列
配列番号116:ラットCDRL1(R118に由来するが、ヒト化抗体では使用されていない。)
Claims (6)
- 配列番号2に記載のアミノ酸配列に特異的に結合し、PMAおよびA23187処理されたJurkat細胞が放出するIL−2量を50%阻害する濃度が80ng/mL以下であることを特徴とする、抗体または該抗体の抗原結合性断片。
- PMAおよびA23187処理されたJurkat細胞が放出するIL−2量を50%阻害する濃度が10ng/mL以下であることを特徴とする、請求項1に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片。
- 配列番号2に記載のアミノ酸配列に特異的に結合し、PMAおよびA23187処理されたヒト末梢血単核球が放出するIL−2量を50%阻害する濃度が100ng/mL以下であることを特徴とする、抗体または該抗体の抗原結合性断片。
- PMAおよびA23187処理されたヒト末梢血単核球が放出するIL−2量を50%阻害する濃度が20ng/mL以下であることを特徴とする、請求項3に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片。
- 配列番号2に記載のアミノ酸配列に特異的に結合し、PMAおよびA23187処理されたヒト末梢血単核球が放出するIFN−γ量を50%阻害する濃度が800ng/mL以下であることを特徴とする、抗体または該抗体の抗原結合性断片。
- PMAおよびA23187処理されたヒト末梢血単核球が放出するIFN−γ量を50%阻害する濃度が40ng/mL以下であることを特徴とする、請求項5に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片。
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